RU2416644C1 - Photobiocatalyst for producing reduced forms of nicotinamide coenzymes nadh or nadph and photocatalytic method for producing nadh or nadph - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: offered is a photobiocatalyst for producing reduced forms of nicotinamide coenzymes NADH or NADPH. The photobiocatalyst represents ferredoxin-NADP-reductase immobilised on a surface of nanopatterned mesoporous titanium dioxide TiO₂ film in amount 0.8-1.24 nmole in 1 cm² of the film surface. The film is prepared of nanocrystalline titanium dioxide of size 15-25 nm and specific surface 50-100 m²/g on a glass substrate or on a glass substrate with a an electrically conductive composition. Also, offered is a photocatalytic method for producing the reduced forms of nicotinamide coenzymes NADH or NADPH with using the photobiocatalyst of ferredoxin-NADP-reductase immobilised on the surface of nanopatterned mesoporous titanium dioxide TiO₂ film. The photobiocatalyst allows high speed and specific NADH or NADPH production of NAD⁺ or NADP⁺ under exposure to light.

EFFECT: method for producing reduced forms of nicotinamide coenzymes NADH or NADPH with using the prepared photobiocatalyst provides easy reaction product separation from an enzyme and a semiconductor, and multiple use of the photobiocatalyst.

4 cl, 5 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к фотобиокатализатору на основе фермента ферредоксин-NADP-редуктазы, иммобилизованного на наноструктурированной мезопористой пленке диоксида титана (TiO₂) - фотоактивного полупроводника, и может быть использовано в энзиматических процессах получения восстановленных форм никотинамидных коферментов NADH и NADPH под действием света.The invention relates to biotechnology, in particular to a photobiocatalyst based on the enzyme ferredoxin-NADP reductase, immobilized on a nanostructured mesoporous film of titanium dioxide (TiO ₂ ) - a photoactive semiconductor, and can be used in enzymatic processes for the preparation of reduced forms of nicotinamide N ADP NAD Sveta.

Восстановленные формы никотинамидных коферментов NADH (восстановленный никотинамидадениндинуклеотид) и NADPH (восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат) широко применяются в ферментативных и биокаталитических процессах для получения оптически активных соединений (аминокислот, их производных, алифатических и ароматических аминоспиртов и аминов) и лекарств, в биомедицинской диагностике.The reduced forms of the nicotinamide coenzymes NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) and NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) are widely used in enzymatic and biocatalytic processes for the preparation of optically active compounds (amino acids, their derivatives, aliphatic and aromatic amino alcohols and amine biomedics).

Однако применение NADH или NADPH невыгодно с экономической точки зрения в связи с высокой стоимостью восстановленных коферментов - цена восстановленных форм никотинамидных коферментов в десятки раз превосходит стоимость окисленных форм, выделяемых из микроорганизмов.However, the use of NADH or NADPH is unprofitable from an economic point of view due to the high cost of reduced coenzymes - the price of reduced forms of nicotinamide coenzymes is ten times higher than the cost of oxidized forms released from microorganisms.

Для восстановления окисленных форм никотинамидных коферментов NAD⁺ и NADP⁺ используют биокатализаторы на основе ферментов (Mihaela D. Leonida. "Redox Enzymes Used in Chiral Syntheses Coupled to Coenzyme Regeneration". Current Medicinal Chemistry, 2001, 8, pp.345-369; Тишков В.И. «Регенерация кофакторов в биосинтезе хиральных соединений с помощью дегидрогеназ». Вестник Московского Университета, СЕР.2, Химия, 2002. Т.43, №6, с.381-388). Наиболее широкое применение в практике нашли биокатализаторы на основе NAD⁺-зависимой формиатдегидрогеназы (Тишков В.И., Попов В.О. «Механизм действия формиатдегидрогеназы и ее практическое применение». Биохимия, 2004, Т.69, №11, с.1537-1554). Применение ферментов для восстановления NAD⁺ и NADP⁺ требует использования специфических (пригодных только для используемого фермента) органических соединений в качестве доноров электрона, которые имеют высокую стоимость. Кроме того, процессы регенерации NADH или NADPH ограничены активностью ферментов.Enzyme-based biocatalysts (Mihaela D. Leonida. "Redox Enzymes Used in Chiral Syntheses Coupled to Coenzyme Regeneration". Current Medicinal Chemistry, 2001, 8, pp. 345-369; Tishkov are used to reduce the oxidized forms of the nicotinamide coenzymes NAD ⁺ and NADP ⁺ . VI "Regeneration of cofactors in the biosynthesis of chiral compounds using dehydrogenases." Herald of Moscow University, SER.2, Chemistry, 2002. V. 43, No. 6, p. 381-388). The most widely used in practice are biocatalysts based on NAD ⁺ -dependent formate dehydrogenase (Tishkov V.I., Popov V.O. “The mechanism of action of formate dehydrogenase and its practical application.” Biochemistry, 2004, V.69, No. 11, p. 1537 -1554). The use of enzymes for the reduction of NAD ⁺ and NADP ⁺ requires the use of specific (suitable only for the used enzyme) organic compounds as electron donors, which are of high cost. In addition, NADH or NADPH regeneration processes are limited by enzyme activity.

В настоящее время исследуются электрохимические (Nakamura K. et al. "Electro-enzymology Coenzyme Regeneration". Springer-Verlag, Berlin, 1988, 165 p.; A.A.Karyakin et al. "Electroreduction of NAD⁺ to enzymatically active NADH at poly (Neutral Red) modified electrodes". J. Electroanal. Chem., 399 (1-2) (1995) pp.179-184; Damian and S. Omanovic. "Electrochemical Reduction of NAD⁺ on a Polycrystalline Gold Electrode". J. Molec. Catal. A: Chemical, 253 (2006) p.222) и фотохимические методы восстановления NAD⁺ и NADP⁺ до NADH и NADPH (Rainer Wienkamp and Eberhard Steckhan. "Selective Generation of NADH by Visible Light". Angew. Chem. Inf. Ed. Engl. 22 (1983), No. 6,497; Shumilin LA., Nikandrov V.V. et al. "Photogeneration of NADH under coupled action of CdS semiconductor and hydrogenase from Alcaligenes eutrophus without exogenous mediators". FEBS Letters (1992), 306 [2-3], pp.125-128; Chan Beum Park et al. "Solar energy in production of L-glutamate through visible light active photocatalyst-redox enzyme coupled bioreactor". Chem. Commun. 2008, pp.5423-5425; Lee SH et al. "Eosin Y-sensitized artificial photosynthesis by highly efficient visible-light-driven regeneration of nicotinamide cofactor". Chembiochem. 2009, Jul 6, 10(10), pp.1621-1624). Описаны электрохимические и фотохимические методы восстановления NAD⁺ и NADP⁺ до NADH и NADPH как с применением ферментов, так и без их использования. Недостатком этих методов является низкая специфичность процесса восстановления NAD⁺ и NADP⁺, который сопровождается образованием димера (NAD)₂ и других побочных продуктов. Использование ферментов при восстановлении NAD⁺ и NADP⁺ позволяет снизить выход побочных продуктов реакции, но требует введения дополнительных дорогостоящих переносчиков электрона от электрода, а наблюдаемые при этом скорости образования NADH и NADPH ниже, чем в чисто ферментативном процессе. Кроме того, в описанных методах ферменты или переносчики электронов находятся в растворе, что ограничивает использование этих методов в биотехнологии, так как в свободном виде ферменты нестабильны и увеличивается расход соединений-переносчиков электрона.Electrochemical studies are currently underway (Nakamura K. et al. "Electro-enzymology Coenzyme Regeneration. Springer-Verlag, Berlin, 1988, 165 p .; AAKaryakin et al." Electroreduction of NAD ⁺ to enzymatically active NADH at poly (Neutral Red ) modified electrodes ". J. Electroanal. Chem. 399 (1-2) (1995) pp. 179-184; Damian and S. Omanovic." Electrochemical Reduction of NAD ⁺ on a Polycrystalline Gold Electrode ". J. Molec. Catal. A: Chemical, 253 (2006) p. 222) and photochemical methods for reducing NAD ⁺ and NADP ⁺ to NADH and NADPH (Rainer Wienkamp and Eberhard Steckhan. "Selective Generation of NADH by Visible Light". Angew. Chem. Inf. Ed. Engl. 22 (1983), No. 6,497; Shumilin LA., Nikandrov VV et al. "Photogeneration of NADH under coupled action of CdS semiconductor and hydrogenase from Alcaligenes eutrophus without exogenous mediators". FEBS Letters (1992), 306 [ 2-3], pp. 125-128; Chan Beum Park et al. "S olar energy in production of L-glutamate through visible light active photocatalyst-redox enzyme coupled bioreactor. " Chem. Commun. 2008, pp. 5423-5425; Lee SH et al. "Eosin Y-sensitized artificial photosynthesis by highly efficient visible-light-driven regeneration of nicotinamide cofactor." Chembiochem. 2009, Jul 6, 10 (10), pp. 1621-1624). The electrochemical and photochemical methods for the reduction of NAD ⁺ and NADP ⁺ to NADH and NADPH both with and without enzymes are described. The disadvantage of these methods is the low specificity of the NAD ⁺ and NADP ⁺ reduction process, which is accompanied by the formation of dimer (NAD) ₂ and other by-products. The use of enzymes in the reduction of NAD ⁺ and NADP ⁺ reduces the yield of reaction by-products, but requires the introduction of additional expensive electron carriers from the electrode, and the observed formation rates of NADH and NADPH are lower than in a purely enzymatic process. In addition, in the described methods, enzymes or electron carriers are in solution, which limits the use of these methods in biotechnology, since enzymes are unstable in free form and the consumption of electron carrier compounds increases.

