RU2423524C1 - Method of whole blood hla-typing - Google Patents
Method of whole blood hla-typing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2423524C1 RU2423524C1 RU2009149410/10A RU2009149410A RU2423524C1 RU 2423524 C1 RU2423524 C1 RU 2423524C1 RU 2009149410/10 A RU2009149410/10 A RU 2009149410/10A RU 2009149410 A RU2009149410 A RU 2009149410A RU 2423524 C1 RU2423524 C1 RU 2423524C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- solution
- hla
- pcr
- membrane
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Способ HLA-типирования цельной крови относится к области медицины, биотехнологии и генной инженерии.The HLA typing method for whole blood relates to the field of medicine, biotechnology and genetic engineering.
Быстрое развитие биотехнологии привело к созданию и развитию направления на стыке физико-химических и биомедицинских областей. Для восстановления утраченной структуры или функции органов все шире используются новые методы, основанные на применении клеточной трансплантологии тканевой инженерии. Клеточная трансплантология подразумевает использование для терапии клеточных продуктов. Тканевая инженерия подразумевает конструирование живых эквивалентов тканей или органов ex vivo с последующей трансплантацией в организм. Полный спектр задач в этой области включает доставку к пораженным участкам тела биосовместимых материалов, стволовых клеток, а также сигнальных молекул, инициирующих регенеративные процессы на клеточном уровне.The rapid development of biotechnology has led to the creation and development of a direction at the junction of physico-chemical and biomedical areas. To restore the lost structure or function of organs, new methods are increasingly being used based on the use of cell transplantology of tissue engineering. Cell transplantology implies the use of cellular products for therapy. Tissue engineering involves the construction of living equivalents of tissues or organs ex vivo, followed by transplantation into the body. A full range of tasks in this area includes the delivery of biocompatible materials, stem cells, and also signaling molecules initiating regenerative processes at the cellular level to the affected areas of the body.
Цельная кровь - это и периферическая и пуповинная/плацентарная кровь. Пуповинная кровь известна как богатый источник гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), которые все чаще используют для эффективного лечения разных заболеваний. Несформировавшиеся клетки пуповинной крови могут служить альтернативой костному мозгу при аллогенной трансплантации ГСК. Открытие коммерческих банков стволовых клеток позволяет сохранять пуповинную кровь ребенка в течение многих лет, обеспечивая, таким образом, его биологическую страховку. Организация таких банков требует разработки совершенной методики обработки и замораживания образца, которая способна обеспечить наибольшую сохранность клеток.Whole blood is both peripheral and umbilical / placental blood. Cord blood is known as a rich source of hematopoietic stem cells (HSCs), which are increasingly used for the effective treatment of various diseases. Unformed umbilical cord blood cells can serve as an alternative to bone marrow during allogeneic HSC transplantation. The opening of commercial stem cell banks allows preserving the umbilical cord blood of a child for many years, thus ensuring its biological insurance. The organization of such banks requires the development of a perfect method for processing and freezing the sample, which is able to ensure the highest preservation of cells.
Лимитирующим фактором при трансплантации ГСК является система главного комплекса гистосовместимости - HLA-система (Human Leukocyte Antigen - человеческий лейкоцитарный антиген) - это набор антигенов на поверхности лейкоцитов, который определяет основную функцию лейкоцитов - иммунный ответ. Благодаря таким свойствам HLA-системы, как полиморфизм, полигенность и кодоминантный тип экспрессии, набор лейкоцитарных рецепторов отличается у каждого человека. Для успешной трансплантации и приживления новых клеток необходимо максимальное совпадение HLA-системы у донора и реципиента. Проведение HLA-типирования очень важно при создании регистра доноров пуповинной крови. HLA-диагностика или тканевое типирование применяется для решения вопросов трансплантации костного мозга и органов для диагностики наследственных заболеваний, ассоциированных с генами главного комплекса гистосовместимости (болезни Бехтерева, сахарного диабета, цилиакии, рассеянного склероза и т.д.), а также в диагностике некоторых форм бесплодия, связанных с совпадениями HLA у супругов.The limiting factor in HSC transplantation is the system of the main histocompatibility complex - the HLA system (Human Leukocyte Antigen - a human leukocyte antigen) - a set of antigens on the surface of leukocytes, which determines the main function of leukocytes - the immune response. Due to the properties of the HLA system, such as polymorphism, polygenicity, and the codominant type of expression, the set of leukocyte receptors is different in every person. For successful transplantation and engraftment of new cells, the maximum coincidence of the HLA system in the donor and recipient is necessary. HLA typing is very important when creating a cord blood donor registry. HLA diagnostics or tissue typing is used to solve bone marrow and organ transplantation for the diagnosis of hereditary diseases associated with the genes of the main histocompatibility complex (Ankylosing spondylitis, diabetes mellitus, cilia, multiple sclerosis, etc.), as well as in the diagnosis of some forms infertility associated with HLA matches in spouses.
В последнее десятилетие благодаря достижениям молекулярной биологии и генетики появилась возможность изучения не только антигенов HLA, но и кодирующих их генов. Разработанный несколько лет назад молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и применение его в ДНК-генотипировании аллелей HLA открыл перспективы в повышении эффективности изучения генетической предрасположенности к заболеваниям, что позволяет выявлять случаи более высокого относительного риска развития патологии, быстро и объективно проводить обследование значительных контингентов населения, а также проводить обследование здоровых сибсов с целью прогноза развития целого ряда заболеваний, например инсулинозависимого сахарного диабета, в семьях с высокой заболеваемостью.In the last decade, thanks to the achievements of molecular biology and genetics, it became possible to study not only HLA antigens, but also the genes encoding them. The molecular genetic method of polymerase chain reaction (PCR), developed several years ago and its application in DNA genotyping of HLA alleles, has opened up prospects for increasing the efficiency of studying the genetic predisposition to diseases, which makes it possible to identify cases of a higher relative risk of pathology, and to quickly and objectively examine significant contingents of the population, as well as an examination of healthy siblings in order to predict the development of a number of diseases, for example, insulinosis diabetes mellitus, in families with a high incidence.
Определение антигенов системы HLA проводят несколькими способами. Молекулярный метод HLA-типирования использует в настоящее время три основные технологии идентификации ДНК: 1- SSP, 2 - SSO, 3-Секвенирование. Типирование антигенное - это совокупность методов серологических исследований антигенной структуры клеток в отношении определенных групп антигенов, применяется при определении тканевой совместимости.The determination of HLA system antigens is carried out in several ways. The molecular method of HLA typing currently uses three main DNA identification technologies: 1 - SSP, 2 - SSO, 3-Sequencing. Antigenic typing is a set of methods for serological studies of the antigenic structure of cells in relation to certain groups of antigens; it is used in determining tissue compatibility.
