RU2437692C2 - Method of treating solid malignant growths and their metastases - Google Patents
Method of treating solid malignant growths and their metastases Download PDFInfo
- Publication number
- RU2437692C2 RU2437692C2 RU2010109034/14A RU2010109034A RU2437692C2 RU 2437692 C2 RU2437692 C2 RU 2437692C2 RU 2010109034/14 A RU2010109034/14 A RU 2010109034/14A RU 2010109034 A RU2010109034 A RU 2010109034A RU 2437692 C2 RU2437692 C2 RU 2437692C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- perfluorocarbon
- nanoemulsion
- perfluorocarbons
- oxygen
- tumor
- Prior art date
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается способа лечения солидных опухолей различной локализации и их метастазов с использованием различного вида противоопухолевых процедур, преимущественно химиотерапевтических.The invention relates to medicine, namely to oncology, and relates to a method for the treatment of solid tumors of various localization and their metastases using various types of antitumor procedures, mainly chemotherapeutic.
Способ может применяться для лечения неоперабельных солидных опухолей центральной нервной системы, органов желудочно-кишечного тракта, органов выделительной системы, репродуктивных органов, молочной железы, головы и шеи, легких и др., а также снижения метастазирования после хирургического лечения солидных опухолей в составе адъювантной терапии.The method can be used to treat inoperable solid tumors of the central nervous system, organs of the gastrointestinal tract, organs of the excretory system, reproductive organs, breast, head and neck, lungs, etc., as well as to reduce metastasis after surgical treatment of solid tumors as part of adjuvant therapy .
Хорошо известны широко применяемые в онкологической практике консервативные способы лечения солидных опухолей - лучевой, химиотерапевтический и фотодинамический. Однако все они имеют невысокую избирательность действия по отношению к опухолевой ткани и характеризуются выраженными побочными эффектами, даже при локальном применении.The conservative methods of treating solid tumors that are widely used in oncological practice are well known - radiation, chemotherapeutic and photodynamic. However, all of them have a low selectivity of action in relation to tumor tissue and are characterized by pronounced side effects, even with local application.
Одним из факторов, способствующих повышению чувствительности солидных опухолей к воздействию терапевтических противоопухолевых процедур, является повышение содержания в опухолях кислорода.One of the factors contributing to an increase in the sensitivity of solid tumors to the effects of therapeutic antitumor procedures is an increase in the oxygen content in tumors.
Известны, например, способы повышения эффективности противоопухолевой терапии при проведении ее на фоне дыхания чистым кислородом или карбогеном при нормальных или гипербарических условиях в случае химиотерапии, лучевой терапии, фотодинамической терапии (US 7338670, 04.03.2008).Known, for example, are methods for increasing the effectiveness of antitumor therapy when it is administered while breathing with pure oxygen or carbogen under normal or hyperbaric conditions in the case of chemotherapy, radiation therapy, and photodynamic therapy (US 7338670, March 4, 2008).
Недостатком таких способов является невысокая эффективность оксигенации опухоли в силу малого просвета формирующихся в ней микрокапилляров и невозможности циркуляции в них эритроцитов, а также повышенная оксигенация всех тканей организма, что обуславливает усиление побочных эффектов.The disadvantage of such methods is the low efficiency of tumor oxygenation due to the small clearance of the microcapillaries formed in it and the inability to circulate red blood cells in them, as well as increased oxygenation of all body tissues, which leads to increased side effects.
Известен способ улучшения доставки кислорода по мелким капиллярам солидных опухолей, характеризующимся низкой доступностью для эритроцитов, за счет увеличения кислородной емкости внеклеточной части крови (плазмы) путем инфузии перед проведением химиотерапии, лучевой терапии или фотодинамической терапии кровезаменителей с газотранспортной функцией виде фармацевтически приемлемых микроэмульсий перфторуглеродов (US 5567765, 22.10.1996) или на основе полимерного гемоглобина (US 20090169591. 02.07.2009).There is a method of improving oxygen delivery to small capillaries of solid tumors, characterized by low availability for red blood cells, by increasing the oxygen capacity of the extracellular part of the blood (plasma) by infusion before chemotherapy, radiation therapy or photodynamic therapy of blood substitutes with gas transport function as pharmaceutically acceptable microemulsions of perfluorocarbons 5567765, 10/22/1996) or based on polymer hemoglobin (US 20090169591. 07/02/2009).
Недостатками применения кровезаменителей с газотранспортной функцией является повышение содержания кислорода во всех тканях организма при усилении побочных эффектов, а также наличие системного сосудосуживающего действия из-за используемых высоких дозах кровезаменителей за счет связывания окиси азота (NO), которое уменьшает целевой оксигенирующий эффект вследствие снижения периферического кровотока.The disadvantages of using blood substitutes with a gas transport function are an increase in the oxygen content in all body tissues with increasing side effects, as well as the presence of systemic vasoconstrictor action due to the high doses of blood substitutes used due to the binding of nitric oxide (NO), which reduces the target oxygenation effect due to a decrease in peripheral blood flow .
Известен способ ввода насыщенной кислородом микроэмульсии перфторуглеродов непосредственно в гипоксическую зону опухоли с целью локальной оксигенации опухоли для повышения эффективности лучевой терапии (US 4781676, 01.11.1988). Известный способ характеризуется ограниченными возможностями применения, т.к. инъекции возможны только в случае достижения опухолью размеров, позволяющих провести ее четкую локализацию, а также при курабельном расположении опухоли.A known method of introducing oxygenated microemulsions of perfluorocarbons directly into the hypoxic zone of the tumor with the aim of local oxygenation of the tumor to increase the effectiveness of radiation therapy (US 4781676, 01.11.1988). The known method is characterized by limited applications, because injections are possible only if the tumor reaches a size that allows it to be clearly localized, as well as when the tumor is in a curable position.
Для устранения побочных системных эффектов противоопухолевой терапии известны способы, в которых используются несущие распознающий элемент системы доставки в опухолевую ткань химиотерапевтических или сенсибилизирующих веществ. (Friedman M, Ståhl S. Engineered affinity proteins for tumour-targeting applications. Biotechnol Appi Biochem. 2009 May; 53(Pt 1):1-29).To eliminate the side systemic effects of antitumor therapy, methods are known in which chemotherapeutic or sensitizing substances are used to carry a recognizing element of the delivery system to the tumor tissue. (Friedman M, Ståhl S. Engineered affinity proteins for tumor-targeting applications. Biotechnol Appi Biochem. 2009 May; 53 (Pt 1): 1-29).
Однако успех, достигнутый в области создания вводимых в системный кровоток опухолеспецифических систем доставки лекарственных веществ, носит ограниченный характер в силу необходимости преодоления гистогематического барьера между кровью и тканью, в котором на уровне эндотелиальной выстилки сосудов теряется выраженность специфических маркеров опухоли. Как следствие, при использовании внутривенного введения систем доставки лекарственных веществ in vivo, хотя и наблюдается повышение противоопухолевого эффекта за счет улучшение поступления цитотоксических лекарственных веществ в опухолевую ткань, но происходит и их неизбежное поступление практически во все ткани. Такое увеличение поступления этих веществ в другие ткани приводит к сопутствующему усилению побочных эффектов.However, the success achieved in the development of tumor-specific drug delivery systems introduced into the systemic circulation is limited due to the need to overcome the histohematological barrier between blood and tissue, in which the expression of specific tumor markers is lost at the level of the endothelial lining of blood vessels. As a result, when using intravenous administration of drug delivery systems in vivo, although there is an increase in the antitumor effect due to an improvement in the flow of cytotoxic drugs into the tumor tissue, their inevitable entry into almost all tissues also occurs. Such an increase in the intake of these substances in other tissues leads to a concomitant increase in side effects.
Таким образом, описанные выше способы повышения эффективности противоопухолевой терапии характеризуются вместе с положительными эффектами и одновременным усилением выраженности побочных эффектов в силу системного применения используемых средств и недостаточной специфичности используемых систем доставки.Thus, the methods described above for increasing the effectiveness of antitumor therapy are characterized together with positive effects and a simultaneous increase in the severity of side effects due to the systemic use of the drugs used and the insufficient specificity of the delivery systems used.
