RU2438664C2 - Synergetic pharmaceutical combination for cancer treatment - Google Patents
Synergetic pharmaceutical combination for cancer treatment Download PDFInfo
- Publication number
- RU2438664C2 RU2438664C2 RU2009146008/15A RU2009146008A RU2438664C2 RU 2438664 C2 RU2438664 C2 RU 2438664C2 RU 2009146008/15 A RU2009146008/15 A RU 2009146008/15A RU 2009146008 A RU2009146008 A RU 2009146008A RU 2438664 C2 RU2438664 C2 RU 2438664C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cancer
- compound
- hours
- cdk
- doxorubicin
- Prior art date
Links
- YILZFXDHRZARQB-UHFFFAOYSA-N CN(CC1)C(CO)C1c(c(OC([AlH2])=C1)c(c(O)c2)C1=O)c2O Chemical compound CN(CC1)C(CO)C1c(c(OC([AlH2])=C1)c(c(O)c2)C1=O)c2O YILZFXDHRZARQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область изобретенияField of Invention
Данное изобретение касается новой фармацевтической комбинации для лечения рака, причем указанная комбинация проявляет синергический эффект. Фармацевтическая комбинация включает цитотоксическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин и гемцитабин или их фармацевтически приемлемую соль и, по меньшей мере, один ингибитор циклин-зависимой киназы (CDK), выбранный из соединений формулы I (как описано здесь), или фармацевтически приемлемую соль, или сольват его. Данное изобретение также касается способа лечения рака, который включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества указанной комбинации.The present invention relates to a new pharmaceutical combination for the treatment of cancer, said combination exhibiting a synergistic effect. The pharmaceutical combination includes a cytotoxic antitumor agent selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin and gemcitabine or a pharmaceutically acceptable salt thereof and at least one cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor selected from compounds of formula I (as described herein) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof. The present invention also relates to a method of treating cancer, which comprises administering to a patient in need of such treatment a therapeutically effective amount of said combination.
Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Рак - это общий термин, используемый для описания болезней, при которых анормальные клетки делятся без контроля. Раковые клетки могут проникать в соседние ткани и могут распространяться по кровяному руслу и лимфатической системе в другие части организма. Существуют различные типы рака, такие как рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак головы и шеи, эндометриальный рак, рак почки (почечноклеточный), лейкемия, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак щитовидной железы, рак кожи, Неходжкинская лимфома и меланома. В настоящее время существует много способов, приемлемых для лечения рака, чем когда-либо ранее, включая химиотерапию, радиацию, хирургию, гормональную терапию, иммунную терапию и генную терапию. Химиотерапию обычно используют для лечения многих типов рака. Наиболее широко используемые химиотерапевтические средства (противоопухолевые средства) включают паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин, этопозид, карбоплатин, цисплатин, топотекан и гемцитабин. Эти и другие подобные противоопухолевые средства успешно использовались для лечения различных раков. Однако в свое время у некоторых пациентов, страдающих раком, как выяснили, развивается невосприимчивость к монотерапии, включающей применение таких стандартных противоопухолевых средств. Устойчивость или невосприимчивость к лекарственному средству представляет главное препятствие успешному лечению. Такую невосприимчивость часто рассматривают или как врожденную (то есть присутствующую в начале лечения), или приобретенную (то есть возникшую во время курсов химиотерапии). Исследование, связанное с воздействием на человеческие раковые клетки немелкоклеточного рака легкого (NCI-H460) постепенно возрастающих концентраций доксорубицина, подтвердило появление новой клеточной линии (NCI-H460/R), которая была невосприимчива к доксорубицину (96,2 раза) и кросс-невосприимчива к этопозиду, паклитакселу, винбластину и эпирубицину (J.Chemother., 2006 Feb; 18(1) 66-73). В другом исследовании сообщалось о распространенности in vitro невосприимчивости к химиотерапии в культурах опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), чрезмерной невосприимчивости к лекарственному средству или промежуточной невосприимчивости к лекарственному средству к ряду противоопухолевых средств, включающих цисплатин, доксорубицин, этопозид, гемцитабин, навелбин, паклитаксел, таксотер и топотекан (Ann. Thorac. Surg. 2006 Feb;81(2):440-6; discussion 446-7). Гемцитабин рассматривали как наиболее клинически активное лекарственное средство для лечения рака поджелудочной железы, однако он не смог значительно улучшить состояние пациентов с раком поджелудочной железы по причине предсуществующей или приобретенной хемоневосприимчивости большинства опухолевых клеток к лекарственному средству (Oncogene 2003 May 22; 22(21): 3243-51). Другой наблюдаемой или распространенной при лечении рака проблемой является тяжелая токсичность, связанная с большинством противоопухолевых средств. Частота проявления тяжелых побочных эффектов, таких как кардиотоксичность в случае с такими лекарственными средствами, как доксорубицин, описана в J Egypt Natl Cane Inst. 2005 Dec 17(4) 291-300. Несмотря на частоту проявления невосприимчивости и тяжелую токсичность, связанную с традиционными противоопухолевыми средствами, например гемцитабином, паклитакселом, эти средства будут оставаться важными при лечении рака, потому что они обладают способностью уменьшать опухолевую массу. Для улучшения скорости реакции и предотвращения токсичности, связанной с традиционными противоопухолевыми средствами, оценивают новые терапевтические подходы. Один такой подход направлен на протокол, включающий объединение различных противораковых средств, обладающих различным биологическим механизмом (Jekunen et al., Br. J.Cancer, 69, 299-306 (1994); Yeh et al., Life Sciences, 54, 431-35 (1994)). Оптимальный комбинационный химиотерапевтический протокол может привести к усилению терапевтической эффективности, снижению токсичности реципиента и минимальной или отсроченной невосприимчивости к лекарственному средству. Когда комбинируют лекарственные средства с различной токсичностью, каждое лекарственное средство можно использовать в его оптимальной дозе, помогая минимизировать непереносимые побочные эффекты, как сообщили для комбинации капецитабина и доцетаксела в "Oncology" (Williston Park). 2002 Oct; 16:17-22. Некоторые из противоопухолевых средств, как выяснили, синергически эффективны, когда используются в комбинации с другими противораковыми средствами, чем когда используются как монотерапия. Например, циклофосфамид и 5-фторурацил действуют синергически в клетках овариальной светлоклеточной аденокарциномы, как сообщается в Cancer Lett. 2001 Jan 10; 162 (1):39-48. Комбинационную химиотерапию также можно успешно использовать для лечения рака в поздних стадиях, которые трудно лечить монотерапией, радиацией или хирургическим лечением, например, сообщают о комбинации паклитаксела и гемцитабина для лечения метастатического немелкоклеточного рака легкого (Cancer, 2006 Sep 1; 107(5): 1050-4).Cancer is a general term used to describe diseases in which abnormal cells divide without control. Cancer cells can invade neighboring tissues and can spread through the bloodstream and lymphatic system to other parts of the body. There are various types of cancer, such as bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, endometrial cancer, kidney cancer (renal cell), leukemia, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, pancreatic cancer , prostate cancer, thyroid cancer, skin cancer, non-Hodgkin lymphoma and melanoma. Currently, there are many methods acceptable for treating cancer than ever before, including chemotherapy, radiation, surgery, hormone therapy, immune therapy, and gene therapy. Chemotherapy is usually used to treat many types of cancer. The most commonly used chemotherapeutic agents (antitumor agents) include paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, etoposide, carboplatin, cisplatin, topotecan and gemcitabine. These and other similar antitumor agents have been successfully used to treat various cancers. However, at one time, some patients with cancer were found to develop immunity to monotherapy, including the use of such standard antitumor agents. Resistance or immunity to the drug is the main obstacle to successful treatment. Such immunity is often considered either congenital (that is, present at the beginning of treatment), or acquired (that is, that occurred during chemotherapy courses). A study on the effects on human cancer cells of non-small cell lung cancer (NCI-H460) of gradually increasing concentrations of doxorubicin confirmed the appearance of a new cell line (NCI-H460 / R) that was immune to doxorubicin (96.2 times) and cross-immune to etoposide, paclitaxel, vinblastine and epirubicin (J. Chemother., 2006 Feb; 18 (1) 66-73). Another study reported the prevalence of in vitro chemotherapy immunity in non-small cell lung cancer tumor cell cultures (NSCLC), excessive drug immunity or intermediate drug immunity to a number of anticancer drugs, including cisplatin, doxorubicelicinbicinbicelinbicinbicelinbicinbicelinbicelinbicelinbicilbin-etopinbicelinbicelinbicinbicelinbicelinbicinbicilinbicinbicelinbicelinbicinbicelinbicinbicelinbicinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelinbicelin-bicincin types , Taxotere and Topotecan (Ann. Thorac. Surg. 2006 Feb; 81 (2): 440-6; discussion 446-7). Gemcitabine was considered as the most clinically active drug for treating pancreatic cancer, but it could not significantly improve the condition of patients with pancreatic cancer due to the preexisting or acquired chemo-susceptibility of most tumor cells to the drug (Oncogene 2003 May 22; 22 (21): 3243 -51). Another observable or common problem in cancer treatment is severe toxicity associated with most anticancer agents. The incidence of severe side effects, such as cardiotoxicity with drugs such as doxorubicin, is described in J Egypt Natl Cane Inst. 2005 Dec 17 (4) 291-300. Despite the frequency of immunity and the severe toxicity associated with traditional anticancer drugs, such as gemcitabine, paclitaxel, these drugs will remain important in the treatment of cancer because they have the ability to reduce tumor mass. New therapeutic approaches are being evaluated to improve the reaction rate and prevent toxicity associated with conventional antitumor agents. One such approach is directed to a protocol that includes combining various anticancer agents with different biological mechanisms (Jekunen et al., Br. J. Cancer, 69, 299-306 (1994); Yeh et al., Life Sciences, 54, 431- 35 (1994)). An optimal combination chemotherapeutic protocol can lead to increased therapeutic efficacy, reduced recipient toxicity, and minimal or delayed drug resistance. When drugs with different toxicities are combined, each drug can be used in its optimal dose, helping to minimize intolerable side effects, as reported for the combination of capecitabine and docetaxel at Oncology (Williston Park). 2002 Oct; 16: 17-22. Some of the antitumor agents have been found to be synergistically effective when used in combination with other anti-cancer agents than when used as monotherapy. For example, cyclophosphamide and 5-fluorouracil act synergistically in ovarian clear cell adenocarcinoma cells, as reported by Cancer Lett. 2001 Jan 10; 162 (1): 39-48. Combination chemotherapy can also be used successfully to treat advanced cancer that is difficult to treat with monotherapy, radiation, or surgery, for example, a combination of paclitaxel and gemcitabine has been reported to treat metastatic non-small cell lung cancer (Cancer, 2006 Sep 1; 107 (5): 1050 -four).
В последнее время была опробована комбинация одного или более стандартных противоопухолевых средств, таких как паклитаксел, цисплатин и т.д., с молекулярно нацеленным противораковым средством для лечения рака для повышения норм ответа на лекарственное средство и для обращения к невосприимчивости к противоопухолевым средствам. Молекулярно нацеленные средства, например иматиниб мезилат, флавопиридол и т.д., модулируют белки, такие как киназы, чья активность является более специфично связанной с раковыми клетками. За долгий период исследования доказали, что члены семейства циклин-зависимой киназы (CDK) играют ключевые роли в различных клеточных процессах. На данный момент известно 11 членов семейства CDK, среди которых CDK1, 2, 3, 4 и 6, как известно, играют важные роли в клеточном цикле (Cyclins and cyclin-dependent kinases: theme and variations. Adv Cancer Res. 1995; 66:181 -212). CDK активированы формирующими нековалентными комплексами с циклинами, такими как циклины А-, В-, С-, D- (D1, D2 и D3) и Е-типов. Каждый изофермент этого семейства отвечает за конкретные аспекты (клеточная сигнализация, транскрипция и т.д.) клеточного цикла, и некоторые из CDK изоферментов специфичны к определенным видам тканей. Аберрантная экспрессия и надэкспрессия этих киназ проявляются при многих болезненных состояниях. Ряд соединений, обладающих потенциально полезными свойствами ингибитора CDK, разработаны и отражены в литературе. Флавопиридол является первым мощным ингибитором циклин-зависимых киназ (CDK), дошедшим до клинического испытания. Как обнаружили, флавопиридол синергически делает возможным цитотоксический ответ на традиционные противоопухолевые средства в различных линиях раковых клеток. Например, о последовательном лечении НСТ116 рака толстой кишки доцетакселом, флавопиридолом и 5-фторурацилом сообщается в Acta Pharmacol Sin. 2006 Oct; 27(10):1375-81. Также о комбинированном лечении доцетакселом и флавопиридолом раковых клеток легкого сообщается в Radiother Oncol. 2004 May; 71(2):213-21, а о лечении рака желудка - в Mol Cancer Ther. 2003 Jun; 2(6): 549-55.Recently, a combination of one or more standard antitumor agents, such as paclitaxel, cisplatin, etc., with a molecularly targeted anticancer agent for treating cancer to increase drug response rates and to appeal to antitumor immunity has been tested. Molecularly targeted agents, for example, imatinib mesylate, flavopyridol, etc., modulate proteins, such as kinases, whose activity is more specifically associated with cancer cells. Over a long period of research, it was proved that members of the cyclin-dependent kinase (CDK) family play key roles in various cellular processes. Currently, 11 members of the CDK family are known, among which CDK1, 2, 3, 4, and 6 are known to play important roles in the cell cycle (Cyclins and cyclin-dependent kinases: theme and variations. Adv Cancer Res. 1995; 66: 181 -212). CDKs are activated by forming non-covalent complexes with cyclins, such as A-, B-, C-, D- (D1, D2 and D3) and E-type cyclins. Each isoenzyme of this family is responsible for specific aspects (cell signaling, transcription, etc.) of the cell cycle, and some of the CDK isoenzymes are specific to certain types of tissues. Aberrant expression and overexpression of these kinases is manifested in many painful conditions. A number of compounds with potentially useful properties of a CDK inhibitor have been developed and are reflected in the literature. Flavopiridol is the first potent inhibitor of cyclin-dependent kinases (CDKs) to reach clinical trials. Flavopiridol was found to synergistically make possible a cytotoxic response to traditional antitumor agents in various cancer cell lines. For example, sequential treatment of HCT116 colon cancer with docetaxel, flavopiridol, and 5-fluorouracil has been reported in Acta Pharmacol Sin. 2006 Oct; 27 (10): 1375-81. Also, combination treatment with docetaxel and flavopiridol for lung cancer cells has been reported by Radiother Oncol. 2004 May; 71 (2): 213-21, and for the treatment of stomach cancer, at Mol Cancer Ther. 2003 Jun; 2 (6): 549-55.
Хотя доказано, что комбинации противораковых средств обладают значительным успехом в протоколах лечения рака, существуют еще некоторые неудовлетворенные потребности и возможности для улучшений в лекарствах для лечения онкологических заболеваний, которые с трудом поддаются лечению или которые показывают невосприимчивость к лечению традиционными противоопухолевыми средствами в качестве монотерапии. В частности, разработка нового комбинационного подхода к доставке известных противораковых средств, обладающих различным механизмом действия, будет представлять важное достижение в данной области. Хотя протокол, включающий комбинацию противораковых средств, обладающих различным механизмом действия, может работать в случае некоторых комбинаций, но он не может работать тем же образом в другой комбинации противораковых средств, и такая комбинация не всегда может стать комбинацией, обладающей благоприятными терапевтическими эффектами. Однако в данном изобретении определено, что новая фармацевтическая комбинация известных противораковых средств, включающих ингибитор циклин-зависимой киназы, выбранный из соединений, представленных формулой I (как описано здесь), и стандартного цитотоксического противоопухолевого средства для лечения различных онкологических заболеваний обеспечивает неожиданно большую эффективность, чем когда противораковые средства используются отдельно.Although it has been proven that combinations of anticancer drugs have significant success in cancer treatment protocols, there are still some unmet needs and opportunities for improvements in cancer drugs that are difficult to treat or that show resistance to treatment with traditional anticancer drugs as monotherapy. In particular, the development of a new combination approach to the delivery of known anti-cancer agents with a different mechanism of action will be an important achievement in this area. Although a protocol including a combination of anticancer agents with a different mechanism of action may work in the case of some combinations, it cannot work the same way in another combination of anticancer agents, and such a combination may not always be a combination with beneficial therapeutic effects. However, this invention has determined that a new pharmaceutical combination of known anti-cancer agents, including a cyclin-dependent kinase inhibitor selected from the compounds represented by formula I (as described herein), and a standard cytotoxic antitumor agent for treating various oncological diseases provides unexpectedly greater efficacy than when anticancer drugs are used separately.
Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
В одном аспекте данное изобретение касается новой фармацевтической комбинации, включающей цитотоксическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин и гемцитабин или их фармацевтически приемлемую соль; и ингибитор циклин-зависимой киназы (CDK), выбранный из соединений формулы I (как описано здесь) или фармацевтически приемлемой соли, или сольвата их; причем указанная комбинация проявляет синергический эффект при лечении рака.In one aspect, the invention provides a novel pharmaceutical combination comprising a cytotoxic antitumor agent selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin and gemcitabine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor selected from compounds of formula I (as described herein) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof; moreover, this combination exhibits a synergistic effect in the treatment of cancer.
В другом аспекте данное изобретение касается фармацевтической комбинации, включающей цитотоксическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин и гемцитабин или их фармацевтически приемлемую соль; и ингибитор циклин-зависимой киназы (CDK), выбранный из соединений формулы I (как описано здесь) или фармацевтически приемлемой соли, или сольвата их, для одновременного или последовательного введения для лечения рака.In another aspect, the invention provides a pharmaceutical combination comprising a cytotoxic antitumor agent selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin and gemcitabine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor selected from compounds of formula I (as described herein) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, for simultaneous or sequential administration for the treatment of cancer.
В следующем аспекте данное изобретение касается применения новой фармацевтической комбинации для лечения рака и для индуцирования клеточного апоптоза.In a further aspect, the invention relates to the use of a new pharmaceutical combination for treating cancer and for inducing cell apoptosis.
В следующем аспекте данное изобретение касается способа лечения рака, который включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества цитотоксического противоопухолевого средства, выбранного из группы, включающей паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин и гемцитабин или их фармацевтически приемлемую соль; в комбинации с терапевтически эффективным количеством ингибитора циклин-зависимой киназы (CDK), выбранного из соединений формулы I (как описано здесь), или фармацевтически приемлемой соли, или сольвата их.In a further aspect, the invention provides a method for treating cancer, which comprises administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of a cytotoxic antitumor agent selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin and gemcitabine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; in combination with a therapeutically effective amount of a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor selected from compounds of formula I (as described herein) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В еще одном аспекте данное изобретение касается применения новой комбинации для получения лекарства для лечения рака.In yet another aspect, the invention provides the use of a novel combination for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
Другие аспекты и дополнительный объем применимости данного изобретения станет очевидным из следующего детального описания.Other aspects and additional scope of applicability of the present invention will become apparent from the following detailed description.
Краткое описание графических материаловA brief description of the graphic materials
Фигура 1 показывает, что комбинация доксорубицина и соединения А при обработке клеток немелкоклеточного рака легкого Н-460 in vitro проявляет синергизм. График(и) А, В, С и D представляет(представляют) распределение клеточного цикла различных групп обработки, а именно контроль (в течение 96 часов), 200 нМ доксорубицина отдельно (в течение 24 часов), 800 нМ соединения А отдельно (в течение 72 часов) и комбинацию, включающую введение 200 нМ доксорубицина (в течение 24 часов), за которым следует 800 нМ соединения А (72 часа) соответственно.Figure 1 shows that the combination of doxorubicin and compound A in the treatment of non-small cell lung cancer cells N-460 in vitro shows synergism. Graph (s) A, B, C and D represents (represent) the distribution of the cell cycle of various treatment groups, namely, control (within 96 hours), 200 nM doxorubicin separately (within 24 hours), 800 nM of compound A separately (in within 72 hours) and a combination comprising administering 200 nM of doxorubicin (within 24 hours), followed by 800 nM of compound A (72 hours), respectively.
Фигура 2 показывает, что комбинация доксорубицина и соединения А при обработке клеток немелкоклеточного рака легкого Н-460 in vitro проявляет синергизм. График(и) А, В, С и D представляет(представляют) распределение клеточного цикла различных групп обработки, а именно контроль (в течение 120 часов), 100 нМ доксорубицина отдельно (в течение 24 часов), 1200 нМ соединения А отдельно (в течение 96 часов) и комбинацию, включающую введение 100 нМ доксорубицина (24 часа), за которым следует 1200 нМ соединения А (96 часов) соответственно.Figure 2 shows that the combination of doxorubicin and compound A in the treatment of non-small cell lung cancer cells N-460 in vitro shows synergism. Graph (s) A, B, C and D represents (represent) the distribution of the cell cycle of various treatment groups, namely, control (within 120 hours), 100 nM doxorubicin separately (within 24 hours), 1200 nM of compound A separately (in within 96 hours) and a combination comprising administering 100 nM doxorubicin (24 hours), followed by 1200 nM of compound A (96 hours), respectively.
Фигура 3 демонстрирует, что применение комбинации гемцитабина и соединения А при обработке клеток поджелудочной железы (Panc-1) in vitro приводит к синергической активности. График(и) А, В, С и D представляет(представляют) распределение клеточного цикла различных групп обработки, а именно контроль (в течение 24 часов), контроль (в течение 96 часов), 70 нМ гемцитабина отдельно (в течение 24 часов), 300 нМ соединения А отдельно (в течение 72 часов) и комбинацию, включающую введение 70 нМ гемцитабина (24 часа), за которым следует 300 нМ соединения А (72 часа) соответственно.Figure 3 demonstrates that the use of a combination of gemcitabine and compound A in the treatment of pancreatic cells (Panc-1) in vitro leads to synergistic activity. Graph (s) A, B, C and D represents (represent) the distribution of the cell cycle of various treatment groups, namely control (within 24 hours), control (within 96 hours), 70 nM gemcitabine alone (within 24 hours) 300 nM of compound A alone (within 72 hours) and a combination comprising administering 70 nM of gemcitabine (24 hours), followed by 300 nM of compound A (72 hours), respectively.
Фигура 4 демонстрирует определение раннего апоптоза при синергической комбинации доксорубицина, за которым следует соединение А в конце 120-часовой обработки, с помощью окрашивания аннексином V. График(и) А, В, С и D представляет(представляют) распределение клеток в четырех квадратах в различных группах обработки, а именно контроль (в течение 120 часов), 1200 нМ соединения А отдельно (в течение 96 часов), 100 нМ доксорубицина отдельно (в течение 24 часов) и комбинацию, включающую введение 100 нМ доксорубицина (24 часа), за которым следует 1200 нМ соединения А (96 часов) соответственно.Figure 4 shows the determination of early apoptosis with a synergistic combination of doxorubicin, followed by compound A at the end of the 120-hour treatment, by staining with annexin V. Graph (s) A, B, C and D represent (represent) the distribution of cells in four squares in different treatment groups, namely control (within 120 hours), 1200 nM of compound A alone (within 96 hours), 100 nM of doxorubicin alone (within 24 hours), and a combination comprising administration of 100 nM of doxorubicin (24 hours), per followed by 1200 nM of compound A (96 hours) respectively.
Фигура 5 показывает, что комбинация доксорубицина и соединения А при обработке клеток немелкоклеточного рака легкого Н-460 in vitro проявляет синергизм при тестировании в клоногенном испытании.Figure 5 shows that the combination of doxorubicin and compound A in the treatment of non-small cell lung cancer cells N-460 in vitro shows synergism when tested in a clonogenic test.
Фигура 6 показывает анализ вестерн-блоттинга различных белков, включенных в регуляцию клеточного цикла и апоптоз.Figure 6 shows an analysis of Western blotting of various proteins involved in cell cycle regulation and apoptosis.
Фигура 7а иллюстрирует in vivo эффективность доксорубицина (2 мг на кг) по человеческим клеткам немелкоклеточной карциномы легкого (Н-460) и соединения А (20 мг на кг) комбинации на Н-460 ксенотрансплантатной модели.Figure 7a illustrates the in vivo efficacy of doxorubicin (2 mg per kg) in human cells of non-small cell lung carcinoma (H-460) and compound A (20 mg per kg) of the combination in the H-460 xenograft model.
Фигура 7b иллюстрирует in vivo эффективность доксорубицина (2 мг на кг) и соединения А (35 мг на кг) комбинации на Н-460 ксенотрансплантатной модели.Figure 7b illustrates in vivo the efficacy of doxorubicin (2 mg per kg) and compound A (35 mg per kg) of the combination in the H-460 xenograft model.
Фигуры 8а и 8b показывают средний вес опухоли в конце лечения и SE (столбцы) 8 опухолей от отдельной мыши в каждой группе в конце исследования. Процент ингибирования роста (GI) в конце обработки представлен для соответствующей группы на вершине каждого столбца. Парный t тест использовали для оценки статистической значимости различия между различными группами обработки. Статистически значимое различие считали присутствующим при Р<0,05.Figures 8a and 8b show the average tumor weight at the end of treatment and the SE (columns) of 8 tumors from a single mouse in each group at the end of the study. The growth inhibition percentage (GI) at the end of the treatment is presented for the corresponding group at the top of each column. A paired t test was used to assess the statistical significance of differences between different treatment groups. A statistically significant difference was considered present at P <0.05.
Фигура 9 показывает вестерн-блоттинг с помощью СОХ-2 антитела.Figure 9 shows western blotting using COX-2 antibodies.
Детальное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
В настоящее время установлено, что новая комбинация данного изобретения, которая включает традиционное цитотоксическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин и гемцитабин или их фармацевтически приемлемую соль, и ингибитор CDK, выбранный из соединений формулы I (как описано здесь), или фармацевтически приемлемой соли, или сольвата их, проявляет синергический эффект, когда применяется при лечении рака, особенно солидных опухолей.It has now been found that a new combination of the present invention, which includes a conventional cytotoxic antitumor agent selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin and gemcitabine or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a CDK inhibitor selected from compounds of formula I (as described here) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof exhibits a synergistic effect when used in the treatment of cancer, especially solid tumors.
Ингибитор CDK, используемый в фармацевтической комбинации данного изобретения, выбран из соединений формулы I, как описано здесь ниже. Ингибиторы CDK, представленные следующей формулой I, раскрыты в патентной РСТ публикации WO 2004004632. Соединения формулы I являются перспективными ингибиторами CDK, которые могут ингибировать пролиферацию многих раковых клеток. Соединения формулы I, как используется в данном изобретении, эффективны против различных солидных и гематологических злокачественных новообразований. В данном изобретении отмечено, что объединение ингибиторов CDK формулы I с традиционным цитотоксическим противоопухолевым средством, выбранным из группы, включающей паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин и гемцитабин, привели к усилению апоптоза или программированной клеточной смерти.The CDK inhibitor used in the pharmaceutical combination of the present invention is selected from compounds of formula I as described herein below. The CDK inhibitors represented by the following formula I are disclosed in PCT Patent Publication WO 2004004632. The compounds of formula I are promising CDK inhibitors that can inhibit the proliferation of many cancer cells. The compounds of formula I, as used in this invention, are effective against various solid and hematological malignancies. The present invention noted that the combination of CDK inhibitors of formula I with a traditional cytotoxic antitumor agent selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin and gemcitabine led to increased apoptosis or programmed cell death.
Ингибиторы CDK, используемые в данном изобретении, выбраны из соединений, представленных следующей формулой IThe CDK inhibitors used in this invention are selected from the compounds represented by the following formula I
где Ar представляет собой фенильную группу, которая замещена или незамещена 1, 2 или 3 идентичными или различными заместителями, выбранными из: галогена, такого как хлор, бром, фтор или йод, нитро, циано, С1-С4-алкила, трифторметила, гидроксила, С1-С4-алкокси, карбокси, С1-С4-алкоксикарбонила, CONH2 и NR1R2;where Ar represents a phenyl group which is substituted or unsubstituted with 1, 2 or 3 identical or different substituents selected from: halogen, such as chlorine, bromine, fluorine or iodine, nitro, cyano, C 1 -C 4 alkyl, trifluoromethyl, hydroxyl, C 1 -C 4 alkoxy, carboxy, C 1 -C 4 alkoxycarbonyl, CONH 2 and NR 1 R 2 ;
где R1 и R2 каждый независимо выбран из водорода или С1-С4-алкила.where R 1 and R 2 are each independently selected from hydrogen or C 1 -C 4 alkyl.
Получение соединений формулы I, которые могут быть в форме фармацевтически приемлемых солей и сольватов, и получение оральной и/или парентеральной фармацевтической композиции, включающей вышеуказанные соединения, раскрыты в патентной РСТ публикации WO 2004004632. Этот патент, который включен в данное описание путем ссылки, раскрывает, что ингибиторы CDK, представленные формулой I, проявляют значительную противораковую эффективность.The preparation of compounds of formula I, which may be in the form of pharmaceutically acceptable salts and solvates, and the preparation of an oral and / or parenteral pharmaceutical composition comprising the above compounds are disclosed in PCT Patent Publication WO 2004004632. This patent, which is incorporated herein by reference, discloses that the CDK inhibitors represented by formula I exhibit significant anti-cancer efficacy.
Как показано здесь выше, ингибиторы CDK формулы I можно использовать в форме их солей или сольватов. Предпочтительная соль соединений формулы I включает гидрохлоридную соль, соль метансульфоновой кислоты и соль трифторуксусной кислоты.As shown here above, the CDK inhibitors of formula I can be used in the form of their salts or solvates. A preferred salt of the compounds of formula I includes a hydrochloride salt, a methanesulfonic acid salt and a trifluoroacetic acid salt.
Специалист в данной области оценит, что соединения формулы I содержат, по меньшей мере, два хиральных центра. Таким образом, соединения формулы I существуют в форме двух различных оптических изомеров (то есть (+) или (-) энантиомеров). Все эти энантиомеры и смеси их, включая рацемические смеси, включены в объем данного изобретения. Энантиомеры соединения формулы I можно получить способами, раскрытыми в публикациях РСТ заявок WO 2004004632 и WO 2007148158, которые включены в данное описание путем ссылки во всей их полноте. Энантиомеры соединения формулы I также можно получить способами, хорошо известными в данной области, такими как хиральная HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) и ферментативное разделение. Альтернативно, энантиомеры соединений формулы (I) можно синтезировать с помощью оптически активных исходных материалов. Таким образом, определение ингибитора CDK формулы I включает в себя все возможные стереоизомеры и их смеси. Определение формулы I включает рацемические формы и выделенные оптические изомеры, обладающие установленной активностью.One skilled in the art will appreciate that the compounds of formula I contain at least two chiral centers. Thus, the compounds of formula I exist in the form of two different optical isomers (i.e., (+) or (-) enantiomers). All of these enantiomers and mixtures thereof, including racemic mixtures, are included in the scope of this invention. Enantiomers of the compounds of formula I can be obtained by the methods disclosed in PCT applications WO 2004004632 and WO 2007148158, which are incorporated herein by reference in their entirety. Enantiomers of the compounds of formula I can also be obtained by methods well known in the art, such as chiral HPLC (high performance liquid chromatography) and enzymatic resolution. Alternatively, the enantiomers of the compounds of formula (I) can be synthesized using optically active starting materials. Thus, the definition of a CDK inhibitor of formula I includes all possible stereoisomers and mixtures thereof. The definition of formula I includes racemic forms and isolated optical isomers having established activity.
Традиционное цитотоксическое противоопухолевое средство(средства), используемое в новой фармацевтической комбинации данного изобретения, можно выбрать из группы, включающей паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин, гемцитабин и аналогичные цитотоксические противоопухолевые средства, которые проявляют противораковую активность через сходный механизм действия.The traditional cytotoxic antitumor agent (s) used in the new pharmaceutical combination of the present invention can be selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin, gemcitabine and similar cytotoxic antitumor agents that exhibit anticancer activity through a similar mechanism of action.
