RU2415869C2 - Dll4 antibodies and methods of application thereof - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention represents an airra-DLL4-antibody, a coding polynucleotide, a vector, a host cell, a method for producing an antibody, compositions containing such antibodies, and methods of application thereof.

EFFECT: invention can be used effectively for treatment or prevention of pathological conditions associated with DLL4 expression or activity.

27 cl, 59 dwg, 3 tbl, 14 ex

Description

Область, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

В общих чертах, настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Более конкретно настоящее изобретение относится к анти-DLL4-антителам и к их применению.In General terms, the present invention relates to the field of molecular biology. More specifically, the present invention relates to anti-DLL4 antibodies and their use.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Обеспечение кровоснабжения является основной потребностью для многих физиологических и патологических процессов. Для активного роста тканей, таких как эмбрионы и опухоли, необходимо адекватное кровоснабжение. Такое кровоснабжение обеспечивается благодаря продуцированию проангиогенных факторов, стимулирующих образование новых кровеносных сосудов в процессе, называемом ангиогенезом. Образование сосудов является сложным, но планомерным биологическим процессом, включающим в себя все или многие из следующих стадий: a) пролиферацию эндотелиальных клеток (EC) из существующих EC или их дифференцировку из клеток-предшественников; b) миграцию и коалесценцию EC с образованием канатико-подобных структур; c) тубулогенез сосудистых канатиков с образованием сосудов, имеющих центральный просвет; d) разрастание существующих канатиков или сосудов с образованием вторичных сосудов; e) последующее ремоделирование и образование новых форм из первичного сосудистого сплетения; и f) рекрутинг периэндотельальных клеток в эндотелиальные сосуды, что сообщает этим сосудам поддерживающие и модуляторные функции, где указанными клетками являются перициты для небольших капилляров, клетки гладких мышц для более крупных сосудов и клетки миокарда в сердце. Hanahan, Science 277:48-50 (1997); Hogan & Kolodziej, Nat. Rev. Genet. 3:513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112:19-28 (2003).Providing blood supply is a basic need for many physiological and pathological processes. For active tissue growth, such as embryos and tumors, adequate blood supply is needed. This blood supply is ensured by the production of pro-angiogenic factors that stimulate the formation of new blood vessels in a process called angiogenesis. Vascular formation is a complex but systematic biological process that includes all or many of the following stages: a) proliferation of endothelial cells (EC) from existing ECs or their differentiation from progenitor cells; b) EC migration and coalescence to form rope-like structures; c) tubulogenesis of vascular cords with the formation of vessels with a central lumen; d) proliferation of existing cords or vessels with the formation of secondary vessels; e) subsequent remodeling and the formation of new forms from the primary vascular plexus; and f) recruiting periendothelial cells to the endothelial vessels, which provides these vessels with supporting and modulatory functions, where the indicated cells are pericytes for small capillaries, smooth muscle cells for larger vessels, and myocardial cells in the heart. Hanahan, Science 277: 48-50 (1997); Hogan & Kolodziej, Nat. Rev. Genet. 3: 513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112: 19-28 (2003).

В настоящее время хорошо известно, что ангиогенез участвует в патогенезе различных заболеваний. Такими заболеваниями являются солидные опухоли и метастазы, атеросклероз, ретролентальная фиброплазия, гемангиомы, хроническое воспаление, внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как пролиферативные ретинопатии, например диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), неоваскулярная глаукома, иммунное отторжение имплантированной ткани роговицы и других тканей, ревматоидный артрит и псориаз. Folkman et al., J. Biol. Chem. 267:10931-34 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); и Garner A., “Vascular diseases,” In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp.1625-1710.It is now well known that angiogenesis is involved in the pathogenesis of various diseases. Such diseases are solid tumors and metastases, atherosclerosis, retrolental fibroplasia, hemangiomas, chronic inflammation, intraocular neovascular diseases such as proliferative retinopathies, such as diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD), neovascular glaucoma, and immune tissue , rheumatoid arthritis and psoriasis. Folkman et al., J. Biol. Chem. 267: 10931-34 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39 (1991); and Garner A., “Vascular diseases,” In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp. 1625-1710.

В случае роста опухоли ангиогенез, очевидно, играет решающую роль в переходе от гиперплазии к неоплазии и в обеспечении поступления питательных элементов, необходимых для роста опухолей и образования метастазов. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). Неоваскуляризация способствует преимущественному росту опухолевых клеток и приобретению ими пролиферативной автономии по сравнению с нормальными клетками. Развитие опухоли обычно начинается с одной аберрантной клетки, которая может пролиферироваться только до размера в несколько кубических миллиметров, что обусловлено определенным расстоянием от доступного капиллярного ложа, и такая клетка может оставаться «спящей», то есть она может не подвергаться дальнейшему росту и диссеминированию в течение длительного периода. Затем некоторые опухолевые клетки приобретают ангиогенный фенотип с активацией эндотелиальных клеток, которые после пролиферации и созревания образуют новые капиллярные кровеносные сосуды. Эти новообразованные сосуды не только способствуют продолжению роста первичной опухоли, но также диссеминированию и реколонизации метастатических опухолевых клеток. В соответствии с этим наблюдается корреляция между плотностью микрососудов в опухолевых срезах и выживаемостью пациентов, страдающих раком молочной железы и некоторыми другими опухолями. Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-24 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-46 (1992). Точные механизмы, регулирующие переключение ангиогенеза, пока еще не установлены, хотя и вероятно, что неоваскуляризация опухолевой массы является результатом общего соотношения множества стимуляторов и ингибиторов ангиогенеза (Folkman, Nat. Med. 1(1):27-31 (1995)).In the case of tumor growth, angiogenesis obviously plays a decisive role in the transition from hyperplasia to neoplasia and in ensuring the supply of nutrients necessary for tumor growth and the formation of metastases. Folkman et al., Nature 339: 58 (1989). Neovascularization promotes the predominant growth of tumor cells and their acquisition of proliferative autonomy compared to normal cells. Tumor development usually begins with one aberrant cell, which can proliferate only to a size of several cubic millimeters, which is due to a certain distance from the available capillary bed, and such a cell may remain “dormant”, that is, it may not undergo further growth and dissemination during long period. Then, some tumor cells acquire an angiogenic phenotype with activation of endothelial cells, which, after proliferation and maturation, form new capillary blood vessels. These newly formed vessels not only contribute to the continued growth of the primary tumor, but also the dissemination and recolonization of metastatic tumor cells. In accordance with this, there is a correlation between the density of microvessels in tumor sections and the survival rate of patients with breast cancer and some other tumors. Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340: 1120-24 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340: 145-46 (1992). The exact mechanisms governing the switching of angiogenesis have not yet been established, although it is likely that neovascularization of the tumor mass is the result of a common ratio of many stimulants and inhibitors of angiogenesis (Folkman, Nat. Med. 1 (1): 27-31 (1995)).

