RU2429488C1 - Method for measuring thrombin activity - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine. ^ SUBSTANCE: method is based on a method of observing turbidimetric fibrin clot formation with optical transmission of an incubation medium recorded by ultraviolet radiation band 230 to 320 nm by means of UV-spectrophotometre as a fibrin-polymer detector. ^ EFFECT: invention enables higher accuracy and sensitivity of the method. ^ 4 ex, 4 dwg

Description

Изобретение относится к области медицинских исследований, фармацевтической промышленности и биотехнологии и конкретно касается определения активности тромбина с использованием оптических методов.The invention relates to the field of medical research, the pharmaceutical industry and biotechnology, and specifically relates to the determination of thrombin activity using optical methods.

Тромбин - это белок, относящийся к классу сериновых протеаз. Согласно Второму международному стандарту для тромбина, принятому Всемирной Организацией Здравоохранения, активность белка измеряется в IU (international units). Непосредственное определение активности тромбина не практикуется в лабораториях, более надежным представляется измерение относительно коммерчески доступного стандартного препарата [1].Thrombin is a protein belonging to the class of serine proteases. According to the Second International Standard for Thrombin, adopted by the World Health Organization, protein activity is measured in IU (international units). The direct determination of thrombin activity is not practiced in laboratories; it seems more reliable to measure a relatively commercially available standard preparation [1].

Биохимические методы определения активности тромбина можно разбить на две группы. Во-первых, применяются низкомолекулярные аналоги субстрата, которые расщепляются активным центром фермента с образованием окрашенного продукта. Примерами таких субстратов служат H-D-Phe-Pro-Arg-п-нитроанилид (FPR) [2], H-D-Phe-Pro-Phe-п-нитроанилид (FPF) [3]. Полученные данные характеризуют активность только каталитического центра тромбина, поэтому корректнее использовать методы второй группы.Biochemical methods for determining the activity of thrombin can be divided into two groups. Firstly, low molecular weight analogs of the substrate are used, which are cleaved by the active center of the enzyme to form a colored product. Examples of such substrates are H-D-Phe-Pro-Arg-p-nitroanilide (FPR) [2], H-D-Phe-Pro-Phe-p-nitroanilide (FPF) [3]. The data obtained characterize the activity of only the catalytic center of thrombin; therefore, it is more correct to use the methods of the second group.

Ко второй группе относятся методы, учитывающие эффективность как работы каталитической триады, так и связывания природных субстратов с распознающим участком протеазы. Активность тромбина можно вычислить исходя из кривых накопления продуктов расщепления PAR1, PAR4, протеина C или фибриногена [3-6]. Отщепляемые пептиды определяются хроматографическими методами. Однако специализированное оборудование ВЭЖХ обычно недоступно для повседневного использования в лаборатории, что вынуждает обратиться к определению модифицированных тромбином белков, а не отщепленных пептидов. В этой области разработаны методики для определения фибрина, продукта протеолиза фибриногена тромбином. Фибрин самопроизвольно и обратимо агрегирует с образованием фибриновых нитей. Несмотря на то, что для клинического применения разработаны методы измерения количества фибрин-мономера (на основе ELISA) [7], для лабораторных исследований степень превращения фибриногена удобнее оценивать оптикомеханическим и спектрофотометрическим методом по образованию фибриновых нитей.The second group includes methods that take into account the effectiveness of both the catalytic triad and the binding of natural substrates to the recognition site of the protease. Thrombin activity can be calculated from the accumulation curves of the cleavage products of PAR1, PAR4, protein C, or fibrinogen [3-6]. Detachable peptides are determined by chromatographic methods. However, specialized HPLC equipment is usually not available for everyday laboratory use, which leads to the determination of thrombin-modified proteins, rather than cleaved peptides. Techniques for determining fibrin, a product of fibrinogen proteolysis by thrombin, have been developed in this area. Fibrin spontaneously and reversibly aggregates with the formation of fibrin filaments. Despite the fact that methods for measuring the amount of fibrin monomer (based on ELISA) have been developed for clinical use [7], for laboratory studies, the degree of fibrinogen conversion is more conveniently evaluated using the optomechanical and spectrophotometric method for the formation of fibrin filaments.