Известен способ, в котором для повышения специфичности накопления в опухоли цитотоксических терапевтических агентов используется способность мезенхимальных и других стволовых клеток проникать через гистогематические барьеры и избирательно накапливаться в опухолевой ткани (US 20070264231, 15.11.2007).A method is known in which the ability of mesenchymal and other stem cells to penetrate histohematological barriers and selectively accumulate in tumor tissue is used to increase the specificity of accumulation of cytotoxic therapeutic agents in a tumor (US 20070264231, November 15, 2007).
Способ предусматривает внутривенное введение трансдуцированных лигандом, индуцирующим апоптоз с участием фактора некроза опухоли, клеток разных типов, в том числе мезенхимных стволовых клеток для лечения опухолей, в частности лимфомы и рака молочной железы.The method involves the intravenous administration of a transduced ligand inducing apoptosis involving tumor necrosis factor, various types of cells, including mesenchymal stem cells, for treating tumors, in particular lymphoma and breast cancer.
Недостатком описанного способа является то, что в нем используются клетки, генетически модифицированные для продуцирования цитотоксических факторов. Это приводит к высокой вероятности озлокачествления используемых клеток как следствия генетической модификации. Кроме того, процедура получения генетически модифицированных клеток является трудоемкой и дорогостоящей.The disadvantage of the described method is that it uses cells genetically modified to produce cytotoxic factors. This leads to a high probability of malignancy of the cells used as a result of genetic modification. In addition, the procedure for obtaining genetically modified cells is time-consuming and expensive.
При этом в настоящее время неизвестны публикации по использованию мезенхимальных стволовых клеток, нагруженных лекарственными субстанциями или содержащими их системами доставки, как лечебного фактора в противоопухолевой терапии.Moreover, publications on the use of mesenchymal stem cells loaded with drug substances or delivery systems containing them as a therapeutic factor in antitumor therapy are currently unknown.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ лечения солидных злокачественных новообразований, который предусматривает проведение инфузии кровезаменителя с газотранспортной функцией водной наноэмульсии перфторуглеродов или производных гемоглобина и проведение химиотерапевтических процедур на фоне дыхания чистым кислородом при нормальном или повышенном давлении (Hochberg F, Prados M, Russell С, Weissman D, Evans R, Cook P, Burton G, Eisenberg PD, Valenzuela R, Verkh L. Treatment of recurrent malignant glioma with BCNU-fluosol and oxygen inhalation. A phase I-II study. J Neurooncol. 1997 Mar; 32(1):45-55).Closest to the claimed invention is a method for the treatment of solid malignant neoplasms, which provides for the infusion of a blood substitute with the gas transport function of an aqueous nanoemulsion of perfluorocarbons or hemoglobin derivatives and chemotherapeutic procedures against the background of breathing with pure oxygen at normal or high pressure (Hochberg F, Prados M, Russell C Weissman D, Evans R, Cook P, Burton G, Eisenberg PD, Valenzuela R, Verkh L. Treatment of recurrent malignant glioma with BCNU-fluosol and oxygen inhalation. A phase I-II study. J Neurooncol. 1997 Mar; 32 (1 ): 45-55).
Основным недостатком способа является системное применение как основного противоопухолевого химиотерапевтического препарата, так и вспомогательных средств (инфузия наноэмульсией перфторуглеродов, обогащение вдыхаемого воздуха кислородом). Это приводит к повышенной токсикологической нагрузке не только на опухолевые ткани, но и на весь организм пациента в целом и обуславливает повышенную вероятность проявления нежелательных побочных эффектов.The main disadvantage of this method is the systemic use of both the main antitumor chemotherapeutic drug and auxiliary agents (infusion with perfluorocarbon nanoemulsion, enrichment of the inhaled air with oxygen). This leads to an increased toxicological load not only on the tumor tissue, but also on the whole patient’s body as a whole and leads to an increased likelihood of undesirable side effects.
В связи с изложенным задачей настоящего изобретения является разработка нового способа противоопухолевой терапии, сочетающего в себе повышение эффективности противоопухолевого воздействия без заметного повышения уровня отрицательных побочных эффектов за счет адресного воздействия на опухоль.In connection with the stated objective of the present invention is to develop a new method of antitumor therapy, combining an increase in the effectiveness of antitumor effects without a noticeable increase in the level of negative side effects due to targeted exposure to the tumor.
Технический результат изобретения заключается в эффективном подавлении роста и уменьшении размеров опухоли за счет введение пациенту препарата нагруженных наночастицами перфторуглеродов мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, накапливающихся в опухоли и доставляющих в нее вещества, повышенное содержания которых в опухолевой ткани приводит к росту чувствительности опухолевых клеток к основному химиотерапевтическому воздействию в условиях повышенной оксигенации.The technical result of the invention is to effectively suppress the growth and decrease in tumor size by administering to the patient a preparation of mesenchymal stem cells of a human bone marrow loaded with nanoparticles of perfluorocarbons that accumulate in the tumor and deliver substances to it, the increased content of which in the tumor tissue leads to an increase in the sensitivity of tumor cells to the main chemotherapeutic effects in conditions of increased oxygenation.
Для достижения указанного технического результата предложен способ лечения солидных злокачественных новообразований, предусматривающий проведение пациенту инфузии кровезаменителя с газотранспортной функцией на основе фармацевтически приемлемой водной наноэмульсии перфторуглеродов или производных гемоглобина и проведение химиотерапевтических процедур на фоне дыхания газовой смесью, обогащенной кислородом, при нормальном или повышенном давлении, при этом за 1-2 суток до начала процедур пациенту внутривенно вводят в дозе 0,5-10·106 клеток/кг препарат мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, нагруженных наночастицами перфторуглеродов, полученных путем инкубации в среде, содержащей фармацевтически приемлемую водную наноэмульсию перфторуглеродов с диаметром частиц не более 300 нм.To achieve the technical result, a method for the treatment of solid malignant neoplasms is proposed, which provides the patient with an infusion of a blood substitute with a gas transport function based on a pharmaceutically acceptable aqueous nanoemulsion of perfluorocarbons or hemoglobin derivatives and chemotherapeutic procedures against the background of breathing with an oxygen-enriched gas mixture at normal or elevated pressure this is 1-2 days before the start of the procedure, the patient is administered intravenously at a dose of 0.5-10 · 10 6 cells it is / kg a preparation of human bone marrow mesenchymal stem cells loaded with perfluorocarbon nanoparticles obtained by incubation in a medium containing a pharmaceutically acceptable aqueous perfluorocarbon nanoemulsion with a particle diameter of not more than 300 nm.
Предпочтительно, чтобы водная наноэмульсия перфторуглеродов содержала 10-40 об.% перфторуглеродной фазы.Preferably, the aqueous nano-emulsion of perfluorocarbons contains 10-40 vol.% Perfluorocarbon phase.
Предпочтительно, чтобы перфторуглеродная фаза представляла собой один перфторуглерод или их смесь с разными температурами кипения из ряда перфтордекалин, перфтороктилбромид, перфторметилциклогексилпиперидин, перфтортрипропиламин, перфтортрибутиламин.Preferably, the perfluorocarbon phase is one perfluorocarbon or a mixture thereof with different boiling points from the series perfluorodecalin, perfluorooctyl bromide, perfluoromethylcyclohexyl piperidine, perfluorotripropylamine, perfluorotributylamine.
Предпочтительно, чтобы водная наноэмульсия перфторуглеродов содержала в качестве эмульгатора липиды в количестве 0,5-10% по массе или блок-сополимеры полиэтиленоксида-полипропиленоксида в количестве 0,2-20% по массе или их смесь.Preferably, the aqueous perfluorocarbon nanoemulsion contains as an emulsifier lipids in an amount of 0.5-10% by weight or block copolymers of polyethylene oxide-polypropylene oxide in an amount of 0.2-20% by weight or a mixture thereof.
Проведение пациенту инфузии кровезаменителя с газотранспортной функцией на основе фармацевтически приемлемой водной наноэмульсии перфторуглеродов или производных гемоглобина предпочтительно проводить с одновременным введением средств, обладающих периферическим сосудорасширяющим действием.Conducting a patient with a blood substitute infusion with a gas transport function based on a pharmaceutically acceptable aqueous nanoemulsion of perfluorocarbons or hemoglobin derivatives is preferably carried out with the simultaneous administration of agents with peripheral vasodilating action.
Это позволит увеличить доставку кислорода по мелким капиллярам солидных опухолей, обладающих низкой доступностью для эритроцитов, увеличить кислородную емкость внеклеточной части крови и улучшить микроциркуляцию в опухоли и прилегающих тканях.This will increase the oxygen delivery through the small capillaries of solid tumors with low availability for red blood cells, increase the oxygen capacity of the extracellular part of the blood and improve microcirculation in the tumor and adjacent tissues.