Паклитаксел является натуральным дитерпеновым продуктом, выделенным из дерева тис тихий Taxus brevifolia (Rowinsky et. al., J.Natl. Cancer Inst, 82, 1247-1259 (1990)). Выделение паклитаксела и его структура раскрыты в J.Am. Chem. Soc. 93, 2325 (1971). Это противомикротрубочковое средство, которое обеспечивает систему микротрубочек из тубулиновых димеров и стабилизирует микротрубочки путем предотвращения деполимиризации. Паклитаксел одобрен для клинического применения для лечения овариального рака (Merkman et al.; Yale Journal Of Biology and Medicine, 64:583, 1991) и для лечения рака молочной железы (Holmes et al.; J.Nat. cancer Inst., 83; 1797, 1991), однако он также применим для лечения других онкологических заболеваний, например, его рассматривают как потенциальный кандидат для лечения рака головы и шеи (Forastire et. al., Sem. OncoL, 20: 56, 1990) и рака легкого (М.Ghaemmaghami et al.; Chest; 113; 86-91 (1998)). Паклитаксел раскрыт в патенте США №5670537, который включен в данное описание путем ссылки, для его идеи по применению или введению паклитаксела в лечении восприимчивых онкологических заболеваний. Паклитаксел коммерчески доступен как инъекционный раствор Таксол®. Применение паклитаксела как монотерапии обычно сопровождается нежелательными побочными эффектами, включающими реакции гиперчувствительности, гипотензию, брадикардию, гипертензию, тошноту и рвоту и реакции в месте инъекции.Paclitaxel is a natural diterpen product isolated from the yew tree Taxus brevifolia (Rowinsky et. Al., J. Natl. Cancer Inst, 82, 1247-1259 (1990)). Isolation of paclitaxel and its structure are disclosed in J.Am. Chem. Soc. 93, 2325 (1971). It is an anti-microtubule agent that provides a microtubule system of tubulin dimers and stabilizes microtubules by preventing depolymerization. Paclitaxel is approved for clinical use for the treatment of ovarian cancer (Merkman et al .; Yale Journal Of Biology and Medicine, 64: 583, 1991) and for the treatment of breast cancer (Holmes et al .; J. Nat. Cancer Inst., 83; 1797, 1991), however, it is also applicable to the treatment of other oncological diseases, for example, it is considered as a potential candidate for the treatment of head and neck cancer (Forastire et. Al., Sem. OncoL, 20: 56, 1990) and lung cancer (M Ghaemmaghami et al .; Chest; 113; 86-91 (1998)). Paclitaxel is disclosed in US Pat. No. 5,670,537, which is incorporated herein by reference for his idea of using or administering paclitaxel in the treatment of susceptible cancers. Paclitaxel is commercially available as Taxol® Injection. The use of paclitaxel as monotherapy is usually accompanied by undesirable side effects, including hypersensitivity reactions, hypotension, bradycardia, hypertension, nausea and vomiting, and reactions at the injection site.
Доцетаксел принадлежит таксановому семейству и является полусинтетическим производным паклитаксела. Доцетаксел показан главным образом для рака молочной железы и немелкоклеточного рака легкого. Его также применяют в лечении других онкологических заболеваний. Это соединение раскрыто в патенте США №4814470, который включен в данное описание путем ссылки, для его идеи синтеза и применения доцетаксела для лечения восприимчивых онкологических заболеваний. Доцетаксел тригидрат коммерчески доступен как инъекционный раствор Таксотер®. Все лечения на основе таксоидных производных, включая доцетаксел, могут показывать серьезные и болезненные токсичности, такие как миелосупрессия, нейтропения, гиперчувствительность, периферическая нейропатия и удержание жидкости среди прочих (Fumoleau et al., Bull. Cancer, (82)8: 629-636 (1995)).Docetaxel belongs to the taxane family and is a semi-synthetic derivative of paclitaxel. Docetaxel is indicated primarily for breast cancer and non-small cell lung cancer. It is also used in the treatment of other oncological diseases. This compound is disclosed in US patent No. 4814470, which is incorporated into this description by reference, for his idea of the synthesis and use of docetaxel for the treatment of susceptible cancer. Docetaxel trihydrate is commercially available as Taxotere® Injection. All treatments based on taxoid derivatives, including docetaxel, may show serious and painful toxicities, such as myelosuppression, neutropenia, hypersensitivity, peripheral neuropathy, and fluid retention, among others (Fumoleau et al., Bull. Cancer, (82) 8: 629-636 (1995)).
Доксорубицин является дженерическим названием Адримицина® и коммерчески доступен в инъекционной форме. Доксорубицин был впервые выделен из ферментативного бульона Sreptomyces peucetius var caesius (патент США №3590028). Это цитотоксическое противоопухолевое средство связывается с нуклеиновыми кислотами, вероятно, с помощью специфичного интеркалирования плоского антрациклинового ядра с двойной спиралью ДНК, что приводит к анормальной клеточной репликации. Доксорубицин используют в лечении раковых заболеваний молочной железы, мочевого пузыря, печени, легкого, простаты, желудка и щитовидной железы; сарком костной и мягких тканей; лимфом и лейкемий и опухолей детского возраста. Применение доксорубицина обычно сопровождается некоторыми побочными эффектами, включая миелосупрессию, тошноту и рвоту, кожно-слизистые и сердечные эффекты.Doxorubicin is the generic name Adrimycin® and is commercially available as an injectable. Doxorubicin was first isolated from the enzyme broth Sreptomyces peucetius var caesius (US patent No. 3590028). This cytotoxic antitumor agent binds to nucleic acids, probably by specific intercalation of a flat anthracycline nucleus with a double helix of DNA, which leads to abnormal cell replication. Doxorubicin is used in the treatment of cancers of the breast, bladder, liver, lung, prostate, stomach and thyroid gland; sarcomas of bone and soft tissues; lymphomas and leukemia and childhood tumors. The use of doxorubicin is usually accompanied by some side effects, including myelosuppression, nausea and vomiting, mucocutaneous and cardiac effects.
Гемцитабин является дженерическим названием 2'-деокси-2',2'-дифторцитидина. Он коммерчески доступен как моногидрохлоридная соль и как β-изомер. Гемцитабин раскрыт в патентах США №№4808614 и 5464826, которые включены в данное описание путем ссылки, для его идеи синтеза и применения гемцитабина для лечения восприимчивых онкологических заболеваний. Коммерческий состав гемцитабина гидрохлорида как отдельного средства показан как терапия первого ряда для пациентов с локально запущенной или метастатической аденокарциномой поджелудочной железы или карциномой клеток легкого (NSCLC), и его обычно используют для пациентов, которых ранее лечили 5-фторурацилом.Gemcitabine is the generic name of 2'-deoxy-2 ', 2'-difluorocytidine. It is commercially available as a monohydrochloride salt and as a β-isomer. Gemcitabine is disclosed in US Pat. Nos. 4,808,614 and 5,464,826, which are incorporated herein by reference, for his idea of the synthesis and use of gemcitabine for the treatment of susceptible cancers. The commercial composition of gemcitabine hydrochloride as a separate agent is shown as first-line therapy for patients with locally advanced or metastatic pancreatic adenocarcinoma or lung cell carcinoma (NSCLC), and it is usually used for patients who have previously been treated with 5-fluorouracil.
Общие выражения, используемые выше и ниже, предпочтительно имеют в контексте этого описания следующие значения, если не определено иное. Формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если контекст явно диктует иное.The general expressions used above and below preferably have the following meanings in the context of this description, unless otherwise specified. Singular forms include a reference to the plural, unless the context clearly dictates otherwise.
Выражение "противоопухолевое средство" является синонимом "химиотерапевтическому средству" или "противораковому средству" и означает терапевтическое средство, которое действует путем ингибирования или предотвращения роста новообразований. Выражение "противоопухолевое средство" или "противораковой средство" обычно означает соединения, которые предотвращают размножение раковых клеток (то есть противопролиферативные средства). Обычно противоопухолевое средство(средства) относятся к двум классам, противопролиферативные цитотоксические и противопролиферативные цитостатические. Цитотоксические средства предотвращают размножение раковых клеток путем (1) препятствования способности клеток реплицировать ДНК и (2) индуцирования клеточной смерти и/или апоптоза в раковых клетках.The expression "antitumor agent" is synonymous with "chemotherapeutic agent" or "anticancer agent" and means a therapeutic agent that acts by inhibiting or preventing the growth of tumors. The term “antitumor agent” or “anticancer agent” usually means compounds that prevent the proliferation of cancer cells (i.e., antiproliferative agents). Typically, an antitumor agent (s) belong to two classes, antiproliferative cytotoxic and antiproliferative cytostatic. Cytotoxic agents prevent the proliferation of cancer cells by (1) inhibiting the ability of cells to replicate DNA and (2) inducing cell death and / or apoptosis in cancer cells.
Противопролиферативные цитостатические средства действуют посредством модулирования, препятствования или ингибирования процессов клеточной сигнальной трансдукции, которые регулируют клеточную пролиферацию. В данном изобретении противоопухолевые средства, включенные в фармацевтическую комбинацию данного изобретения, являются цитотоксическими средствами и, следовательно, относятся к цитотоксическим противоопухолевым средствам.Antiproliferative cytostatic agents act by modulating, inhibiting, or inhibiting cell signal transduction processes that regulate cell proliferation. In the present invention, the antitumor agents included in the pharmaceutical combination of the present invention are cytotoxic agents and therefore relate to cytotoxic antitumor agents.
Как используется здесь, выражение "синергический" означает, что эффект, достижимый способами и комбинациями данного изобретения, больше, чем сумма эффектов, полученных от применения цитотоксического противоопухолевого средства(средств) или его фармацевтически приемлемой соли и ингибитора CDK формулы I или фармацевтически приемлемой соли или сольвата его, отдельно. Преимущественно такой синергизм обеспечивает большую эффективность при тех же дозах и/или предотвращает или задерживает развитие мультиневосприимчивости к лекарственному средству.As used herein, the term “synergistic” means that the effect achieved by the methods and combinations of the present invention is greater than the sum of the effects obtained from the use of a cytotoxic antitumor agent (s) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a CDK inhibitor of formula I or a pharmaceutically acceptable salt or solvate it, separately. Advantageously, such synergism provides greater efficacy at the same doses and / or prevents or delays the development of multi-drug resistance.
Как используется здесь, выражение "терапевтически эффективное количество" означает количество химиотерапевтического средства, обеспечивающее максимальный апоптоз пролиферативных клеток при минимальной токсичности к непролиферативным клеткам.As used herein, the term “therapeutically effective amount” means the amount of a chemotherapeutic agent that maximizes apoptosis of proliferative cells with minimal toxicity to non-proliferative cells.
Выражение "апоптоз" означает тип клеточной смерти, при котором серии молекулярных этапов в клетке ведут к ее смерти. Для организма это является нормальным способом организма избавляться от ненужных или анормальных клеток. Процесс апоптоза может быть заблокирован в раковых клетках. Также его называют программированной клеточной смертью (Dictionary of cancer terms. National Cancer Institute).The expression "apoptosis" means a type of cell death in which a series of molecular steps in a cell leads to its death. For the body, this is the normal way the body gets rid of unnecessary or abnormal cells. Apoptosis can be blocked in cancer cells. It is also called programmed cell death (Dictionary of cancer terms. National Cancer Institute).
Как используется здесь, выражение "возрастающий апоптоз" определяется как повышение нормы программированной клеточной смерти, то есть у большего числа клеток индуцирован процесс смерти по сравнению с воздействием (контактом) либо цитотоксического противоопухолевого средства отдельно, либо ингибитора CDK отдельно.As used here, the expression "increasing apoptosis" is defined as an increase in the rate of programmed cell death, that is, in a larger number of cells the death process is induced compared with the exposure (contact) of either a cytotoxic antitumor agent alone or a CDK inhibitor separately.
Выражение "субъект", как используется здесь, означает животное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человек, которое является объектом лечения, наблюдения или эксперимента.The term “subject,” as used herein, means an animal, preferably a mammal, most preferably a human being, that is being treated, observed or experimented with.
В одном варианте осуществления данное изобретение касается новой фармацевтической комбинации для лечения рака, где указанная комбинация включает цитотоксическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей паклитаксел, доцетаксел, доксорубицин или гемцитабин или их фармацевтически приемлемую соль, и, по меньшей мере, один ингибитор циклин-зависимой киназы (CDK), выбранный из соединений формулы I (как описано здесь), или фармацевтически приемлемой соли, или сольвата их.In one embodiment, the invention provides a new pharmaceutical combination for treating cancer, wherein said combination comprises a cytotoxic antitumor agent selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin or gemcitabine or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and at least one cyclin- dependent kinase (CDK) selected from compounds of formula I (as described herein), or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В одном варианте осуществления фармацевтическая комбинация, включающая ингибитор CDK формулы I и цитотоксические противоопухолевые средства, как описано здесь, не ограничена исключительно теми комбинациями, которые получены физическим объединением указанных ингредиентов, а также охватывает те, которые позволяют отдельное введение, которое может быть одновременным, последовательным или растягиваемым на период времени с тем, чтобы получить максимальную эффективность комбинации. Таким образом, фармацевтическую комбинацию можно вводить одновременно или растягивать на период времени для эффективного лечения рака.In one embodiment, a pharmaceutical combination comprising a CDK inhibitor of formula I and cytotoxic antitumor agents, as described herein, is not limited solely to those combinations obtained by physically combining these ingredients, but also encompasses those that allow a single administration that can be simultaneous, sequential or stretchable for a period of time in order to obtain the maximum effectiveness of the combination. Thus, the pharmaceutical combination can be administered simultaneously or stretched for a period of time to effectively treat cancer.
Для цели данного изобретения ингибитор CDK, выбранный из соединений формулы I, можно вводить, например, до, после или одновременно с цитотоксическим противоопухолевым средством. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения цитотоксическое противоопухолевое средство или его фармацевтически приемлемую соль вводят до введения ингибитора CDK формулы I, или фармацевтически приемлемой соли, или сольвата его, в диапазоне дозировки, описанном ниже. Однако оптимальный способ и последовательность введения ингибитора CDK и цитотоксического противоопухолевого средства при данных условиях могут быть надлежащим образом выбранными специалистом в данной области с помощью следующих установленных методик и информации, содержащейся в данном описании.For the purpose of this invention, a CDK inhibitor selected from compounds of formula I can be administered, for example, before, after, or simultaneously with a cytotoxic antitumor agent. In a preferred embodiment of the invention, a cytotoxic antitumor agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered prior to administration of a CDK inhibitor of formula I, or a pharmaceutically acceptable salt, or solvate thereof, in a dosage range described below. However, the optimal method and sequence of administration of the CDK inhibitor and cytotoxic antitumor agent under these conditions can be appropriately selected by a person skilled in the art using the following established methods and information contained in this description.
В одном варианте осуществления составляющие, включенные в комбинацию, должны быть введены различными путями, потому что у них различные физические и химические характеристики. Например, ингибиторы CDK формулы I можно вводить либо орально, либо парентерально для образования и поддержания их оптимальных уровней в крови, тогда как цитотоксическое противоопухолевое средство(средства) можно вводить парентерально, внутривенным, подкожным или внутримышечным путем.In one embodiment, the constituents included in the combination must be entered in different ways, because they have different physical and chemical characteristics. For example, CDK inhibitors of formula I can be administered either orally or parenterally to form and maintain their optimal blood levels, while a cytotoxic antitumor agent (s) can be administered parenterally, intravenously, subcutaneously or intramuscularly.
Для орального применения ингибиторы CDK формулы I можно вводить, например, в форме таблеток или капсул, порошков, дисперсных гранул, или крахмальных капсул или как водных растворов, или суспензий. В случае таблеток для орального применения носители, которые обычно используют, включают лактозу, кукурузный крахмал, магния карбонат, тальк и сахар и обычно добавляют смазывающие средства, такие как магния стеарат. Для орального введение в капсулированной форме применимые носители включают лактозу, кукурузный крахмал, магния карбонат, тальк и сахар.For oral administration, the CDK inhibitors of formula I can be administered, for example, in the form of tablets or capsules, powders, dispersible granules, or starch capsules, or as aqueous solutions or suspensions. In the case of tablets for oral use, carriers that are commonly used include lactose, corn starch, magnesium carbonate, talc and sugar, and lubricants such as magnesium stearate are usually added. For oral administration in capsule form, suitable carriers include lactose, corn starch, magnesium carbonate, talc and sugar.
Для внутримышечного, внутриперитонеального, подкожного и внутривенного применения обычно применяют стерильные растворы активного ингредиента (цитотоксического противоопухолевого средства(средств) или ингибитора CDK), а рН растворов должен быть надлежащим образом отрегулирован и буферизован.For intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous and intravenous use, sterile solutions of the active ingredient (cytotoxic antitumor agent (s) or CDK inhibitor) are usually used, and the pH of the solutions must be properly adjusted and buffered.