Суть оптико-механического метода состоит в перемешивании реакционной смеси магнитной мешалкой, что приводит к наматыванию на нее фибриновых нитей, которые тормозят вращение мешалки вплоть до полной остановки. Время остановки мешалки фиксируется как время сворачивания. Несмотря на некоторую условность получаемой величины и отсутствие корреляции с кинетическими параметрами, стандартизация реагентов и условий реакции делает время сворачивания хорошо воспроизводимым параметром. Оптико-механический метод, в основном, находит применение в клинических лабораториях, что объясняется небольшим диапазоном определяемой активности тромбина (0,3-0,6 IU на 300 мкл пробы), значительной погрешностью результатов (до 50%) и потребностью в узкоспециализированном оборудовании - т.н. коагулометре [8, 9]. Результаты оптико-механического метода недостоверно отражают степень агрегации фибрина в случае некоторых мутаций, поэтому более предпочтительно использование спектрофотометрических методов исследования агрегированного фибрина [9].The essence of the optical-mechanical method consists in stirring the reaction mixture with a magnetic stirrer, which leads to winding fibrin threads onto it, which inhibit the rotation of the stirrer until it stops. The stopping time of the mixer is fixed as the folding time. Despite some conventions of the obtained value and the absence of correlation with kinetic parameters, the standardization of reagents and reaction conditions makes the folding time a well reproducible parameter. The optical-mechanical method is mainly used in clinical laboratories, which is explained by a small range of detectable thrombin activity (0.3-0.6 IU per 300 μl of sample), a significant error in the results (up to 50%) and the need for highly specialized equipment - the so-called coagulometer [8, 9]. The results of the optomechanical method do not accurately reflect the degree of fibrin aggregation in the case of certain mutations; therefore, the use of spectrophotometric methods for studying aggregated fibrin is more preferable [9].

В спектрофотометрических методах определения активности тромбина не используется перемешивание раствора во время реакции. На начальных этапах протеолиза раствор агрегирующегося фибрина ведет себя подобно коллоидному раствору, который с течением реакции переходит в гель, образованный трехмерным каркасом агрегированного фибрина и раствора низкомолекулярных соединений, удерживаемого им. Протекание реакции сопровождается помутнением и увеличением вязкости, соответственно для наблюдения можно использовать нефелометрию, турбидиметрию и вискозиметрию.In spectrophotometric methods for determining the activity of thrombin, stirring of the solution during the reaction is not used. At the initial stages of proteolysis, an aggregating fibrin solution behaves like a colloidal solution, which, during the course of the reaction, becomes a gel formed by a three-dimensional framework of aggregated fibrin and a solution of low molecular weight compounds retained by it. The reaction is accompanied by turbidity and an increase in viscosity; accordingly, nephelometry, turbidimetry, and viscometry can be used for observation.

Из RU 2007137972 A, 10.06.2009 известен способ измерения активности тромбина в цельной крови (в образце), а измерение выработки тромбина включает следующие стадии:From RU 2007137972 A, 06/10/2009 a method for measuring the activity of thrombin in whole blood (in a sample) is known, and the measurement of thrombin production includes the following steps:

- приведение слоя указанного образца в контакт с флюорогенным субстратом тромбина, при этом толщина указанного слоя составляет от 0.05 до 5 мм, а площадь поверхности составляет от 10 до 500 мм²;- bringing the layer of the specified sample into contact with the fluorogenic substrate of thrombin, while the thickness of the specified layer is from 0.05 to 5 mm, and the surface area is from 10 to 500 mm ² ;

- обеспечение для условий выработки тромбина в указанном образце;- providing for the conditions for the production of thrombin in the specified sample;

- измерение флюоресценции, испускаемой с поверхности указанного слоя флюоресцентной группой, которую высвобождает флюорогенный субстрат в результате ферментативного воздействия вырабатываемого тромбина на указанный флюорогенный субстрат.- measuring the fluorescence emitted from the surface of the specified layer by a fluorescent group, which is released by the fluorogenic substrate as a result of the enzymatic action of the generated thrombin on the specified fluorogenic substrate.

Концентрацию тромбина, выработанного в ходе анализа, определяют как функцию измеренной флюоресценции от высвобождаемой флюоресцентной группы. Указанный образец цельной крови разбавляют в пределах до 10 максимум раз. Толщина слоя указанного образца составляет примерно 2 мм или меньше. При проведении анализа указанный образец крови помещают в лунку планшета, которая содержит решетку с размером отверстий от 50 до 500 мкм.The concentration of thrombin generated during the analysis is determined as a function of the measured fluorescence from the released fluorescence group. The specified whole blood sample is diluted to a maximum of 10 times. The layer thickness of said sample is about 2 mm or less. During the analysis, the specified blood sample is placed in the well of the tablet, which contains a lattice with a hole size of from 50 to 500 microns.