Предпочтительно в качестве средств, обладающих периферическим сосудорасширяющим действием, использовать производные никотиновой кислоты или ингибиторы фосфодиэстеразы.Preferably, nicotinic acid derivatives or phosphodiesterase inhibitors are used as agents with peripheral vasodilating effects.
Предпочтительно в качестве кровезаменителя использовать эмульсии типа «Перфторан®» или «Oxygent®» или «Fluosol-DA®».It is preferable to use emulsions of the type “Perftoran®” or “Oxygent®” or “Fluosol-DA®” as a blood substitute.
При этом после инфузии кровезаменителя и за 5-30 минут до начала химиотерапевтических процедур пациента переводят на дыхание воздухом, обогащенным кислородом. Это может быть чистый кислород или карбоген при нормальном или повышенном давлении. Время процедуры - 0,5-8 часов.Moreover, after the infusion of a blood substitute and 5-30 minutes before the start of chemotherapeutic procedures, the patient is transferred to breathing air enriched with oxygen. It can be pure oxygen or carbogen at normal or elevated pressure. The treatment time is 0.5-8 hours.
Предпочтительно, для проведения химиотерапевтических процедур использовать зависимые от кислорода противоопухолевые препараты: блеомицин, прокарбазин, актиномицин D и винкристин.Preferably, oxygen-dependent antitumor drugs are used for chemotherapeutic procedures: bleomycin, procarbazine, actinomycin D and vincristine.
Другим вариантом для проведения химиотерапевтических процедур является использование независимых или слабозависимых от кислорода противоопухолевых препаратов: митомицин С, доксорубицин, фторурацил, метотрексат, кармустин, циклофосфамид.Another option for chemotherapeutic procedures is the use of independent or weakly dependent on oxygen antitumor drugs: mitomycin C, doxorubicin, fluorouracil, methotrexate, carmustine, cyclophosphamide.
Приведенный список противоопухолевых препаратов не ограничивает возможность использования других препаратов с противоопухолевой активностью.The list of antitumor drugs does not limit the use of other drugs with antitumor activity.
Для приготовления препаратов стволовых мезенхимальных клеток, содержащих депо веществ, обладающих противоопухолевым действием или способствующих противоопухолевому действию факторов химиотерапевтических процедур, могут быть использованы фармацевтически приемлемые вещества, способствующие ускорению (катализу) реакций образования из эндогенных или экзогенных субстратов продуктов, обладающие необходимыми цитотоксическими или регуляторными свойствами.For the preparation of stem mesenchymal cell preparations containing a depot of substances having an antitumor effect or contributing to the antitumor effect of factors of chemotherapeutic procedures, pharmaceutically acceptable substances can be used that accelerate (catalize) the formation of products from endogenous or exogenous substrates that possess the necessary cytotoxic or regulatory properties.
Очевидно, что в силу наличия продолжительного периода между введением нагруженных стволовых клеток в кровеносное русло и их накоплением в опухоли используемые вещества должны выбираться из неметаболизируемых или слабо метаболизируемых фармацевтически приемлемых веществ, которые необходимо включать в специальные транспортные формы с отсроченным высвобождением (ретардные формы). Без включения в транспортные формы возможно использование веществ, плохо растворимых в воде или несмешивающихся с водой, которые будут присутствовать в клетке в виде постепенно разрушающихся частичек или капелек микро- или наноразмеров.Obviously, due to the presence of a long period between the introduction of loaded stem cells into the bloodstream and their accumulation in the tumor, the substances used must be selected from non-metabolizable or poorly metabolizable pharmaceutically acceptable substances that must be included in special delayed-release transport forms (retard forms). Without inclusion in transport forms, it is possible to use substances that are poorly soluble in water or immiscible with water, which will be present in the cell in the form of gradually destroyed particles or droplets of micro- or nano-sizes.
Как показали многочисленные исследования авторов, возможно и эффективно использование в противоопухолевой терапии мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, нагруженных фармацевтически приемлемой наноэмульсией перфторуглеродов. Привлекательность использования перфторуглеродов для решения поставленной задачи определяется:As shown by numerous studies of the authors, it is possible and effective to use human bone marrow mesenchymal stem cells loaded with a pharmaceutically acceptable perfluorocarbon nanoemulsion in antitumor therapy. The attractiveness of using perfluorocarbons to solve the problem is determined by:
- наличием биологической активности, характеризующейся проявлениями, способствующими повышению цитотоксического действия химиотерапевтических, радиотерапевтических или фотодинамических процедур;- the presence of biological activity, characterized by manifestations that contribute to the increase of the cytotoxic effect of chemotherapeutic, radiotherapeutic or photodynamic procedures;
- способностью к созданию в месте накопления наноэмульсии условий для увеличения содержания NO и S-нитрозилов, приводящего к местному сосудорасширяющему эффекту;- the ability to create conditions at the place of accumulation of the nanoemulsion for increasing the content of NO and S-nitrosyls, leading to a local vasodilating effect;
- наличием промышленно выпускаемых водных медицинских наноэмульсий на их основе для инфузионного применения, делающим возможным их применения в рамках медицинских технологий.- the presence of industrially produced aqueous medical nanoemulsions based on them for infusion use, making it possible to use them in the framework of medical technologies.
Используемая наноэмульсия перфторуглеродов должна иметь диаметр частиц не более 300 нм, предпочтительно 30-100 нм. Частицы указанного размера в отличие от более крупных частиц подвергаются эндоцитозу практически любым типом клеток, что обеспечивает эффективную загрузку стволовых клеток капельками наноэмульсий. Сформулированное требование к размерам загружаемых частиц применимо как в случае использования суспензий и эмульсий, плохо растворимых в воде, или несмешивающихся с водой биологически активных веществ как в чистом виде, так и в случае использования дисперсий любых корпускулярных систем доставки биологически активных веществ. Приведенным требованиям по дисперсности удовлетворяют все наноэмульсий перфторуглеродов, разрабатываемые в качестве кровезаменителей с газотранспортной функцией, например, «Перфторан®», «Oxygent®», «Fluosol-DA®».The perfluorocarbon nanoemulsion used should have a particle diameter of not more than 300 nm, preferably 30-100 nm. Particles of this size, unlike larger particles, undergo endocytosis by almost any type of cell, which ensures efficient loading of stem cells with droplets of nanoemulsions. The formulated requirement for the size of the loaded particles is applicable both in the case of the use of suspensions and emulsions, poorly soluble in water, or biologically active substances immiscible with water both in pure form, and in the case of dispersions of any corpuscular delivery systems of biologically active substances. The above dispersion requirements are met by all perfluorocarbon nanoemulsions developed as blood substitutes with a gas transport function, for example, Perftoran ® , Oxygent ® , and Fluosol-DA ® .
Требования по клинически эффективной наноэмульсий перфторуглеродов ограничивает минимальное содержание в ней перфторуглеродов - 10% по объему. Существенное увеличение технологических затрат на производство нанодисперсной эмульсии с содержанием перфторуглеродов более 40% по объему определяет ограничение по содержанию перфторуглеродов сверху.The requirements for the clinically effective perfluorocarbon nanoemulsions are limited by the minimum perfluorocarbon content of 10% by volume. A significant increase in technological costs for the production of nanodispersed emulsions with a perfluorocarbon content of more than 40% by volume determines the restriction on the content of perfluorocarbons from above.
В наноэмульсии перфторуглеродов может быть использован один перфторуглерод или, для увеличения стабильности эмульсии, смесь нескольких перфторуглеродов с разными температурами кипения. При этом перфторуглероды выбирают как из ряда уже используемых в медицинской практике: перфтор декалина, перфтороктилбромида, перфторметилциклогексилпиперидина, перфтортрипропиламина, перфтортрибутиламина, так и из ряда других фармацевтически приемлемых перфторуглеродов. В силу более выраженной способности влиять на клеточный метаболизм более привлекательным является использование циклических и гетероциклических перфторуглеродов, в частности входящих в состав кровезаменителей с газотранспортной функцией «Перфторан®» и «Fluosol-DA®».A perfluorocarbon nanoemulsion can use one perfluorocarbon or, to increase the stability of the emulsion, a mixture of several perfluorocarbons with different boiling points. At the same time, perfluorocarbons are chosen both from a number of already used in medical practice: perfalin decalin, perfluorooctyl bromide, perfluoromethylcyclohexyl piperidine, perfluorotripropylamine, perfluorotributylamine, and from a number of other pharmaceutically acceptable perfluorocarbons. Due to the more pronounced ability to influence cellular metabolism, it is more attractive to use cyclic and heterocyclic perfluorocarbons, in particular Perftoran ® and Fluosol-DA ® , which are part of blood substitutes with the gas transport function.