В другом варианте осуществления данное изобретение касается способа лечения рака, который включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества указанной комбинации. Следовательно, в способе данного изобретения рак лечат у субъекта путем введения субъекту терапевтического количества цитотоксического противоопухолевого средства, эффективного для лечения рака, в комбинации с терапевтически эффективным количеством ингибитора CDK, выбранного из соединений формулы I, или фармацевтически приемлемой соли, или сольвата их, где возникает синергический эффект.In another embodiment, the invention provides a method of treating cancer, which comprises administering to a subject in need of such treatment a therapeutically effective amount of said combination. Therefore, in the method of the present invention, cancer is treated in a subject by administering to the subject a therapeutic amount of a cytotoxic antitumor agent effective for treating cancer, in combination with a therapeutically effective amount of a CDK inhibitor selected from compounds of formula I, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, where it occurs synergistic effect.
Как показано здесь ранее, активные ингредиенты, содержащиеся в фармацевтической композиции, можно вводить одновременно или последовательно.As shown here previously, the active ingredients contained in the pharmaceutical composition can be administered simultaneously or sequentially.
Таким образом, согласно данному изобретению способ лечения рака включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтическое количество цитотоксического противоопухолевого средства одновременно с терапевтическим количеством ингибитора CDK, представленного соединениями формулы I.Thus, according to this invention, a method of treating cancer includes administering to a subject in need of such treatment a therapeutic amount of a cytotoxic antitumor agent simultaneously with a therapeutic amount of a CDK inhibitor represented by compounds of formula I.
В одном варианте осуществления способ лечения рака включает последовательное введение терапевтического количества цитотоксического противоопухолевого средства и терапевтического количества ингибитора CDK, представленного соединениями формулы I, субъекту, нуждающемуся в таком лечении.In one embodiment, a method of treating cancer comprises the sequential administration of a therapeutic amount of a cytotoxic antitumor agent and a therapeutic amount of a CDK inhibitor represented by compounds of formula I to a subject in need of such treatment.
В другом варианте осуществления способ лечения рака включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтического количества цитотоксического противоопухолевого средства до введения ингибитора CDK, представленного соединениями формулы I.In another embodiment, a method of treating cancer comprises administering to a subject in need of such treatment a therapeutic amount of a cytotoxic antitumor agent prior to administration of a CDK inhibitor represented by compounds of formula I.
Способ и фармацевтическую комбинацию данного изобретения можно использовать в лечении рака, выбранного из группы, включающей рак молочной железы, рак легкого (включая мелко- и немелкоклеточный рак легкого и аденокарциному легкого), овариальный рак, рак поджелудочной железы (включая карциному экзокринной поджелудочной железы), рак желудка, колоректальный рак и гепатоцеллюлярный рак.The method and pharmaceutical combination of the present invention can be used in the treatment of cancer selected from the group comprising breast cancer, lung cancer (including small and non-small cell lung cancer and lung adenocarcinoma), ovarian cancer, pancreatic cancer (including exocrine pancreatic carcinoma), stomach cancer, colorectal cancer and hepatocellular cancer.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую комбинацию данного изобретения можно использовать в лечении рака, выбранного из немелкоклеточного рака легкого и рака поджелудочной железы.In a preferred embodiment, the pharmaceutical combination of the present invention can be used in the treatment of cancer selected from non-small cell lung cancer and pancreatic cancer.
Фактическая дозировка активных ингредиентов, содержащихся в комбинации, может варьировать в зависимости от потребностей пациента и серьезности состояния, подлежащего лечению. Определение подходящей дозировки для конкретной ситуации известно специалисту в данной области. Как правило, лечение начинают с меньших доз, которые ниже, чем оптимальная доза соединения. Затем дозу каждого ингредиента увеличивают на небольшие количества, пока не будет достигнуто оптимального эффекта при таких обстоятельствах. Однако количество каждого ингредиента в фармацевтической комбинации типично будет меньше, чем количество, которое произвело бы терапевтический эффект при отдельном введении. Для удобства полную дневную дозу можно делить и вводить порциями в течение дня, если нужно. В предпочтительном варианте осуществления цитотоксическое противоопухолевое средство или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор CDK, представленный соединениями формулы I, или фармацевтически приемлемой солью, или сольватом их, вводят последовательно в инъекционных формах, так что цитотоксическое противоопухолевое средство вводят в синергически эффективной дозе, изменяющейся от 10 мг до 1400 мг, предпочтительно изменяющейся от 15 мг до 1000 мг, а ингибитор CDK вводят в синергически эффективной дозе, изменяющейся от 5 мг до 750 мг, предпочтительно изменяющейся от 10 мг до 300 мг.The actual dosage of the active ingredients contained in the combination may vary depending on the needs of the patient and the severity of the condition to be treated. Determining the appropriate dosage for a particular situation is known to the person skilled in the art. As a rule, treatment begins with lower doses, which are lower than the optimal dose of the compound. Then the dose of each ingredient is increased by small amounts until the optimum effect is achieved under such circumstances. However, the amount of each ingredient in a pharmaceutical combination will typically be less than the amount that would produce a therapeutic effect if administered separately. For convenience, the full daily dose can be divided and administered in portions throughout the day, if necessary. In a preferred embodiment, the cytotoxic antitumor agent or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a CDK inhibitor represented by compounds of formula I, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, are administered sequentially in injection forms, so that the cytotoxic antitumor agent is administered in a synergistically effective dose, varying from 10 mg to 1400 mg, preferably varying from 15 mg to 1000 mg, and the CDK inhibitor is administered in a synergistically effective dose, varying from 5 mg to 750 mg, varying significantly from 10 mg to 300 mg.
В одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, когда цитотоксическим противоопухолевым средством является паклитаксел, его вводят в синергически эффективной дозе, изменяющейся от 30 мг до 300 мг.In one preferred embodiment of the invention, when the cytotoxic antitumor agent is paclitaxel, it is administered in a synergistically effective dose ranging from 30 mg to 300 mg.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, когда цитотоксическим противоопухолевым средством является доцетаксел, его вводят в синергически эффективной дозе, изменяющейся от 20 мг до 175 мг.In another preferred embodiment of the present invention, when the cytotoxic antitumor agent is docetaxel, it is administered in a synergistically effective dose ranging from 20 mg to 175 mg.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, когда цитотоксическим противоопухолевым средством является доксорубицин, его вводят в синергически эффективной дозе, изменяющейся от 17,5 мг до 75 мг.In another preferred embodiment of the invention, when the cytotoxic antitumor agent is doxorubicin, it is administered in a synergistically effective dose ranging from 17.5 mg to 75 mg.
В следующем предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, когда цитотоксическим противоопухолевым средством является гемцитабин, его вводят в синергически эффективной дозе, изменяющейся от 70 мг до 1200 мг.In a further preferred embodiment of the present invention, when the cytotoxic antitumor agent is gemcitabine, it is administered in a synergistically effective dose, varying from 70 mg to 1200 mg.
Комбинации, представленные данным изобретением, оценили некоторыми аналитическими системами и несколькими различными режимами введения in vitro. Детали эксперимента представлены здесь ниже. Представленные здесь данные четко указывают, что цитотоксическое противоопухолевое средство, когда комбинируется с ингибитором CDK формулы I, проявляет синергический эффект. Четко указано, что противораковые средства, когда используются в комбинации при лечении рака, усиливают апоптоз или цитотоксичность у пролиферативных клеток, чем когда клетки обработаны только ингибитором CDK формулы I отдельно или цитотоксическим противоопухолевым средством отдельно. Например, из данных, представленных в Таблицах 2-4, можно четко видеть, что ингибитор CDK, представленный соединением формулы I, обозначенным здесь как соединение А, синергически усилил цитотоксичность доксорубицина в анализе in vitro по отношению к клеткам немелкоклеточной карциномы легкого Н-460.The combinations represented by this invention have been evaluated by some assay systems and several different in vitro administration modes. Details of the experiment are presented here below. The data presented here clearly indicate that a cytotoxic antitumor agent, when combined with a CDK inhibitor of formula I, exhibits a synergistic effect. It is clearly indicated that anticancer agents, when used in combination in the treatment of cancer, enhance apoptosis or cytotoxicity in proliferative cells than when cells are treated only with a CDK inhibitor of formula I alone or with a cytotoxic antitumor agent alone. For example, from the data presented in Tables 2-4, it can be clearly seen that the CDK inhibitor represented by the compound of formula I, designated here as compound A, synergistically enhanced the cytotoxicity of doxorubicin in an in vitro assay with respect to non-small cell lung carcinoma H-460 cells.
Представленное соединение, соединение А, используемое в фармакологических испытаниях, является (+)-trans-2-(2-хлор-фенил)-5,7-дигидрокси-8-(2-гидроксиметил-1-метил-пирролидин-3-ил)-хромен-4-оном гидрохлоридом и является одним из соединений, раскрытых в РСТ публикации патентной заявки WO 2004004632, включенной здесь путем ссылки.The present compound, compound A used in pharmacological tests, is (+) - trans-2- (2-chloro-phenyl) -5,7-dihydroxy-8- (2-hydroxymethyl-1-methyl-pyrrolidin-3-yl ) -chromen-4-one hydrochloride and is one of the compounds disclosed in the PCT publication of patent application WO 2004004632, incorporated herein by reference.
В данном изобретении также созданы ксенотрансплантатные модели для расширенных in vitro наблюдений in vivo системы. В данном изобретении тестирована комбинация данного изобретения по ее in vivo эффективности с применением ксенотрансплантатных моделей немелкоклеточного рака легкого SCID (тяжелая комбинированная иммунная недостаточность) у самцов мышей. Было отмечено, что ингибитор CDK синергически усиливал эффективность доксорубицина, когда вводился в последовательной комбинации с доксорубицином. Как видно из графического представления на фигурах 7а и 7b, фармацевтическая комбинация данного изобретения проявила терапевтически синергическую активность на ксенотрансплантатных моделях немелкоклеточного рака легкого SCID мышей.Xenograft models for extended in vitro observations of the in vivo system are also provided by the present invention. The present invention tested a combination of the present invention for its in vivo efficacy using xenograft models of non-small cell lung cancer SCID (severe combined immune deficiency) in male mice. It was noted that a CDK inhibitor synergistically enhanced the effectiveness of doxorubicin when administered in sequential combination with doxorubicin. As can be seen from the graphical representation in figures 7a and 7b, the pharmaceutical combination of the present invention showed therapeutically synergistic activity in xenograft models of non-small cell lung cancer SCID mice.
В параллельном in vitro исследовании, проведенном по данному изобретению, с применением комбинации, включающей традиционное цитотоксическое противоопухолевое средство, доксорубицин и другой известный ингибитор CDK, флавопиридол, в лечении человеческих линий клеток немелкоклеточной карциномы легкого Н-460, обнаружили, что комбинация доксорубицина и флавопиридола независимо от последовательности введения дает аддитивный эффект, а не синергизм (Таблица 16-А, В, С). Детали этого исследования продемонстрированы здесь ниже. Таким образом, нельзя с уверенностью сказать, что комбинация противораковых средств, обладающих различным механизмом действия, может всегда привести к благоприятным терапевтическим эффектам. Однако в данном изобретении четко продемонстрирована синергическая эффективность новой фармацевтической комбинации данного изобретения.In a parallel in vitro study of the invention using a combination comprising a conventional cytotoxic antitumor agent, doxorubicin and another known CDK inhibitor, flavopyridol, in the treatment of human non-small cell lung carcinoma cell lines H-460, it was found that the combination of doxorubicin and flavopiridol independently from the sequence of administration gives an additive effect, rather than synergism (Table 16-A, B, C). The details of this study are demonstrated here below. Thus, it is impossible to say with certainty that a combination of anti-cancer agents with a different mechanism of action can always lead to favorable therapeutic effects. However, the present invention clearly demonstrated the synergistic effectiveness of the new pharmaceutical combination of the present invention.
Синергический эффект комбинации данного изобретения, включающей цитотоксическое противоопухолевое средство и ингибитор CDK, будет объяснен более детально со ссылкой на его предпочтительные варианты осуществления. Следует отметить, что они представлены только как примеры и не предназначены ограничивать данное изобретение.The synergistic effect of a combination of the present invention comprising a cytotoxic antitumor agent and a CDK inhibitor will be explained in more detail with reference to its preferred embodiments. It should be noted that they are presented only as examples and are not intended to limit the invention.
Фармакологические испытанияPharmacological tests
In vitro испытание цитотоксичностиIn vitro cytotoxicity test
Используемое испытание цитотоксичности представляло собой испытание MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолиум, внутренняя соль). Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка в 180 µл культуральной среды в 96-луночный планшет и инкубировали в течение ночи, чтобы позволить клеткам прилипнуть. Варьирующие концентрации лекарственных средств, содержащихся в комбинации, добавили в лунки и инкубировали в течение соответствующего периода времени в увлажненном 5% СО2 инкубаторе при 37°С в случае воздействия отдельного лекарственного средства. При обработке двумя лекарственными средствами традиционное цитотоксическое противоопухолевое средство (паклитаксел, доцетаксел и доксорубицин) вводили в течение 3 часов или 24 часов с последующим удалением среды и промыванием клеток один раз средой. После промывания клеток две различные концентрации соединения А добавили в лунки и планшеты инкубировали в течение 48, 72 или 96 часов в увлажненном 5% СО2 инкубаторе при 37°С. Контрольные лунки обработали наполнителем. В конце периода инкубации среду удалили из лунок и добавили 20 µл MTS (2 мг/мл в фосфатном буфере, рН 6-6,5 и простерилизовали посредством фильтрации) и 1 µл феназин метосульфата (PMS, 3 мМ в фосфатном буфере, рН 7,3 и простерилизовали посредством фильтрации) в каждую лунку и полный объем отрегулировали до 200 µл полной средой. Планшет инкубировали в течение 2-4 часов в увлажненном 5% СО2 инкубаторе при 37°С. Планшет считывали при 490 нМ на спектрофотометре (SpectraMax, Molecular Devices); процент цитотоксичности и IC50 рассчитали с помощью программного обеспечения SoftMax для SpectraMax.The cytotoxicity test used was the MTS test (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium, internal salt). Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were plated at a density of 1,500 cells / well in 180 μl of culture medium in a 96-well plate and incubated overnight to allow the cells to adhere. Varying concentrations of the drugs contained in the combination were added to the wells and incubated for an appropriate period of time in a humidified 5% CO 2 incubator at 37 ° C when exposed to a single drug. When treated with two drugs, the traditional cytotoxic antitumor agent (paclitaxel, docetaxel and doxorubicin) was administered for 3 hours or 24 hours, followed by removal of the medium and washing the cells once with the medium. After washing the cells, two different concentrations of compound A were added to the wells and the plates were incubated for 48, 72 or 96 hours in a humidified 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Control wells were treated with vehicle. At the end of the incubation period, the medium was removed from the wells and 20 μl of MTS (2 mg / ml in phosphate buffer, pH 6-6.5 and sterilized by filtration) and 1 μl of phenazine methosulfate (PMS, 3 mm in phosphate buffer,
Пример 1Example 1
Этот пример показывает синергический эффект комбинации доксорубицина и соединения А, где доксорубицин и соединение А вводили последовательно, так что доксорубицин вводили до соединения А. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из двух лекарственных средств отдельно, то есть доксорубицином или соединением А отдельно. Обработка доксорубицином длилась сначала 24 часа, за ней последовала обработка полной средой в течение 72 часов, тогда как в случае соединения А сначала 24 часа в полной среде, а затем соединением А в течение следующих 72 часов. Используемые концентрации доксорубицина составляли 100 нМ и 200 нМ, тогда как соединение А использовали при концентрации 800 нМ (IC30 концентрация после 48-часовой обработки). При исследовании комбинации клетки сначала обработали 200 нМ или 100 нМ доксорубицина в течение сначала 24 часов, а затем 800 нМ соединения А в течение 72 часов. После завершения обработки лекарственными средствами, то есть в конце 96 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости, а процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты представлены в следующей Таблице 1.This example shows the synergistic effect of a combination of doxorubicin and compound A, where doxorubicin and compound A were administered sequentially so that doxorubicin was administered prior to compound A. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were seeded at a density of 1,500 cells / well. Cells were first treated with one of two drugs separately, that is, doxorubicin or compound A separately. Treatment with doxorubicin lasted 24 hours first, followed by treatment with complete medium for 72 hours, whereas in the case of compound A, first 24 hours in complete medium, and then with compound A for the next 72 hours. The concentrations of doxorubicin used were 100 nM and 200 nM, while compound A was used at a concentration of 800 nM (IC 30 concentration after 48 hours of treatment). In a combination study, cells were first treated with 200 nM or 100 nM doxorubicin for 24 hours at first, and then 800 nM of compound A for 72 hours. After completion of the drug treatment, that is, at the end of 96 hours, the plates were subjected to the MTS survival test, and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are presented in the following Table 1.
