RU2425840C1 - ANTIBODY SPECIFICALLY REACTING WITH HER2/neu ONCOPROTEIN - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine. ^ SUBSTANCE: antibody under the invention is produced from Nicotiana benthamiana leaves by transient transfection of expression vectors. It represents immunoglobulin G and a tetramer consisting of two light and two heavy peptide chains and them larger supramolecular assemblies. The antibody is recovered both in the glycated, and in non-glycated form. The antibody is capable to bind selectively HER2/neu protein, to inhibit cancer cell proliferation. Using the antibody under the invention enables diagnosing HER2-positive breast cancer. ^ EFFECT: invention can be used for preparing drugs and diagnostic agent for breast cancer. ^ 8 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для создания лекарства и диагностического средства для HER2/neu-позитивных клеток рака молочной железы.The invention relates to biotechnology, genetic engineering and medicine and can be used to create drugs and diagnostic tools for HER2 / neu-positive breast cancer cells.

В последнее время особый интерес у исследователей вызывает разработка техники создания специфических антител к онкобелку HER2 (от Human Epidermal growth factor Receptor 2). Дело в том, что примерно у 30% больных раком молочной железы наблюдается наиболее опасная и устойчивая к терапевтическому воздействию форма, так называемая НЕР2-позитивная форма рака, приводящая к ускоренному метастазированию.Recently, researchers have been particularly interested in developing the technique for creating specific antibodies to the HER2 cancer protein (from Human Epidermal growth factor Receptor 2). The fact is that about 30% of patients with breast cancer have the most dangerous and resistant to therapeutic effects form, the so-called HEP2-positive form of cancer, leading to accelerated metastasis.

На фармацевтическом рынке имеется препарат герпептин (трастузумаб) (Hudziak et al., 1989 Mol Cel Biol 9, 1165-1175; Harries and Smith, 2002 Endocrine-Related Cancer 9 75-85) на основе моноклональных антител, представляющих собой имунноглобулин класса IgG и являющихся тетрамерами, состоящими из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей. Эти антитела специфически взаимодействуют с онкобелком HER2/neu и ингибируют пролиферацию раковых клеток SK-BR-3.Herpeptin (trastuzumab) is available on the pharmaceutical market (Hudziak et al., 1989 Mol Cel Biol 9, 1165-1175; Harries and Smith, 2002 Endocrine-Related Cancer 9 75-85) based on monoclonal antibodies that are IgG immunoglobulin and being tetramers consisting of two light and two heavy polypeptide chains. These antibodies specifically interact with the HER2 / neu oncoprotein and inhibit the proliferation of SK-BR-3 cancer cells.

Упомянутые антитела производятся в культуре животных клеток-клеток опухоли яичника китайского хомячка. Технология получения этих антител сложна, стоимость их очень высока, и, кроме того, велика опасность контаминации белками животного происхождения и патогенными вирусами.Mentioned antibodies are produced in an animal culture of Chinese Hamster Ovary tumor cell cells. The technology for producing these antibodies is complex, their cost is very high, and, in addition, there is a great danger of contamination with animal proteins and pathogenic viruses.

Задача изобретения - создание антитела указанного строения на основе растительного сырья, способного специфически взаимодействовать с онкобелком HER2/neu, ингибировать пролиферацию раковых клеток SK-BR-3 и пригодного для диагностики HER2-позитивного рака молочной железы. Решение этой задачи позволит значительно упростить технологию получения этого антитела и снизить его стоимость.The objective of the invention is the creation of antibodies of this structure on the basis of plant materials capable of specifically interacting with the HER2 / neu oncoprotein, inhibiting the proliferation of SK-BR-3 cancer cells and suitable for the diagnosis of HER2-positive breast cancer. The solution to this problem will significantly simplify the technology for producing this antibody and reduce its cost.

Поставленная задача решается тем, что антитело получают из листьев растения Nicotiana benthamiana путем транзиторной трансфекции экспрессионными векторами, причем это антитело выделяют как в гликозилированной, так и в негликозилированой форме.The problem is solved in that the antibody is obtained from the leaves of the Nicotiana benthamiana plant by transient transfection with expression vectors, and this antibody is isolated in both glycosylated and non-glycosylated forms.

