RU2434942C2 - Oligiribonucleotides and methods of their application for treatment of acute renal failure and other diseases - Google Patents

Oligiribonucleotides and methods of their application for treatment of acute renal failure and other diseases Download PDF

Info

Publication number
RU2434942C2
RU2434942C2 RU2007116168/10A RU2007116168A RU2434942C2 RU 2434942 C2 RU2434942 C2 RU 2434942C2 RU 2007116168/10 A RU2007116168/10 A RU 2007116168/10A RU 2007116168 A RU2007116168 A RU 2007116168A RU 2434942 C2 RU2434942 C2 RU 2434942C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
sirna
patient
chain
renal failure
ribonucleotide
Prior art date
Application number
RU2007116168/10A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2007116168A (en
Inventor
Елена ФЕЙНШТЕЙН (IL)
Елена Фейнштейн
Дэниел ЗУРР (IL)
Дэниел ЗУРР
Шай ЭРЛИХ (US)
Шай ЭРЛИХ
Original Assignee
Кварк Фармасьютикалс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Кварк Фармасьютикалс, Инк. filed Critical Кварк Фармасьютикалс, Инк.
Publication of RU2007116168A publication Critical patent/RU2007116168A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2434942C2 publication Critical patent/RU2434942C2/en

Links

Images

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: compound has structure: 5'ugaagggugaaauauucuc-Z3' 3'Z'-acuucccacuuuauaagag5', where constituting it ribonucleotides can be both 2'-O-Me-modified by sugar residue and non-modified. A Z and Z', if present, means dTdT, which is covalently bound on 3'- chain end. Claimed invention also relates to pharmaceutical composition, containing claimed compound and pharmaceutically acceptable carrier. Obtained compound or pharmaceutical composition can be used for treatment of patient with acute renal failure or ischemic-reperfusion injury, caused by surgery, or for treatment of patient with induced by cisplatin deafness.
EFFECT: introduction of claimed compound contributes to improvement of transplanted tissue survival after transplantation in patient.
18 cl, 7 dwg, 5 tbl, 4 ex

Description

На протяжении этой заявки цитируются различные патентные и научные публикации. Раскрытия этих публикаций в их полном виде включены тем самым в качестве ссылки в эту заявку для более полного описания состояния области, к которой относится это изобретение.Various patent and scientific publications are cited throughout this application. The disclosures of these publications in their entirety are hereby incorporated by reference into this application for a more complete description of the state of the field to which this invention relates.

Уровень техникиState of the art

siPHK и интерференция РНКsiRNA and RNA interference

Интерференция РНК (PHKi) является феноменом, включающим в себя зависимый от двухцепочечной (дц) РНК геноспецифический посттранскрипционный сайленсинг генов. Первоначально попытки исследования этого феномена и манипуляции клетками млекопитающих экспериментально были тщетными вследствие активного неспецифического антивирусного защитного механизма, который активировался длинными молекулами дцРНК; см. Gil et al. 2000, Apoptosis, 5:107-114. Позднее было обнаружено, что синтетические дуплексы, состоящие из 21 нуклеотида РНК, могли опосредовать геноспецифическую PHKi в клетках млекопитающих без стимуляции общих антивирусных защитных механизмов (см. Elbashir et al. Nature 2001, 411:494-498 и Caplen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2001, 98:9742-9747). В результате малые интерферирующие РНК (siPHK), которые являются короткими двухцепочечными РНК, стали мощными инструментами в попытке понимания функции генов.RNA interference (PHKi) is a phenomenon that includes double-stranded (dc) RNA-dependent gene-specific post-transcriptional gene silencing. Initially, attempts to study this phenomenon and manipulate mammalian cells were experimentally futile due to an active nonspecific antiviral defense mechanism that was activated by long dsRNA molecules; see Gil et al. 2000, Apoptosis 5: 107-114. It was later discovered that synthetic duplexes consisting of 21 RNA nucleotides could mediate gene-specific PHKi in mammalian cells without stimulation of common antiviral defense mechanisms (see Elbashir et al. Nature 2001, 411: 494-498 and Caplen et al. Proc. Natl Acad. Sci. 2001, 98: 9742-9747). As a result, small interfering RNAs (siRNAs), which are short double-stranded RNAs, have become powerful tools in trying to understand the function of genes.

Таким образом, интерференцией РНК (PHKi) называют процесс последовательность-специфического посттранскрипционного сайленсинга генов у млекопитающих, опосредованный малыми интерферирующими РНК (siPHK) (Fire et al., 1998, Nature 391, 806) или микроРНК (miRNA) (Ambros V. Nature 431:7006, 350-355 (2004); и Bartel DP. Cell. 2004 Jan 23; 116(2):281-97 MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function). Соответствующий процесс у растений называют обычно специфическим посттранскрипционным сайленсингом генов или РНК-сайленсингом, а у грибов называют также подавлением. siPHK является двухцепочечной молекулой РНК, которая осуществляет отрицательную регуляцию или производит сайленсинг (предотвращает экспрессию) гена/мРНК ее эндогенной (клеточной) копии. Интерференция РНК основана на способности молекул дцРНК вступать в специфический белковый комплекс, который затем нацеливается на комплементарную клеточную РНК и подвергает ее специфической деградации. Таким образом, реакция интерференции РНК имеет в своей основе эндонуклеазный комплекс, содержащий siPHK, обычно называемый РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечной РНК, имеющей последовательность, комплементарную антисмысловой цепи этого siPHK-дуплекса. Расщепление РНК-мишени может иметь место в середине района, комплементарного антисмысловой цепи siPHK-дуплекса (Elbashir et al. 2001, Genes Dev., 15, 188). Более подробно, более длинные дцРНК расщепляются на короткие (17-29 п.н.) дцРНК-фрагменты (также называемые короткими ингибирующими РНК - “siPHK”) РНКазами типа III (DICER, DROSHA, etc., Bernstein et al., Nature, 2001, v.409, p.363-6; Lee et al., Nature, 2003, 425, p.415-9). Белковый комплекс RISC узнает эти фрагменты и комплементарную мРНК. Весь процесс достигает кульминации при расщеплении мРНК-мишени под действием эндонуклеазы (McManus & Sharp, Nature Rev Genet, 2002, v.3, p.737-47; Paddison & Hannon, Curr. Opin. Mol. Ther. 2003 Jun; 5(3):217-24). В отношении информации об этих терминах и предлагаемых механизмах см. Bernstein E., Denli AM. Hannon GJ: 2001 The rest is silence. RNA. I; 7(11): 1509-21; Nishikura K.: 2001 A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. I 16; 107(4): 415-8 и РСТ публикацию WO 01/36646 (Glover et al.).Thus, RNA interference (PHKi) is a mammalian sequence-specific post-transcriptional gene silencing process mediated by small interfering RNAs (siRNA) (Fire et al., 1998, Nature 391, 806) or miRNA (miRNA) (Ambros V. Nature 431 : 7006, 350-355 (2004); and Bartel DP. Cell. 2004 Jan 23; 116 (2): 281-97 MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function). The corresponding process in plants is usually called specific post-transcriptional gene silencing or RNA silencing, and in fungi it is also called inhibition. siRNA is a double-stranded RNA molecule that carries out negative regulation or silences (prevents expression) the gene / mRNA of its endogenous (cellular) copy. RNA interference is based on the ability of dsRNA molecules to enter a specific protein complex, which then targets a complementary cellular RNA and exposes it to specific degradation. Thus, the RNA interference reaction is based on an endonuclease complex containing siRNA, commonly referred to as an RNA-induced silencing complex (RISC), which mediates the cleavage of single-stranded RNA having a sequence complementary to the antisense strand of this siRNA duplex. The cleavage of the target RNA can take place in the middle of the region complementary to the antisense strand of the siRNA duplex (Elbashir et al. 2001, Genes Dev., 15, 188). In more detail, longer dsRNAs are cleaved into short (17-29 bp) dsRNA fragments (also called “siRNA short inhibitory RNAs”) type III RNases (DICER, DROSHA, etc., Bernstein et al., Nature, 2001, v.409, p.363-6; Lee et al., Nature, 2003, 425, p.415-9). The RISC protein complex recognizes these fragments and complementary mRNA. The entire process culminates in the cleavage of the target mRNA by endonuclease (McManus & Sharp, Nature Rev Genet, 2002, v. 3, p. 737-47; Paddison & Hannon, Curr. Opin. Mol. Ther. 2003 Jun; 5 ( 3): 217-24). For information on these terms and proposed mechanisms, see Bernstein E., Denli AM. Hannon GJ: 2001 The rest is silence. RNA I; 7 (11): 1509-21; Nishikura K .: 2001 A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. I 16; 107 (4): 415-8 and PCT publication WO 01/36646 (Glover et al.).

Отбор и синтез siPHK, соответствующих известным генам, описаны в обширной литературе; см., например, Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. 2004 Improved and automated prediction of effective siRNA Biochem. Biophys, Res. Commun. Jun 18; 319(1): 264-74; Sioud M, Leirdal M., 2004, Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs, Methods Mol. Biol.; 252:457-69; Levenkova N, Gu Q, Rux JJ. 2004, Gene specific siRNA selector Bioinformatics. I 12; 20(3): 430-2 и Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K., Guidelines for the selection of higly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference Nucleic Acids Res. 2004 I 9; 32(3):936-48. См. также Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR. Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 I 24; 43(7):192-7. См. также РСТ публикации WO 2004/015107 (Atugen) и WO 02/44321 (Tuschl et al.), а также Chiu YL, Rana TM. siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis, RNA 2003 Sep; 9(9):1034-48 и I патент №5898031 и 6107094 (Crooke) в отношении получения модифицированных/более стабильных siPHK.The selection and synthesis of siRNA corresponding to known genes is described in the extensive literature; see, for example, Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. 2004 Improved and automated prediction of effective siRNA Biochem. Biophys, Res. Commun. Jun 18; 319 (1): 264-74; Sioud M, Leirdal M., 2004, Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs , Methods Mol. Biol .; 252: 457-69; Levenkova N, Gu Q, Rux JJ. 2004, Gene specific siRNA selector Bioinformatics. I 12; 20 (3): 430-2 and Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K., Guidelines for the selection of higly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference Nucleic Acids Res. 2004 I 9; 32 (3): 936-48. See also Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR. Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 I 24; 43 (7): 192-7. See also PCT Publication WO 2004/015107 (Atugen) and WO 02/44321 (Tuschl et al.), As well as Chiu YL, Rana TM. siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis, RNA 2003 Sep; 9 (9): 1034-48 and I Patent No. 5898031 and 6107094 (Crooke) in relation to obtaining modified / more stable siRNA.

Несколько групп исследователей описали получение векторов на основе ДНК, способных генерировать siPHK в клетках. Этот способ обычно включает в себя транскрипцию коротких шпилечных РНК, которые подвергаются эффективному процессингу с образованием siPHK в клетках. Paddison et al. PNAS 2002, 99:1443-1448; Paddison et al. Genes & Dev 2002, 16:948-958; Sui et al. PNAS 2002, 8:5515-5520; и Brummelkamp et al. Science 2002, 296:550-553. В этих сообщениях описаны способы получения siPHK, способных специфически нацеливаться на многочисленные эндогенно и экзогенно экспрессируемые гены.Several research groups have described the preparation of DNA-based vectors capable of generating siRNA in cells. This method typically involves transcription of short hairpin RNAs that are efficiently processed to form siRNA in cells. Paddison et al. PNAS 2002, 99: 1443-1448; Paddison et al. Genes & Dev 2002, 16: 948-958; Sui et al. PNAS 2002, 8: 5515-5520; and Brummelkamp et al. Science 2002, 296: 550-553. These reports describe methods for producing siRNAs capable of specifically targeting numerous endogenously and exogenously expressed genes.

Недавно siPHK успешно использовали для ингибирования в организме приматов; подробнее см. Tolentino et al., Retina 24(1) February 2004 I 132-138.Recently, siRNAs have been used successfully to inhibit primates; see Tolentino et al., Retina 24 (1) February 2004 I 132-138 for more details.

Ген и полипептид р53The p53 gene and polypeptide

Ген р53 человека является хорошо известным и в высокой степени исследованным геном. Полипептид р53 играет ключевую роль в клеточных механизмах стрессовых реакций посредством превращения различных стимулов, например разрушающих ДНК условий, таких как гамма-излучение, нарушение регуляции транскрипции или репликации и неопластической трансформации, в сигнал для остановки клеточного роста или апоптоза (Gottlieb et al., 1996, Biochem. Biophys. Acta, 1287, p.77). Полипептид р53 является существенным для индукции запрограммированной смерти клеток или «апоптоза» в качестве реакции на такие стимулы.The human p53 gene is a well-known and highly researched gene. The p53 polypeptide plays a key role in the cellular mechanisms of stress reactions by converting various stimuli, for example, DNA-degrading conditions, such as gamma radiation, dysregulation of transcription or replication, and neoplastic transformation, into a signal to stop cell growth or apoptosis (Gottlieb et al., 1996 Biochem. Biophys. Acta, 1287, p. 77). The p53 polypeptide is essential for inducing programmed cell death or “apoptosis” in response to such stimuli.

Большинство противораковых терапий повреждают или убивают также и нормальные клетки, которые содержат нативный р53, вызывая тяжелые побочные эффекты, ассоциированные с повреждением или смертью здоровых клеток. Поскольку такие побочные эффекты в высокой степени определяются р53-опосредованной смертью нормальных клеток, в качестве терапевтической стратегии во избежание этих тяжелых токсичных событий была предложена временная супрессия р53 во время острой фазы противораковой терапии. Это было описано в Патенте США №6593353 и в Komarov PG et al., 1999, A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy, Science, 285(5434):1651, 1653. Было показано, что р53 участвует в индуцированной химиотерапией и облучением алопеции (Botcharev et al., 2000, p53 is essential for Chemotherapy-induced Hair Loss, Cancer Research, 60, 5002-5006).Most anti-cancer therapies also damage or kill normal cells that contain native p53, causing severe side effects associated with damage or death to healthy cells. Since such side effects are highly determined by p53-mediated death of normal cells, a temporary suppression of p53 during the acute phase of anti-cancer therapy has been proposed as a therapeutic strategy to avoid these severe toxic events. This has been described in US Patent No. 6,593,353 and in Komarov PG et al., 1999, A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy, Science, 285 (5434): 1651, 1653. It was shown that p53 participates in induced chemotherapy and irradiation of alopecia (Botcharev et al., 2000, p53 is essential for Chemotherapy-induced Hair Loss, Cancer Research, 60, 5002-5006).

АлопецияAlopecia

Недавно были получены разительные успехи в понимании молекул и путей, регулирующих образование волосяных фолликулов и рост волос. Химиотерапия нарушает пролиферацию кератиноцитов матрикса в волосяной луковице, которые образуют волосяной стержень. Это заставляет волосяные фолликулы входить в стадию дистрофической регрессии, при которой целостность волосяного стержня оказывается нарушенной, и затем этот волос разрывается и выпадает. Поскольку более чем 90% фолликулов волосистой части головы в любой момент находятся в стадии роста, эти волосы быстро выпадают после химиотерапии, и, следовательно, такая алопеция является быстрой и обширной (George Cotsarelis and Sarah E. Millar, 2001, Towards a molecular understanding of hair loss and its treatment, TRENDS in Molecular Medicine Vol.7, №7). Химиотерапевтическими лекарственными средствами, которые с наибольшей вероятностью вызывают выпадение волос, являются цисплатин, цитарабин, циклофосфамид, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, ифосфамид и винкристин. Индуцированная облучением общая алопеция наблюдается фактически у 100% пациентов, которые получают облучение всего головного мозга (WBR), в частности, 3000 рад и более.Recently, striking advances have been made in understanding the molecules and pathways that regulate hair follicle formation and hair growth. Chemotherapy disrupts the proliferation of matrix keratinocytes in the hair bulb, which form the hair shaft. This causes the hair follicles to enter the stage of dystrophic regression, in which the integrity of the hair shaft is impaired, and then this hair breaks and falls out. Since more than 90% of the scalp follicles are at any time growing, these hairs fall out quickly after chemotherapy, and therefore such alopecia is fast and extensive (George Cotsarelis and Sarah E. Millar, 2001, Towards a molecular understanding of hair loss and its treatment, TRENDS in Molecular Medicine Vol. 7, No. 7). The chemotherapeutic drugs that are most likely to cause hair loss are cisplatin, cytarabine, cyclophosphamide, doxorubicin, epirubicin, etoposide, ifosfamide and vincristine. Irradiation-induced total alopecia is observed in virtually 100% of patients who receive irradiation of the whole brain (WBR), in particular, 3000 rad or more.

Выпадение волос является одним из наиболее нежелательных побочных действий химиотерапии среди пациентов с раком, хотя выпавшие волосы со временем снова вырастают после химиотерапии. С точки зрения пациента, выпадение волос (алопеция) стоит на втором месте только после тошноты в качестве вызывающего беспокойство побочного действия химиотерапии. Приблизительно 75% пациентов оценивают индуцированное химиотерапией выпадение волос как событие, вызывающее такое же или большее расстройство, что и вызванная раком боль.Hair loss is one of the most undesirable side effects of chemotherapy among cancer patients, although hair loss grows again after chemotherapy over time. From the patient’s point of view, hair loss (alopecia) is second only to nausea as a worrisome side effect of chemotherapy. Approximately 75% of patients rate chemotherapy-induced hair loss as an event causing the same or greater disorder as cancer-induced pain.

Таким образом, хотя нарушение роста волос не представляет угрозу жизни, его огромное влияние на социальные взаимодействия и на психологическое благополучие пациентов является несомненным. Эта потребность в способах лечения выпадения волос питает мультимиллиардную (в долларах) промышленность. Несмотря на это, большинство продаваемых в настоящее время продуктов неэффективно, что подтверждается тем фактом, что Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA) одобрило только два способа лечения выпадения волос. Ни одна из известных терапий и ни одно из известных лекарственных средств не является эффективным в отношении индуцируемой лечением рака алопеции.Thus, although a violation of hair growth does not pose a threat to life, its enormous impact on social interactions and the psychological well-being of patients is undeniable. This need for treatments for hair loss is fueling the multi-billion dollar industry. Despite this, most of the products currently sold are ineffective, as evidenced by the fact that the US Food and Drug Administration (FDA) has approved only two treatments for hair loss. None of the known therapies and none of the known drugs is effective against the inducible treatment of cancer of alopecia.

Острая почечная недостаточность (ОПН) (ARF)Acute Renal Failure (ARF) (ARF)

ОПН является клиническим синдромом, характеризующимся быстрым ухудшением почечной функции, развивающимся в течение нескольких дней. Основным признаком ОПН является резкое уменьшение скорости клубочковой фильтрации (GFR), приводящее к удерживанию азотистых продуктов выделения (мочевины, креатинина). В общей мировой популяции ежегодно имеют место 170-200 случаев тяжелой ОПН на миллион населения. К настоящему времени не существует специфической терапии для установленной ОПН. Было обнаружено, что несколько лекарственных средств ослабляют токсическую и ишемическую экспериментальную ОПН, о чем судили по более низким уровням сывороточного креатинина, уменьшению гистологического повреждения и более быстрому восстановлению почечной функции на моделях различных животных. Они включают в себя антиоксиданты, блокаторы кальциевых каналов, мочегонные средства, вазоактивные вещества, гормоны роста, противовоспалительные агенты и другие. Однако лекарственные средства, которые исследовались в клинических испытаниях, не обнаруживали преимущества, и их использование в клинической ОПН не было одобрено.ARF is a clinical syndrome characterized by rapid deterioration of renal function, developing over several days. The main sign of acute renal failure is a sharp decrease in glomerular filtration rate (GFR), leading to the retention of nitrogenous excretion products (urea, creatinine). In the total world population, 170-200 cases of severe acute renal failure per million people occur annually. To date, there is no specific therapy for established ARF. Several drugs have been found to weaken toxic and ischemic experimental acute renal failure, as judged by lower levels of serum creatinine, decreased histological damage, and faster restoration of renal function in various animal models. They include antioxidants, calcium channel blockers, diuretics, vasoactive substances, growth hormones, anti-inflammatory agents and others. However, the drugs that were investigated in clinical trials did not show benefits, and their use in clinical ARF was not approved.