Исходя из практического опыта разработки кровезаменителей с газотранспортной функцией для стабилизации наноэмульсий перфторуглеродов в качестве эмульгатора могут быть использованы фосфолипиды с содержанием 0,5-10% по массе или блок-сополимеры полиэтиленоксида-полипропиленоксида с содержанием 0,2-20% по массе или их смесь. Поскольку использование блок-сополимеров полиэтиленоксида-полипропиленоксида сопровождается замедлением мембранозависимых процессов и внутриклеточного транспорта с участием частиц, на поверхности которых находится эти полимеры, то предпочтительным является использование в заявляемом способе наноэмульсии перфторуглеродов типа «Перфторан®», в которой используется только такой эмульгатор.Based on practical experience in the development of blood substitutes with a gas transport function to stabilize perfluorocarbon nanoemulsions, phospholipids with a content of 0.5-10% by weight or block copolymers of polyethylene oxide-polypropylene oxide with a content of 0.2-20% by weight or their mixture can be used as an emulsifier . Since the use of block copolymers of polyethylene oxide-polypropylene oxide is accompanied by a slowdown of membrane-dependent processes and intracellular transport involving particles on the surface of which these polymers are located, it is preferable to use "Perftoran ® " type perfluorocarbons in the present method, in which only such an emulsifier is used.
Для приготовления используемых в изобретении препаратов стволовых клеток могут быть использованы стволовые клетки, получаемые в рамках зарегистрированных медицинских технологий или выпускаемые как уже готовые медицинские препараты. Примерами последних являются препараты мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, выпускаемых в США фирмами Stemedica Cell Technologies, Inc. и Osiris Therapeutics, Inc.For the preparation of stem cell preparations used in the invention, stem cells obtained in the framework of registered medical technologies or produced as ready-made medical preparations can be used. Examples of the latter are human bone marrow mesenchymal stem cell preparations manufactured in the USA by Stemedica Cell Technologies, Inc. and Osiris Therapeutics, Inc.
Предлагаемый способ реализуют следующим образом.The proposed method is implemented as follows.
1. Готовят препараты стволовых мезенхимальных клеток, содержащие депо веществ, обладающих противоопухолевым действием или способствующих противоопухолевому действию факторов химиотерапевтических процедур.1. Prepare preparations of stem mesenchymal cells containing a depot of substances having an antitumor effect or contributing to the antitumor effect of factors of chemotherapeutic procedures.
Получение стволовых клеток, нагруженных наночастичками перфторуглеродов, осуществляют в результате инкубации в среде, содержащей наноэмульсию перфторуглеродов из расчета содержания перфторуглеродов 1-100 мг/мл. Для инкубации используют среду, оптимальную для культивирования данного типа клеток, но без добавления сыворотки. Содержание клеток в инкубационной среде составляет 2-10·106 клеток/мл. Время инкубации составляет от нескольких часов до суток. Точное время инкубации, так же как содержание наноэмульсии и клеток в инкубационной среде, определяется особенностями используемых клеток и наноэмульсии перфторуглеродов. По завершению инкубации клетки дважды отмывают двукратным объемом сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) от непоглощенной эмульсии центрифугированием при 400 g 7 минут. Для инъекций готовят суспензию отмытых клеток в физиологическом растворе с концентрацией 5-10·106 клеток/мл.Obtaining stem cells loaded with perfluorocarbon nanoparticles is carried out as a result of incubation in a medium containing a perfluorocarbon nanoemulsion based on a perfluorocarbon content of 1-100 mg / ml. For incubation, a medium is used that is optimal for the cultivation of this type of cell, but without the addition of serum. The cell content in the incubation medium is 2-10 · 10 6 cells / ml. The incubation time is from several hours to a day. The exact incubation time, as well as the content of the nanoemulsion and cells in the incubation medium, is determined by the characteristics of the cells used and the nanoemulsion of perfluorocarbons. Upon completion of the incubation, the cells are washed twice with a double volume of Hanks balanced saline (HBSS) from the non-absorbed emulsion by centrifugation at 400 g for 7 minutes. For injection, a suspension of washed cells in physiological saline with a concentration of 5-10 · 10 6 cells / ml is prepared.
2. Вводят подготовленные описанным образом клетки в дозе 0,5-10·106 клеток/кг внутривенно за 1-2 суток до проведения противоопухолевой терапии.2. Introduce cells prepared as described in a dose of 0.5-10 · 10 6 cells / kg intravenously 1-2 days before antitumor therapy.
3. До начала проведения противоопухолевых (химиотерапевтических) процедур проводят пациенту инфузию кровезаменителя с газотранспортной функцией, способствующего увеличению кислородной емкости внеклеточной части крови (плазмы) для увеличения содержания в опухолевой ткани кислорода.3. Prior to the start of the antitumor (chemotherapeutic) procedures, the patient is given an infusion of a blood substitute with a gas transport function, which increases the oxygen capacity of the extracellular part of the blood (plasma) to increase the oxygen content in the tumor tissue.
Для инфузии кровезаменителя с газотранспортной функцией используют фармацевтически приемлемую водную наноэмульсию перфторуглеродов типа медицинских эмульсий ПФУ «Перфторан®» «Oxygent®» и «Fluosol-DA®». Наноэмульсию перфторуглеродов вводят в дозе 1-3 0 мл/кг (40-1200 мл/м2) исходя из требований к клиническому применению указанных наноэмульсий.For infusion of a blood substitute with gas transport function, a pharmaceutically acceptable aqueous nano-emulsion of perfluorocarbons of the type of medical emulsions PFU "Perftoran ® " Oxygent ® and "Fluosol-DA ® " is used. Perfluorocarbon nanoemulsion is administered at a dose of 1-3 0 ml / kg (40-1200 ml / m 2 ) based on the requirements for the clinical use of these nanoemulsions.
Практически все требования к физико-химическим свойствам наноэмульсий перфторуглеродов, сформулированные выше при описании загрузки наночастицами перфторуглеродов стволовых клеток, применимы для газотранспортных наноэмульсий при их использовании по прямому назначению. Предпочтительным является использование наноэмульсий перфторуглеродов с максимальной дисперсностью, поскольку это обеспечивает большую эффективность протекания плазмы по микрокапиллярам и, как следствие, большую эффективность оксигенации тканей с плохой васкуляризацией.Almost all the requirements for the physicochemical properties of perfluorocarbon nanoemulsions, formulated above when describing the loading of stem cell perfluorocarbons by nanoparticles, are applicable to gas transport nanoemulsions when used for their intended purpose. It is preferable to use perfluorocarbon nanoemulsions with maximum dispersion, since this ensures greater efficiency of plasma flow through microcapillaries and, as a result, greater oxygenation efficiency of tissues with poor vascularization.
Для инфузии с целью увеличения кислородной емкости внеклеточной части крови (плазмы) также могут быть использованы кровезаменители с газотранспортной функцией в виде растворов или суспензий наноинкапсулированных форм фармацевтически приемлемых или поперечно-сшитого гемоглобина, или полимерного гемоглобина, или конъюгированного гемоглобина.For infusion in order to increase the oxygen capacity of the extracellular part of the blood (plasma), blood substitutes with gas transport function in the form of solutions or suspensions of nano-encapsulated forms of pharmaceutically acceptable or cross-linked hemoglobin, or polymer hemoglobin, or conjugated hemoglobin can also be used.