В настоящее время в медицинской практике широко применяют оптический турбидиметрический метод (G.V.Born, V.J.Cross. The aggregation of platelet. // J Physiol, 1963, V.16, P.178-195), основанный на регистрации светопропускания суспензии тромбоцитов (обогащенная тромбоцитами плазма, получаемая путем центрифугирования крови). Мерой агрегационного процесса здесь является графически регистрируемое увеличение светопропускания плазмы, обусловленное уменьшением рассеяния света на тромбоцитах в результате их поглощения агрегатами, образующимися под воздействием индукторов агрегации.Currently, the optical turbidimetric method (GVBorn, VJCross. The aggregation of platelet. // J Physiol, 1963, V.16, P.178-195) is widely used in medical practice, based on the registration of light transmission of a platelet suspension (enriched with platelets plasma obtained by centrifugation of blood). A measure of the aggregation process here is a graphically recorded increase in plasma transmittance due to a decrease in light scattering on platelets as a result of their absorption by aggregates formed under the influence of aggregation inducers.

Турбидиметрия - метод количественного химического анализа, основанный на измерении интенсивности света, прошедшего через исследуемую дисперсную систему.Turbidimetry is a method of quantitative chemical analysis based on measuring the intensity of light transmitted through the dispersed system under study.

К настоящему моменту наиболее разработаны методики на основе турбидиметрии, являющейся ближайшим аналогом изобретения.To date, the most developed methods based on turbidimetry, which is the closest analogue of the invention.

Ближайшим аналогом изобретения является традиционный турбидиметрический способ определения фибриновых нитей, представленный в работе [10], фиг.1. В качестве источника фибриногена использовали пул бестромбоцитарной цитратной плазмы здоровых доноров. Для активации свертывания применяли бычий тромбин. Регистрацию светопоглощения инкубационной среды проводили с помощью фотоэлектрокалориметра МКМФ-02М со светофильтром 340 нм в кювете толщиной 1 см, термостатируемой при 37°C. Графическую регистрацию процесса осуществляли с использованием самописца ЛКД-4-003. Стандартная процедура исследования состояла в следующем. В кювету с толщиной оптического слоя 1 см вносили 1,79 мл 0,02 М вероналового буфера, содержащего 0,13 NaCl и 1 мМ CaCl₂; 0,1 мл плазмы крови и 0,1 мл рабочего раствора тромбина, быстро перемешивали и регистрировали динамику изменений светопоглощения во времени. Скрытый период, когда не происходит изменений мутности среды, оценивается временем Tlag. Эта величина характеризует время образования растворимого фибрин-полимера и двунитчатых протофибрилл. В этот период среда остается жидкой. Наиболее четкие и простые закономерности выявляются для Tlag: на фиг.1 представлено, как в исследованном нами диапазоне величина, обратная Tlag, линейно зависела от количества тромбина, добавленного в пробу, а полученная прямая проходит через начало координат (активность пропорциональна концентрации, определяется относительно стандартного препарата тромбина).The closest analogue of the invention is the traditional turbidimetric method for determining fibrin filaments, presented in [10], Fig.1. A healthy blood donor pool of platelet-free citrate plasma of healthy donors was used as a source of fibrinogen. Bovine thrombin was used to activate coagulation. The light absorption of the incubation medium was recorded using an MKMF-02M photoelectrocalorimeter with a 340 nm light filter in a 1 cm thick cuvette that was thermostatically controlled at 37 ° C. The process was graphically recorded using the LKD-4-003 recorder. The standard research procedure was as follows. 1.79 ml of 0.02 M veronal buffer containing 0.13 NaCl and 1 mm CaCl _{2 was} added to a cuvette with an optical layer thickness of 1 cm; 0.1 ml of blood plasma and 0.1 ml of a working solution of thrombin were quickly mixed and recorded the dynamics of changes in light absorption over time. The latent period when there is no change in the turbidity of the medium is estimated by the Tlag time. This value characterizes the time of formation of soluble fibrin polymer and double-stranded protofibrils. During this period, the medium remains liquid. The clearest and simplest patterns are revealed for Tlag: Fig. 1 shows how, in the range we studied, the inverse of Tlag linearly depended on the amount of thrombin added to the sample, and the resulting straight line passes through the origin (activity is proportional to concentration, determined relative to the standard thrombin preparation).