Повышение стабильности и технологичности применения ферментов достигается иммобилизацией ферментов на различных носителях.Improving the stability and manufacturability of enzymes is achieved by immobilization of enzymes on various carriers.

Известно большое количество иммобилизованных биокатализаторов как на органических носителях (RU 2327738, C12N 11/00, C12N 11/04, C12N 11/12, C12N 11/14, 27.06.2008; RU 2233327, C12N 11/04, C12N 11/18, 27.07.2004; RU 2261911, C12N 11/02, 10.10.2005; RU 2210596, C12P 35/00, 20.08.2003), так и на неорганических (RU 2281328, C12N 11/14, C12N9/26, 10.08.2006; RU 2279475, C12N 11/14, C12N 9/26, 10.07.2006; RU 2224020, C12N 11/14, C12N 9/26, 20.02.2004; RU 2167197, C12N 11/14, 20.05.2001; RU 2007456, C12N 11/14, 15.02.1994; RU 1473358, C12N 11/00, C12N 11/14, 20.02.2000). Такие иммобилизованные биокатализаторы решают проблему повышения стабильности и технологичности применения ферментов, но они не позволяют осуществлять фотохимические процессы.A large number of immobilized biocatalysts are known both on organic carriers (RU 2327738, C12N 11/00, C12N 11/04, C12N 11/12, C12N 11/14, 06/27/2008; RU 2233327, C12N 11/04, C12N 11/18, 07/27/2004; RU 2261911, C12N 11/02, 10/10/2005; RU 2210596, C12P 35/00, 08/20/2003), and inorganic (RU 2281328, C12N 11/14, C12N9 / 26, 08/10/2006; RU 2279475, C12N 11/14, C12N 9/26, 07/10/2006; RU 2224020, C12N 11/14, C12N 9/26, 02/20/2004; RU 2167197, C12N 11/14, 05/20/2001; RU 2007456, C12N 11/14, 02.15.1994; RU 1473358, C12N 11/00, C12N 11/14, 02.20.2000). Such immobilized biocatalysts solve the problem of increasing the stability and manufacturability of enzymes, but they do not allow photochemical processes to be carried out.

Известно, что неорганические полупроводники, например TiO₂, являются катализаторами окислительно-восстановительных фотохимических реакций (RU 2275238, B01J 21/06, C01G 23/053, 27.04.2006; RU 2151632, B01D 53/86, B01J 21/06, 27.06.2000; RU 2259866, B01D 53/86, B01J 21/06, 10.09.2005; US 6939611, B32B 9/00, B01J 23/00, 06.09.2005; US 6387844, B01J 23/00, B01J 21/08, 14.05.2002).Inorganic semiconductors, for example TiO ₂ , are known to be catalysts for redox photochemical reactions (RU 2275238, B01J 21/06, C01G 23/053, 04/27/2006; RU 2151632, B01D 53/86, B01J 21/06, 27.06. 2000; RU 2259866, B01D 53/86, B01J 21/06, 09/10/2005; US 6939611, B32B 9/00, B01J 23/00, 09/09/2005; US 6387844, B01J 23/00, B01J 21/08, 14.05 .2002).

Исследование сопряженного действия неорганических полупроводников и ферментов в окислительно-восстановительных реакциях в биохимических системах привело к развитию нового направления в катализе - фотобиокатализа (В.В.Никандров. "Неорганические полупроводники в биологических и биохимических системах: биосинтез, свойства и фотохимическая активность". Успехи биологической химии, 2000, т.40, с.357-396). Установлено, что при сопряжении полупроводника и фермента полупроводник фотосенсибилизирует окисление донора электрона, а фермент восстанавливает субстрат ферментативной реакции, используя электроны, фотогенерированные в зоне проводимости полупроводника. Фермент выступает в роли катализатора окислительно-восстановительной реакции, фотосенсибилизированной полупроводником. Сопряжение полупроводника и фермента позволяет получить продукт ферментативной реакции при использовании в качестве доноров электронов доступных и дешевых органических соединений, которые фермент в отсутствие полупроводника использовать не способен.The study of the conjugate action of inorganic semiconductors and enzymes in redox reactions in biochemical systems has led to the development of a new direction in catalysis - photobiocatalysis (V.V. Nikandrov. "Inorganic semiconductors in biological and biochemical systems: biosynthesis, properties and photochemical activity." Successes in biological Chemistry, 2000, T. 40, p. 357-396). It was found that, when a semiconductor and an enzyme are conjugated, the semiconductor photosensitizes the oxidation of the electron donor, and the enzyme restores the substrate of the enzymatic reaction using electrons photogenerated in the conduction band of the semiconductor. The enzyme acts as a catalyst for the redox reaction, a photosensitized semiconductor. The conjugation of the semiconductor and the enzyme allows you to get the product of the enzymatic reaction when using available and cheap organic compounds as electron donors, which the enzyme is not able to use in the absence of a semiconductor.

