RU2423698C1 - Method of selective recovery of viable cell population from biological fluids - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine. ^ SUBSTANCE: for selective recovery of a viable cell population, a biological fluid sample is placed in a microfluid device cell containing a silicon microchannel matrix with through holes of size 3-30 mcm and channel length 50-300 mcm as a filter medium, and passed through the matrix at rate 0.1-4 ml/min. In case of cell size separation, a cell fraction of the size less than that of the through holes in the matrix, are collected after passing of the microchannel matrix, while the larger cells are eluated from the microchannel matrix channels by eluent backflow. In case of receptor-specific cell separation, a matrix surface is pre-modified by specific cell receptor antibodies, while the target cells are eluated from the matrix channels by isotypic antibodies or haptens. ^ EFFECT: more efficient and faster selective recovery of the viable cell population from biological fluids. ^ 3 cl, 2 dwg, 4 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области молекулярной/клеточной биологии и диагностической медицины, а именно к разработке способов выделения клеток определенного типа из биологических образцов.The invention relates to the field of molecular / cell biology and diagnostic medicine, namely to the development of methods for the isolation of cells of a certain type from biological samples.

Способы, позволяющие быстро и недорого выделять индивидуальные популяции жизнеспособных клеток из биологических образцов, требуются для исследования механизмов клеточных взаимодействий, клеточной дифференцировки, тканевой инженерии и в ряде смежных областей. Особенный интерес такие способы представляют для диагностической медицины, в частности выделение редких клеток из крови позволяет выделять клетки плода из материнской крови, а также циркулирующие клетки опухолей. Такие циркулирующие клетки могут быть эффективно использованы для анализа хромосомных аберраций, а методология их выделения позволяет не только перейти к малоинвазивной онкодиагностике, но и получать принципиально новые диагностические данные (оценка метастатического потенциала, генетического профиля, лекарственной устойчивости и т.д.).Methods for quickly and inexpensively isolating individual populations of viable cells from biological samples are required to study the mechanisms of cellular interactions, cell differentiation, tissue engineering, and in a number of related fields. Such methods are of particular interest for diagnostic medicine, in particular, the isolation of rare cells from the blood allows the fetal cells to be isolated from maternal blood, as well as circulating tumor cells. Such circulating cells can be effectively used to analyze chromosomal aberrations, and the methodology for their isolation allows not only to switch to minimally invasive oncodiagnostics, but also to obtain fundamentally new diagnostic data (assessment of metastatic potential, genetic profile, drug resistance, etc.).

Известен способ выделения редких онкотрансформированных клеток метастазирующих опухолей из крови пациентов с использованием микрофлюидных устройств (Nature, 2007, v.450, 1235-1239). Устройство состоит из микрофлюидной ячейки, представляющей из себя плоскую прозрачную камеру с множеством стержней, предназначенных для создания развитой поверхности. Поверхность микростержней модифицирована тиольными группами, к которым в дальнейшем ковалентно присоединяют биотин, а затем авидин. Далее ячейку инкубируют с антителами против поверхностных рецепторов онкотрансформированных клеток, например ЕрСАМ (молекулы адгезии эпителиальных клеток), меченных биотином. Клетки прокачивают через микрофлюидное устройство при помощи микродозаторов, затем визуализуют при помощи флуоресцентно меченых моноклональных антител против цитокератинов и анализируют при помощи флуоресцентной микроскопии. Способ требует уникального оборудования как для изготовления микроячеек, так и для анализа результатов и обеспечивает только рецептор-специфичное выделение клеток.A known method for the isolation of rare oncotransformed cells of metastatic tumors from the blood of patients using microfluidic devices (Nature, 2007, v.450, 1235-1239). The device consists of a microfluidic cell, which is a flat transparent chamber with many rods designed to create a developed surface. The surface of the micro rods is modified by thiol groups, to which biotin and then avidin are subsequently covalently attached. The cell is then incubated with antibodies against surface receptors of oncotransformed cells, for example EpCAM (epithelial cell adhesion molecules) labeled with biotin. Cells are pumped through a microfluidic device using microdosers, then visualized using fluorescently labeled monoclonal antibodies against cytokeratins and analyzed using fluorescence microscopy. The method requires unique equipment both for the manufacture of microcells and for analysis of the results and provides only receptor-specific cell isolation.

Известен способ непрерывного разделения частиц по размеру в микропроточной системе, содержащей асимметричную, относительно направления силы действия, микроструктурированную матрицу с системой микроканалов (патент US 7150812, кл. C12N 15/06, опубл. 19.12.2006). В микроканалах матрицы создана упорядоченная структура препятствий, в которой каждый ряд препятствий смещен относительно предыдущего на определенную величину; тем самым создается асимметричное направление столбца препятствий по сравнению с направлением приложенного поля силы, что позволяет сохранять направление движения, совпадающее с направлением приложенного поля силы более мелким частицам, в то время как более крупные частицы совершают боковое движение под углом к направлению основного потока. Варьируя размер щелей и величину смещения рядов препятствий, а также размер самих препятствий, можно добиться разделения частиц в широком диапазоне размеров.A known method of continuous separation of particles by size in a micro-flow system containing an asymmetric microstructured matrix with a microchannel system with respect to the direction of the force (patent US 7150812, class C12N 15/06, published on December 19, 2006). An ordered structure of obstacles is created in the microchannels of the matrix, in which each row of obstacles is shifted relative to the previous one by a certain amount; This creates an asymmetric direction of the column of obstacles compared with the direction of the applied force field, which allows you to keep the direction of motion coinciding with the direction of the applied force field to smaller particles, while larger particles make lateral movement at an angle to the direction of the main flow. By varying the size of the slots and the displacement of the rows of obstacles, as well as the size of the obstacles themselves, it is possible to achieve particle separation in a wide range of sizes.