Процесс развития сосудов строго регулируется. В настоящее время уже известно, что большое число молекул, главным образом секретируемых факторов, продуцируемых окружающими клетками, регулируют дифференцировку, пролиферацию, миграцию и коалесценцию ЕС с образованием канатико-подобных структур. Так, например, васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF) был идентифицирован как ключевой фактор, участвующий в стимуляции ангиогенеза и в индуцировании проницаемости сосудов. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). Обнаружение того факта, что потеря даже одного аллеля VEGF приводит к гибели эмбриона, указывает на незаменимую роль, которую играет этот фактор в развитии и дифференцировке сосудистой системы. Кроме того, было показано, что VEGF является ключевым медиатором неоваскуляризации, ассоциированной с развитием опухолевых и внутриглазных заболеваний. Ferrara et al., Endocr. Rev. см. выше. мРНК VEGF сверхэкспрессируется большинством исследуемых человеческих опухолей. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-59 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-35 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-34 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-39 (1995). The process of vascular development is strictly regulated. It is now known that a large number of molecules, mainly secreted factors produced by surrounding cells, regulate the differentiation, proliferation, migration and coalescence of the EU with the formation of rope-like structures. For example, vascular endothelial growth factor (VEGF) has been identified as a key factor involved in stimulating angiogenesis and in inducing vascular permeability. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18: 4-25 (1997). The discovery of the fact that the loss of even one VEGF allele leads to embryo death indicates the indispensable role that this factor plays in the development and differentiation of the vascular system. In addition, VEGF has been shown to be a key mediator of neovascularization associated with the development of tumor and intraocular diseases. Ferrara et al., Endocr. Rev. see above. VEGF mRNA is overexpressed by most of the studied human tumors. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91: 153-59 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26: 86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53: 4727-35 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73: 931-34 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146: 1029-39 (1995).

Кроме того, уровни концентрации VEGF во внутриглазной жидкости в значительной степени коррелируют с активной пролиферацией кровеносных сосудов у пациентов с диабетической ретинопатией и другой ассоциированной с ишемией ретинопатией. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-87 (1994). Кроме того, были проведены исследования, которые выявили локализацию VEGF в хороидальных неоваскулярных мембранах у пациентов, страдающих AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-68 (1996).In addition, VEGF concentrations in the intraocular fluid are significantly correlated with active proliferation of blood vessels in patients with diabetic retinopathy and other ischemia-associated retinopathy. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331: 1480-87 (1994). In addition, studies have been conducted that have identified VEGF localization in choroidal neovascular membranes in patients with AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 37: 855-68 (1996).

Нейтрализующие анти-VEGF-антитела подавляют рост различных человеческих опухолевых клеточных линий у «голых» мышей (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995); Borgstrum et al., Cancer Res. 56:4032-39 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-24 (1996)), также ингибируют внутриглазной ангиогенез в моделях ишемических заболеваний сетчатки (Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). Поэтому моноклональные анти-VEGF-антитела или другие ингибиторы действия VEGF являются перспективными кандидатами на их применение для лечения опухолевых и различных внутриглазных неоваскулярных заболеваний. Такие антитела описаны, например, в EP 817648, опубликованном 14 января 1998; в заявках WO 98/45331 и WO 98/45332, опубликованных 15 октября 1998. Одно из анти-VEGF-антител, бевацизумаб, было разрешено Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) к его применению в комбинации с химиотерапией для лечения конкретных раковых заболеваний, фрагмент анти-VEGF-антитела, ранибизумаб, был разрешен FDA к применению для лечения возрастной (мокрой) дегенерации желтого пятна. В настоящее время оба этих лекарственных средства проходят клинические испытания. Neutralizing anti-VEGF antibodies inhibit the growth of various human tumor cell lines in nude mice (Kim et al., Nature 362: 841-44 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95: 1789-97 (1995); Borgstrum et al., Cancer Res. 56: 4032-39 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56: 921-24 (1996)) also inhibit intraocular angiogenesis in models of ischemic retinal diseases (Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114: 66-71 (1996)). Therefore, monoclonal anti-VEGF antibodies or other inhibitors of the action of VEGF are promising candidates for their use in the treatment of tumor and various intraocular neovascular diseases. Such antibodies are described, for example, in EP 817648, published January 14, 1998; in applications WO 98/45331 and WO 98/45332 published on October 15, 1998. One of the anti-VEGF antibodies, bevacizumab, was approved by the Food and Drug Administration for the use of the drug in combination with chemotherapy for the treatment of specific cancers, a fragment of the anti-VEGF antibody, ranibizumab, has been approved by the FDA for the treatment of age-related (wet) macular degeneration. Both of these drugs are currently undergoing clinical trials.

Очевидно, что необходимость получения агентов, которые обладают клиническими признаками, являющимися оптимальными для разработки терапевтических средств, остается актуальной. Изобретение, описанное в настоящей заявке, удовлетворяет этим требованием и имеет другие преимущества. It is obvious that the need to obtain agents that have clinical signs that are optimal for the development of therapeutic agents remains relevant. The invention described in this application satisfies this requirement and has other advantages.

Все цитируемые здесь работы, включая патентные заявки и публикации, во всей их полноте включены в настоящее описание посредством ссылки.All works cited herein, including patent applications and publications, are hereby incorporated by reference in their entirety.

Описание сущности изобретенияDescription of the invention

Настоящее изобретение частично основано на идентификации различных DLL4-связывающих агентов (таких как иммуноконъюгаты, антитела и их фрагменты). DLL4 представляет собой важную и предпочтительную терапевтическую мишень, и настоящее изобретение относится к композициям и к способам, основанным на связывании с DLL4. Описанные здесь DLL4-связывающие агенты согласно изобретению представляют собой важные терапевтические и диагностические средства, которые могут быть использованы для лечения патологических состояний, ассоциированных с экспрессией и/или активностью каскада реакций DLL4-рецептора Notch. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способам, композициям, наборам и промышленным изделиям, ассоциированным с DLL4-связыванием. The present invention is based in part on the identification of various DLL4 binding agents (such as immunoconjugates, antibodies, and fragments thereof). DLL4 is an important and preferred therapeutic target, and the present invention relates to compositions and methods based on binding to DLL4. The DLL4 binding agents described herein according to the invention are important therapeutic and diagnostic agents that can be used to treat pathological conditions associated with the expression and / or activity of the Notch DLL4 receptor reaction cascade. Accordingly, the present invention relates to methods, compositions, kits, and industrial products associated with DLL4 binding.

