RU2416645C2 - Single-chain antibody binding tumour necrosis factor alpha, dna, plasmid dna and method for producing single-chained antibody - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention represents a single-chain antibody binding a human tumour necrosis factor alpha (FNO-α). Also, there are presented DNA, plasmid DNA, as well as a method for producing the antibody.

EFFECT: invention can be used for treating human autoimmune pathologies, such as rheumatoid arthritis and Crohn's disease.

7 cl, 2 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных производных антитела, специфического к фактору некроза опухолей альфа (ФНО-α) человека. Изобретение может быть использовано для лечения аутоиммунных патологий человека, таких как ревматоидный артрит и болезнь Крона.The invention relates to the field of biotechnology, specifically to the production of recombinant derivatives of an antibody specific for human tumor necrosis factor alpha (TNF-α). The invention can be used for the treatment of human autoimmune pathologies, such as rheumatoid arthritis and Crohn's disease.

Антитела, связывающие ФНО-α человека и блокирующие его взаимодействие с рецептором ФНО-α, являются важным терапевтическим средством при лечении таких тяжелых заболеваний, как анкилозирующий спондилит, болезнь Крона, ревматоидный артрит, являются мощным симптоматическим средством при терапии системной красной волчанки, тироидита, а также при отторжениии трансплантата (GVHD).Antibodies that bind human TNF-α and block its interaction with the TNF-α receptor are an important therapeutic agent in the treatment of severe diseases such as ankylosing spondylitis, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, are a powerful symptomatic agent in the treatment of systemic lupus erythematosus, thyroiditis, and also for transplant rejection (GVHD).

ФНО-α продуцируется широким спектром тканей и типов клеток, однако важнейшим продуцентом являются активированные макрофаги (Vassalli, Ann. Rev. Immunol. 10: 411-452 (1992)). ФНО-α является растворимым гомотримером, состоящим из 17-кДа субъединиц (Smith, et aL, J. Biol. Chem. 262: 6951-6954 (1987)). ФНО-α также существует в виде 26-кДа мембраносвязанной формы (Kriegler, et al., Cell 53: 45-53 (1988)). При нормальном ответе организма на внешние угрозы ФНО-α является мощным медиатором воспалительного процесса В патологических состояниях выброс ФНО-α сопровождается повреждением тканей, индукцией прокоагуляционной активности клеток сосудистого эндотелия, усиления адгезии нейтрофилов и лимфоцитов и выбросом фактора активации тромбоцитов из макрофагов, нейтрофилов и клеток сосудистого эндотелия (Pober, et al., J. Immunol. 136: 1680-1687 (1986); Pober, et al. J. Immunol. 138: 3319-3324 (1987); Camussi, et al. J. Exp. Med. 166: 1390-1404 (1987)).TNF-α is produced by a wide range of tissues and cell types, but activated macrophages are the most important producer (Vassalli, Ann. Rev. Immunol. 10: 411-452 (1992)). TNF-α is a soluble homotrimer consisting of 17 kDa subunits (Smith, et aL, J. Biol. Chem. 262: 6951-6954 (1987)). TNF-α also exists as a 26-kDa membrane-bound form (Kriegler, et al., Cell 53: 45-53 (1988)). With the normal response of the body to external threats, TNF-α is a powerful mediator of the inflammatory process. In pathological conditions, the release of TNF-α is accompanied by tissue damage, the induction of procoagulant activity of vascular endothelial cells, increased adhesion of neutrophils and lymphocytes and the release of platelet activation factor from macrophages, neutrophils and vascular cells endothelium (Pober, et al., J. Immunol. 136: 1680-1687 (1986); Pober, et al. J. Immunol. 138: 3319-3324 (1987); Camussi, et al. J. Exp. Med. 166: 1390-1404 (1987)).

Физиологическое и патологическое действие ФНО-а осуществляется при его связывании с двумя трансмембранными клеточными рецепторами, р55 и р75 (Hohmann, et al., J. Biol. Chem. 264: 14927-14934 (1989); Engelmann, et al. J. Biol. Chem. 265: 1531-1536 (1990)). Экстраклеточные домены этих рецепторов, полученные протеолизом или методами генетической инженерии, ингибируют действие ФНО-α (Kohno, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 8331-8335 (1990)).The physiological and pathological effect of TNF-a occurs when it binds to two transmembrane cell receptors, p55 and p75 (Hohmann, et al., J. Biol. Chem. 264: 14927-14934 (1989); Engelmann, et al. J. Biol Chem. 265: 1531-1536 (1990)). The extracellular domains of these receptors obtained by proteolysis or genetic engineering methods inhibit the action of TNF-α (Kohno, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 8331-8335 (1990)).

ФНО-α ассоциирован с целым рядом патологий, таких как неоплазии, инфекционные и аутоиммунные заболевания (Cerami, et al., Immunol. Today 9: 28-31 (1988); Oliff, et al., Cell 50: 555-563 (1987); Piguet, et al., J. Exp. Med. 166: 1280-1289 (1987)). Оверпродукция ФНО-α ответственна за патологические процессы при сепсисе, церебральной малярии и при аутоиммунных заболеваниях, таких как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системная красная волчанка и болезнь Крона.TNF-α is associated with a number of pathologies, such as neoplasia, infectious and autoimmune diseases (Cerami, et al., Immunol. Today 9: 28-31 (1988); Oliff, et al., Cell 50: 555-563 (1987 ); Piguet, et al., J. Exp. Med. 166: 1280-1289 (1987)). Overproduction of TNF-α is responsible for pathological processes in sepsis, cerebral malaria, and in autoimmune diseases such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and Crohn's disease.

Кроме того, ФНО-α может быть вовлечен в патогенез опухолей (см обзоры Zhang and Tracey, The Cytokine Handbook, Thomson AW (ed). pp 517-548 (1998)). ФНО-α может опосредовать кахексию при опухолях, инфекционных патологиях и других патологических катаболических состояниях (см обзор Tracey, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 587: 325-331 (1990)).In addition, TNF-α may be involved in the pathogenesis of tumors (see reviews Zhang and Tracey, The Cytokine Handbook, Thomson AW (ed). Pp 517-548 (1998)). TNF-α can mediate cachexia in tumors, infectious pathologies, and other pathological catabolic conditions (see review by Tracey, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 587: 325-331 (1990)).