В настоящее время в связи с развитием нанобиотехнологии основное внимание исследователей обращено к наноструктурированным полупроводниковым носителям для иммобилизации ферментов. Наноструктурированные полупроводниковые пленки TiO₂ использовались для иммобилизации ферментов (RU 2326818, C01G 23/047, C12N 11/14, B01J 37/36, 20.06.2008) и разработки биосенсоров (Qingwen Li et al. "Amperometric Detection of Glucose with Glucose Oxidase Absorbed on Porous Nanocrystalline TiO₂ Film". Electroanalysis, (2001) V.13, Iss. 5, pp.413-416; M. Viticoli et al. "Third-generation biosensors based on TiO₂ nanostructured films". Materials Science and Engineering (2006), 26, Iss. 5-7, pp.947-951). В данных работах фотокаталитические свойства полученных пленок ТiO₂ с иммобилизованными ферментами не исследовались.Currently, in connection with the development of nanobiotechnology, the main attention of researchers is turned to nanostructured semiconductor carriers for immobilization of enzymes. Nanostructured semiconductor films of TiO _{2 were} used to immobilize enzymes (RU 2326818, C01G 23/047, C12N 11/14, B01J 37/36, 06/20/2008) and to develop biosensors (Qingwen Li et al. "Amperometric Detection of Glucose with Glucose Oxidase Absorbed on Porous Nanocrystalline TiO ₂ Film ". Electroanalysis, (2001) V.13, Iss. 5, pp. 413-416; M. Viticoli et al." Third-generation biosensors based on TiO ₂ nanostructured films ". Materials Science and Engineering (2006), 26, Iss. 5-7, pp. 947-951). In these works, the photocatalytic properties of the obtained TiO ₂ films with immobilized enzymes were not studied.

Наиболее близким к предлагаемому фотобиокатализатору является фотобиокатализатор для образования водорода, включающий фермент, иммобилизованный на наноструктурированной мезопористой пленке ТiO₂ (RU 2322498, C12N 9/00, C12N 11/00, 20.04.2008 - прототип). Фотобиокатализатор-прототип содержит гидрогеназу в количестве 0,1-2,3 нмоль на 1 см² поверхности наноструктурированной мезопористой пленки TiO₂, полученной из нанокристаллов TiO₂ размером от 15 до 25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием.Closest to the proposed photobiocatalyst is a photobiocatalyst for the formation of hydrogen, including an enzyme immobilized on a nanostructured mesoporous TiO ₂ film (RU 2322498, C12N 9/00, C12N 11/00, 04/20/2008 - prototype). The photobiocatalyst prototype contains hydrogenase in an amount of 0.1-2.3 nmol per 1 cm ^{2 of the} surface of a nanostructured mesoporous TiO ₂ film obtained from TiO ₂ nanocrystals from 15 to 25 nm in size with a specific surface of 50-100 m ² / g on a glass substrate or on a glass substrate with a conductive coating.

Фотобиокатализатор-прототип на основе гидрогеназы позволяет с достаточно высокой скоростью получать водород под действием света, но не пригоден для восстановления окисленных форм никотинамидных коферментов.A photobiocatalyst prototype based on hydrogenase allows hydrogen to be produced at a sufficiently high speed under the influence of light, but is not suitable for the reduction of the oxidized forms of nicotinamide coenzymes.

Наиболее близким к предлагаемому фотокаталитическому способу получения восстановленных форм никотинамидных коферментов NADH или NADPH является способ, описанный в работе Z.Goren, N.Lapidot and I.Willner Photocatalysed regeneration of NAD(P)H by CdS and TiO₂ semiconductors: applications in enzymatic synthesis. J. Mol. Cat. 47, 1988, pp.21-32 (прототип). В способе-прототипе реакция фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH осуществляется при сопряженном действии полупроводника TiO₂ и фермента липоамид-дегидрогеназы или ферредоксин-NADP-редуктазы в присутствии органического донора электрона с помощью переносчика электронов - метилвиологена. Реакция проводится в коллоидном растворе полупроводника, содержащем фермент, донор электрона и метилвиологен. При освещении коллоидного раствора TiO₂ полупроводник фотосенсибилизирует окисление донора электрона и происходит восстановление метилвиологена за счет электронов, фотогенерированных в зоне проводимости полупроводника. Восстановленный метилвиологен используется в последующих реакциях восстановления NAD⁺ или NADP⁺ катализируемых ферментом липоамид-дегидрогеназой или ферредоксин-NADP-редуктазой. Контрольными экспериментами было показано, что NAD(P)H не образуется в темноте, а также при освещении, но в отсутствие метилвиологена, то есть в способе-прототипе реакцию фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH осуществляют путем предварительного переноса электрона от полупроводника к переносчику электронов - метилвиологену, восстановленная форма которого используется затем ферментом.Closest to the proposed photocatalytic method for producing reduced forms of NADH or NADPH nicotinamide coenzymes is the method described by Z. Goren, N. Lapidot and I. Willner Photocatalysed regeneration of NAD (P) H by CdS and TiO ₂ semiconductors: applications in enzymatic synthesis . J. Mol. Cat. 47, 1988, pp.21-32 (prototype). In the prototype method, the photoreduction reaction of NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH is carried out under the conjugate action of the TiO ₂ semiconductor and the enzyme lipoamide dehydrogenase or ferredoxin NADP reductase in the presence of an organic electron donor using an electron carrier, methylviologen. The reaction is carried out in a colloidal semiconductor solution containing an enzyme, an electron donor and methyl viologen. When a colloidal solution of TiO _{2 is} illuminated, the semiconductor photosensitizes the oxidation of the electron donor and methylviologene is reduced due to electrons photogenerated in the conduction band of the semiconductor. Reduced methyl viologen is used in subsequent NAD ⁺ or NADP ⁺ reduction reactions catalyzed by the enzyme lipoamide dehydrogenase or ferredoxin-NADP reductase. Control experiments showed that NAD (P) H does not form in the dark, as well as under illumination, but in the absence of methyl viologen, that is, in the prototype method, the photoreduction reaction of NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH is carried out by preliminary electron transfer from the semiconductor to the electron carrier - methyl viologen, the reduced form of which is then used by the enzyme.

Необходимость использования в известном способе дорогостоящего и токсичного переносчика электронов метилвиологена существенно снижает практическую ценность этого способа. Кроме того, в данном способе фермент находится в растворе, что ограничивает использование способа в биотехнологии, так как, во-первых, в свободном виде ферменты нестабильны, во-вторых, требуется трудоемкая процедура отделения продуктов реакции от фермента и полупроводника и, в-третьих, практически невозможно повторное использование фермента.The need to use in the known method expensive and toxic electron carrier methylviologen significantly reduces the practical value of this method. In addition, in this method, the enzyme is in solution, which limits the use of the method in biotechnology, since, firstly, the enzymes are unstable in the free state, secondly, a laborious procedure is required to separate the reaction products from the enzyme and the semiconductor, and thirdly , almost impossible to reuse the enzyme.

Задачей изобретения является создание фотобиокатализатора на основе ферредоксин-NADP-редуктазы, иммобилизованной на наноструктурированной мезопористой пленке TiO₂, способного с достаточно высокой скоростью специфично восстанавливать окисленные формы никотинамидных коферментов NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH под действием света.The objective of the invention is to provide a photobiocatalyst based on a ferredoxin-NADP reductase immobilized on a nanostructured mesoporous TiO ₂ film, capable of specifically reducing the oxidized forms of the nicotinamide coenzymes NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH under the action of light at a sufficiently high rate.