У большинства госпитализированных пациентов ОПН вызывала острый некроз почечных канальцев (ATN), который происходит в результате ишемического и/или нефротоксического повреждений. Почечная гипоперфузия вызывается гиповолемическим, кардиогенным и септическим шоком, введением вазоконстрикторных лекарственных средств или реноваскулярным повреждением. Нефротоксины включают в себя экзогенные токсины, такие как контрастные вещества и аминогликозиды, а также эндогенный токсин, такой как миоглобин. Однако недавние исследования подтверждают, что апоптоз в почечных тканях в большинстве случаев ОПН человека является сильно выраженным. Основным сайтом апоптотической смерти клеток является дистальный нефрон. Во время начальной фазы ишемического повреждения потеря целостности актинового цитоскелета приводит к уплощению эпителия с потерей щеточной каемки, потерей фокальных клеточных контактов и к последующему высвобождению клетки из выстилающего субстрата. Было сделано предположение, что апоптотическая смерть канальцевых клеток может быть более прогностической в отношении функциональных изменений, чем некротическая смерть клеток (Komarov et al. Science, 1999 Sep. 10; 285(5434):1733-7); см. также (Supavekin et al. Kidney Int. 2003 May; 63(5):1714-24).In most hospitalized patients, acute renal failure caused acute renal tubular necrosis (ATN), which occurs as a result of ischemic and / or nephrotoxic damage. Renal hypoperfusion is caused by hypovolemic, cardiogenic and septic shock, the introduction of vasoconstrictor drugs, or renovascular damage. Nephrotoxins include exogenous toxins, such as contrast agents and aminoglycosides, as well as an endogenous toxin, such as myoglobin. However, recent studies confirm that apoptosis in the renal tissues in most cases of human acute renal failure is very pronounced. The main site of apoptotic cell death is the distal nephron. During the initial phase of ischemic damage, the loss of integrity of the actin cytoskeleton leads to flattening of the epithelium with loss of brush border, loss of focal cell contacts and subsequent release of the cell from the lining substrate. It has been suggested that apoptotic tubular cell death may be more predictive of functional changes than necrotic cell death (Komarov et al. Science, 1999 Sep. 10; 285 (5434): 1733-7); see also (Supavekin et al. Kidney Int. 2003 May; 63 (5): 1714-24).

Таким образом, в настоящее время нет удовлетворительных способов терапии для предупреждения и/или лечения токсической алопеции и острой почечной недостаточности и нет удовлетворительного способа терапии многих других заболеваний и нарушений, которые сопровождаются повышенным уровнем полипептида р53, и, следовательно, существует потребность в развитии новых соединений для этой цели.Thus, there are currently no satisfactory therapies for the prevention and / or treatment of toxic alopecia and acute renal failure, and there is no satisfactory treatment for many other diseases and disorders that are accompanied by an elevated level of the p53 polypeptide, and therefore there is a need for the development of new compounds for this purpose.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Данное изобретение обеспечивает новые двухцепочечные олигорибонуклеотиды, которые ингибируют ген р53. Данное изобретение обеспечивает также фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько таких олигорибонуклеотидов, и вектор, способный экспрессировать этот олигорибонуклеотид. Данное изобретение обеспечивает также способ лечения пациента, страдающего от заболевания, в котором временное (обратимое) ингибирование активности р53 является полезным, предусматривающий введение этому пациенту одного или нескольких олигорибонуклеотидов, обычно в виде фармацевтической композиции, в терапевтически эффективной дозе таким образом, чтобы посредством этого лечить этого пациента. Данное изобретение рассматривает также лечение других нарушений, которые сопровождаются повышенным уровнем полипептида р53. Поскольку долгосрочная инактивация р53 может значительно увеличивать риск рака, предпочтительно, чтобы ингибирование р53 с использованием молекул согласно изобретению было временным (транзиторным).The present invention provides novel double-stranded oligoribonucleotides that inhibit the p53 gene. The invention also provides a pharmaceutical composition comprising one or more of these oligoribonucleotides and a vector capable of expressing this oligoribonucleotide. The present invention also provides a method of treating a patient suffering from a disease in which temporary (reversible) inhibition of p53 activity is useful, comprising administering to this patient one or more oligoribonucleotides, usually in the form of a pharmaceutical composition, in a therapeutically effective dose so as to thereby treat this patient. The present invention also contemplates the treatment of other disorders that are accompanied by an elevated level of the p53 polypeptide. Since long-term inactivation of p53 can significantly increase the risk of cancer, it is preferred that inhibition of p53 using the molecules of the invention is temporary (transient).

В одном предпочтительном варианте осуществления описанные здесь новые молекулы siPHK могут быть использованы в лечении опухолей в случаях, когда временная супрессия р53 с использованием siPHK р53 могла бы быть полезной вместе с общепринятой химиотерапией (как описано здесь) или лучевой терапией (радиотерапией). Например, описанные здесь новые молекулы siPHK будут защищать нормальные р53-содержащие клетки от индуцированного химиотерапией или лучевой терапией апоптоза. Описанные здесь новые молекулы siPHK могут быть также использованы для ингибирования экспрессии р53 в конкретных раковых клетках в случаях, когда ингибирование р53 потенцирует апоптотическую клеточную смерть этих клеток. Конкретно, лучевая терапия и химиотерапия могут вызывать тяжелые побочные действия, такие как тяжелое повреждение лимфоидной и гемопоэтической системы и кишечного эпителия, которые ограничивают эффективность этих терапий, и могут вызывать выпадение волос, которое вызывает психологическое расстройство. Эти побочные действия обусловлены р53-опосредованным апоптозом. Таким образом, для элиминации или уменьшения вредных побочных действий, ассоциированных с лечением рака, была бы полезна индукция временного ингибирования активности р53 в нормальных клетках с использованием молекул siPHK согласно изобретению с защитой посредством этого нормальной ткани.In one preferred embodiment, the novel siRNA molecules described herein can be used in the treatment of tumors in cases where temporary p53 suppression using siRNA p53 could be useful in conjunction with conventional chemotherapy (as described here) or radiation therapy (radiotherapy). For example, the novel siRNA molecules described herein will protect normal p53-containing cells from chemotherapy or radiation-induced apoptosis. The novel siRNA molecules described herein can also be used to inhibit p53 expression in specific cancer cells in cases where inhibition of p53 potentiates apoptotic cell death of these cells. Specifically, radiation therapy and chemotherapy can cause severe side effects, such as severe damage to the lymphoid and hematopoietic system and intestinal epithelium, which limit the effectiveness of these therapies, and can cause hair loss, which causes a psychological disorder. These side effects are due to p53-mediated apoptosis. Thus, to eliminate or reduce the harmful side effects associated with the treatment of cancer, the induction of transient inhibition of p53 activity in normal cells using the siRNA molecules of the invention with protection through this normal tissue would be useful.

В другом предпочтительном варианте осуществления описанные здесь новые молекулы siPHK могут быть использованы в лечении острой почечной недостаточности (ОПН), которая характеризуется быстрым нарушением почечной функции, ассоциированным с апопототической смертью клеток в почечной ткани.In another preferred embodiment, the novel siRNA molecules described herein can be used in the treatment of acute renal failure (ARF), which is characterized by rapid renal impairment associated with apoptotic cell death in the renal tissue.

Описанные здесь новые молекулы siPHK могут быть также использованы в других состояниях, в которых р53 активируется как следствие различных стрессов, связанных с повреждениями, такими как ожог, гипертермия (перегревание организма), гипоксия, связанная с блокированным кровоснабжением, таким как в случае инфаркта миокарда, и ишемия. Временное ингибирование р53 с использованием молекул siPHK согласно изобретению может быть терапевтически эффективным в уменьшении или элиминации р53-зависимой смерти нейронов в центральной нервной системе, т.е. при повреждении головного мозга и спинного мозга, консервировании тканей и органов перед трансплантацией, подготовке хозяина для пересадки костного мозга и в уменьшении или элиминации нейронного повреждения во время припадка.The new siRNA molecules described here can also be used in other conditions in which p53 is activated as a result of various stresses associated with injuries, such as a burn, hyperthermia (overheating of the body), hypoxia associated with blocked blood supply, such as in the case of myocardial infarction, and ischemia. Temporary inhibition of p53 using siRNA molecules of the invention can be therapeutically effective in reducing or eliminating p53-dependent death of neurons in the central nervous system, i.e. with damage to the brain and spinal cord, preserving tissues and organs before transplantation, preparing the host for bone marrow transplantation, and reducing or eliminating neuronal damage during a seizure.

р53 играет также роль в старении клеток. В частности, морфологические и физиологические изменения нормальных тканей, связанные со старением, могут быть связаны с активностью р53. Известно, что старые клетки, которые накапливаются в тканях с течением времени, поддерживают очень высокие уровни р53-зависимой транскрипции. р53-зависимая секреция ингибиторов факторов роста накапливается в стареющей ткани. Таким образом, описанные здесь молекулы siPHK могут быть также использованы в супрессии старения тканей.p53 also plays a role in cell aging. In particular, morphological and physiological changes in normal tissues associated with aging can be associated with p53 activity. Old cells that accumulate in tissues over time are known to support very high levels of p53-dependent transcription. p53-dependent secretion of growth factor inhibitors accumulates in aging tissue. Thus, the siRNA molecules described herein can also be used in suppressing tissue aging.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг.1. На этой фигуре представлена нуклеотидная последовательность гена р53 человека SEQ ID NO:1.Figure 1. The figure shows the nucleotide sequence of the human p53 gene of SEQ ID NO: 1.

Фиг.2. На этой фигуре представлена аминокислотная последовательность полипептида р53 человека SEQ ID NO:2.Figure 2. The figure shows the amino acid sequence of the human p53 polypeptide of SEQ ID NO: 2.

Фиг.3. На этой фигуре показаны результаты Вестерн-блота, демонстрирующие действие различных siPHK р53 человека на экспрессию р53.Figure 3. This figure shows the results of a Western blot showing the effect of various human p53 siRNAs on p53 expression.

Фиг.4. На этой фигуре показаны результаты Вестерн-блота, демонстрирующие действие различных siPHK р53 мыши на экспрессию р53.Figure 4. This figure shows the results of a Western blot showing the effect of various mouse p53 siRNAs on p53 expression.

Фиг.5. На этой фигуре показан уровень сывороточного креатинина как показатель острой почечной недостаточности у животных, которые были подвергнуты билатеральному пережиманию почечных артерий и были обработаны соединением siPHK р53 или контролем, как указано.Figure 5. This figure shows the level of serum creatinine as an indicator of acute renal failure in animals that were subjected to bilateral compression of the renal arteries and were treated with siRNA p53 or control, as indicated.

Фиг.6. На этой фигуре показана степень некроза канальцев в почечной ткани у животных, которые были подвергнуты билатеральному пережиманию почечных артерий и были обработаны соединением siPHK р53.6. This figure shows the degree of tubular necrosis in the renal tissue in animals that underwent bilateral compression of the renal arteries and were treated with siRNA p53.

Фиг.7. Эта фигура демонстрирует, что обработка siPHK р53 вызывает отрицательную регуляцию экспрессии про-апоптотического гена Puma в кортикальном компартменте почки у животного, подвергнутого ишемическому/реперфузионному повреждению почки.7. This figure demonstrates that treatment with p53 siRNA causes downregulation of the expression of the pro-apoptotic Puma gene in the cortical compartment of a kidney in an animal subjected to ischemic / reperfusion damage to the kidney.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Данное изобретение относится, в общем, к соединениям, которые вызывают отрицательную регуляцию экспрессии гена р53, конкретно, к новым малым интерферирующим РНК (siPHK) и к применению этих новых siPHK в лечении различных заболеваний и медицинских состояний, в частности алопеции или острой почечной недостаточности или нарушения, сопровождающегося повышенным уровнем полипептида р53.This invention relates, in General, to compounds that cause downregulation of p53 gene expression, in particular to new small interfering RNAs (siRNAs) and the use of these new siRNAs in the treatment of various diseases and medical conditions, in particular alopecia or acute renal failure or disorders accompanied by an increased level of p53 polypeptide.

Авторы согласно изобретению обнаружили, что полезно индуцировать временное ингибирование р53 для лечения указанных заболеваний или нарушений. Способы, молекулы и композиции, которые ингибируют р53, обсуждаются здесь подробно, и любые из указанных молекул и/или композиций могут быть с пользой использованы в лечении пациента, страдающего от любого из указанных состояний.The inventors have found that it is useful to induce transient inhibition of p53 for the treatment of these diseases or disorders. Methods, molecules and compositions that inhibit p53 are discussed here in detail, and any of these molecules and / or compositions can be useful in treating a patient suffering from any of these conditions.

Данное изобретение обеспечивает способы и композиции для ингибирования экспрессии гена р53-мишени in vivo. Обычно этот способ включает в себя введение олигорибонуклеотидов, таких как малые интерферирующие РНК (т.е. siPHK), которые нацелены на конкретную мРНК р53 и гибридизуются или взаимодействуют с этой мРНК в биологических условиях (внутри клетки), или материала нуклеиновой кислоты, который может продуцировать siPHK в клетке, в количестве, достаточном для отрицательной регуляции экспрессии гена-мишени по механизму интерференции РНК. В частности, рассматриваемый способ может быть использован для ингибирования экспрессии гена р53 для лечения заболевания.The present invention provides methods and compositions for inhibiting expression of a p53 target gene in vivo. Typically, this method involves the introduction of oligoribonucleotides, such as small interfering RNAs (i.e., siRNAs) that target a particular p53 mRNA and hybridize or interact with that mRNA under biological conditions (within the cell), or nucleic acid material that can to produce siRNA in the cell, in an amount sufficient to upregulate the expression of the target gene by the RNA interference mechanism. In particular, the subject method can be used to inhibit p53 gene expression for treating a disease.

Согласно данному изобретению, молекулы siPHK или ингибиторы гена р53 могут быть использованы в качестве лекарственных средств для лечения различных патологий, в частности алопеции и острой почечной недостаточности, или других нарушений, сопровождающихся повышенным уровнем полипептида р53. Поскольку долгосрочная инактивация р53 может значительно увеличивать риск рака, предпочтительно, чтобы ингибирование р53 с использованием молекул согласно изобретению было временным/обратимым.According to this invention, siRNA molecules or p53 gene inhibitors can be used as drugs for the treatment of various pathologies, in particular alopecia and acute renal failure, or other disorders accompanied by an increased level of the p53 polypeptide. Since long-term inactivation of p53 can significantly increase the risk of cancer, it is preferable that the inhibition of p53 using the molecules of the invention is temporary / reversible.

Данное изобретение связано с двухцепочечными олигорибонуклеотидами (siPHK), которые вызывают отрицательную регуляцию экспрессии гена р53. siPHK согласно изобретению является дуплексным олигорибонуклеотидом, в котором смысловая цепь произведена из мРНК-последовательности гена р53, а антисмысловая цепь является комплементарной смысловой цепи. Обычно некоторое отклонение от мРНК-последовательности-мишени допускается без нарушения активности siPHK (см., например, Czauderna et al 2003 Nucleic Acids Research 31(11), 2705-2716). siPHK согласно изобретению ингибирует экспрессию гена на посттранскрипционном уровне, с разрушением или без разрушения мРНК. Не связывая себя теорией, авторы считают, что siPHK может быть нацелена на мРНК для специфического расщепления и деградации и/или может ингибировать трансляцию из мРНК-мишени.The present invention relates to double-stranded oligoribonucleotides (siRNA), which cause downregulation of p53 gene expression. The siRNA according to the invention is a duplex oligoribonucleotide in which the sense strand is derived from the p53 gene mRNA sequence and the antisense strand is complementary to the sense strand. Typically, some deviation from the target mRNA sequence is allowed without impairing siRNA activity (see, for example, Czauderna et al 2003 Nucleic Acids Research 31 (11), 2705-2716). The siRNA according to the invention inhibits gene expression at the post-transcriptional level, with or without mRNA degradation. Without binding themselves to theory, the authors believe that siRNA can be targeted to mRNA for specific cleavage and degradation and / or can inhibit translation from the target mRNA.

Имеются по меньшей мере четыре варианта полипептидов р53 (см. Bourdon et al. Genes Dev., 2005; 19:2122-2137). Последовательность, приведенная на фиг.1, является нуклеотидной последовательностью gi-8400737. Соответствующая полипептидная последовательность имеет 393 аминокислоты; см. фиг.2. Все варианты и любые другие подобные минорные варианты включены в определение полипептида р53 и в определение генов р53, кодирующих их.There are at least four variants of p53 polypeptides (see Bourdon et al. Genes Dev., 2005; 19: 2122-2137). The sequence shown in FIG. 1 is the nucleotide sequence of gi-8400737. The corresponding polypeptide sequence has 393 amino acids; see figure 2. All variants and any other similar minor variants are included in the definition of p53 polypeptide and in the definition of p53 genes encoding them.

В данном контексте термин «ген р53» определяется как любой гомолог гена р53, имеющий предпочтительно 90% гомологию, более предпочтительно, 95% гомологию и даже более предпочтительно, 98% гомологию с кодирующим аминокислоты районом SEQ ID NO:1 или последовательностями нуклеиновых кислот, которые связываются с геном р53 в условиях гибридизации высокой жесткости, которые хорошо известны в данной области (например, см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), обновленные в 1995 и 1998 годах.In this context, the term "p53 gene" is defined as any homologue of the p53 gene having preferably 90% homology, more preferably 95% homology and even more preferably 98% homology with the amino acid coding region of SEQ ID NO: 1 or nucleic acid sequences that bind to the p53 gene under high stringency hybridization conditions that are well known in the art (e.g. see Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), updated in 1995 and 1998 .

В данном контексте термин «р53» или «полипептид р53» определяется как любой гомолог полипептида р53, имеющий предпочтительно 90% гомологию, более предпочтительно, 95% гомологию и даже более предпочтительно, 98% гомологию с SEQ ID NO:2, в виде полноразмерной последовательности или ее фрагмента или домена, в виде мутанта или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты сплайсингового варианта, в виде химеры с другими полипептидами, при условии, что любая последовательность из вышеуказанных последовательностей имеет ту же самую или по существу ту же самую биологическую функцию, что и полипептид р53.In this context, the term “p53” or “p53 polypeptide” is defined as any homologue of a p53 polypeptide having preferably 90% homology, more preferably 95% homology and even more preferably 98% homology with SEQ ID NO: 2, in the form of a full-sized sequence or a fragment or domain thereof, in the form of a mutant or polypeptide encoded by a splicing variant nucleic acid sequence, in the form of a chimera with other polypeptides, provided that any sequence of the above sequences has the same and whether essentially the same biological function as the p53 polypeptide.