Антитела, нейтрализующие активность ФНО-α, были описаны ранее. Такие антитела могут быть использованы для диагностики и терапии заболеваний, связанных с избыточной продукцией ФНО-α. Представителем группы терапевтических антител, нейтрализующих активность ФНО-α, является инфликсимаб (Ремикейд) (патенты США 5,656,272, 5,698,195, 5,919,452). Инфликсимаб используется для терапии следующих болезней:Antibodies that neutralize the activity of TNF-α have been described previously. Such antibodies can be used to diagnose and treat diseases associated with excess production of TNF-α. The representative of the group of therapeutic antibodies that neutralize the activity of TNF-α is infliximab (Remicade) (US patents 5,656,272, 5,698,195, 5,919,452). Infliximab is used to treat the following diseases:

Крона, ревматоидного артрита, псориатического артрита и анкилозирующего спондилита. Он также может использоваться для базовой или симптоматической терапии ряда патологий иммунной системы и хронических воспалительных процессов, таких как системная красная волчанка, тиреоидоз, аутоиммунный тиреоидит Хашимото, системная склеродерма, аутоиммунный диабет, болезнь Грейвса, язвенный колит, рассеянная сосудистая коагуляция, отторжение трансплантатов, саркоидоз, хроническое воспаление кишечника, атеросклероз и болезнь Кавасаки.Crohn, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis and ankylosing spondylitis. It can also be used for basic or symptomatic treatment of a number of pathologies of the immune system and chronic inflammatory processes, such as systemic lupus erythematosus, thyroidosis, Hashimoto's autoimmune thyroiditis, systemic scleroderma, autoimmune diabetes, Graves' disease, ulcerative colitis, disseminated vascular coagulation, coagulation, and coagulation , chronic intestinal inflammation, atherosclerosis, and Kawasaki disease.

Расширение спектра патологий, к которым применим инфликсимаб, ставит задачу повышения объемов его производства и понижения стоимости продукта. Вместе с тем, создание высокоэффективного продуцента антитела и получение конечного продукта являются дорогостоящими задачами, в силу чего себестоимость препарата весьма высока.Expanding the range of pathologies to which infliximab is applicable sets the task of increasing its production volumes and lowering the cost of the product. However, the creation of a highly effective producer of antibodies and obtaining the final product are expensive tasks, and therefore the cost of the drug is very high.

Производство Ремикейда началось более 15 лет назад, в силу чего, и принимая во внимание особенности цикла регистрации фармакопейных препаратов, для получения продуцента были использованы технологии начала 90-х или даже конца 80-х годов. Эти технологии весьма несовершенны и с точки зрения конструирования эффективного продуцента для повышения уровня продукции белка, и с точки зрения оптимизации экспрессии на уровне ДНК и РНК. За последние 5-7 лет появился ряд важных исследований, свидетельствующих о возможности значительного повышения уровня экспрессии целевого белка за счет манипуляций с кодирующей этот белок последовательностью. Показано, что на эффективную экспрессию влияет процент содержания CG-пар. РНК, богатые АТ-парами, менее стабильны и продуцируют меньше копий белка. Кроме того, на стабильность и интактность мРНК влияет целый ряд факторов, таких как наличие внутренних (аберрантных) сигналов сплайсинга, сайтов незаконного полиаденилирования, коротких открытых рамок считывания (микро-ОРС), длинных гомополимерных последовательностей и прочее (http://www.pubmedcentral.mh.gov/articlerender.fcgi?artid=137409 http://bidlab.life.nctu.edu.tw/RegRNA2/website/browse/index.php).The production of Remicade began more than 15 years ago, which is why, and taking into account the peculiarities of the registration cycle of pharmacopeia drugs, technologies of the early 90s or even the end of the 80s were used to obtain a producer. These technologies are very imperfect from the point of view of constructing an effective producer to increase the level of protein production, and from the point of view of optimization of expression at the level of DNA and RNA. Over the past 5-7 years, a number of important studies have appeared that indicate the possibility of a significant increase in the level of expression of the target protein due to manipulations with the sequence encoding this protein. It was shown that the percentage of CG pairs affects the effective expression. RNAs rich in AT pairs are less stable and produce fewer copies of the protein. In addition, a number of factors affect the stability and intactness of mRNAs, such as the presence of internal (aberrant) splicing signals, illegal polyadenylation sites, short open reading frames (micro-ORS), long homopolymer sequences, etc. (http: //www.pubmedcentral .mh.gov / articlerender.fcgi? artid = 137409 http://bidlab.life.nctu.edu.tw/RegRNA2/website/browse/index.php).

Важную роль могут играть тугоплавкие вторичные структуры мРНК, препятствующие эффективной трансляции областей тугоплавких шпилек РНК. Все эти факторы могут снижать уровень продукции интактной мРНК и уровень продукции белка в несколько раз [PMID: 14959831 geneart PMID: 16971027]. В приложении к антителам, оптимизация последовательности мРНК может повысить уровень продукции белка даже в оптимизированных по экспрессии продуцентах с высоким выходом целевого продукта [PMID: 17172660]. В приложении к Ремикейду задача оптимизации структуры мРНК для повышения уровня продукции белка ранее не решалась. Описанная в патенте США 6277969 последовательность антитела инфликсимаб не подвергалась оптимизации как минимум по нескольким из вышеперечисленных параметров.An important role can be played by the refractory secondary structures of mRNA, which impede the efficient translation of regions of refractory RNA hairpins. All these factors can reduce the level of production of intact mRNA and the level of protein production by several times [PMID: 14959831 geneart PMID: 16971027]. When applied to antibodies, mRNA sequence optimization can increase the level of protein production even in expression-optimized producers with high yield of the target product [PMID: 17172660]. In the annex to Remicade, the task of optimizing the structure of mRNA to increase the level of protein production has not been previously solved. The infliximab antibody sequence described in US Pat. No. 6,277,969 has not been optimized for at least a few of the above parameters.

Техническим результатом изобретения является создание последовательностей ДНК вариабельных частей антитела инфликсимаб (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), содержащих кодоны, оптимизированных для высокоэффективной продукции тяжелой и легкой цепей антитела инфликсимаб, и не содержащих критических сайтов сплайсинга, полиаденилирования, дополнительных открытых рамок считывания, автономно реплицирующихся элементов и сайтов узнавания РНК-связывающими белками.The technical result of the invention is the creation of DNA sequences of the variable parts of the antibody infliximab (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) containing codons optimized for highly efficient production of heavy and light chains of the antibody infliximab, and not containing critical splicing sites, polyadenylation, additional open reading frames, autonomously replicating elements, and recognition sites by RNA-binding proteins.

Способ получения антитела, связывающего человеческий фактор некроза опухоли, состоит в том, что в клетку-хозяина вводят плазмидную ДНК SEQ ID NO: 3, кодирующую кодон-оптимизированный вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела инфликсимаб с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, культивируют в среде культивирования в условиях, необходимых для продуцирования антитела, с дальнейшим выделением и очисткой указанного одноцепочного антитела, последовательности вариабельных участков которого имеют, по меньшей мере, 99,5%-99,9% идентичности с последовательностями вариабелыных участков легкой и тяжелой цепей антитела инфликсимаб.A method of producing an antibody that binds human tumor necrosis factor is that plasmid DNA of SEQ ID NO: 3 encoding a codon-optimized variable fragment of the heavy chain of the infliximab antibody with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is introduced into the host cell, cultured in medium cultivation under the conditions necessary for the production of antibodies, with the further isolation and purification of the specified single-chain antibodies, the sequences of the variable regions of which have at least 99.5% -99.9% identity with Therefore variabelynyh areas of light and heavy chains of the antibody infliximab.