Способ продукции антитела, специфически связывающего онкобелок HER2/neu, включает в себя введение в листья N. benthamiana векторов, обеспечивающих синтез тяжелой, легкой цепи антитела, культивирование растения в условиях, обеспечивающих совместную экспрессию в клетке указанных векторов, и последующее выделение и очистку антитела.A method of producing an antibody specifically binding the HER2 / neu oncoprotein comprises introducing vectors into the leaves of N. benthamiana that provide synthesis of the antibody heavy, light chain, cultivating the plant under conditions that co-express these vectors in the cell, and then isolating and purifying the antibody.

Тестирование антитела из растительного материала к онкогену HER2/neu проводят с помощью антител, специфических к легкой и тяжелой цепям антитела человека. Очистку антител осуществляют на оборудовании "AKTApurifier" (GE Healthcare), а последующий капиллярный электрофорез позволяет выявить как гликозилированные, так и негликозилированные формы белка.Testing antibodies from plant material to the HER2 / neu oncogen is performed using antibodies specific for the light and heavy chains of a human antibody. Antibodies are purified using AKTApurifier equipment (GE Healthcare), and subsequent capillary electrophoresis can detect both glycosylated and non-glycosylated forms of the protein.

Краткое описание чертежей, иллюстрирующих предлагаемое изобретение:A brief description of the drawings illustrating the invention:

Фиг.1. Накопление антитела, полученного из листьев N. benthamiana.Figure 1. The accumulation of antibodies obtained from leaves of N. benthamiana.

Фиг.2. Очистка антитела, полученного из листьев N. benthamiana.Figure 2. Purification of the antibody obtained from leaves of N. benthamiana.

Фиг.3. Тестирование антитела, полученного из листьев N. benthamiana. Тест проводили с помощью коммерческих антител, специфических к легкой и тяжелой цепи антитела человека.Figure 3. Testing antibodies derived from N. benthamiana leaves. The test was performed using commercial antibodies specific for the light and heavy chains of human antibodies.

Фиг.4. Очистка на оборудовании "AKTApurifier" (GE Healthcare) антитела, полученного из листьев N. benthamiana.Figure 4. Purification on equipment "AKTApurifier" (GE Healthcare) antibodies obtained from leaves of N. benthamiana.

Дорожки 1-10, очистка на колонке HiTrap Protein A HP; 11, очистка на мембране "Sartobind Q nano"; 12, элюция с Sartobind 1M NaCl.Lanes 1-10, HiTrap Protein A HP column cleaning; 11, cleaning on a Sartobind Q nano membrane; 12, elution with Sartobind 1M NaCl.

Фиг.5. Анализ при помощи капиллярного электрофореза в восстанавливающих условиях (в присутствии P-меркаптоэтанола) антитела, полученного из листьев N. benthamiana.Figure 5. Analysis by capillary electrophoresis under reducing conditions (in the presence of P-mercaptoethanol) of an antibody obtained from leaves of N. benthamiana.

Фиг.6. Цитологический анализ клеток SK-BR-3, содержащих на своей поверхности.6. Cytological analysis of SK-BR-3 cells containing on its surface.

Фиг.7. Иммуногистохимическое окрашивание образцов ткани пациента с Her2/neu-позитивным раком молочной железы. A - антитела "Dako" (A0485), B - антитело, выделенное из листьев N. benthamiana.7. Immunohistochemical staining of patient tissue samples with Her2 / neu-positive breast cancer. A - antibodies "Dako" (A0485), B - an antibody isolated from leaves of N. benthamiana.

Фиг.8. Сравнение антипролиферативного действия Герцептина и антитела, выделенного из листьев N. benthamiana (фитогерпептин) в концентрациях 1-0,01 мг/мл. Митогенный метод по Crystal Violet.Fig. 8. Comparison of the antiproliferative effect of Herceptin and an antibody isolated from leaves of N. benthamiana (phytoherceptin) at concentrations of 1-0.01 mg / ml. Mitogenic method according to Crystal Violet.

Следующие примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.The following examples illustrate the invention.

Пример 1. Продуцирование, выделение и очистка антитела из листьев N. benthamiana.Example 1. The production, isolation and purification of antibodies from leaves of N. benthamiana.