Недостатком известного способа является сложность ячейки, необходимость точного контроля давления и расхода жидкости, низкая эффективность разделения клеток по размеру и отсутствие возможности рецептор-специфичного разделения клеток.The disadvantage of this method is the complexity of the cell, the need for precise control of pressure and fluid flow, low efficiency of separation of cells by size and the lack of receptor-specific separation of cells.

Известен способ серийной сортировки клеток, включающий в себя обеспечение разделения потока жидкости при движении клеток через серию клеточных разделителей в первом направлении с выходом на предшествующий серии клеточный разделитель, сообщающийся с входом на последующий клеточный разделитель серии (патент US 7390387, кл. G01N 27/447, опубл. 24.06.2008). В пределах каждого клеточного разделителя первая порция клеток отделяется от второй порции клеток с помощью приложения переменного электрического поля через первый электрод, чтобы вызвать движение первой порции клеток во втором направлении, отличном от движения потока жидкости, пересекающемся с первым потоком, направляющимся к выходу соответствующего клеточного разделителя. Такая серия разделителей позволяет выделять из образца несколько разновидностей клеток, различающихся по электрическим свойствам.A known method of serial sorting of cells, including the separation of the fluid flow when the cells move through a series of cell dividers in the first direction with access to the previous series of cell separator, communicating with the entrance to the subsequent cell separator series (US patent 7390387, CL G01N 27/447 published on June 24, 2008). Within each cell separator, the first batch of cells is separated from the second batch of cells by applying an alternating electric field through the first electrode to cause the first batch of cells to move in a second direction other than the fluid flow, intersecting with the first stream heading to the outlet of the corresponding cell divider . Such a series of separators makes it possible to isolate several types of cells from the sample that differ in electrical properties.

Известен способ разделения, очистки и подсчета клеточных субпопуляций в микропроточной системе, имеющей управление потоками жидкости в микроканалах в районе клеточной фокусировки (международная заявка WO 2005/108963, кл. G01N 21/64, опубл. 17.11.2005). Участок оптической детекции обнаруживает различные типы клеток, находящиеся в едином потоке. Электромагнитные поля используются для управления потоками клеток согласно сигналам от участка оптической детекции, направляя их в ветви каналов под действием источника силы для разделения образца. Система может иметь параллельные структуры, которые повышают производительность или последовательно включают системы для обеспечения некоторых аналитических шагов. Оптическая система и микролинзы могут быть вставлены в отливаемый материал в процессе отливки.A known method of separation, purification and counting of cell subpopulations in a micro-flow system having control of fluid flows in microchannels in the area of cell focusing (international application WO 2005/108963, class G01N 21/64, publ. 11/17/2005). The optical detection section detects various types of cells in a single stream. Electromagnetic fields are used to control cell flows according to signals from the optical detection section, directing them to the branches of the channels under the action of a force source to separate the sample. A system may have parallel structures that increase productivity or sequentially enable systems to provide some analytical steps. The optical system and microlenses can be inserted into the cast material during the casting process.

Недостатками известного способа являются сложность в изготовлении и управлении микропроточной системы, низкая эффективность разделения клеточных субпопуляций. Кроме того, система требует предварительной пробоподготовки для маркировки искомых клеточных популяций.The disadvantages of this method are the complexity in the manufacture and control of a micro-flow system, the low separation efficiency of cell subpopulations. In addition, the system requires preliminary sample preparation for labeling the desired cell populations.

Известен способ разделения клеток по размеру в микрофлюидном устройстве (Wu Z, Hjort K, Wicher G, Fex Svenningsen A. Microfluidic high viability neural cell separation using viscoelastically tuned hydrodynamic spreading. Biomed Microdevices. 2008 Oct; 10(5): 631-8). Микроканальная матрица выполнена из полидиметоксисилана методом литографии и разделяет клетки в вязкой среде, содержащей альгинат натрия, за счет сил, возникающих в токе вязких жидкостей.A known method for separating cells by size in a microfluidic device (Wu Z, Hjort K, Wicher G, Fex Svenningsen A. Microfluidic high viability neural cell separation using viscoelastically tuned hydrodynamic spreading. Biomed Microdevices. 2008 Oct; 10 (5): 631-8) . The microchannel matrix is made of polydimethoxysilane by lithography and separates the cells in a viscous medium containing sodium alginate due to the forces arising in the flow of viscous fluids.