Пример 1. Оптимизация последовательности мРНК, кодирующей вариабельные фрагменты тяжелой и легкой цепей антитела инфликсимаб.Example 1. Optimization of the mRNA sequence encoding the variable fragments of the heavy and light chains of the antibody infliximab.

Последовательность вариабельных фрагментов легкой цепи антитела инфликсимаб была подвергнута нескольким раундам оптимизации. Исходная последовательность, содержащая кодоны, характерные для генома мыши, была оптимизирована с учетом наиболее часто встречающихся кодонов китайского хомячка с использованием алгоритмов, описанных в работе [PMID: 16376569]. Была использована база данных часто встречающихся кодонов китайского хомячка (http://www.kazusa.or.ip/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=10029). После общей оптимизации использования кодонов в каждом положении был проведен отбор кодонов, характеризующихся одновременно частым использованием и высоким содержанием GС-пар. Например, наиболее часто употребляющиеся триплеты ССС и ССТ кодируют пролин с примерно одинаковой частотой. Для увеличения содержания GC-пар и понижения деградации мРНК из этих двух кодонов выбирался ССС. В ряде случаев, часто употребимые кодоны, полностью состоящие из АТ-нуклеотидов, заменялись вторыми по частоте встречаемости, но состоящими, в основном, из GC-нуклеотидов. Высокое содержание GС-пар эффективно снижает скорость деградации РНК, обеспечивая в клетке повышенный динамический уровень мРНК, кодирующей целевой белок.The sequence of variable fragments of the light chain of the infliximab antibody was subjected to several rounds of optimization. The initial sequence containing codons characteristic of the mouse genome was optimized taking into account the most common codons of the Chinese hamster using the algorithms described in [PMID: 16376569]. A database of frequently occurring codons of the Chinese hamster was used (http://www.kazusa.or.ip/codon/cgi-bin/showcodon.cgi? Species = 10029). After general optimization of the use of codons in each position, a selection of codons was carried out, characterized simultaneously by frequent use and high content of GC-pairs. For example, the most commonly used triplets of CCC and CCT encode proline with approximately the same frequency. To increase the content of GC pairs and reduce the degradation of mRNA, CCC was selected from these two codons. In a number of cases, frequently used codons entirely consisting of AT nucleotides were replaced by the second most frequent, but consisting mainly of GC nucleotides. The high content of GC pairs effectively reduces the rate of RNA degradation, providing an increased dynamic level of mRNA encoding the target protein in the cell.

По окончании работ с составом кодонов и процентом GC были проведены работы по детекции и удалению криптических донорных и акцепторных сатов сплайсинга мРНК. Сайты сплайсинга представляют собой участки РНК длиной 8-15 нуклеотидов, содержащие донорный (GT) или акцепторный (AG) сайты сплайсинга. Сплайсинг зрелой мРНК по таким криптическим аберрантным сайтам может значительно снижать уровень полноразмерных транскриптов. Анализ сайтов сплайсинга проводили при помощи нескольких различных алгоритмов (PMID: 9278062, PMID: 18269701 PMID: 11222768). Полученные данные использовали для внесения модификаций в оптимизированную по кодонам и GC-составу мРНК.Upon completion of the work with the composition of the codons and the percentage of GC, work was carried out to detect and remove cryptic donor and acceptor mats of mRNA splicing. Splicing sites are RNA regions 8-15 nucleotides in length containing donor (GT) or acceptor (AG) splicing sites. Splicing mature mRNA at such cryptic aberrant sites can significantly reduce the level of full-size transcripts. Splicing sites were analyzed using several different algorithms (PMID: 9278062, PMID: 18269701 PMID: 11222768). The data obtained were used to introduce modifications into the mRNA optimized for codons and GC composition.

Преждевременное полиаденилирование приводит к продукции аберрантных мРНК, не кодирующих целевой продукт. Для поиска криптических сайтов полиаденилирования в последовательностях вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей антитела инфликсимаб использовался алгоритм, описанный в работе PMID: 10231571. При обнаружении криптических сайтов полиаденилирования производили их удаление с помощью внесения вариаций в кодоны и повторного тестирования.Premature polyadenylation leads to the production of aberrant mRNAs that do not encode the target product. To search for cryptic polyadenylation sites in the sequences of variable fragments of the light and heavy chains of the infliximab antibody, we used the algorithm described in PMID: 10231571. When cryptic polyadenylation sites were detected, they were removed by introducing variations in the codons and retesting.

Присутствие CpG-островков в мРНК, как правило, не оказывает прямого влияния на эффективность экспрессии. Однако CpG-островки могут быть иммуногенны в составе векторной ДНК, а также могут иметь аберрантный паттерн метилирования [PMID: 16487676], что может негативно сказываться на эффективности экспрессии целевого белка. Поэтому в последовательностях с процентом GС-пар выше, чем 40-50, необходимо анализировать возможность появления CpG-островков и проводить их элиминирование. Анализ наличия CpG-островков проводили при помощи алгоритма, описанного в работе (Rice, P., Longden, I. and Bleasby, A. (2000) EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends Genet, 16, 276-277).The presence of CpG islands in mRNA, as a rule, does not directly affect expression efficiency. However, CpG islands can be immunogenic in the composition of vector DNA, and may also have an aberrant methylation pattern [PMID: 16487676], which can adversely affect the expression efficiency of the target protein. Therefore, in sequences with a percentage of GC pairs higher than 40–50, it is necessary to analyze the possibility of the appearance of CpG islands and to eliminate them. The analysis of the presence of CpG islands was carried out using the algorithm described in (Rice, P., Longden, I. and Bleasby, A. (2000) EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends Genet, 16, 276-277) .

Наличие в составе мРНК так называемых ARE-элементов первого, второго и третьего типа может значительно сокращать время жизни мРНК, снижая уровень экспрессии целевого белка. Как правило, в организме ARE-элементы встречаются в 3'-нетранслируемых областях РНК, в особенности в РНК, кодирующей цитокины PMID: 1398070. В результате манипуляций с последовательностью ДНК в процессе оптимизации возникает отличная от нуля вероятность внесения ARE-элементов в тело мРНК. Для предотвращения образования ARE-элементов последовательность мРНК была сначала подвергнута визуальной инспекции (наличие мотивов AUUUA и подобных им), а затем дополнительно проанализирована в ходе поиска других нежелательных элементов с использованием алгоритма, описанного в работе PMID: 16845041.The presence of the so-called ARE elements of the first, second, and third types in the mRNA can significantly reduce the life of the mRNA, reducing the level of expression of the target protein. As a rule, in the body, ARE elements are found in 3'-untranslated regions of RNA, especially in RNA encoding the cytokines PMID: 1398070. As a result of manipulations with the DNA sequence during optimization, a non-zero probability of introducing ARE elements into the body of mRNA arises. To prevent the formation of ARE elements, the mRNA sequence was first subjected to visual inspection (the presence of AUUUA motifs and the like), and then it was further analyzed during the search for other undesirable elements using the algorithm described in PMID: 16845041.