Отдельные гены легкой и тяжелой цепи антитела против онкогена HER2/neu были клонированы в субклон pFF19, содержащий 35S-промотор по сайтам NcoI и XhoI. На следующем этапе гены по отдельности клонировали в вектор Bin19 (Bevan, 1984. Nucleic Acids Res. 12, 8711-8721) по сайтам HindIII-EcoRI с получением векторов. Agrobacterium tumefaciens с бинарными векторами, экспрессирующими тяжелую или легкую цепь антитела против онкогена HER2/neu, засевали в жидкую среду 2-YT и выращивали ночь при температуре 28°C. Ночную культуру осаждали центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 3 мин. Затем осадок ресуспендировали в буфере для агроинфильтрации, содержащем 10 мМ MgCl₂ и 10 мм MES pH 5,0, и вводили в лист в соответствующем разведении. Фиг.1 показывает накопление легкой цепи (L-цепь) антитела против онкогена Her2/neu в листьях N. benthamiana через 3 дня после агроинъекции бинарными векторами. Показаны результаты ЭФ в неденатурирующих условиях в 8% полиакриламидном геле. Дорожки 1-6, собранное антитело; 7 - неинфипированный материал; S, контрольные антитела человека (hIgG) -1 мкг. M - маркеры.Separate light and heavy chain genes of the anti-HER2 / neu oncogene antibody were cloned into the pFF19 subclone containing the 35S promoter at the NcoI and XhoI sites. In the next step, the genes were individually cloned into a Bin19 vector (Bevan, 1984. Nucleic Acids Res. 12, 8711-8721) at HindIII-EcoRI sites to generate vectors. Agrobacterium tumefaciens with binary vectors expressing the heavy or light chain of the anti-HER2 / neu oncogen antibody was seeded in 2-YT liquid medium and grown overnight at 28 ° C. Night culture was besieged by centrifugation at 5 thousand rpm for 3 minutes Then, the precipitate was resuspended in agroinfiltration buffer containing 10 mM MgCl ₂ and 10 mm MES pH 5.0, and introduced into the sheet in an appropriate dilution. Figure 1 shows the accumulation of light chain (L-chain) antibodies against the Her2 / neu oncogen in leaves of N. benthamiana 3 days after agroinjection with binary vectors. EF results are shown under non-denaturing conditions in an 8% polyacrylamide gel. Lanes 1-6, assembled antibody; 7 - non-infected material; S, human control antibodies (hIgG) -1 mcg. M - markers.

При одновременной коинъекции векторов в листья N. benthamiana накапливаются легкая и тяжелая цепи антитела, которые можно выделить и очистить аффинной хроматографией на колонке с протеин G-сефарозой. Оценку чистоты препаратов антител мы проводили ЭФ в полиакриламидном геле в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях, т.е. в условиях соответственно отсутствия и при добавлении к образцам восстанавливающих агентов. На Фиг.2 показаны результаты ЭФ в полиакриламидном геле в невосстанавливающих (А) и восстанавливающих (Б) условиях; гель окрашен Кумасси синим. Дорожки 1-7, белковые фракции после очистки на колонке с протеин-A-сефарозой; дорожка 8 -промывочная фракция. M - маркеры, S, контрольные антитела человека (hIgG) - 1 мкг. Об интактности белка свидетельствуют также данные по тестированию в вестерн-блоте моноклональных антител из растительного материала с помощью известных антител, в свою очередь, специфичных к легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина G человека. На Фиг.3 показано тестирование антитела из N. benthamiana с помощью антител, специфических к легкой и тяжелой цепям антитела человека. В данном случае показаны результаты ЭФ в полиакриламидном геле в невосстанавливающих (A, B) и восстанавливающих (C, D) условиях. Вестерн-блоты тестировали антителами к гамма (тяжелой)-цепи (A, C) и каппа (легкой)-цепи (B, D). Дорожки 1,2 - фракции после очистки на колонке с протеин-A-сефарозой. M - маркеры. S, контрольные антитела человека (hIgG) - 1 мкг. На конечной стадии очистки проводили хроматографию белка на оборудовании "AKTApurifier" (фирмы GE Healthcare) при использовании колонок HiTrap Protein A HP (объем 1 мл) (Фиг.4, дорожки 1-10). Таким образом, удалось очистить до высокого уровня чистоты 6 мг моноклональных антител из 50 г N. benthamiana.With the simultaneous co-injection of vectors into the leaves of N. benthamiana, light and heavy chains of antibodies accumulate, which can be isolated and purified by affinity chromatography on a protein G-sepharose column. We evaluated the purity of antibody preparations by EF in a polyacrylamide gel under non-reducing and reducing conditions, i.e. under conditions of corresponding absence and when reducing agents are added to the samples. Figure 2 shows the results of EF in a polyacrylamide gel in non-reducing (A) and reducing (B) conditions; the gel is colored Coomassie blue. Lanes 1-7, protein fractions after purification on a protein-A-Sepharose column; lane 8 - wash fraction. M - markers, S, human control antibodies (hIgG) - 1 μg. The intactness of the protein is also evidenced by data on testing in a Western blot of monoclonal antibodies from plant material using known antibodies, in turn, specific for the light and heavy chains of human immunoglobulin G. Figure 3 shows the testing of antibodies from N. benthamiana using antibodies specific for the light and heavy chains of human antibodies. In this case, the results of EF in a polyacrylamide gel are shown under non-reducing (A, B) and reducing (C, D) conditions. Western blots were tested with antibodies to the gamma (heavy) chain (A, C) and kappa (light) chain (B, D). Lanes 1.2 - fractions after purification on a protein-A-Sepharose column. M - markers. S, human control antibodies (hIgG) - 1 μg. At the final purification step, protein chromatography was performed on AKTApurifier equipment (GE Healthcare) using HiTrap Protein A HP columns (1 ml volume) (Figure 4, lanes 1-10). Thus, 6 mg of monoclonal antibodies from 50 g of N. benthamiana were purified to a high purity level.