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются (например, специфически связываются) с DLL4.The present invention relates to antibodies that bind (e.g., specifically bind) to DLL4.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному анти-DLL4-антителу, где полноразмерная IgG-форма антитела специфически связывается с человеческим DLL4 с аффинностью связывания примерно 1 нМ или более или примерно 500 пМ или более. Как хорошо известно специалистам, аффинность связывания лиганда с его рецептором может быть определена с помощью различных анализов и выражена различными количественными величинами. В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения аффинность связывания выражена величинами Kd и представляет собой природную аффинность связывания (например, с минимальными эффектами авидности). Обычно и предпочтительно аффинность связывания измеряют in vitro в бесклеточной или в клеточной среде. Для измерения аффинности связывания может быть использован любой из известных анализов, включая описанные здесь анализы, например Biacore®, радиоиммуноанализ (РИА) и ELISA. В некоторых вариантах изобретения выделенное анти-DLL4-антитело связывается с человеческим и мышиным DLL4 с аналогичной аффинностью, то есть аффинность связывания с человеческим DLL4 превышает аффинность связывания с мышиным DLL4 не более чем в 100 раз или менее. В некоторых вариантах изобретения аффинность связывания с человеческим DLL4 превышает аффинность связывания с мышиным DLL4 не более чем в 10 раз или менее. В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с мышиным DLL4 с аффинностью связывания примерно 1 нМ или более или примерно 500 пМ или более.In one aspect, the present invention provides an isolated anti-DLL4 antibody, wherein the full-length IgG antibody form specifically binds to human DLL4 with a binding affinity of about 1 nM or more or about 500 pM or more. As is well known to specialists, the affinity of binding of a ligand to its receptor can be determined using various assays and expressed in various quantitative quantities. Accordingly, in one embodiment of the invention, the binding affinity is expressed by Kd values and represents the natural binding affinity (for example, with minimal avidity effects). Typically and preferably, binding affinity is measured in vitro o in a cell-free or cell medium. To measure the binding affinity, any of the known assays can be used, including the assays described here, for example Biacore®, radioimmunoassay (RIA) and ELISA. In some embodiments of the invention, the isolated anti-DLL4 antibody binds to human and murine DLL4 with similar affinity, that is, the binding affinity of the human DLL4 exceeds the binding affinity of the murine DLL4 by no more than 100 times or less. In some embodiments of the invention, the binding affinity for human DLL4 exceeds the binding affinity for murine DLL4 by no more than 10 times or less. In some embodiments of the invention, the antibody specifically binds to murine DLL4 with a binding affinity of about 1 nM or more, or about 500 pM or more.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному анти-DLL4-антителу, где полноразмерная IgG-форма антитела специфически связывается с человеческим DLL4 с k_on примерно 2×10⁵ или более или примерно 1×10⁵ или более. Как хорошо известно специалистам, k_on связывания лиганда с его рецептором может быть определена с помощью различных анализов и выражена различными количественными величинами. In one aspect, the present invention provides an isolated anti-DLL4 antibody, wherein the full-length IgG form of the antibody specifically binds to human DLL4 with k _{on of} about 2 × 10 ⁵ or more or about 1 × 10 ⁵ or more. As is well known to those skilled in the art, k _on binding of a ligand to its receptor can be determined using various assays and expressed in various quantitative quantities.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое связывается с лиганд-связывающей областью DLL4. В некоторых вариантах изобретения, выделенное антитело связывается с полипептидом, включающим внеклеточный домен DLL4 или состоящим, или, в основном, состоящим из этого домена. В некоторых вариантах изобретения выделенное антитело связывается с полипептидом, включающим, состоящим или, в основном, состоящим из них, аминокислоты 252-282, 1-252, 1-286, 1-324 и/или 219-286 человеческого DLL4.In one aspect, the present invention provides an isolated antibody that binds to the ligand binding region of DLL4. In some embodiments of the invention, the isolated antibody binds to a polypeptide comprising the extracellular domain of DLL4 or consisting of, or essentially consisting of, this domain. In some embodiments of the invention, the isolated antibody binds to a polypeptide comprising, consisting of, or essentially consisting of, amino acids 252-282, 1-252, 1-286, 1-324 and / or 219-286 of a human DLL4.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному анти-DLL4-антителу, которое конкурирует с рецептором Notch за связывание с DLL4.In one aspect, the present invention provides an isolated anti-DLL4 antibody that competes with the Notch receptor for binding to DLL4.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному анти-DLL4-антителу, которое ингибирует, снижает и/или блокирует биологическую активность DLL4. In one of its aspects, the present invention relates to an isolated anti-DLL4 antibody that inhibits, reduces and / or blocks the biological activity of DLL4.

В одном из аспектов изобретения анти-DLL4-антитело согласно изобретению включает:In one aspect of the invention, an anti-DLL4 antibody of the invention includes:

(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей гипервариабельных областей (HVR), выбранных из группы, состоящей из: (a) at least one, two, three, four, five, or six sequences of hypervariable regions (HVR) selected from the group consisting of:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A11, где A1-A11 представляет собой RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:10);(i) an HVR-L1 comprising the sequence A1-A11, wherein A1-A11 is RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 10);

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой SASFLYS (SEQ ID NO:11);(ii) an HVR-L2 containing the sequence B1-B7, where B1-B7 is SASFLYS (SEQ ID NO: 11);

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSYNGPST (SEQ ID NO:15);(iii) an HVR-L3 containing the sequence C1-C9, wherein C1-C9 is QQSYNGPST (SEQ ID NO: 15);

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GFTFTDNWIS (SEQ ID NO:1);(iv) an HVR-H1 comprising the sequence D1-D10, wherein D1-D10 is GFTFTDNWIS (SEQ ID NO: 1);

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GVINPNSGATEYADSVKG (SEQ ID NO:5) и(v) an HVR-H2 containing the sequence E1-E18, where E1-E18 is GVINPNSGATEYADSVKG (SEQ ID NO: 5) and

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F15, где F1-F15 представляет собой VYYCARDNFGGYFDY (SEQ ID NO:9); и(vi) an HVR-H3 comprising the sequence F1-F15, wherein F1-F15 is VYYCARDNFGGYFDY (SEQ ID NO: 9); and

(b) по меньшей мере один вариант HVR, где указанный вариант последовательности HVR имеет модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленной в SEQ ID NO:1-18. (b) at least one HVR variant, wherein said HVR sequence variant has a modification of at least one residue of the sequence shown in SEQ ID NO: 1-18.