Обычно siPHK, используемые в данном изобретении, содержат рибонуклеиновую кислоту, содержащую двухцепочечную структуру, причем эта двухцепочечная структура содержит первую цепь и вторую цепь, причем первая цепь содержит первый сегмент смежных нуклеотидов, и причем указанный первый сегмент является по меньшей мере частично комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени, а второй сегмент является по меньшей мере частично идентичным нуклеиновой кислоте-мишени, причем указанная первая цепь и/или указанная вторая цепь содержит множество групп модифицированных нуклеотидов, имеющих модификацию в положении 2', причем в этой цепи каждая группа модифицированных нуклеотидов фланкирована на одной или на обеих сторонах фланкирующей группой нуклеотидов, причем эти фланкирующие нуклеотиды, образующие фланкирующую группу нуклеотидов, являются либо немодифицированными нуклеотидами, либо нуклеотидами, имеющими модификацию, отличающуюся от модификации вышеупомянутых модифицированных нуклеотидов. Кроме того, указанная первая цепь и/или указанная вторая цепь может содержать указанное множество модифицированных нуклеотидов и может содержать указанное множество групп модифицированных нуклеотидов.Typically, the siRNAs used in this invention comprise a ribonucleic acid containing a double-stranded structure, this double-stranded structure containing a first chain and a second chain, the first chain containing a first segment of adjacent nucleotides, and wherein said first segment is at least partially complementary to the nucleic acid target, and the second segment is at least partially identical to the target nucleic acid, wherein said first chain and / or said second chain contains many groups modified nucleotides having a modification in position 2 ', and in this chain each group of modified nucleotides is flanked on one or both sides by a flanking group of nucleotides, and these flanking nucleotides forming a flanking group of nucleotides are either unmodified nucleotides or nucleotides having a modification, different from the modification of the above modified nucleotides. Furthermore, said first strand and / or said second strand may comprise said plurality of modified nucleotides and may comprise said plurality of groups of modified nucleotides.

Группа модифицированных нуклеотидов и/или группа фланкирующих нуклеотидов может содержать некоторое количество нуклеотидов, причем это количество нуклеотидов выбрано из группы, состоящей из 1-10 нуклеотидов. В связи с любыми указанными здесь диапазонами должно быть понятно, что каждый диапазон включает в себя любое отдельное целое число между соответствующими числами, используемыми для определения диапазона, в том числе указанные два числа, ограничивающие указанный диапазон. Таким образом, в данном случае эта группа содержит один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида, четыре нуклеотида, пять нуклеотидов, шесть нуклеотидов, семь нуклеотидов, восемь нуклеотидов, девять нуклеотидов и десять нуклеотидов.The group of modified nucleotides and / or the group of flanking nucleotides may contain a certain number of nucleotides, and this number of nucleotides is selected from the group consisting of 1-10 nucleotides. In connection with any of the ranges indicated herein, it should be understood that each range includes any single integer between the corresponding numbers used to define the range, including the indicated two numbers that limit the specified range. Thus, in this case, this group contains one nucleotide, two nucleotides, three nucleotides, four nucleotides, five nucleotides, six nucleotides, seven nucleotides, eight nucleotides, nine nucleotides and ten nucleotides.

Распределение модифицированных нуклеотидов указанной первой цепи может быть смещено на один или несколько нуклеотидов относительно распределения модифицированных нуклеотидов второй цепи.The distribution of the modified nucleotides of said first strand may be shifted by one or more nucleotides relative to the distribution of the modified nucleotides of the second strand.

Обсуждаемые выше модификации могут быть выбраны из группы, состоящей из амино, фтора, метокси, алкокси, алкила, амино, фтора, хлора, брома, CN, CF, имидазола, карбоксилата, тиоата, низшего С1-С10 алкила, замещенного низшего алкила, алкарила, или аралкила, OCF3, OCN, O-, S- или N-алкила; O-, S- или N-алкенила; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; гетероциклоалкила; гетероциклоалкарила; аминоалкиламино; полиалкиламино или замещенного силила, как, среди прочих, описано в Европейских патентах ЕРО 586520 В1 или ЕРО 618925 В1.The modifications discussed above can be selected from the group consisting of amino, fluoro, methoxy, alkoxy, alkyl, amino, fluoro, chloro, bromo, CN, CF, imidazole, carboxylate, thioate, lower C 1 -C 10 alkyl, substituted lower alkyl alkaryl or aralkyl, OCF 3 , OCN, O-, S- or N-alkyl; O-, S- or N-alkenyl; SOCH 3 ; SO 2 CH 3 ; ONO 2 ; NO 2 , N 3 ; heterocycloalkyl; heterocycloalkaryl; aminoalkylamino; polyalkylamino or substituted silyl, as, among others, described in European patents EPO 586520 B1 or EPO 618925 B1.

Двухцепочечная структура siPHK может быть затуплена на одной стороне или на обеих сторонах. Более конкретно, эта двухцепочечная структура может быть затуплена на стороне двухцепочечной структуры, которая ограничена 5'-концом первой цепи и 3'-концом второй цепи, или эта двухцепочечная структура может быть затуплена на стороне двухцепочечной структуры, которая ограничена 3'-концом первой цепи и 5'-концом второй цепи.The siRNA double stranded structure may be dull on one side or on both sides. More specifically, this double-stranded structure may be dull on the side of the double-stranded structure that is bounded by the 5'-end of the first chain and the 3'-end of the second chain, or this double-stranded structure may be dulled on the side of the double-stranded structure that is bounded by the 3'-end of the first chain and the 5'-end of the second chain.

Кроме того, по меньшей мере одна из этих двух цепей может иметь выступ по меньшей мере одного нуклеотида на 5'-конце; этот выступ может состоять из по меньшей мере одного дезоксирибонуклеотида. По меньшей мере одна из этих цепей может также необязательно иметь выступ из по меньшей мере одного нуклеотида на 3'-конце.In addition, at least one of these two chains may have a protrusion of at least one nucleotide at the 5'-end; this protrusion may consist of at least one deoxyribonucleotide. At least one of these chains may also optionally have a protrusion of at least one nucleotide at the 3'-end.

Длина двухцепочечной структуры этой siPHK обычно равна приблизительно 17-21, и более предпочтительно, 18-19 оснований. Кроме того, длина указанной первой цепи и/или длина указанной второй цепи может независимо друг от друга быть выбрана из группы, содержащей диапазоны приблизительно в 15 оснований - приблизительно в 23 основания, в 17 оснований - 21 основание и в 18 или 19 оснований.The length of the double-stranded structure of this siRNA is typically about 17-21, and more preferably 18-19 bases. In addition, the length of said first chain and / or the length of said second chain can be independently selected from the group consisting of ranges of about 15 bases — about 23 bases, 17 bases — 21 bases and 18 or 19 bases.

Кроме того, комплементарность между указанной первой цепью и нуклеиновой кислотой-мишенью может быть абсолютной, или дуплекс, образованный между первой цепью и нуклеиновой кислотой-мишенью, может содержать по меньшей мере 15 нуклеотидов, где имеется одно ошибочное спаривание или два ошибочных спаривания между указанной первой цепью и нуклеиновой кислотой-мишенью, образующими указанную двухцепочечную структуру.In addition, the complementarity between said first strand and the target nucleic acid may be absolute, or the duplex formed between the first strand and the target nucleic acid may contain at least 15 nucleotides where there is one mismatch or two mismatches between the first the chain and the target nucleic acid, forming the specified double-stranded structure.

В некоторых случаях как первая цепь, так и вторая цепь, каждая, содержат по меньшей мере одну группу модифицированных нуклеотидов и по меньшей мере одну фланкирующую группу нуклеотидов, причем каждая группа модифицированных нуклеотидов содержит по меньшей мере один нуклеотид и каждая фланкирующая группа нуклеотидов содержит по меньшей мере один нуклеотид, причем каждая группа модифицированных нуклеотидов первой цепи сопоставляется с фланкирующей группой нуклеотидов на второй цепи, причем наиболее концевой 5'-нуклеотид первой цепи является нуклеотидом группы модифицированных нуклеотидов, а наиболее 3'-концевой нуклеотид второй цепи является нуклеотидом фланкирующей группы нуклеотидов. Каждая группа модифицированных нуклеотидов может состоять из единственного нуклеотида и/или каждая фланкирующая группа нуклеотидов может состоять из единственного нуклеотида.In some cases, both the first strand and the second strand each contain at least one group of modified nucleotides and at least one flanking group of nucleotides, each group of modified nucleotides containing at least one nucleotide and each flanking group of nucleotides at least one nucleotide, each group of modified nucleotides of the first chain being mapped to a flanking group of nucleotides on the second chain, the most terminal 5'-nucleotide of the first chain being etsya nucleotide modified group of nucleotides, and most 3'-terminal nucleotide of the second strand is a nucleotide of the flanking group of nucleotides. Each group of modified nucleotides may consist of a single nucleotide and / or each flanking group of nucleotides may consist of a single nucleotide.

Кроме того, может быть так, что на первой цепи нуклеотид, образующий фланкирующую группу нуклеотидов, является немодифицированным нуклеотидом, который расположен в 3'-направлении относительно нуклеотида, образующего группу модифицированных нуклеотидов, а на второй цепи нуклеотид, образующий группу модифицированных нуклеотидов, является модифицированным нуклеотидом, который расположен в 5'-направлении относительно нуклеотида, образующего фланкирующую группу нуклеотидов.In addition, it may be that on the first chain the nucleotide forming the flanking group of nucleotides is an unmodified nucleotide that is located in the 3'-direction relative to the nucleotide forming the group of modified nucleotides, and on the second chain the nucleotide forming the group of modified nucleotides is modified nucleotide, which is located in the 5'-direction relative to the nucleotide forming a flanking group of nucleotides.

Кроме того, первая цепь siPHK может содержать восемь-двенадцать, предпочтительно девять-одиннадцать, групп модифицированных нуклеотидов, а вторая цепь может содержать семь-одиннадцать, предпочтительно восемь-десять, групп модифицированных нуклеотидов.In addition, the first siRNA chain may contain eight to twelve, preferably nine to eleven, groups of modified nucleotides, and the second chain may contain seven to eleven, preferably eight to ten, groups of modified nucleotides.

Первая цепь и вторая цепь могут быть связаны структурой петли, которая может состоять из полимера, не являющегося нуклеиновой кислотой, такого как, помимо прочего, полиэтиленгликоль. Альтернативно, эта структура петли может состоять из нуклеиновой кислоты.The first chain and the second chain may be connected by a loop structure, which may consist of a non-nucleic acid polymer, such as, but not limited to, polyethylene glycol. Alternatively, this loop structure may consist of nucleic acid.

Кроме того, 5'-конец первой цепи siPHK может быть связан с 3'-концом второй цепи или 3'-конец первой цепи может быть связан с 5'-концом второй цепи, причем указанная связь осуществляется через представляющий собой нуклеиновую кислоту линкер, обычно имеющий длину 10-2000 нуклеооснований.In addition, the 5'-end of the first siRNA chain may be linked to the 3'-end of the second chain or the 3'-end of the first chain may be connected to the 5'-end of the second chain, said link being via a nucleic acid linker, typically having a length of 10-2000 nucleobases.

В частности, данное изобретение обеспечивает соединение, имеющее структуру А:In particular, this invention provides a compound having structure A:

5'(N)x - Z 3' (антисмысловая цепь)5 '(N) x - Z 3' (antisense chain)

3'Z' -(N')y 5' (смысловая цепь)3'Z '- (N') y 5 '(sense circuit)

где каждый N и N' означает рибонуклеотид, который может быть модифицированным или немодифицированным по его сахарному остатку, а (N)x и (N')y означает олигомер, в котором каждый последовательный N или N' соединен с последующим N или N' ковалентной связью;where each N and N ′ is a ribonucleotide which may be modified or unmodified with respect to its sugar residue, and (N) x and (N ′) y is an oligomer in which each consecutive N or N ′ is connected followed by N or N ′ covalent communication;

где каждый из x и y означает целое число 19-40;where each of x and y means an integer of 19-40;

где каждый из Z и Z' может присутствовать или отсутствовать, но, если присутствует, означает dTdT и является ковалентно присоединенным на 3'-конце цепи, в которой он присутствует; иwhere each of Z and Z 'may be present or absent, but if present, means dTdT and is covalently attached at the 3'-end of the chain in which it is present; and

где последовательность (N)x содержит антисмысловую последовательность относительно мРНК р53, в частности, любой из антисмысловых последовательностей, представленных в любой из таблиц А, В и С.where the sequence (N) x contains an antisense sequence relative to p53 mRNA, in particular, any of the antisense sequences shown in any of tables A, B and C.

Специалистам с квалификацией в данной области будет легко понятно, что соединения согласно изобретению состоят из множества нуклеотидов, которые связаны ковалентными связями. Каждая такая ковалентная связь может быть фосфодиэфирной связью, фосфотиоатной связью или комбинацией из обеих, вдоль длины нуклеотидной последовательности отдельной цепи. Другие возможные модификации скелета описаны, помимо прочего, в патентах США с номерами 5587361; 6242589; 6277967; 6326358; 5399676; 5489677 и 5596086.Those skilled in the art will readily appreciate that the compounds of the invention are comprised of multiple nucleotides that are linked by covalent bonds. Each such covalent bond may be a phosphodiester bond, a phosphothioate bond, or a combination of the two, along the length of the nucleotide sequence of a single chain. Other possible skeleton modifications are described, inter alia, in US Pat. Nos. 5,587,361; 6242589; 6,277,967; 6,326,358; 5,399,676; 5,489,677 and 5,596,086.

В конкретных вариантах осуществления х и y равны предпочтительно целому числу приблизительно 19 - приблизительно 27, наиболее предпочтительно, приблизительно 19 - приблизительно 23. В конкретном варианте осуществления соединения согласно изобретению х может быть равен y (т.е. х=y) и в предпочтительных вариантах осуществления х=y=19 или х=y=21. В особенно предпочтительном варианте осуществления х=y=19.In specific embodiments, x and y are preferably an integer of about 19 to about 27, most preferably about 19 to about 23. In a particular embodiment of the compound of the invention, x may be equal to y (i.e., x = y) and in preferred embodiments x = y = 19 or x = y = 21. In a particularly preferred embodiment, x = y = 19.

В одном из воплощений соединения согласно изобретению и Z, и Z' отсутствуют; в другом варианте один из Z или Z' присутствует.In one of the embodiments of the compounds according to the invention and Z, and Z 'are absent; in another embodiment, one of Z or Z ′ is present.

В одном из воплощений соединения согласно изобретению все рибонуклеотиды согласно соединению являются немодифицированными по их сахарным остаткам.In one embodiment of a compound of the invention, all ribonucleotides of the compound are unmodified with respect to their sugar moieties.

В предпочтительных вариантах воплощения соединения согласно изобретению по меньшей мере один рибонуклеотид модифицирован по его сахарному остатку, предпочтительно в положении 2'. Эта модификация в положении 2' приводит к присутствию группы, которая предпочтительно выбрана из группы, состоящей из амино, фтора, метокси, алкокси и алкильной групп. В наиболее предпочтительном в настоящее время варианте осуществления эта группа в положении 2' является метокси (2'-О-метилом).In preferred embodiments of the compound of the invention, at least one ribonucleotide is modified at its sugar moiety, preferably at position 2 ′. This modification at position 2 ′ results in the presence of a group which is preferably selected from the group consisting of amino, fluoro, methoxy, alkoxy and alkyl groups. In the currently most preferred embodiment, this group at position 2 ′ is methoxy (2′-O-methyl).

В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения антисимметричные рибонуклеотиды модифицированы как в антисмысловой, так и в смысловой цепях согласно соединению. В частности, siPHK, используемая в примерах, была модифицирована таким образом, что 2'-О-Ме-группа присутствовала на первом, третьем, пятом, седьмом, девятом, одиннадцатом, тринадцатом, пятнадцатом, семнадцатом и девятнадцатом нуклеотиде антисмысловой цепи, причем та же самая модификация, т.е. 2'-О-Ме-группа, присутствовала на втором, четвертом, шестом, восьмом, десятом, двенадцатом, четырнадцатом, шестнадцатом и восемнадцатом нуклеотиде смысловой цепи. Кроме того, следует отметить, что в случае конкретных нуклеиновых кислот согласно изобретению первый сегмент является идентичным первой цепи, а второй сегмент является идентичным второй цепи, и эти нуклеиновые кислоты также являются затупленными.In preferred embodiments of the invention, antisymmetric ribonucleotides are modified in both the antisense and sense chains according to the compound. In particular, the siRNA used in the examples was modified so that the 2'-O-Me group was present on the first, third, fifth, seventh, ninth, eleventh, thirteenth, fifteenth, seventeenth and nineteenth nucleotide of the antisense strand the same modification, i.e. 2'-O-Me-group, was present on the second, fourth, sixth, eighth, tenth, twelfth, fourteenth, sixteenth and eighteenth nucleotide of the sense strand. In addition, it should be noted that in the case of specific nucleic acids according to the invention, the first segment is identical to the first chain, and the second segment is identical to the second chain, and these nucleic acids are also dull.

В особенно предпочтительном варианте осуществления последовательность siPHK является последовательностью 15 в таблице А.In a particularly preferred embodiment, the siRNA sequence is sequence 15 in Table A.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления согласно изобретению, обе антисмысловая и смысловая цепи молекулы siPHK являются фосфорилированными только на 3'-конце, но не на 5'-конце. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления согласно изобретению, обе - антисмысловая и смысловая - цепи являются нефосфорилированными на 3'-конце, а также на 5'-конце. Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, 1-ый нуклеотид в положении 5' является специфически модифицированным во избежание любой возможности 5'-фосфорилирования in vivo.According to one preferred embodiment according to the invention, both the antisense and sense strands of the siRNA molecule are phosphorylated only at the 3'-end, but not at the 5'-end. According to another preferred embodiment according to the invention, both the antisense and the sense chains are non-phosphorylated at the 3'-end as well as at the 5'-end. According to another preferred embodiment of the present invention, the 1st nucleotide at position 5 ′ is specifically modified to avoid any possibility of 5′-phosphorylation in vivo.

В другом варианте воплощения соединения согласно изобретению, рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах антисмысловой цепи являются модифицированными по их сахарным остаткам, а рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах смысловой цепи являются немодифицированными по их сахарным остаткам.In another embodiment of the compound of the invention, the ribonucleotides at the 5'- and 3'-ends of the antisense chain are modified at their sugar residues, and the ribonucleotides at the 5'- and 3'-ends of the sense chain are unmodified at their sugar residues.

Кроме того, изобретение связано с вектором, способным экспрессировать любой из вышеуказанных олигорибонуклеотидов в немодифицированной форме в клетке, после чего может быть произведена подходящая модификация.In addition, the invention relates to a vector capable of expressing any of the above oligoribonucleotides in an unmodified form in a cell, after which a suitable modification can be made.

Изобретение связано также с композицией, содержащей одно или несколько соединений согласно изобретению в носителе, предпочтительно фармацевтически приемлемом носителе. Эта композиция может содержать смесь двух или более различных siPHK.The invention also relates to a composition comprising one or more compounds of the invention in a carrier, preferably a pharmaceutically acceptable carrier. This composition may contain a mixture of two or more different siRNAs.

Настоящее изобретение связано также с композицией, которая содержит вышеуказанное соединение согласно изобретению, ковалентно или нековалентно связанное с одним или несколькими соединениями согласно изобретению, в количестве, эффективном для ингибирования р53 человека, и носитель. Эта композиция может внутриклеточно подвергаться процессингу под действием эндогенных клеточных комплексов, с образованием одного или нескольких олигорибонуклеотидов согласно изобретению.The present invention also relates to a composition that contains the above compound according to the invention, covalently or non-covalently linked to one or more compounds according to the invention, in an amount effective to inhibit human p53, and a carrier. This composition can be intracellularly processed by endogenous cell complexes to form one or more oligoribonucleotides according to the invention.