SSP (Sequnce Specific Primers)-НLА-типирование называется так потому, что искомые HLA, участки ДНК улавливаются специфическими праймерами в процессе амплификации. На первом этапе этого метода необходимо выделить ДНК из исследуемого образца крови, костного мозга или ткани. Затем следует этап ДНК-амплификации в термоциклере. ДНК раскапывается в лунки ПЦР планшета, каждая из которых содержит праймеры определенной специфичности. Количество лунок (ПЦР реакции) определяют количеством типируемых локусов и количеством аллельных вариантов в каждом локусе. Так, например, для низкоразрешающего (скринингового) типирования локуса DR определяют около 24 специфичностей (24 лунки ПЦР планшета). После амплификации ампликоны переносятся в лунки агарозного геля, где проводится электрофорез, В тех лунках, где специфичности праймеров совпали со специфическими участками ДНК видят полосу продукта геля. По таблице интерпретации или при помощи программы определяют какой HLA-аллели она соответствует. Этот метод позволяет разделить аллели, т.к. амплификация гена происходит в лунках с разными праймерами, специфичными к полиморфным последовательностям. Индентификация гена происходит по наличию продукта ПЦР. Визуализацию продуктов ПЦР производят электрофоретическим разделением в агарозном геле, см. статью «HLA-типирование и анализ предшествующих анти-HLA антител» WWW.BOCHEMMACK.RU.SSP (Sequnce Specific Primers) -HLA typing is called so because the desired HLA, regions of DNA are captured by specific primers during amplification. At the first stage of this method, it is necessary to isolate DNA from the test sample of blood, bone marrow or tissue. This is followed by the step of DNA amplification in a thermal cycler. DNA is dug into the wells of a PCR plate, each of which contains primers of a specific specificity. The number of wells (PCR reaction) is determined by the number of typed loci and the number of allelic variants at each locus. So, for example, for low-resolution (screening) typing of the DR locus, about 24 specificities are determined (24 wells of a PCR plate). After amplification, the amplicons are transferred to the wells of the agarose gel where electrophoresis is carried out. In those wells where the specificities of the primers coincide with the specific regions of the DNA, a strip of gel product is seen. Using the interpretation table or using a program, it is determined which HLA alleles it corresponds to. This method allows you to split alleles, because gene amplification occurs in wells with different primers specific for polymorphic sequences. Identification of a gene occurs by the presence of a PCR product. Visualization of PCR products is carried out by agarose gel electrophoretic separation, see the article “HLA typing and analysis of previous anti-HLA antibodies” WWW.BOCHEMMACK.RU.
Недостатками такого способа HLA-типирования является его низкая производительность. В 96-луночный термоциклер при низкоразрешающем типировании можно поместить только один образец (DR-локус - 24 пробирки, А локус - 24 пробирки, В локус - 48 пробирок). Время, затраченное таким образом на типирование одного образца, например, по А, В, DR от выделения ДНК до интерпретации результатов составит 3 часа. За день можно лишь протипировать 2-3 человека. Способ описан слишком схематично, не раскрыта технология выделения ДНК, не указана проверка ее концентрации, не раскрыта конкретная методика определения HLA-типирования образцов ДНК кровиThe disadvantages of this method of HLA-typing is its low productivity. With a low-resolution typing, only one sample can be placed in a 96-well thermal cycler (DR locus — 24 tubes, A locus — 24 tubes, 48 tubes at the locus). The time spent in this way on typing one sample, for example, according to A, B, DR from DNA extraction to interpretation of the results will be 3 hours. Only 2-3 people can be typed per day. The method is described too schematically, the technology for DNA extraction is not disclosed, verification of its concentration is not indicated, the specific method for determining HLA typing of blood DNA samples is not disclosed.
В литературных источниках по теме HLA-типирования имеются краткие сообщения о молекулярно-генетическом HLA-типировании с использованием метода ПЦР, например, по адресу http.//www.biochemmack. ru/userful/articles/hla_tiping/, но самым близким решением является описанное в разделе Системы для HLA-генотипирования в реферате диссертации Болдыревой М.Н. на соискание ученой степени доктора медицинских наук сообщение о HLA-генотипировании. Из перифрической крови методом высаливания выделяли геномную ДНК. Полученные образцы ДНК сразу используют для генотипирования либо хранят при -20°С. Концентрацию ДНК определяют по флуоресценции на мини-флуориметре. HLA-генотипирование образцов ДНК проводят методом мультпраймерной полимеразной цепной реакции. Для типирования генов HLA класса 11 (DRBI, DQAI, DQBI) использовали наборы HLA - ДНК-Тех. Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца ДНК и концентрации компонентов. 0,2 мМ каждого дНТФ(дАТФ, ДЦТФ, дТТФ, дГТф), 67 мМ Трис-НСl(рН 8,8), 2,5 mM MgCl, 50 mM NaCl, 1 mM 2-меркаптоэтанола, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Амплификацию проводят на многоканальном термоциклере «МС2» (НПФ «ДНК-Технология», Москва). Типирование локуса DRBI проводят в два этапа. В первом этапе геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках. В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRBI, а во второй - пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR03,05, 06,08. В обоих случаях выдерживался температурный режим амплификации с параметрами по времени и количеству циклов. На втором этапе проводилось точное регулирование с температурным режимом с параметрами по времени и числу циклов. Типирование локуса DQAI проводят также в два этапа, в которых использовались праймеры, амплифицирующие со своей специфичностью со своими температурным режимом, временем и количеством циклов. Типирование локуса DQBI также проводят в два этапа с использованием праймеров, амплифицирующих все специфичности для этого локуса со своими параметрами по температуре, времени и количеству циклов.Literary sources on the subject of HLA typing contain brief reports on molecular genetic HLA typing using the PCR method, for example, at http.//www.biochemmack. com / userful / articles / hla_tiping /, but the closest solution is described in the section Systems for HLA genotyping in the abstract of the dissertation M. Boldyreva for the degree of Doctor of Medical Sciences report on HLA genotyping. Genomic DNA was isolated from peripheral blood by salting out. The obtained DNA samples are immediately used for genotyping or stored at -20 ° C. DNA concentration is determined by fluorescence on a mini-fluorimeter. HLA-genotyping of DNA samples is carried out by the method of multimer polymerase chain reaction. For typing of class 11 HLA genes (DRBI, DQAI, DQBI), HLA - DNA-Tech kits were used. The polymerase chain reaction was carried out in 10 μl of the reaction mixture containing 1 μl of the DNA sample and the concentration of the components. 0.2 mM of each dNTP (dATP, DCTF, dTTP, dGTf), 67 mM Tris-Hcl (pH 8.8), 2.5 mM MgCl, 50 mM NaCl, 1 mM 2-mercaptoethanol, and 1 unit of thermostable DNA polymerases. Amplification is carried out on a multi-channel thermal cycler "MS2" (NPF "DNA-Technology", Moscow). Typing of the DRBI locus is carried out in two stages. In the first step, genomic DNA was amplified in two different tubes. In the first tube, a pair of primers was used to amplify all known alleles of the DRBI gene, and in the second, a pair of primers was amplified only to alleles belonging to the DR03.05, 06.08 groups. In both cases, the temperature regime of amplification was maintained with parameters in time and the number of cycles. At the second stage, precise control was carried out with a temperature regime with parameters in time and the number of cycles. Typing of the DQAI locus is also carried out in two stages, in which primers were used that amplify with their specificity their temperature regime, time and number of cycles. Typing of the DQBI locus is also carried out in two stages using primers that amplify all the specificities for this locus with their parameters in terms of temperature, time and number of cycles.
