RU2416429C2 - Способ получения антигенного препарата из бруцелл в l-форме - Google Patents
Способ получения антигенного препарата из бруцелл в l-форме Download PDFInfo
- Publication number
- RU2416429C2 RU2416429C2 RU2009120812/15A RU2009120812A RU2416429C2 RU 2416429 C2 RU2416429 C2 RU 2416429C2 RU 2009120812/15 A RU2009120812/15 A RU 2009120812/15A RU 2009120812 A RU2009120812 A RU 2009120812A RU 2416429 C2 RU2416429 C2 RU 2416429C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- brucella
- suspension
- buffered
- minutes
- drug
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к микробиологии и иммунологии. Способ включает культивирование штамма Brucella abortus И-206 в L-форме на плотной питательной среде для бруцелл в L-форме при 37°С в течение 3-5 суток. Затем смывают микробную массу забуференным 0,9% раствором хлорида натрия с pH 7,2±0,2 и инактивируют ее добавлением 2,5% формалина. Выдерживают бактериальную суспензию сутки при 37°С и контролируют специфическую стерильность. Доводят бактериальную суспензию до концентрации 4,5·1010-5·1010 м.к. в мл забуференным 0,9% раствором хлорида натрия (pH 7,2±0,2) и проводят термообработку суспензии на водяной бане при 100°С в течение 45-50 минут. Центрифугируют суспензию при 7000 об/мин в течение 50-60 мин, отделяют и лиофилизируют надосадочную жидкость. Способ позволяет получить препарат, обладающий высокой специфичностью и активностью, пригодный для создания на его основе иммунобиологических препаратов и тест-системы для определения антител против бруцелл в L-форме в сыворотках крови людей и животных. Способ технологичен, доступен, не требует использования дорогостоящих приборов и оборудования.
Description
Изобретение относиться к области медицины и ветеринарии, а именно к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано в производстве медицинских и ветеринарных иммунобиологических препаратов.
Персистенция L-форм бруцелл в организме человека и животных с последующей реверсией в типичную форму может быть одной из причин непрогнозируемых эпизоотолого-эпидемиологических осложнений. При выявлении неманифестных очагов инфекции и расшифровки атипично протекающих форм заболевания у людей решающее значение имеют наиболее информативные методы лабораторной диагностики бруцеллеза. До настоящего времени не производятся тест-системы для диагностики бруцеллеза, обусловленного L-формами возбудителя. Поэтому разработка таких тест-систем с использованием специфических препаратов из L-форм бруцелл является актуальной.
Целью изобретения является разработка способа получения антигенного препарата из бруцелл в L-форме, пригодного для создания на его основе иммунобиологических препаратов для определения антител против бруцелл в L-форме в сыворотках крови людей и животных.
Поставленная цель достигается тем, что культивируют клетки штамма Brucella abortus И-206 в L-форме на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 3-5 суток. Микробную суспензию смывают забуференным 0,9% раствором хлорида натрия (pH 7,2±0,2) и инактивируют добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживают сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовят суспензию бруцелл по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 4,5·1010-5·1010 м.к. в мл. Далее суспензию подвергают термообработке на водяной бане при 100°C в течение 45-50 минут. После остывания суспензию центрифугируют при 7000 об/мин в течение 50-60 мин. Надосадочную жидкость отделяют, разливают в стеклянные ампулы по 1 мл и лиофильно высушивают.
В доступной литературе авторами не найдены способы получения антигенного препарата из бруцелл в L-форме. Предлагаемое техническое решение основано на том, что для получения препарата используется штамм бруцеллезного микроба Brucella abortus И-206 в L-форме. Данный штамм культивируют на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 3-5 суток. Микробную суспензию смывают с плотной питательной среды забуференным 0,9% раствором хлорида натрия (pH 7,2±0,2) и инактивируют добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживают сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовят суспензию бруцелл по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 4,5·1010-5·1010 м.к. в мл. Далее суспензию подвергают термообработке на водяной бане при 100°C в течение 45-50 минут. После остывания суспензию центрифугируют при 7000 об/мин в течение 50-60 мин. Надосадочную жидкость отделяют, разливают в стеклянные ампулы по 1 мл, лиофильно высушивают и запаивают.
Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения "новизна".
Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается от технических решений в данной и смежных областях. Предлагаемые режимы позволяют достичь поставленной цели - получить высокоспецифичный и активный препарат из бруцелл в L-форме, пригодный для создания на его основе иммунобиологических препаратов для определения антител против бруцелл в L-форме в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных.
Данный способ получения препарата из бруцелл в L-форме может быть использован при производстве иммунобиологических препаратов, используемых в медицинской и ветеринарной практике.