Настоящее изобретение связано также с композицией, содержащей носитель и одно или несколько соединений согласно изобретению в количестве, эффективном для отрицательной регуляции экспрессии в клетке р53 человека, причем это соединение содержит последовательность, по существу комплементарную последовательности (N)x.The present invention also relates to a composition comprising a carrier and one or more compounds of the invention in an amount effective to down-regulate expression in a human p53 cell, the compound comprising a sequence substantially complementary to (N) x .

Кроме того, данное изобретение связано со способом отрицательной регуляции экспрессии гена р53 по меньшей мере на 50% в сравнении с контролем, предусматривающим контактирование мРНК-транскрипта гена р53 с одним или несколькими соединениями согласно изобретению.In addition, this invention relates to a method for downregulating p53 gene expression by at least 50% compared to a control involving contacting the p53 mRNA transcript with one or more compounds of the invention.

В одном варианте осуществления указанный олигорибонуклеотид отрицательно регулирует р53, причем такая отрицательная регуляция выбрана из группы, состоящей из отрицательной регуляции функции р53, отрицательной регуляции полипептида р53 и отрицательной регуляции экспрессии мРНК р53.In one embodiment, said oligoribonucleotide negatively regulates p53, which negative regulation is selected from the group consisting of negative regulation of p53 function, negative regulation of p53 polypeptide, and negative regulation of p53 mRNA expression.

В одном варианте осуществления соединение вызывает отрицательную регуляцию полипептида р53, причем эта отрицательная регуляция р53 выбрана из группы, состоящей из отрицательной регуляции функции р53 (которая может быть испытана ферментативным анализом или, помимо прочего, анализом связывания с известным взаимодействующим агентом нативного гена/полипептида, отрицательной регуляции белка р53 (которая может, помимо прочего, быть испытана методом Вестерн-блоттинга, ELISA или иммунопреципитации) и отрицательной регуляции экспрессии мРНК р53 (которая может быть, помимо прочего, испытана методом Нозерн-блоттинга, количественной ОТ-ПЦР, гибридизации in situ или гибридизации микромассива (биочипа)).In one embodiment, the compound causes downregulation of the p53 polypeptide, and this downregulation of p53 is selected from the group consisting of downregulation of the p53 function (which can be tested by enzymatic analysis or, inter alia, by binding analysis of a negative gene known for the native gene / polypeptide interacting agent regulation of p53 protein (which can, among other things, be tested by Western blotting, ELISA, or immunoprecipitation) and negative regulation of p53 mRNA expression (co oraya can be, among others, tested by Northern blotting, quantitative RT-PCR, in situ hybridization or microarray hybridization (biochip)).

Данное изобретение обеспечивает также способ лечения пациента, страдающего от заболевания, сопровождающегося повышенным уровнем полипептида р53, предусматривающий введение пациенту композиции согласно изобретению в терапевтически эффективной для лечения дозе. Предпочтительно, данное изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего от заболевания, при котором полезно временное ингибирование р53. В одном предпочтительном варианте осуществления, композиции согласно изобретению используют для лечения опухолей вместе с общепринятой химиотерапией или лучевой терапией для предупреждения алопеции, связанной с химиотерапией или лучевой терапией. В другом предпочтительном варианте осуществления, композиции согласно изобретению используют для лечения острой почечной недостаточности. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления, композиции согласно изобретению используют в состояниях, при которых р53 активируется как следствие различных стрессов, ассоциированных с повреждениями, такими как ожог, гипертермия (перегревание организма), гипоксия, ассоциированная с блокированным кровоснабжением, например, при инфаркте миокарда, инсульте и ишемии. Временное (обратимое) ингибирование р53 с использованием молекул siPHK согласно изобретению может быть терапевтически эффективным в уменьшении или элиминации р53-зависимой смерти нейронов в центральной нервной системе, т.е. в повреждении головного мозга и спинного мозга, в консервировании ткани и органа перед трансплантацией, подготовке хозяина для пересадки костного мозга, уменьшении или элиминации нейронного повреждения во время припадка и в супрессии старения тканей.The invention also provides a method of treating a patient suffering from a disease accompanied by an elevated level of the p53 polypeptide, comprising administering to the patient a composition of the invention in a therapeutically effective dose. Preferably, the present invention provides a method of treating a patient suffering from a disease in which temporary inhibition of p53 is useful. In one preferred embodiment, the compositions of the invention are used to treat tumors together with conventional chemotherapy or radiation therapy to prevent alopecia associated with chemotherapy or radiation therapy. In another preferred embodiment, the compositions of the invention are used to treat acute renal failure. In another preferred embodiment, the compositions according to the invention are used in conditions in which p53 is activated as a result of various stresses associated with injuries, such as a burn, hyperthermia (overheating of the body), hypoxia associated with blocked blood supply, for example, with myocardial infarction, stroke and ischemia. Temporary (reversible) inhibition of p53 using siRNA molecules according to the invention can be therapeutically effective in reducing or eliminating p53-dependent death of neurons in the central nervous system, i.e. in damage to the brain and spinal cord, in preserving tissue and organ before transplantation, preparing the host for bone marrow transplantation, reducing or eliminating neural damage during a seizure, and in suppressing tissue aging.

Данное изобретение обеспечивает также применение терапевтически эффективной дозы одного или нескольких соединений согласно изобретению для приготовления композиции для лечения заболевания, сопровождающегося повышенным уровнем полипептида р53, например, у пациента, страдающего от алопеции или острой почечной недостаточности.The invention also provides the use of a therapeutically effective dose of one or more compounds according to the invention for the preparation of a composition for the treatment of a disease accompanied by an elevated level of the p53 polypeptide, for example, in a patient suffering from alopecia or acute renal failure.

Более конкретно, данное изобретение связано с олигорибонуклеотидом, в котором одна цепь содержит смежные нуклеотиды, имеющие, от 5' к 3', последовательность, представленную в SEQ ID NO:3-25 (таблица А, смысловые цепи), или в SEQ ID NO:49-119 (таблица В, смысловые цепи), или в SEQ ID NO:191-253 (таблица С, смысловые цепи), или его гомолог, в котором изменено основание в 1-2 из нуклеотидов в каждом концевом районе.More specifically, this invention relates to an oligoribonucleotide in which one strand contains adjacent nucleotides having, from 5 ′ to 3 ′, the sequence shown in SEQ ID NO: 3-25 (Table A, sense strands), or in SEQ ID NO : 49-119 (table B, sense strands), or in SEQ ID NO: 191-253 (table C, sense strands), or its homologue, in which the base is changed to 1-2 of the nucleotides in each end region.

Концевым районом этого олигонуклеотида называют основания 1-4 и/или 16-19 в 19-мерной последовательности и основания 1-4 и/или 18-21 в 21-мерной последовательности.The terminal region of this oligonucleotide is called bases 1-4 and / or 16-19 in the 19-dimensional sequence and bases 1-4 and / or 18-21 in the 21-dimensional sequence.

Кроме того, изобретение связано с олигорибонуклеотидами, в которых одна цепь содержит последовательные нуклеотиды, имеющие, от 5' к 3', последовательность, представленную в SEQ ID NO:26-48 (таблица А, антисмысловые цепи), или SEQ ID NO:120-190 (таблица В, антисмысловые цепи) или SEQ ID NO:254-316 (Таблица С, антисмысловые цепи), или их гомолог, в котором изменено основание в 1-2 из нуклеотидов в каждом концевом районе.In addition, the invention relates to oligoribonucleotides in which one strand contains sequential nucleotides having, from 5 ′ to 3 ′, the sequence shown in SEQ ID NO: 26-48 (Table A, antisense strands), or SEQ ID NO: 120 -190 (Table B, antisense strands) or SEQ ID NO: 254-316 (Table C, antisense strands), or their homologue, in which the base is changed to 1-2 of the nucleotides in each end region.

Предпочтительными олигонуклеотидами согласно изобретению являются олигонуклеотиды р53 человека с порядковыми номерами 3, 5, 20 и 23 в таблице D и олигонуклеотиды р53 мыши с порядковыми номерами 11, 12, 14, 17 и 18 в таблице Е. Они идентичны порядковым номерам 3, 5, 20 и 23 (человек), а также 11, 12, 14, 17 и 18 (мышь) в таблице А. Наиболее предпочтительными олигонуклеотидами согласно изобретению являются олигонуклеотиды р53 человека, имеющие последовательность порядкового номера 23 в таблице А.Preferred oligonucleotides according to the invention are human p53 oligonucleotides with serial numbers 3, 5, 20 and 23 in table D and mouse p53 oligonucleotides with serial numbers 11, 12, 14, 17 and 18 in table E. They are identical to serial numbers 3, 5, 20 and 23 (human), as well as 11, 12, 14, 17 and 18 (mouse) in table A. The most preferred oligonucleotides according to the invention are human p53 oligonucleotides having a sequence number 23 in table A.

Наиболее предпочтительным соединением согласно изобретению в настоящее время является затупленный на концах 19-мерный олигонуклеотид, т.е. х=y=19 и Z, и Z' оба отсутствуют. Эта олигонуклеотидная молекула является либо фосфорилированной на 3'-концах как смысловой, так и антисмысловой цепи, либо вообще нефосфорилированной; или имеет 1-ый нуклеотид в положении 5' на смысловой цепи, специфически модифицированный во избежание любой возможности 5'-фосфорилирования in vivo. Антисимметричные рибонуклеотиды модифицированы в положении 2' как в антисмысловой, так и в смысловой цепях, причем группой в положении 2' является метокси (2'-О-метил), и причем рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах антисмысловой цепи являются модифицированными по их сахарным остаткам, а рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах смысловой цепи являются немодифицированными по их сахарным остаткам. Наиболее предпочтительными в настоящее время подобными соединениями являются такие модифицированные олигонуклеотиды, содержащие последовательности, имеющие порядковый номер 23 в таблице А.The most preferred compound according to the invention at present is a 19-dimensional oligonucleotide blunt at the ends, i.e. x = y = 19 and Z and Z 'are both absent. This oligonucleotide molecule is either phosphorylated at the 3'-ends of both the sense and antisense chains, or is generally non-phosphorylated; or has a 1st nucleotide at position 5 ′ on the sense strand specifically modified to avoid any possibility of 5 ′ phosphorylation in vivo. Antisymmetric ribonucleotides are modified at position 2 'in both the antisense and sense chains, with the group at position 2' being methoxy (2'-O-methyl), and the ribonucleotides at the 5'- and 3'-ends of the antisense chain are modified according to their sugar residues, and ribonucleotides at the 5'- and 3'-ends of the sense chain are unmodified by their sugar residues. The most preferred such compounds currently are such modified oligonucleotides containing sequences having the sequence number 23 in table A.

В одном аспекте изобретения олигонуклеотид содержит двухцепочечную структуру, причем такая двухцепочечная структура содержитIn one aspect of the invention, the oligonucleotide contains a double-stranded structure, and such a double-stranded structure contains

первую цепь и вторую цепь, причемthe first chain and the second chain, and

первая цепь содержит первый сегмент смежных нуклеотидов, а вторая цепь содержит второй сегмент смежных нуклеотидов, причемthe first chain contains a first segment of adjacent nucleotides, and the second chain contains a second segment of adjacent nucleotides, wherein

указанный первый сегмент является либо комплементарным, либо идентичным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей р53, а второй сегмент является либо идентичным, либо комплементарным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей р53.said first segment is either complementary or identical to the nucleic acid sequence encoding p53, and the second segment is either identical or complementary to the nucleic acid sequence encoding p53.

В одном варианте осуществления первый сегмент содержит приблизительно 14-40 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 18-30 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно 19-27 нуклеотидов и наиболее предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов - 23 нуклеотида, в частности приблизительно 19 нуклеотидов - 21 нуклеотид. В таком варианте осуществления этот олигонуклеотид может иметь длину 17-40 нуклеотидов.In one embodiment, the first segment contains approximately 14-40 nucleotides, preferably approximately 18-30 nucleotides, more preferably approximately 19-27 nucleotides and most preferably approximately 19 nucleotides, 23 nucleotides, in particular approximately 19 nucleotides, 21 nucleotides. In such an embodiment, this oligonucleotide may have a length of 17-40 nucleotides.

Кроме того, дополнительные нуклеиновые кислоты согласно изобретению содержат по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов любого из полинуклеотидов в этих таблицах и, более предпочтительно, 14 смежных пар нуклеотидных оснований на любом конце двухцепочечной структуры, состоящей из первого сегмента и второго сегмента, как описано выше.In addition, the additional nucleic acids of the invention contain at least 14 contiguous nucleotides of any of the polynucleotides in these tables and, more preferably, 14 contiguous pairs of nucleotide bases at either end of a double-stranded structure consisting of a first segment and a second segment, as described above.

В одном варианте осуществления первый сегмент содержит последовательность по меньшей мере из 14 смежных нуклеотидов олигонуклеотида, причем такой олигонуклеотид выбран из группы, содержащей SEQ ID NO:3-316, предпочтительно из группы, содержащей олигорибонуклеотиды, имеющие последовательность любого из порядковых номеров 3, 5, 20 или 23 (человек) или имеющие последовательность любого из порядковых номеров 11, 12, 14, 17 и 18 (мышь) в таблице А, более предпочтительно выбран из группы, имеющей последовательность любого из порядковых номеров 3, 5, 20 или 23 в таблице А.In one embodiment, the first segment comprises a sequence of at least 14 contiguous nucleotides of the oligonucleotide, which oligonucleotide is selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 3-316, preferably from the group comprising oligoribonucleotides having a sequence of any of sequence numbers 3, 5, 20 or 23 (person) or having a sequence of any of the sequence numbers 11, 12, 14, 17 and 18 (mouse) in table A, more preferably selected from the group having a sequence of any of the sequence numbers 3, 5, 20 or 23 in table Itse A.

Кроме того, дополнительные нуклеиновые кислоты согласно изобретению содержат по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов любой из SEQ ID NO:3-316 и, более предпочтительно, 14 смежных пар нуклеотидных оснований на любом конце двухцепочечной структуры, состоящей из первого сегмента и второго сегмента, как описано выше. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что при такой потенциальной длине нуклеиновой кислоты согласно изобретению и, в частности, отдельных сегментов, образующих такую нуклеиновую кислоту согласно изобретению, возможны некоторые смещения относительно кодирующей последовательности р53 в каждую сторону, причем такие смещения могут быть смещениями на 1, 2, 3, 4, 5 и 6 нуклеотидов в обоих направлениях, причем генерированные таким образом молекулы двухцепочечной кислоты будут также входить в объем согласно изобретению.In addition, additional nucleic acids according to the invention contain at least 14 adjacent nucleotides of any of SEQ ID NO: 3-316 and, more preferably, 14 adjacent pairs of nucleotide bases at either end of a double-stranded structure consisting of a first segment and a second segment, as described above. One skilled in the art will understand that with such a potential length of the nucleic acid according to the invention and, in particular, individual segments forming such a nucleic acid according to the invention, there may be some displacements with respect to the p53 coding sequence in each direction, and such displacements may be displacements 1, 2, 3, 4, 5 and 6 nucleotides in both directions, the double-stranded acid molecules thus generated will also be included in the volume according to the invention.

Доставка: Были разработаны системы доставки, нацеленные специфически на усиленную и улучшенную доставку siPHK в клетки млекопитающих, см., например, Shen et al. (FEBS letters 539: 111-114 (2003)), Xia et al., Nature Biotechnology 20: 1006-1010 (2002), Reich et al., Molecular Vision 9: 210-216 (2003), Sorensen et al. (J. Mol. Biol. 327: 761-766 (2003), Lewis et al., Nature Genetics 32: 107-108 (2002) и Simeoni et al., Nucleic Acids Research 31, 11: 2717-2724 (2003). siPHK была недавно использована для ингибирования в организме приматов; подробнее см. Tolentino et al., Retina 24(1) February 2004 I 132-138. Респираторные препараты siPHK описаны в заявке на патент США №2004/0063654 Davis et al. Конъюгированные с холестерином siPHK (и конъюгированные с другими стероидами и липидами siPHK) могут быть использованы для доставки, см. Soutschek et al Nature 432: 173-177(2004) Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs; и Lorenz et al. Bioorg. Med. Chemistry. Lett. 14:4975-4977 (2004) Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells. Delivery : Delivery systems have been developed that specifically target enhanced and improved delivery of siRNA to mammalian cells, see, for example, Shen et al. (FEBS letters 539: 111-114 (2003)), Xia et al., Nature Biotechnology 20: 1006-1010 (2002), Reich et al., Molecular Vision 9: 210-216 (2003), Sorensen et al. (J. Mol. Biol. 327: 761-766 (2003), Lewis et al., Nature Genetics 32: 107-108 (2002) and Simeoni et al., Nucleic Acids Research 31, 11: 2717-2724 (2003) siRNA has recently been used to inhibit primates; see Tolentino et al., Retina 24 (1) February 2004 I 132-138 for more details. siRNA respiratory preparations are described in US Patent Application No. 2004/0063654 to Davis et al. siRNA cholesterol (and siRNA conjugated with other steroids and lipids) can be used for delivery, see Soutschek et al Nature 432: 173-177 (2004) Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs; and Lorenz et al. Bioorg. Med. Chemistry. Lett. 14: 4975-4977 (2004) Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells.

siPHK или фармацевтические композиции согласно изобретению вводят и предоставляют в дозах в соответствии с медицинской практикой, с учетом клинического состояния индивидуального пациента, подлежащего лечению заболевания, места и способа введения, схемы введения, возраста, пола, массы тела пациента и других факторов, известных врачам-практикам. siRNA or pharmaceutical compositions according to the invention are administered and provided in doses in accordance with medical practice, taking into account the clinical condition of the individual patient, the disease to be treated, the place and method of administration, administration schedule, age, gender, body weight of the patient and other factors known to doctors practices.