После процесса амплификации осуществляют визуализацию продуктов ПЦР посредством электрофореза. В каждую лунку 3% агарозного геля под буфер вносят по 5 мкл окрашенного амплификата. Окрашивание геля проводят бромистым этидием. Электрофорез проводят при напряжении 200-250 В. После проведения электрофореза гель вынимают из прибора и просматривают на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. В качестве маркера длин используют перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp 1.After the amplification process, the PCR products are visualized by electrophoresis. In each well of 3% agarose gel, 5 μl of stained amplification is added under buffer. Gel staining is carried out with ethidium bromide. Electrophoresis is carried out at a voltage of 200-250 V. After electrophoresis, the gel is removed from the device and viewed on a transilluminator in transmitted ultraviolet light with a wavelength of 254 nm. The amplification product is visible as a luminous strip of red-orange color. As a marker of lengths, a digest of plasmid pUC19 with restriction enzyme Msp 1 is used.
Недостатками такого решения HLA-типирования крови являются: концентрация ДНК при выделении методом высаливания составляет 50-100 мкг/мл, что недостаточно для более точного ее определения, отсутствует оценка качества чистоты ДНК, т.к. примеси и белковые компоненты могут препятствовать процессу ПЦР, процесс HLA-типирования проводят в несколько стадий, что занимет много времени при одинаковом результате определения генотипирования. Визуалиацию продуктов ПЦР проводят в агарозном геле при напряжении 200-250 В. Большое напряжение приводит к нагреву буфера в электрофоретической ячейке, что негативно влияет на расхождение фрагментов ДНК и может привести к неверной интерпретации результатов.The disadvantages of such a solution of HLA-typing of blood are: the concentration of DNA during isolation by salting out is 50-100 μg / ml, which is not enough to more accurately determine it, there is no assessment of the quality of DNA purity, because impurities and protein components can interfere with the PCR process; the HLA typing process is carried out in several stages, which takes a lot of time with the same result of determining genotyping. Visualization of PCR products is carried out on an agarose gel at a voltage of 200-250 V. High voltage leads to heating of the buffer in the electrophoretic cell, which negatively affects the discrepancy of DNA fragments and can lead to incorrect interpretation of the results.
Техническим результатом изобретения является повышение надежности определения результатов HLA-генотипирования, сокращение времени для быстрого типирования донорской крови, улучшение качества чистоты выделения ДНК, повышение технологичности с уменьшением экономических затрат при использовании современного импортного оборудования с высокой степенью автоматизации и эффективных программ.The technical result of the invention is to increase the reliability of determining the results of HLA genotyping, reduce the time for fast typing of donated blood, improve the quality of DNA purity, increase manufacturability with reduced economic costs when using modern imported equipment with a high degree of automation and effective programs.
Этот результат достигается тем, что в способе HLA-типирования цельной крови, включающем выделение ДНК из крови с промежуточным хранением ее образцов, проверку концентрации ДНК и осуществление HLA-генотипирования образцов ДНК крови посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) путем проведения амплификации на термоциклере, а после процесса амплификации осуществляют с помощью агарозного геля с его окрашиванием бромистым этидием визуализацию продуктов ПЦР и маркера с использованием электрофореза в проходящем ультрафиолетовом свете, при выделении ДНК из крови в первую пробирку вливают 0,7 мл исследуемой цельной крови, раствор буфера ELB А, предварительно охлажденного до температуры +4°С, инкубируют их на шейкере в течение 15', центрифугируют смесь при 3000 g 1', удаляют супернатант и эритроциты, оставляя лейкоциты в пробирке после центрифугирования, в пробирку добавляют 1 мл раствора буфера ELB В, охлажденного предварительно до температуры +4°С, ресуспендируют содержимое пробирки на вортексе до растворения осадка, центрифугируют с ускорением 2000g в течение 2' и удаляют супернатант и остатки эритроцитов, затем к оставшемуся осадку добавляют 400 мкл раствора буфера LBS, ресуспендируют осадок на вортексе, инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере в течение 15' до полного растворения осадка, добавляют 400 мкл раствора TBS и перемешивают содержимое в пробирке на вортексе с получением образца, далее во вторую пробирку помещают колонку с мембраной, в центр мембраны с помощью электронного дозатора вносят раствор полученного образца из первой пробирки, инкубируют их при комнатной температуре в течение 1', центрифугируют с ускорением 10000g в течение 2', после чего удаляют фильтрат, помещают во вторую пробирку колонку с мембраной с полученной ДНК, осевшей на мембране, добавляют 600 мкл раствора буфера WB MS, центрифугируют 1' с ускорением 10000g, повторяя процедуру отмывания с удалением фильтрата, добавлением в пробирку с установленной в ней мембраной с ДНК 600 мкл раствора этого же буфера и центрифугированием с такими же параметрами, вновь повторяют ту же процедуру, но при центрифугировании 18000g в течение 2', затем вставляют колонку с мембраной с осевшей на мембране ДНК в третью пробирку, добавляют 200 мкл подогретого в термоблоке до 60°С раствора буфера DEB, элюирующего ДНК, инкубируют их, центрифугируют смесь с ускорением 6000g в течение 1', получая образцы чистой ДНК, при невозможности немедленного использования элюированной ДНК хранят последнюю в течение двух недель при температуре +4°С или при температуре -20°С в течение продолжительного времени, проверку концентрации ДНК в растворе осуществляют на спектрофотометре, вставляют в него микрокювету на 75 мкл с чистой бидистиллированной водой, в микропробирку с 49 мкл бидистиллированной воды вносят 1 мкл раствора ДНК, тщательно размешивают и выливают полученный раствор в новую микрокювету, установив ее в спектрофотометр, проводят анализ на концентрацию ДНК в растворе, смешивание растворов для проведения процесса полимеразной цепной реакции осуществляют в ПЦР-боксе, устанавливая в нем и облучая ультрафиолетовым светом рабочую станцию, предварительно охлажденную до -20°С, размещают в станции планшету с лиофилизированными праймерами HLA-A*,-B*,-DRBI*, приготавливают в ПЦР-боксе смесь буферов D 280 мкл, 560 мкл Y и 6,5 мкл Taq Polymerase 5 ед/мкл, перемешивая ее на вортексе, вносят 10 мкл раствора в лунку с негативным контролем, добавляют 1 мкг образца ДНК в смесь, перемешивают полученный раствор на вортексе и вносят последний раствор в лунки планшета, помещают планшету с образцами в термоциклер по установленной программе с осуществлением стадий действий денатурации, отжигов и элонгации с параметрами по времени, температурам и количеству циклов, после окончания амплификации планшету из термоциклера ставят в холодильник