Хорошо известно, что развитая вторичная структура РНК с тугоплавкими шпильками затрудняет транскрипцию и особенно трансляцию РНК PMID: 6328446. При повышении уровня GC-пар в последовательности вероятность возникновения тугоплавких шпилек в продуцируемой мРНК существенно возрастает. Поэтому полученные оптимизированные по нескольким параметрам гены проанализировали на наличие тугоплавких шпилек в мРНК. Тугоплавкими считались все шпильки, способные сохранять стабильность при 37°С (энергия более 15 ккал/моль, рассчитанная на основании образования классических уотсон-криквских пар нуклеотидов), иначе говоря, при температуре роста клеток и продукции белка.It is well known that the developed secondary structure of RNA with refractory hairpins complicates the transcription and especially translation of RID PMID: 6328446. With an increase in the level of GC pairs in the sequence, the probability of occurrence of refractory hairpins in the produced mRNA increases significantly. Therefore, the resulting genes optimized for several parameters were analyzed for the presence of refractory hairpins in mRNA. All studs capable of maintaining stability at 37 ° C (an energy of more than 15 kcal / mol, calculated on the basis of the formation of classical Watson-Cricket nucleotide pairs) were considered refractory, in other words, at the cell growth temperature and protein production.

Расчеты проводили на основании алгоритма, описанного в работе (Nucleic Acids Res. 31: 3429-3431 (2003)). На основании полученных результатов проводили последовательные замены пар, образующих шпильки (предпочтительно (/ на GC-пары) и повторный анализ вторичной структуры РНК. Циклы повторяли до достижения желаемого результата с точки зрения свободной энергии остаточных вторичных структур РНК.The calculations were performed based on the algorithm described in (Nucleic Acids Res. 31: 3429-3431 (2003)). Based on the results obtained, successive replacements of hairpin-forming pairs (preferably (/ for GC pairs) and repeated analysis of the RNA secondary structure were performed. The cycles were repeated until the desired result was achieved in terms of the free energy of the residual RNA secondary structures.

Наличие в составе мРНК дополнительных рамок считывания (micro-ORF), а также сайтов связывания РНК с различными РНК-взаимодействующими белками может оказывать существенное негативное влияние на эффективность продукции белка, блокируя трансляцию полноразмерного продукта. Поиск микро-ORF и сайтов, потенциально взаимодействующих с РНК-связывающими белками, проводили при помощи алгоритмов, описанных в работе 16845041.The presence of an additional reading frame (micro-ORF) as well as binding sites of RNA with various RNA interacting proteins in the mRNA can have a significant negative effect on the efficiency of protein production, blocking the translation of a full-sized product. The search for micro-ORFs and sites potentially interacting with RNA-binding proteins was performed using the algorithms described in 16845041.

Значительные изменения, вносимые в состав мРНК в процессе описанных выше преобразований, могут генерировать нежелательные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, которые могут в дальнейшем мешать как сборке генов, кодирующих целевой белок, так и переносу их в различные экспрессионные векторы. Поэтому последовательности, кодирующие мРНК обоих фрагментов антитела, тестировали на наличие нежелательных сайтов рестрикции при помощи программы Webcutter 2.0 (http://ma.lundberg.gu.se/cutter2/). Нежелательные сайты рестрикции удаляли с учетом сохранения описанных выше параметров.Significant changes made to the composition of mRNAs during the above transformations can generate undesirable recognition sites by restriction endonucleases, which can further interfere with both the assembly of genes encoding the target protein and their transfer to various expression vectors. Therefore, the sequences encoding the mRNA of both antibody fragments were tested for the presence of undesirable restriction sites using the Webcutter 2.0 program (http://ma.lundberg.gu.se/cutter2/). Unwanted restriction sites were removed taking into account the preservation of the parameters described above.

Для обеспечения сохранения оптимизированных параметров последовательности мРНК после проведения описанных аналитических и модификационных процедур с полученной последовательностью проводили повторный цикл оптимизации, сохраняя последовательность действий, указанных выше. Если это было необходимо, проводили несколько повторных циклов оптимизации последовательности мРНК. На промежуточных стадиях повторения оптимизационного цикла вводили сайты рестрикции для последующей сборки генов.To ensure the preservation of the optimized parameters of the mRNA sequence after carrying out the described analytical and modification procedures, a repeated optimization cycle was carried out with the obtained sequence, preserving the sequence of actions indicated above. If necessary, several repeated cycles of mRNA sequence optimization were performed. At the intermediate stages of repeating the optimization cycle, restriction sites were introduced for subsequent gene assembly.

Пример 2. Дизайн и синтез олигонуклеотидных последовательностей на основании оптимизированных мРНК вариабельных фрагментов генов иммуноглобулина инфликсимаб.Example 2. Design and synthesis of oligonucleotide sequences based on optimized mRNA variable fragments of infliximab immunoglobulin genes.

Сборку последовательностей, кодирующих вариабельные фрагменты антитела инфликсимаб, проводили путем получения отдельных сегментов ДНК и дальнейшего их соединения по сайтам рестрикции. Возможна сборка фрагментов антитела мультиплексным ПЦР, однако, в случае относительно GC-богатых последовательностей, сборка методом мультиплексного ПЦР может приводить к некорректному отжигу фрагментов и появлению точечных мутаций. Поэтому предпочтительным методом сборки является однократная достройка длинных L фрагментов целевых последовательностей, отожженных друг на друга небольшими (15-19 пар нуклеотидов) комплементарными участками с последующим объединением фрагментов при помощи сайтов рестрикции. Дизайн рестриктных сайтов на основе существующей полипептидной последовательности проводят при помощи программы SILMUT. Синтез олигонуклеотидов осуществляют на автоматическом синтезаторе "Glen Research" или аналогичном.The assembly of sequences encoding the variable fragments of the infliximab antibody was carried out by obtaining individual DNA segments and their further connection at the restriction sites. It is possible to assemble antibody fragments by multiplex PCR, however, in the case of relatively GC-rich sequences, assembly by multiplex PCR can lead to incorrect annealing of fragments and the appearance of point mutations. Therefore, the preferred assembly method is a single completion of long L fragments of target sequences annealed to each other in small (15-19 pairs of nucleotides) complementary regions, followed by combining fragments using restriction sites. The design of restriction sites based on the existing polypeptide sequence is carried out using the SILMUT program. The synthesis of oligonucleotides is carried out on an automatic synthesizer "Glen Research" or similar.