Известный способ позволяет делить клетки только по размеру, причем после разделения двух популяций клеток, отличающихся по размеру в 5 раз, чистота каждой популяции составляет не более 70%. Т.е. способ характеризуется низкой эффективностью, а кроме того, требования к равномерности потоков и стабилизации входного давления очень высоки, что требует специальной оснастки.The known method allows you to divide cells only in size, and after separation of two populations of cells that differ in size by 5 times, the purity of each population is not more than 70%. Those. the method is characterized by low efficiency, and in addition, the requirements for uniform flow and stabilization of the inlet pressure are very high, which requires special equipment.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ селективного выделения как минимум одного компонента из биологической жидкости организма с использованием микрофлюидного устройства, включающий подготовку образца, пропускание последнего через ячейку с микроканальной матрицей с последующим сбором и анализом выделенных клеток, при этом кровь или жидкость пропускают через микроканальную матрицу, содержащую сквозные отверстия (поры) размером от 5 до 500 мкм (международная заявка WO 03/090924, кл. B01J 20/32, опубл. 06.11.2003). Матрица может быть изготовлена из полимеров или природных силикатов, глиноземов, минеральных волокон, имеет губчатую структуру и предназначена для удаления низкомолекулярных компонентов из крови. Для разделения клеток используют дополнительную модификацию клеток микробусами. Эффективность удаления фагоцитирующих клеток из крови составляет не более 50%.The prototype closest to the claimed method is a method for selectively isolating at least one component from a body fluid using a microfluidic device, including preparing a sample, passing it through a cell with a microchannel matrix, followed by collection and analysis of the selected cells, while blood or liquid is passed through a microchannel matrix containing through holes (pores) ranging in size from 5 to 500 microns (international application WO 03/090924, class B01J 20/32, publ. 06.11.2003). The matrix can be made of polymers or natural silicates, alumina, mineral fibers, has a spongy structure and is designed to remove low molecular weight components from the blood. For cell separation, an additional modification of cells using microbuses is used. The efficiency of removing phagocytic cells from the blood is not more than 50%.

Недостатками прототипа является низкая эффективность удаления клеток за счет высокого сопротивления потоку жидкости, создаваемого губчатой структурой, отсутствие возможности использования способа для размер-специфичного разделения интактных, не модифицированных специальными реагентами клеток, отсутствие возможности выделения клеток из матрицы и отсутствие возможности получения жизнеспособных клеток.The disadvantages of the prototype are the low efficiency of removing cells due to the high resistance to fluid flow created by the spongy structure, the inability to use the method for size-specific separation of intact cells not modified with special reagents, the inability to isolate cells from the matrix, and the inability to obtain viable cells.

Технической задачей изобретения является повышение эффективности способа и расширение его функциональных возможностей.An object of the invention is to increase the efficiency of the method and expand its functionality.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.The technical task is achieved by the proposed method, which consists in the following.

Подготовленный образец биологической жидкости (кровь, лимфу, ликвор, бронхиальные смывы, мочу и др.) пропускают через кремниевую микроканальную матрицу со сквозными отверстиями квадратного сечения с размером 3-30 мкм и длиной каналов 50-300 мкм со скоростью 0,1-4 мл/мин. При этом, в случае разделения клеток по размеру, фракцию клеток, имеющих размер меньше, чем размер сквозных отверстий в матрице, собирают после микроканальной матрицы, а клетки с размерами больше, чем размер сквозных отверстий в матрице, элюируют из каналов микроканальной матрицы обратным током элюента (т.е. в обратном направлении относительно направления потока нанесения клеток). В качестве элюента используют преимущественно буферный раствор, содержащий 20-50 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). В случае рецептор-специфичного выделения клеток, поверхность матрицы предварительно модифицируют антителами против специфических рецепторов клеток, а целевые клетки элюируют из каналов матрицы изотипическими (по отношению к рецептор-специфическим антителам) иммуноглобулинами или гаптенами. В частном случае, когда биологической жидкостью является кровь, последнюю разводят 0,2-5 раз буферным раствором, содержащим 20-50 мМ ЭДТА.A prepared sample of biological fluid (blood, lymph, cerebrospinal fluid, bronchial swabs, urine, etc.) is passed through a silicon microchannel matrix with through holes of square section with a size of 3-30 microns and a channel length of 50-300 microns with a speed of 0.1-4 ml / min In this case, in the case of separation of cells by size, the fraction of cells having a size smaller than the size of the through holes in the matrix is collected after the microchannel matrix, and cells with sizes larger than the size of the through holes in the matrix are eluted from the channels of the microchannel matrix by the reverse eluent current (i.e., in the opposite direction relative to the direction of flow of cell deposition). As an eluent, a predominantly buffer solution containing 20-50 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) is used. In the case of receptor-specific cell isolation, the matrix surface is pre-modified with antibodies against specific cell receptors, and target cells are eluted from the matrix channels by isotypic (relative to receptor-specific antibodies) immunoglobulins or haptens. In the particular case, when the biological fluid is blood, the latter is diluted 0.2-5 times with a buffer solution containing 20-50 mm EDTA.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются следующие.The defining distinguishing features of the proposed method, in comparison with the prototype, are the following.

1. Образец биологической жидкости пропускают через микроканальную матрицу, выполненную из кремния, со сквозными отверстиями квадратного сечения с размером 3-30 мкм и длиной каналов 50-300 мкм, что позволяет исключить сопротивление потоку жидкости за счет высокой пористости поверхности и гладких стенок отверстий матрицы, перпендикулярных направлению потока, что обеспечивает ламинарный поток жидкости и минимальное разрушение жизнеспособных клеток, а также обеспечивает максимально эффективное выделение клеток заданного размера и возможность эффективного выделения больших и малых клеток, диаметром от 3 до 30 микрон. Отсутствие сопротивления потоку и большое количество отверстий на единицу поверхности позволяют выделять более 96% жизнеспособных клеток.1. A sample of biological fluid is passed through a microchannel matrix made of silicon, with through holes of square section with a size of 3-30 microns and a channel length of 50-300 microns, which eliminates the resistance to fluid flow due to the high porosity of the surface and smooth walls of the holes of the matrix, perpendicular to the direction of flow, which provides a laminar fluid flow and minimal destruction of viable cells, and also provides the most efficient isolation of cells of a given size and effective isolation of large and small cells with a diameter of 3 to 30 microns. The lack of resistance to flow and a large number of holes per unit surface allow you to allocate more than 96% of viable cells.