Таким образом, «терапевтически эффективную дозу» для указанных здесь целей определяют с учетом обстоятельств, которые известны в данной области. Эта доза должна быть эффективна для получения улучшения, в том числе, но не только, улучшенного коэффициента выживаемости, или более быстрого выздоровления, или улучшения или элиминации симптомов и других показателей, которые выбираются в качестве подходящих критериев специалистами с квалификацией в данной области. Соединения согласно изобретению могут вводиться любым из общепринятых способов введения. Следует отметить, что соединение может быть введено в виде соединения или в виде фармацевтически приемлемой соли и может быть введено отдельно или в виде активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями, растворителями, разбавителями, эксципиентами, адъювантами и наполнителями. Соединения могут вводиться перорально, подкожно или парентерально, в том числе внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрибрюшинным и интраназальным введением, а также внутриоболочечным и инфузионным способами. Применимы также имплантаты этих соединений. Жидкие формы могут быть приготовлены для инъекции, причем этот термин включает в себя подкожный, чрескожный, внутривенный, внутримышечный, внутриоболочечный и другие парентеральные способы введения. Жидкие композиции включают в себя водные растворы, с органическими сорастворителями или без органических сорастворителей, водные и масляные суспензии, эмульсии с годными в пищу маслами, а также подобными фармацевтическими наполнителями. Кроме того, в определенных обстоятельствах композиции для применения в новых способах терапии согласно изобретению могут быть приготовлены в виде аэрозолей для интраназального и подобного введения. Подлежащим лечению пациентом является теплокровное животное, в частности млекопитающие, в том числе человек. Фармацевтически приемлемыми носителями, растворителями, разбавителями, эксципиентами, адъювантами и наполнителями, а также носителями имплантатов обычно называют инертные, нетоксичные твердые или жидкие наполнители, разбавители или инкапсулирующий материал, не реагирующие с активными ингредиентами согласно изобретению, и они включают в себя липосомы и микросферы. Примеры систем доставки, применимых в данном изобретении, включают в себя системы доставки, описанные в патентах США с номерами 5225182; 5169383; 5167616; 4959217; 4925678; 4487603; 4486194; 4447233; 4447224; 4439196 и 4475196. Многие другие подобные имплантаты, системы доставки и модули хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области. В одном конкретном варианте осуществления согласно изобретению особенно предпочтительными являются готовые формы для местной и трансдермальной доставки.Thus, a “therapeutically effective dose” for the purposes indicated here is determined taking into account circumstances that are known in the art. This dose should be effective in order to obtain an improvement, including, but not limited to, an improved survival rate, or a faster recovery, or an improvement or elimination of symptoms and other indicators that are selected as suitable criteria by specialists qualified in this field. The compounds of the invention may be administered by any of the conventional methods of administration. It should be noted that the compound may be administered as a compound or as a pharmaceutically acceptable salt and may be administered alone or as an active ingredient in combination with pharmaceutically acceptable carriers, solvents, diluents, excipients, adjuvants and excipients. Compounds can be administered orally, subcutaneously or parenterally, including intravenously, intraarterially, intramuscularly, intraperitoneally and intranasally, as well as by intracranial and infusion methods. Implants of these compounds are also applicable. Liquid forms can be prepared for injection, the term including subcutaneous, transdermal, intravenous, intramuscular, intrathecal and other parenteral routes of administration. Liquid compositions include aqueous solutions, with or without organic cosolvents, aqueous and oily suspensions, emulsions with edible oils, and similar pharmaceutical excipients. In addition, in certain circumstances, compositions for use in the new methods of therapy according to the invention can be prepared in the form of aerosols for intranasal and similar administration. The patient to be treated is a warm-blooded animal, in particular mammals, including humans. Pharmaceutically acceptable carriers, solvents, diluents, excipients, adjuvants and excipients, as well as implant carriers, are commonly referred to as inert, non-toxic solid or liquid excipients, diluents or encapsulating material that do not react with the active ingredients of the invention, and include liposomes and microspheres. Examples of delivery systems useful in the present invention include the delivery systems described in US Pat. Nos. 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196 and 4,475,196. Many other similar implants, delivery systems, and modules are well known to those skilled in the art. In one particular embodiment according to the invention, formulations for topical and transdermal delivery are particularly preferred.

Обычно активная доза соединения для человека находится в диапазоне от 1 нг/кг приблизительно до 20-100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно приблизительно от 0,01 мг приблизительно до 2-10 мг/кг массы тела в день, по схеме одна доза в день, или два раза, или три раза, или более раз в день в течение периода 1-4 недель или более.Typically, the active dose of a compound for humans is in the range from 1 ng / kg to about 20-100 mg / kg body weight per day, preferably from about 0.01 mg to about 2-10 mg / kg body weight per day, according to one scheme dose per day, or twice, or three times, or more than once a day for a period of 1-4 weeks or more.

Отмечается, что доставка соединений siPHK в соответствии с данным изобретением в клетки-мишени в проксимальных почечных канальцах является особенно эффективной в лечении острой почечной недостаточности. Без ограничения теорией, это может быть обусловлено тем фактом, что обычно молекулы siPHK экскретируются из организма через клетки проксимальных почечных канальцев. Таким образом, голые молекулы siPHK природно концентрируются в этих клетках, которые являются мишенями для терапии при острой почечной недостаточности.It is noted that the delivery of the siRNA compounds of the invention to target cells in proximal renal tubules is particularly effective in the treatment of acute renal failure. Without being limited by theory, this may be due to the fact that siRNA molecules are normally excreted from the body through proximal renal tubule cells. Thus, naked siRNA molecules naturally concentrate in these cells, which are targets for therapy in acute renal failure.

Термин «лечение» относится в данном контексте к введению терапевтического вещества, эффективного в ослаблении симптомов, ассоциированных с заболеванием, для ослабления тяжести или лечения этого заболевания или для предотвращения возникновения этого заболевания.The term “treatment” as used herein refers to the administration of a therapeutic substance effective in alleviating the symptoms associated with a disease, to alleviate the severity or treatment of the disease, or to prevent the occurrence of the disease.

В конкретном варианте осуществления введение предусматривает внутривенное введение. В другом конкретном варианте осуществления введение предусматривает местное или локальное введение.In a specific embodiment, the administration comprises intravenous administration. In another specific embodiment, the administration comprises local or local administration.

Другим аспектом изобретения является способ лечения пациента, страдающего от алопеции или острой почечной недостаточности или нарушения, сопровождающегося повышенным уровнем полипептида р53, предусматривающий введение этому пациенту фармацевтической композиции согласно изобретению в терапевтически эффективном для лечения количестве.Another aspect of the invention is a method of treating a patient suffering from alopecia or acute renal failure or a disorder accompanied by an elevated level of the p53 polypeptide, comprising administering to the patient a pharmaceutical composition of the invention in a therapeutically effective amount for treatment.

В предпочтительном варианте осуществления для лечения алопеции введение предусматривает местное или локальное введение. В другом предпочтительном варианте осуществления введение предусматривает трансдермальное введение. В конкретном варианте осуществления фармацевтическую композицию наносят на волосистую часть кожи головы пациента. В предпочтительном варианте осуществления для лечения ОПН введение предусматривает внутривенное, внутриартериальное или внутрибрюшинное введение.In a preferred embodiment, for the treatment of alopecia, administration comprises local or local administration. In another preferred embodiment, the administration comprises transdermal administration. In a specific embodiment, the pharmaceutical composition is applied to the scalp of a patient’s scalp. In a preferred embodiment, for the treatment of acute renal failure, the administration comprises intravenous, intraarterial or intraperitoneal administration.

Другим аспектом изобретения является способ предупреждения алопеции у пациента, подвергающегося лечению, которое вызывает алопецию, предусматривающий введение этому пациенту фармацевтической композиции согласно изобретению в терапевтически эффективном для лечения пациента количестве.Another aspect of the invention is a method for preventing alopecia in a patient undergoing treatment that causes alopecia, comprising administering to this patient a pharmaceutical composition of the invention in a therapeutically effective amount for treating a patient.

В другом аспекте согласно изобретению обеспечена фармацевтическая композиция, которая содержит любой из вышеописанных олигорибонуклеотидов (SEQ ID NO:3-316) или векторов и фармацевтически приемлемый носитель. Другим аспектом изобретения является применение терапевтически эффективного количества любого из вышеописанных олигорибонуклеотидов (SEQ ID NO:3-316) или векторов для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления пациента, страдающего от алопеции или острой почечной недостаточности или нарушения, которое сопровождается повышенным уровнем р53.In another aspect, the invention provides a pharmaceutical composition that comprises any of the above oligoribonucleotides (SEQ ID NO: 3-316) or vectors and a pharmaceutically acceptable carrier. Another aspect of the invention is the use of a therapeutically effective amount of any of the above oligoribonucleotides (SEQ ID NO: 3-316) or vectors for the preparation of a medicament for stimulating the recovery of a patient suffering from alopecia or acute renal failure or a disorder accompanied by elevated p53 level.

В предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство включает в себя местное лекарственное средство. В конкретном варианте осуществления лекарственное средство наносят на волосистую часть кожи головы пациента. В другом предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство включает в себя средство для трансдермального введения.In a preferred embodiment, the drug includes a topical drug. In a specific embodiment, the drug is applied to the scalp of a patient’s scalp. In another preferred embodiment, the medicament includes a transdermal agent.

Во всех вышеописанных аспектах согласно изобретению алопеция может быть индуцирована химиотерапией или лучевой терапией и называется далее «токсической алопецией». Более подробно, токсическая алопеция может быть вызвана облучением, например гамма-излучением, или химиотерапевтическими агентами, такими как этопозид, 5-ФУ (5-фторурацил), цисплатин, доксорубицин, винкаалкалоид, винкристин, винбластин, винорелбин, таксол, циклофосфамид, ифосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, меклоретамин, митомицин, дакарбазин, карбоплатинум, тиотепа, даунорубицин, идарубицин, митоксантрон, блеомицин, эсперамицин А1, дактиномицин, пликамицин, кармустин, ломустин, тауромустин, стрептозоцин, мелфалан, дактиномицин, прокарбазин, дексаметазон, преднизон, 2-хлордезоксиаденозин, цитарабин, доцетаксел, флударабин, гемцитабин, херцептин, гидроксимочевина, иринотекан, метотрексат, оксалиплатин, ритуксин, семустин, эпирубицин, этопозид, томудекс и топотекан или химический аналог одного из этих химиотерапевтических агентов. Химиотерапевтическими агентами, с наибольшей вероятностью вызывающими выпадение волос, являются: цисплатин, цитарабин, циклофосфамид, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, ифосфамид и винкристин.In all of the above aspects according to the invention, alopecia can be induced by chemotherapy or radiation therapy and is hereinafter referred to as "toxic alopecia." In more detail, toxic alopecia can be caused by radiation, such as gamma radiation, or chemotherapeutic agents such as etoposide, 5-FU (5-fluorouracil), cisplatin, doxorubicin, vinca alkaloid, vincristine, vinblastine, vinorelbine, taxol, cyclophosphamide chlorambucil, busulfan, mecloretamine, mitomycin, dacarbazine, carboplatinum, thiotepa, daunorubicin, idarubicin, mitoxantrone, bleomycin, esperamycin A1, dactinomycin, plicamycin, carmustine, lomustine, taralthozincin, tauromazin, eksametazon, prednisone, 2-chlorodeoxyadenosine, cytarabine, docetaxel, fludarabine, gemcitabine, Herceptin, hydroxyurea, irinotecan, methotrexate, oxaliplatin, rituksin, semustine, epirubicin, etoposide, topotecan and Tomudex or chemical analogue of one of these chemotherapeutic agents. The chemotherapeutic agents most likely to cause hair loss are: cisplatin, cytarabine, cyclophosphamide, doxorubicin, epirubicin, etoposide, ifosfamide and vincristine.

Соединения согласно изобретению предпочтительно используют для лечения острой почечной недостаточности, в частности острой почечной недостаточности, вызываемой ишемией у пациентов после хирургии, и острой почечной недостаточности, вызываемой химиотерапевтическим лечением, таким как введение цисплатина, или ассоциированной с сепсисом острой почечной недостаточности. Предпочтительным применением соединений согласно изобретению является применение для предотвращения острой почечной недостаточности у пациентов, имеющих высокую степень риска, подвергающихся обширной операции на сердце или васкулярной хирургии. Пациенты при высоком риске развития острой почечной недостаточности могут быть идентифицированы с использованием различных способов балльной оценки, таких как Clevland Clinic algorithm или способ, разработанный US Academic Hospitals (QMMI), и способ, разработанный Veterans' Administration (CICSS). Другими предпочтительными применениями соединений согласно изобретению являются применения для предупреждения ишемической острой почечной недостаточности у пациентов с трансплантацией почки или для предотвращения токсичной почечной недостаточности у пациентов, получающих химиотерапию. Другими применениями являются применения для заживления ран, при острой печеночной недостаточности, индуцированной цисплатином глухоты (возможно, местным нанесением), размножения in vivo гемопоэтических стволовых клеток, консервирования донорских органов/тканей перед трансплантацией замачиванием в растворе siPHK (возможно, посредством электропорации) и последующего улучшения выживания трансплантированной ткани после трансплантации. Другими показаниями могут быть инсульт, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, индуцированная доксорубицином кардиотоксичность, инфаркт миокарда/сердечная недостаточность и улучшение выживаемости ткани трансплантата после трансплантации (системным введением). Без связи с определенной теорией, все эти нарушения сопровождаются повышенным уровнем полипептида р53.The compounds of the invention are preferably used to treat acute renal failure, in particular acute renal failure caused by ischemia in patients after surgery, and acute renal failure caused by chemotherapeutic treatment, such as the administration of cisplatin, or acute renal failure associated with sepsis. A preferred use of the compounds of the invention is for the prevention of acute renal failure in high-risk patients undergoing extensive heart surgery or vascular surgery. Patients at high risk of developing acute renal failure can be identified using various scoring methods, such as the Clevland Clinic algorithm or the method developed by the US Academic Hospitals (QMMI) and the method developed by Veterans' Administration (CICSS). Other preferred uses of the compounds of the invention are for the prevention of ischemic acute renal failure in patients with kidney transplantation or for the prevention of toxic renal failure in patients receiving chemotherapy. Other applications are for wound healing, in acute liver failure, cisplatin-induced deafness (possibly topical application), in vivo propagation of hematopoietic stem cells, preservation of donor organs / tissues before transplantation by soaking in siRNA solution (possibly by electroporation), and subsequent improvement survival of transplanted tissue after transplantation. Other indications may include stroke, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, doxorubicin-induced cardiotoxicity, myocardial infarction / heart failure, and improved transplant tissue survival after transplantation (systemic administration). Without a connection with a certain theory, all these disorders are accompanied by an increased level of the p53 polypeptide.

Данное изобретение обеспечивает также способ приготовления фармацевтической композиции, который предусматриваетThe invention also provides a method for preparing a pharmaceutical composition, which comprises

получение одного или нескольких двухцепочечных соединений согласно изобретению; иobtaining one or more double-stranded compounds according to the invention; and

смешивание указанного соединения с фармацевтически приемлемым носителем.mixing said compound with a pharmaceutically acceptable carrier.

Данное изобретение обеспечивает также способ приготовления фармацевтической композиции, который предусматривает смешивание одного или нескольких соединений согласно изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.The invention also provides a method for preparing a pharmaceutical composition, which comprises admixing one or more compounds of the invention with a pharmaceutically acceptable carrier.

В предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в приготовлении фармацевтической композиции, смешивают с носителем в фармацевтически эффективной дозе. В конкретном варианте осуществления соединение согласно изобретению конъюгирует со стерином, или с липидом, или другой подходящей молекулой, например с холестерином.In a preferred embodiment, the compound used in the preparation of the pharmaceutical composition is mixed with a carrier in a pharmaceutically effective dose. In a specific embodiment, the compound of the invention is conjugated to a sterol, or to a lipid, or other suitable molecule, for example, cholesterol.

Модификации или аналоги нуклеотидов могут быть введены для улучшения терапевтических свойств этих нуклеотидов. Улучшенные свойства включают в себя увеличенную устойчивость к нуклеазам и/или увеличенную способность проникать через клеточные мембраны.Modifications or analogs of nucleotides can be introduced to improve the therapeutic properties of these nucleotides. Improved properties include increased resistance to nucleases and / or increased ability to penetrate cell membranes.

Таким образом, данное изобретение включает в себя также все аналоги или модификации олигонуклеотида согласно изобретению, которые по существу не изменяют функцию этого полинуклеотида или олигонуклеотида. В предпочтительном варианте осуществления такая модификация относится к группе основания нуклеотида, к сахарной части нуклеотида и/или фосфатной части нуклеотида.Thus, the invention also includes all analogues or modifications of an oligonucleotide according to the invention that do not substantially alter the function of this polynucleotide or oligonucleotide. In a preferred embodiment, such a modification relates to a base group of a nucleotide, to a sugar moiety of a nucleotide and / or a phosphate moiety of a nucleotide.

В вариантах осуществления согласно изобретению эти нуклеотиды могут быть выбраны из природно встречающихся или синтетически модифицированных оснований. Природно встречающиеся основания включают в себя аденин, гуанин, цитозин, тимин и урацил. Модифицированные основания этих олигонуклеотидов включают в себя инозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 6-азацитозин и 6-азатимин, псевдоурацил, 4-тиоурацил, 8-галогенаденин, 8-аминоаденин, 8-тиоладенин, 8-тиоалкиладенин, 8-гидроксиладенин, и другие 8-замещенные аденины, 8-галогенгуанины, 8-аминогуанин, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанин, 8-гидроксилгуанин и другие замещенные гуанины, другие аза- и деазааденины, другие аза- и деазагуанины, 5-трифторметилурацил и 5-трифторцитозин.In embodiments of the invention, these nucleotides may be selected from naturally occurring or synthetically modified bases. Naturally occurring bases include adenine, guanine, cytosine, thymine and uracil. Modified bases of these oligonucleotides include inosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl-, 2-propyl- and other alkyladenines, 5-halogenouracil, 5-halogenocytosine, 6-azacytosine and 6-azatimine, pseudouracil, 4- thiouracil, 8-haloadenenine, 8-aminoadenine, 8-thioladenine, 8-thioalkyladenine, 8-hydroxyladenine, and other 8-substituted adenines, 8-halogen guanines, 8-aminoguanine, 8-thiolguanine, 8-thioalkylguanine, 8-hydroxylguanine and others substituted guanines, other aza and deazaadenins, other aza and deazaguanines, 5-trifluoromethyluracil and 5-trifluorocyto in.

Кроме того, могут быть получены аналоги полинуклеотидов, в которых структуры нуклеотидов фундаментально изменены и которые более подходят в качестве терапевтических или экспериментальных реагентов. Примером аналога нуклеотида является пептиднуклеиновая кислота (ПНК), в которой дезоксирибоза- (или рибоза)фосфатный скелет в ДНК (или РНК) заменен полиамидным скелетом, который сходен со скелетом, обнаруживаемым в пептидах. Было показано, что ПНК-аналоги устойчивы к деградации ферментами и имеют пролонгированные периоды существования in vivo и in vitro. Кроме того, было показано, что ПНК сильнее связываются с комплементарной последовательностью ДНК, чем с молекулой ДНК. Это наблюдение связывают с отсутствием отталкивания зарядов между цепью ПНК и цепью ДНК. Другие модификации, которые могут быть произведены в отношении олигонуклеотидов, включают в себя полимерные скелеты, циклические скелеты или ациклические скелеты молекул.In addition, polynucleotide analogs can be prepared in which the nucleotide structures are fundamentally altered and which are more suitable as therapeutic or experimental reagents. An example of a nucleotide analog is peptide nucleic acid (PNA), in which the deoxyribose (or ribose) phosphate backbone in DNA (or RNA) is replaced by a polyamide backbone that is similar to the backbone found in peptides. It was shown that PNA analogues are resistant to degradation by enzymes and have prolonged periods of in vivo and in vitro existence. In addition, it has been shown that PNAs are more strongly associated with a complementary DNA sequence than with a DNA molecule. This observation is associated with the absence of charge repulsion between the PNA chain and the DNA chain. Other modifications that can be made to oligonucleotides include polymeric skeletons, cyclic skeletons or acyclic skeletons of molecules.

В одном варианте осуществления модификацией является модификация фосфатной части, причем эта модифицированная фосфатная часть выбрана из группы, содержащей фосфотиоат.In one embodiment, the modification is a modification of the phosphate moiety, wherein the modified phosphate moiety is selected from the group consisting of phosphotioate.