Для конструирования кодон-оптимизированного фрагмента тяжелой цепи антитела инфликсимаб пептидная последовательность вариабельного фрагмента тяжелой цепи была разделена на три субфрагмента. Объединение субфрагментов проводили при помощи лигирования этих субфрагментов, расщепленных в концевых областях эндонуклеазами рестрикции. Сайты для расщепления эндонуклеазами рестрикции были введены в ДНК, используя вырожденность триплетного кодирования аминокислот. Предпочтительными эндонуклеазами для сборки тяжелой цепи являются Sac I, Nco I Xba I, Bgl II и Pst I. Для сборки вариабельной части тяжелой цепи были синтезированы олигонуклеотиды SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 12. Комплементарная пара, образующая первый субфрагмент, формируется олигонуклеотидами SEQ ID NO: 3-4. Завершение сборки первого субфрагмента проводится амплификацией продукта отжига и достройки олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3-4 с помощью олигонуклеотидов SEQ ID NO: 5-6.To construct a codon-optimized heavy chain fragment of the infliximab antibody, the peptide sequence of the variable heavy chain fragment was divided into three subfragments. The combination of subfragments was performed by ligation of these subfragments cleaved in the terminal regions with restriction endonucleases. Restriction endonuclease cleavage sites were introduced into DNA using the degeneracy of triplet coding of amino acids. Preferred heavy chain endonucleases are Sac I, Nco I Xba I, Bgl II, and Pst I. Oligonucleotides SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 12 were synthesized to assemble the variable part of the heavy chain. The complementary pair forming the first subfragment is formed oligonucleotides of SEQ ID NO: 3-4. The assembly of the first sub-fragment is completed by amplification of the product of annealing and completion of the oligonucleotides SEQ ID NO: 3-4 using the oligonucleotides SEQ ID NO: 5-6.

Первый субфрагмент, кодирующий N-концевую часть вариабельного фрагмента тяжелой цепи антитела, ограничен сайтами Nco I и Xba I (аминокислотные последовательности АМАЕ и GLE, соответственно). Первый субфрагмент содержит d 5'-концевой области сайт узнавания эндонуклеазы Sac I для сборки с использованием плазмиды pBluescript II SK- и ее полилинкерного участка.The first sub-fragment encoding the N-terminal portion of the antibody heavy chain variable fragment is restricted to the Nco I and Xba I sites (amino acid sequences AMAE and GLE, respectively). The first subfragment contains the d 5'-terminal region of the Sac I endonuclease recognition site for assembly using plasmid pBluescript II SK and its polylinker region.

Второй субфрагмент ограничен сайтами Xba I и Bgl II (аминокислоты GLE и TDL). Для сборки второго субфрагмента проводят отжиг и достройку олигонуклеотидов SEQ ID NO: 7-8. Полученный двухцепочечный фрагмент ДНК амплифицируют при помощи ПЦР с пары олигонуклеотидов SEQ ID NO: 9-10.The second subfragment is limited to Xba I and Bgl II sites (amino acids GLE and TDL). To assemble the second subfragment, annealing and completion of the oligonucleotides of SEQ ID NO: 7-8 are carried out. The resulting double-stranded DNA fragment is amplified by PCR from a pair of oligonucleotides of SEQ ID NO: 9-10.

Третий субфрагмент ограничен сайтами Bgl II и Pst I (аминокислоты TDL и SAG). Для сборки третьего субфрагмента использовали отжиг и достройку олигонуклеотидов SEQ ID NO: 11-12.The third subfragment is limited to the Bgl II and Pst I sites (amino acids TDL and SAG). To assemble the third subfragment, annealing and completion of oligonucleotides of SEQ ID NO: 11-12 were used.

Последовательность аминокислот SAG для внесения сайта узнавания эндонуклеазы Pst I является предпочтительной для конструирования одноцепочечного антитела (scFv) на основе вариабельных фрагментов антитела инфликсимаб. Предпочтительными сайтами для конструирования полноразмерного химерного антитела инфликсимаб являются сайты узнавания эндонуклеазами Sac I или Xho I с их изошизомерами, кодирующие аминокислотную последовательность VSS.The SAG amino acid sequence for introducing the Pst I endonuclease recognition site is preferred for constructing a single chain antibody (scFv) based on variable fragments of the infliximab antibody. Preferred sites for constructing the full-length chimeric antibody infliximab are recognition sites by Sac I or Xho I endonucleases with their isoschisomers encoding the amino acid sequence of VSS.

Конструирование сегментов ДНК, кодирующей кодон-оптимизированный вариабельный фрагмент легкой цепи, проводилось по аналогичной схеме. Для конструирования вариабельного фрагмента легкой цепи того же антитела синтезируют олигонуклеотиды SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 18. Предпочтительными эндонуклеазами для сборки являются Barn HI, Kpn I и Eco RI. Сборку проводят на основе вектора pBluescript II SK (-). Схема сборки генов, кодирующих вариабельные фрагменты цепей антитела инфликсимаб, приводится на Фиг.1.The construction of DNA segments encoding a codon-optimized variable fragment of the light chain was carried out according to a similar scheme. To construct a variable fragment of the light chain of the same antibody, oligonucleotides of SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 18 are synthesized. Preferred assembly endonucleases are Barn HI, Kpn I and Eco RI. Assembly is carried out on the basis of the vector pBluescript II SK (-). The assembly scheme of genes encoding the variable fragments of the chains of antibodies infliximab is shown in Figure 1.

Первый субфрагмент получают отжигом и достройкой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 13-14. Сайт узнавания Вarn HI кодируется в составе аминокислот GS в линкере, являющемся составной частью одноцепочечного антитела (scFv) и является предпочтительным для конструирования scFv и клонирования в эту конструкцию вариабельного фрагмента легкой цепи. Сайт узнавания Kpn I первого субфрагмента легкой цепи кодируется в составе аминокислот WYQ.The first subfragment is obtained by annealing and completing oligonucleotides of SEQ ID NO: 13-14. The Barn HI recognition site is encoded as part of the GS amino acids in the linker, which is part of a single chain antibody (scFv), and is preferred for constructing scFv and cloning into this construct a light chain variable fragment. The recognition site Kpn I of the first subfragment of the light chain is encoded as part of the amino acids WYQ.

Второй субфрагмент получают отжигом и достройкой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 15-16. Второй (3'-концевой) сайт узнавания Kpn I второго фрагмента кодируется в составе аминокислот GT.The second sub-fragment is obtained by annealing and completing the oligonucleotides of SEQ ID NO: 15-16. The second (3'-terminal) recognition site Kpn I of the second fragment is encoded as part of the amino acids GT.

Третий субфрагмент получали при отжиге и достройке олигонуклеотидов SEQ ID NO: 17-18. 5'-концевой сайт Kpn I кодируется в составе аминокислот GT. 3'-концевой сайт EcoR I является предпочтительным для конструирования scFv на основе вариабельных фрагментов антитела инфликсимаб. Области ДНК, кодирующие аминокислотную последовательность 3'-концевой области рекомбинантного конструкта, а также область пептидного линкера (GGGS)₄ между вариабельными фрагментами легкой и тяжелой цепи антитела инфликсимаб, кодируются фрагментом ДНК, полученным при отжиге и достройке олигонуклеотидов SEQ ID NO: 19-20. Все субфрагменты ДНК, составляющие ДНК вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей после получения расщепляют соответсвующими эндонуклеазами рестрикции и лигируют друг с другом (Пример 3 и Фиг.1)The third subfragment was obtained by annealing and completing oligonucleotides of SEQ ID NO: 17-18. The 5'-terminal site of Kpn I is encoded as part of the amino acids GT. The 3'-terminal EcoR I site is preferred for constructing scFv based on variable fragments of the infliximab antibody. The DNA regions encoding the amino acid sequence of the 3'-terminal region of the recombinant construct, as well as the peptide linker region (GGGS) ₄ between the variable fragments of the light and heavy chains of the infliximab antibody, are encoded by the DNA fragment obtained by annealing and completing oligonucleotides SEQ ID NO: 19-20 . All DNA subfragments constituting the DNA of the variable fragments of the light and heavy chains after production are cleaved with the corresponding restriction endonucleases and ligated with each other (Example 3 and Figure 1)

Пример 3. Сборка фрагментов ДНК, кодирующих цепи рекомбинантного антитела инфликсимаб.Example 3. The assembly of DNA fragments encoding the chain of the recombinant antibody infliximab.