Эти результаты в сочетании с результатами, представленными на Фиг.4 и 5, показывают, во-первых, высокий уровень чистоты, и, во-вторых, присутствие как гликозилированных, так и негликозилированных форм белка.These results, combined with the results presented in Figures 4 and 5, show, firstly, a high level of purity, and, secondly, the presence of both glycosylated and non-glycosylated forms of the protein.

Пример 2. Взаимодействие антитела из N. benthamiana с раковыми клетками SK-BR-3.Example 2. The interaction of antibodies from N. benthamiana with cancer cells SK-BR-3.

Для доказательства активности полученного в листьях N. benthamiana антитела использовали иммуноцитохимический (ИЦХ) тест, описанный в работе Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Надгорная В.А., Крячок И.А. Диагностическая иммунопитохимия опухолей. Киев, Морион; 2003, с.28-31. Использовали полученное антитело в ИЦХ раковых клеток SKBR-3, имеющих на своей поверхности онкоген HER2/Neu. Из Фиг.6 видно, что антитело обладает способностью связывать внеклеточный домен онкогена HER2/Neu. Таким образом, антитело, полученное в N. benthamiana, является полностью функциональным и способно специфически узнавать и связываться с онкогеном HER2/Neu.To prove the activity of the antibody obtained in the leaves of N. benthamiana, we used the immunocytochemical (ICC) test described in the work by Gluzman D.F., Sklyarenko L.M., Nadgornaya V.A., Kryachok I.A. Diagnostic immunopitochemistry of tumors. Kiev, Morion; 2003, p. 28-31. The obtained antibody was used in the ICC of SKBR-3 cancer cells having the HER2 / Neu oncogen on their surface. Figure 6 shows that the antibody has the ability to bind the extracellular domain of the HER2 / Neu oncogen. Thus, the antibody obtained in N. benthamiana is fully functional and is able to specifically recognize and bind to the HER2 / Neu oncogen.

Пример 3. Сравнение способности коммерческих антител и антител, выделенных из N. benthamiana выявлять раковые клетки в гистологических препаратах пациентов.Example 3. Comparison of the ability of commercial antibodies and antibodies isolated from N. benthamiana to detect cancer cells in histological preparations of patients.

Иммуногистохимический анализ проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, предназначенных для стандартного морфологического исследования. В качестве первичных антител использовали поликлональные антитела против HER2/neu рецептора A0485 [Dako].Immunohistochemical analysis was performed on sections from paraffin blocks of tumors intended for standard morphological studies. Polyclonal antibodies against the HER2 / neu receptor A0485 [Dako] were used as primary antibodies.

Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. Для "демаскировки" антигенов проводили прогревание срезов на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99°C нитратном буфере в течение 30 минут. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 минут и переносили в фосфатный буфер на 5 минут. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 20 минут в темноте с 3% перекисью водорода, приготовленной на дистиллированной воде, а затем промывали 5 минут в фосфатном буфере. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 минут с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными антителами проводили при 4°C в течение 16 часов. После первичных антител стекла промывали в фосфатном буфере. Инкубацию с проявочной тест-системой ENVISION+rabbit kit, DAKO проводили при комнатной температуре в течение 25 минут, и затем срезы промывали. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали DAB+систему DAKO. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам.Paraffin sections were dewaxed and rehydrated according to standard procedures. To "unmask" the antigens, sections were heated in a water bath in a nitrate buffer preheated to 95-99 ° C for 30 minutes. Then the glass was cooled at room temperature for 15-20 minutes and transferred to phosphate buffer for 5 minutes. To block endogenous peroxidase, sections were incubated for 20 minutes in the dark with 3% hydrogen peroxide prepared in distilled water, and then washed for 5 minutes in phosphate buffer. To block non-specific antibody binding, sections were incubated for 15 minutes with 1% bovine serum albumin solution. Primary antibody incubation was performed at 4 ° C for 16 hours. After primary antibodies, the glasses were washed in phosphate buffer. Incubation with the ENVISION + rabbit kit, DAKO developmental test system, was performed at room temperature for 25 minutes, and then the sections were washed. To visualize the immunohistochemical reaction, the DAB + DAKO system was used. Slices were stained with Mayer hematoxylin and enclosed in Canadian balsam.

Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением ×10, ×20, ×40. Для всех маркеров оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. Для оценки экспрессии HER2 использовали критерии: 0 - отсутствие окрашивания; 1+ - слабое окрашивание мембраны опухолевых клеток; 2+ - средняя интенсивность окрашивания более 10% опухолевых клеток; 3+ - сильная степень окрашивания более 10% опухолевых клеток. Опухоль, оцениваемую как 0 или 1+, считали отрицательной, а как 2+ или 3+ - положительной по HER2/neu.Evaluation of the staining results was carried out using a light microscope "Leica" (Germany) under magnification × 10, × 20, × 40. For all markers, the localization of staining in the cell (nucleus, cytoplasm, membrane) was evaluated. The number of positive cells was evaluated in areas containing their maximum number. The following criteria were used to evaluate HER2 expression: 0 — no staining; 1+ - weak staining of the membrane of tumor cells; 2+ - average staining intensity of more than 10% of tumor cells; 3+ - a strong degree of staining of more than 10% of tumor cells. The tumor, assessed as 0 or 1+, was considered negative, and as 2+ or 3+ - positive for HER2 / neu.

Результаты, приведенные на Фиг.7, показывают эффективность использования антитела из N. benthamiana для диагностики HER-2-позитивного рака груди. Полученные результаты свидетельствуют о том, что антитело из N. benthamiana не отличается от поликлональных коммерческих антител A0485 [«Dako», Дания] в своей способности выявлять раковые клетки в гистологических препаратах пациентов.The results shown in Fig.7 show the effectiveness of using antibodies from N. benthamiana for the diagnosis of HER-2-positive breast cancer. The results obtained indicate that the antibody from N. benthamiana does not differ from the A0485 polyclonal commercial antibodies [Dako, Denmark] in its ability to detect cancer cells in histological specimens of patients.

Таким образом антитело из N. benthamiana не отличается от коммерческих антител A0485 [«Dako», Дания] в своей способности выявлять раковые клетки в гистологических препаратах пациентов.Thus, the antibody from N. benthamiana does not differ from the commercial antibodies A0485 [Dako, Denmark] in their ability to detect cancer cells in histological specimens of patients.

Пример 4. Сравнение способности коммерческих антител и антител, выделенных из N. benthamiana, ингибировать пролиферацию опухолевых клеток SK-BR-3.Example 4. Comparison of the ability of commercial antibodies and antibodies isolated from N. benthamiana to inhibit the proliferation of tumor cells SK-BR-3.