Пример 2Example 2
Этот пример показывает синергический эффект комбинации доксорубицина и соединения А, где доксорубицин и соединение А вводили последовательно, так что доксорубицин вводили до соединения А. В этом примере использовали соединение А при концентрации 1200 нМ. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из двух лекарственных средств отдельно, то есть доксорубицином или соединением А отдельно. Обрабатывали доксорубицином сначала в течение 24 часов, а затем полной средой в течение 72 часов, тогда как в случае соединения А сначала 24 часа в полной среде, а затем соединением А в течение следующих 72 часов. Концентрации используемого доксорубицина составили 200 нМ и 100 нМ, тогда как соединение А использовали при концентрации 1200 нМ (IC50 концентрация после 48-часовой обработки). В исследовании комбинации клетки сначала обработали 100 нМ или 200 нМ доксорубицина в течение 24 часов, а затем 1200 нМ соединения А в течение 72 часов. После завершения обработки лекарственными средствами, то есть в конце 96 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты представлены в следующей Таблице 2.This example shows the synergistic effect of the combination of doxorubicin and compound A, where doxorubicin and compound A were administered sequentially, so that doxorubicin was administered prior to compound A. In this example, compound A was used at a concentration of 1200 nM. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were seeded at a density of 1,500 cells / well. Cells were first treated with one of two drugs separately, that is, doxorubicin or compound A separately. It was treated with doxorubicin first for 24 hours, and then with complete medium for 72 hours, whereas in the case of compound A, first 24 hours in complete medium, and then with compound A for the next 72 hours. The concentrations of doxorubicin used were 200 nM and 100 nM, while compound A was used at a concentration of 1200 nM (IC 50 concentration after 48 hours of treatment). In a combination study, cells were first treated with 100 nM or 200 nM doxorubicin for 24 hours, and then 1200 nM of compound A for 72 hours. After completion of the drug treatment, that is, at the end of 96 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are presented in the following Table 2.
Пример 3Example 3
Этот пример показывает синергический эффект комбинации доксорубицина и соединения А, где доксорубицин и соединение А вводили последовательно, так что доксорубицин вводили до соединения А. В этом примере соединение А использовали при концентрации 1200 нМ, а период времени длился 96 часов. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из двух лекарственных средств отдельно, то есть доксорубицином или соединением А отдельно. Обработка доксорубицином длилась сначала в течение 24 часов, а затем полной средой в течение 96 часов, тогда как в случае соединения А сначала 24 часа в полной среде, а затем соединением А в течение следующих 96 часов. Использовали концентрации доксорубицина 100 нМ и 200 нМ, тогда как соединение А использовали при концентрации 1200 нМ (IC50 концентрация после 48-часовой обработки). В исследовании комбинации клетки сначала обработали 100 нМ или 200 нМ доксорубицина в течение 24 часов, а затем 1200 нМ соединения А в течение 96 часов. После завершения обработки лекарственными средствами, то есть в конце 120 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты представлены в следующей Таблице 3.This example shows the synergistic effect of a combination of doxorubicin and compound A, where doxorubicin and compound A were administered sequentially, so that doxorubicin was administered prior to compound A. In this example, compound A was used at a concentration of 1200 nM and the period of time was 96 hours. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were seeded at a density of 1,500 cells / well. Cells were first treated with one of two drugs separately, that is, doxorubicin or compound A separately. Treatment with doxorubicin lasted first for 24 hours, and then complete medium for 96 hours, whereas in the case of compound A, first 24 hours in complete medium, and then compound A for the next 96 hours. Doxorubicin concentrations of 100 nM and 200 nM were used, while Compound A was used at a concentration of 1200 nM (IC 50 concentration after 48 hours of treatment). In a combination study, cells were first treated with 100 nM or 200 nM doxorubicin for 24 hours, and then 1200 nM of compound A for 96 hours. After completing the drug treatment, that is, at the end of 120 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are presented in the following Table 3.
Пример 4Example 4
Этот пример показывает синергический эффект комбинации доксорубицина и соединения А, введенных одновременно в течение 120 часов. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из двух лекарственных средств отдельно, то есть доксорубицином или соединением А отдельно в течение 120 часов каждым. Использовали концентрации доксорубицина 30 нМ и 100 нМ, тогда как соединение А использовали при концентрации 800 нМ и 1200 нМ (~IC30 и ~IC50 концентрация после 48-часовой обработки). В исследовании этой комбинации 30 нМ или 100 нМ доксорубицина и 1200 нМ или 800 нМ соединения А соответственно добавили вместе в течение 120 часов. После завершения обработкой лекарственными средствами, то есть в конце 120 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты представлены в следующей Таблице 4.This example shows the synergistic effect of a combination of doxorubicin and compound A administered simultaneously for 120 hours. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were seeded at a density of 1,500 cells / well. Cells were first treated with one of two drugs separately, that is, doxorubicin or compound A separately for 120 hours each. Doxorubicin concentrations of 30 nM and 100 nM were used, while Compound A was used at a concentration of 800 nM and 1200 nM (~ IC 30 and ~ IC 50 concentration after 48-hour treatment). In a study of this combination, 30 nM or 100 nM doxorubicin and 1200 nM or 800 nM Compound A were respectively added together over 120 hours. After completion of the drug treatment, that is, at the end of 120 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are presented in the following Table 4.
Пример 5Example 5
Этот пример показывает, что нет синергического эффекта, когда соединение А вводили перед цитотоксическим противоопухолевым средством доксорубицином. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из двух лекарственных средств отдельно, то есть доксорубицином или соединением А отдельно. Обработали соединением А сначала в течение 96 часов, а затем полной средой в течение 24 часов, тогда как в случае доксорубицина сначала 96 часов в полной среде, а затем доксорубицином в течение 24 часов. Использовали концентрации доксорубицина 30 нМ, 70 нМ, 100 нМ и 200 нМ, тогда как соединение А использовали при концентрации 800 нМ и 1200 нМ (~IC30 и -IC50 концентрация после 48-часовой обработки). В этом исследовании комбинации добавили 1200 нМ или 800 нМ соединения А в течение сначала 96 часов, а затем 30 нМ, 70 нМ, 100 нМ или 200 нМ доксорубицина в течение 24 часов. После завершения обработки лекарственными средствами, то есть в конце 120 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Таблица 6 показывает, что процент цитотоксичности в этой комбинации ниже, чем цитотоксичность соединения А при введении отдельно. Поэтому этот эффект последовательности является антагонистическим, поскольку доксорубицин не потенцирует эффект первого лекарственного средства, которое является соединением А в этом случае. Результаты представлены в следующей Таблице 5.This example shows that there is no synergistic effect when compound A was administered before the cytotoxic antitumor agent doxorubicin. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were seeded at a density of 1,500 cells / well. Cells were first treated with one of two drugs separately, that is, doxorubicin or compound A separately. It was treated with compound A first for 96 hours and then with complete medium for 24 hours, whereas in the case of doxorubicin, first 96 hours in complete medium, and then with doxorubicin for 24 hours. Doxorubicin concentrations of 30 nM, 70 nM, 100 nM and 200 nM were used, whereas compound A was used at a concentration of 800 nM and 1200 nM (~ IC 30 and -IC 50 concentration after 48 hours of treatment). In this combination study, 1200 nM or 800 nM of compound A was added over a first 96 hours and then 30 nM, 70 nM, 100 nM or 200 nM doxorubicin over 24 hours. After completing the drug treatment, that is, at the end of 120 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. Table 6 shows that the percentage of cytotoxicity in this combination is lower than the cytotoxicity of compound A when administered alone. Therefore, this sequence effect is antagonistic, since doxorubicin does not potentiate the effect of the first drug, which is compound A in this case. The results are presented in the following Table 5.
Примеры 1-4 четко показывают, что ингибитор CDK синергически потенцирует эффект доксорубицина, когда ингибитор CDK вводят после или одновременно с цитотоксическим лекарственным средством. Пример 5 также показывает важность последовательного лечения. Лечение доксорубицином, за которым следует ингибитор CDK, оказывается синергическим, тогда как обратная последовательность не эффективна.Examples 1-4 clearly show that a CDK inhibitor synergistically potentiates the effect of doxorubicin when a CDK inhibitor is administered after or simultaneously with a cytotoxic drug. Example 5 also shows the importance of sequential treatment. Treatment with doxorubicin, followed by a CDK inhibitor, is synergistic, while the reverse sequence is not effective.
Пример 6Example 6
Этот пример показывает синергический эффект комбинации доцетаксела и соединения А, где доцетаксел и соединение А вводили последовательно, так что доцетаксел вводили до соединения А. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 3000 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из двух лекарственных средств отдельно, то есть доцетакселом или соединением А отдельно. Обрабатывали доцетакселом в течение сначала 3 часов, а затем полной средой в течение 45 часов, тогда как в случае обработки соединением А сначала 3 часа полной средой, а затем соединением А в течение следующих 45 часов. Использовали концентрации доцетаксела 0,1 нМ и 3 нМ, тогда как соединение А использовали при концентрации 700 нМ (~IC30 концентрация после 48-часовой обработки). В этом исследовании комбинации клетки сначала обработали 0,1 нМ или 3 нМ доцетаксела в течение 3 часов, а затем 700 нМ соединения А в течение 45 часов. После завершения обработки лекарственными средствами, то есть в конце 48 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты представлены в следующей Таблице 6.This example shows the synergistic effect of a combination of docetaxel and compound A, where docetaxel and compound A were administered sequentially, so that docetaxel was administered before compound A. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were seeded at a density of 3000 cells / well. Cells were first treated with one of two drugs separately, that is, docetaxel or compound A separately. It was treated with docetaxel for 3 hours first, and then with complete medium for 45 hours, whereas in the case of treatment with compound A, first 3 hours with complete medium, and then with compound A for the next 45 hours. Docetaxel concentrations of 0.1 nM and 3 nM were used, while Compound A was used at a concentration of 700 nM (~ IC 30 concentration after 48 hours of treatment). In this combination study, cells were first treated with 0.1 nM or 3 nM docetaxel for 3 hours, and then 700 nM Compound A for 45 hours. After completing the drug treatment, that is, at the end of 48 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are presented in the following Table 6.
Пример 7Example 7
Этот пример показывает синергический эффект комбинации доцетаксела и соединения А, где доцетаксел и соединение А вводили последовательно, так что доцетаксел вводили до соединения А. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 3000 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из двух лекарственных средств отдельно, то есть доцетакселом или соединением А отдельно. Обрабатывали доцетакселом в течение сначала 3 часов, а затем полной средой в течение 45 часов, тогда как в случае обработки соединением А сначала 3 часа полной средой, а затем соединением А в течение следующих 45 часов. Использовали концентрации доцетаксела 0,1 нМ и 3 нМ, тогда как соединение А использовали при концентрации 1000 нМ (~IC50 концентрация после 48-часовой обработки). В исследовании комбинации клетки сначала обработали 0,1 нМ или 3 нМ доцетаксела в течение 3 часов, а затем 1000 нМ соединения А в течение 45 часов. Планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты представлены в следующей Таблице 7.This example shows the synergistic effect of a combination of docetaxel and compound A, where docetaxel and compound A were administered sequentially, so that docetaxel was administered before compound A. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were seeded at a density of 3000 cells / well. Cells were first treated with one of two drugs separately, that is, docetaxel or compound A separately. It was treated with docetaxel for 3 hours first, and then with complete medium for 45 hours, whereas in the case of treatment with compound A, first 3 hours with complete medium, and then with compound A for the next 45 hours. Docetaxel concentrations of 0.1 nM and 3 nM were used, while compound A was used at a concentration of 1000 nM (~ IC 50 concentration after 48 hours of treatment). In a combination study, cells were first treated with 0.1 nM or 3 nM docetaxel for 3 hours, and then 1000 nM of compound A for 45 hours. The tablets were tested for MTS survival and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are presented in the following Table 7.
Пример 8Example 8
Этот пример показывает синергический эффект комбинации паклитаксела и соединения А, где паклитаксел и соединение А вводили последовательно, так что паклитаксел вводили до соединения А. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из двух лекарственных средств отдельно, то есть паклитакселом или соединением А отдельно. Обрабатывали паклитакселом в течение сначала 3 часов, а затем полной средой в течение 45 часов, тогда как в случае обработки соединением А сначала 3 часа полной средой, а затем соединением А в течение следующих 45 часов. Концентрации используемого паклитаксела составляли 10 нМ, тогда как соединение А использовали при концентрации 700 нМ (~IC30 концентрация после 48-часовой обработки). В исследовании комбинации клетки сначала обработали 10 нМ паклитаксела в течение 3 часов, а затем 700 нМ соединения А в течение 45 часов. После завершения обработки лекарственными средствами, то есть в конце 48 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты представлены в следующей Таблице 8.This example shows the synergistic effect of a combination of paclitaxel and compound A, where paclitaxel and compound A were administered sequentially, so that paclitaxel was administered prior to compound A. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were plated at a density of 1,500 cells / well. Cells were first treated with one of two drugs separately, that is, paclitaxel or compound A separately. It was treated with paclitaxel for 3 hours first and then complete medium for 45 hours, whereas in the case of treatment with compound A, first 3 hours with complete medium and then compound A for the next 45 hours. The concentrations of paclitaxel used were 10 nM, while compound A was used at a concentration of 700 nM (~ IC 30 concentration after 48 hours of treatment). In a combination study, cells were first treated with 10 nM paclitaxel for 3 hours, and then 700 nM compound A for 45 hours. After completing the drug treatment, that is, at the end of 48 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are presented in the following Table 8.
Пример 9Example 9
Этот пример показывает синергический эффект комбинации гемцитабина и соединения А, где гемцитабин и соединение А вводили последовательно, так что гемцитабин вводили до соединения А. Клетки из человеческой клеточной линии поджелудочной железы (Panc-1) высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из двух лекарственных средств отдельно, то есть гемцитабином или соединением А отдельно. Обрабатывали гемцитабином в течение сначала 24 часов, а затем полной средой в течение 72 часов. Тогда как в случае обработки соединением А сначала 24 часа полной средой, а затем соединением А в течение следующих 72 часов. Гемцитабин использовали при концентрации 70 нМ, тогда как соединение А использовали при концентрации 300 нМ (~IC30 концентрация после 48-часовой обработки). В исследовании комбинации клетки сначала обработали 70 нМ гемцитабина в течение 24 часов, а затем 300 нМ соединения А в течение 72 часов. После завершения обработки лекарственными средствами, то есть в конце 96 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты представлены в следующей Таблице 9.This example shows the synergistic effect of the combination of gemcitabine and compound A, where gemcitabine and compound A were administered sequentially, so that gemcitabine was administered prior to compound A. Cells from the human pancreatic cell line (Panc-1) were seeded at a density of 1,500 cells / well. Cells were first treated with one of two drugs separately, i.e. gemcitabine or compound A separately. Treated with gemcitabine for a first 24 hours and then complete medium for 72 hours. Whereas in the case of treatment with compound A, first 24 hours with complete medium, and then with compound A over the next 72 hours. Gemcitabine was used at a concentration of 70 nM, while compound A was used at a concentration of 300 nM (~ IC 30 concentration after 48 hours of treatment). In a combination study, cells were first treated with 70 nM gemcitabine for 24 hours, and then 300 nM Compound A for 72 hours. After completion of the drug treatment, that is, at the end of 96 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are presented in the following Table 9.