Соединения согласно изобретению могут быть синтезированы любым из способов, которые хорошо известны в данной области для синтеза рибонуклеиновых (или дезоксирибонуклеиновых) олигонуклеотидов. Такой синтез описан, помимо прочего, в Beaucage S.L. and Iyer R.P., Tetrahedron 1992; 48: 2223-2311, Beaucage S.L. and Iyer R.P., Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 и Caruthers M.H. et al., Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313, синтез тиоатов, помимо прочего, описан в Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402, синтез молекул РНК описан в Sproat B., in Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P.; Kap. 2: 17-31 и соответствующие процессы далее по ходу описаны, помимо прочего, у Pingoud A. et al., in IRL Press 1989 Edited by Oliver R.W.A.; Kap. 7: 183-208 и Sproat B., in Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P.; Kap. 2: 17-31 (выше).The compounds of the invention can be synthesized by any of the methods that are well known in the art for the synthesis of ribonucleic (or deoxyribonucleic) oligonucleotides. Such synthesis is described, inter alia, in Beaucage S.L. and Iyer R. P., Tetrahedron 1992; 48: 2223-2311, Beaucage S.L. and Iyer R. P., Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 and Caruthers M.H. et al., Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313, the synthesis of thioates, among other things, is described in Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402, RNA molecule synthesis is described in Sproat B., in Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P .; Kap. 2: 17-31 and related processes are further described, inter alia, by Pingoud A. et al., In IRL Press 1989 Edited by Oliver R.W.A .; Kap. 7: 183-208 and Sproat B., in Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P .; Kap. 2: 17-31 (above).

В данной области известны и другие синтетические процедуры, например процедуры, описанные у Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids res., 18, 5433; Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684; и Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, и в этих процессах могут быть использованы обычные защитные и связывающие группы нуклеиновых кислот, такие как диметокситритил, на 5'-конце. В случае необходимости включают модифицированные (например, 2'-О-метилированные) нуклеотиды и немодифицированные нуклеотиды.Other synthetic procedures are known in the art, for example, those described by Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids res., 18, 5433; Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684; and Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, and in these processes conventional protective and binding nucleic acid groups, such as dimethoxytrityl, at the 5'-end, can be used. If necessary, include modified (for example, 2'-O-methylated) nucleotides and unmodified nucleotides.

Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть синтезированы по отдельности и соединены вместе после синтеза, например, путем лигирования (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., International PCT publication No. WO93/23569; Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204) или гибридизации после синтеза и/или удаления защитных групп.The oligonucleotides according to the invention can be separately synthesized and joined together after synthesis, for example, by ligation (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., International PCT publication No. WO93 / 23569; Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204) or hybridization after synthesis and / or deprotection.

Отмечается, что может быть использован коммерчески доступный прибор (доступный, помимо прочего, из Applied Biosystems); олигонуклеотиды получают в соответствии с описанными здесь последовательностями. Перекрывающиеся пары химически синтезированных фрагментов могут быть лигированы с использованием способов, хорошо известных в данной области (например, см. Патент США №6121426). Цепи синтезируют по отдельности и затем отжигают друг с другом в пробирке. Затем двухцепочечные siPHK отделяют от одноцепочечных олигонуклеотидов, которые не отожглись (например, вследствие избытка одного из них), при помощи ВЖХ. Что касается siPHK или фрагментов siPHK согласно изобретению, две или более таких последовательностей могут быть синтезированы и связаны вместе для применения в данном изобретении.It is noted that a commercially available device can be used (available, inter alia, from Applied Biosystems); oligonucleotides are prepared in accordance with the sequences described herein. Overlapping pairs of chemically synthesized fragments can be ligated using methods well known in the art (for example, see US Patent No. 6121426). The chains are synthesized separately and then annealed to each other in vitro. Double-stranded siRNAs are then separated from single-stranded oligonucleotides that have not been annealed (for example, due to an excess of one of them) using HPLC. Regarding siPHK siPHK or fragments according to the invention, two or more such sequences can be synthesized and linked together for use in the present invention.

Соединения согласно изобретению могут быть также синтезированы с использованием методологии тандемного синтеза, описанного в публикации заявки на патент США с номером US 2004/0019001 (McSwiggen), где обе цепи синтезируют в виде единого смежного олигонуклеотидного фрагмента или единой цепи, разделяемой расщепляемым линкером, который затем расщепляют, с получением отдельных фрагментов siPHK или цепей, которые гибридизуются и дают возможность очистки этого siPHK-дуплекса. Этим линкером может быть полинуклеотидный линкер или ненуклеотидный линкер.Compounds according to the invention can also be synthesized using the tandem synthesis methodology described in US 2004/0019001 (McSwiggen), where both chains are synthesized as a single adjacent oligonucleotide fragment or a single chain shared by a cleavable linker, which then split, to obtain individual fragments of siRNA or chains that hybridize and allow the purification of this siRNA duplex. This linker may be a polynucleotide linker or a non-nucleotide linker.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую две или более молекул siPHK, для лечения любого из заболеваний и состояний, упомянутых здесь, причем указанные две молекулы могут быть физически смешаны вместе в фармацевтической композиции в количествах, которые генерируют равную или иным образом выгодную активность, или могут быть ковалентно или нековалентно связаны или соединены вместе представляющим собой нуклеиновую кислоту линкером с длиной в диапазоне 2-100, предпочтительно 2-50 или 2-30 нуклеотидов. В одном варианте осуществления эти молекулы siPHK состоят из двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты, описанной здесь, где две последовательности siPHK выбраны из таблиц А-С, предпочтительно из таблицы А, SEQ ID NO:3, 5, 20 и 23 (последовательности человека) и 11, 12, 14, 17 и 18 (последовательности мыши).In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising two or more siRNA molecules for the treatment of any of the diseases and conditions mentioned herein, said two molecules being physically mixed together in a pharmaceutical composition in amounts that generate an equal or otherwise beneficial activity , or can be covalently or non-covalently linked or linked together by a nucleic acid linker with a length in the range of 2-100, preferably 2-50 or 2-30 nucleotides. In one embodiment, these siRNA molecules are composed of the double-stranded nucleic acid structure described herein, wherein the two siRNA sequences are selected from Tables A-C, preferably from Table A, SEQ ID NOs: 3, 5, 20, and 23 (human sequences) and 11 , 12, 14, 17 and 18 (mouse sequences).

В другом варианте осуществления молекулы siPHK состоят из двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты, где первая последовательность siPHK выбрана из таблиц А-С, предпочтительно из таблицы А, SEQ ID NO:3, 5, 20 и 23 (последовательности р53 человека) или 11, 12, 14, 17 и 18 (последовательности р53 мыши), а вторая молекула siPHK нацелена на про-апоптотический ген, обеспечивая посредством этого полезную активность. Тандемная двухцепочечная структура, которая содержит две или более последовательностей siPHK, подвергается внутриклеточному процессингу, с образованием двух или более различных siPHK. Такой второй молекулой siPHK является предпочтительно молекула siPHK, которая нацелена на про-апоптотический ген.In another embodiment, the siRNA molecules are composed of a double-stranded nucleic acid structure, wherein the first siRNA sequence is selected from Tables A-C, preferably from Table A, SEQ ID NOs: 3, 5, 20, and 23 (human p53 sequences) or 11, 12, 14, 17 and 18 (mouse p53 sequences), and the second siRNA molecule targets the pro-apoptotic gene, thereby providing useful activity. A tandem double-stranded structure that contains two or more siRNA sequences undergoes intracellular processing to form two or more different siRNAs. Such a second siRNA molecule is preferably a siRNA molecule that targets a pro-apoptotic gene.

Молекулы siPHK связаны ковалентно или нековалентно или соединены линкером с образованием тандемной молекулы siPHK. Такие тандемные молекулы siPHK, содержащие две последовательности siPHK, имеют обычно длину 38-150 нуклеотидов, более предпочтительно, 38 или 40-60 нуклеотидов или являются более длинными соответственно, если в эту тандемную молекулу включены более чем две последовательности siPHK. Ожидается также более длинная тандемная молекула, состоящая из двух или более длинных последовательностей, которые кодируют siPHK, продуцированную через внутренний клеточный процессинг, например длинные дцРНК, а также тандемная молекула, кодирующая две или более shPHK. Такие тандемные молекулы также рассматриваются как часть согласно изобретению.The siRNA molecules are linked covalently or non-covalently or are linked by a linker to form the tandem siRNA molecule. Such tandem siRNA molecules containing two siRNA sequences are typically 38-150 nucleotides in length, more preferably 38 or 40-60 nucleotides, or are longer, respectively, if more than two siRNA sequences are included in this tandem molecule. A longer tandem molecule is also expected, consisting of two or more long sequences that encode siRNA produced through internal cell processing, for example long dsRNAs, as well as a tandem molecule encoding two or more shRNAs. Such tandem molecules are also contemplated as part of the invention.

Молекулы siPHK, которые нацелены на р53, могут быть основным активным компонентом в фармацевтической композиции или могут быть одним активным компонентом фармацевтической композиции, содержащей две или более siPHK (или молекул, которые кодируют или эндогенно продуцируют две или более siPHK, независимо от того, являются ли они смесью молекул или одной или более тандемными молекулами, которые кодируют две или более siPHK), причем указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит одну или несколько дополнительных молекул siPHK, которые нацелены на один или несколько дополнительных генов. Одновременное ингибирование р53 и указанных дополнительных генов будет, возможно, иметь аддитивное или синергическое действие в отношении лечения описанных здесь заболеваний.SiRNA molecules that target p53 can be a major active ingredient in a pharmaceutical composition or can be a single active ingredient in a pharmaceutical composition containing two or more siRNAs (or molecules that encode or endogenously produce two or more siRNAs, regardless of whether they are a mixture of molecules or one or more tandem molecules that encode two or more siRNAs), wherein said pharmaceutical composition further comprises one or more additional siRNA molecules that are enes on the one or more additional genes. Simultaneous inhibition of p53 and these additional genes will probably have an additive or synergistic effect on the treatment of the diseases described herein.

В конкретном примере фармацевтическая композиция для лечения описанных здесь заболеваний может состоять из следующих комбинаций соединений: 1) siPHK р53 и siPHK Fas; 2) siPHK р53 и siPHK Вах; 3) siPHK р53 и siPHK Noxa; 4) siPHK р53 и siPHK Puma; 5) siPHK р53 и siPHK RTP801; 6) siPHK р53 и siPHK PIDD; 7) siPHK р53, siPHK Fas и любая из siPHK RTP801L, siPHK Вах, siPHK Noxa или siPHK Puma или siPHK PIDD для образования тримеров или полимеров (т.е. тандемных молекул, которые кодируют три siPHK). Другими предпочтительными возможностями про-апоптотических генов для комбинации с siPHK р53 являются гены TNFα, каспазы 2, каспазы 3, каспазы 9, E2F1 и PARP-1. Предпочтительной комбинацией в соответствии с данным изобретением является siPHK р53 и siPHK RTP801 (см. РСТ Заявку на патент РСТ/ЕР 2005/008891).In a specific example, a pharmaceutical composition for treating the diseases described herein may consist of the following combinations of compounds: 1) siRNA p53 and siRNA Fas; 2) siRNA p53 and siRNA Bax; 3) siRNA p53 and siRNA Noxa; 4) siRNA p53 and siRNA Puma; 5) siRNA p53 and siRNA RTP801; 6) siRNA p53 and siRNA PIDD; 7) siPHK p53, siPHK Fas and any of RTP801L siPHK, siPHK Bax, siPHK Noxa or siPHK Puma or siPHK PIDD to form trimers or polymers (i.e., tandem molecules which encode three siPHK). Other preferred pro-apoptotic gene possibilities for combination with p53 siRNA are TNFα, caspase 2, caspase 3, caspase 9, E2F1 and PARP-1. A preferred combination in accordance with this invention is siRNA p53 and siRNA RTP801 (see PCT Patent Application PCT / EP 2005/008891).

Кроме того, siPHK р53 или любая молекула нуклеиновой кислоты, содержащая или кодирующая siPHK р53, может быть связана (ковалентно или нековалентно) с антителами против интернализуемых молекул клеточной поверхности, экспрессируемых на клетках-мишенях, для достижения усиленного нацеливания для лечения описанных здесь заболеваний. Например, анти-Fas-антитело (предпочтительно, нейтрализующее антитело) может быть объединено с молекулой siPHK р53.In addition, siRNA p53 or any nucleic acid molecule containing or encoding siRNA p53 can be coupled (covalently or non-covalently) to antibodies against internalizable cell surface molecules expressed on target cells to achieve enhanced targeting for the treatment of the diseases described herein. For example, an anti-Fas antibody (preferably a neutralizing antibody) can be combined with the p53 siRNA .

Соединения согласно изобретению могут доставляться либо непосредственно, либо вирусными или невирусными векторами. При непосредственной доставке эти последовательности обычно делают устойчивыми к нуклеазам. Альтернативно, эти последовательности могут быть включены в экспрессионные кассеты или конструкции, так что эта последовательность экспрессируется в клетке, как обсуждается здесь ниже. Обычно эта конструкция содержит подходящую регуляторную последовательность или промотор для создания возможности экспрессии этой последовательности в клетке-мишени. Векторы, необязательно используемые для доставки соединений согласно изобретению, являются коммерчески доступными и могут быть модифицированы для цели доставки соединений согласно изобретению способами, известными специалисту с квалификацией в данной области.The compounds of the invention can be delivered either directly or by viral or non-viral vectors. Upon direct delivery, these sequences are usually rendered resistant to nucleases. Alternatively, these sequences can be included in expression cassettes or constructs, so that this sequence is expressed in the cell, as discussed below. Typically, this construct contains a suitable regulatory sequence or promoter to enable expression of this sequence in the target cell. The vectors optionally used to deliver the compounds of the invention are commercially available and can be modified for the purpose of delivering the compounds of the invention by methods known to those skilled in the art.

Рассматривается также, что длинный олигонуклеотид (обычно с длиной приблизительно 25-500 нуклеотидов), содержащий одну или несколько структур стебля и петли, где районы стебля содержат последовательности олигонуклеотидов согласно изобретению, может доставляться в носителе, предпочтительно фармацевтически приемлемом носителе, и может процессироваться внутриклеточно эндогенными клеточными комплексами (например, DROSHA и DICER, описанными выше) с образованием одного или нескольких меньших двухцепочечных олигонуклеотидов (siPHK), которые являются олигонуклеотидами согласно изобретению. Этот олигонуклеотид может быть назван тандемной конструкцией shPHK. Предполагается, что этот длинный олигонуклеотид является одноцепочечным олигонуклеотидом, содержащим одну или несколько структур стебля и петли, где каждый район стебля содержит смысловую и соответствующую антисмысловую последовательность siPHK гена р53. В частности, предполагается, что этот олигонуклеотид содержит смысловую и антисмысловую последовательности siPHK, изображенные в любой из таблиц А, В или С.It is also contemplated that a long oligonucleotide (typically about 25-500 nucleotides long) containing one or more stem and loop structures, where the stem regions contain the oligonucleotide sequences of the invention, can be delivered in a carrier, preferably a pharmaceutically acceptable carrier, and can be processed intracellularly endogenously cell complexes (e.g., DROSHA and DICER described above) to form one or more smaller double-stranded oligonucleotides (siRNAs), which are oligonucleotides according to the invention. This oligonucleotide may be called the tandem construct shPHK. This long oligonucleotide is believed to be a single-stranded oligonucleotide containing one or more stem and loop structures, where each region of the stem contains the sense and corresponding antisense sequence of the p53 siRNA . In particular, it is contemplated that this oligonucleotide contains sense and antisense siRNA sequences depicted in any of Tables A, B or C.

В данном контексте термин «полипептид» относится, наряду с полипептидом, к олигопептиду, пептиду и полноразмерному белку.As used herein, the term “polypeptide” refers, together with a polypeptide, to an oligopeptide, a peptide and a full-sized protein.

Скрининг инактивирующих р53 соединенийScreening for inactivating p53 compounds

Некоторые соединения и композиции согласно изобретению могут быть использованы в скрининг-анализе для идентификации и выделения соединений, которые модулируют активность р53, в конкретных соединениях, которые модулируют алопецию или острую почечную недостаточность или нарушение, сопровождающееся повышенным уровнем полипептида р53. Подлежащие скринингу соединения включают в себя, помимо прочего, такие вещества, как малые химические молекулы и антисмысловые олигонуклеотиды.Certain compounds and compositions according to the invention can be used in a screening assay to identify and isolate compounds that modulate p53 activity, in specific compounds that modulate alopecia or acute renal failure or a disorder accompanied by an elevated level of p53 polypeptide. Compounds to be screened include, but are not limited to, substances such as small chemical molecules and antisense oligonucleotides.

Ингибирующая активность соединений согласно изобретению в отношении активности полипептида р53 или связывания соединений согласно изобретению с р53 может быть использована для определения взаимодействия дополнительного соединения с полипептидом р53, например, если это дополнительное соединение конкурирует с олигонуклеотидами согласно изобретению за ингибирование р53 или если это дополнительное соединение снимает указанное ингибирование. Эти ингибирование или активация могут быть тестированы различными способами, такими как, помимо прочего, анализ на продукт активности полипептида р53 или вытеснение связывающего соединения из полипептида р53 в радиоактивном или флуоресцентном конкурентном анализе.The inhibitory activity of the compounds of the invention with respect to the activity of the p53 polypeptide or the binding of the compounds of the invention to p53 can be used to determine the interaction of the additional compound with the p53 polypeptide, for example, if this additional compound competes with the oligonucleotides of the invention for inhibition of p53, or if this additional compound removes said inhibition. These inhibitions or activation can be tested in various ways, such as, but not limited to, analyzing the product of p53 polypeptide activity or displacing a binding compound from p53 polypeptide in a radioactive or fluorescence competitive assay.

Данное изобретение иллюстрируется более подробно ниже со ссылкой на примеры, но не должно рассматриваться как ограниченное этими примерами.The invention is illustrated in more detail below with reference to examples, but should not be construed as limited by these examples.

Цитирование любого приведенного здесь документа не предназначено для признания, что такой документ является прототипом предшествующего уровня техники или рассматриваемым материалом в отношении патентоспособности любого пункта формулы данной заявки. Любое утверждение в отношении содержания или даты любого документа основано на информации, доступной для заявителя в момент подачи заявки, и не является признанием в отношении правильности такого утверждения.The citation of any document cited herein is not intended to recognize that such a document is a prior art prototype or material under consideration with respect to the patentability of any claim in this application. Any statement regarding the content or date of any document is based on information available to the applicant at the time of filing, and does not constitute recognition as to the correctness of such a statement.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Общие способы в молекулярной биологииGeneral methods in molecular biology

Стандартные протоколы молекулярной биологии, известные в данной области, не описанные конкретно здесь, обычно выполняются по существу, как описано у Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989, 1992) и у Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), и у Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), и у Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, и у Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols.1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) и как описано в патентах США 4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057, и включены здесь в качестве ссылки. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили обычно, как описано в PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990). ПЦР in situ (в клетке) в комбинации с проточной цитометрией может быть использована для детектирования клеток, содержащих конкретные последовательности ДНК и мРНК (Testoni et al., 1996, Blood 87:3822). Способы выполнения ОТ-ПЦР также хорошо известны в данной области.Standard molecular biology protocols known in the art that are not specifically described here are typically performed essentially as described by Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989, 1992) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), and Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), and Watson et al ., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, and Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) and as described in US Pat. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5192659 and 5272057, and are incorporated herein by reference. Polymerase chain reaction (PCR) was usually performed as described in PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990). In situ PCR (in a cell) in combination with flow cytometry can be used to detect cells containing specific DNA and mRNA sequences (Testoni et al., 1996, Blood 87: 3822). Methods for performing RT-PCR are also well known in the art.