2. Образец биологической жидкости пропускают через микроканальную матрицу со скоростью 0,1-4 мл/мин самотеком, что позволяет исключить необходимость комплектации устройства дополнительным оборудованием. Требуемую скорость задают простым перепадом давления за счет вертикального перемещения приемного резервуара и резервуара-коллектора, что позволяет значительно удешевить процесс. Например, длительность процесса выделения клеток по размеру для одного образца крови составляет не более 20 минут.2. A sample of biological fluid is passed through a microchannel matrix at a speed of 0.1-4 ml / min by gravity, which eliminates the need to equip the device with additional equipment. The required speed is set by a simple pressure drop due to the vertical movement of the receiving tank and the reservoir tank, which can significantly reduce the cost of the process. For example, the duration of the process of isolating cells in size for one blood sample is no more than 20 minutes.

3. Для разделения клеток по размеру фракцию клеток, имеющих размер меньше, чем размер сквозных отверстий в матрице, собирают после прохождения микроканальной матрицы, а более крупные клетки элюируют с каналов микроканальной матрицы обратным током элюента, что позволяет выделять крупные клетки с высокой эффективностью.3. To separate cells by size, a fraction of cells having a size smaller than the size of the through holes in the matrix is collected after the passage of the microchannel matrix, and larger cells are eluted from the channels of the microchannel matrix by the reverse eluent flow, which allows large cells to be isolated with high efficiency.

4. Для рецептор-специфичного выделения клеток поверхность матрицы модифицируют антителами против специфических рецепторов клеток, а затем целевые клетки элюируют из каналов матрицы изотипическими иммуноглобулинами или гаптенами, что позволяет расширить функциональные возможности способа.4. For receptor-specific cell isolation, the matrix surface is modified with antibodies against specific cell receptors, and then the target cells are eluted from the matrix channels with isotypic immunoglobulins or haptens, which allows to expand the functionality of the method.

Кроме этого, способ позволяет многократно использовать одну матрицу за счет предусмотренных стадий регенерации, промывки и прокаливания последней.In addition, the method allows you to reuse one matrix due to the provided stages of regeneration, washing and calcination of the latter.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.The invention is illustrated by the following examples of specific performance of the method.

Пример 1Example 1

Для оценки эффективности выделения крупных клеток из периферической крови в последнюю были добавлены клетки HeLa. В предварительном эксперименте было показано, что размер клеток HeLa не позволяет им проходить через каналы микроканальной матрицы со сквозными отверстиями (порами) размером 7×7 мкм. На фиг.1 представлена электронная сканирующая микроскопия клеток HeLa на поверхности микроканальной матрицы с порами размером 7×7 мкм.To evaluate the efficiency of isolation of large cells from peripheral blood, HeLa cells were added to the latter. In a preliminary experiment, it was shown that the size of HeLa cells does not allow them to pass through the channels of a microchannel matrix with through holes (pores) of 7 × 7 μm in size. Figure 1 shows the electron scanning microscopy of HeLa cells on the surface of a microchannel matrix with pores of 7 × 7 μm in size.

Для выделения популяции жизнеспособных клеток использовали микрофлюидное устройство, представленное на фиг.2, включающее емкость для сепарируемых клеток (1), микрофлюидную ячейку с установленной микроканальной матрицей (2), входящий и выходящий капилляры (3) и емкость для сбора клеток (4).To isolate the population of viable cells, the microfluidic device shown in Fig. 2 was used, including a container for separated cells (1), a microfluidic cell with an installed microchannel matrix (2), inlet and outlet capillaries (3), and a cell collection tank (4).

В 1 мл крови, предварительно пропущенной через микроканальное устройство для удаления крупных клеток (моноцитов и гранулоцитов), вносили 0,5×10⁶ клеток HeLa, клеточную суспензию разводили фосфатным буфером, содержащим 20 мМ ЭДТА (ФБР-ЭДТА), в 5 раз и пропускали со скоростью 2,5 мл в минуту через кремниевую микроканальную матрицу с размером сквозных отверстий квадратного сечения размером 7×7 мкм и длиной каналов 150 мкм. Перепад давления составлял 30 см водного столба.0.5 × 10 ⁶ HeLa cells were added to 1 ml of blood previously passed through a microchannel device to remove large cells (monocytes and granulocytes), the cell suspension was diluted with phosphate buffer containing 20 mM EDTA (FBI-EDTA) 5 times and passed at a speed of 2.5 ml per minute through a silicon microchannel matrix with a size of through holes of square section size 7 × 7 μm and a channel length of 150 μm. The pressure drop was 30 cm of water.

При этом эритроциты и другие клетки с размером меньше, чем размер отверстий в матрице, проходили через матрицу, а более крупные клетки HeLa задерживались на матрице.In this case, red blood cells and other cells with a size smaller than the size of the holes in the matrix passed through the matrix, and larger HeLa cells were retained on the matrix.