4. Вместе с инфузией наноэмульсии перфторуглеродов пациенту могут вводить препарат, обладающий периферическим сосудорасширяющим действием. Его введение направлено на улучшение микроциркуляции в околоопухолевой ткани за пределами области интенсификации обмена NO, обусловленной эффектом накопления стволовых клеток, нагруженных перфторуглеродов. Потребность в дополнительном ведении сосудорасширяющих средств обусловлена необходимостью устранения системного сосудосуживающего действия кровезаменителей с газотранспортной функцией, в частности, при введении наноэмульсии перфторуглеродов в дозе, приводящей к содержанию перфторуглеродов в крови более 0,5% масса/объем. В качестве препаратов, обладающих периферическим сосудорасширяющим действием, могут использоваться производные никотиновой кислоты; ингибиторы фосфодиэстеразы; препараты, способствующие увеличению синтеза окиси азота, и другие.4. Together with the infusion of perfluorocarbon nanoemulsions, a patient with a peripheral vasodilating effect can be administered to the patient. Its introduction is aimed at improving microcirculation in the near-tumor tissue outside the area of intensification of NO metabolism, due to the effect of the accumulation of stem cells loaded with perfluorocarbons. The need for additional management of vasodilators is due to the need to eliminate the systemic vasoconstrictor action of blood substitutes with gas transport function, in particular, with the introduction of a perfluorocarbon nanoemulsion in a dose leading to a perfluorocarbon content in the blood of more than 0.5% mass / volume. As drugs with peripheral vasodilating action, derivatives of nicotinic acid can be used; phosphodiesterase inhibitors; drugs that increase the synthesis of nitric oxide, and others.
5. За 5-30 минут до начала противоопухолевых (химиотерапевтических) процедур и на время их проведения пациента переводят на дыхание воздухом, обогащенным кислородом, чистым кислородом или карбогеном при нормальном или повышенном давлении. Суммарная продолжительность дыхания в условиях повышенного содержания кислорода составляет 0,5-8 часов в соответствии с нормами проведения простой и гипербарической кислородной терапии, а также особенностями проводимых противоопухолевых терапевтических процедур.5. 5-30 minutes before the start of the antitumor (chemotherapeutic) procedures and for the duration of the procedure, the patient is transferred to breathing with air enriched with oxygen, pure oxygen or carbogen under normal or elevated pressure. The total duration of breathing in conditions of high oxygen content is 0.5-8 hours in accordance with the standards for simple and hyperbaric oxygen therapy, as well as the features of the ongoing anti-tumor therapeutic procedures.
6. Через указанное время после начала дыхания в условиях повышенного содержания кислорода в соответствии с используемым протоколом лечения диагностированной солидной опухоли пациенту вводят противоопухолевое химиотерапевтическое средство.6. At the indicated time after the start of breathing under conditions of increased oxygen content, an antitumor chemotherapeutic agent is administered to the patient in accordance with the protocol used to treat a diagnosed solid tumor.
Образующие описанный выше способ приемы повторяются с периодичностью применения химиотерапевтических процедур в соответствии с используемым протоколом лечения диагностированной солидной опухоли.The techniques forming the method described above are repeated with the frequency of application of chemotherapeutic procedures in accordance with the protocol used to treat a diagnosed solid tumor.
Использование локального повышения содержания кислорода в сочетании с повышенным уровнем зависимых от кислорода цитотоксических факторов в опухоли само по себе создает локальную цитотоксическую нагрузку в опухолевой ткани. Это имеет следствием повышение эффективности не только зависимых от кислорода противоопухолевых препаратов (блеомицин, прокарбазин, актиномицин D, винкристин). За счет повышенной суммарной цитотоксической нагрузки усиливается противоопухолевое действие химиотерапевтических препаратов, являющихся независимыми или слабозависимыми от кислорода (митомицин С, доксорубицин, фторурацил, метотрексат, кармустин и др. алкилирующие препараты).Using a local increase in oxygen content in combination with an increased level of oxygen-dependent cytotoxic factors in the tumor itself creates a local cytotoxic load in the tumor tissue. This leads to an increase in the effectiveness of not only oxygen-dependent antitumor drugs (bleomycin, procarbazine, actinomycin D, vincristine). Due to the increased total cytotoxic load, the antitumor effect of chemotherapeutic drugs that are independent or slightly dependent on oxygen (mitomycin C, doxorubicin, fluorouracil, methotrexate, carmustine, and other alkylating drugs) is enhanced.
Использование заявляемого способа приводит к повышению чувствительности клеток опухоли к воздействию химиотерапевтических процедур при лечении солидных опухолей различной локализации, а также может быть полезно при профилактике метастазирования после оперативного лечения этих опухолей с использованием химиотерапевтических процедур в качестве адьювантных.Using the proposed method leads to an increase in the sensitivity of tumor cells to the effects of chemotherapeutic procedures in the treatment of solid tumors of various localization, and may also be useful in the prevention of metastasis after surgical treatment of these tumors using chemotherapeutic procedures as adjuvant.
Следующие примеры иллюстрируют предложенный способ, не ограничивая его по существу.The following examples illustrate the proposed method, without limiting it in essence.
Пример 1.Example 1
Приготовление препарата мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека путем их нагрузки наноэмульсией перфторуглеродов in vitro.Preparation of a preparation of human bone marrow mesenchymal stem cells by loading them with in vitro perfluorocarbon nanoemulsion.
В экспериментах использовали препараты мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, производимые фирмой Stemedica Cell Technologies, Inc. (США). Клетки хранили в жидком азоте и размораживали перед экспериментом в соответствии с протоколом, предоставленным фирмой-производителем. После размораживания клетки дважды отмывали двукратным объемом сбалансированного солевого раствора Хенкса от среды хранения центрифугированием при 400 g 7 минут и помещали в среду, получаемую добавлением к культуральной среде RPMI наноэмульсии перфторуглеродов «Перфторан®» в количестве 0, 5, 10, 20, 50, 100%. Содержание клеток в инкубационной среде составляло 5-106 клеток/мл. В указанных условиях клетки инкубировали 2.0, 8.0, 12 часов. По завершению инкубации клетки дважды отмывали двукратным объемом сбалансированного солевого раствора Хенкса от непоглощенной эмульсии центрифугированием при 400 g 7 минут. Перед последним центрифугированием в полученной суспензии определяли долю жизнеспособных клеток с использованием окраски трипановым синим.In the experiments, human bone marrow mesenchymal stem cell preparations manufactured by Stemedica Cell Technologies, Inc. were used. (USA). Cells were stored in liquid nitrogen and thawed before the experiment in accordance with the protocol provided by the manufacturer. After thawing, the cells were washed twice with double volume of Hanks balanced salt solution by centrifugation storage environment at 400 g 7 minutes and placed in a medium obtained by adding to the culture medium RPMI nanoemulsion perfluorocarbons "Perftoran ®» in an amount of 0, 5, 10, 20, 50, 100 % The cell content in the incubation medium was 5-10 6 cells / ml. Under these conditions, cells were incubated for 2.0, 8.0, 12 hours. Upon completion of the incubation, the cells were washed twice with twice the volume of Hanks balanced saline from the non-absorbed emulsion by centrifugation at 400 g for 7 minutes. Before the last centrifugation in the resulting suspension, the proportion of viable cells was determined using trypan blue staining.
Для определения содержания перфтордекалина использовали осадок отмытых клеток. Из клеток перфторуглероды экстрагировали ресуспензированием в 0.5 мл эмульсии, содержащей 20% по объему фторуглерода С6F13СН=НСF13С6, характеризующегося высокой чистотой и длительным временем удерживания на хроматографической колонке, и 1% Triton X-100. После 2-часовой экстракции при комнатной температуре эмульсия разрушалась добавлением равного объема этанола. Каплю отделившихся фторуглеродов осаждали центрифугированием и несколько раз отмывали водой, после чего использовали для хроматографического анализа. Количественное определение перфтордекалина в пробах проводили на хроматографе «Chrom-5» со стеклянной колонкой (2 м×2.5 м), заполненной 25% OV-1 на Gas Chrom Q, 80-100 меш. Детектор - пламенно-ионизационный газ-носитель - азот, давление на выходе колонки - 0.6 атм, температуры дозатора, термостата и детектора - 160, 60, 120°С соответственно.To determine the content of perfluorodecalin, a precipitate of washed cells was used. Perfluorocarbons were extracted from the cells by resuspension in 0.5 ml of an emulsion containing 20% by volume of fluorocarbon С 6 F 13 СН = НСF 13 С 6 , characterized by high purity and long retention time on a chromatographic column, and 1% Triton X-100. After 2 hours of extraction at room temperature, the emulsion was destroyed by the addition of an equal volume of ethanol. A drop of separated fluorocarbons was precipitated by centrifugation and washed several times with water, after which it was used for chromatographic analysis. Quantitative determination of perfluorodecalin in the samples was carried out on a Chrom-5 chromatograph with a glass column (2 m × 2.5 m) filled with 25% OV-1 on a Gas Chrom Q, 80-100 mesh. The detector — flame ionization carrier gas — nitrogen, the pressure at the column outlet — 0.6 atm, the temperature of the dispenser, thermostat, and detector — 160, 60, 120 ° С, respectively.