В одном из аспектов изобретения анти-DLL4-антитело согласно изобретению включает:In one aspect of the invention, an anti-DLL4 antibody of the invention includes:

(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре или пять последовательностей гипервариабельных областей (HVR), выбранных из группы, состоящей из:(a) at least one, two, three, four or five sequences of hypervariable regions (HVR) selected from the group consisting of:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A11, где A1-A11 представляет собой RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:10);(i) an HVR-L1 comprising the sequence A1-A11, wherein A1-A11 is RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 10);

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой SASFLYS (SEQ ID NO:11);(ii) an HVR-L2 containing the sequence B1-B7, where B1-B7 is SASFLYS (SEQ ID NO: 11);

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSVNGPAT (SEQ ID NO:14);(iii) an HVR-L3 containing the sequence C1-C9, wherein C1-C9 is QQSVNGPAT (SEQ ID NO: 14);

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GFSFRDNWIS (SEQ ID NO:2);(iv) an HVR-H1 comprising the sequence D1-D10, wherein D1-D10 is GFSFRDNWIS (SEQ ID NO: 2);

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GVINPNSGSTDYADSVKG (SEQ ID NO:3); (v) an HVR-H2 containing the sequence E1-E18, where E1-E18 is GVINPNSGSTDYADSVKG (SEQ ID NO: 3);

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F15, где F1-F15 представляет собой VYYCARDNFGGYFDY (SEQ ID NO:9); и(vi) an HVR-H3 comprising the sequence F1-F15, wherein F1-F15 is VYYCARDNFGGYFDY (SEQ ID NO: 9); and

(b) по меньшей мере один вариант HVR, где указанный вариант последовательности HVR имеет модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленной в SEQ ID NO:1-18.(b) at least one HVR variant, wherein said HVR sequence variant has a modification of at least one residue of the sequence shown in SEQ ID NO: 1-18.

В одном из аспектов изобретения анти-DLL4-антитело согласно изобретению включает:In one aspect of the invention, an anti-DLL4 antibody of the invention includes:

(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре или пять последовательностей гипервариабельных областей (HVR), выбранных из группы, состоящей из:(a) at least one, two, three, four or five sequences of hypervariable regions (HVR) selected from the group consisting of:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A11, где A1-A11 представляет собой RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:10);(i) an HVR-L1 comprising the sequence A1-A11, wherein A1-A11 is RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 10);

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой SASFLYS (SEQ ID NO:11);(ii) an HVR-L2 containing the sequence B1-B7, where B1-B7 is SASFLYS (SEQ ID NO: 11);

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSYTGTVT (SEQ ID NO:18);(iii) an HVR-L3 containing the sequence C1-C9, wherein C1-C9 is QQSYTGTVT (SEQ ID NO: 18);

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GFTFTDNWIS (SEQ ID NO:1);(iv) an HVR-H1 comprising the sequence D1-D10, wherein D1-D10 is GFTFTDNWIS (SEQ ID NO: 1);

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GYISPNSGFTYYADSVKG (SEQ ID NO:8) and(v) an HVR-H2 containing the sequence E1-E18, where E1-E18 is GYISPNSGFTYYADSVKG (SEQ ID NO: 8) and

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F15, где F1-F15 представляет собой VYYCARDNFGGYFDY (SEQ ID NO:9); и(vi) an HVR-H3 comprising the sequence F1-F15, wherein F1-F15 is VYYCARDNFGGYFDY (SEQ ID NO: 9); and

(b) по меньшей мере один вариант HVR, где указанный вариант последовательности HVR имеет модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленной в SEQ ID NO:1-18.(b) at least one HVR variant, wherein said HVR sequence variant has a modification of at least one residue of the sequence shown in SEQ ID NO: 1-18.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, где каждая HVR включает последовательность или состоит, или, в основном, состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-18, и где SEQ ID NO:10 соответствует HVR-L1, SEQ ID NO:11 соответствует HVR-L2, SEQ ID NO:12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 соответствуют HVR-L3, SEQ ID NO:1 или 2 соответствуют HVR-H1, SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 или 8 соответствуют HVR-H2, SEQ ID NO:9 соответствует HVR-H3. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 12, 1, 3, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 13, 1, 4, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 14, 2, 3, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 15, 1, 5, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 16, 1, 6, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 17, 1, 7, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 18, 1, 8, 9.In one of its aspects, the present invention relates to an antibody comprising one, two, three, four, five or six HVRs, where each HVR comprises a sequence or consists of, or mainly consists of, a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-18, and where SEQ ID NO: 10 corresponds to HVR-L1, SEQ ID NO: 11 corresponds to HVR-L2, SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17 or 18 correspond to HVR-L3, SEQ ID NO: 1 or 2 correspond to HVR-H1, SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 or 8 correspond to HVR-H2, SEQ ID NO: 9 corresponds to HVR-H3. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3, where each of these regions includes, in that order, SEQ ID NO: 10, 11, 12, 1, 3, 9. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, where each of these regions includes in this order SEQ ID NO: 10, 11, 13, 1, 4, 9. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3, where each of these areas includes, in that order, SEQ ID NO: 10, 11, 14, 2, 3, 9. In one embodiment, of the invention, the antibody of the invention comprises HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3, where each of these regions includes, in that order, SEQ ID NO: 10, 11, 15, 1, 5, 9. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3, where each of these regions includes, in that order, SEQ ID NO: 10, 11, 16, 1, 6, 9. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3, where each of these areas includes in that order SEQ ID NO: 10, 11, 17, 1, 7, 9. In one embodiment of the invention, an antibody o according to the invention contains HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3, where each of these areas includes in this order SEQ ID NO: 10, 11, 18, 1, 8 , 9.