часа), за которым следует ингибитор CDK (соединение А) (72 часа)Gemcitabine (24
hours) followed by a CDK inhibitor (compound A) (72 hours)
Анализ распределения клеточного цикла и проточной цитометрииAnalysis of cell cycle distribution and flow cytometry
Человеческую немелкоклеточную карциному легкого Н-460 высеяли в 25 мм3 колбы с культурой ткани. Через 24 часа клетки обработали соединением А отдельно в течение 72 часов или 96 часов и цитотоксическим противоопухолевым средством доксорубицином отдельно в течение 24 часов. Для исследования комбинации клетки обработали сначала цитотоксическим противоопухолевым средством доксорубицином в течение 24 часов, а затем соединением А в течение 72 часов или 96 часов после удаления цитотоксического противоопухолевого средства и промывания клеток дважды PBS (фосфатным буферным раствором). Контрольные клетки оставили необработанными в течение 96 часов или 120 часов. И отдельные, и прилипшие клетки собрали в различные точки времени. Клетки промыли дважды приблизительно 5 мл PBS с центрифугированием при 1000 rpm (оборотов в минуту) в течение 10 минут. Клетки повторно суспендировали в 500 µл PBS и фиксировали в 500 µл охлажденного до 0°С 70% этанола. Фиксированные клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут, вращали при 1000 rpm в течение 10 минут. К клеточному осадку добавили 1 мл охлажденного 70% этанола и затем клеточный осадок держали в холоде до следующего анализа. Клетки промыли дважды PBS для удаления фиксажа и повторно суспендировали в 250 µл PBS. К ним добавили 50 µл пропидий йодида (4 мг/мл d PBS) и 12,5 µл РНКазы А (1 мг/мл). После инкубации при 37°С в течение 30 минут клетки анализировали с помощью проточной цитометрии.Human non-small cell lung carcinoma H-460 was seeded in 25 mm 3 tissue culture flasks. After 24 hours, the cells were treated with compound A separately for 72 hours or 96 hours and the cytotoxic antitumor agent doxorubicin separately for 24 hours. To study the combination, the cells were first treated with a cytotoxic antitumor agent doxorubicin for 24 hours, and then with compound A for 72 hours or 96 hours after removal of the cytotoxic antitumor agent and washing the cells twice with PBS (phosphate buffered saline). Control cells were left untreated for 96 hours or 120 hours. Both individual and adherent cells were collected at different points in time. Cells were washed twice with approximately 5 ml PBS centrifuged at 1000 rpm (rpm) for 10 minutes. Cells were resuspended in 500 μl of PBS and fixed in 500 μl of 70% ethanol cooled to 0 ° C. Fixed cells were incubated at room temperature for 30 minutes, rotated at 1000 rpm for 10 minutes. 1 ml of chilled 70% ethanol was added to the cell pellet, and then the cell pellet was kept cold until the next analysis. Cells were washed twice with PBS to remove fixative and resuspended in 250 μl of PBS. To them were added 50 μl of propidium iodide (4 mg / ml d PBS) and 12.5 μl of RNase A (1 mg / ml). After incubation at 37 ° C for 30 minutes, the cells were analyzed by flow cytometry.
Использовали проточный цитометр Becton Dickinson FACS Calibur согласно рекомендациям производителя. Использовали установку лазер на ионах аргона при 488 нм как источник возбуждения. Клетки с содержанием ДНК между 2n и 4n были определены как находящиеся в фазах G1, S и G2/M клеточного цикла, как определили уровнем красной флуоресценции. Клетки, обладающие содержанием ДНК менее чем 2n, обозначили как суб-G1 клетки. Число клеток в каждом отделении клеточного цикла выразили как процент полного числа присутствующих клеток.A Becton Dickinson FACS Calibur flow cytometer was used according to the manufacturer's recommendations. An argon ion laser at 488 nm was used as an excitation source. Cells with a DNA content between 2n and 4n were identified as being in the G1, S, and G2 / M phases of the cell cycle, as determined by the level of red fluorescence. Cells with a DNA content of less than 2n were designated as sub-G 1 cells. The number of cells in each compartment of the cell cycle was expressed as a percentage of the total number of cells present.
Пример 10Example 10
Этот пример дает распределение клеточного цикла для различных обработок, как показано на фигуре 1. Около 1-2×106 клеток высеяли в колбу с культурой ткани для групп обработки. Протокол испытания был таким же, как упомянуто выше в "Анализ распределения клеточного цикла и проточная цитометрия". Клеточный цикл разделили на четыре части, которые представлены на фигуре 1 как M1, M2, М3 и М4. M1 соответствует G1 фазе, M2 - S фазе, М3 - G2-M фазе, а М4 - суб-G1 фазе, которая представляет клетки, подвергающиеся апоптозу. 96-часовый контроль, где не было обработки лекарственным средством, показал незначительный апоптоз только 2%, тогда как группа обработки любым лекарственным средством отдельно показала только 10% апоптоз и для соединения А, и для доксорубицина отдельно. Комбинация обоих лекарственных средств показала повышенный апоптоз 34%.This example gives the distribution of the cell cycle for various treatments, as shown in Figure 1. About 1-2 × 10 6 cells were seeded into a tissue culture flask for treatment groups. The test protocol was the same as mentioned above in "Analysis of the distribution of the cell cycle and flow cytometry." The cell cycle was divided into four parts, which are represented in figure 1 as M1, M2, M3 and M4. M1 corresponds to G1 phase, M2 to S phase, M3 to G2-M phase, and M4 to sub-G1 phase, which represents cells undergoing apoptosis. The 96-hour control, where there was no drug treatment, showed insignificant apoptosis of only 2%, while the treatment group with any drug alone showed only 10% apoptosis for both compound A and doxorubicin separately. The combination of both drugs showed increased apoptosis of 34%.
Пример 11Example 11
Этот пример дал распределение клеточного цикла для различных групп обработки, как показано на фигуре 2. Около 1-2×106 клеток высеяли в колбу с культурой ткани для групп обработки. Протокол испытания был таким же, как упомянуто выше в "Анализ распределения клеточного цикла и проточная цитометрия". Клеточный цикл разделили на четыре части, которые представлены на фигуре как M1, M2, М3 и М4. M1 соответствует G1 фазе, M2 - S фазе, М3 - G2-M фазе, а М4 -суб-G1 фазе, которая представляет клетки, подвергающиеся апоптозу. 120-часовый контроль, где не было обработки лекарственным средством, показал незначительный апоптоз только 8%, тогда как группа обработки любым лекарственным средством отдельно показала 32% и 3% апоптоз для соединения А и доксорубицина соответственно. Комбинация обоих лекарственных средств показала повышенный апоптоз 65%.This example gave the distribution of the cell cycle for different treatment groups, as shown in Figure 2. About 1-2 × 10 6 cells were seeded into a tissue culture flask for treatment groups. The test protocol was the same as mentioned above in "Analysis of the distribution of the cell cycle and flow cytometry." The cell cycle was divided into four parts, which are represented in the figure as M1, M2, M3 and M4. M1 corresponds to G1 phase, M2 to S phase, M3 to G2-M phase, and M4 to sub-G1 phase, which represents cells undergoing apoptosis. The 120-hour control, where there was no drug treatment, showed insignificant apoptosis of only 8%, while the drug treatment group alone showed 32% and 3% apoptosis for compound A and doxorubicin, respectively. The combination of both drugs showed increased apoptosis of 65%.
Пример 12Example 12
Этот пример дал распределение клеточного цикла для различных групп обработки, как показано на фигуре 3. Около 1-2х106 клеток высеяли в колбу с культурой ткани для групп обработки. Протокол испытания был таким же, как упомянуто выше в "Анализ распределения клеточного цикла и проточная цитометрия". Клеточный цикл разделили на четыре части, которые представлены на фигуре как M1, М2, М3 и М4. M1 соответствует G1 фазе, М2 - S фазе, М3 - G2-M фазе, а М4 - суб-G1 фазе, которая представляет клетки, подвергающиеся апоптозу. 96-часовый контроль, где не было обработки лекарственным средством, показал незначительный апоптоз только 2,1%, тогда как группа обработки любым лекарственным средством отдельно показала 4,3% и 1,7% апоптоз для соединения А и гемцитабина соответственно. Комбинация обоих лекарственных средств показала повышенный апоптоз 25,4%.This example gave the distribution of the cell cycle for different treatment groups, as shown in Figure 3. About 1-2x10 6 cells were seeded into a tissue culture flask for treatment groups. The test protocol was the same as mentioned above in "Analysis of the distribution of the cell cycle and flow cytometry." The cell cycle was divided into four parts, which are represented in the figure as M1, M2, M3 and M4. M1 corresponds to G1 phase, M2 to S phase, M3 to G2-M phase, and M4 to sub-G1 phase, which represents cells undergoing apoptosis. The 96-hour control, where there was no drug treatment, showed slight apoptosis of only 2.1%, while the treatment group with any drug alone showed 4.3% and 1.7% apoptosis for compound A and gemcitabine, respectively. The combination of both drugs showed increased apoptosis of 25.4%.
Пример 13Example 13
Окрашивание аннексином V-FITC (для определения раннего апоптоза)V-FITC annexin staining (for early apoptosis)
Аннексии V-FITC (флуоресцинизотиоцианат) является чувствительной пробой для идентификации апоптических клеток. Во время раннего апоптоза мембранный фосфолипидный фосфотидил серии (PS) перемещается от внутреннего к внешнему листу плазматической мембраны, тем самым PS подвергается внешней клеточной окружающей среде. Аннексин V является 35-36 кДа кальций фосфолипид связывающим белком, который обладает высокой аффинностью к PS и связывается с клетками с открытым PS. Пропидий йодид (PI) представляет собой полярный краситель, который входит в клетки через неплотные мембраны и, следовательно, используется в сочетании с FITC для определения позднего апоптоза.The annexation of V-FITC (fluorescein isothiocyanate) is a sensitive probe for the identification of apoptotic cells. During early apoptosis, the membrane phospholipid phosphotidyl series (PS) moves from the inner to the outer sheet of the plasma membrane, thereby exposing the PS to the external cellular environment. Annexin V is a 35-36 kDa calcium phospholipid binding protein that has high affinity for PS and binds to open PS cells. Propidium iodide (PI) is a polar dye that enters cells through loose membranes and is therefore used in combination with FITC to detect late apoptosis.
Человеческую немелкоклеточную карциному легкого Н-460 высеяли в 25 мм3 колбы с культурой ткани. Через 24 часа клетки обработали 1200 нМ соединения А или 100 нМ доксорубицина отдельно в течение 96 часов и 24 часов соответственно. Для исследования комбинации клетки обработали сначала 100 нМ цитотоксического противоопухолевого средства доксорубицина в течение 24 часов, а затем 1200 нМ соединения А в течение 96 часов после удаления цитотоксического противоопухолевого средства (доксорубицина) и промывания клеток один раз средой. Контрольные клетки оставили необработанными в течение 120 часов. Плавающие в среде клетки собрали и объединили с прилипшими клетками после сбора с трипсином в различные моменты времени. Клетки промыли дважды холодным PBS с центрифугированием при 1000 rpm в течение 10 минут. Клеточный осадок повторно суспендировали в IX связывающем буфере (10 мм HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновая кислота), рН 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2) при концентрации 1×106 клетки/мл. 100 µл раствора (1×105 клеток) окрасили аннексином V-FITC и пропидий йодидом. Клетки инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте и образец анализировали проточной цитометрией.Human non-small cell lung carcinoma H-460 was seeded in 25 mm 3 tissue culture flasks. After 24 hours, cells were treated with 1200 nM of compound A or 100 nM of doxorubicin separately for 96 hours and 24 hours, respectively. To study the combination, the cells were first treated with 100 nM of the cytotoxic antitumor agent Doxorubicin for 24 hours, and then 1200 nM of compound A for 96 hours after removal of the cytotoxic antitumor agent (Doxorubicin) and washing the cells once with medium. Control cells were left untreated for 120 hours. Cells floating in the medium were harvested and combined with adherent cells after harvesting with trypsin at various points in time. Cells were washed twice with cold PBS centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. The cell pellet was resuspended in IX binding buffer (10 mm HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid), pH 7.4, 140 mm NaCl, 2.5 mm CaCl 2 ) at a concentration of 1 × 10 6 cells /
Использовали проточный цитометр Becton Dickinson FACS Calibur согласно рекомендациям производителя. Использовали установку лазер на ионах аргона при 488 нм как источник возбуждения. Фигура 4 показывает распределение клеток на четыре квадрата. Квадрат I, расположенный в нижнем левом углу (LL), показывает клетки, негативные по FITC и PI, что свидетельствует о том, что они являются здоровыми. Квадрат II, расположенный в нижнем правом углу (LR), показывает клетки, которые позитивны только по PI, что свидетельствует о том, что они полностью апоптические. Квадрат III в верхнем правом углу (UR) показывает клетки, которые позитивны и по аннексину, и PI, что свидетельствует о том, что они переходят от раннего апоптоза в поздний апоптоз. Квадрат IV в верхнем левом углу (UL) показывает, что клетки позитивны только по аннексину, что свидетельствует о том, что они находятся в раннем апоптозе.A Becton Dickinson FACS Calibur flow cytometer was used according to the manufacturer's recommendations. An argon ion laser at 488 nm was used as an excitation source. Figure 4 shows the distribution of cells into four squares. Square I, located in the lower left corner (LL), shows FITC and PI negative cells, indicating that they are healthy. Square II, located in the lower right corner (LR), shows cells that are positive only for PI, indicating that they are completely apoptotic. Square III in the upper right corner (UR) shows cells that are positive for both annexin and PI, indicating that they are transitioning from early apoptosis to late apoptosis. Square IV in the upper left corner (UL) indicates that cells are positive for annexin only, indicating that they are in early apoptosis.
Если клетки, даже после прекращения воздействия соединения, продолжают входить в апоптоз, они будут положительно окрашены аннексином. Клетки один раз в раннем апоптозе подвергнуты программированной клеточной смерти и в точке необратимости. Результаты указаны в Таблице 10. Было установлено, что самый высокий процент клеток в комбинации находятся или в раннем, или в раннем - позднем апоптозе по сравнению с любым лекарственным средством отдельно.If cells, even after cessation of exposure to the compound, continue to enter apoptosis, they will be positively stained with annexin. Cells once in early apoptosis underwent programmed cell death and at the point of irreversibility. The results are shown in Table 10. It was found that the highest percentage of cells in combination are either in early or in early - late apoptosis compared to any drug alone.
Пример 14Example 14
Клоногенное испытаниеClonogenic test
Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого (Н-460) высеяли с плотностью 750-1000 клеток на 35 мм планшет для культуры ткани. Инкубировали в течение ночи при 37°С для прикрепления клеток к планшету. Клетки обработали цитотоксическим противоопухолевым средством в течение 24 часов с последующим промыванием клеток и добавлением свежей среды, включающей соединение А, в течение 96 часов. В конце обработки среду снова заменили свежей полной средой, включающей 10% FCS, и инкубировали в течение 7-14 дней для формирования колоний. Как только на планшете появились видимые колонии, среду удалили, а колонии фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 2:1 в течение 5 минут. Планшеты промыли водой и повторили процедуру фиксации. Планшеты высушили и колонии окрасили 0,1% кристаллическим фиолетовым красителем в течение 3-5 минут. Планшеты осторожно ополоснули водой, высушили и колонии сосчитали на Geldoc.Human non-small cell lung carcinoma (H-460) cells were seeded at a density of 750-1000 cells per 35 mm tissue culture plate. Incubated overnight at 37 ° C to attach cells to the plate. The cells were treated with a cytotoxic antitumor agent for 24 hours, followed by washing the cells and adding fresh medium, including compound A, for 96 hours. At the end of the treatment, the medium was again replaced with fresh, complete medium containing 10% FCS and incubated for 7-14 days to form colonies. As soon as visible colonies appeared on the plate, the medium was removed, and the colonies were fixed with a mixture of methanol and acetic acid in a ratio of 2: 1 for 5 minutes. The plates were washed with water and the fixing procedure was repeated. The plates were dried and the colonies were stained with 0.1% crystal violet dye for 3-5 minutes. The plates were carefully rinsed with water, dried, and the colonies were counted on Geldoc.
Клетки обработали 1200 нМ соединения А или 100 нМ доксорубицина отдельно в течение 96 часов и 24 часов соответственно или в комбинации 100 нМ доксорубицина, за которым следует 1200 нМ соединения А, в течение 96 часов. Фигура 5 показывает синергический эффект комбинации, поскольку только одна колония была видна в комбинации по сравнению с контролем или любым из лекарственных средств отдельно.Cells were treated with 1200 nM of compound A or 100 nM of doxorubicin separately for 96 hours and 24 hours, respectively, or in a combination of 100 nM of doxorubicin, followed by 1200 nM of compound A, for 96 hours. Figure 5 shows the synergistic effect of the combination, since only one colony was visible in combination compared to control or any of the drugs separately.