ПРИМЕР 1EXAMPLE 1

Генерирование последовательностей для активных соединений siPHK Sequence Generation for Active siRNA Compounds

С использованием патентованных алгоритмов и известной последовательности гена р53 (SEQ ID NO:1) генерировали последовательности многих потенциальных siPHK. Таблица А показывает 23 siPHK, которые до настоящего времени были отобраны, химически синтезированы и испытаны на активность (см. Пример 2). Все эти siPHK являются 19-мерами.Using proprietary algorithms and the known p53 gene sequence (SEQ ID NO: 1), sequences of many potential siRNAs were generated. Table A shows 23 siRNAs that have so far been selected, chemically synthesized and tested for activity (see Example 2). All of these siRNAs are 19 measures.

Figure 00000001
Figure 00000001

Обратите внимание на то, что в приведенной выше таблице А смысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:3-25 соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:26-48 соответственно. Соединение №1 siPHK (SEQ ID NO:3 и 26) известно из литературы (Dirac and Bernards, Reversal of senescence in mouse fibroblasts through lentiviral suppression of p53, J. Biol. Chem. (2003) 278:11731) и siPHK №2 (SEQ ID NO:4 и 27) также известна из литературы (Brummelkamp et al. Science 2002, 296:550-553). Однако применение этих соединений в способах лечения, описанных здесь, не было описано ранее и, следовательно, является новым.Please note that in the above table A, sense chains siRNA 1-23 have SEQ ID NO: 3-25, respectively, and antisense chains siRNA 1-23 have SEQ ID NO: 26-48, respectively. Compound No. 1 siRNA (SEQ ID NOs: 3 and 26) is known from the literature (Dirac and Bernards, Reversal of senescence in mouse fibroblasts through lentiviral suppression of p53, J. Biol. Chem. (2003) 278: 11731) and siRNA No. 2 (SEQ ID NO: 4 and 27) is also known from the literature (Brummelkamp et al. Science 2002, 296: 550-553). However, the use of these compounds in the treatment methods described herein has not been described previously and, therefore, is new.

Таблица В ниже показывает дополнительные 71 19-мерные siPHK, которые были генерированы с использованием патентованных алгоритмов.Table B below shows the optional 71 19-dimensional siRNAs that were generated using proprietary algorithms.

Figure 00000002
Figure 00000002

Figure 00000003
Figure 00000003

Обратите внимание на то, что в приведенной выше таблице В смысловые цепи siPHK 1-71 имеют SEQ ID NO:49-11, соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-71 имеют SEQ ID NO:120-190 соответственно.Please note that in the above table B, sense chains of siRNA 1-71 have SEQ ID NO: 49-11, respectively, and antisense chains of siRNA 1-71 have SEQ ID NO: 120-190, respectively.

Таблица С ниже показывает дополнительные 63 21-мерные siPHK, которые были генерированы с использованием патентованных алгоритмов.Table C below shows the additional 63 21-dimensional siRNAs that were generated using proprietary algorithms.

Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000004
Figure 00000005

Обратите внимание на то, что в приведенной выше таблице С смысловые цепи siPHK 1-63 имеют SEQ ID NO:191-253 соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-63 имеют SEQ ID NO:254-316 соответственно.Please note that in the above table C, sense chains of siRNA 1-63 have SEQ ID NO: 191-253, respectively, and antisense chains of siRNA 1-63 have SEQ ID NO: 254-316, respectively.

ПРИМЕР 2EXAMPLE 2

Испытание соединений siPHK на анти-р53-активностьAnti-p53 activity test of siRNA compounds

ПротоколыProtocols

I. Получение siPHK (двухцепочечных олигонуклеотидов)I. Obtaining siRNA (double-stranded oligonucleotides)

Лиофилизированные олигонуклеотиды растворяли в не содержащей РНКаз дистиллированной воде с получением конечной концентрации 100 мкМ. Разбавленные олигонуклеотиды выдерживали при комнатной температуре в течение 15 минут и сразу после этого замораживали в жидком азоте.Lyophilized oligonucleotides were dissolved in RNase-free distilled water to give a final concentration of 100 μM. The diluted oligonucleotides were kept at room temperature for 15 minutes and immediately thereafter frozen in liquid nitrogen.

Эти олигонуклеотиды хранили при -80°С и разбавляли буфером ЗФР перед использованием.These oligonucleotides were stored at −80 ° C. and diluted with PBS before use.

II. Трансфекция siPHK в клетки человека с использованием реагента Липофектамина2000:II. Transfection of siRNA into human cells using Lipofectamine 2000 reagent:

2·105 клеток р53-wt HCT116 или SW480 высевали на лунку в 6-луночной чашке. Спустя 24 часа клетки трансфицировали олигонуклеотидами р53 с использованием реагента Липофектамина2000 (полученного из Invitrogen).2 · 10 5 p53-wt HCT116 or SW480 cells were plated per well in a 6-well plate. After 24 hours, the cells were transfected with p53 oligonucleotides using Lipofectamine 2000 reagent (obtained from Invitrogen).

Выполняли следующую процедуру:Perform the following procedure:

1. Перед трансфекцией клеточную среду заменяли 1500 мкл свежей среды без антибиотиков.1. Before transfection, the cell medium was replaced with 1,500 μl of fresh medium without antibiotics.

2. В стерильную, пластиковую пробирку добавляли реагент Липофектамин2000 (количество рассчитывали в соответствии с 5 мкл на лунку) к 250 мкл бессывороточной среды и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре.2. Lipofectamine 2000 (reagent was calculated in accordance with 5 μl per well) was added to a sterile plastic tube to 250 μl of serum-free medium and incubated for 5 minutes at room temperature.

3. В другую пробирку добавляли анти-р53-олигонуклеотиды (варьирующиеся количества для подгонки к желаемой конечной концентрации на лунку) к 250 мкл бессывороточной среды.3. Anti-p53 oligonucleotides (varying amounts to fit the desired final concentration per well) were added to another tube to 250 μl of serum-free medium.

4. Комплекс Липофектамина2000 объединяли с раствором олигонуклеотида р53 и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.4. The Lipofectamine 2000 complex was combined with a p53 oligonucleotide solution and incubated for 20 minutes at room temperature.

5. Полученную смесь добавляли по каплям к клеткам и эти клетки инкубировали при 37°С.5. The resulting mixture was added dropwise to the cells and these cells were incubated at 37 ° C.

6. Клетки SW480: спустя 48 часов после трансфекции эти клетки собирали и белки экстрагировали с использованием буфера RIPA.6. SW480 cells: 48 hours after transfection, these cells were harvested and proteins were extracted using RIPA buffer.

7. Клетки НСТ116:7. HCT116 cells:

Спустя 40 часов после трансфекции к клеткам добавляли 5Fu (Sigma) для получения конечной концентрации 25 мкг/мл. Спустя 48 часов после трансфекции клеток (8 часов после обработки 5Fu) эти клетки собирали и белки экстрагировали с использованием буфера RIPA.40 hours after transfection, 5Fu (Sigma) was added to the cells to obtain a final concentration of 25 μg / ml. 48 hours after transfection of cells (8 hours after 5Fu treatment), these cells were harvested and proteins were extracted using RIPA buffer.

8. Экспрессию р53 определяли Вестерн-блот-анализом с использованием моноклонального антитела (Do-1-клона, Santa Cruz). Для нормализации блоты испытывали на экспрессию тубулина.8. The expression of p53 was determined by Western blot analysis using a monoclonal antibody (Do-1 clone, Santa Cruz). To normalize, blots were tested for tubulin expression.

III. Котрансфекция гена р53 мыши и олигонуклеотидов р53 мыши в клетки РС3 с использованием реагента Липофектамина2000:III. Cotransfection of mouse p53 gene and mouse p53 oligonucleotides into PC3 cells using Lipofectamine 2000 reagent:

2·105 клеток р53-0 РС3 высевали на лунку в 6-луночной чашке. Спустя 24 часа клетки котрансфицировали геном р53 мыши и геном GFP, и олигонуклеотидом р53 мыши с использованием реагента Липофектамина2000 (Invitrogen). Выполняли следующую процедуру:2 · 10 5 p53-0 PC3 cells were plated per well in a 6-well plate. After 24 hours, the cells were co-transfected with the mouse p53 gene and the GFP gene, and mouse p53 oligonucleotide using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen). Perform the following procedure:

1. Перед трансфекцией клеточную среду заменяли 1500 мкл свежей среды без антибиотиков.1. Before transfection, the cell medium was replaced with 1,500 μl of fresh medium without antibiotics.

2. В стерильную, пластиковую пробирку добавляли реагент Липофектамин2000 (5 мкл на лунку) к 250 мкл бессывороточной среды и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре.2. Lipofectamine 2000 (5 μl per well) was added to a sterile plastic tube to 250 μl of serum-free medium and incubated for 5 minutes at room temperature.

3. В другую пробирку добавляли 4 мкг ДНК (ген р53:ген GFP, 10:1) и олигонуклеотиды р53 человека к 250 мкл бессывороточной среды.3. 4 μg DNA (p53 gene: 10: 1 GFP gene) and human p53 oligonucleotides were added to another 250 μl serum-free medium to another tube.

4. Комплекс Липофектамина2000 объединяли с раствором олигонуклеотида р53 и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.4. The Lipofectamine 2000 complex was combined with a p53 oligonucleotide solution and incubated for 20 minutes at room temperature.

5. Полученную смесь добавляли по каплям к клеткам и эти клетки инкубировали при 37°С.5. The resulting mixture was added dropwise to the cells and these cells were incubated at 37 ° C.

6. Спустя 48 часов после трансфекции эти клетки собирали и белки экстрагировали с использованием буфера RIPA.6. 48 hours after transfection, these cells were harvested and proteins were extracted using RIPA buffer.

7. Экспрессию р53 определяли Вестерн-блот-анализом с использованием моноклонального антитела (Clone240, Chemicon). Для нормализации блоты испытывали на экспрессию GFP.7. The expression of p53 was determined by Western blot analysis using a monoclonal antibody (Clone240, Chemicon). To normalize, blots were tested for GFP expression.

Результаты:Results:

А. Олигонуклеотиды р53 человека:A. Human p53 oligonucleotides:

Таблица DTable D Номерroom ОлигоOligo ВидView ИсточникSource Результаты тестаTest results SW480SW480 HCT116HCT116 22 Hu2'Hu2 ' ЧеловекPerson ЛитератураLiterature (-)(-) (+)(+) 33 QHMon1QHmon1 Человек, обезьянаMan monkey ПатентованныйPatented (++)(++) (+++)(+++) 4four QHMonQhmon Человек, обезьянаMan monkey ПатентованныйPatented (-)(-) Не тестировалиNot tested 55 QH1QH1 ЧеловекPerson Патентованный Patented (+++)(+++) (+++)(+++) 66 QH2QH2 ЧеловекPerson ПатентованныйPatented (-)(-) Не тестировалиNot tested 1313 А17A17 Человек, мышьMan mouse Патентованный Patented (-)(-) Не тестировалиNot tested 14fourteen Е2E2 Человек, мышь, крысаMan, mouse, rat Патентованный Patented (+)(+) Не тестировалиNot tested 15fifteen Е6E6 Человек, мышь, крысаMan, mouse, rat Патентованный Patented (-)(-) Не тестировалиNot tested 1616 В1IN 1 Человек, мышь, крысаMan, mouse, rat Патентованный Patented (-)(-) Не тестировалиNot tested 1717 В2IN 2 Человек, мышь, крысаMan, mouse, rat Патентованный Patented (-)(-) Не тестировалиNot tested 18eighteen С1C1 Человек, обезьяна, мышьMan, monkey, mouse Патентованный Patented (-)(-) Не тестировалиNot tested 1919 F2F2 Человек, обезьяна, собакаMan, monkey, dog Патентованный Patented (-)(-) Не тестировалиNot tested 20twenty F3F3 Человек, обезьяна, собакаMan, monkey, dog Патентованный Patented (+++)(+++) (+++)(+++) 2121 G1G1 Человек, обезьяна, собакаMan, monkey, dog Патентованный Patented (+++)(+++) Не тестировалиNot tested 2222 Н2H2 Человек, обезьяна, собакаMan, monkey, dog Патентованный Patented (+)(+) Не тестировалиNot tested 2323 I5I5 Человек, обезьяна, собакаMan, monkey, dog Патентованный Patented (+++)(+++) Не тестировалиNot tested

Примечание: номера в таблице D соответствуют номерам, использованным в таблице А, где смысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:3-25 соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:26-48 соответственно.Note: the numbers in table D correspond to the numbers used in table A, where the sense chains of siRNA 1-23 have SEQ ID NO: 3-25, respectively, and the antisense chains of siRNA 1-23 have SEQ ID NO: 26-48, respectively.

Как показано в таблице D, четыре олигонуклеотида человека тестировали в двух системах SW480 и HCT116 в соответствии с Протоколом II, приведенным выше. Репрезентативные результаты (Вестерн-блот), на которых основаны результаты теста, показаны на фиг.3.As shown in table D, four human oligonucleotides were tested in two systems SW480 and HCT116 in accordance with Protocol II above. Representative results (Western blot) on which the test results are based are shown in FIG. 3.

В. Олигонуклеотиды р53 мыши:B. Mouse p53 oligonucleotides:

Таблица ЕTable E Номерroom ОлигоOligo ВидView ИсточникSource Результаты тестаTest results Клетки РС3/экзогенный р53PC3 cells / exogenous p53 0-мышь0-mouse 1one Мо3Mo3 МышьMouse ЛитератураLiterature (+++)(+++)   77 QM1QM1 МышьMouse ПатентованныйPatented (-)(-)   88 QM2QM2 МышьMouse ПатентованныйPatented (-)(-)   99 QM3QM3 МышьMouse ПатентованныйPatented (-)(-)   1010 QM6QM6 мышьmouse ПатентованныйPatented (-)(-)   11eleven QM4QM4 Мышь, крысаMouse rat ПатентованныйPatented (+++)(+++)   1212 QM5QM5 Мышь, крысаMouse rat ПатентованныйPatented (+++)(+++)   1313 A17A17 Человек, мышьMan mouse ПатентованныйPatented (-)(-)   14fourteen Е2E2 Человек, мышь, крысаMan, mouse, rat ПатентованныйPatented (++)(++)   15fifteen Е6E6 Человек, мышь, крысаMan, mouse, rat ПатентованныйPatented (-)(-)   1616 В1IN 1 Человек, обезьяна, мышьMan, monkey, mouse ПатентованныйPatented (-)(-)   1717 В2IN 2 Человек, обезьяна, мышьMan, monkey, mouse ПатентованныйPatented (++)(++)   18eighteen С1C1 Человек, обезьяна, мышьMan, monkey, mouse ПатентованныйPatented (++)(++)   1919 G1G1 Человек, обезьяна, собакаMan, monkey, dog ПатентованныйPatented (++)(++)   20twenty F3F3 Человек, обезьяна, собакаMan, monkey, dog ПатентованныйPatented (+++)(+++)   2121 I5I5 Человек, обезьяна, собакаMan, monkey, dog ПатентованныйPatented (-)(-)   2222 QHMon1QHmon1 Человек, обезьянаMan monkey ПатентованныйPatented (++)(++)  

Примечание: номера в таблице Е (как и для таблицы D) соответствуют номерам, использованным в таблице А, где смысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:3-25 соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:26-48 соответственно. Репрезентативные результаты Вестерн-блота, на которых основаны результаты теста, показаны на фиг.4.Note: the numbers in table E (as for table D) correspond to the numbers used in table A, where the sense chains siRNA 1-23 have SEQ ID NO: 3-25, respectively, and the antisense chains siRNA 1-23 have SEQ ID NO: 26-48 respectively. Representative Western blot results on which test results are based are shown in FIG. 4.

ПРИМЕР 3EXAMPLE 3

Модельные системы выпадения волосModel hair loss systems

Тестирование активной siPHK может быть выполнено в следующих системах:Active siPHK testing can be performed on the following systems:

а. Мышиная модель выпадения волосbut. Mouse hair loss model

b. Культивируемые ex vivo волосяные фолликулы человекаb. Ex vivo cultured human hair follicles

с. Трансплантат волосяного фолликула человека в голых мышахfrom. Human Hair Follicle Transplant in Nude Mice

Примечание: Системы для тестирования активной siPHK описаны у Botcharev et al., 2000, p53 is essential for Chemotherapy-induced Hair Loss, Cancer Research, 60, 5002-5006).Note: Systems for testing active siRNA are described in Botcharev et al., 2000, p53 is essential for Chemotherapy-induced Hair Loss, Cancer Research, 60, 5002-5006).

ПРИМЕР 4EXAMPLE 4

Модельные системы острой почечной недостаточности (ОПН)Model systems of acute renal failure (ARF)

Тестирование активной siPHK для лечения ОПН может быть произведено с использованием индуцированной сепсисом ОПН или индуцированной ишемией-реперфузией ОПН.Testing active siRNA for the treatment of acute renal failure can be performed using sepsis-induced acute renal failure or ischemia-reperfusion-induced acute renal failure.

1. Индуцированная сепсисом ОПН1. Induced sepsis acute renal failure

Две прогностические модели животных индуцированной сепсисом ОПН описаны Miyaji T, Hu X, Yuen PS, Muramatsu Y, Iyer S, Hewitt SM, Star RA, 2003, Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice, Kidney Int. Nov; 64(5):1620-31. Этими двумя моделями являются введение липополисахарида и слепокишечная лигирующая пункция у мышей, предпочтительно у стареющих мышей.Two prognostic animal models of sepsis-induced acute renal failure are described by Miyaji T, Hu X, Yuen PS, Muramatsu Y, Iyer S, Hewitt SM, Star RA, 2003, Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice , Kidney Int . Nov; 64 (5): 1620-31. These two models are the administration of lipopolysaccharide and cecal ligation puncture in mice, preferably in aging mice.

2. Индуцированная ишемией-реперфузией ОПН2. Induced by ischemia-reperfusion acute renal failure

Эта прогностическая модель животного описана Kelly KJ, Plotkin Z, Vulgamott SL, Dagher PC, 2003 January, P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion after renal ischemia-reperfusion: protective role of a p53 inhibitor, J Am Soc Nephrol.; 14(1):128-38).This animal predictive model is described by Kelly KJ, Plotkin Z, Vulgamott SL, Dagher PC, 2003 January, P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion after renal ischemia-reperfusion: protective role of a p53 inhibitor, J Am Soc Nephrol .; 14 (1): 128-38).

Ишемическое-реперфузионное повреждение индуцировали у крыс после 45 минут билатерального пережимания артерий почек и последующего удаления этого пережимания для создания возможности 24 часов реперфузии. 250 мкг siPHK р53 (последовательность QM5, таблица А) инъецировали в яремную вену за 2 часа до пережимания и спустя 30 минут после этого пережимания. Дополнительные 250 мкг siPHK вводили через хвостовую вену при 4 и 8 часах после пережимания. siPHK против GFP служила в качестве отрицательного контроля. Описанные здесь используемые в этих экспериментах siPHK имели фосфатную группу на 3'-конце как смысловой, так и антисмысловой цепи. Было обнаружено, что 3'-нефосфорилированная siPHK имеет такую же биологическую активность в модели животного, что и соответствующая 3'-фосфорилированная siPHK. Прогрессирование ОПН подвергали мониторингу измерением сывороточных уровней креатинина до хирургии и спустя 24 часа после хирургии. В конце этого эксперимента крыс перфузировали через постоянную бедренную линию теплым буфером ЗФР и затем 4% параформальдегидом. Левые почки удаляли и хранили в 4% параформальдегиде для последующего гистологического анализа. Острую почечную недостаточность часто определяют как острое увеличение сывороточного уровня креатинина от фона. Увеличение по меньшей мере 0,5 мг на дл или 44,2 мкмоль на л сывороточного креатинина считается указанием на острую почечную недостаточность. Сывороточный креатинин измеряют в момент 0 перед хирургией и при 24 часах после хирургии ОПН.Ischemic reperfusion injury was induced in rats after 45 minutes of bilateral constriction of the arteries of the kidneys and subsequent removal of this constriction to allow 24 hours of reperfusion. 250 μg siRNA p53 (QM5 sequence, Table A) was injected into the jugular vein 2 hours before pinching and 30 minutes after this pinching. An additional 250 μg siRNA was administered via the tail vein at 4 and 8 hours after pinching. siRNA against GFP served as a negative control. The siRNAs used in these experiments described here had a phosphate group at the 3'-end of both the sense and antisense chains. It was found that 3'-non-phosphorylated siRNA has the same biological activity in the animal model as the corresponding 3'-phosphorylated siRNA. Progression of acute renal failure was monitored by measuring serum creatinine levels before surgery and 24 hours after surgery. At the end of this experiment, rats were perfused through a constant femoral line with warm PBS and then 4% paraformaldehyde. Left kidneys were removed and stored in 4% paraformaldehyde for subsequent histological analysis. Acute renal failure is often defined as an acute increase in serum creatinine levels from the background. An increase of at least 0.5 mg per dL or 44.2 µmol per liter of serum creatinine is considered indicative of acute renal failure. Serum creatinine is measured at time 0 before surgery and at 24 hours after acute renal failure.