с температурой +4°С до проверки в течение 2-х дней или в морозильную камеру при долгом хранении, визуализацию результатов ПЦР осуществляют посредством 2% раствора агарозы с буфером ТАЕ, разведенных в бидистиллированной воде, сваренного в микроволновой печи, охлажденного до 60°С и окрашенного раствором 10 мкл бромистого этидия, затем вливают расплавленную агарозу с бромистьм этидием в подложку для геля и охлаждают его до застывания, помещают застывший гель в подложке в электрофоретическую ячейку, наливают буфер 50 мкл 50×ТАЕ, смешанный с 2,450 л бидистиллированной воды, заполняя все лунки, раствор из планшеты с амплифицированными образцами ПЦР переносят в лунки агарозного геля, при этом в каждую полоску лунок в геле вносят маркер молекулярного веса ДНК 50-1000 пар нуклеотидов, подключают электрофоретическую ячейку к источнику питания, осуществляя электрофорез в течение 20 минут при 170 В, после окончания его выполняют снимок геля и заносят результаты ПЦР в протокол.This result is achieved by the fact that in the method of HLA-typing of whole blood, including the extraction of DNA from blood with intermediate storage of its samples, checking the DNA concentration and performing HLA-genotyping of blood DNA samples by polymerase chain reaction (PCR) by amplification on a thermal cycler, and after the amplification process, the PCR products and the marker are visualized using agarose gel with its staining with ethidium bromide using electrophoresis in transmitted ultraviolet light, at When dividing DNA from the blood, 0.7 ml of the investigated whole blood is poured into the first tube, a solution of ELB A buffer, pre-cooled to + 4 ° C, incubated on a shaker for 15 ', the mixture is centrifuged at 3000 g 1', the supernatant is removed and erythrocytes, leaving leukocytes in the tube after centrifugation, add 1 ml of ELB B buffer solution, previously cooled to + 4 ° С, to the tube, resuspend the contents of the tube on the vortex until the precipitate dissolves, centrifuges with an acceleration of 2000g for 2 'and remove the supernatant and leave erythrocyte attacks, then 400 μl of LBS buffer solution is added to the remaining precipitate, the suspension is resuspended in a vortex, incubated with constant stirring on a shaker for 15 ′ until the precipitate is completely dissolved, 400 μl of TBS solution is added and the contents are mixed in a vortex tube to obtain a sample, then a column with a membrane is placed in the second test tube, a solution of the obtained sample from the first test tube is introduced into the center of the membrane using an electronic dispenser, they are incubated at room temperature for 1 ', centrifuged with rhenium 10000g for 2 ', after which the filtrate is removed, a column with a membrane with the obtained DNA deposited on the membrane is placed in the second test tube, 600 μl of WB MS buffer solution are added, centrifuged 1' with an acceleration of 10000g, repeating the washing procedure to remove the filtrate, by adding into a test tube with a 600 μl DNA membrane in it and centrifuged with the same parameters, repeat the same procedure again, but centrifuged at 18000g for 2 ', then insert a column with a membrane with a third deposited on the membrane test tube, add 200 μl of a DEB buffer eluting in a thermoblock to 60 ° C, incubate them, centrifuge the mixture with an acceleration of 6000g for 1 'to obtain samples of pure DNA, and if it is impossible to immediately use the eluted DNA, store the latter for two weeks at a temperature of + 4 ° C or at a temperature of -20 ° C for a long time, the concentration of DNA in the solution is checked on a spectrophotometer, a 75 μl microcuvette with clean double-distilled water is inserted into it, in a microtube with 49 μl bi 1 ml of DNA solution is added to the purified water, the solution is thoroughly stirred and the resulting solution is poured into a new microcuvette by installing it in a spectrophotometer, the DNA concentration in the solution is analyzed, the solutions are mixed for the polymerase chain reaction process in a PCR box, installed in it and irradiated ultraviolet light, the workstation pre-cooled to -20 ° C is placed in the station a plate with lyophilized primers HLA-A *, - B *, - DRBI *, a mixture of buffers D 280 μl, 560 μl Y and 6, is prepared in a PCR box. 5 mk l Taq Polymerase 5 u / μl, mixing it on a vortex, add 10 μl of the solution to the negative control well, add 1 μg of the DNA sample to the mixture, mix the resulting solution on the vortex and add the last solution to the wells of the tablet, place the sample plate in the thermal cycler according to the established program with the implementation of the steps of denaturation, annealing and elongation with parameters in time, temperature and number of cycles, after amplification is completed, the tablet from the thermal cycler is placed in a refrigerator with a temperature of + 4 ° С until it is checked for 2 it or in the freezer during long-term storage, the PCR results are visualized by means of a 2% agarose solution with TAE buffer diluted in double-distilled water, microwaved, cooled to 60 ° C and stained with 10 μl of ethidium bromide solution, then molten agarose is poured with ethidium bromide in the gel support and cool it to solidification, place the gel in the support in the electrophoretic cell, pour 50 μl of 50 × TAE buffer mixed with 2.450 l of double-distilled water, filling all the wells, the solution from the tablet with amplified PCR samples is transferred to the wells of an agarose gel, while a DNA molecular weight marker of 50-1000 nucleotides is added to each strip of the wells, the electrophoretic cell is connected to a power source, performing electrophoresis for 20 minutes at 170 V, after at the end of it, they take a picture of the gel and record the results of PCR in the protocol.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention consists in the combination of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.
Существенными признаками предложенного способа определения HLA-типирования цельной крови являются: А - выделение ДНК из крови с промежуточным хранением ее образцов; Б - проверка концентрации ДНК; В - осуществление HLA-генотипирования образцов ДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) путем проведения амплификации на термоциклере; Г - после процесса амплификации осуществляют с помощью агарозного геля с его окрашиванием бромистым этидием визуализацию продуктов ПЦР и маркера с использованием электрофореза в проходящем ультрафиолетовом свете.The essential features of the proposed method for determining HLA typing of whole blood are: A - DNA extraction from blood with intermediate storage of its samples; B - DNA concentration check; B - the implementation of HLA-genotyping of DNA samples by means of polymerase chain reaction (PCR) by amplification on a thermal cycler; G - after the amplification process is carried out using an agarose gel with its staining with ethidium bromide visualization of PCR products and marker using electrophoresis in transmitted ultraviolet light.