Несомненным достоинством таких методик является использование для детектирования спектрофотометров - приборов, компактных и доступных для лабораторного использования. Рассеяние света образцом агрегирующегося фибрина фиксируется спектрофотометром как поглощение излучения. Получаемая величина является сложной функцией формы, размера и концентрации частиц агрегированного фибрина, однако получаемые зависимости поглощения от времени реакции позволяют выделить несколько параметров с установленной зависимостью от концентрации фермента, фибриногена и температуры. Традиционно длину волны падающего излучения выбирают 330-660 нм, т.е. в области прозрачности неокрашенных белков. В качестве параметра, линейно зависящего от концентрации тромбина в диапазоне 0,03-0,3 IU/пробу (погрешность около 10%), выбирают т.н. «лаговое» время Tlag, т.е. время, в течение которого отсутствует поглощение образца [10].The undoubted advantage of such techniques is the use of spectrophotometers for detecting - devices that are compact and accessible for laboratory use. Light scattering by an aggregating fibrin sample is recorded by a spectrophotometer as radiation absorption. The obtained value is a complex function of the shape, size and concentration of particles of aggregated fibrin, however, the obtained dependences of the absorption on the reaction time allow us to distinguish several parameters with the established dependence on the concentration of the enzyme, fibrinogen and temperature. Traditionally, the wavelength of the incident radiation is chosen to be 330-660 nm, i.e. in the field of transparency of unpainted proteins. As a parameter that linearly depends on the concentration of thrombin in the range of 0.03-0.3 IU / sample (error of about 10%), the so-called "Lag" time Tlag, i.e. time during which there is no absorption of the sample [10].

Технической задачей заявленного изобретения является повышение точности и чувствительности метода, т.е. возможность определять тысячные доли IU активности тромбина, а также упрощение процесса.The technical task of the claimed invention is to increase the accuracy and sensitivity of the method, i.e. the ability to determine thousandths of the IU of thrombin activity, as well as simplifying the process.

Поставленная техническая задача достигается способом определения активности тромбина с использованием турбидиметрического метода, включающего наблюдение за образованием фибринового сгустка по гидролизу фибриногена и регистрацию светопропускания инкубационной среды с помощью ультрафиолетового диапазона излучения посредством УФ-спектрофотометра в качестве детектора фибрин-полимера.The stated technical problem is achieved by a method for determining the activity of thrombin using the turbidimetric method, which includes observing the formation of a fibrin clot by hydrolysis of fibrinogen and registering the light transmission of the incubation medium using the ultraviolet radiation range using a UV spectrophotometer as a fibrin-polymer detector.

Сущность изобретения состоит в использовании УФ-диапазона для турбидиметрических измерений. Огранические молекулы интенсивно поглощают УФ-излучение, однако уменьшение длины волны дает выигрыш в чувствительности турбидиметрического метода.The invention consists in the use of the UV range for turbidimetric measurements. Organic molecules intensively absorb UV radiation, however, a decrease in the wavelength gives a gain in the sensitivity of the turbidimetric method.

Предпочтительно при осуществлении способа по изобретению используют температуру 27°C. Все растворы подогреваются при рабочей температуре в течение 15 мин. Состав растворов предпочтительно следующий:Preferably, the temperature of 27 ° C. is used in the process of the invention. All solutions are heated at operating temperature for 15 minutes. The composition of the solutions is preferably as follows:

0,1±0,005% человеческий фибриноген;0.1 ± 0.005% human fibrinogen;

10-кратная буферная смесь (pH 7,4±0,1, 200±10 мМ Tris-ацетат, 1,4±0,05 М NaCl, 50±5 мМ KCl, 10±1 мМ MgCl₂, 10±1 мМ CaCl₂);10x buffer mixture (pH 7.4 ± 0.1, 200 ± 10 mm Tris-acetate, 1.4 ± 0.05 M NaCl, 50 ± 5 mm KCl, 10 ± 1 mm MgCl ₂ , 10 ± 1 mm CaCl ₂ );

тромбин человеческий (0,2-50 мкМ).human thrombin (0.2-50 μM).