Задачей изобретения является также разработка более эффективного и технологичного фотокаталитического способа получения NADH и NADPH, который позволит исключить применение дорогостоящих соединений в качестве переносчика электронов, обеспечит повышение устойчивости фермента ферредоксин-NADP-редуктазы при осуществлении процесса, позволит легко отделять продукты реакции от фермента и полупроводника и обеспечит возможность многократного использования фотобиокатализатора.The objective of the invention is the development of a more efficient and technologically advanced photocatalytic method for producing NADH and NADPH, which will eliminate the use of expensive compounds as an electron carrier, will increase the stability of the enzyme ferredoxin-NADP reductase during the process, will easily separate the reaction products from the enzyme and the semiconductor and will provide the ability to reuse the photobiocatalyst.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым фотобиокатализатором для получения восстановленных форм никотинамидных коферментов NADH или NADPH, включающим фермент, иммобилизованный на наноструктурированной мезопористой пленке диоксида титана, приготовленной из нанокристаллов диоксида титана размером 15-25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием, который в качестве иммобилизованного фермента содержит ферредоксин-NADP-редуктазу в количестве 0,8-1,24 нмоль на 1 см² поверхности наноструктуриванной мезопористой пленки диоксида титана.The solution of this problem is achieved by the proposed photobiocatalyst to obtain reduced forms of NADH or NADPH nicotinamide coenzymes, including an enzyme immobilized on a nanostructured mesoporous titanium dioxide film prepared from titanium dioxide nanocrystals 15-25 nm in size with a specific surface of 50-100 m ² / g on a glass substrate or on a glass substrate with a conductive coating, which as an immobilized enzyme contains ferredoxin-NADP reductase in an amount of 0.8-1.24 nmol per 1 cm ² surfaces of a nanostructured mesoporous titanium dioxide film.

Решение поставленной задачи достигается также предлагаемым фотокаталитическим способом получения восстановленных форм никотинамидных коферментов NADH или NADPH реакцией фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ при сопряженном действии полупроводника TiO₂ и фермента ферредоксин-NADP-редуктазы при освещении УФ-светом в анаэробных условиях в присутствии органического донора электрона, в котором реакцию фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH осуществляют путем прямого переноса электрона от полупроводника TiO₂ к ферменту ферредоксин-NADP-редуктазе, для чего используют ферредоксин-NADP-редуктазу, иммобилизованную на наноструктурированной мезопористой пленке ТiO₂, приготовленной из нанокристаллов TiO₂ размером 15-25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием, в количестве 0,8-1,24 нмоль на 1 см² поверхности пленки TiO₂.The solution of this problem is also achieved by the proposed photocatalytic method for producing reduced forms of NADH or NADPH nicotinamide coenzymes by the photoreduction reaction of NAD ⁺ or NADP ⁺ under the conjugate action of the TiO ₂ semiconductor and the ferredoxin-NADP reductase enzyme under irradiation with UV light in anaerobic conditions, in the presence of an organic electron wherein photoreduction reaction is NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH is carried out by direct electron transfer from the semiconductor to the TiO ₂ enzyme ferredoxin-NADP-reductase, d I then use ferredoxin-NADP-reductase immobilized on mesoporous nanostructured TiO ₂ film prepared from TiO ₂ nanocrystals size of 15-25 nm with a specific surface of 50-100 m ² / g on the glass substrate or on a glass substrate with a conductive coating in an amount 0.8-1.24 nmol per 1 cm ^{2 the} surface of the film of TiO ₂ .

Реакцию фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH можно проводить при освещении УФ-светом с λ=365 нм.The photoreduction reaction of NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH can be carried out under UV light with λ = 365 nm.

В качестве органического донора электрона можно использовать трис(гидроксиметил)аминометан - компонент водного буферного раствора 0,05 М ТРИС, рН 7.2, в котором проводят реакцию фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH.As an organic electron donor, you can use Tris (hydroxymethyl) aminomethane - a component of an aqueous buffer solution of 0.05 M TRIS, pH 7.2, in which the photoreduction reaction of NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH is carried out.

Главным отличием предлагаемого способа от известного является то, что реакцию фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH осуществляют путем прямого переноса электрона от полупроводниковой наноструктурированной пленки TiO₂ к иммобилизованному на пленке ферменту ферредоксин-NADP-редуктазе, что позволяет исключить применение дорогостоящих соединений в качестве переносчика электронов.The main difference between the proposed method and the known one is that the photoreduction reaction of NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH is carried out by direct electron transfer from a semiconductor nanostructured TiO ₂ film to a ferredoxin-NADP reductase enzyme immobilized on the film, which eliminates the use of expensive compounds in as an electron carrier.

Использование в заявленном способе фермента, иммобилизованного на наноструктурированной пленке TiO₂, повышает устойчивость ферредоксин-NADP-редуктазы, обеспечивает эффективное сопряжение фермента с полупроводником, позволяет легко отделять NADH или NADPH от фотобиокатализатора и позволяет использовать фотобиокатализатор многократно.The use of an enzyme immobilized on a TiO ₂ nanostructured film in the inventive method increases the stability of ferredoxin-NADP reductase, provides efficient conjugation of the enzyme with a semiconductor, makes it easy to separate NADH or NADPH from the photobiocatalyst, and allows the photobiocatalyst to be used repeatedly.

Ферредоксин-NADP-редуктаза - фермент, катализирующий реакцию:Ferredoxin-NADP reductase is an enzyme that catalyzes the reaction:

NADP⁺+2е^-+H⁺↔NADPHNADP ⁺ + 2e ^- + H ⁺ ↔NADPH

Этот фермент способен также катализировать реакцию восстановления NAD⁺:This enzyme is also capable of catalyzing the NAD ⁺ reduction reaction:

NAD⁺+2е^-+H⁺↔NADHNAD ⁺ + 2e ^- + H ⁺ ↔NADH

Природным донором электрона - субстратом - для ферредоксин-NADP-редуктазы является белок ферредоксин.The natural electron donor — the substrate — for ferredoxin-NADP reductase is the ferredoxin protein.

Ферредоксин-NADP-редуктаза из листьев шпината получена от фирмы Sigma (мол. вес 41 кДа, ε_280нм=55600 М^-1 см^-1).Ferredoxin-NADP reductase from spinach leaves was obtained from Sigma (mol. Weight 41 kDa, ε _{280 nm} = 55600 M ^-1 cm ^-1 ).

Ферредоксин-NADP-редуктазу иммобилизовывали на наноструктурированных мезопористых пленках TiO₂, полученных из наночастиц TiO₂ размером 15-25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г. Получение пленок TiO₂ описано в приведенных далее примерах. См. также патент RU 2326818, C01G 23/047, C12N 11/14, 20.06.2008. Иммобилизацию фермента осуществляли выдерживанием мезопористой пленки TiO₂ площадью 1-4 см², толщиной 8-10 мкм в 3 мл водного буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН 7,2), содержащего 0,5-1,5·10^-5 М ферредоксин-NADP-редуктазы, при температуре 4°С в течение 2 суток. Получен фотобиокатализатор, содержащий 0,8-1,24 нмоль (0,033-0,051 мг) ферредоксин-NADP-редуктазы на 1 см² поверхности пленки диоксида титана.Ferredoxin-NADP reductase was immobilized on nanostructured mesoporous TiO ₂ films obtained from TiO ₂ nanoparticles 15–25 nm in size with a specific surface area of 50–100 m ² / g. The preparation of TiO ₂ films is described in the following examples. See also patent RU 2326818, C01G 23/047, C12N 11/14, 06/20/2008. The enzyme was immobilized by maintaining a meso-porous TiO ₂ film with an area of 1-4 cm ² , a thickness of 8-10 μm in 3 ml of an aqueous buffer solution (TRIS, 0.05 M, pH 7.2), containing 0.5-1.5 · 10 ^-5 M ferredoxin-NADP reductase, at a temperature of 4 ° C for 2 days. A photobiocatalyst was obtained containing 0.8-1.24 nmol (0.033-0.051 mg) of ferredoxin-NADP reductase per 1 cm ^{2 of the} surface of the titanium dioxide film.