Далее матрицу промывали 3 мл фосфатного буфера, содержащего 20 мМ ЭДТА, и обратным током буферного раствора со скоростью 4 мл/мин элюировали целевые клетки 10 мл фосфатного буфера, содержащего 20 мМ ЭДТА. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора, брали аликвоту 10 мкл и производили подсчет клеток в камере Горяева. Кроме этого, эффективность выделения клеток оценивали по количественному ПЦР-анализу аберрантно метилированного гена RARβ2, как описано в заявке RU №2008132233/15, решение о выдаче патента от 22.06.2009.Next, the matrix was washed with 3 ml of phosphate buffer containing 20 mM EDTA, and the target cells 10 ml of phosphate buffer containing 20 mM EDTA were eluted by reverse flow of the buffer solution at a rate of 4 ml / min. Cells were pelleted by centrifugation and resuspended in 1 ml of physiological saline, an aliquot of 10 μl was taken, and cells were counted in a Goryaev chamber. In addition, the efficiency of cell isolation was evaluated by quantitative PCR analysis of the aberrantly methylated RARβ2 gene, as described in application RU No. 2008132233/15, the decision to grant a patent dated 06.22.2009.

Данные о количестве клеток Hela до и после выделения, определенные методом прямого подсчета клеток и количественного ПЦР, представлены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что эффективность выделения крупных клеток составляет не менее 90%. Количество клеток Hela составляло не менее 82%.Data on the number of Hela cells before and after isolation, determined by direct cell counting and quantitative PCR, are presented in table 1. From table 1 it can be seen that the efficiency of isolation of large cells is at least 90%. The number of Hela cells was at least 82%.

Для повторного использования матрицы после разделения клеток ее последовательно промывали 10 мл физиологического раствора в прямом и 10 мл в обратном направлениях, 5 мл 10% водного раствора додецилсульфата натрия (SDS) и затем 20 мл дистиллированной воды. После отмывки матрицу инкубировали 30 минут в 3%-ном растворе бихромата калия в концентрированной серной кислоте, отмывали 50 мл дистиллированной воды и высушивали на воздухе.To reuse the matrix after separation of the cells, it was successively washed with 10 ml of physiological saline solution in the forward and 10 ml in the opposite directions, 5 ml of a 10% aqueous solution of sodium dodecyl sulfate (SDS), and then 20 ml of distilled water. After washing, the matrix was incubated for 30 minutes in a 3% solution of potassium dichromate in concentrated sulfuric acid, washed with 50 ml of distilled water and dried in air.

Данный пример иллюстрирует возможность быстрого выделения крупных клеток, циркулирующих в крови, не требующего дополнительных реагентов (таких как среда для разделения лейкоцитов и т.д.).This example illustrates the ability to quickly isolate large cells circulating in the blood that do not require additional reagents (such as a medium for the separation of white blood cells, etc.).

Пример 2Example 2

Для оценки рисков метастазирования опухолей молочной железы циркулирующие эпителиальные клетки опухоли выделяли из образцов крови больных раком молочной железы (n=5, Т₂, N_xM₁) заявляемым способом.To assess the risks of metastasis of breast tumors, circulating tumor epithelial cells were isolated from blood samples of patients with breast cancer (n = 5, T ₂ , N _x M ₁ ) by the claimed method.

Венозную кровь от 3 пациентов (4 мл) помещали в 1 мл физиологического раствора, содержащего 50 мМ ЭДТА (ФБР-ЭДТА). Далее полученный образец крови (5 мл) пропускали со скоростью 0,5 мл/мин через кремниевую микроканальную матрицу с размером сквозных отверстий квадратного сечения 8×8 мкм и длиной каналов 300 мкм, установленную в микрофлюидную ячейку, как описано в примере 1.Venous blood from 3 patients (4 ml) was placed in 1 ml of physiological saline containing 50 mM EDTA (FBI-EDTA). Next, the obtained blood sample (5 ml) was passed at a speed of 0.5 ml / min through a silicon microchannel matrix with a through-hole size of a square section of 8 × 8 μm and a channel length of 300 μm installed in a microfluidic cell, as described in example 1.

Далее матрицу промывали 10 мл фосфатного буфера, содержащего 20 мМ ЭДТА, со скоростью 3 мл/мин и обратным током буферного раствора со скоростью 4 мл/мин элюировали целевые клетки 10 мл фосфатного буфера, содержащего 20 мМ ЭДТА. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 50 мкл физиологического раствора. ДНК выделяли из клеток с использованием набора для выделения ДНК («БиоСилика», Росиия). Для оценки количества онкотрансформированных клеток использовали измерение аберранто метилированного гена Cyclin D2, как было описано ранее (Fackler MJ, McVeigh М, Mehrotra J, et all. Cancer Res. 2004 Jul 1; 64(13): 4442-52). В качестве контроля использовали количественный анализ гена β-актина (Т.Е.Skvortsova, V.V.Vlassov, P.P.Laktionov. Ann NY Acad Sci. 2008, 1137: 36-40). Результаты анализа представлены в таблице 2. Полученные результаты демонстрируют, что в крови 2 пациентов присутствуют онкотрансформированные клетки. Таким образом, заявляемый способ может быть использован для размер-специфичного выделения онкотрансформированных клеток.Next, the matrix was washed with 10 ml of a phosphate buffer containing 20 mM EDTA at a rate of 3 ml / min and a reverse current of the buffer solution at a speed of 4 ml / min. The target cells were eluted with 10 ml of a phosphate buffer containing 20 mM EDTA. Cells were pelleted by centrifugation and resuspended in 50 μl of saline. DNA was isolated from cells using a DNA isolation kit (BioSilica, Russia). To assess the number of oncotransformed cells, the measurement of the aberrantly methylated Cyclin D2 gene was used as described previously (Fackler MJ, McVeigh M, Mehrotra J, et all. Cancer Res. 2004 Jul 1; 64 (13): 4442-52). As a control, a quantitative analysis of the β-actin gene was used (T.E. Skvortsova, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov. Ann NY Acad Sci. 2008, 1137: 36-40). The results of the analysis are presented in table 2. The obtained results demonstrate that oncotransformed cells are present in the blood of 2 patients. Thus, the inventive method can be used for size-specific isolation of oncotransformed cells.