Отжиг и достройка частично комплементарных олигонуклеотидов при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. Coli для получения предшественников фрагментов цепей.Annealing and completion of partially complementary oligonucleotides using the Maple fragment of E. Coli DNA polymerase I to obtain precursors of chain fragments.

Олигонуклеотиды HCHRev1 и HCHForl, HCHRev2 и HCHFor2, HCHFor3Bgl и HCHRev3Pst, LCHlForBam и LCHRevKpRI, LCH2ForKpn и LCH2RevKpn, LCH3ForKpn и LCH3RevRI (no 20 пм каждого) смешивают попарно с однократным буфером для фрагмента Кленова и 0.25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатами (ATGC) в конечном объеме 50 мкл. Смесь нагревают до 90°С и медленно охлаждают в ДНК-амплификаторе до 45°С в течение 20 мин и с 45°С до комнатной температуры в течение 10 мин. После окончания отжига немедленно добавляют 1 единицу активности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli и инкубируют при 37°С в течение 30 минут.The oligonucleotides HCHRev1 and HCHForl, HCHRev2 and HCHFor2, HCHFor3Bgl and HCHRev3Pst, LCHlForBam and LCHRevKpRI, LCH2ForKpn and LCH2RevKpn, LCH3ForKpn and LCH3 with a single moiety of at least 50 mn . The mixture is heated to 90 ° C and slowly cooled in a DNA thermocycler to 45 ° C for 20 minutes and from 45 ° C to room temperature for 10 minutes. After annealing is completed, 1 unit of activity of the maple fragment of E. coli DNA polymerase I is immediately added and incubated at 37 ° C for 30 minutes.

Полимеразная цепная реакция для достройки предшественников фрагментов цепей и встраивания сайтов узнавания эндлонуклеаз рестрикции.Polymerase chain reaction for completing the precursors of chain fragments and embedding restriction endonuclease recognition sites.

Фрагменты ДНК, представляющие собой предшественники фрагментов цепей, полученные отжигом и достройкой праймеров HCHRevl и HCHForl, HCHRev2 и HCHFor2, применяют в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции с целью получения фрагментов тяжелой цепи, используемых при сборке. Смесь для полимеразной цепной реакции содержит буфер для Pwo-полимеразы и 1 единицу активности Pwo-полимеразы (Roches), 0.2 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов (ATGC) и праймеры HCHForSacNc и HCHRevlXba (для продукта отжига и достройки первой пары праймеров) либо HCHFor2Xba и НСН Rev2 Bgl (для продукта отжига и достройки второй пары праймеров). Количество каждого праймера в реакции составляет 20 пМ. Полимеразная цепная реакция состоит из 25 циклов 30 секундной денатурации, отжига праймеров на матрице при 56°С в течение 30 секунд и 30 секунд элонгации последовательности ДНК.DNA fragments, which are precursors of chain fragments obtained by annealing and completing primers HCHRevl and HCHForl, HCHRev2 and HCHFor2, are used as a template for the polymerase chain reaction to obtain heavy chain fragments used in the assembly. The mixture for the polymerase chain reaction contains a buffer for Pwo polymerase and 1 unit of activity of Pwo polymerase (Roches), 0.2 mM deoxynucleotide triphosphates (ATGC) and HCHForSacNc and HCHRevlXba primers (for the annealing product and the completion of the first pair of primers) or HCH2 Rev and HCHFor 2 and HCHFor for the product of annealing and completion of the second pair of primers). The amount of each primer in the reaction is 20 pM. The polymerase chain reaction consists of 25 cycles of 30 second denaturation, annealing of the primers on the template at 56 ° C for 30 seconds and 30 seconds of elongation of the DNA sequence.

Обработка синтезированных фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции и киназой фага Т4 и очистка продуктов рестрикции в акриламидном геле.Processing of synthesized DNA fragments with restriction endonucleases and T4 phage kinase and purification of restriction products in acrylamide gel.

Для получения липких концов ДНК, используемых при клонировании фрагментов цепей, фрагменты цепей антитела, полученные в результате отжига и достройки либо полимеразной цепной реакции, обрабатывают смесью фенол-хлороформ, осаждают тремя объемами этанола и расщепляют эндонуклеазами рестрикции (1 фрагмент тяжелой цепи Sad и Xbal, 2 фрагмент тяжелой цепи Xbal, 3 фрагмент тяжелой цепи BglII и PstI, второй фрагмент легкой цепи Kpnl, третий фрагмент легкой цепи Kpnl и EcoRI) с использованием соответствующих буферных растворов согласно рекомендации производителя (Fermentas). Реакция расщепления проводится при температуре 37°С в течение 1 часа. 1 фрагмент легкой цепи и второй фрагмент тяжелой цепи антитела подвергаются реакции кинирования в буфере для киназы фага Т4. Смесь для кинирования содержит 1 мМ АТФ и 2 единицы активности киназы. Реакция кинирования проводится при температуре 37°С в течение 1 часа.To obtain the sticky ends of DNA used in cloning chain fragments, antibody chain fragments obtained by annealing and completion of either a polymerase chain reaction are treated with a phenol-chloroform mixture, precipitated with three volumes of ethanol and digested with restriction endonucleases (1 Sad and Xbal heavy chain fragment, 2 Xbal heavy chain fragment, 3 BglII and PstI heavy chain fragment, second Kpnl light chain fragment, third Kpnl light chain fragment and EcoRI) using appropriate buffer solutions as recommended by the manufacturer (Fermentas). The cleavage reaction is carried out at a temperature of 37 ° C for 1 hour. 1 fragment of the light chain and the second fragment of the heavy chain of the antibody undergo a kinization reaction in T4 phage kinase buffer. The kinization mixture contains 1 mM ATP and 2 units of kinase activity. The reaction is carried out at a temperature of 37 ° C for 1 hour.