Активность ферредоксин-NADP-редуктазы, иммобилизованной на мезопористой пленке TiO₂, в темновой реакции определяли спектрофотометрически по скорости окисления NADPH в присутствии метилвиологена (MV²⁺) в аэробных условиях.The activity of ferredoxin-NADP reductase immobilized on a mesoporous TiO ₂ film in the dark reaction was determined spectrophotometrically by the oxidation rate of NADPH in the presence of methyl viologen (MV ²⁺ ) under aerobic conditions.

Ферредоксин-NADP-редуктаза катализирует перенос электрона от NADPH к MV²⁺; восстановленный метилвиологен (MV⁺) окисляется кислородом:Ferredoxin-NADP reductase catalyzes electron transfer from NADPH to MV ²⁺ ; reduced methyl viologen (MV ⁺ ) is oxidized by oxygen:

4MV⁺+4H⁺+О₂→4MV²⁺+2H₂O4MV ⁺ + 4H ⁺ + O ₂ → 4MV ²⁺ + 2H ₂ O

В спектрофотометрическую кювету добавляли 2,54 мл буфера (ТРИС, 0,05 М, рН 7,20), 0,3 мл 10^-3М NADPH, 150 мкл 0,01М MV²⁺ и образец полученного фотобиокатализатора. Изменение концентрации NADPH определяли спектрофотометрически при 340 нм, используя ε_340нм=6220 М^-1см^-1.2.54 ml of buffer (TRIS, 0.05 M, pH 7.20), 0.3 ml of 10 ^-3 M NADPH, 150 μl of 0.01 M MV ²⁺ and a sample of the obtained biocatalyst were added to the spectrophotometric cuvette. Changing NADPH concentration was determined spectrophotometrically at 340 nm using ε _340nm = 6220 M ^-1 cm ^-1.

Темновая каталитическая активность иммобилизованной ферредоксин-NADP-редуктазы в реакции окисления NADPH составила 2,58±0,25 мкмоль NADPH / мг фермента · час.The dark catalytic activity of immobilized ferredoxin-NADP reductase in the oxidation reaction of NADPH was 2.58 ± 0.25 μmol NADPH / mg of enzyme · hour.

Фотообразование NADH или NADPH из NAD⁺ или NADP⁺ в присутствии предлагаемого фотобиокатализатора исследовали, используя в качестве донора электрона широко применяемый в биохимических и биомедицинских опытах компонент буферного раствора ТРИС - трис(гидрокси-метил)аминометан - органическое соединение, которое не способно выступать в качестве субстрата для ферментов, в том числе и для ферредоксин-NADP-редуктазы, и не способно восстанавливать NAD⁺ или NADP⁺ в отсутствие фермента. В качестве доноров электрона возможно также использование спиртов, органических кислот и других соединений, которые окисляются диоксидом титана при световом возбуждении.The photoproduction of NADH or NADPH from NAD ⁺ or NADP ⁺ in the presence of the proposed photobiocatalyst was studied using the TRIS buffer component, Tris (hydroxymethyl) aminomethane, an organic compound that is unable to act as an electron donor, widely used in biochemical and biomedical experiments substrate for enzymes, including ferredoxin-NADP reductase, and is not able to restore NAD ⁺ or NADP ⁺ in the absence of the enzyme. It is also possible to use alcohols, organic acids, and other compounds that are oxidized by titanium dioxide upon light excitation as electron donors.

Фотокаталитическую реакцию проводили в спектрофотометрической кювете, содержащей 1·10^-4 М NAD⁺ или NADP⁺ и наноструктурированную мезопористую пленку TiO₂ с иммобилизованной ферредоксин-NADP-редуктазой в водном буферном растворе: 0,05М ТРИС, рН 7,2. Перед экспериментами кюветы с образцами продували аргоном для удаления кислорода. Фотокаталитические процессы реализовывали при комнатной температуре при перемешивании раствора.The photocatalytic reaction was carried out in a spectrophotometric cuvette containing 1 × 10 ^-4 M NAD ⁺ or NADP ⁺ and a nanostructured mesoporous TiO ₂ film with immobilized ferredoxin-NADP reductase in an aqueous buffer: 0.05 M TRIS, pH 7.2. Before experiments, sample cuvettes were purged with argon to remove oxygen. Photocatalytic processes were carried out at room temperature with stirring of the solution.

Источником света служила ртутная лампа ДРШ 250 мощностью 250 Вт. Освещение проводили через конденсор и водный тепловой фильтр. При помощи граничных светофильтров из спектра излучения ртутной лампы выделяли линии 365 нм. Интенсивность света 4·10⁵ эрг/см²·с. Добавление растворов и газов в кювету и отбор проб осуществляли шприцем.The light source was a DRSh 250 mercury lamp with a power of 250 watts. Lighting was carried out through a condenser and an aqueous heat filter. Using boundary light filters, 365 nm lines were extracted from the radiation spectrum of a mercury lamp. The light intensity is 4 · 10 ⁵ erg / cm ² · s. Adding solutions and gases to the cuvette and sampling was carried out with a syringe.

Идентификацию образования NADH и NADPH проводили по спектрам поглощения с помощью спектрофотометров «Beckman Coulter» DU-650 (Германия) и СФ-2000-2, по спектрам люминесценции на флуориметре «Shimadzu» RF-5301 PC, Япония и энзиматически по реакции окисления NADH и NADPH кислородом в присутствии метилвиологена и ферредоксин-NADP-редуктазы.The formation of NADH and NADPH was identified by absorption spectra using Beckman Coulter DU-650 (Germany) and SF-2000-2 spectrophotometers, by luminescence spectra on a Shimadzu RF-5301 PC fluorimeter, Japan, and enzymatically by the oxidation reaction of NADH and NADPH by oxygen in the presence of methyl viologen and ferredoxin-NADP reductase.

На фиг.1А приведен спектр поглощения, на фиг.2А - спектр флуоресценции растворов NAD⁺, подвергшихся облучению в присутствии предлагаемого фотобиокатализатора. Продукт фотореакции, также как контрольный раствор NADH, имеет спектр поглощения с максимумом при 340 нм и спектр флуоресценции с максимумом при 460 нм. Полное совпадение спектров поглощения и спектров флуоресценции растворов продукта фотореакции и контрольных растворов NADH, имеющих одинаковую оптическую плотность при 340 нм, указывает на то, что при фотокаталитическом восстановлении NAD⁺ не образуются иные продукты реакции помимо NADH. Известно, что димер (NAD)₂, образующийся при электрохимическом восстановлении NAD⁺, имеет, как и NADH, максимум в спектре поглощения при 340 нм, но не обладает флуоресценцией с максимумом при 460 нм (Land Е.J. and Swallow A.J. Biochim. Biophys. Acta (1968) 162, pp.327-337).On figa shows the absorption spectrum, on figa - fluorescence spectrum of NAD ⁺ solutions subjected to irradiation in the presence of the proposed photobiocatalyst. The photoreaction product, as well as the NADH control solution, has an absorption spectrum with a maximum at 340 nm and a fluorescence spectrum with a maximum at 460 nm. The complete coincidence of the absorption spectra and the fluorescence spectra of the solutions of the photoreaction product and the control NADH solutions having the same optical density at 340 nm, indicates that photocatalytic reduction of NAD ⁺ does not produce reaction products other than NADH. It is known that the dimer (NAD) ₂ formed during the electrochemical reduction of NAD ⁺ has, like NADH, a maximum in the absorption spectrum at 340 nm, but does not have fluorescence with a maximum at 460 nm (Land E.J. and Swallow AJ Biochim. Biophys. Acta (1968) 162, pp. 327-337).