Существенными отличительными признаками предложенного способа являются: Д - при выделении ДНК из крови в первую пробирку вливают 0,7 мл исследуемой цельной крови, раствор буфера ELB А, предварительно охлажденного до температуры +4°С; Е - инкубируют их на шейкере в течение 15', центрифугируют при 3000g 1', удаляют супернатант и эритроциты, оставляя лейкоциты в пробирке после центрифугировании; Ж - в эту же пробирку добавляют 1 мл раствора буфера ELB В, охлажденного предварительно до температуры +4°С, ресуспендируют содержимое пробирки на вортексе до растворения осадка, центрифугируют с ускорением 2000g в течение 2' и удаляют супернатант и остатки эритроцитов; И - к оставшемуся осадку добавляют 400 мкл раствора буфера LBS, ресуспендируют осадок на вортексе, инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере в течение 15' до полного растворения осадка, добавляют 400 мкл раствора TBS и перемешивают содержимое в пробирке на вортексе с получением образца; К - во вторую пробирку помещают колонку с мембраной, в центр мембраны с помощью электронного дозатора вносят раствор полученного образца из первой пробирки, инкубируют их в течение 1', центрифугируют с ускорением 10000g в течение 2', после чего удаляют фильтрат; Л - помещают во вторую пробирку колонку с мембраной с полученной ДНК, осевшей на мембране, добавляют 600 мкл раствора буфера WB MS, центрифугируют 1' с ускорением 10000g, повторяя процедуру отмывания с удалением фильтрата, добавлением в пробирку с установленной мембраной с ДНК 600 мкл раствора этого же буфера и центрифугированием с такими же параметрами; М - вновь повторяют ту же процедуру, но при центрифугировании 18000g в течение 2'; Н - вставляют колонку с мембраной с осевшей на мембране ДНК в третью пробирку, добавляют 200 мкл подогретого в термоблоке до 60°С раствора DEB, элюирующего ДНК, инкубируют их, центрифугируют смесь с ускорением 6000g в течение 1', получая образцы очищенной ДНК, при невозможности немедленного использования элюированной ДНК хранят последнюю в течение двух недель при температуре 4°С или при температуре -20°С в течение продолжительного времени; П - проверку концентрации ДНК в растворе осуществляют на спектрофотометре, вставляют в него микрокювету на 75 мкл с чистой бидистиллированной водой, в микропробирку с 49 мкл бидистиллированной воды вносят 1 мкл раствора ДНК, тщательно размешивают и выливают полученный раствор в новую микрокювету, устанавив ее в спектрофотометр; проводят анализ на концентрацию ДНК в растворе; Р - смешивание растворов для проведения процесса полимеразной цепной реакции осуществляют в ПЦР-боксе, устанавливая в нем и облучая ультрафиолетовым светом рабочую станцию, предварительно охлажденную до -20°С, размещают в станции планшету с лиолифизированными праймерами HLA-A*,-B*, -DRBI*, приготавливают в ПЦР-боксе смесь буферов из последнего набора D 280 мкл, 560 мкл Y и 6,5 мкл Taq Polymerase 5 ед/мкл, перемешивая ее на вортексе, вносят 10 мкл раствора в лунку планшеты с негативным контролем, добавляют 1 мкг образца ДНК в смесь, перемешивают полученный раствор на вортексе и вносят последний раствор в лунки планшеты; С - помещают планшету с образцами в термоциклер по установленной программе с осуществлением стадий действий денатурации, отжигов и элонгации с параметрами по времени, температурам и количеству циклов и после окончания процесса амплификации планшету из термоциклера ставят в холодильник с температурой +4°С до проверки в течение 2-х дней или в морозильную камеру при долгом хранении; Т - визуализацию результатов ПЦР осуществляют посредством 2% раствора агарозы с буфером ТАЕ, разведенных в бидистиллированной воде, сваренного в микроволновой печи, охлажденного до 60°С и окрашенного раствором 10 мкл бромистым этидием, затем вливают расплавленную агарозу с бромистым этидием в подложку для геля и охлаждают его до застывания, помещают застывший гель в подложке в электрофоретическую ячейку, наливают буфер 50 мл 50×ТАЕ, смешанный с 2,450 л бидистиллированной воды, заполняя все лунки, раствор из планшеты с амплифицированными образцами ПЦР переносят в лунки агарозного геля, при этом в каждую лунку в геле вносят маркер молекулярного веса ДНК 50-1000 пар нуклеотидов, подключают электрофоретическую ячейку к источнику питания, осуществляя электрофорез в течение 20' при 170 В, после окончания его выполняют снимок геля и заносят результаты ПЦР в протокол.The salient features of the proposed method are: D — when isolating DNA from the blood, 0.7 ml of the investigated whole blood is poured into the first tube, a solution of ELB A buffer, pre-cooled to a temperature of + 4 ° C; E - incubate them on a shaker for 15 ', centrifuge at 3000g 1', remove the supernatant and red blood cells, leaving white blood cells in vitro after centrifugation; G - add 1 ml of ELB B buffer solution, previously cooled to a temperature of + 4 ° С, to the same tube, resuspend the contents of the tube on a vortex until the precipitate dissolves, centrifuges with an acceleration of 2000g for 2 'and remove the supernatant and red blood cell residues; And - to the remaining precipitate add 400 μl of a solution of LBS buffer, resuspend the precipitate on a vortex, incubate with constant stirring on a shaker for 15 'until the precipitate is completely dissolved, add 400 μl of a TBS solution and mix the contents in a vortex tube to obtain a sample; K - a column with a membrane is placed in the second test tube, a solution of the obtained sample from the first test tube is introduced into the center of the membrane using an electronic dispenser, incubated for 1 ', centrifuged with an acceleration of 10000g for 2', after which the filtrate is removed; L - a column with a membrane with the obtained DNA deposited on the membrane is placed in the second test tube, 600 μl of WB MS buffer solution are added, centrifuged 1 'with an acceleration of 10,000 g, repeating the washing procedure to remove the filtrate, adding 600 μl of the solution to the installed membrane tube with DNA the same buffer and centrifugation with the same parameters; M - again repeat the same procedure, but with centrifugation of 18000g for 2 '; N - insert the column with the membrane with the DNA settled on the membrane into the third tube, add 200 μl of DEB solution eluting with DNA heated in a thermoblock to 60 ° С, incubate them, centrifuge the mixture with an acceleration of 6000g for 1 'to obtain samples of purified DNA, the inability to immediately use the eluted DNA is stored for two weeks at a temperature of 4 ° C or at a temperature of -20 ° C for a long time; P - the concentration of DNA in the solution is checked on a spectrophotometer, a microcuvette with 75 μl of pure bidistilled water is inserted into it, 1 μl of DNA solution is added to a microtube with 49 μl of bidistilled water, the resulting solution is thoroughly mixed and poured into a new microcuvette, placing it in a spectrophotometer ; analyze the concentration of DNA in solution; P - mixing solutions for the polymerase chain reaction process is carried out in a PCR box, installing a workstation pre-cooled to -20 ° C in it and irradiating it with ultraviolet light, place a tablet with HLA-A * lyophilized primers in the station, - B *, -DRBI *, prepare in a PCR box a mixture of buffers from the last set of D 280 μl, 560 μl Y and 6.5 μl Taq Polymerase 5 u / μl, mixing it on a vortex, add 10 μl of the solution to the well of the negative control plate, add 1 μg DNA sample in the mixture, mix the resulting solution while vortexing and make the latter solution into the wells of the plates; C - place the plate with the samples in the thermal cycler according to the established program with the implementation of the steps of denaturation, annealing and elongation with parameters in time, temperature and number of cycles, and after the amplification process is completed, the tablet from the thermal cycler is placed in a refrigerator with a temperature of + 4 ° С until verification 2 days or in the freezer for long-term storage; T - visualization of the PCR results is carried out by means of a 2% agarose solution with TAE buffer, diluted in double-distilled water, microwaved, cooled to 60 ° C and stained with 10 μl ethidium bromide solution, then molten ethidium bromide agarose is poured into the gel substrate and cool it to solidification, place the gel in a substrate in an electrophoretic cell, pour 50 ml of 50 × TAE buffer mixed with 2.450 l of double-distilled water, filling all wells, solution from a plate with amplified samples PCR is transferred to the wells of an agarose gel, while a DNA molecular weight marker of 50-1000 nucleotides is added to each well in the gel, the electrophoretic cell is connected to a power source, electrophoresis is carried out for 20 'at 170 V, after which the gel is taken and record the results of PCR in the protocol.