Варианты HVR в антителе согласно изобретению могут иметь модификации в одном или нескольких (например, в двух, трех, четырех, пяти или более) остатках в HVR. Variants of the HVR in an antibody of the invention may have modifications in one or more (e.g., two, three, four, five or more) residues in the HVR.

В одном из вариантов изобретения вариант HVR-L3 содержит 1-6 (1, 2, 3, 4, 5 или 6) замен в любой комбинации в нижеследующих положениях: 91 (S или W), 92 (Y или F), 93 (T, N или S), 94 (T или G), 95 (P, Q, A или T) и/или 96 (P, S, A или V).In one embodiment of the invention, the HVR-L3 variant contains 1-6 (1, 2, 3, 4, 5, or 6) substitutions in any combination in the following positions: 91 (S or W), 92 (Y or F), 93 ( T, N or S), 94 (T or G), 95 (P, Q, A or T) and / or 96 (P, S, A or V).

В одном из вариантов изобретения вариант HVR-H2 содержит 1-4 (1, 2, 3 или 4) замен в любой комбинации в нижеследующих положениях: 50 (V, L или Y), 52 (N или S), 52a (P или S) или 53 (N, Q, T или I). In one embodiment of the invention, the HVR-H2 variant contains 1-4 (1, 2, 3 or 4) substitutions in any combination in the following positions: 50 (V, L or Y), 52 (N or S), 52a (P or S) or 53 (N, Q, T or I).

Буквы в скобках после каждого положения указывают на репрезентативное замещение (то есть репрезентативную замену) аминокислот; и как очевидно специалисту в данной области, допустимость замены одной аминокислоты другой аминокислотой в соответствии с описанным здесь изобретением может быть оценена рутинными известными и/или описанными здесь методами.The letters in brackets after each position indicate a representative substitution (i.e., a representative replacement) of amino acids; and as one skilled in the art will recognize, the feasibility of replacing one amino acid with another amino acid in accordance with the invention described herein can be evaluated by routine methods known and / or described herein.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-H1, содержащую последовательность SEQ ID NO:1 или 2. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-H2, содержащую последовательность SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 или 8. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-H3, содержащую последовательность SEQ ID NO:9. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-L1, содержащую последовательность SEQ ID NO:10. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-L2, содержащую последовательность SEQ ID NO:11. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-L3, содержащую последовательность SEQ ID NO:12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18.In one of its aspects, the present invention relates to an antibody comprising an HVR-H1 region containing the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. In one of its aspects, the present invention relates to an antibody comprising an HVR-H2 region containing a sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 or 8. In one of its aspects, the present invention relates to an antibody comprising an HVR-H3 region comprising the sequence of SEQ ID NO: 9. In one embodiment, the present invention provides an antibody comprising an HVR-L1 region comprising the sequence of SEQ ID NO: 10. In one embodiment, the present invention provides an antibody comprising an HVR-L2 region comprising the sequence of SEQ ID NO: 11. In one embodiment, the present invention provides an antibody comprising an HVR-L3 region comprising the sequence of SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, or 18.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три нижеследующие последовательности: In one of its aspects, the present invention relates to an antibody comprising at least one, at least two, or all three of the following sequences:

(i) последовательность HVR-H1, содержащую последовательность SEQ ID NO:1;(i) an HVR-H1 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 1;

(ii) последовательность HVR-H2, содержащую последовательность SEQ ID NO:5;(ii) an HVR-H2 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 5;

(iii) последовательность HVR-H3, содержащую последовательность SEQ ID NO:9.(iii) an HVR-H3 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 9.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три нижеследующие последовательности:In one of its aspects, the present invention relates to an antibody comprising at least one, at least two, or all three of the following sequences:

(i) последовательность HVR-L1, содержащую последовательность SEQ ID NO:10;(i) an HVR-L1 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 10;

(ii) последовательность HVR-L2, содержащую последовательность SEQ ID NO:11;(ii) an HVR-L2 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 11;

(iii) последовательность HVR-L3, содержащую последовательность SEQ ID NO:15.(iii) an HVR-L3 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 15.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три нижеследующие последовательности:In one of its aspects, the present invention relates to an antibody comprising at least one, at least two, or all three of the following sequences:

(i) последовательность HVR-H1, содержащую последовательность SEQ ID NO:1;(i) an HVR-H1 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 1;

(ii) последовательность HVR-H2, содержащую последовательность SEQ ID NO:8;(ii) an HVR-H2 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 8;

(iii) последовательность HVR-H3, содержащую последовательность SEQ ID NO:9.(iii) an HVR-H3 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 9.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три нижеследующие последовательности:In one of its aspects, the present invention relates to an antibody comprising at least one, at least two, or all three of the following sequences:

(i) последовательность HVR-L1, содержащую последовательность SEQ ID NO:10;(i) an HVR-L1 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 10;

(ii) последовательность HVR-L2, содержащую последовательность SEQ ID NO:11;(ii) an HVR-L2 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 11;

(iii) последовательность HVR-L3, содержащую последовательность SEQ ID NO:18.(iii) an HVR-L3 sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 18.

Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-18 пронумерованы для каждой отдельной HVR (то есть H1, H2 или H3), как показано на фигурах 1a и 1b, где указанная нумерация соответствует системе нумерации Кэбата, описанной ниже. The amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-18 are numbered for each individual HVR (i.e., H1, H2 or H3), as shown in Figures 1a and 1b, where the numbering corresponds to the Kabat numbering system described below.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителам, включающим последовательности HVR тяжелой цепи, как показано на фигурах 1a и 1b.In one of its aspects, the present invention relates to antibodies comprising heavy chain HVR sequences, as shown in figures 1a and 1b.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителам, включающим последовательности HVR легкой цепи, как показано на фигурах 1a и 1b. In one of its aspects, the present invention relates to antibodies comprising light chain HVR sequences, as shown in figures 1a and 1b.

Некоторые варианты антител согласно изобретению включают вариабельный домен легкой цепи гуманизованного антитела 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN^®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также описанного в патенте США № 6407213 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93)), представленного ниже в SEQ ID NO:52.Some embodiments of antibodies of the invention comprise a light chain variable domain of humanized antibody ^{4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN ®,} Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) ( also described in U.S. Patent № 6,407,213 and Lee et al., J . Mol. Biol. (2004), 340 (5): 1073-93)) presented below in SEQ ID NO: 52.

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:52) (остатки HVR подчеркнуты).1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO: 52) (HVR residues underlined).