На фиг.1Б представлена кинетическая кривая фотообразования NADH из NAD⁺. Фотокаталитическая активность фотобиокатализатора (скорость образования NADH из NAD⁺ мезопористой пленкой TiO₂ площадью 1 см², содержащей 1 мг фермента) составила 7,2±0,7 мкмоль NADH/см²·мг фермента · час.On figb presents the kinetic curve of the photoproduction of NADH from NAD ⁺ . Fotobiokatalizatora Photocatalytic Activity (NADH production rate of NAD ⁺ mesoporous TiO ₂ film area of 1 cm ² containing 1 mg of enzyme) was 7.2 ± 0.7 umol NADH / cm ² · h · mg of enzyme.

На фиг.3А приведен спектр поглощения, на фиг.4А - спектр флуоресценции растворов 1·10^-4M NADP⁺, подвергшихся облучению в присутствии предлагаемого фотобиокатализатора. Продукт фотореакции, так же как и NADPH, имеет спектр поглощения с максимумом при 340 нм и спектр флуоресценции с максимумом при 460 нм. На фиг.4Б представлены результаты энзиматического окисления продукта фотореакции кислородом в присутствии метилвиологена и ферредоксин-NADP-редуктазы: 2 мл пробы раствора, облученного в фотокювете, насыщали воздухом и добавляли 0,15 мл 10^-2 М метилвиологена и 0,0668 мг ферредоксин-NADP-редуктазы. Наблюдается падение оптической плотности пробы на длине волны 340 нм, что указывает на энзиматическое окисление продукта фотореакции - NADPH.On figa shows the absorption spectrum, on figa - fluorescence spectrum of solutions of 1 · 10 ^-4 M NADP ⁺ , irradiated in the presence of the proposed photobiocatalyst. The photoreaction product, like NADPH, has an absorption spectrum with a maximum at 340 nm and a fluorescence spectrum with a maximum at 460 nm. Fig. 4B shows the results of enzymatic oxidation of the photoreaction product with oxygen in the presence of methyl viologen and ferredoxin-NADP reductase: 2 ml of a sample of the solution irradiated in a photocuvette was saturated with air and 0.15 ml of 10 ^-2 M methyl viologen and 0.0668 mg of ferredoxin- NADP reductases. A decrease in the optical density of the sample at a wavelength of 340 nm is observed, which indicates the enzymatic oxidation of the photoreaction product - NADPH.

Типичная кинетическая кривая фотогенерации NADPH в фотокаталитическом процессе восстановления NADP⁺ представлена на фиг.3Б. Фотокаталитическая активность фотобиокатализатора (скорость образования NADPH на 1 см² мезопористой пленки, содержащей 1 мг фермента) составила 8,3±0,8 мкмольA typical kinetic NADPH photogeneration curve in the photocatalytic NADP ⁺ reduction process is shown in FIG. 3B. The photocatalytic activity of the photobiocatalyst (the rate of NADPH formation per 1 cm ^{2 of the} mesoporous film containing 1 mg of the enzyme) was 8.3 ± 0.8 μmol

NADPH/см²·мг белка · час.NADPH / cm ² · mg protein · hour.

Нами был проведен контрольный эксперимент фотохимического восстановления NAD⁺ наноструктурированной мезопористой пленкой TiO₂, не содержащей фермента.We carried out a control experiment on the photochemical reduction of NAD ^{+ with a} nanostructured mesoporous TiO ₂ film containing no enzyme.

Облучение мезопористой пленки TiO₂ без фермента в кювете, содержащей 1,36·10^-3 М NAD⁺ в водном буферном растворе (0,05 М ТРИС, рН 7,2), не приводит к образованию NADH. Продукт фотореакции, так же как и NADH, имеет спектр поглощения с максимумом при 340 нм, однако он не флуоресцирует при 460 нм (см. фиг.2Б), что указывает на образование димера (NAD)_2.. Кроме того, продукт данной фотореакции в отличие от NADH не окисляется кислородом воздуха в присутствии ферредоксин-NADP-редуктазы и метилвиологена.Irradiation of a mesoporous TiO ₂ film without an enzyme in a cuvette containing 1.36 · 10 ^-3 M NAD ⁺ in an aqueous buffer solution (0.05 M TRIS, pH 7.2) does not lead to the formation of NADH. The photoreaction product, like NADH, has an absorption spectrum with a maximum at 340 nm, however, it does not fluoresce at 460 nm (see Fig. 2B), which indicates the formation of a dimer (NAD) ₂ . In addition, the product of this photoreaction, unlike NADH, is not oxidized by atmospheric oxygen in the presence of ferredoxin-NADP reductase and methyl viologen.

Образование димера (NAD)₂, как уже упоминалось выше, наблюдалось ранее при фотохимическом восстановлении NAD⁺ в отсутствие ферментов и при электрохимическом восстановлении. Образование (NAD)₂ происходит в результате одноэлектронного восстановления с последующей димеризацией радикалов:The formation of dimer (NAD) ₂ , as mentioned above, was previously observed during the photochemical reduction of NAD ⁺ in the absence of enzymes and during electrochemical reduction. The formation of (NAD) ₂ occurs as a result of single-electron reduction with subsequent dimerization of radicals:

NAD⁺+е^-→NADNAD ⁺ + e ^- → NAD

2 NAD→(NAD)₂ 2 NAD → (NAD) ₂

Последовательность реакций при фотокаталитическом образовании NADH или NADPH в присутствии фотобиокатализатора, содержащего ферредоксин-NADP-редуктазу, можно представить следующим образом:The sequence of reactions during the photocatalytic formation of NADH or NADPH in the presence of a photobiocatalyst containing ferredoxin-NADP reductase can be represented as follows:

TiO₂+hν→e^-+h⁺ TiO ₂ + hν → e ^- + h ⁺ фотогенерация электрона и дырки(1)electron and hole photogeneration (1) е^-+Ti(IV)O-H→Ti(III)O-H^- e ^- + Ti (IV) OH → Ti (III) OH ^- захват поверхностной ловушкой (2)surface trap (2) h⁺+Ti(IV)O-H→Ti(IV)O-H⁺ h ⁺ + Ti (IV) OH → Ti (IV) OH ⁺ захват поверхностной ловушкой (3)surface trap (3) 2e^-+NAD(P)⁺+H⁺→NAD(P)H2e ^- + NAD (P) ⁺ + H ⁺ → NAD (P) H межфазный перенос заряда; реакция, катализируемая ферментами оксиредуктазами (4)interphase charge transfer; Oxyreductase Enzyme-catalyzed Reaction (4) h⁺+Ti(III)O-H^-→Ti(IV)O-Hh ⁺ + Ti (III) OH ^- → Ti (IV) OH рекомбинация (5)recombination (5) е^-+Ti(IV)O-H⁺→Ti(IV)O-He ^- + Ti (IV) OH ⁺ → Ti (IV) OH рекомбинация (6)recombination (6) h⁺+е^-→теплоh ⁺ + e ^- → heat рекомбинация (7)recombination (7) h⁺+RH→R+H⁺ h ⁺ + RH → R + H ⁺ межфазный перенос заряда, окисление донораinterphase charge transfer, donor oxidation   электрона (8)electron (8) Ti(IV)O-H⁺+RH→Ti(IV)O-H+R+H⁺ Ti (IV) OH ⁺ + RH → Ti (IV) O-H + R + H ⁺ окисление донора электрона на поверхности (9)surface electron donor oxidation (9)

В качестве донора электрона использовали 0,05 М ТРИС - трис(гидроксиметил)аминометан.0.05 M TRIS - tris (hydroxymethyl) aminomethane was used as an electron donor.