Способ HLA-типирования заключается в следующем. Вначале необходимо выделить ДНК из исследуемого образца цельной крови. При выделении ДНК из крови используют специальный набор с реагентами и элементами PROTRANS DNA Box 500, обеспечивающий процесс выделения ДНК. Поэтому в первую пробирку объемом 2 мл вливают 0,7 мл исследуемой цельной крови и раствор буфера ELB A (Ery Lysis Buffer A) из набора реагентов, предварительно охлажденного до температуры +4°С, инкубируют их на шейкере в течение 15' при комнатной температуре (18-20°С), эритроциты лопаются, остаются только лейкоциты, которые содержат ДНК. Центрифугируют смесь при 3000g в течение 1', удаляют супернатант, оставив нетронутым прозрачный опаллесцирующий осадок, представляющий собой белые клетки крови (лейкоциты), т.е. остатки эритроцитов (влияющих на загрязнение ДНК) в супернатанте удаляются, остается осадок лейкоцитов. Далее осуществляют отмыв от остатков эритроцитов. В пробирку с осадком добавляют 1 мл раствора буфера ELB В (Ery Lysis Buffer В) из набора реагентов Protrans DNA Box 500, охлажденного предварительно до температуры +4°С, ресуспендируют осадок (содержимое в пробирке) на вортексе - устройство, осуществляющее водоворотное перемешивание, до растворения осадка, центрифугируют с ускорением 2000g в течение 2' и удаляют супернатант. Затем к оставшемуся осадку добавляют 400 мкл раствора буфера LBS из этого же набора реагентов, ресуспендируют осадок на вортексе, инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере (устройство перемешивания покачиванием) в течение 15' до полного растворения осадка. Добавленный раствор растворяет мембраны клеток и высвобождает ДНК в раствор. Далее берут раствор TBS (Binding Solution) из набора, встряхивают его, добавляют 400 мкл его и перемешивают содержимое в пробирке на вортексе с получением образца до полной гомогенизации раствора. Этот раствор связывает ДНК, придает ей дополнительный заряд для связывания с мембраной. Во вторую пробирку объемом 2 мл помещают колонку с мембраной из этого же набора Protrans, в центр мембраны с помощью электронного дозатора вносят раствор полученного образца из первой пробирки, инкубируют их при комнатной температуре в течение 1'. ДНК связывается с мембраной, а остатки мембран и клеток проходят сквозь мембрану и удаляются. Центрифугируют содержимое во второй пробирке в течение 2' с ускорением 10000g, удаляют фильтрат, помещают во вторую пробирку колонку с мембраной с полученной ДНК, осевшей на мембране, добавляют 600 мкл раствора буфера WB MS (Wash Buffer) из набора реагентов и центрифугируют 1' с ускорением 10000g. ДНК промывают раствором, содержащим спирт, происходит очистка ДНК. Процесс отмывания повторяют дважды, т.е. удаляют фильтрат, помещают колонку с мембраной с ДНК, осевшей на мембране, во вторую пробирку, добавляют 600 мкл буфера WB VS и центрифугируют 1' при ускорении 10000g. Удаляют фильтрат, помещают колонку с мембраной с ДНК во вторую пробирку и центрифугируют ее содержимое с ускорением 18000g в течение 2'. Таким образом удаляют все остатки влаги. Затем вставляют колонку с мембраной и с осевшей на мембране ДНК в третью пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 200 мкл подогретого в термоблоке до 60°С раствора буфера DEB из набора, элюирующего ДНК, и инкубируют их при комнатной температуре. Центрифугируют смесь с ускорением 6000g в течение 1', получая образцы очищенной ДНК. Добавленный здесь раствор нарушает связь ДНК с мембраной и ДНК проходит сквозь поры мембраны и попадает в чистую пробирку. При невозможности немедленного использования элюированной ДНК ее хранят в течение 2-х недель при температуре 4°С или при температуре -20°С в течение продолжительного времени. Проверку концентрации ДНК в растворе осуществляют на спектрофотометре DU 800 (Becman Culter, США). Вначале проводят анализ чистой воды, чтобы в последующем сравнить с ней оптическую плотность в растворе ДНК. Вставляют в спектрофотометр микрокювету на 75мкл с чистой бидистиллированной водой. В микропробирке на 0,5 мл смешивают 49 мкл бидистиллированной воды с 1 мкл раствора ДНК, тщательно размешивают пипетированием и выливают полученный раствор в новую кювету, устанавливая ее в спектрофотометр, и проводят анализ на концентрацию ДНК. В спектрофотометре происходит считывание оптической плотности ДНК в ультрафиолете на длине волны 260 нм и белка на длине волны 280 нм и с оценкой их концентраций. По отношению концентраций определяется их чистота. Все результаты анализа заносятся в протокол исследования. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) смешивание растворов проводят в ПЦР-боксе, представляющем настольный бокс, в котором хранятся все необходимые расходные материалы, облучают элементы для обеззараживания ультрафиолетовым светом и проводят их промывку, чтобы не занести в исследуемый образец чужеродную ДНК (контаминировать). Достают из морозильной камеры (-20°С) рабочую станцию (Protrans PCR workstantion), представляющую пластину органического стекла с отверстиями для пробирок, поддерживающую долго низкую температуру, необходимую для проведения процесса ПЦР и не загрязняющую исследуемый образец ДНК (лучше, чем использование льда). На этой станции размещают планшету с лиолифизированными праймерами из следующего набора Protrans HLA-A* -В*, -DRBI* Cyclerplate, приготавливают в ПЦР-боксе смесь буферов из последнего набора D 280 мкл, 560 мкл Y и 6,5 мкл Taq Polymerase 5 ед/мкл. Эти растворы буферов необходимы для реакции, а полимераза - это фермент, синтезирующий ДНК. Перемешивают растворы на вортексе. Для негативного контроля в одну из лунок планшеты вносят 10 мкл перемешанного раствора буферов для проверки ДНК на наличие примесей. В смесь буферов с полимеразой добавляют 1 мкг образца ДНК, перемешивают их на вортексе. Вносят последний раствор в лунки планшеты, помещают планшету с образцами в термоциклер (My Cycler Bio-Rad, США) и по установленной программе осуществляют амплификацию по стадиям действий с соответствующими параметрами. Установленная программа показана в таблице.The method of HLA typing is as follows. First, it is necessary to isolate the DNA from the test sample of whole blood. When isolating DNA from the blood, a special kit with reagents and PROTRANS DNA Box 500 elements is used, which ensures the process of DNA extraction. Therefore, 0.7 ml of the studied whole blood is poured into the first 2 ml test tube and the ELB A buffer solution (Ery Lysis Buffer A) from the reagent kit, pre-cooled to + 4 ° C, is incubated on a shaker for 15 'at room temperature (18-20 ° C), red blood cells burst, only white blood cells that contain DNA remain. The mixture is centrifuged at 3000g for 1 ', the supernatant is removed, leaving a clear opalescent sediment, which is white blood cells (leukocytes), i.e. erythrocyte residues (affecting DNA pollution) in the supernatant are removed, and a white blood cell deposit remains. Then carry out washing from the remnants of red blood cells. Add 1 ml of ELB B solution (Ery Lysis Buffer B) from the Protrans DNA Box 500 reagent kit, pre-cooled to + 4 ° С to the tube with the pellet, resuspend the pellet (contents in the tube) on the vortex - a device performing vortex mixing, until the precipitate is dissolved, centrifuged with an acceleration of 2000g for 2 'and the supernatant is removed. Then, 400 μl of the LBS buffer solution from the same reagent kit was added to the remaining precipitate, the precipitate was resuspended on a vortex, incubated with constant stirring on a shaker (shaking stirrer) for 15 'until the precipitate was completely dissolved. The added solution dissolves the cell membranes and releases DNA into the solution. Next, take the TBS (Binding Solution) solution