Пример 3. Выделение клеток из мочиExample 3. Isolation of cells from urine

Ядерные клетки мочи представляют интерес для неинвазивной диагностики рака предстательной железы и могут быть использованы в качестве материала для генетических исследований.Urine nuclear cells are of interest for non-invasive diagnosis of prostate cancer and can be used as material for genetic research.

Для выделения ядерных клеток из мочи были взяты образцы мочи у здоровых мужчин (n=10) и больных раком предстательной железы (n=5, Т_1-2, NxMx) с целью дальнейшего поиска онкотрансформированных клеток.To isolate nuclear cells from urine, urine samples were taken from healthy men (n = 10) and patients with prostate cancer (n = 5, T _1-2 , NxMx) in order to further search for oncotransformed cells.

50 мл мочи от каждого донора пропускали со скоростью 4 мл/минуту через кремниевую микроканальную матрицу с размером сквозных отверстий квадратного сечения 3×3 мкм и длиной каналов 50 мкм, установленную в микрофлюидную ячейку, как описано в примере 1. При этом микроканальная матрица не препятствовала прохождению свободной жидкости, белковых агрегатов и веществ, ингибирующих ПЦР, но задерживала ядерные клетки. Далее матрицу промывали 10 мл фосфатного буфера, содержащего 20 мМ ЭДТА, со скоростью 4 мл/мин и обратным током буферного раствора со скоростью 4 мл/мин элюировали целевые клетки 10 мл фосфатного буфера, содержащего 20 мМ ЭДТА. ФБР-ЭДТА, ядерные клетки собирали обратным током жидкости со скоростью 4 мл/мин. Клетки осаждали центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5 мин на настольной центрифуге (Eppendorf, Германия) и ресуспендировали в 50 мкл физиологического раствора. ДНК выделяли из клеток с использованием набора для выделения ДНК («БиоСилика», Росиия) и анализировали наличие аберрантно метилированного гена GSTP-1, как описано ранее (Jeronimo С, Usadel Н, Henrique R, Silva С, Oliveira J, Lopes С, Sidransky D. Urology. 2002 Dec; 60(6): 1131-1135). Количество клеток определяли при помощи количественного ПЦР однокопийного гена β-актина, как описано (Т.Е.Skvortsova, V.V.Vlassov, P.P.Laktionov. Ann NY Acad Sci. 2008, 1137: 36-40). Данные представлены в таблице 3. В моче здоровых доноров не было обнаружено трансформированных клеток, в то время как в 3 образцах мочи, полученных от больных раком предстательной железы, обнаружены раковые клетки.50 ml of urine from each donor was passed at a rate of 4 ml / minute through a silicon microchannel matrix with a through-hole size of 3 × 3 μm square cross-section and a channel length of 50 μm installed in a microfluidic cell, as described in example 1. In this case, the microchannel matrix did not interfere passage of free fluid, protein aggregates and substances that inhibit PCR, but retained nuclear cells. Next, the matrix was washed with 10 ml of phosphate buffer containing 20 mM EDTA at a rate of 4 ml / min and reverse flow of the buffer solution at a speed of 4 ml / min. The target cells were eluted with 10 ml of phosphate buffer containing 20 mM EDTA. FBI-EDTA, nuclear cells were collected by reverse fluid flow at a rate of 4 ml / min. Cells were besieged by centrifugation at 1200 rpm for 5 min in a benchtop centrifuge (Eppendorf, Germany) and resuspended in 50 μl of saline. DNA was isolated from cells using a DNA isolation kit (BioSilica, Russia) and the presence of an aberrantly methylated GSTP-1 gene was analyzed as previously described (Jeronimo C, Usadel H, Henrique R, Silva C, Oliveira J, Lopes C, Sidransky D. Urology. 2002 Dec; 60 (6): 1131-1135). Cell numbers were determined by quantitative PCR of a single copy β-actin gene as described (T.E. Skvortsova, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov. Ann NY Acad Sci. 2008, 1137: 36-40). The data are presented in table 3. No transformed cells were found in the urine of healthy donors, while cancer cells were found in 3 urine samples from patients with prostate cancer.

Данный пример иллюстрирует возможность быстрого и эффективного выделения ядерных клеток мочи, не требующего дополнительных реагентов для дальнейшего анализа.This example illustrates the ability to quickly and efficiently isolate urine nuclear cells that do not require additional reagents for further analysis.