Таким образом, предлагаемый способ получения антигенного препарата соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".
Способ осуществляется следующим образом: культивируют клетки штамма Brucella abortus И-206 в L-форме на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 3-5 суток. Штамм Brucella abortus И-206 в L-форме находится в коллекции музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора.
Питательная среда для культивирования бруцелл в L-форме содержит следующие компоненты (мас.%): агар-агар 1,2, натрия хлорид 0,1, магния сульфат 0,05, сахарозу 10, глицерин 1,0, нормальную лошадиную сыворотку 10, бициллин - 3 (5-9)·103 ЕД/мл, печеночный настой - остальное.
Микробную суспензию смывают 0,9% раствором хлорида натрия, забуференного фосфатно-кислыми солями натрия и калия (двузамещенным фосфатно-кислым натрием и однозамещенным фосфатно-кислым калием), pH 7,2±0,2 и инактивируют добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживают сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовят суспензию бруцелл, используя 0,9% забуференный фосфатно-кислыми солями натрия и калия (двузамещенным фосфатно-кислым натрием и однозамещенным фосфатно-кислым калием) раствор хлорида натрия, pH 7,2±0,2, по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 4,5·1010-5·1010 м.к. в мл. Далее суспензию подвергают термообработке на водяной бане при 100°C в течение 45-50 минут. После остывания суспензию центрифугируют при 7000 об/мин в течение 50-60 мин. Надосадочную жидкость отделяют, разливают в стеклянные ампулы по 1 мл, лиофильно высушивают, после чего ампулы запаивают.
В 1 мл полученного предлагаемым способом препарата содержание белка составило 603,2-648,6 мкг, углеводов - 785-844,1 мкг, суммарных нуклеиновых кислот 9,5-10,2 мкг. ДСН-электрофорез в препарате, переосажденном этанолом, показал наличие 11 компонентов, окрашиваемых белковым красителем Кумасси ярко-синим R-250, из которых - два мажорных полипептида с мол. массами 62,8-67,5 и 69,3-74,5 кДа. Для создания суспензионной эритроцитарной тест-системы для РПГА препарат в количестве 7500 (150,8 мкг белка) и 10000 мкг (162,2 мкг белка) конъюгировали с 1 мл 5% эритроцитами барана.
Полученный препарат проверяли на специфичность и активность в реакциях кольцепреципитации (РК), иммунодиффузии в геле (РИД) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
Активность препарата в реакции кольцепреципитации с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме определяли образованием специфического кольца на границе препарата и сыворотки (положительная реакция) при разведении препарата до 1:160. Неразведенный препарат положительно реагировал со специфической антисывороткой против бруцелл в L-форме, разведенной до 1:10. В РИД в геле препарат при нагрузке на лунку 2-3 мг давал положительную реакцию с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме до разведения 1:8-1:16 соответственно. РПГА с гомологичной сывороткой была положительной до разведения 1:12800.
Специфичность препарата определяли с гипериммунными сыворотками против бруцелл и некоторых бактерий, имеющими с ними общие антигенные детерминанты и дающими перекрестные реакции: бруцеллезной против исходного штамма в S-форме, холерной диагностической «O», туляремийной диагностической. Специфическое взаимодействие препарата в РК и РИД с указанными сыворотками отсутствует, в РПГА отмечено слабое взаимодействие с поливалентной бруцеллезной сывороткой (S) до разведения 1:200, что свидетельствует о его высокой специфичности.
Полученный по предлагаемому способу препарат использовали для исследования сывороток крови больных хроническим бруцеллезом людей. В РК в 4,7% случаев получили положительные результаты, отмечены положительные реакции в РПГА до титров 1:800-1:1600, свидетельствующие о наличии в их сыворотках крови антител против бруцелл в L-форме.
Пример 1.
Клетки штамма Brucella abortus И-206 в L-форме выращивали на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 3 суток, при этом питательная среда содержала бициллин - 3 в количестве 5·103 ЕД/мл. Микробную суспензию смывали забуференным 0,9% раствором хлорида натрия pH 7,0 и инактивировали добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживали сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовили суспензию бруцелл, используя забуференный 0,9% раствор хлорида натрия pH 7,0, по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 4,5-1010 м.к./мл. Далее бактериальную суспензию подвергали термообработке на водяной бане при 100°C в течение 45 минут. После остывания суспензию центрифугировали при 7000 об/мин в течение 50 мин. Надосадочную жидкость отделяли, разливали в стеклянные ампулы по 1 мл и лиофильно высушивали.