Исследование проводилось на клеточной линии рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu SK-BR-3. Клетки SK-BR-3 высаживались в низкой плотности (30 т клеток/мл) в триплетах на 48-луночный планшет в среде, содержащей 10% сыворотки FCS. На следующий день среда заменялась на среду с низким содержанием сыворотки (1%), добавлялись различные концентрации тестируемых препаратов. Среда, антибиотики и препараты менялись раз в 3-4 дня. Рост клеток определялся модифицированным «митогенным методом по Crystal Violet». Клетки промывались PBS и фиксировались 1% параформальдегидом на PBS и окрашивались 0,5% раствором Crystal Violet (Sigma Chemical Co) на этаноле. Краситель растворяли в этаноле и измеряли на спектрофотометре при 540-560 им.The study was conducted on a cell line of breast cancer with overexpression of HER2 / neu SK-BR-3. SK-BR-3 cells were plated in low density (30 t cells / ml) in triplets on a 48-well plate in medium containing 10% FCS serum. The next day, the medium was replaced with a medium with a low serum content (1%), various concentrations of the tested drugs were added. The environment, antibiotics and drugs changed every 3-4 days. Cell growth was determined by a modified Crystal Violet mitogenic method. Cells were washed with PBS and fixed with 1% paraformaldehyde on PBS and stained with 0.5% solution of Crystal Violet (Sigma Chemical Co) on ethanol. The dye was dissolved in ethanol and measured on a spectrophotometer at 540-560 them.

Было проанализировано антипролиферативное действие антитела из N. benthamiana в сравнении с Герпептином. Результаты представлены на Фиг.8. Не обнаружено статистически значимых различий в количестве клеток при добавлении Герцептина и антитела из N. benthamiana. При концентрации препаратов 1 мг/мл ингибирование пролиферации составляет 45,97%±10,09 для антитела из N. benthamiana и 41,93%±17,25 для Герцептина, для концентраций 100 нг/мл ингибирование пролиферации составляет 36,6%±19,63 для антитела из N. benthamiana и 39,27%±18,96 для Герцептина и для концентрации 10 нг/мл - 8,45%±3,29 для антитела из N. benthamiana и 21,35%±14,81 для Герцептина. Таким образом, антитело з N. benthamiana блокирует пролиферацию клеточной линии рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu в концентрациях, сравнимых с концентрацией Герцептина. Таким образом, антитело, выделенное из листьев растения Nicotiana benthamian, получено с высокой степенью чистоты, включает как гликозилированную, так и негликозилированную форму, взаимодействует с раковыми клетками, способно выявлять раковые клетки SK-BR-3, а также обеспечивать ингибирование их пролиферации.The antiproliferative effect of an antibody from N. benthamiana was compared with Herpeptin. The results are presented in Fig. 8. No statistically significant differences in cell numbers were found when Herceptin and N. benthamiana antibody were added. At a drug concentration of 1 mg / ml, inhibition of proliferation is 45.97% ± 10.09 for antibodies from N. benthamiana and 41.93% ± 17.25 for Herceptin, for concentrations of 100 ng / ml, inhibition of proliferation is 36.6% ± 19.63 for an antibody from N. benthamiana and 39.27% ± 18.96 for Herceptin and for a concentration of 10 ng / ml - 8.45% ± 3.29 for an antibody from N. benthamiana and 21.35% ± 14, 81 for Herceptin. Thus, antibody z N. benthamiana blocks the proliferation of the breast cancer cell line with overexpression of HER2 / neu at concentrations comparable to Herceptin concentration. Thus, the antibody isolated from the leaves of the Nicotiana benthamian plant, obtained with a high degree of purity, includes both glycosylated and non-glycosylated forms, interacts with cancer cells, is able to detect SK-BR-3 cancer cells, and also inhibits their proliferation.

Claims (1)

Антитело, полученное из листьев растения Nicotiana benthamiana путем транзиторной трансфекции экспрессионными векторами, представляющее собой иммуноглобулин класса IgG, состоящее из легких и тяжелых пептидных цепей, специфически взаимодействующее с HER2/neu, отличающееся тем, что оно является тетрамером, состоящим из двух легких и двух тяжелых пептидных цепей и их более крупных супрамолекулярных ансамблей, и выделенное как в гликозилированной, так и в негликозилированной форме. An antibody obtained from the leaves of the plant Nicotiana benthamiana by transient transfection with expression vectors, which is an IgG class immunoglobulin consisting of light and heavy peptide chains, specifically interacting with HER2 / neu, characterized in that it is a tetramer consisting of two light and two heavy peptide chains and their larger supramolecular ensembles, and isolated in both glycosylated and non-glycosylated forms.

Images