Пример 4Example 4

Для рецептор-специфичного выделения циркулирующих клеток из крови больных раком молочной железы венозную кровь от 5 доноров (Т₂, NxMx) собирали в ФБР-ЭДТА, как описано в примере 2. Для рецептор-специфичного выделения была использована микроканальная матрица со сквозными отверстиями квадратного сечения размером 30×30 мкм и длиной каналов 300 мкм. Антивидоспецифические антитела ковалентно иммобилизовали на стенки каналов микроканальной матрицы следующим образом. Поверхность микроканальной матрицы активировали (окисляли) путем выдерживания в растворе хромовой смеси в течение 15 минут, затем тщательно промывали матрицу дистиллированной водой и трижды ополаскивали этиловым спиртом, после чего матрицу помещали в 5% спиртовой раствор аминопропилтриэтоксисилана и инкубировали в течение 2 часов, затем отмывали спиртом (3 раза), ополаскивали ацетоном и высушивали при 80°С в течение часа. Далее поверхность микроканальной матрицы обрабатывали раствором бифункционального реагента цианур хлорида в ацетонитриле с концентрацией 4 мг/мл в течение 2 часов при комнатной температуре. После реакции матрицу три раза промывали ацетонитрилом. Блокирование активированной поверхности, во избежание неспецифической сорбции, проводили 0,02 М раствором глицина в буферном растворе, содержащем 0,02 М трис, 0,1 М NaCl, 0,002 М MgCl₂, 0,05% Твин-20, рН 7,5, в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем матрицу модифицировали инкубированием в растворе козьих поликлональных антител против иммуноглобулина кролика. Удаляли несвязавшиеся молекулы антител путем отмывок раствором, содержащим: 0,02 М трис, 0,1 М NaCl, 0,05% Твин-20, рН 7,5, и инкубировали матрицу с раствором кроличьих поликлональных антител против цитокератина 18 в концентрации 0,72 мг/мл в растворе 0,15 М NaCl в течение 12 часов. Удаляли несвязавшиеся молекулы антител путем отмывок раствором, содержащим: 0,02 М трис, 0,1 М NaCl, 0,002 М MgCl₂, 0,05% Твин-20, рН 7,5. Промывали матрицу физиологическим раствором и использовали для рецептор-специфичного выделения клеток в течение не более чем 48 часов от конца процедуры связывания специфических антител.For receptor-specific isolation of circulating cells from the blood of patients with breast cancer, venous blood from 5 donors (T ₂ , NxMx) was collected in the FBI-EDTA, as described in example 2. For the receptor-specific isolation, a microchannel matrix with through holes of square section was used 30 × 30 μm in size and 300 μm long. Anti-specific antibodies were covalently immobilized on the channel walls of the microchannel matrix as follows. The surface of the microchannel matrix was activated (oxidized) by keeping the chromium mixture in solution for 15 minutes, then the matrix was thoroughly washed with distilled water and rinsed three times with ethyl alcohol, after which the matrix was placed in a 5% alcohol solution of aminopropyltriethoxysilane and incubated for 2 hours, then washed with alcohol (3 times), rinsed with acetone and dried at 80 ° C for one hour. Next, the surface of the microchannel matrix was treated with a solution of bifunctional reagent cyanuride chloride in acetonitrile with a concentration of 4 mg / ml for 2 hours at room temperature. After the reaction, the matrix was washed three times with acetonitrile. Blocking the activated surface, in order to avoid non-specific sorption, was carried out with a 0.02 M glycine solution in a buffer solution containing 0.02 M Tris, 0.1 M NaCl, 0.002 M MgCl ₂ , 0.05% Tween-20, pH 7.5 for 30 minutes at room temperature. The matrix was then modified by incubation in a solution of goat polyclonal antibodies against rabbit immunoglobulin. Unbound antibody molecules were removed by washing with a solution containing: 0.02 M Tris, 0.1 M NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5, and the matrix was incubated with a solution of rabbit polyclonal antibodies against cytokeratin 18 at a concentration of 0, 72 mg / ml in a solution of 0.15 M NaCl for 12 hours. Unbound antibody molecules were removed by washing with a solution containing: 0.02 M Tris, 0.1 M NaCl, 0.002 M MgCl ₂ , 0.05% Tween-20, pH 7.5. The matrix was washed with saline and used for receptor-specific cell isolation for no more than 48 hours from the end of the binding process for specific antibodies.

Образцы цельной крови разводили в 3 раза раствором ФБР с 20 мМ ЭДТА и пропускали через микрофлюидное устройство со скоростью 0,1 мл/мин. После нанесения клеток ячейку отмывали 5 мл ФБР с 20 мМ ЭДТА со скоростью 0,5 мл/мин. Для элюции клеток использовали раствор кроличьего иммуноглобулина G с концентрацией 2 мг/мл в ФБР. Клетки элюировали со скоростью 0,2 мл/мин, осаждали центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5 мин на настольной центрифуге (Eppendorf, Германия) и выделяли ДНК с использованием набора «БиоСилика». Анализировали наличие аберрантно метилированного гена Cyclin D2, как описано ранее (Fackler MJ, McVeigh М, Mehrotra J, Blum MA, Lange J, Lapides A, Garrett E, Argani P, Sukumar S. Cancer Res. 2004 Jul 1; 64(13): 4442-52). Количество клеток определяли при помощи количественного ПЦР однокопийного гена β-актина, как описано (Т.Е.Skvortsova, V.V.Vlassov, P.P.Laktionov. Ann NY Acad Sci. 2008, 1137: 36-40). Данные представлены в таблице 4. Результаты демонстрируют, что рецептор-специфичное выделение клеток позволило детектировать циркулирующие опухолевые клетки в крови 4 из 5 больных раком молочной железы.Whole blood samples were diluted 3 times with a PBS solution with 20 mM EDTA and passed through a microfluidic device at a rate of 0.1 ml / min. After cell application, the cell was washed with 5 ml of PBS with 20 mM EDTA at a rate of 0.5 ml / min. To elute the cells, a rabbit immunoglobulin G solution with a concentration of 2 mg / ml in the FBI was used. Cells were eluted at a rate of 0.2 ml / min, pelleted by centrifugation at 1200 rpm for 5 min in a benchtop centrifuge (Eppendorf, Germany), and DNA was isolated using the BioSilica kit. The presence of the aberrantly methylated Cyclin D2 gene was analyzed as previously described (Fackler MJ, McVeigh M, Mehrotra J, Blum MA, Lange J, Lapides A, Garrett E, Argani P, Sukumar S. Cancer Res. 2004 Jul 1; 64 (13) : 4442-52). Cell numbers were determined by quantitative PCR of a single copy β-actin gene as described (T.E. Skvortsova, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov. Ann NY Acad Sci. 2008, 1137: 36-40). The data are presented in table 4. The results demonstrate that receptor-specific isolation of cells allowed the detection of circulating tumor cells in the blood of 4 out of 5 patients with breast cancer.