Момент добавления раствора тромбина фиксируют секундомером и проводят измерения оптической плотности образца при рабочей длине волны 200-300 нм (в работе обычно использовалось излучение 230 нм). Измерения прекращают при достижении плато кривой оптической плотности - приблизительно через 40-100 секунд после добавления раствора тромбина (в зависимости от качества белков и удельной активности тромбина). Качество белка - удельная активность для ферментов (тромбин), способность выполнять свою специфическую функцию для фибриногена, гирудина. Качество белка зависит от технологии получения белка, условий хранения, срока хранения, количества циклов замораживание/размораживание и т.п.The moment of adding a thrombin solution is fixed with a stopwatch and the optical density of the sample is measured at a working wavelength of 200-300 nm (radiation of 230 nm was usually used in the work). Measurements are stopped when the optical density curve reaches a plateau - approximately 40-100 seconds after the addition of a thrombin solution (depending on the quality of the proteins and the specific activity of thrombin). Protein quality - specific activity for enzymes (thrombin), the ability to perform its specific function for fibrinogen, hirudin. The quality of the protein depends on the technology of protein production, storage conditions, shelf life, the number of freeze / thaw cycles, etc.

В качестве параметра полученной кривой оптической плотности, пропорционального активности тромбина, можно использовать тангенс угла наклона касательной в точке перегиба кривой. Этот параметр можно интерпретировать как максимальную скорость накопления фибрин-полимера W_max. Использование препаратов тромбина со стандартизованной активностью позволяет получить калибровочную кривую, линейную для сравнительно широкого диапазона активности протеазы.As a parameter of the obtained optical density curve proportional to the activity of thrombin, one can use the tangent of the angle of inclination of the tangent at the inflection point of the curve. This parameter can be interpreted as the maximum accumulation rate of the fibrin polymer W _max . The use of thrombin preparations with standardized activity allows one to obtain a calibration curve linear for a relatively wide range of protease activity.

Способ иллюстрируется следующими примерами.The method is illustrated by the following examples.

Пример 1. Определение оптимальной рабочей длины волны (фиг.2)Example 1. Determination of the optimal operating wavelength (figure 2)

Данные на фиг.2 согласуются с тем фактом, что рассеяние света увеличивается с уменьшением длины волны излучения. При экспериментальном определении длины волны использовался раствор в составе фибриногена 2,15 (мкМ) и тромбина 7,15 (нМ). Наибольший отклик и наименьшие погрешности точек наблюдались при 230 нм, поэтому именно эта длина волны использовалась в последующих экспериментах. В то же время белки поглощают в данной области спектра, это ограничение удалось обойти путем измерения поглощения рабочего раствора относительно такого же раствора фибриногена, но без добавления тромбина (фибриноген всегда присутствовал в 10³-10⁴-кратном избытке по массе).The data in FIG. 2 is consistent with the fact that light scattering increases with decreasing radiation wavelength. In the experimental determination of the wavelength, a solution of 2.15 fibrinogen (μM) and 7.15 thrombin (nM) was used. The greatest response and the smallest point errors were observed at 230 nm; therefore, this wavelength was used in subsequent experiments. At the same time, proteins absorb in this region of the spectrum, this limitation was circumvented by measuring the absorption of the working solution relative to the same fibrinogen solution, but without the addition of thrombin (fibrinogen was always present in 10 ³ -10 ^4- fold excess by weight).

Пример 2. Построение калибровочной кривойExample 2. The construction of the calibration curve

В качестве стандарта активности протеазы использован тромбин человека с активностью 110 IU/ампула (NIBSC, Великобритания). В качестве параметра кривой, пропорционального активности тромбина, можно выбрать тангенс угла наклона участка кривой. Тангенс угла α далее обозначается как W_max (м.о.е./с, мили оптических единиц в секунду), отображая соответствие этого параметра максимальной скорости изменения поглощения образца во времени.Human thrombin with activity of 110 IU / ampoule (NIBSC, UK) was used as a standard for protease activity. As a parameter of the curve proportional to the activity of thrombin, one can choose the slope of the curve. The tangent of the angle α is hereinafter referred to as W _max (m.u./s, miles of optical units per second), reflecting the correspondence of this parameter to the maximum rate of change in the absorption of the sample over time.

На фиг.3 представлена калибровочная кривая ферментативной активности тромбина. Т.о. продемонстрирована линейная корреляция между активностью препарата тромбина в пробе и параметром Wmax. Полученная калибровочная кривая аппроксимирована уравнением Wmax=524*A+0.5, где A - активность тромбина, IU.Figure 3 presents a calibration curve of the enzymatic activity of thrombin. T.O. a linear correlation between the activity of the thrombin preparation in the sample and the Wmax parameter was demonstrated. The obtained calibration curve is approximated by the equation Wmax = 524 * A + 0.5, where A is the thrombin activity, IU.