В одном из вариантов изобретения последовательность вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 модифицирована в одном или нескольких положениях 30, 66 и 91 (Asn, Arg и His указаны выше жирным шрифтом/курсивом соответственно). В одном из вариантов изобретения модифицированная последовательность huMAb4D5-8 содержит Ser в положении 30, Gly в положении 66 и/или Ser в положении 91. В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, имеющий последовательность, представленную ниже в SEQ ID NO:53:In one embodiment of the invention, the huMAb4D5-8 light chain variable domain sequence is modified at one or more positions 30, 66 and 91 (Asn, Arg and His are shown above in bold / italics, respectively). In one embodiment of the invention, the modified huMAb4D5-8 sequence contains Ser at position 30, Gly at position 66, and / or Ser at position 91. Accordingly, in one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain having the sequence represented by below in SEQ ID NO: 53:

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:53) (остатки HVR подчеркнуты).1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO: 53) (HVR residues underlined).

Замененные остатки в huMAb4D5-8 указаны выше жирным шрифтом/курсивом.Replaced residues in huMAb4D5-8 are indicated above in bold / italics.

Антитела согласно изобретению могут содержать любую подходящую последовательность каркасного домена в вариабельной области при условии, что активность связывания с DLL4 будет, в основном, сохраняться. Так, например, в некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасных областей содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител, в положении 71 присутствует A, в положении 73 присутствует T и/или в положении 78 присутствует A. В одном из вариантов изобретения указанные антитела включают каркасные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также описанного в патентах США №№ 6407213 и 5821337 и в публикации Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93). В одном из вариантов изобретения эти антитела также включают консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи κI. В одном из вариантов изобретения указанные антитела включают последовательности HVR легкой цепи huMAb4D5-8 (описанные в патентах США №№ 6407213 и 5821337). В одном из вариантов изобретения указанные антитела включают последовательности вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также описанного в патентах США №№ 6407213 и 5821337 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93).Antibodies according to the invention may contain any suitable sequence of the frame domain in the variable region, provided that the activity of binding to DLL4 will mainly remain. So, for example, in some embodiments of the invention, the antibodies according to the invention contain a consensus sequence of the frame region of the human heavy chain of subgroup III. In one embodiment of these antibodies, the consensus sequence of the framework regions comprises a substitution at position 71, 73 and / or 78. In some embodiments of these antibodies, position A is present at position 71, T is present at position 73 and / or A. is present at position 78. embodiment said antibodies comprise the variable domain framework sequences of huMAb4D5-8 heavy chain ^{(HERCEPTIN ®, Genentech, Inc.,} South San Francisco, CA, USA) ( also described in U.S. patents 6,407,213 and 5,821,337 №№ and publications Lee et al. J. Mol. Biol. (2004), 340 (5): 1073-93). In one embodiment of the invention, these antibodies also include the consensus sequence of the frame region of the human κI light chain. In one embodiment of the invention, said antibodies comprise huMAb4D5-8 light chain HVR sequences (described in US Pat. Nos. 6,472,213 and 5,821,337). In one embodiment, these antibodies comprise variable domain light chain huMAb4D5-8 ^{(HERCEPTIN ®, Genentech, Inc.,} South San Francisco, CA, USA) ( also described in U.S. Patents 6,407,213 and 5,821,337 №№ and Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340 (5): 1073-93).

В одном из вариантов изобретения указанное антитело согласно изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 и/или 37, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:1, 5 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению включает вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:38, 39, 40 и/или 41, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 15 соответственно.In one embodiment of the invention, said antibody according to the invention comprises a heavy chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 and / or 37, the HVR sequences H1, H2 and H3 are SEQ ID NO: 1, 5 and / or 9, respectively. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 38, 39, 40 and / or 41, the HVR sequences L1, L2 and L3 are SEQ ID NO: 10, 11 and / or 15, respectively.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 и/или 37, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:2, 3 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:38, 39, 40 и/или 41, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 14 соответственно.In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36 and / or 37, the HVR sequences H1, H2 and H3 are SEQ ID NO: 2, 3 and / or 9, respectively. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 38, 39, 40 and / or 41, the HVR sequences L1, L2, and L3 are SEQ ID NO: 10, 11, and / or 14, respectively.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 и/или 37, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:1, 8 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:38, 39, 40 и/или 41, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 18 соответственно.In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36 and / or 37, the HVR sequences H1, H2 and H3 are SEQ ID NO: 1, 8 and / or 9, respectively. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 38, 39, 40 and / or 41, the HVR sequences L1, L2, and L3 are SEQ ID NO: 10, 11, and / or 18, respectively.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:46, 47, 48 и/или 49, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:1, 5 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:42, 43, 44 и/или 45, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 15 соответственно.In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 46, 47, 48 and / or 49, the HVR sequences H1, H2 and H3 are SEQ ID NO: 1, 5, and / or 9, respectively. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 42, 43, 44 and / or 45, the HVR sequences L1, L2 and L3 are SEQ ID NO: 10, 11 and / or 15, respectively.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:46, 47, 48 и/или 49, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:2, 3 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:42, 43, 44 и/или 45, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 14 соответственно.In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence SEQ ID NO: 46, 47, 48 and / or 49, the HVR sequences H1, H2 and H3 are SEQ ID NO: 2, 3, and / or 9, respectively. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 42, 43, 44 and / or 45, the HVR sequences L1, L2 and L3 are SEQ ID NO: 10, 11 and / or 14, respectively.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:46, 47, 48 и/или 49, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:1, 8 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:42, 43, 44 и/или 45, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 18 соответственно.In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence SEQ ID NO: 46, 47, 48 and / or 49, the HVR sequences H1, H2 and H3 are SEQ ID NO: 1, 8 and / or 9, respectively. In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain, wherein the frame sequence comprises the sequence of SEQ ID NO: 42, 43, 44 and / or 45, the HVR sequences L1, L2 and L3 are SEQ ID NO: 10, 11 and / or 18, respectively.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению подвергают аффинному созреванию с достижением нужной аффинности связывания с мишенью. В одном из примеров аффинно зрелое антитело согласно изобретению содержит замену в одном или нескольких положениях аминокислот H28, H30, H31, H32, H33, L91, L92, L93, L94, L95 и/или L96. В одном из примеров аффинно зрелое антитело согласно изобретению содержит одну или несколько из нижеследующих замен: (a) в тяжелой цепи, V50L, V50Y, N52S, P52aS, N53Q, N53T, N53I, S56A, S56F, T57S, D58E, D58I, D58A, D58Y, или (b), в легкой цепи, S91W, Y92F, T93N, T93S, T94G, P95Q, P95A, P95T, P96S, P96A, P96V.In one embodiment of the invention, the antibody of the invention is affinity matured to achieve the desired binding affinity for the target. In one example, an affinity matured antibody of the invention comprises a substitution at one or more positions of amino acids H28, H30, H31, H32, H33, L91, L92, L93, L94, L95 and / or L96. In one example, an affinity matured antibody according to the invention contains one or more of the following substitutions: (a) in the heavy chain, V50L, V50Y, N52S, P52aS, N53Q, N53T, N53I, S56A, S56F, T57S, D58E, D58I, D58A, D58Y, or (b), in the light chain, S91W, Y92F, T93N, T93S, T94G, P95Q, P95A, P95T, P96S, P96A, P96V.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:54. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:55. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:54, и вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:55.In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 54 . In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 55 . In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 54, and a light chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 55.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:56. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:57. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:56, и вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:57.In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 56 . In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 57 . In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 56, and a light chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 57.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:58. В одном из вариантов изобретения, антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:59. В одном из вариантов изобретения, антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:58, и вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:59.In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 58 . In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a light chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 59 . In one embodiment of the invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 58, and a light chain variable domain comprising the sequence of SEQ ID NO: 59.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое конкурирует с любыми вышеупомянутыми антителами за связывание с DLL4. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с таким же эпитопом на DLL4, с которым связывается любое из вышеупомянутых антител. In one of its aspects, the present invention relates to an antibody that competes with any of the aforementioned antibodies for binding to DLL4. In one of its aspects, the present invention relates to an antibody that binds to the same epitope on DLL4 that binds to any of the above antibodies.