Согласно полученным результатам накопление перфторуглеродов в мезенхимальных стволовых клетках костного мозга человека существенно замедляется между 8 и 12 часами инкубации. При этом жизнеспособность клеток при содержании наноэмульсии перфторуглеродов в инкубационной среде не более 50% меняется несущественно. Значительное изменение жизнеспособности выявлено лишь при инкубации мезенхимальных стволовых клеток человека в 100% наноэмульсии перфторуглеродов в течение 12 часов.According to the results obtained, the accumulation of perfluorocarbons in the mesenchymal stem cells of the human bone marrow significantly slows down between 8 and 12 hours of incubation. Moreover, the cell viability when the content of perfluorocarbon nanoemulsion in the incubation medium is not more than 50% does not change significantly. A significant change in viability was detected only during incubation of human mesenchymal stem cells in 100% perfluorocarbon nanoemulsion for 12 hours.
Пример 2.Example 2
Определение накопления мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, нагруженных наноэмульсией перфторуглеродов, в перевиваемой опухоли in vivo.Determination of accumulation of bone marrow mesenchymal stem cells loaded with perfluorocarbon nanoemulsion in an in vivo transplanted tumor.
В экспериментах использовали самок бестимусных мышей nude в возрасте 4-6 недель. Животных содержали при цикле освещения/темноты по 12 часов в условиях свободного доступа к стерильной воде и стерильному корму для грызунов. Непосредственно перед инокуляцией опухоли животным имплантировали под кожу межлопаточной области пеллеты 60-дневного высвобождения с 1,5 мг эстродиола (Innovative Research of America, США) с использованием прецизионного троакара. Клетки аденокарциномы человека MCF-7 в количестве 5·106 инокулировали в 0,2 мл культуральной среды подкожно в грудную жировую складку. Два раза в неделю животных обследовали с измерением максимального (а) и минимального (b) размеров образующихся опухолей и рассчитывали их объем по формуле V=0,4·a·b2. После достижения среднего размера опухолей 500 мм3 проводили эксперимент по изучению накопления в опухолевой ткани мезенхимальных стволовых клеток, нагруженные наноэмульсией ПФУ.In experiments, female nude nude mice aged 4-6 weeks were used. The animals were kept in a light / dark cycle of 12 hours under free access to sterile water and sterile rodent food. Immediately prior to tumor inoculation, the animals were implanted under the skin of the interscapular region with 60-day-release pellets with 1.5 mg of estrodiol (Innovative Research of America, USA) using a precision trocar. Cells of human adenocarcinoma MCF-7 in an amount of 5 · 10 6 were inoculated in 0.2 ml of culture medium subcutaneously into the chest fat fold. Twice a week, animals were examined with measurements of the maximum (a) and minimum (b) sizes of the resulting tumors and their volume was calculated by the formula V = 0.4 · a · b 2 . After reaching an average tumor size of 500 mm 3 , an experiment was conducted to study the accumulation of mesenchymal stem cells in the tumor tissue loaded with PFC nanoemulsion.
Для изучения накопления в опухолевой ткани мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, нагруженные наноэмульсией перфторуглеродов «Перфторан®», получали по методике, описанной в примере 1 в условиях замещения 50% культуральной среды наноэмульсией и инкубации в течение 12 часов. После двух отмывок двукратным объемом сбалансированного солевого раствора Хенкса от непоглощенной эмульсии центрифугированием при 400 g 7 минут клетки суспензировали в физиологическом растворе из расчета 10·106 клеток/мл. Полученную суспензию вводили опытной группе животных в хвостовую вену в дозе 1 мл/кг. Контрольной группе животных вводили в хвостовую вену такое же количество разведенной в 20 раз физиологическим раствором наноэмульсии «Перфторан®». Через 6 часов и на 1, 2, 3 сутки забивали по три животных в опытной и контрольной группах. У забитых животных вырезали опухоль, тщательно удаляя прилегающие ткани, а также печень, селезенку и кусочки массой около 0,3 г из бедренной мышцы и брюшной стенки в районе паха. Извлеченный биоматериал подсушивали, без усилия зажимая между листами фильтровальной бумаги, взвешивали, помещали во флаконы с герметично закрывающимися крышками и хранили в замороженном состоянии до проведения пробоподготовки для хроматографического определения перфторуглеродов.To study the accumulation of tumor tissue in the tumor tissue, bone marrow mesenchymal stem cells loaded with Perftoran ® perfluorocarbons nanoemulsion were prepared according to the procedure described in Example 1 under the conditions of replacing 50% of the culture medium with nanoemulsion and incubation for 12 hours. After two washes with twice the volume of Hanks balanced saline from the non-absorbed emulsion by centrifugation at 400 g for 7 minutes, the cells were suspended in saline at a rate of 10 · 10 6 cells / ml. The resulting suspension was administered to the experimental group of animals in the tail vein at a dose of 1 ml / kg. The control group of animals was injected into the tail vein with the same amount diluted 20 times with physiological solution of Perftoran ® nanoemulsion. After 6 hours and on days 1, 2, 3, three animals were slaughtered in the experimental and control groups. A tumor was excised from slaughtered animals, carefully removing adjacent tissues, as well as a liver, spleen, and pieces weighing about 0.3 g from the femoral muscle and abdominal wall in the groin area. The extracted biomaterial was dried, squeezed between the sheets of filter paper without effort, weighed, placed in bottles with hermetically sealed lids, and stored frozen until sample preparation for chromatographic determination of perfluorocarbons.
Для извлечение перфторуглеродов к отобранным образцам после размораживания добавляли по 1 мл эмульсии, содержащей 20% по объему фторуглерода С6F13СН=НСF13С6 и и 1% Triton Х-100. Полученные пробы гомогенизировали 1 минуту при 20000 об/минуту на диспергаторе ULTRA-TURRAX® T 10 basic2 (IKА® Werke GmbH & Co., Germany). После 2-часовой экстракции при комнатной температуре из каждой пробы отбиралось по 0,5 мл и отобранная эмульсия разрушалась добавлением равного объема этанола. Каплю отделившихся фторуглеродов осаждали центрифугированием и несколько раз отмывали водой, после чего отделившуюся смесь ПФУ использовали для хроматографического анализа, который проводили, как описано в примере 1.To extract perfluorocarbons, 1 ml of an emulsion containing 20% by volume of fluorocarbon С 6 F 13 СН = НСF 13 С 6 and 1% Triton Х-100 was added to the selected samples after thawing. Samples were homogenized for 1 minute at 20,000 revolutions / minute for disperser ULTRA-TURRAX ® T 10 basic2 (IKA ® Werke GmbH & Co., Germany) . After 2 hours of extraction at room temperature, 0.5 ml was taken from each sample and the selected emulsion was destroyed by the addition of an equal volume of ethanol. A drop of separated fluorocarbons was precipitated by centrifugation and washed several times with water, after which the separated PFC mixture was used for chromatographic analysis, which was carried out as described in example 1.
Согласно полученным результатам при введении мышам с привитой солидной опухолью аденокарциномы человека MCF-7 мезенхимальных стволовых клеток человека, нагруженных наноэмульсией перфторуглеродов, максимальное удельное содержание перфторуглеродов наблюдается в опухоли и достигается на 2 сутки, практически не меняясь к 3 суткам.According to the results obtained, when MCF-7 human mesenchymal stem cells loaded with perfluorocarbons nanoemulsion were injected into mice inoculated with a solid tumor of a human adenocarcinoma of the person, the maximum specific content of perfluorocarbons is observed in the tumor and is reached on day 2, practically unchanging by 3 days.
При этом удельное содержание перфторуглеродов в других исследовавшихся тканях (печени, селезенке, мышечной ткани и тканях брюшной стенки) оказывается существенно меньше. В случае самостоятельного введения наноэмульсии перфторуглеродов в кровеносное русло уже через 6 часов наблюдается повышенное удельное содержание перфторуглеродов в печени и несколько меньшее в селезенке по сравнению с мышечной тканью, тканями брюшной стенки и опухолевой тканью. Отмеченные различия несколько усиливаются к 1 суткам и практически не меняются в дальнейшем.In this case, the specific content of perfluorocarbons in other tissues studied (liver, spleen, muscle tissue and tissues of the abdominal wall) is significantly less. In the case of self-administration of perfluorocarbon nanoemulsion into the bloodstream, after 6 hours there is an increased specific content of perfluorocarbons in the liver and slightly lower in the spleen compared to muscle tissue, abdominal wall tissues and tumor tissue. The noted differences somewhat increase by 1 day and practically do not change in the future.