Для исследования распределения siPHK р53 в почке крысы Cy3-меченые 19-мерные затупленные на концах молекулы siPHK (2 мг/кг), имеющие чередующуюся О-метил-модификацию в сахарных остатках, вводили i.v. в течение 3-5 минут, после чего проводили визуализацию in vivo с использованием двухфотонной конфокальной микроскопии. Анализ конфокальной микроскопией выявил, что большая часть siPHK в почках концентрируется в эндосомном компартменте клеток проксимальных канальцев. Флуоресценция как эндосомной, так и цитоплазматической siPHK была относительно стабильной во время первых 2 часов после доставки и исчезала при 24 часах.To study the distribution of p53 siRNA in rat kidney, Cy3-labeled 19-dimensional blunted siRNA molecules at the ends (2 mg / kg) with alternating O-methyl modification in sugar residues were administered iv for 3-5 minutes, after which visualization was performed in vivo using two-photon confocal microscopy. Confocal microscopy analysis revealed that most of the siRNA in the kidneys is concentrated in the endosomal compartment of proximal tubule cells. Fluorescence of both endosomal and cytoplasmic siRNA was relatively stable during the first 2 hours after delivery and disappeared at 24 hours.

Как видно из фиг.5, имелось десятикратное увеличение уровня сывороточного креатинина после 45 минут обработки билатерального пережимания артерий почек (ЗФР-обработки). Четыре инъекции siPHK р53 (последовательность QM5, таблица А) (за 2 часа до пережимания и спустя 30 минут, 4 часа и 8 часов после пережимания) значимо уменьшали уровень креатинина в сыворотке на 50% (Р<0,001). Эти результаты предполагают, что siPHK р53 может защищать почечную ткань от действий ишемического-реперфузионного повреждения и, следовательно, уменьшает тяжесть ОПН.As can be seen from FIG. 5, there was a ten-fold increase in serum creatinine level after 45 minutes of bilateral renal artery constriction treatment (PBS treatment). Four injections of siRNA p53 (QM5 sequence, Table A) (2 hours before pinching and 30 minutes, 4 hours and 8 hours after pinching) significantly reduced serum creatinine by 50% (P <0.001). These results suggest that siRNA p53 can protect renal tissue from the effects of ischemic reperfusion injury and, therefore, reduces the severity of acute renal failure.

Действие обработки siPHK р53 на ишемическое-реперфузионное повреждение определяли дополнительно анализом степени канальцевого некроза в почечной ткани. Канальцевый некроз может оцениваться в баллах следующим образом: нет повреждения (балльная оценка повреждения 0), одноклеточный, изолированный в виде пятен некроз (балльная оценка повреждения 1), канальцевый некроз в менее чем 25% ткани (балльная оценка повреждения 2), канальцевый некроз в 25-50% этой ткани (балльная оценка повреждения 3) и канальцевый некроз в более чем 50% этой ткани (балльная оценка повреждения 4). Фиг.6 демонстрирует повреждение канальцев почек, выраженное в виде балльной оценки повреждения (ось Y) у животных, которые не подвергались ишемическому-реперфузионному повреждению (группа 1), или у животных с ишемическим-реперфузионным повреждением после обработки ЗФР (группа 2), двумя инъекциями siPHK р53 (группа 3), тремя инъекциями siPHK р53 (группа 4) или четырьмя инъекциями siPHK р53 (группа 5). Как показано на фиг.6, четыре инъекции siPHK р53 приводили к значимому уменьшению в канальцевом почечном повреждении в сравнении с обработанной ЗФР контрольной группой. Фиг.7 показывает, что четыре инъекции обработки siPHK р53 отрицательно регулировали экспрессию про-апоптотического гена Puma в кортикальном компартменте почки у животного, подвергнутого ишемическому-реперфузионному повреждению. Это свидетельствует о том, что обработка siPHK р53 способна ингибировать апоптотические процессы в почке после ишемического-реперфузионного повреждения.The effect of siRNA p53 treatment on ischemic-reperfusion injury was further determined by analysis of the degree of tubular necrosis in the renal tissue. Tubular necrosis can be scored as follows: no damage (damage score 0), unicellular necrosis isolated as spots (damage score 1), tubular necrosis in less than 25% of the tissue (damage score 2), tubular necrosis 25-50% of this tissue (damage score 3) and tubular necrosis in more than 50% of this tissue (damage score 4). 6 shows damage to the renal tubules, expressed as a score for damage (Y axis) in animals that did not undergo ischemic reperfusion damage (group 1), or in animals with ischemic reperfusion damage after treatment with PBS (group 2), two injections of siRNA p53 (group 3), three injections of siRNA p53 (group 4) or four injections of siRNA p53 (group 5). As shown in FIG. 6, four injections of siRNA p53 resulted in a significant decrease in tubular renal damage compared with the PBS-treated control group. Fig. 7 shows that four injections of s53R p53 treatment negatively regulated the expression of the pro-apoptotic Puma gene in the cortical compartment of a kidney in an animal undergoing ischemic reperfusion injury. This suggests that siRNA p53 treatment is able to inhibit apoptotic processes in the kidney after ischemic reperfusion injury.

Claims (18)

1. Соединение в виде двухцепочечной РНК для отрицательной регуляции экспрессии гена р53, имеющее структуру
5'ugaagggugaaauauucuc-Z3' (антисмысловая цепь SEQ ID NO: 48)
3'Z'-acuucccacuuuauaagag 5' (смысловая цепь SEQ ID NO: 25),
где каждый из а, с, u и g означает 2'-O-Ме-модифицированный по сахарному остатку рибонуклеотид или немодифицированный рибонуклеотид, и каждый последовательный рибонуклеотид соединен с последующим рибонуклеотидом ковалентной связью;
где каждый из Z и Z' может присутствовать или отсутствовать, но, если присутствует, означает dTdT и является ковалентно присоединенным на 3'-конце цепи, в которой он присутствует; и
где чередующиеся рибонуклеотиды как в антисмысловой цепи, так и в смысловой цепи являются 2'-O-Ме-модифицированными по сахарному остатку рибонуклеотидами, и 2'-O-Ме-модифицированный по сахарному остатку рибонуклеотид находится как на 5'-конце, так и 3'-конце антисмысловой цепи, и немодифицированный рибонуклеотид находится как на 5'-конце, так и 3'-конце смысловой цепи.1. The compound in the form of double-stranded RNA for negative regulation of p53 gene expression, having the structure
5'ugaagggugaaauauucuc-Z3 '(antisense strand SEQ ID NO: 48)
3'Z'-acuucccacuuuauaagag 5 '(sense chain of SEQ ID NO: 25),
where each of a, c, u, and g is a 2'-O-Me sugar residue-modified ribonucleotide or unmodified ribonucleotide, and each successive ribonucleotide is connected to the subsequent ribonucleotide by a covalent bond;
where each of Z and Z 'may be present or absent, but if present, means dTdT and is covalently attached at the 3'-end of the chain in which it is present; and
where alternating ribonucleotides both in the antisense chain and in the sense chain are 2'-O-Me-sugar-modified ribonucleotides, and the 2'-O-Me-sugar-modified ribonucleotide is located at both the 5'-end and 3'-end of the antisense chain, and the unmodified ribonucleotide is located at both the 5'-end and 3'-end of the sense strand. 2. Соединение по п.1, где ковалентной связью является фосфодиэфирная связь.2. The compound according to claim 1, where the covalent bond is a phosphodiester bond. 3. Соединение по п.1 или 2, где и Z, и Z' отсутствуют.3. The compound according to claim 1 or 2, where both Z and Z 'are absent. 4. Соединение по п.1 или 2, где один из Z или Z' присутствует.4. The compound according to claim 1 or 2, where one of Z or Z 'is present. 5. Соединение по п.1 или 2, где антисмысловая цепь и смысловая цепь являются нефосфорилированными на 3'-конце и 5'-конце.5. The compound according to claim 1 or 2, where the antisense chain and the sense chain are non-phosphorylated at the 3'-end and 5'-end. 6. Соединение по п.1 или 2, где антисмысловая цепь и смысловая цепь являются фосфорилированными на их 3'-концах.6. The compound according to claim 1 or 2, where the antisense strand and the sense strand are phosphorylated at their 3'-ends. 7. Соединение в виде двухцепочечной РНК для отрицательной регуляции экспрессии гена р53, имеющее структуру
5' ugaagggugaaauauucuc 3' (антисмысловая цепь SEQ ID NO: 48)
3' acuucccacuuuauaagag 5' (смысловая цепь SEQ ID NO: 25),
где каждый из а, с, u и g означает 2'-O-Ме-модифицированный по сахарному остатку рибонуклеотид или немодифицированный рибонуклеотид, и каждый последовательный рибонуклеотид соединен с последующим рибонуклеотидом фосфодиэфирной связью;
где чередующиеся рибонуклеотиды как в антисмысловой цепи, так и в смысловой цепи являются 2'-O-Ме-модифицированными по сахарному остатку рибонуклеотидами, и 2'-O-Ме-модифицированный по сахарному остатку рибонуклеотид находится как на 5'-конце, так и 3'-конце антисмысловой цепи, и немодифицированный рибонуклеотид находится как на 5'-конце, так и 3'-конце смысловой цепи; и где рибонуклеотид на 3'-конце и рибонуклеотид на 5'-конце являются нефосфорилированными как в антисмысловой цепи, так и в смысловой цепи.7. A double-stranded RNA compound for downregulating p53 gene expression, having the structure
5 'ugaagggugaaauauucuc 3' (antisense chain SEQ ID NO: 48)
3 'acuucccacuuuuauaagag 5' (sense chain of SEQ ID NO: 25),
where each of a, c, u, and g is a 2'-O-Me sugar residue-modified ribonucleotide or unmodified ribonucleotide, and each successive ribonucleotide is connected to the subsequent ribonucleotide by a phosphodiester linkage;
where alternating ribonucleotides both in the antisense chain and in the sense chain are 2'-O-Me-sugar-modified ribonucleotides, and the 2'-O-Me-sugar-modified ribonucleotide is located at both the 5'-end and 3'-end of the antisense chain, and the unmodified ribonucleotide is located both at the 5'-end and 3'-end of the sense chain; and where the ribonucleotide at the 3'end and the ribonucleotide at the 5'end are non-phosphorylated both in the antisense strand and in the sense strand. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая любое из соединений по пп.1-7 в количестве, эффективном для отрицательной регуляции экспрессии гена р53 человека, и фармацевтически приемлемый носитель.8. A pharmaceutical composition comprising any of the compounds of claims 1-7 in an amount effective to downregulate the expression of the human p53 gene, and a pharmaceutically acceptable carrier. 9. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение в виде двухцепочечной РНК по любому из пп.1-7 в количестве, эффективном для лечения пациента, страдающего острой почечной недостаточностью или ишемическим-реперфузионным повреждением, вызванными хирургическим вмешательством, или с высоким риском развития острой почечной недостаточности или ишемического-реперфузионного повреждения, вызванных хирургическим вмешательством, и фармацевтически приемлемый носитель.9. A pharmaceutical composition comprising a double-stranded RNA compound according to any one of claims 1 to 7 in an amount effective to treat a patient suffering from acute renal failure or ischemic reperfusion injury caused by surgery, or with a high risk of developing acute renal failure or ischemic reperfusion injury caused by surgery, and a pharmaceutically acceptable carrier. 10. Способ лечения пациента, страдающего нарушением, выбранным из группы, состоящей из острой почечной недостаточности и индуцированной цисплатином глухоты, предусматривающий введение этому пациенту соединения по любому из пп.1-7 или композиции по п.8 в терапевтически эффективной дозе, посредством чего осуществляется лечение пациента.10. A method of treating a patient suffering from a disorder selected from the group consisting of acute renal failure and cisplatin-induced deafness, comprising administering to this patient a compound according to any one of claims 1 to 7 or a composition according to claim 8 in a therapeutically effective dose, whereby patient treatment. 11. Способ улучшения выживаемости трансплантированной ткани после трансплантации у пациента, подвергшегося пересадке почки, предусматривающий введение этому пациенту соединения по любому из пп.1-7 или композиции по п.8 в терапевтически эффективной дозе, посредством чего осуществляется лечение пациента.11. A method for improving the survival of transplanted tissue after transplantation in a patient undergoing a kidney transplant, the method comprising administering to the patient a compound according to any one of claims 1 to 7 or a composition according to claim 8 in a therapeutically effective dose, whereby the patient is treated. 12. Применение терапевтически эффективного количества соединения в виде двухцепочечной РНК по любому из пп.1-7 для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления у пациента, страдающего острой почечной недостаточностью, или индуцированной цисплатином глухотой, или для улучшения выживаемости трансплантированной ткани после трансплантации.12. The use of a therapeutically effective amount of a double-stranded RNA compound according to any one of claims 1 to 7 for the preparation of a medicament for stimulating recovery in a patient suffering from acute renal failure or cisplatin-induced deafness, or for improving the survival of the transplanted tissue after transplantation. 13. Способ отрицательной регуляции экспрессии гена р53 по меньшей мере на 50% в сравнении с контролем, предусматривающий приведение мРНК гена р53 в контакт с соединением в виде двухцепочечной РНК по любому из пп.1-7.13. A method for negatively regulating p53 gene expression by at least 50% in comparison with a control, comprising contacting the p53 gene mRNA with the double-stranded RNA compound of any one of claims 1 to 7. 14. Способ предотвращения острой почечной недостаточности у пациента, имеющего высокую степень риска, подвергающегося обширному хирургическому вмешательству, предусматривающий введение этому пациенту соединения по любому из пп.1-7 или композиции по п.8 в терапевтически эффективной дозе, посредством чего осуществляется лечение пациента.14. A method of preventing acute renal failure in a patient at high risk, undergoing extensive surgery, comprising administering to this patient a compound according to any one of claims 1 to 7 or a composition of claim 8 in a therapeutically effective dose, whereby the patient is treated. 15. Способ по п.14, где хирургическим вмешательством является хирургическая операция на сердце.15. The method according to 14, where the surgical intervention is a surgical operation on the heart. 16. Способ лечения пациента, страдающего острой почечной недостаточностью или ишемическим-реперфузионным повреждением, вызванными хирургическим вмешательством, или с высоким риском развития острой почечной недостаточности или ишемического-реперфузионного повреждения, вызванных хирургическим вмешательством, который включает введение этому пациенту соединения в виде двухцепочечной РНК по любому из пп.1-7 или композиции по п.8 в терапевтически эффективной дозе, посредством чего осуществляется лечение пациента.16. A method of treating a patient suffering from acute renal failure or ischemic reperfusion injury caused by surgery, or at a high risk of developing acute renal failure or ischemic reperfusion injury caused by surgery, which comprises administering to this patient a double-stranded RNA compound according to any from claims 1 to 7 or the composition of claim 8 in a therapeutically effective dose, whereby the patient is treated. 17. Способ по п.16, где хирургическим вмешательством является пересадка почки.17. The method according to clause 16, where the surgical intervention is a kidney transplant. 18. Способ по п.16, где хирургическим вмешательством является хирургическая операция на сердце. 18. The method according to clause 16, where the surgical intervention is a surgical operation on the heart.
RU2007116168/10A 2004-09-28 2005-09-27 Oligiribonucleotides and methods of their application for treatment of acute renal failure and other diseases RU2434942C2 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61399104P 2004-09-28 2004-09-28
US60/613,991 2004-09-28
US65819605P 2005-03-02 2005-03-02
US60/658,196 2005-03-02
US60/703,020 2005-07-26

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011130434/10A Division RU2584609C2 (en) 2004-09-28 2005-09-27 Oligoribonucleotides and methods of their application for treatment of acute renal failure

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2007116168A RU2007116168A (en) 2008-11-27
RU2434942C2 true RU2434942C2 (en) 2011-11-27

Family

ID=45318365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2007116168/10A RU2434942C2 (en) 2004-09-28 2005-09-27 Oligiribonucleotides and methods of their application for treatment of acute renal failure and other diseases

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2434942C2 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2577227C1 (en) * 2012-01-05 2016-03-10 Байонир Корпорейшн Highly effective double-stranded oligo-rna structure such nanoparticles and method of its manufacturing
RU2599449C1 (en) * 2011-12-15 2016-10-10 Байонир Корпорейшн New oligonucleotides conjugates and use thereof
RU2667960C2 (en) * 2012-04-18 2018-09-25 Ногра Фарма Лимитед Methods of treating diabetes and/or promoting survival of pancreatic islets after transplantation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Knocking down p53 expression using RNA interference". Cell notes, 2003, v.7, p.12-13, найдено в Интернет <URL: www.promega.com, 13.05.2010. *
IAVARONE A. ET AL.: "Germ-line and somatic p53 gene mutation in multifocal sarcoma", PNAS, 1992, v.82, n.9, p.4207-4209, последовательность NP_001126117, найдена в интернет <URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&P AGE_TYPE, 13.05.2010. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2599449C1 (en) * 2011-12-15 2016-10-10 Байонир Корпорейшн New oligonucleotides conjugates and use thereof
RU2577227C1 (en) * 2012-01-05 2016-03-10 Байонир Корпорейшн Highly effective double-stranded oligo-rna structure such nanoparticles and method of its manufacturing
RU2667960C2 (en) * 2012-04-18 2018-09-25 Ногра Фарма Лимитед Methods of treating diabetes and/or promoting survival of pancreatic islets after transplantation

Also Published As

Publication number Publication date
RU2007116168A (en) 2008-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2584609C2 (en) Oligoribonucleotides and methods of their application for treatment of acute renal failure
CA2880290C (en) Double-stranded oligonucleotide molecules targeting p53 and methods of use thereof
US7910566B2 (en) Prevention and treatment of acute renal failure and other kidney diseases by inhibition of p53 by siRNA
WO2007029249A2 (en) Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of cardiovascular diseases
RU2434942C2 (en) Oligiribonucleotides and methods of their application for treatment of acute renal failure and other diseases
EP2895608B1 (en) Double-stranded oligonucleotide molecules to p53 and methods of use thereof
CN101291948B (en) Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of alopecia, acute renal failure and other diseases
AU2012232948B2 (en) Oligoribonucleotides and Methods of Use Thereof for Treatment of Alopecia, Acute Renal Failure and Other Diseases