Продукты рестрикции обрабатывают смесью фенол-хлороформ, разделяют в 10% акриламидном геле (соотношение акриламида к метиленбисакриламиду 19:1) в трис-боратном буфере, вырезают окрашенные бромистым этидием продукты реакции и элюируют в диализных мешках в камере для горизонтального электрофореза. Очищенные продукты осаждают тремя объемами этанола и растворяют в 5 мкл бидистиллированной воды.The restriction products are treated with a phenol-chloroform mixture, separated in 10% acrylamide gel (acrylamide to methylenebisacrylamide 19: 1 ratio) in Tris-borate buffer, reaction products stained with ethidium bromide are cut and eluted in dialysis bags in a horizontal electrophoresis chamber. The purified products are precipitated with three volumes of ethanol and dissolved in 5 μl bidistilled water.

Подготовка векторов для клонирования фрагментов ДНК антителаPreparation of vectors for cloning antibody DNA fragments

Сборку цепей антитела проводят во вспомогательном векторе Bluescript IISK-(Stratagene). Плазмидную ДНК обрабатывают необходимыми эндонуклеазами рестрикции (Smal и Xbal для встраивания второго фрагмента тяжелой цепи, PvuII для встраивания кинированного первого фрагмента легкой цепи и так далее согласно требуемым для клонирования эндонуклеазам рестрикции, которые были ранее использованы для обработки фрагментов) и разделяют в агарозном геле. Векторную ДНК вырезают из агарозного геля и очищают с использованием Gel Extraction Kit (Qiagen) согласно инструкциям производителя. Аналогичным образом подготавливают векторы для сборки цепей антитела в одноцепочечном формате в векторе pET22b(+) (Novagen).The assembly of the antibody chains is carried out in an auxiliary Bluescript IISK- vector (Stratagene). Plasmid DNA is treated with the necessary restriction endonucleases (Smal and Xbal for embedding the second heavy chain fragment, PvuII for embedding the cinned first light chain fragment, and so on according to the restriction endonucleases required for cloning, which were previously used to process the fragments) and separated in an agarose gel. Vector DNA was excised from the agarose gel and purified using the Gel Extraction Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. Similarly prepare vectors for the assembly of chains of antibodies in single-chain format in the vector pET22b (+) (Novagen).

Лигирование фрагментов цепей в вектор и трансформация плазмидной ДНК Лигирование фрагментов цепей с векторной ДНК проводят с использованием Rapid Ligation Kit (Roche) с использованием рекомендаций производителя. Молярное соотношение вектор/вставка составляет 1:3 при лигировании липких концов ДНК и 1:1 при лигировании тупых концов ДНК.Ligation of chain fragments into a vector and transformation of plasmid DNA Ligation of chain fragments with vector DNA is performed using the Rapid Ligation Kit (Roche) using the manufacturer's recommendations. The vector / insert molar ratio is 1: 3 for ligating the sticky ends of DNA and 1: 1 for ligating the blunt ends of DNA.

Трансформацию полученной рекомбинантной ДНК проводят в электрокомпетентные клетки Е.coli при помощи электропорации. Трансформированные бактерии высевают на чашку с 1.5% агаром, приготовленным на среде 2xYT и содержащим 50 мкг ампициллина на 1 мл, и выращивают в течение ночи при 37°С. Полученные клоны анализируют на наличие целевой вставки полимеразной цепной реакцией с праймеров, использованных для синтеза цепей или внешних универсальных праймеров, последовательности которых входят в состав векторной ДНК.Transformation of the resulting recombinant DNA is carried out in electrocompetent E. coli cells by electroporation. Transformed bacteria are plated on a plate with 1.5% agar prepared on 2xYT medium and containing 50 μg ampicillin per ml, and grown overnight at 37 ° C. The resulting clones are analyzed for the presence of the target insert by polymerase chain reaction from the primers used for the synthesis of chains or external universal primers, the sequences of which are part of vector DNA.

Положительные клоны выращивают на среде 2xYT в течение ночи и выделяют плазмидную ДНК с применением Plasmid Purification Kit (Qiagen). Из полученной плазмидной ДНК приготавливают векторы для следующей стадии сборки цепей антитела. По завершении сборки проводят окончательную проверку правильности встраивания фрагментов рестриктным картированием и верификацию последовательности синтезированных цепей антитела секвенированием конечной плазмидной ДНК.Positive clones were grown on 2xYT medium overnight and plasmid DNA was isolated using the Plasmid Purification Kit (Qiagen). Vectors are prepared from the obtained plasmid DNA for the next step of antibody chain assembly. Upon completion of the assembly, a final check of the correct insertion of fragments by restriction mapping and verification of the sequence of the synthesized antibody chains by sequencing of the final plasmid DNA is carried out.

Пример 4. Сборка экспрессионной конструкции для продукции одноцепочечного антитела инфликсимаб в E.coli, очистка рекомбинантного антитела и детекция его иммунологической активности.Example 4. Assembling the expression construct for the production of a single chain antibody infliximab in E. coli, purification of the recombinant antibody and detection of its immunological activity.

Сборка экспрессионной конструкции одноцепочечного антитела проводится на базе вектора pET22b(+) (Novagen). В вектор по сайтам эндонуклеаз рестрикции Ndel и Sail вводят синтетическую последовательность ДНК, соответствующую лидерной последовательности pel В, но переводящую содержащийся ранее в векторе сайт Ncol в требуемую для корректного встраивания цепей антитела рамку считывания.Assembly of the expression construct of a single chain antibody is based on the vector pET22b (+) (Novagen). A synthetic DNA sequence corresponding to the pel B leader sequence is inserted into the Ndel and Sail restriction endonuclease vector, but translates the Ncol site previously contained in the vector into the reading frame required for the antibody chains to be correctly inserted.

В полученную плазмиду по сайтам эндонуклеаз рестрикции Ncol и Xhol клонируют синтетический полилинкер, имеющий в своем составе сайты эндонуклеаз рестрикции, необходимые для встраивания цепей антитела и линкерную последовательность, соединяющую цепи антитела в один полипептид. Данный полилинкер обеспечивает корректный фолдинг вариабельных доменов цепей антитела в составе одноцепочечного антитела. Далее в полученный вектор клонируют полученный сборкой конечный фрагмент тяжелой цепи антитела по сайтам эндонуклеаз рестрикции Ncol и Pstt и конечный фрагмент легкой цепи антитела по сайтам BamHI и EcoRI. Правильность встраивания цепей подтверждают рестриктным картированием и секвенированием ДНК полученной экспрессионной конструкции.A synthetic polylinker containing the restriction endonuclease sites necessary for embedding the antibody chains and the linker sequence connecting the antibody chains into one polypeptide is cloned into the obtained plasmid at the Ncol and Xhol restriction endonuclease sites. This polylinker provides the correct folding of the variable domains of antibody chains in a single-chain antibody. Next, the final antibody heavy chain fragment at the Ncol and Pstt restriction endonuclease sites and the antibody light chain final fragment at the BamHI and EcoRI sites are cloned into the resulting vector by assembly. The correct insertion of the chains is confirmed by restriction mapping and DNA sequencing of the resulting expression construct.