Полученные данные свидетельствуют об избирательном накоплении мезенхимальных стволовых клеток в опухолевой ткани и о возможности использования их для накопления в опухоли медленно выводящихся форм лекарственных средств.The data obtained indicate selective accumulation of mesenchymal stem cells in the tumor tissue and the possibility of using them to accumulate slowly excreted forms of drugs in the tumor.
Пример 3.Example 3
Изучение влияния мезенхимальных стволовых клеток, нагруженных наноэмульсией перфторуглеродов, на эффективность противоопухолевой терапии в условиях повышенной оксигенации в эксперименте на мышах.Study of the effect of mesenchymal stem cells loaded with perfluorocarbon nanoemulsion on the effectiveness of antitumor therapy under conditions of increased oxygenation in a mouse experiment.
В экспериментах использовали самок бестимусных мышей nude, которым прививали опухоль аденокарциномы человека MCF-7, как описано в примере 2. Мезенхимальные стволовые клетки, нагруженные наноэмульсией перфторуглеродов «Перфторан®», получали по методике, описанной в примере 1, в условиях замещения 50% культуральной среды наноэмульсией и инкубации в течение 12 часов. После двух отмывок двукратным объемом сбалансированного солевого раствора Хенкса от непоглощенной эмульсии центрифугированием при 400 g 7 минут клетки суспензировали в физиологическом растворе из расчета 10·106 клеток/мл.In experiments, female nude nude mice were used, which were inoculated with MCF-7 human adenocarcinoma tumor, as described in Example 2. Mesenchymal stem cells loaded with Perftoran ® perfluorocarbon nanoemulsion were prepared according to the procedure described in Example 1 under 50% culture substitution conditions medium nanoemulsion and incubation for 12 hours. After two washes with twice the volume of Hanks balanced saline from the non-absorbed emulsion by centrifugation at 400 g for 7 minutes, the cells were suspended in saline at a rate of 10 · 10 6 cells / ml.
После достижения среднего объема опухолей 50 мм3 всем экспериментальным животным, за исключением одной контрольной группы, в качестве химиотерапевтической процедуры три раза с перерывом в неделю внутрибрюшинно вводили 15 мг/кг 5-фторурацила.After reaching an average tumor volume of 50 mm 3, all experimental animals, with the exception of one control group, received 15 mg / kg of 5-fluorouracil intraperitoneally as a chemotherapeutic procedure three times with a break of a week.
Первой опытной группе животных каждый раз за двое суток до инъекции 5-фторурацила в хвостовую вену вводили приготовленную, как описано выше, суспензию мезенхимальных стволовых клеток, нагруженных наноэмульсией перфторуглеродов в дозе 1 мл/кг. За десять минут до инъекции 5-фторурацила животных этой группы помещали в камеру с карбогеном (95% кислорода и 5% углекислого газа), в которой они находились еще час после инъекции.The first experimental group of animals every two days before the injection of 5-fluorouracil in the tail vein was injected prepared as described above, a suspension of mesenchymal stem cells loaded with nanoemulsion perfluorocarbons at a dose of 1 ml / kg. Ten minutes before the injection of 5-fluorouracil, animals of this group were placed in a chamber with carbogen (95% oxygen and 5% carbon dioxide), in which they were still an hour after injection.
Вторая опытная группа отличалась от первой внутривенным введением такого же количества мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, не нагруженных наноэмульсией перфторуглеродов, которые лишь дважды отмывались от культуральной среды двукратным объемом сбалансированного солевого раствора Хенкса, как описано выше. Животные дышали обогащенной кислородом газовой смесью.The second experimental group differed from the first by the intravenous administration of the same number of bone marrow mesenchymal stem cells not loaded with perfluorocarbon nanoemulsion, which were only washed twice from the culture medium with a double volume of Hanks balanced salt solution, as described above. The animals breathed an oxygen-rich gas mixture.
В третьей опытной группе инъекция 5-фторурацила сопровождалась переводом животных на дыхание карбогеном по описанной выше схеме без введения каких-либо дополнительных препаратов.In the third experimental group, the injection of 5-fluorouracil was accompanied by the transfer of animals to respiration by carbogen according to the scheme described above without the introduction of any additional drugs.
Животным четвертой опытной группы вводили только 5-фторурацил без введения клеточных препаратов и дыхания обогащенной кислородом газовой смесью.The animals of the fourth experimental group were administered only 5-fluorouracil without the introduction of cell preparations and respiration with an oxygen-enriched gas mixture.
Животные контрольной группы не подвергались каким-либо терапевтическим воздействиям.Animals of the control group were not exposed to any therapeutic effects.
Оценка противоопухолевого эффекта проведенных процедур была проведена по результатам измерений размеров опухолей через два месяца после первой инъекции 5-фторурацила. Наименьший размер имели опухоли у животных первой группы, которым дополнительно вводились мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, нагруженные наноэмульсией перфторуглеродов. У животных второй группы, получавших интактные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, и животных третьей группы, которым не вводилось клеточных препаратов, но которые дышали обогащенной кислородом газовой смесью, как и первые две группы, размеры опухолей были заметно больше и близки между собой. Животные четвертой группы, которым вводился только 5-фторурацил без введения клеточных препаратов и дыхания обогащенной кислородом газовой смесью, имели еще более крупные опухоли. Самые крупные опухоли имели животные контрольной группы, не подвергавшиеся каким-либо терапевтическим воздействиям.Evaluation of the antitumor effect of the performed procedures was carried out according to the results of measuring the size of the tumors two months after the first injection of 5-fluorouracil. Tumors were smallest in animals of the first group, which were additionally injected with bone marrow mesenchymal stem cells loaded with perfluorocarbon nanoemulsion. In animals of the second group receiving intact bone marrow mesenchymal stem cells, and animals of the third group, which were not injected with cell preparations, but which breathed an oxygen-enriched gas mixture, like the first two groups, the size of the tumors was noticeably larger and close to each other. Animals of the fourth group, which were administered only 5-fluorouracil without the introduction of cell preparations and respiration with an oxygen-enriched gas mixture, had even larger tumors. The largest tumors were animals of the control group, not exposed to any therapeutic effects.
Таким образом, описанный эксперимент демонстрирует положительный терапевтический эффект мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, нагруженных наноэмульсией перфторуглеродов, при лечении солидных опухолей в условиях повышенной оксигенации.Thus, the described experiment demonstrates the positive therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells loaded with perfluorocarbon nanoemulsion in the treatment of solid tumors under conditions of increased oxygenation.
Пример 4.Example 4
Изучение влияния мезенхимальных стволовых клеток, нагруженных наноэмульсией перфторуглеродов, на эффективность противоопухолевой терапии в условиях повышенной оксигенации в эксперименте на мышах при наличии метастазов.Study of the effect of mesenchymal stem cells loaded with perfluorocarbon nanoemulsion on the effectiveness of antitumor therapy under conditions of increased oxygenation in an experiment in mice in the presence of metastases.
В экспериментах использовали мышей линии С57В 1/6 обоего пола в возрасте 2-3 месяца. Животных содержали при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище (сбалансированный по составу корм для лабораторных крыс и мышей). Всем экспериментальным животным производили трансплантацию солидной опухоли - аденокарциномы легких Льюиса, - внутримышечным введением в мышцу левого бедра по 5·106 клеток в 0,1 мл физиологического раствора.In the experiments used mice line C57B 1/6 of both sexes at the age of 2-3 months. The animals were kept under natural light and free access to water and food (balanced feed for laboratory rats and mice). All experimental animals underwent transplantation of a solid tumor - Lewis lung adenocarcinoma - by intramuscular injection of 5 × 10 6 cells in 0.1 ml of physiological saline into the muscle of the left thigh.