Вышеприведенное уравнение калибровочной кривой получено в программе Excel (Microsoft Office) путем линейной аппроксимации зависимости Wmax от количества единиц активности тромбина, внесенных в реакционную смесь, у соответствует Wmax (м.о.е./с), x - активности тромбина (IU), R² - величина достоверности аппроксимации.The above equation of the calibration curve was obtained in Excel (Microsoft Office) by linearly approximating the dependence of Wmax on the number of units of thrombin activity introduced into the reaction mixture, y corresponds to Wmax (m.u./s), x - thrombin activity (IU), R ² - the value of the reliability of the approximation.

Пример 3. Определение активности неизвестного препарата тромбинаExample 3. Determination of the activity of an unknown drug thrombin

Определение активности неизвестного препарата тромбинаDetermination of the activity of an unknown thrombin preparation

В микрощелевую УФ-проницаемую кювету для спектрофотометра помещают предварительно прогретые 15 минут при 27°C растворы:In a micro-slot UV-permeable cuvette for a spectrophotometer, pre-warmed 15 minutes at 27 ° C are placed solutions:

0,1±0,005% человеческий фибриноген (50 мкл);0.1 ± 0.005% human fibrinogen (50 μl);

10-кратная буферная смесь (pH 7,4±0,1, 200±10 мМ Tris-ацетат, 1,4±0,05 М NaCl, 50±5 мМ KCl, 10±1 мМ MgCl₂, 10±1 мМ CaCl₂) (7 мкл);10x buffer mixture (pH 7.4 ± 0.1, 200 ± 10 mm Tris-acetate, 1.4 ± 0.05 M NaCl, 50 ± 5 mm KCl, 10 ± 1 mm MgCl ₂ , 10 ± 1 mm CaCl ₂ ) (7 μl);

Вода (бидистиллят) (до общего объема реакционной смеси 70 мкл);Water (double distillate) (up to a total volume of the reaction mixture of 70 μl);

тромбин человеческий (0,01-50 мкМ) (от 1 до 13 мкл).human thrombin (0.01-50 μM) (1 to 13 μl).

Момент добавления тромбина фиксируют секундомером и проводят измерения оптической плотности образца при рабочей длине волны (230 нм).The moment of thrombin addition is fixed with a stopwatch and the optical density of the sample is measured at a working wavelength (230 nm).

Измерения прекращают при достижении плато кривой оптической плотности - приблизительно 40-100 сек.Measurements are stopped when the optical density curve reaches a plateau - approximately 40-100 sec.

Далее добавляют количество препарата тромбина с неизвестной активностью так, чтобы получаемое значение W_max находилось в пределах градуировочной кривой, построенной в примере 2. Для достоверности опыт повторяем, экспериментально подбирая количество препарата тромбина так, чтобы W_max получался в пределах диапазона значений калибровочной кривой (см. фиг.3). Активность внесенного тромбина вычисляем исходя из уравнения калибровочной кривой, в данном случае A=(W_max-0.5)/524, IU. Результат можно выразить как объемную активность a_Thr=A/V (IU/мкл), где V - объем внесенного препарата (в микролитрах).Next, add the amount of thrombin preparation with unknown activity so that the obtained value of W _max is within the calibration curve constructed in Example 2. For reliability, we repeat the experiment by experimentally selecting the amount of thrombin preparation so that W _{max is} obtained within the range of the calibration curve (see Fig. 3). The activity of the introduced thrombin is calculated based on the equation of the calibration curve, in this case A = (W _max -0.5) / 524, IU. The result can be expressed as volumetric activity a _Thr = A / V (IU / μl), where V is the volume of the introduced drug (in microliters).

Например, в кювету спектрофотометра внесли 2 мкл препарата тромбина с неизвестной активностью, W_max составил 8 м.о.е./с. Тогда активность внесенного количества тромбина составила:For example, 2 μl of a thrombin preparation with unknown activity was added to a spectrophotometer cuvette, W _max was 8 m.u./s. Then the activity of the introduced amount of thrombin was:

A=(8-0.5)/524=0,014 IU, а объемная активность α_Thr=0,014/2-0,007 IU/мкл.A = (8-0.5) / 524 = 0.014 IU, and volumetric activity α _Thr = 0.014 / 2-0.007 IU / μl.