from the kit, shake it, add 400 μl of it and mix the contents in a vortex tube to obtain a sample until the solution is completely homogenized. This solution binds DNA, gives it an additional charge for binding to the membrane. A column with a membrane from the same Protrans kit is placed in a second 2 ml test tube, a solution of the obtained sample from the first test tube is introduced into the center of the membrane using an electronic dispenser, and they are incubated at room temperature for 1 '. DNA binds to the membrane, and the remains of the membranes and cells pass through the membrane and are removed. The contents are centrifuged in a second tube for 2 ′ with an acceleration of 10,000 g, the filtrate is removed, a column with a membrane of DNA obtained on the membrane is placed in a second tube, 600 μl of WB MS buffer solution (Wash Buffer) is added from the reagent kit and centrifuged for 1 s acceleration 10000g. DNA is washed with a solution containing alcohol, DNA is purified. The washing process is repeated twice, i.e. remove the filtrate, place the membrane column with the DNA deposited on the membrane in a second tube, add 600 μl of WB VS buffer and centrifuge 1 'at 10,000 g. The filtrate is removed, the column with the DNA membrane is placed in a second tube, and its contents are centrifuged with an acceleration of 18000g for 2 ′. In this way, all residual moisture is removed. A column with a membrane and with the DNA settled on the membrane is then inserted into a third 1.5 ml tube, 200 μl of a DEB buffer solution from the DNA elution kit, heated in a thermoblock to 60 ° C, are added and incubated at room temperature. Centrifuge the mixture with an acceleration of 6000g for 1 ', obtaining samples of purified DNA. The solution added here disrupts the binding of DNA to the membrane and the DNA passes through the pores of the membrane and enters a clean tube. If it is impossible to immediately use the eluted DNA, it is stored for 2 weeks at a temperature of 4 ° C or at a temperature of -20 ° C for a long time. The concentration of DNA in the solution is checked on a DU 800 spectrophotometer (Becman Culter, USA). First, an analysis of pure water is carried out in order to subsequently compare with it the optical density in a DNA solution. Insert a 75 μl microcuvette with pure bidistilled water into the spectrophotometer. In a 0.5 ml microtube, 49 μl of double-distilled water are mixed with 1 μl of a DNA solution, thoroughly mixed by pipetting and the resulting solution is poured into a new cuvette, placing it in a spectrophotometer, and DNA concentration is analyzed. The spectrophotometer reads the optical density of DNA in ultraviolet at a wavelength of 260 nm and a protein at a wavelength of 280 nm and with an assessment of their concentrations. The ratio of concentrations determines their purity. All analysis results are recorded in the study protocol. To carry out the polymerase chain reaction (PCR), the solutions are mixed in a PCR box, which is a table box, which stores all the necessary consumables, irradiates the elements with UV light for disinfection and flushes them so that foreign DNA is not introduced into the test sample (contaminate) . Remove from the freezer (-20 ° C) a workstation (Protrans PCR workstantion), which is a plate of organic glass with holes for tubes, maintaining a long low temperature necessary for the PCR process and not polluting the DNA sample being studied (better than using ice) . A plate with lyophilized primers from the following Protrans HLA-A * -B *, -DRBI * Cyclerplate set is placed at this station, a mixture of buffers from the last set D 280 μl, 560 μl Y and 6.5 μl Taq Polymerase 5 is prepared in a PCR box u / μl These buffer solutions are necessary for the reaction, and polymerase is an enzyme that synthesizes DNA. Vortex the solutions. For negative control, 10 μl of a mixed buffer solution is added to one of the wells of the plate to check the DNA for impurities. In a mixture of buffers with polymerase add 1 μg of a DNA sample, mix them on a vortex. The last solution is added to the wells of the plates, the plate with the samples is placed in a thermal cycler (My Cycler Bio-Rad, USA) and amplification is carried out according to the established program according to the stages of actions with the appropriate parameters. The installed program is shown in the table.
После окончания амплификации планшету из термоциклера ставят в холодильник с температурой +4°С до проверки в течение 2-х дней или в морозильную камеру при долгом хранении.After amplification is completed, the thermocycler plate is placed in a refrigerator with a temperature of + 4 ° С until verification for 2 days or in a freezer during long-term storage.
Визуализацию результатов ПЦР осуществляют посредством 2% раствора агарозы с буфером 1×TAE, разведенных в бидистиллированной воде. Агарозу расплавляют и варят в микроволновой печи, т.к. она растворяется только при высокой температуре, когда раствор кипит. Затем ее охлаждают до температуры 60°С и добавляют в нее 10 мкл раствора бромистого этидия (или этидиума бромида), окрашивая агарозу. Потом вливают расплавленную агарозу с бромистым этидием в подложку для геля и охлаждают до его застывания. Агароза при застывании превращается в лист толщиной несколько мм. Гребенки, установленные на подложке для геля агарозы, своими зубчиками делают отверстия в агарозе (лунки), куда добавляют амплификаты. Помещают застывший гель агарозы в подложке в электрофоретическую ячейку, наливают буфер 50 мл 50×ТАЕ, смешанный с 2,450 л бидистиллированной воды, заполняя все лунки агарозного геля. В каждую лунку в геле вносят маркер молекулярного веса ДНК 50-1000 пар нуклеотидов, подключают электрофоретическую ячейку к источнику питания, осуществляя электрофорез в течение 20 минут при напряжении 170 В. Под действием тока заряженная ДНК проходит сквозь пористый гель к отрицательному электроду, молекулы ДНК в геле расходятся в зависимости от своей массы. По наличию продукта в лунке и по сравнению со специфическими праймерами в данной лунке определяется HLA-генотип. После окончания электрофореза выполняют снимок геля и заносят результаты ПЦР в протокол.Visualization of the PCR results is carried out by means of a 2% agarose solution with 1 × TAE buffer diluted in bidistilled water. Agarose is melted and cooked in a microwave, as it dissolves only at high temperature, when the solution boils. Then it is cooled to a temperature of 60 ° C and 10 μl of a solution of ethidium bromide (or ethidium bromide) is added to it, staining agarose. Then molten agarose with ethidium bromide is poured into the gel substrate and cooled to solidify. When hardening, agarose turns into a sheet several mm thick. Combs mounted on an agarose gel substrate make holes in the agarose (wells) with their teeth, where amplifications are added. The solidified agarose gel is placed in a substrate in an electrophoretic cell, a buffer of 50 ml of 50 × TAE is added, mixed with 2.450 l of double-distilled water, filling all wells of the agarose gel. A DNA molecular weight marker of 50-1000 nucleotides is introduced into each well in the gel, an electrophoretic cell is connected to a power source, electrophoresis is carried out for 20 minutes at a voltage of 170 V. Under the action of a current, charged DNA passes through a porous gel to a negative electrode, the DNA molecules in gel diverge depending on its mass. The HLA genotype is determined by the presence of product in the well and compared with specific primers in this well. After electrophoresis is completed, a gel photograph is taken and the PCR results are recorded in the protocol.