В 1 мл полученного препарата содержание белка составило 603,2 мкг, углеводов - 785 мкг, суммарных нуклеиновых кислот 9,5 мкг. ДСН-электрофорез в препарате, переосажденном этанолом, показал наличие 11 компонентов, окрашиваемых белковым красителем Кумасси ярко-синим R-250, из которых два мажорных полипептида с мол. массами 62,8 и 69,3 кДа. Для создания суспензионной эритроцитарной тест-системы для РПГА препарат в количестве 7500 мкг (150,8 мкг белка) конъюгировали с 1 мл 5% эритроцитами барана.
Полученный препарат проверяли на специфичность и активность в реакциях кольцепреципитации (РК), иммунодиффузии в геле (РИД) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
Положительную реакцию препарата в РК с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме регистрировали при разведении препарата до 1:160. Неразведенный препарат положительно реагировал со специфической антисывороткой против бруцелл в L-форме, разведенной до 1:10. В РИД в геле препарат при нагрузке на лунку 2 мг давал положительную реакцию с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме до разведения 1:8. РПГА с гомологичной сывороткой была положительной до разведения 1:12800.
Специфичность препарата определяли с гипериммунными сыворотками против бруцелл и некоторых бактерий, имеющими с ними общие антигенные детерминанты и дающими перекрестные реакции: бруцеллезной против исходного штамма в S-форме, холерной диагностической «О», туляремийной диагностической. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии специфического взаимодействия препарата в РК и РИД с указанными сыворотками, в РПГА отмечено слабое взаимодействие с поливалентной бруцеллезной сывороткой (S) до разведения 1:200, что свидетельствует об его высокой специфичности.
Пример 2.
Клетки штамма Brucella abortus И-206 в L-форме выращивали на плотной питательной среде для культивирования бруцелл в L-форме при 37°C в течение 5 суток, при этом питательная среда содержала бициллин - 3 в количестве 9·103 ЕД/мл. Микробную суспензию смывали забуференным 0,9% раствором хлорида натрия pH 7,4 и инактивировали добавлением 2,5% (об./об.) формалина, после чего выдерживали сутки при 37°C. После контроля специфической стерильности готовили суспензию бруцелл, используя забуференный 0,9% раствор хлорида натрия pH 7,4, по стандарту мутности бактериальных взвесей 10 ед. ГИСК в концентрации, составляющей 5·1010 м.к./мл. Далее бактериальную суспензию подвергали термообработке на водяной бане при 100°C в течение 50 минут. После остывания суспензию центрифугировали при 7000 об/мин в течение 60 мин. Надосадочную жидкость отделяли, разливали в стеклянные ампулы по 1 мл и лиофильно высушивали.
В 1 мл полученного препарата содержание белка составило 648,6 мкг, углеводов - 844,1 мкг, суммарных нуклеиновых кислот 10,2 мкг. ДСН-электрофорез в препарате, переосажденном этанолом, показал наличие 11 компонентов, окрашиваемых белковым красителем Кумасси ярко-синим R-250, из которых два мажорных полипептида с мол. массами 67,5 и 74,5 кДа. Для создания суспензионной эритроцитарной тест-системы для РПГА препарат в количестве 10000 мкг (162,2 мкг белка) конъюгировали с 1 мл 5% эритроцитами барана.
Полученный препарат проверяли на специфичность и активность в реакциях кольцепреципитации (РК), иммунодиффузии в геле (РИД) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА)
Положительная реакция препарата в РК с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме регистрировалась при разведении препарата до 1:160. Неразведенный препарат положительно реагировал со специфической антисывороткой против бруцелл в L-форме, разведенной до 1:10. В РИД в геле препарат при нагрузке на лунку 3 мг давал положительную реакцию с гипериммунной кроличьей сывороткой против бруцелл в L-форме до разведения 1:16. РПГА с гомологичной сывороткой была положительной до разведения 1:12800.
Специфичность препарата определяли с гипериммунными сыворотками против бруцелл и некоторых бактерий, имеющими с ними общие антигенные детерминанты и дающими перекрестные реакции: бруцеллезной против исходного штамма в S-форме, холерной диагностической «О», туляремийной диагностической. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии специфического взаимодействия препарата в РК и РИД с указанными сыворотками, в РПГА отмечено слабое взаимодействие с поливалентной бруцеллезной сывороткой (S) до разведения 1:200, что свидетельствует о высокой специфичности полученного препарата.
Таким образом, предлагаемый способ получения антигенного препарата технологичен при производстве, не требует использования дорогостоящих приборов и оборудования и позволяет получать препарат, который обладает высокой специфичностью, активностью, что позволяет создавать на его основе иммунобиологические препараты и тест-системы для определения антител в сыворотках крови людей и животных против бруцелл в L-форме.