Пример 4. Определение активности ингибиторов тромбина на примере гирудина.Example 4. Determination of the activity of thrombin inhibitors by the example of hirudin.

Гирудин - специфический ингибитор тромбина является полипептидом (65 аминокислот). В микрощелевую УФ-проницаемую кювету для спектрофотометра помещают предварительно прогретые 15 минут при 27°C растворы:Hirudin, a specific thrombin inhibitor, is a polypeptide (65 amino acids). In a micro-slot UV-permeable cuvette for a spectrophotometer, pre-warmed 15 minutes at 27 ° C are placed solutions:

0,1±0,005% человеческий фибриноген (50 мкл);0.1 ± 0.005% human fibrinogen (50 μl);

10-кратная буферная смесь (pH 7,4±0,1, 200±10 мМ Tris-ацетат, 1,4±0,05 М NaCl, 50±5 мМ KCl, 10±1 мМ MgCl₂, 10±1 мМ CaCl₂) (7 мкл);10x buffer mixture (pH 7.4 ± 0.1, 200 ± 10 mm Tris-acetate, 1.4 ± 0.05 M NaCl, 50 ± 5 mm KCl, 10 ± 1 mm MgCl ₂ , 10 ± 1 mm CaCl ₂ ) (7 μl);

Гирудин (100±10нМ) (1-5 мкл);Hirudin (100 ± 10nM) (1-5 μl);

Вода (бидистиллят) (до общего объема реакционной смеси 70 мкл);Water (double distillate) (up to a total volume of the reaction mixture of 70 μl);

Тромбин человеческий (0,1 мкМ) (от 1 до 8 мкл).Human thrombin (0.1 μM) (1 to 8 μl).

Каждый раз вносим известное количество единиц активности тромбина, а объем препарата гирудина с каждым опытом повышаем вплоть до достижения минимальной величины W_max градуированной кривой примера 2.Each time we introduce a known number of units of thrombin activity, and increase the volume of the hirudin preparation with each experiment until the minimum value W _{max of the} graded curve of Example 2 is reached.

Момент добавления тромбина фиксируют секундомером и проводят измерение оптической плотности образца при рабочей длине волны (230 нм).The moment of thrombin addition is fixed with a stopwatch and the optical density of the sample is measured at a working wavelength (230 nm).

Измерения прекращают при достижении плато кривой оптической плотности - приблизительно 40-300 сек.Measurements are stopped when the optical density curve reaches a plateau - approximately 40-300 sec.

На фиг.4 приведена зависимость параметра W_max от количества добавленного гирудина. Экстраполируя зависимость к W_max=0, получаем количество гирудина, обладающего активностью, равной активности внесенного тромбина, которую он полностью ингибирует (т.е. 10 mIU в данном случае). Результат можно представить в виде α_Hir=A/m (IU/пмоль), где m - количество вещества гирудина (пмоль). A_hir=0.01/0.2=0.05 (IU/пмоль).Figure 4 shows the dependence of the parameter W _max on the amount of added hirudin. By extrapolating the dependence on W _max = 0, we obtain the amount of hirudin with an activity equal to the activity of the introduced thrombin, which it completely inhibits (i.e., 10 mIU in this case). The result can be represented as α _Hir = A / m (IU / pmol), where m is the amount of hirudin substance (pmol). A _hir = 0.01 / 0.2 = 0.05 (IU / pmol).

Измерения оптической плотности прекращают при достижении плато кривой оптической плотности. В приведенных экспериментах за плато принимали изменение оптической плотности при 230 нм менее чем 1 м.о.е. в секунду.Optical density measurements are stopped when the optical density curve reaches a plateau. In the above experiments, the change in optical density at 230 nm was less than 1 m.u. per second.

Состав буферного раствора и количество фибриногена можно варьировать в широком диапазоне концентраций. В описании приведен лишь оптимальный вариант соотношения реагентов. Изменение соотношения реагентов влияет на чувствительность метода.The composition of the buffer solution and the amount of fibrinogen can vary over a wide range of concentrations. The description provides only the best option for the ratio of reagents. Changing the ratio of reagents affects the sensitivity of the method.