Первой группе экспериментальных животных через семь суток в хвостовую вену вводили приготовленную, как описано в примерах 2 и 3, суспензию мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, нагруженных наноэмульсией перфторуглеродов в дозе 1 мл/кг. На 9 сутки животным этой группы в неповрежденную хвостовую вену вводили наноэмульсию перфторуглеродов «Перфторан» в дозе 30 мл/кг и помещали их в камеру с карбогеном (95% кислорода и 5% углекислого газа). Затем через 30 минут животным внутрибрюшинно вводили циклофосфан в дозе 100 мг/кг в виде 1% раствора в физиологическом растворе и оставляли их в камере с карбогеном еще на 1 час.After seven days, the first group of experimental animals was injected with a suspension of bone marrow mesenchymal stem cells loaded with perfluorocarbon nanoemulsion at a dose of 1 ml / kg, which was prepared as described in Examples 2 and 3. On day 9, animals of this group were injected with an intact tail vein perfluorocarbon nanoemulsion at a dose of 30 ml / kg and placed in a chamber with carbogen (95% oxygen and 5% carbon dioxide). Then, after 30 minutes, the animals were injected intraperitoneally with cyclophosphamide at a dose of 100 mg / kg in the form of a 1% solution in physiological saline and left them in the chamber with carbogen for another 1 hour.
Вторая группа экспериментальных животных отличалась от первой тем, что входящим в нее особям не вводили наноэмульсию перфторуглеродов.The second group of experimental animals differed from the first in that the individuals included in it were not injected with a perfluorocarbon nanoemulsion.
Третьей группе не вводили наноэмульсию перфторуглеродов и мезенхимальные стволовые клеток костного мозга при сохранении режима нахождения в камере с карбогеном и введения циклофосфана, как описано для первой группы.The third group was not injected with perfluorocarbon nanoemulsion and bone marrow mesenchymal stem cells while maintaining the regime of being in the chamber with carbogen and introducing cyclophosphamide, as described for the first group.
Контрольная группа животных не подвергалась каким-либо терапевтическим воздействиям.The control group of animals was not exposed to any therapeutic effects.
Каждая экспериментальная группа включала по 10 животных. На 25-е сутки животных подвергали декапитации, задние конечности отделяли и по разности их веса определяли массу опухоли. Для выявления метастазов извлекали легкие и фиксировали их в 10% формалине, а затем под бинокулярной лупой оценивали наличие метастатических узлов. Противоопухолевый и антиметастатический эффекты процедур оценивали по снижению массы опухоли и среднему количеству метастазов в легких.Each experimental group included 10 animals. On the 25th day, the animals were decapitated, the hind limbs were separated, and the mass of the tumor was determined by the difference in their weight. To detect metastases, the lungs were removed and fixed in 10% formalin, and then the presence of metastatic nodes was evaluated under a binocular magnifier. The antitumor and antimetastatic effects of the procedures were evaluated by reducing the mass of the tumor and the average number of metastases in the lungs.
Результаты проведенных экспериментов показали, что в опытных группах сформировались опухоли, меньшие по массе при сравнении с контролем. Так, средняя масса опухоли у животных первой группы была на 54%, во второй - на 37% и в третьей - на 24% меньше средней массы опухоли у животных контрольной группы. При этом метастазы в легких были выявлены у 2 животных в первой, у 5 - во второй, 7 - в третьей группах и у всех животных контрольной группы.The results of the experiments showed that in the experimental groups formed tumors, smaller in weight when compared with the control. So, the average tumor mass in animals of the first group was 54%, in the second - by 37% and in the third - 24% less than the average tumor mass in animals of the control group. Moreover, lung metastases were detected in 2 animals in the first, in 5 in the second, 7 in the third group and in all animals of the control group.
Приведенные данные подтверждают повышение эффективности противоопухолевых химиотерапевтических процедур при применении заявляемого способа. Это выражается как в большей степени подавления развития солидной опухоли, так и в меньшем количестве формирующихся метастазов.The data confirm the increase in the effectiveness of antitumor chemotherapeutic procedures when using the proposed method. This is expressed both in a greater degree of suppression of the development of a solid tumor, and in a smaller number of metastases that are forming.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010109034/14A RU2437692C2 (en) | 2010-03-12 | 2010-03-12 | Method of treating solid malignant growths and their metastases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010109034/14A RU2437692C2 (en) | 2010-03-12 | 2010-03-12 | Method of treating solid malignant growths and their metastases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010109034A RU2010109034A (en) | 2011-09-20 |
| RU2437692C2 true RU2437692C2 (en) | 2011-12-27 |
Family
ID=44758380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010109034/14A RU2437692C2 (en) | 2010-03-12 | 2010-03-12 | Method of treating solid malignant growths and their metastases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2437692C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2657604C2 (en) * | 2013-03-27 | 2018-06-14 | Тайхо Фармасьютикал Ко., Лтд. | Antitumour agent including irinotecan hydrochloride hydrate |
-
2010
- 2010-03-12 RU RU2010109034/14A patent/RU2437692C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МЕШАЛКИН Ю.П. и др. Перспективы и проблемы использования неорганических наночастиц в онкологии (обзор)// Журнал Сибирского Федерального Университета, Биология 3 (2008, 1), стр.260-266. GUNDERSEN SI, et al. Hemoglobin-based oxygen carrier enhanced tumor oxygenation: a novel strategy for cancer therapy, Biotechnol Prog. 2008 Nov-Dec; 24(6):1353-64, реферат. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2657604C2 (en) * | 2013-03-27 | 2018-06-14 | Тайхо Фармасьютикал Ко., Лтд. | Antitumour agent including irinotecan hydrochloride hydrate |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010109034A (en) | 2011-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | Bioresponsive immune-booster-based prodrug nanogel for cancer immunotherapy | |
| Yi et al. | Transforming “cold” tumors into “hot” ones via tumor-microenvironment-responsive siRNA micelleplexes for enhanced immunotherapy | |
| RU2492863C2 (en) | Agent improving anti-cancer effect and containing liposomal agent containing oxaliplatin, and anti-cancer agent containing liposomal agent | |
| Yuan et al. | Hypoxia-modulatory nanomaterials to relieve tumor hypoxic microenvironment and enhance immunotherapy: Where do we stand? | |
| US20190262267A1 (en) | Pharmaceutical solution having a toxicity-reducing effect for antitumor drugs, and pharmaceutical composition comprising same | |
| Guo et al. | Fucoidan-functionalized activated platelet-hitchhiking micelles simultaneously track tumor cells and remodel the immunosuppressive microenvironment for efficient metastatic cancer treatment | |
| Huang et al. | Dual mitigation of immunosuppression combined with photothermal inhibition for highly effective primary tumor and metastases therapy | |
| WO2018208700A1 (en) | Quinic acid-modified nanoparticles and uses thereof | |
| Sunil et al. | Convection enhanced delivery of light responsive antigen capturing oxygen generators for chemo-phototherapy triggered adaptive immunity | |
| Yang et al. | Engineering prodrug nanomicelles as pyroptosis inducer for codelivery of PI3K/mTOR and CDK inhibitors to enhance antitumor immunity | |
| Hendriks et al. | Isolated lung perfusion with melphalan and tumor necrosis factor for metastatic pulmonary adenocarcinoma | |
| RU2437692C2 (en) | Method of treating solid malignant growths and their metastases | |
| CN106606783B (en) | A kind of targeting is passed altogether to be released the drug of photosensitizer and chemotherapeutics and passs release system | |
| CN106420618A (en) | Preparation method for Anti-CA IX modified norcantharidin micelle nanoparticle | |
| CN104840478A (en) | Application of NADPH in preparation of drugs used for treating cardio-cerebrovascular diseases | |
| CN114699537A (en) | ROS (reactive oxygen species) -responsive anticancer drug for improving curative effect of hypoxia-sensitized PD-1 antibody | |
| CN113908276A (en) | Light-controlled drug release nano particle and preparation method and application thereof | |
| Klubes et al. | Attempts to increase intratumoral blood flow in the rat solid Walker 256 tumor by the use of the perfluorocarbon emulsion Fluosol-DA | |
| WO2022165794A2 (en) | Method for inhibiting tumor stem cells, and method for regulating tumor blood vessel normalization | |
| CN104840479A (en) | Application of NADPH in preparation of drugs used for treating heart diseases | |
| CN114404389B (en) | Gene delivery vector and anti-tumor application thereof | |
| CN113144213B (en) | Nano-drug for multi-stage pH response gene-drug co-delivery, preparation method and application thereof | |
| US11517588B2 (en) | Nanoparticle, preparation process and uses thereof | |
| CN115317447B (en) | Co-supported indocyanine green and sorafenib micelle and preparation method and application thereof | |
| WO2022151335A2 (en) | Method for tumor treatment by means of hyperbaric oxygen combined with immune drug |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180313 |