Claims (2)
1. Способ получения антигенного препарата из бруцелл в L-форме, включающий культивирование штамма Brucella abortus И-206 в L-форме на плотной питательной среде для бруцелл в L-форме при 37°С в течение 3-5 суток, смывание микробной массы забуференным 0,9%-ным раствором хлорида натрия с pH 7,2±0,2, инактивацию добавлением 2,5%-ного формалина, выдерживание бактериальной суспензии сутки при 37°С, контроль специфической стерильности, доведение бактериальной суспензии до концентрации 4,5·1010-5·1010 м.к. в мл забуференным 0,9%-ным раствором хлорида натрия (pH 7,2±0,2), проведение термообработки суспензии на водяной бане при 100°С в течение 45-50 мин, центрифугирование суспензии при 7000 об/мин в течение 50-60 мин, отделение и лиофилизацию надосадочной жидкости.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после отделения надосадочную жидкость разливают по 1 мл.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009120812/15A RU2416429C2 (ru) | 2009-06-01 | 2009-06-01 | Способ получения антигенного препарата из бруцелл в l-форме |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009120812/15A RU2416429C2 (ru) | 2009-06-01 | 2009-06-01 | Способ получения антигенного препарата из бруцелл в l-форме |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009120812A RU2009120812A (ru) | 2010-12-10 |
RU2416429C2 true RU2416429C2 (ru) | 2011-04-20 |
Family
ID=44051477
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009120812/15A RU2416429C2 (ru) | 2009-06-01 | 2009-06-01 | Способ получения антигенного препарата из бруцелл в l-форме |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2416429C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2539827C1 (ru) * | 2013-08-27 | 2015-01-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) | Способ получения бруцеллезного l-антигена |
-
2009
- 2009-06-01 RU RU2009120812/15A patent/RU2416429C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
БАЗИКОВ И.А. Л-трансформация бруцелл. Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций. Тезисы докладов областной научной конференции молодых ученых, 17-20 октября 1989 г., Ростов-на-Дону, 1989, стр.5-8. Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты. - М.: изд-во сельскохозяйственной литературы, журналов и плакатов, 1963, с.358-359. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2539827C1 (ru) * | 2013-08-27 | 2015-01-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) | Способ получения бруцеллезного l-антигена |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2009120812A (ru) | 2010-12-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104007269B (zh) | 一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用 | |
CN104258386B (zh) | 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合 | |
RU2607006C1 (ru) | Тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae | |
RU2416429C2 (ru) | Способ получения антигенного препарата из бруцелл в l-форме | |
RU2549434C2 (ru) | Способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки | |
RU2361610C1 (ru) | Способ получения бруцеллезного антигена из штамма brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для ра, рск и рдск, бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (рбп) и бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (кр) с молоком, способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки и диагностические наборы | |
US20210025888A1 (en) | Crude native hapten-based indirect elisa assay kit and lyophilised controls for the confirmatory diagnosis of bovine brucellosis in blood serum and milk by animal and tank | |
RU2538158C1 (ru) | Способ изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота | |
RU2388489C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий | |
Staroverov et al. | Use of gold nanoparticles for the preparation of antibodies to tuberculin, the immunoassay of mycobacteria, and animal vaccination | |
RU2539827C1 (ru) | Способ получения бруцеллезного l-антигена | |
RU2366453C2 (ru) | Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при анаплазмозе крупного рогатого скота | |
RU2316345C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий | |
RU2772751C1 (ru) | Способ получения гипериммунной сыворотки к аденовирусу bovine-10 крупного рогатого скота | |
RU2707289C1 (ru) | Способ изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и псевдомоноза крупного рогатого скота | |
RU2043770C1 (ru) | Способ получения вакцины против некробактериоза животных | |
RU2288002C1 (ru) | Способ изготовления вакцины против энтерококковой инфекции нутрий | |
CN106771274A (zh) | 牛布鲁氏菌参考血清库 | |
RU2252031C1 (ru) | Способ получения иммунной сыворотки к антигенам вирулентного штамма bacillus anthracis | |
RU2049815C1 (ru) | Штамм бактерий leptospira interrogans, предназначенный для получения лептоспирозных вакцин | |
RU2639127C2 (ru) | Способ получения бруцеллёзной моноспецифической сыворотки anti-abortus | |
RU2815538C1 (ru) | Способ изготовления вакцины поливалентной против лептоспироза лошадей | |
RU2753265C1 (ru) | Способ получения гипериммунной сыворотки крови кролика к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis с использованием в качестве адьюванта гидроксиапатита | |
RU2746141C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ (варианты) | |
RU2263142C2 (ru) | Способ получения l-субкультур штамма brucella abortus и-206 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130602 |