Таким образом, использование УФ-диапазона позволило на порядок увеличить чувствительность метода, т.е. определять тысячные доли IU активности тромбина. Воспроизводимость результатов, низкие затраты реактивов и простота технического оснащения делают способ удобным для лабораторного определения активности препаратов тромбина, степени его ингибирования, автолиза и прочих процессов, сопровождающихся изменением активности протеазы.Thus, the use of the UV range made it possible to increase the sensitivity of the method by an order of magnitude, i.e. determine thousandths of IU thrombin activity. The reproducibility of the results, the low cost of reagents and the simplicity of technical equipment make the method convenient for laboratory determination of the activity of thrombin preparations, the degree of its inhibition, autolysis and other processes accompanied by a change in protease activity.

ЛитератураLiterature

1. Whitton, С., Sands, D., Lee, Т., Chang, A. and Longstaff, C. (2005). Thromb Haemost., 93, 261-266.1. Whitton, S., Sands, D., Lee, T., Chang, A. and Longstaff, C. (2005). Thromb Haemost., 93, 261-266.

2. Papaconstantinou, M.E., Bah, A. and Di Cera, E. (2008). Cell. Mol Life Sci., 65, 1943-1947.2. Papaconstantinou, M.E., Bah, A. and Di Cera, E. (2008). Cell. Mol Life Sci., 65, 1943-1947.

3. Bush, LA., Nelson, R.W. and Di Cera, E. (2006). J. Biol. Chem., 281, 7183-7188.3. Bush, LA., Nelson, R.W. and Di Cera, E. (2006). J. Biol. Chem., 281, 7183-7188.

4. Nieman, M.T. and Schmaier, A.H. (2007). Biochemistry, 46, 8603-8610.4. Nieman, M.T. and Schmaier, A.H. (2007). Biochemistry, 46, 8603-8610.

5. Mullin, J.L., Gorkun, O.V., Binnie, C.G. and Lord, S.T. (2000). J. Biol. Chem., 275, 25239-25246.5. Mullin, J.L., Gorkun, O.V., Binnie, C.G. and Lord, S.T. (2000). J. Biol. Chem., 275, 25239-25246.

6. Pineda, A.O., Cantwell, A.M., Bush, L.A., Rose, Т. and Di Cera, E. (2002). J. Biol. Chem., 277, 32015-32019.6. Pineda, A.O., Cantwell, A.M., Bush, L.A., Rose, T. and Di Cera, E. (2002). J. Biol. Chem., 277, 32015-32019.

7. Schutgens, R.E., Haas, F.J., Agterof, M.J., Vos, M. and Biesma, D.H. (2007). Thromb Haemost., 97, 807-813.7. Schutgens, R.E., Haas, F.J., Agterof, M.J., Vos, M. and Biesma, D.H. (2007). Thromb Haemost., 97, 807-813.

8. Спиридонова В.А., Рог Е.В., Баранов Ю.В., Дугина Т.Н., Струкова С.М., Копылов А.М. (2003). Биоорг. Хим., 29, 1-4.8. Spiridonova V.A., Rog E.V., Baranov Yu.V., Dugina T.N., Strukova S.M., Kopylov A.M. (2003). Bioorg. Chem., 29, 1-4.

9. Lefkowitz, J.B., DeBoom, Т., Weller, A., Clarke, S. and Lavrinets, D. (2000). Am J Hematol., 63, 149-155.9. Lefkowitz, J.B., DeBoom, T., Weller, A., Clarke, S. and Lavrinets, D. (2000). Am J Hematol., 63, 149-155.

10. Щербак И.Г, Субботина Т.Ф., Фаенкова В.П., Рюмина Е.В. (2001). Вопр. мед. хим., 47, 80-89.10. Shcherbak I.G., Subbotina T.F., Faenkova V.P., Ryumin E.V. (2001). Q. honey. Chem., 47, 80-89.

Claims (1)

Способ определения активности тромбина, характеризующийся тем, что используют турбидиметрический метод, включающий наблюдение за образованием фибринового сгустка и регистрацию светопропускания инкубационной среды с помощью ультрафиолетового диапазона излучения от 230 до 320 нм посредством УФ-спектрофотометра в качестве детектора фибрин-полимера. A method for determining the activity of thrombin, characterized in that the turbidimetric method is used, including monitoring the formation of a fibrin clot and detecting the light transmission of the incubation medium using the ultraviolet radiation range from 230 to 320 nm by means of a UV spectrophotometer as a detector for a fibrin polymer.

Images