Плазмидной ДНК, содержащей экспрессионную конструкцию одноцепочечного антитела, трансформируют электрокомпетентные клетки E.coli штамма BL21DE(3) и высевают трансформантов на чашки с 1,5% агаром, приготовленным на среде 2xYT и содержащим 50 мкг ампициллина на 1 мл, и выращивают в течение ночи при 37°С. Трансформантов смывают с чашки средой 2xYT, подращивают в 1 л среды 2xYT, содержащей 0,1% глюкозы, и индуцируют синтез белка добавлением в среду ИПТГ до конечной концентрации 0.2 мМ. Продукцию белка ведут при температуре 25°С в течение 5 часов.Plasmid DNA containing the expression construct of a single chain antibody is transformed with E. coli strain BL21DE (3) electrocompetent cells and the transformants are seeded on plates with 1.5% agar prepared on 2xYT medium and containing 50 μg ampicillin per 1 ml and grown overnight at 37 ° C. The transformants are washed off with a 2xYT medium plate, grown in 1 L of 2xYT medium containing 0.1% glucose, and protein synthesis is induced by adding IPTG to a final concentration of 0.2 mM. Protein production is carried out at a temperature of 25 ° C for 5 hours.

Клеточную биомассу собирают центрифугированием при 5000g в течение 15 минут, отбрасывают супернатант и выделяют периплазматическую фракцию. Для этого клетки суспендируют в растворе, содержащем 30 мМ трис-HCl, pH 8, 20% сорбитола, 20 мкг/мл лизоцима и 1 мМ ЭДТА. Полученную периплазматическую фракцию отделяют от клеточной массы центрифугированием при 10000g в течение 30 минут. Очистку белка одноцепочечного антитела проводят двумя последовательными раундами ионообменной хроматографии на колонках Q-Sepharose и DEAE-Sepharose (Pharmacia) в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, pH 8.5. Элюцию с колонок проводят градиентом хлорида натрия от 0 до 0,5 М в том же буфере в течение 1 часа. Анализируют фракции белка, сошедшие с колонки Q-Sepharose, электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле по методике Лэмли и отбирают фракции, обладающие наибольшей чистотой и концентрацией целевого белка. Их подвергают дальнейшей очистке на колонке DEAE в тех же условиях. Фракции, отобранные после очистки на колонке DEAE-Sepharose, обладающие 80% чистотой, анализируют на специфическое связывание с ФНО-α, с применением методики иммуноферментного анализа (ELISA). Для этого белок ФНО-α иммобилизуют в течение часа при 37°С на иммунологическом планшете в карбонатном буфере (100 мМ Na₂CO₃, pH 9,0). Промывают лунки планшета фосфатным буфером (PBS), блокируют поверхность плашек 3% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS, вновь троекратно промывают PBS и инкубируют с различными концентрациями одноцепочечного антитела в течение 1 часа при 37°С со встряхиванием в растворе PBS.Cell biomass is collected by centrifugation at 5000 g for 15 minutes, the supernatant is discarded and the periplasmic fraction is isolated. For this, the cells are suspended in a solution containing 30 mM Tris-HCl, pH 8, 20% sorbitol, 20 μg / ml lysozyme and 1 mM EDTA. The resulting periplasmic fraction is separated from the cell mass by centrifugation at 10,000 g for 30 minutes. Protein purification of single-chain antibodies is carried out by two consecutive rounds of ion exchange chromatography on Q-Sepharose and DEAE-Sepharose (Pharmacia) columns in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.5. The elution from the columns is carried out with a gradient of sodium chloride from 0 to 0.5 M in the same buffer for 1 hour. The protein fractions descended from the Q-Sepharose column were analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis according to the Lamley method, and the fractions having the highest purity and concentration of the target protein were selected. They are further purified on a DEAE column under the same conditions. Fractions selected after purification on a DEAE-Sepharose column with 80% purity were analyzed for specific binding to TNF-α using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). For this, the TNF-α protein is immobilized for one hour at 37 ° C on an immunological plate in carbonate buffer (100 mM Na ₂ CO ₃ , pH 9.0). Wash the plate wells with phosphate buffer (PBS), block the plate surface with 3% bovine serum albumin in PBS, rinse three times with PBS and incubate with various concentrations of single chain antibody for 1 hour at 37 ° C with shaking in PBS solution.

После троекратной промывки лунок PBS в лунки добавляют раствор пероксидазного конъюгата поликлонального мышиного антитела, специфичного к целому антителу человека, и инкубируют в течение 2 часов при 37°С со встряхиванием. Лунки промывают от конъюгата троекратно раствором PBS и проявляют добавлением раствора перекиси водорода и субстрата пероксидазы хрена тетраметилендиамина (ТМВ). Детектируют синее окрашивание раствора, свидетельствующее о связывании одноцепочечного антитела с ФНО-α. Остановку реакции проводят добавлением серной кислоты до конечной концентрации 4%. Измерения проводят при длине волны 405 нм.After washing the PBS wells three times, a peroxidase conjugate of a polyclonal mouse antibody specific for the whole human antibody was added to the wells and incubated for 2 hours at 37 ° C with shaking. Wells were washed from the conjugate three times with PBS and were developed by adding a solution of hydrogen peroxide and a horseradish peroxidase substrate tetramethylenediamine (TMB). Blue staining of the solution is detected, indicating the binding of a single chain antibody to TNF-α. The reaction is stopped by the addition of sulfuric acid to a final concentration of 4%. Measurements are taken at a wavelength of 405 nm.

Claims (7)

1. Одноцепочечное антитело, связывающее фактор некроза опухоли альфа (ФНО-альфа), которое представляет собой вариант антитела инфликсимаб, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO:21.1. A single-chain antibody that binds tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha), which is a variant of the infliximab antibody, characterized in that the variable region of the heavy chain is SEQ ID NO: 21. 2. ДНК, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:22, кодирующая антитело по п.1.2. DNA characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22, encoding the antibody according to claim 1. 3. ДНК, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2, кодирующая кодон-оптимизированный вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела по п.1,3. DNA, characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, encoding a codon-optimized variable fragment of the heavy chain of the antibody according to claim 1, 4. ДНК, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:3, кодирующая кодон-оптимизированный вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела по п.1.4. DNA characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 encoding a codon-optimized variable fragment of the heavy chain of the antibody according to claim 1. 5. ДНК, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:4-20, кодирующая субфрагмент антитела по п.1.5. DNA characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4-20, encoding a subfragment of an antibody according to claim 1. 6. Плазмидная ДНК, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:23, включающей SEQ ID NO:22, экспрессирующая антитело по п.1.6. Plasmid DNA characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23, including SEQ ID NO: 22, expressing the antibody according to claim 1. 7. Способ получения одноцепочечного антитела по п.1, включающий введение в клетку-хозяина ДНК по п.4, культивирование в условиях, необходимых для культивирования антитела, с дальнейшим выделением и очисткой указанного одноцепочечного антитела. 7. The method for producing a single chain antibody according to claim 1, comprising introducing into the host cell the DNA according to claim 4, culturing under conditions necessary for culturing the antibody, with further isolation and purification of said single chain antibody.

Images