Эксперименты восстановления после леченияPost-Treatment Recovery Experiments
Протокол испытания для обработки клеток соединением А и доксорубицином отдельно или в комбинации был таким же, как описано в анализе распределения клеточного цикла. После обработки лекарственным средством клеткам позволили восстановиться в свежей полной среде, включающей 10% FCS. Клетки при восстановлении анализировали с помощью FACS при 0-, 6-, 18-, 24- и 48-часовых моментах времени для обработки любым лекарственным средством отдельно и комбинацией. В следующих примерах восстановление клеток представлено процентом клеток, подвергающихся апоптозу.The test protocol for treating cells with compound A and doxorubicin alone or in combination was the same as described in the analysis of the distribution of the cell cycle. After treatment with the drug, the cells were allowed to recover in fresh, complete medium, including 10% FCS. Cells during recovery were analyzed using FACS at 0-, 6-, 18-, 24- and 48-hour time points for treatment with any drug separately and in combination. In the following examples, cell repair is represented by the percentage of cells undergoing apoptosis.
Пример 15Example 15
Клетки обработали только цитотоксическим противоопухолевым средством доксорубицином в течение 24 часов с последующим удалением среды и замещением свежей полной средой. FACS анализ выполнили, как описание в способе, установленном для определения процента клеток, подвергающихся апоптозу во время периода восстановления после окончания обработки лекарственным средством. Апоптоз определяли в 0, 6, 18, 24 и 48 часов во время периода восстановления. В конце 24 часов обработки лекарственным средством процент апоптоза составлял 3%, который во время периода восстановления значительно не увеличился, указывая, что клетки в конечном итоге восстановились от обработки лекарственным средством. Результаты показаны в Таблице 11.Cells were treated only with the cytotoxic antitumor agent doxorubicin for 24 hours, followed by removal of the medium and replacement with fresh complete medium. FACS analysis was performed as described in the method established for determining the percentage of cells undergoing apoptosis during the recovery period after the end of drug treatment. Apoptosis was determined at 0, 6, 18, 24, and 48 hours during the recovery period. At the end of 24 hours of drug treatment, the percentage of apoptosis was 3%, which did not increase significantly during the recovery period, indicating that the cells eventually recovered from the drug treatment. The results are shown in Table 11.
Пример 16Example 16
Испытание выполнили, как описано в протоколе. Клетки обработали только соединением А в течение 96 часов с последующим удалением среды и замещением свежей полной средой. FACS анализ выполнили, как описано в способе, позволяющем определить процент клеток, подвергающихся апоптозу во время периода восстановления после окончания обработки лекарственным средством. Апоптоз определили в 0, 6, 18, 24 и 48 часов во время периода восстановления. В конце 96 часов обработки лекарственным средством процент апоптоза составил 32%, который во время периода восстановления снизился от 24% до 19% в конце 48 часов восстановления, показывая, что клетки постепенно восстанавливаются при увеличении периода восстановления. Результаты показаны в Таблице 12.The test was performed as described in the protocol. Cells were treated only with Compound A for 96 hours, followed by removal of the medium and substitution with fresh complete medium. FACS analysis was performed as described in the method, which allows to determine the percentage of cells undergoing apoptosis during the recovery period after the end of drug treatment. Apoptosis was determined at 0, 6, 18, 24, and 48 hours during the recovery period. At the end of 96 hours of drug treatment, the percentage of apoptosis was 32%, which during the recovery period decreased from 24% to 19% at the end of 48 hours of recovery, indicating that the cells are gradually recovering with an increase in the recovery period. The results are shown in Table 12.
Пример 17Example 17
Испытание выполнили, как описано в протоколе. Клетки обработали доксорубицином в течение 24 часов, а затем соединением А в течение 96 часов с последующим удалением среды и замещением свежей полной средой. FACS анализ выполнили, как описано в способе, позволяющем определить процент клеток, подвергающихся апоптозу во время периода восстановления после окончания обработки лекарственным средством. Апоптоз определяли в 0, 6, 18, 24 и 48 часов во время периода восстановления. В конце обработки лекарственным средством процент апоптоза составлял 55%. Во время периода восстановления дополнительные 32% вошли в апоптоз в конце 6 часов, которые повысились до 57% в конце 48 часов восстановления, показывая, что клетки не восстановились, а вместо этого продолжают входить в апоптоз во время периода восстановления. Результаты показаны в Таблице 13.The test was performed as described in the protocol. Cells were treated with doxorubicin for 24 hours, and then with compound A for 96 hours, followed by removal of the medium and replacement with fresh complete medium. FACS analysis was performed as described in the method, which allows to determine the percentage of cells undergoing apoptosis during the recovery period after the end of the drug treatment. Apoptosis was determined at 0, 6, 18, 24, and 48 hours during the recovery period. At the end of the drug treatment, the apoptosis percentage was 55%. During the recovery period, an additional 32% entered apoptosis at the end of 6 hours, which rose to 57% at the end of 48 hours of recovery, indicating that the cells did not recover, but instead continued to enter apoptosis during the recovery period. The results are shown in Table 13.
Пример 18Example 18
Анализ вестерн-блоттингаWestern blot analysis
Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого (Н-460) были необработанными, то есть контрольными клетками, или обработанными 100 нМ доксорубицина отдельно в течение 24 часов или 1200 нМ соединения А отдельно в течение 96 часов. В обработке комбинацией клетки сначала обработали 100 нМ доксорубицина в течение 24 часов, а затем 1200 нМ соединения А в течение 96 часов. В конце периода обработки клетки лизировали и оценили содержание белка лизата с помощью реагента Брэдфорда. 40 µг белка загрузили в SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и перенесли на PVDF (поливинилиденфторидную) мембрану. Мембраны испытали с помощью р53, Вах, Вс1-2, циклин Dl, Cdk1 и актин антител. Первичное антитело определяют вторичным антителом с пероксидазой хрена и подвергают реагентам west pico хемилюминесценции.Human non-small cell lung carcinoma (H-460) cells were untreated, that is, control cells, or treated with 100 nM doxorubicin alone for 24 hours or 1200 nM compound A alone for 96 hours. In the combination treatment, the cells were first treated with 100 nM doxorubicin for 24 hours, and then 1200 nM of compound A for 96 hours. At the end of the treatment period, the cells were lysed and the lysate protein content was evaluated using Bradford's reagent. 40 μg of protein was loaded onto SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) and transferred onto a PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane. The membranes were tested using p53, Bax, Bc1-2, cyclin Dl, Cdk1 and actin antibodies. The primary antibody is detected with a horseradish peroxidase secondary antibody and chemiluminescence west pico reagents.
Фигура 6 показывает анализ вестерн-блоттинга различных белков, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и апоптоз. Равное количество белка загрузили в четыре полосы. Различные образцы, загруженные в лунки, описаны в подписях на фигуре. Результаты показывают, что противоапоптический белок Bcl-2 был существенно подавлен в обработке комбинацией по сравнению с любым лекарственным средством отдельно, что было почти эквивалентно контролю. Это коррелирует с повышенным апоптозом, наблюдаемым в обработке комбинацией в FACS анализе. Проапоптический белок Вах слегка активирован по отношению к контролю во всех обработанных образцах. Белок - супрессор опухолевого роста р53 был существенно активирован в обработке комбинацией по сравнению с контролем, но не так сильно, как в других двух группах обработки. Cdkl-B1 является инициатором митоза. Дерегулирование этого фермента ведет к онкогенезу. Таким образом, ингибирование Cdk1 будет ингибировать его активность и, следовательно, инициацию митоза и клеточной пролиферации. Фигура показывает, что доксорубицин существенно индуцирует уровни Cdkl, тогда как добавление соединения А понижает Cdkl до незначительных уровней, таким образом, предотвращая клетки от вхождения в митоз. Соединение А отдельно показало уровни, равные контролю. Уровни циклина D1 не показали существенного изменения в различных группах обработки. В обработке комбинацией уровни были эквивалентны контролю, тогда как с соединением А и доксорубицином отдельно наблюдалось незначительное снижение в уровнях.6 shows a Western blot analysis of various proteins involved in cell cycle regulation and apoptosis. An equal amount of protein was loaded into four bands. Various samples loaded into the wells are described in the captions on the figure. The results show that the anti-apoptotic protein Bcl-2 was significantly suppressed in combination treatment compared to any drug alone, which was almost equivalent to control. This correlates with the increased apoptosis observed in combination treatment in the FACS analysis. The proapoptotic protein Bax is slightly activated relative to the control in all treated samples. The p53 tumor suppressor protein was significantly activated in the combination treatment compared to the control, but not as much as in the other two treatment groups. Cdkl-B1 is the initiator of mitosis. Deregulation of this enzyme leads to oncogenesis. Thus, inhibition of Cdk1 will inhibit its activity and, therefore, the initiation of mitosis and cell proliferation. The figure shows that doxorubicin significantly induces Cdkl levels, while the addition of compound A lowers Cdkl to insignificant levels, thus preventing cells from entering mitosis. Compound A separately showed levels equal to control. Cyclin D1 levels did not show a significant change in the various treatment groups. In the combination treatment, the levels were equivalent to control, while with compound A and doxorubicin, a slight decrease in levels was separately observed.
Пример 19Example 19
Этот пример показывает in vivo тестирование эффективности комбинации доксорубицина и ингибитора CDK, соединения А, на немелкоклеточного легкого (Н-460) ксенотрансплантатной модели.This example shows in vivo testing of the efficacy of a combination of doxorubicin and a CDK inhibitor, compound A, in a non-small cell lung (H-460) xenograft model.
Для исследования использовали человеческую клеточную линию немелкоклеточной карциномы легкого (Н-460), полученную из американской коллекции типовых культур (АТСС). Доксорубицин и соединение А для i.p.(внутриперитонеального) введения получили путем растворения соединений в солевом растворе.For the study, we used the human cell line of non-small cell lung carcinoma (H-460), obtained from the American Type Culture Collection (ATCC). Doxorubicin and compound A for i.p. (intraperitoneal) administration were obtained by dissolving the compounds in saline.
Использовали группу 36 самцов мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом SCID, весом ~20 г возрастом 6-8 недель.Used a group of 36 male mice with severe combined immunodeficiency SCID, weighing ~ 20 g, age 6-8 weeks.
Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого (Н-460) выращивали на среде RPMI 1640, включающей 10% фетальной телячьей сыворотки в 5% СО2 инкубаторе при 37°С. Клетки осадили центрифугированием при 1000 rpm в течение 10 минут. Клетки повторно суспендировали в солевом растворе до получения количества 25×106 клеток на мл, 0,2 мл этой клеточной суспензии инъецировали подкожным (s.c.) путем SCID мышам. Мышей осматривали через день на предмет пальпируемой опухолевой массы. Как только размер опухоли достиг 5-7 мм в диаметре, животных рандомизировали на группы соответствующего лечения, как показано в следующей Таблице 14. Доксорубицин вводили один раз каждую неделю, а соединение А вводили один раз каждый день в течение 5 дней, как показано в Таблице 15. Сначала вводили дозу доксорубицина, а затем соединения А с интервалом 6 часов с последующим соединением А ежедневно периодом пять дней, что заключало в себе один цикл. После двухдневного перерыва должен был начинаться следующий цикл. Лечение включало всего 2 цикла. Ежедневно регистрировали вес тела. Размер опухоли и другие признаки токсичности регистрировали через день. Не наблюдалась значительная потеря веса или признаки заболеваемости. Вес опухоли (мг) оценивали по формуле для удлиненного элипсоида: {Длина (мм)×[ширина (мм)2]×0,5}, принимая удельный вес за единицу, а π за тройку. Рост опухоли у обработанных соединением животных рассчитали как Т/С (обработка/контроль)×100%, а процент ингибирования роста (GI%) составлял [100-Т/С%]. Результаты представлены графически на фигурах 7а, 7b, 8 и 9.Human non-small cell lung carcinoma (H-460) cells were grown on RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Cells were pelleted by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes. Cells were resuspended in saline until 25 × 10 6 cells per ml were obtained, 0.2 ml of this cell suspension was injected subcutaneously (sc) by SCID mice. Mice were examined every other day for palpable tumor mass. Once the tumor size reached 5-7 mm in diameter, the animals were randomized to the appropriate treatment groups, as shown in the following Table 14. Doxorubicin was administered once every week, and compound A was administered once every day for 5 days, as shown in Table 15. First, a dose of doxorubicin was administered, followed by compound A at intervals of 6 hours, followed by compound A daily for a period of five days, which included one cycle. After a two-day break, the next cycle was to begin. The treatment included only 2 cycles. Daily recorded body weight. Tumor size and other signs of toxicity were recorded every other day. No significant weight loss or signs of morbidity were observed. Tumor weight (mg) was estimated by the formula for an elongated ellipsoid: {Length (mm) × [width (mm) 2 ] × 0.5}, taking the specific gravity as a unit, and π as a triple. Tumor growth in compound-treated animals was calculated as T / C (treatment / control) × 100%, and the growth inhibition percentage (GI%) was [100-T / C%]. The results are presented graphically in figures 7a, 7b, 8 and 9.
М, Т, W, Т и F: дни недели (Monday, Tuesday, Wednesday, Thursday и Friday)
">" показывает, что доксорубицин вводят до соединения А.S - saline, P - compound A, D - doxorubicin.
M, T, W, T, and F: days of the week (Monday, Tuesday, Wednesday, Thursday, and Friday)
">" indicates that doxorubicin is administered prior to compound A.
Пример 20Example 20
Анализ вестерн-блоттинга с помощью СОХ-2 антителаWestern blot analysis using COX-2 antibody
Фигура 9 показывает анализ вестерн-блоттинга с помощью СОХ-2 антитела. Различные образцы, загруженные в лунки, показаны в подписях на фигуре. Результаты показывают, что:Figure 9 shows the analysis of Western blotting using COX-2 antibodies. Various samples loaded into the wells are shown in the captions on the figure. The results show that:
- Контроль показал базальные уровни СОХ-2, которые являются низкими.- The control showed basal levels of COX-2, which are low.
- Соединение А отдельно также показало низкие уровни СОХ-2.- Compound A alone also showed low levels of COX-2.
- Доксорубицин сильно индуцировал СОХ-2, который отвечает за хемоневосприимчивость через путь NFκB сигнализации.- Doxorubicin strongly induced COX-2, which is responsible for chemo-susceptibility via the NFκB signaling pathway.
- Добавление соединения А после доксорубицина существенно подавляло СОХ-2.- The addition of compound A after doxorubicin significantly inhibited COX-2.
Таким образом, опосредованное NFκB ингибирование СОХ-2 соединением А могло быть включено в супрессию роста опухоли и индуцированной доксорубицином хемоневосприимчивости в опухолевом ксенотрансплантате человеческой немелкоклеточной карциномы легкого (Н-460).Thus, NFκB-mediated inhibition of COX-2 by compound A could be included in the suppression of tumor growth and doxorubicin-induced chemo-susceptibility in the tumor xenograft of human non-small cell lung carcinoma (H-460).