В целом процесс фотогенерации NADH или NADPH на предлагаемом фотобиокатализаторе, содержащем ферредоксин-NADP-редуктазу, можно представить схемой, приведенной на фиг.5. В результате связывания фермента с мезопористой поверхностью пленки TiO₂ происходит формирование фотобиокатализатора, представляющего собой комплекс молекул фермента с несколькими нанокристаллами неорганического полупроводника. При световом возбуждении в наночастицах полупроводника происходит разделение зарядов с последующим восстановлением реакционного центра фермента фотогенерированными электронами. Фермент использует электроны для восстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH. Фотогенерированная в полупроводнике дырка мигрирует от наночастиц к поверхности наноструктурированной пленки, где происходит окисление донора электронов.In General, the process of photographic generation of NADH or NADPH on the proposed photobiocatalyst containing ferredoxin-NADP reductase can be represented by the scheme shown in Fig.5. As a result of the binding of the enzyme to the mesoporous surface of the TiO ₂ film, a photobiocatalyst is formed, which is a complex of enzyme molecules with several nanocrystals of an inorganic semiconductor. Upon light excitation in the semiconductor nanoparticles, charge separation occurs, followed by restoration of the reaction center of the enzyme by photogenerated electrons. The enzyme uses electrons to restore NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH. A hole photogenerated in a semiconductor migrates from nanoparticles to the surface of a nanostructured film, where the electron donor is oxidized.

Приводим примеры осуществления изобретения.Examples of the invention.

А. Получение фотобиокатализатора для восстановления окисленных форм никотинамидных коферментов NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH соответственно.A. Obtaining a photobiocatalyst to reduce the oxidized forms of nicotinamide coenzymes NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH, respectively.

Пример 1.Example 1

Наноструктурированную мезопористую пленку TiO₂ получали из промьппленного порошка нанокристаллов со средним размером 15 нм с удельной поверхностью 100 м²/г (ТКР 102, фирма Тауkа, Япония). 2 г порошка смешивали с 0,3 мл 0,1 М раствора азотной кислоты и подвергали дезагрегированию в ультразвуковом диспергаторе мощностью 300 Вт в течение 15 мин. Полученную однородную массу разбавляли 2 мл 0,1% раствора Тритон X100. Добавляли 0,2 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 и гомогенизировали ультразвуком (600 Вт) в течение 15 минут. Полученную пасту равномерно наносили на подложку из обычного стекла с использованием прокладки для получения пленки заданной толщины (10 мкм) и высушивали при комнатной температуре. Затем органические вещества выжигались в течение 30 мин при 450°С в токе воздуха.A nanostructured mesoporous TiO ₂ film was obtained from an industrial nanocrystal powder with an average size of 15 nm with a specific surface area of 100 m ² / g (TCR 102, Tauka, Japan). 2 g of powder was mixed with 0.3 ml of a 0.1 M nitric acid solution and subjected to disaggregation in an ultrasonic disperser with a power of 300 W for 15 min. The resulting homogeneous mass was diluted with 2 ml of a 0.1% solution of Triton X100. 0.2 g of polyethylene glycol with a molecular weight of 20,000 was added and ultrasonically homogenized (600 W) for 15 minutes. The resulting paste was uniformly applied to a substrate of ordinary glass using a pad to obtain a film of a given thickness (10 μm) and dried at room temperature. Then the organic matter was burned for 30 min at 450 ° C in a stream of air.

Иммобилизацию ферредоксин-NADP-редуктазы на полученной пленке (площадь 2 см²) осуществляли адсорбцией в среде водного буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН 7,2), содержащего 1,5·10^-5 М ферредоксин-NADP-редуктазы, при температуре 4°С в течение 2 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков фермента, величина адсорбции ферредоксин-NADP-редуктазы составила 1,24 нмоль (0,051 мг) на 1 см² поверхности пленки диоксида титана.The immobilization of ferredoxin-NADP reductase on the resulting film (2 cm ^{2 area} ) was carried out by adsorption in an aqueous buffer solution (TRIS, 0.05 M, pH 7.2) containing 1.5 · 10 ^-5 M ferredoxin-NADP reductase at a temperature of 4 ° C for 2 days. The obtained photobiocatalyst was washed with a buffer solution from the remains of the enzyme; the adsorption value of ferredoxin-NADP reductase was 1.24 nmol (0.051 mg) per 1 cm ^{2 of the} surface of the titanium dioxide film.

Пример 2.Example 2

Иммобилизацию ферредоксин-NADP-редуктазы осуществляли на пленке TiO₂, полученной аналогично примеру 1 из порошка нанокристаллов со средним размером 25 нм с удельной поверхностью 50 м²/г (Aeroxide P25) с использованием 0,1 М азотной кислоты. Адсорбцию проводили на пленке площадью 3 см² толщиной 8 мкм (подложка из стекла с токопроводящим покрытием) в среде водного буферного раствора (ТРИС, 0,05 М, рН 7,2), содержащего 0,5·10^-5 М ферредоксин-NADP-редуктазы, при температуре 4°С в течение 2 суток. Полученный фотобиокатализатор промывали буферным раствором от остатков фермента, величина адсорбции ферредоксин-NADP-редуктазы составила 0,8 нмоль (0,033 мг) на 1 см² поверхности пленки диоксида титана.The immobilization of ferredoxin-NADP reductase was carried out on a TiO ₂ film obtained analogously to Example 1 from a nanocrystal powder with an average size of 25 nm with a specific surface area of 50 m ² / g (Aeroxide P25) using 0.1 M nitric acid. Adsorption was carried out on a 3 cm ² film with a thickness of 8 μm (a glass substrate with a conductive coating) in an aqueous buffer solution (TRIS, 0.05 M, pH 7.2) containing 0.5 × 10 ^-5 M ferredoxin-NADP -reductases, at a temperature of 4 ° C for 2 days. The obtained photobiocatalyst was washed with a buffer solution from the remains of the enzyme; the adsorption value of ferredoxin-NADP reductase was 0.8 nmol (0.033 mg) per 1 cm ^{2 of the} surface of the titanium dioxide film.

Б. Фотокаталитическая реакция восстановления окисленных форм никотинамидных коферментов.B. Photocatalytic reaction of the reduction of oxidized forms of nicotinamide coenzymes.

Пример 3. Фотовосстановление NAD⁺ до NADH.Example 3. Photo recovery NAD ⁺ to NADH.

Для проведения фотокаталитической реакции использовали фотобиокатализатор, полученный по примеру 1 - удельная сорбция ферредоксин-NADP-редуктазы составила 1,24 нмоль (0,051 мг) на 1 см² поверхности пленки диоксида титана. В спектрофотометрическую кювету, приспособленную для создания анаэробных условий, помещали водный буферный раствор (0,05 М ТРИС, рН 7,2), компонент которого - трис(гидроксиметил)аминометан - служил донором электронов, 1·10^-4 М раствор NAD⁺ и фотобиокатализатор. Перед экспериментами кювету с образцами продували аргоном для удаления кислорода. Реакцию проводили при комнатной температуре при перемешивании раствора. Отбор проб осуществляли шприцем.To carry out the photocatalytic reaction, the photobiocatalyst obtained in Example 1 was used — the specific sorption of ferredoxin-NADP reductase was 1.24 nmol (0.051 mg) per 1 cm ^{2 of the} surface of the titanium dioxide film. An aqueous buffer solution (0.05 M TRIS, pH 7.2), whose component Tris (hydroxymethyl) aminomethane, served as an electron donor, 1 × 10 ^-4 M NAD ⁺ solution, was placed in a spectrophotometric cell adapted to create anaerobic conditions. photobiocatalyst. Before the experiments, the sample cuvette was purged with argon to remove oxygen. The reaction was carried out at room temperature with stirring of the solution. Sampling was carried out with a syringe.