Предложенный способ позволяет быстро и эффективно выделять популяции жизнеспособных клеток из биологических жидкостей, в частности клетки-мишени, циркулирующие в крови, из общего пула циркулирующих клеток крови.The proposed method allows you to quickly and efficiently isolate populations of viable cells from biological fluids, in particular target cells circulating in the blood from a common pool of circulating blood cells.

Таблица 1Table 1 Подготовленный образецPrepared sample До выделения на МКМBefore allocation to MKM После выделения на МКМAfter isolation on the MKM Количество клеток Hela по данным количественного ПЦР метилированной формы гена RAR β 2The number of Hela cells according to the quantitative PCR methylated form of the RAR β 2 gene 100%one hundred% 82%82% Количество клеток, определенное методом прямого подсчета клеток (считали клетки, содержащие ядро)The number of cells determined by direct cell counting (counting cells containing the nucleus) 100%one hundred% 90%90%

Таблица 2table 2 ПациентыThe patients Здоровые (n=10)Healthy (n = 10) Рак молочной железы (n=2)Breast cancer (n = 2) Количество клеток по данным количественной ПЦР на аберранто метилированную форму гена Cyclin D2The number of cells according to quantitative PCR on the aberrantly methylated form of the Cyclin D2 gene 0%0% 85±7%85 ± 7% Количество клеток по данным ПЦР гена β-актинаThe number of cells according to the PCR gene of β-actin 100%one hundred% 100%one hundred%

Таблица 3Table 3 ПациентыThe patients Здоровые (n=10)Healthy (n = 10) Рак предстательной железы (n=3)Prostate Cancer (n = 3) Количество клеток по данным ПЦР гена β-актинаThe number of cells according to the PCR gene of β-actin 100%one hundred% 100%one hundred% Количество клеток по данным ПЦР гена GSTP-1The number of cells according to PCR gene GSTP-1 0%0% 20%twenty%

Таблица 4Table 4 № пациентаPatient No. 1one 22 33 4four 55 Количество копий последовательности гена β-актина по данным количественной ПЦРThe number of copies of the β-actin gene sequence according to quantitative PCR 305±20305 ± 20 210±10210 ± 10 320±40320 ± 40 202±7202 ± 7 316±40316 ± 40 Количество копий метилированной формы гена Cyclin D2 по данным количественной ПЦРThe number of copies of the methylated form of the Cyclin D2 gene according to quantitative PCR 50±1050 ± 10 65±865 ± 8 47±947 ± 9 70±870 ± 8 00

Claims (3)

1. Способ селективного выделения популяции жизнеспособных клеток из биологических жидкостей с использованием микрофлюидного устройства, включающий подготовку образца, пропускание последнего через ячейку с микроканальной матрицей с последующим сбором и анализом выделенных клеток, отличающийся тем, что подготовленный образец биологической жидкости пропускают через кремниевую микроканальную матрицу со сквозными отверстиями квадратного сечения размером 3-30 мкм и длиной каналов 50-300 мкм со скоростью 0,1-4 мл/мин, при этом, в случае разделения клеток по размеру, фракцию клеток, имеющих размер меньше, чем размер сквозных отверстий в матрице, собирают после прохождения микроканальной матрицы, а более крупные клетки элюируют с каналов микроканальной матрицы обратным током элюента, а в случае рецептор-специфичного выделения клеток поверхность матрицы предварительно модифицируют антителами против специфических рецепторов клеток, а целевые клетки элюируют с каналов матрицы изотипическими иммуноглобулинами или гаптенами.1. A method for selectively isolating a population of viable cells from biological fluids using a microfluidic device, comprising preparing a sample, passing the latter through a cell with a microchannel matrix, followed by collecting and analyzing the isolated cells, characterized in that the prepared biological fluid sample is passed through a silicon microchannel matrix with through openings of square section 3-30 μm in size and 50-300 μm channel length at a speed of 0.1-4 ml / min, while in the case of divided cells in size, the fraction of cells having a size smaller than the size of the through holes in the matrix is collected after passing through the microchannel matrix, and larger cells are eluted from the channels of the microchannel matrix with a reverse eluent, and in the case of receptor-specific cell isolation, the matrix surface is pre-modified antibodies against specific cell receptors, and target cells elute from the matrix channels with isotypic immunoglobulins or haptens. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в случае, когда биологической жидкостью является кровь, последнюю разводят в 0,2-5 раз буферным раствором, содержащим 20-50 мМ ЭДТА.2. The method according to claim 1, characterized in that in the case when the biological fluid is blood, the latter is diluted 0.2-5 times with a buffer solution containing 20-50 mm EDTA. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве элюента используют буферный раствор, содержащий 20-50 мМ ЭДТА. 3. The method according to claim 1, characterized in that as the eluent use a buffer solution containing 20-50 mm EDTA.

Images