Использование решения «Способ HLA-типирования цельной крови» по сравнению с прототипом повышает надежность определения результатов HLA-генотипирования, т.к. использованы стандартизованные аллель-специфические смеси праймеров, заранее разлитых в соответствующие лунки на микропланшете. Качество получаемых результатов типирования соответствует существующим в трансплантологии требованиям по типированию органов и костного мозга. Предложенный способ определения генотипирования очень хорошо подходит по затратам времени для быстрого типирования в экстренных случаях, например для определения качества донорской крови по гистосовместимости. Для запуска амплификации при проведении молекулярно-генетического метода полимеразной цепной реакции требуется внесение одного единственного реагента - смеси ДНК и фермента в буферной среде, что и экономично, и занимает меньше времени по сравнению с аналогичными способами определения человеческого лейкоцитарного антигена. В предложенном способе HLA-генотипирования цельной крови выделенная ДНК не имеет примеси и белковых фракций, которые бы влияли на проведение процесса полимеразной цепной реакции. Концентрация ДНК составляет 100-200 мкг/мл, такого количества достаточно для проведения нескольких тестов без повторного выделения. Для HLA-генотипирования пуповинной крови для трансплантации достаточно анализа трех локусов: HLA-A, HLA-B, HLA-DRBI. Весь процесс генотипирования проводят в одну стадию, в одной планшете, используя одну программу по методике и с помощью наборов Protrans HLA-A*, -В*, DRBI* Cyclerplate System, что и технологичней, и занимает меньше времени на исследования. Предложенный способ автоматизирован, использует современное оборудование высокого качества и надежности, на котором было проведено предприятием «ООО Покровский банк стволовых клеток» в городе Санкт-Петербург более 80 исследований и анализов высокого качества и надежности на определение HLA-типирования цельной крови, т.е. периферической и пуповинной крови.Using the solution "Method of HLA-typing of whole blood" in comparison with the prototype increases the reliability of determining the results of HLA-genotyping, because used standardized allele-specific mixtures of primers previously poured into the corresponding wells on the microplate. The quality of the typing results complies with the requirements for typing of organs and bone marrow existing in transplantology. The proposed method for determining genotyping is very well suited in terms of time for rapid typing in emergency cases, for example, for determining the quality of donor blood by histocompatibility. To start amplification during the molecular genetic method of polymerase chain reaction, one single reagent is required - a mixture of DNA and an enzyme in a buffer medium, which is economical and takes less time compared to similar methods for determining human leukocyte antigen. In the proposed method for HLA genotyping of whole blood, the isolated DNA has no impurities and protein fractions that would influence the polymerase chain reaction process. The DNA concentration is 100-200 μg / ml, this amount is enough to conduct several tests without re-isolation. For HLA genotyping of cord blood for transplantation, an analysis of three loci is sufficient: HLA-A, HLA-B, HLA-DRBI. The entire genotyping process is carried out in one stage, in one tablet, using one program according to the method and using the Protrans HLA-A *, -В *, DRBI * Cyclerplate System kits, which is more technologically advanced and takes less time to research. The proposed method is automated, it uses modern equipment of high quality and reliability, on which more than 80 studies and analyzes of high quality and reliability for the determination of HLA typing of whole blood were carried out by the Pokrovsky stem cell bank LLC in St. Petersburg peripheral and cord blood.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009149410/10A RU2423524C1 (en) | 2009-12-29 | 2009-12-29 | Method of whole blood hla-typing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009149410/10A RU2423524C1 (en) | 2009-12-29 | 2009-12-29 | Method of whole blood hla-typing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2423524C1 true RU2423524C1 (en) | 2011-07-10 |
Family
ID=44740356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009149410/10A RU2423524C1 (en) | 2009-12-29 | 2009-12-29 | Method of whole blood hla-typing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2423524C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013126906A1 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-29 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Method and system for concentrating particles from a solution |
| US8940092B1 (en) | 2008-10-27 | 2015-01-27 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Hybrid fibers, devices using hybrid fibers, and methods for making hybrid fibers |
| RU2585091C1 (en) * | 2015-01-19 | 2016-05-27 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for identification of anti-allogenic hla-g antibodies |
| US9518956B2 (en) | 2008-06-06 | 2016-12-13 | University Of Washington | Particle concentration system |
-
2009
- 2009-12-29 RU RU2009149410/10A patent/RU2423524C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BOYTON R.J. et al. HLA-C and Killer Cell Immunoglobulin-like Receptor Genes in Idiopathic Bronchiectasis, 2006, American journal of respiratory and critical care medicine, v.173, p.327-333. ИВАНОВ П.Л. и др. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел, найдено в Интернет <URL:www.MEDLITER.ru, 17.08.2010. Болдырева М.Н. «HLA (класс II) и естественный отбор. Функциональный генотип, гипотеза преимущества «функциональной гетерозиготности»: автореферат - М., 2007, стр.8. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9518956B2 (en) | 2008-06-06 | 2016-12-13 | University Of Washington | Particle concentration system |
| US8940092B1 (en) | 2008-10-27 | 2015-01-27 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Hybrid fibers, devices using hybrid fibers, and methods for making hybrid fibers |
| WO2013126906A1 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-29 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Method and system for concentrating particles from a solution |
| RU2585091C1 (en) * | 2015-01-19 | 2016-05-27 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for identification of anti-allogenic hla-g antibodies |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shi et al. | Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress | |
| USRE48240E1 (en) | Methods for testing milk | |
| Kuliev et al. | Thirteen years' experience of preimplantation diagnosis: report of the Fifth International Symposium on Preimplantation Genetics | |
| AU2016270823B2 (en) | Compositions and methods for screening T cells with antigens for specific populations | |
| Fragouli et al. | The cytogenetics of polar bodies: insights into female meiosis and the diagnosis of aneuploidy | |
| Bryant et al. | Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation | |
| EP3402902A2 (en) | Semi-permeable arrays for analyzing biological systems and methods of using same | |
| JP6234542B1 (en) | Method for obtaining chromosomal DNA derived from fetal cells | |
| RU2423524C1 (en) | Method of whole blood hla-typing | |
| EP1325963A1 (en) | Method for non-invasive diagnosis of transplantations and transfusions | |
| ES2745695T3 (en) | High resolution transcriptome of human macrophages | |
| EP3436606B1 (en) | Plasma derived cell-free mitochondrial deoxyribonucleic acid | |
| EP4215618A1 (en) | Method for analyzing cell epigenomics from multiple dimensions | |
| WO2020218554A1 (en) | Digital somatic cell variation analysis | |
| Yawata et al. | Practical considerations and workflow in utilizing KIR genotyping in transplantation medicine | |
| Ter-Ovanesyan | Investigation of RNA in Extracellular Vesicles | |
| Sha et al. | Germline Selection by Meiosis Defends the Transmission of defective Mitochondria with mtDNA variants | |
| Spierings et al. | Minor histocompatibility antigen typing by DNA sequencing for clinical practice in hematopoietic stem-cell transplantation | |
| Kroneis et al. | Laser capture and single cell genotyping from frozen tissue sections | |
| JP2018102289A (en) | Method for obtaining fetal cell chromosomal dnas | |
| Almamun et al. | Isolation of precursor B-cell subsets from umbilical cord blood | |
| Weymaere | Cell-based non-invasive prenatal testing: circulating trophoblast enrichment and genetic analysis | |
| Crazzolara et al. | Detection of residual donor erythroid progenitor cells after hematopoietic stem cell transplantation for patients with hemoglobinopathies | |
| Ibrahim et al. | Risk prediction genetic study of non-HLA gene NOD2 three polymorphisms in acute graft versus host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation | |
| Islam | Comparison of mutation spectrum, hemoglobin profiles and hematological features between transfusion dependent and non-dependent patients of Hb E/β Thalassemia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20121230 |