Как известно специалистам и как подробно описано ниже, положения/границы аминокислот, определяющие гипервариабельную область антитела, могут варьироваться в зависимости от окружающих аминокислот и от различных дефиниций, известных специалистам (описанных ниже). Некоторые положения в вариабельном домене могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения, где эти положения, очевидно, могут присуствовать в гипервариабельной области в соответствии с одним рядом признаков, могут присуствовать и вне гипервариабельной области в соответствии с другим рядом признаков. Одно или несколько из этих положений может также находиться в удлиненных гипервариабельных областях (как подробно определено ниже).As is known to those skilled in the art and as described in detail below, the amino acid positions / boundaries defining the hypervariable region of an antibody may vary depending on the surrounding amino acids and on various definitions known to those skilled in the art (described below). Some positions in the variable domain can be considered as hybrid hypervariable positions, where these positions, obviously, can exist in the hypervariable region in accordance with one set of signs, can be present outside the hypervariable region in accordance with another set of signs. One or more of these positions may also be located in elongated hypervariable regions (as detailed below).

В некоторых вариантах изобретения указанным антителом является моноклональное антитело. В некоторых вариантах изобретения указанным антителом является поликлональное антитело. В некоторых вариантах изобретения указанное антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, аффинно зрелого антитела, гуманизованного антитела и человеческого антитела. В некоторых вариантах изобретения указанным антителом является фрагмент антитела. В некоторых вариантах изобретения указанным антителом является Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ или scFv.In some embodiments of the invention, the specified antibody is a monoclonal antibody. In some embodiments of the invention, the specified antibody is a polyclonal antibody. In some embodiments of the invention, said antibody is selected from the group consisting of a chimeric antibody, an affinity matured antibody, a humanized antibody, and a human antibody. In some embodiments of the invention, said antibody is an antibody fragment. In some embodiments of the invention, said antibody is Fab, Fab ', Fab'-SH, F (ab') _2, or scFv.

В одном из вариантов изобретения указанным антителом является химерное антитело, например антитело, включающее антигенсвязывающие последовательности, происходящие от не-человеческого донора и присоединенные к гетерологичной не-человеческой, человеческой или гуманизованной последовательности (например, последовательностям каркасного и/или константного домена). В одном из вариантов изобретения указанным не-человеческим донором является мышь. В одном из вариантов изобретения, антигенсвязывающая последовательность является синтетической, например, она может быть получена посредством мутагенеза (например, путем скрининга методом фагового представления и т.п.). В одном из вариантов изобретения химерное антитело согласно изобретению имеет мышиные V-области и человеческую С-область. В одном из вариантов изобретения мышиная V-область легкой цепи присоединена к человеческой легкой цепи каппа. В одном из вариантов изобретения мышиная V-область тяжелой цепи присоединена к человеческой С-области IgG1.In one embodiment of the invention, said antibody is a chimeric antibody, for example, an antibody comprising antigen binding sequences derived from a non-human donor and attached to a heterologous non-human, human or humanized sequence (e.g., frame and / or constant domain sequences). In one embodiment of the invention, said non-human donor is a mouse. In one embodiment of the invention, the antigen binding sequence is synthetic, for example, it can be obtained by mutagenesis (for example, by screening by phage display, etc.). In one embodiment of the invention, the chimeric antibody of the invention has murine V regions and a human C region. In one embodiment of the invention, the murine light chain V region is attached to the human kappa light chain. In one embodiment of the invention, the murine heavy chain V region is coupled to the human IgG1 C region.