Источником света служила ртутная лампа ДРШ 250 мощностью 250 Вт. Освещение проводили через конденсор и водный тепловой фильтр. При помощи граничных светофильтров из спектра излучения ртутной лампы выделяли линии 365 нм. Интенсивность света 4·10⁵ эрг/см²·с.The light source was a DRSh 250 mercury lamp with a power of 250 watts. Lighting was carried out through a condenser and an aqueous heat filter. Using boundary light filters, 365 nm lines were extracted from the radiation spectrum of a mercury lamp. The light intensity is 4 · 10 ⁵ erg / cm ² · s.

На основании анализа кинетических данных определялась фотокаталитическая активность фотобиокатализатора, которая составила 7,2±0,7 мкмоль NADH/см²·мг фермента · час.Based on the analysis of kinetic data, the photocatalytic activity of the photobiocatalyst was determined, which amounted to 7.2 ± 0.7 μmol NADH / cm ² · mg of enzyme · hour.

Пример 4. Фотовосстановление NADP⁺ до NADPH.Example 4. Photo recovery NADP ⁺ to NADPH.

Для фотокаталитической реакции использовали фотобиокатализатор, полученный по примеру 2 - удельная сорбция ферредоксин-NADP-редуктазы составила 0,8 нмоль (0,033 мг) на 1 см² поверхности пленки диоксида титана.For the photocatalytic reaction, the photobiocatalyst obtained in Example 2 was used — the specific sorption of ferredoxin-NADP reductase was 0.8 nmol (0.033 mg) per 1 cm ^{2 of the} surface of the titanium dioxide film.

Реакцию проводили аналогично примеру 3. Фотокаталитическая активность фотобиокатализатора (скорость образования NADPH на 1 см² мезопористой пленки, содержащей 1 мг фермента) составила 8,3±0,8 мкмоль NADPH/см²·мг белка · час.The reaction was carried out analogously to example 3. The photocatalytic activity of the photobiocatalyst (the rate of NADPH formation per 1 cm ^{2 of the} mesoporous film containing 1 mg of the enzyme) was 8.3 ± 0.8 μmol NADPH / cm ² · mg protein · hour.

Таким образом, предложен фотобиокатализатор на основе ферредоксин-NADP-редуктазы, иммобилизованной на наноструктурированной мезопористой пленке TiO₂, позволяющий с достаточно высокой скоростью получать NADH или NADPH из NAD⁺ или NADP⁺ под действием света. Катализатор отличается высокой специфичностью. Разработан фотокаталитический способ получения восстановленных форм никотинамидных коферментов NADH или NADPH. Способ не требует использования дорогостоящих соединений в качестве переносчиков электрона и является высоко технологичным, так как обеспечивает повышение устойчивости фермента ферредоксин-NADP-редуктазы при осуществлении процесса, позволяет легко отделять продукты реакции от фермента и полупроводника и обеспечивает возможность многократного использования фотобиокатализатора.Thus, a photobiocatalyst based on a ferredoxin-NADP reductase immobilized on a nanostructured mesoporous TiO ₂ film is proposed, which makes it possible to obtain NADH or NADPH from NAD ⁺ or NADP ⁺ under the action of light with a rather high rate. The catalyst is highly specific. A photocatalytic method for the preparation of reduced forms of NADH or NADPH nicotinamide coenzymes has been developed. The method does not require the use of expensive compounds as electron carriers and is highly technological, as it provides increased stability of the enzyme ferredoxin-NADP reductase during the process, makes it easy to separate the reaction products from the enzyme and the semiconductor, and provides the possibility of multiple use of the photobiocatalyst.

Изобретение может применяться в различных энзиматических процессах, использующих восстановленные формы никотинамидных коферментов NADH и NADPH, в биомедицинских исследованиях, для разработки биосенсоров никотинамидных коферментов.The invention can be applied in various enzymatic processes using reduced forms of NADH and NADPH nicotinamide coenzymes, in biomedical research, for the development of nicotinamide coenzyme biosensors.

Claims (4)

1. Фотобиокатализатор для получения восстановленных форм никотинамидных коферментов NADH или NADPH, включающий фермент, иммобилизованный на наноструктурированной мезопористой пленке диоксида титана TiO₂, приготовленной из нанокристаллов диоксида титана размером 15-25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием, отличающийся тем, что в качестве иммобилизованного фермента он содержит ферредоксин-NADP-редуктазу в количестве 0,8-1,24 нмоль на 1 см² поверхности наноструктурированной мезопористой пленки диоксида титана.1. A photobiocatalyst for producing reduced forms of NADH or NADPH nicotinamide coenzymes, comprising an enzyme immobilized on a nanostructured mesoporous TiO ₂ titanium dioxide film prepared from 15-25 nm titanium dioxide nanocrystals with a specific surface area of 50-100 m ² / g on a glass substrate or on a glass substrate with a conductive coating, characterized in that, as an immobilized enzyme, it contains ferredoxin-NADP reductase in an amount of 0.8-1.24 nmol per 1 cm ² surface nanostructured th mesoporous titanium dioxide film. 2. Фотокаталитический способ получения восстановленных форм никотинамидных коферментов NADH или NADPH реакцией фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ при сопряженном действии полупроводника TiO₂ и фермента ферредоксин-NADP-редуктазы при освещении УФ-светом в анаэробных условиях в присутствии органического донора электрона, отличающийся тем, что реакцию фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH осуществляют путем прямого переноса электрона от полупроводника TiO₂ к ферменту ферредоксин-NADP-редуктазе, для чего используют ферредоксин-NADP-редуктазу, иммобилизованную на наноструктурированной мезопористой пленке TiO₂, приготовленной из нанокристаллов TiO₂ размером 15-25 нм с удельной поверхностью 50-100 м²/г на стеклянной подложке или на стеклянной подложке с токопроводящим покрытием, в количестве 0,8-1,24 нмоль на 1 см поверхности пленки TiO₂.2. Photocatalytic method for producing reduced forms of NADH or NADPH nicotinamide coenzymes by the photoreduction reaction of NAD ⁺ or NADP ⁺ under the conjugate action of the TiO ₂ semiconductor and the ferredoxin-NADP reductase enzyme under UV light under anaerobic conditions in the presence of an organic electron donor, characterized in that photoreduction reaction is NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH is carried out by direct electron transfer from the semiconductor to the TiO ₂ enzyme ferredoxin-NADP-reductase, which is used for ferredoxin-NADP-reductase, immo ilizovannuyu on mesoporous nanostructured TiO ₂ film prepared from TiO ₂ nanocrystals size of 15-25 nm with a specific surface of 50-100 m ² / g on the glass substrate or on a glass substrate with a conductive coating in an amount 0,8-1,24 nmol 1 cm of the surface of the TiO ₂ film. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что реакцию фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH проводят при освещении УФ-светом с λ=365 нм.3. The method according to claim 2, characterized in that the photoreduction reaction of NAD ⁺ or NADP ⁺ to NADH or NADPH is carried out under illumination with UV light with λ = 365 nm. 4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что в качестве органического донора электрона используют трис(гидроксиметил)аминометан - компонент водного буферного раствора 0,05 М ТРИС, рН 7,2, в котором проводят реакцию фотовосстановления NAD⁺ или NADP⁺ до NADH или NADPH. 4. The method according to claim 2 or 3, characterized in that Tris (hydroxymethyl) aminomethane, a component of an aqueous buffer solution of 0.05 M TRIS, pH 7.2, in which the NAD ⁺ or NADP photoreduction reaction is carried out, is used as an organic electron donor ⁺ up to NADH or NADPH.

Images