Пример 21Example 21
Исследования комбинации доксорубицина и флавопиридола на человеческой клеточной линии немелкоклеточной карциномы легкого (Н-460)Studies of the combination of doxorubicin and flavopiridol on the human cell line of non-small cell lung carcinoma (H-460)
Этот пример показывает, что не было синергического эффекта, когда флавопиридол вводили после (Таблица 16А), перед. (Таблица 16В) или параллельно с (Таблица 16С) цитотоксическим противоопухолевым средством доксорубицином. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка. Согласно Таблице 16А клетки сначала обработали одним из лекарственных средств отдельно, то есть доксорубицином или флавопиридолом отдельно. Обрабатывали доксорубицином в течение сначала 24 часов, а затем полной средой в течение 96 часов, а в случае флавопиридола сначала 24 часа полной средой, а затем флавопиридолом в течение следующих 96 часов. Использовали концентрации доксорубицина 30 нМ, 70 нМ, 100 нМ и 200 нМ, а флавопиридол использовали при концентрации 200 нМ и 350 нМ (IC30 и IC50 концентрации соответственно после 48-часовой обработки). В исследовании комбинации клетки сначала обработали 30 нМ, 70 нМ, 100 нМ и 200 нМ доксорубицина в течение сначала 24 часов, а затем 200 нМ и 350 нМ флавопиридола в течение 96 часов. После завершения обработки лекарственным средством, то есть в конце 120 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты показаны в Таблице 16А.This example shows that there was no synergistic effect when flavopiridol was administered after (Table 16A), before. (Table 16B) or in parallel with (Table 16C) the doxorubicin cytotoxic antitumor agent. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were seeded at a density of 1,500 cells / well. According to Table 16A, the cells were first treated with one of the drugs separately, that is, doxorubicin or flavopyridol separately. It was treated with doxorubicin for first 24 hours, and then with complete medium for 96 hours, and in the case of flavopiridol, first 24 hours with complete medium, and then with flavopiridol for the next 96 hours. Doxorubicin concentrations of 30 nM, 70 nM, 100 nM and 200 nM were used, and flavopiridol was used at a concentration of 200 nM and 350 nM (IC 30 and IC 50 concentrations, respectively, after 48-hour treatment). In a combination study, cells were first treated with 30 nM, 70 nM, 100 nM and 200 nM doxorubicin for 24 hours at first, and then 200 nM and 350 nM flavopiridol for 96 hours. After completion of the drug treatment, that is, at the end of 120 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are shown in Table 16A.
Согласно Таблице 16В клетки сначала обработали одним из лекарственных средств отдельно, то есть доксорубицином или флавопиридолом отдельно. Обрабатывали флавопиридолом в течение сначала 96 часов, а затем полной средой в течение 24 часов, а в случае доксорубицина сначала 96 часов полной средой, а затем доксорубицином в течение 24 часов. Использовали концентрации доксорубицина 30 нМ, 70 нМ, 100 нМ и 200 нМ, а флавопиридол использовали при концентрации 200 нМ и 350 нМ (~IC30 и ~IC50 концентрация после 48-часовой обработки). В этом исследовании комбинации добавили 200 нМ или 350 нМ флавопиридола в течение сначала 96 часов, а затем 30 нМ, 70 нМ, 100 нМ или 200 нМ доксорубицина в течение 24 часов. После завершения обработки лекарственными средствами, то есть в конце 120 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты показаны в Таблице 16 В.According to Table 16B, the cells were first treated with one of the drugs separately, i.e., doxorubicin or flavopyridol separately. It was treated with flavopiridol for first 96 hours, and then complete medium for 24 hours, and in the case of doxorubicin, first 96 hours with complete medium, and then doxorubicin for 24 hours. Doxorubicin concentrations of 30 nM, 70 nM, 100 nM and 200 nM were used, and flavopiridol was used at a concentration of 200 nM and 350 nM (~ IC 30 and ~ IC 50 concentration after 48-hour treatment). In this combination study, 200 nM or 350 nM flavopiridol was added over a first 96 hours and then 30 nM, 70 nM, 100 nM or 200 nM doxorubicin over 24 hours. After completing the drug treatment, that is, at the end of 120 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are shown in Table 16 B.
Таблица 16С не показывает синергический эффект комбинации доксорубицина и флавопиридола, введенных одновременно в течение 120 часов. Человеческие клетки немелкоклеточной карциномы легкого Н-460 высеяли с плотностью 1500 клеток/лунка. Клетки сначала обработали одним из лекарственных средств отдельно, то есть доксорубицином или флавопиридолом отдельно, в течение 120 часов каждым. Использовали концентрации доксорубицина 30 нМ, 70 нМ, 100 нМ и 200 нМ, а флавопиридол использовали при концентрации 200 нМ и 350 нМ (~IC30 и ~IC50 концентрация после 48-часовой обработки). В этом исследовании комбинации добавили 30 нМ, 70 нМ, 100 нМ или 200 нМ доксорубицина и 200 нМ или 350 нМ флавопиридола соответственно вместе в течение 120 часов. После завершения обработки лекарственными средствами, то есть в конце 120 часов, планшеты подвергли испытанию MTS выживаемости и процент цитотоксичности рассчитали по сравнению с контролем. Результаты представлены в следующей Таблице 16С.Table 16C does not show the synergistic effect of the combination of doxorubicin and flavopiridol, administered simultaneously for 120 hours. Human non-small cell lung carcinoma H-460 cells were seeded at a density of 1,500 cells / well. The cells were first treated with one of the drugs separately, that is, doxorubicin or flavopiridol separately, for 120 hours each. Doxorubicin concentrations of 30 nM, 70 nM, 100 nM and 200 nM were used, and flavopiridol was used at a concentration of 200 nM and 350 nM (~ IC 30 and ~ IC 50 concentration after 48-hour treatment). In this study, combinations were added 30 nM, 70 nM, 100 nM or 200 nM doxorubicin and 200 nM or 350 nM flavopiridol, respectively, together for 120 hours. After completing the drug treatment, that is, at the end of 120 hours, the plates were subjected to the MTS survival test and the percentage of cytotoxicity was calculated compared to the control. The results are presented in the following Table 16C.
Claims (19)
где Аr представляет собой фенил, который незамещен или замещен 1, 2 или 3 идентичными или различными заместителями, выбранными из: галогена, выбранного из хлора, брома, фтора или йода, нитро, циано, С1-С4-алкила, трифторметила, гидроксила, С1-С4-алкокси, карбокси, С1-С4-алкоксикарбонила, CONH2 и NR1R2; где R1 и R2 каждый независимо выбран из водорода или C1-C4-алкила.1. A pharmaceutical combination adapted to treat a cancer selected from the group consisting of breast cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, colorectal cancer and hepatocellular cancer, including a cytotoxic antitumor agent selected from a group comprising paclitaxel, docetaxel, doxorubicin and gemcitabine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor, or an enantiomer, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, wherein said cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor is represented by the following formula I:
where Ar represents phenyl which is unsubstituted or substituted by 1, 2 or 3 identical or different substituents selected from: halogen selected from chlorine, bromine, fluorine or iodine, nitro, cyano, C 1 -C 4 alkyl, trifluoromethyl, hydroxyl C 1 -C 4 alkoxy, carboxy, C 1 -C 4 alkoxycarbonyl, CONH 2 and NR 1 R 2 ; where R 1 and R 2 are each independently selected from hydrogen or C 1 -C 4 alkyl.
где Аr представляет собой фенил, который незамещен или замещен 1, 2 или 3 идентичными или различными заместителями, выбранными из: галогена, выбранного из хлора, брома, фтора или йода, нитро, циано, С1-С4-алкила, трифторметила, гидроксила, С1-С4-алкокси, карбокси, С1-С4-алкоксикарбонила, CONH2 и NR1R2; где R1 и R2 каждый независимо выбран из водорода или С1-С4-алкила; для лечения рака, выбранного из группы, включающей рак молочной железы, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, овариальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, колоректальный рак и гепатоцеллюлярный рак.12. The use of a pharmaceutical combination comprising a cytotoxic antitumor agent selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin and gemcitabine or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor, or an enantiomer, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, wherein said cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor is represented by the following formula I:
where Ar represents phenyl which is unsubstituted or substituted by 1, 2 or 3 identical or different substituents selected from: halogen selected from chlorine, bromine, fluorine or iodine, nitro, cyano, C 1 -C 4 alkyl, trifluoromethyl, hydroxyl C 1 -C 4 alkoxy, carboxy, C 1 -C 4 alkoxycarbonyl, CONH 2 and NR 1 R 2 ; where R 1 and R 2 are each independently selected from hydrogen or C 1 -C 4 alkyl; for the treatment of cancer selected from the group consisting of breast cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, colorectal cancer and hepatocellular cancer.
где Аr представляет собой фенил, который незамещен или замещен 1, 2 или 3 идентичными или различными заместителями, выбранными из: галогена, выбранного из хлора, брома, фтора или йода, нитро, циано, С1-С4-алкила, трифторметила, гидроксила, С1-С4-алкокси, карбокси, С1-С4-алкоксикарбонила, CONH2 и NR1R2; где R1 и R2 каждый независимо выбран из водорода или C1-C4-алкила; для лечения рака, выбранного из группы, включающей рак молочной железы, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, овариальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, колоректальный рак и гепатоцеллюлярный рак, где указанное цитотоксическое противоопухолевое средство и указанный ингибитор циклин-зависимой киназы (CDK) вводятся одновременно или последовательно.15. The use of a pharmaceutical combination comprising a cytotoxic antitumor agent selected from the group consisting of paclitaxel, docetaxel, doxorubicin and gemcitabine or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor, or an enantiomer, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, wherein the cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor is represented by the following formula I:
where Ar represents phenyl which is unsubstituted or substituted by 1, 2 or 3 identical or different substituents selected from: halogen selected from chlorine, bromine, fluorine or iodine, nitro, cyano, C 1 -C 4 alkyl, trifluoromethyl, hydroxyl C 1 -C 4 alkoxy, carboxy, C 1 -C 4 alkoxycarbonyl, CONH 2 and NR 1 R 2 ; where R 1 and R 2 are each independently selected from hydrogen or C 1 -C 4 alkyl; for treating a cancer selected from the group consisting of breast cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, colorectal cancer and hepatocellular cancer, wherein said cytotoxic antitumor agent and said cyclin-dependent kinase inhibitor ( CDK) are administered simultaneously or sequentially.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009146008/15A RU2438664C2 (en) | 2007-05-15 | 2007-05-15 | Synergetic pharmaceutical combination for cancer treatment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009146008/15A RU2438664C2 (en) | 2007-05-15 | 2007-05-15 | Synergetic pharmaceutical combination for cancer treatment |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009146008A RU2009146008A (en) | 2011-06-20 |
| RU2438664C2 true RU2438664C2 (en) | 2012-01-10 |
Family
ID=44737531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009146008/15A RU2438664C2 (en) | 2007-05-15 | 2007-05-15 | Synergetic pharmaceutical combination for cancer treatment |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2438664C2 (en) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2666999C2 (en) * | 2013-03-04 | 2018-09-13 | Астразенека Аб | Combination treatment |
| RU2671857C1 (en) * | 2014-10-30 | 2018-11-07 | Дельта-Флай Фарма, Инк. | New method for production of lipoplex for local introduction and anti-tumor medication that uses such lipoplex |
| US10562925B2 (en) | 2015-05-18 | 2020-02-18 | Tolero Pharmaceuticals, Inc. | Alvocidib prodrugs having increased bioavailability |
| RU2737508C2 (en) * | 2014-11-07 | 2020-12-01 | Сумитомо Даиниппон Фарма Онколоджи, Инк. | Methods of influencing transcription control in super-enhancer areas |
| RU2739992C2 (en) * | 2014-11-07 | 2020-12-30 | ЭйАй ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. | Apilimod compositions and methods of using them in treating colorectal cancer |
| US11034710B2 (en) | 2018-12-04 | 2021-06-15 | Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. | CDK9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer |
| US11166944B2 (en) | 2014-11-07 | 2021-11-09 | AI Therapeutics, Inc. | Apilimod compositions and methods for using same in the treatment of renal cancer |
| US11266654B2 (en) | 2014-01-24 | 2022-03-08 | AI Therapeutics, Inc. | Apilimod compositions and methods for using same |
| US11279694B2 (en) | 2016-11-18 | 2022-03-22 | Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. | Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors |
| US11497756B2 (en) | 2017-09-12 | 2022-11-15 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | Treatment regimen for cancers that are insensitive to BCL-2 inhibitors using the MCL-1 inhibitor alvocidib |
| US11793802B2 (en) | 2019-03-20 | 2023-10-24 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2982928A1 (en) | 2015-04-20 | 2016-10-27 | Tolero Pharmaceuticals, Inc. | Predicting response to alvocidib by mitochondrial profiling |
| AU2016301315C1 (en) | 2015-08-03 | 2022-07-07 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | Combination therapies for treatment of cancer |
-
2007
- 2007-05-15 RU RU2009146008/15A patent/RU2438664C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Д.Г.ГРЭХАМ-СМИТ, Дж.К.АРОНСОН. Оксфордский справочник по клинической фармакологии и фармакотерапии. - М.: Медицина, 2000, с.533-537. Pennati M et al. Potentiation ofpaclitaxel-induced apoptosis by the novel cyclin-dependent kinase inhibitor NU6140: a possible role for survivin down-regulation. Mol Cancer Ther. 2005 Sep; 4(9): 1328-37. [он-лайн] [найдено 2011-01-18] (Найдено из базы данных PubMed PMID: 16170024). Coley HM et al. Seliciclib (CYC202; r-roscovitine) in combination with cytotoxic agents in human uterine sarcoma cell lines. Anticancer Res. 2007 Jan-Feb; 27(1A):273-8. Реферат [он-лайн] [найдено 2011-01-18] (Найдено из базы данных PubMed PMID: 17352243). * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2666999C2 (en) * | 2013-03-04 | 2018-09-13 | Астразенека Аб | Combination treatment |
| US11266654B2 (en) | 2014-01-24 | 2022-03-08 | AI Therapeutics, Inc. | Apilimod compositions and methods for using same |
| RU2671857C1 (en) * | 2014-10-30 | 2018-11-07 | Дельта-Флай Фарма, Инк. | New method for production of lipoplex for local introduction and anti-tumor medication that uses such lipoplex |
| RU2737508C2 (en) * | 2014-11-07 | 2020-12-01 | Сумитомо Даиниппон Фарма Онколоджи, Инк. | Methods of influencing transcription control in super-enhancer areas |
| RU2739992C2 (en) * | 2014-11-07 | 2020-12-30 | ЭйАй ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. | Apilimod compositions and methods of using them in treating colorectal cancer |
| US11166944B2 (en) | 2014-11-07 | 2021-11-09 | AI Therapeutics, Inc. | Apilimod compositions and methods for using same in the treatment of renal cancer |
| US10562925B2 (en) | 2015-05-18 | 2020-02-18 | Tolero Pharmaceuticals, Inc. | Alvocidib prodrugs having increased bioavailability |
| US11279694B2 (en) | 2016-11-18 | 2022-03-22 | Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. | Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors |
| US11497756B2 (en) | 2017-09-12 | 2022-11-15 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | Treatment regimen for cancers that are insensitive to BCL-2 inhibitors using the MCL-1 inhibitor alvocidib |
| US11034710B2 (en) | 2018-12-04 | 2021-06-15 | Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. | CDK9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer |
| US11530231B2 (en) | 2018-12-04 | 2022-12-20 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | CDK9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer |
| US11793802B2 (en) | 2019-03-20 | 2023-10-24 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009146008A (en) | 2011-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2438664C2 (en) | Synergetic pharmaceutical combination for cancer treatment | |
| CA2687204C (en) | A synergistic pharmaceutical combination for the treatment of cancer | |
| AU2002228772B2 (en) | Methods for enhancing the efficacy of cytotoxic agents through the use of HSP90 inhibitors | |
| Pan et al. | The BH3-mimetic GX15-070 induces autophagy, potentiates the cytotoxicity of carboplatin and 5-fluorouracil in esophageal carcinoma cells | |
| BRPI0620058A2 (en) | a pharmaceutical combination comprising smac protein binding inhibitor compounds and apoptosis inhibitor proteins, and a taxane, as well as use thereof | |
| US6949558B2 (en) | Enhancement of taxane-based chemotherapy by a CDK1 antagonist | |
| US20090082406A1 (en) | Cancer Therapy | |
| BRPI0614809A2 (en) | sensitization of drug resistant lung cancer to protein kinase inhibitors | |
| Luttman et al. | ABL allosteric inhibitors synergize with statins to enhance apoptosis of metastatic lung cancer cells | |
| Jiang et al. | The small-molecule IAP antagonist AT406 inhibits pancreatic cancer cells in vitro and in vivo | |
| US20220151976A1 (en) | Targeting lasp1, eif4a1, eif4b and cxc4 with modulators and combinations thereof for cancer therapy | |
| US20100226919A1 (en) | Antitumoral Treatments | |
| Patel | Recent advances in systemic therapy of soft tissue sarcomas | |
| US20220071982A1 (en) | Methods and uses for treating cancer | |
| Berning | Characterization of the autophagy-modulating natural compound prodigiosin for the elimination of therapy-resistant tumor cells | |
| WO2024056995A1 (en) | Combinations and pharmaceutical compositions comprising a pi3k/akt/mtor pathway inhibiting compound | |
| WO2023102379A1 (en) | Combination therapy for cancer treatment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20130821 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160516 |