Гуманизованными антителами согласно изобретению являются антитела, имеющие аминокислотные замены в FR и аффинно зрелые варианты с заменами в присоединенных CDR. Замененные аминокислоты в CDR или FR не ограничиваются аминокислотами, присутствующими в антителе-доноре или реципиенте. В других вариантах изобретения антитела согласно изобретению также содержат замены аминокислотных остатков в Fc-области, которые улучшают эффекторную функцию, включая улучшение CDC- и/или ADCC-функции и усиление цитолиза B-клеток. Другими антителами согласно изобретению являются антитела, имеющие специфические замены, повышающие стабильность. В других вариантах изобретения антитела согласно изобретению содержат замены аминокислотных остатков в Fc-области, которые ослабляют эффекторную функцию, включая ослабление CDC- и/или ADCC-функции и/или ослабление цитолиза B-клеток. В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению характеризуются пониженным уровнем связывания (например, отсутствием связывания) с фактором C1q человеческой системы комплемента и/или с человеческим Fc-рецептором на природных клетках-киллерах (NK). В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению характеризуются пониженным уровнем связывания (например, отсутствием связывания) с человеческим FcγRI, FcγRIIA и/или FcγRIIIA. В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению принадлежат к классу IgG (например, IgG1 или IgG4) и содержат по меньшей мере одну мутацию в E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 и/или P329 (нумерация проводилась в соответствии с Европейской системой нумерации (EU)). В некоторых вариантах изобретения указанные антитела включают мутацию L234A/L235A или D265A/N297A.The humanized antibodies of the invention are those having amino acid substitutions in FR and affinity matured variants with substitutions in the attached CDRs. Substituted amino acids in the CDR or FR are not limited to the amino acids present in the antibody donor or recipient. In other embodiments of the invention, the antibodies of the invention also comprise substitutions of amino acid residues in the Fc region that improve effector function, including improved CDC and / or ADCC function and enhanced cytolysis of B cells. Other antibodies of the invention are antibodies having specific substitutions that increase stability. In other embodiments of the invention, the antibodies of the invention comprise substitutions of amino acid residues in the Fc region that impair effector function, including attenuation of CDC and / or ADCC function and / or attenuation of cytolysis of B cells. In some embodiments of the invention, the antibodies of the invention are characterized by a reduced level of binding (e.g., lack of binding) to the C1q factor of the human complement system and / or to the human Fc receptor on natural killer cells (NK). In some embodiments of the invention, the antibodies of the invention are characterized by a reduced level of binding (e.g., lack of binding) to human FcγRI, FcγRIIA and / or FcγRIIIA. In some embodiments of the invention, the antibodies of the invention belong to the IgG class (e.g., IgG1 or IgG4) and contain at least one mutation in E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 and / or P329 (numbering was carried out in accordance with the European numbering system (EU)). In some embodiments of the invention, these antibodies include a mutation of L234A / L235A or D265A / N297A.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителам против полипептидов DLL4, содержащим любую из описанных здесь антигенсвязывающих последовательностей, где указанные антитела против полипептидов DLL4 специфически связываются с DLL4. In one of its aspects, the present invention relates to antibodies against DLL4 polypeptides containing any of the antigen binding sequences described herein, wherein said antibodies against DLL4 polypeptides specifically bind to DLL4.

Антитела согласно изобретению связываются (например, специфически связываются) с DLL4, в некоторых вариантах изобретения, они могут модулировать один или несколько видов DLL4-ассоциированных эффектов, включая, но не ограничиваясь ими, ослабление или блокирование активации рецептора Notch, ослабление или блокирование молекулярного сигнала, передаваемого после передачи сигнала рецептора Notch, нарушение или блокирование связывания рецептора Notch с DLL4 и/или стимуляцию пролиферации эндотелиальных клеток и/или ингибирование дифференцировки эндотелиальных клеток и/или ингибирование артериальной дифференциации и/или ингибирование сосудистой перфузии опухоли, и/или лечение и/или предупреждение развития опухоли, клоточно-пролиферативного расстройства или рака; и/или лечение или предупреждение расстройства, ассоциированного с экспрессией и/или активностью DLL4 и/или лечение или предупреждение расстройства, ассоциированного с экспрессией и/или активностью рецептора Notch. В некоторых вариантах изобретения, антитело согласно изобретению специфически связывается с DLL4. В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с внеклеточным доменом DLL4 (ECD). В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с полипептидом, состоящим или, в основном, состоящим из внеклеточного домена DLL4. В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с DLL4 с KD примерно 1 нМ или более, или примерно 500 пМ или более. В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с человеческим DLL4 с k_on примерно 2×10⁵ или более, или примерно 1×10⁵ или более. В некоторых вариантах изобретения антитело согласно изобретению ослабляет, ингибирует и/или блокирует активность DLL4 in vivo и/или in vitro. В некоторых вариантах изобретения антитело конкурирует с DLL4-лигандом за связывание с DLL4 (ослабляет и/или блокирует связывание рецептора Notch с DLL4). Antibodies of the invention bind (e.g. specifically bind) to DLL4, in some embodiments of the invention, they can modulate one or more kinds of DLL4-associated effects, including, but not limited to, attenuation or blocking of Notch receptor activation, attenuation or blocking of a molecular signal, transmitted after Notch receptor signaling, disruption or blocking of Notch receptor binding to DLL4 and / or stimulation of endothelial cell proliferation and / or inhibition of endothelial differentiation ialnyh cells and / or inhibition of arterial differentiation, and / or inhibition of tumor vascular perfusion, and / or treatment and / or prevention of tumor development, klotochno proliferative disorder or cancer; and / or treating or preventing a disorder associated with the expression and / or activity of DLL4 and / or treating or preventing a disorder associated with the expression and / or activity of the Notch receptor. In some embodiments of the invention, the antibody of the invention specifically binds to DLL4. In some embodiments of the invention, the antibody specifically binds to the extracellular domain of DLL4 (ECD). In some embodiments of the invention, the antibody specifically binds to a polypeptide consisting or mainly consisting of the extracellular domain of DLL4. In some embodiments of the invention, the antibody specifically binds to DLL4 with a KD of about 1 nM or more, or about 500 pM or more. In some embodiments of the invention, the antibody specifically binds to human DLL4 with k _{on of} about 2 × 10 ⁵ or more, or about 1 × 10 ⁵ or more. In some embodiments of the invention, the antibody according to the invention weakens, inhibits and / or blocks the activity of DLL4 in vivo and / or in vitro o. In some embodiments, the antibody competes with a DLL4 ligand for binding to DLL4 (weakens and / or blocks the binding of Notch receptor to DLL4).

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к композициям, содержащим одно или несколько антител согласно изобретению и носитель. В одном из вариантов изобретения указанный носитель является фармацевтически приемлемым.In one of its aspects, the present invention relates to compositions comprising one or more antibodies of the invention and a carrier. In one embodiment of the invention, said carrier is pharmaceutically acceptable.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим анти-DLL4-антитело согласно изобретению.In one of its aspects, the present invention relates to nucleic acids encoding an anti-DLL4 antibody of the invention.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту согласно изобретению. In one of its aspects, the present invention relates to vectors containing a nucleic acid according to the invention.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к композициям, содержащим одну или несколько нуклеиновых кислот согласно изобретению и носитель. В одном из вариантов изобретения указанный носитель является фармацевтически приемлемым.In one aspect, the present invention relates to compositions comprising one or more nucleic acids of the invention and a carrier. In one embodiment of the invention, said carrier is pharmaceutically acceptable.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор согласно изобретению. Указанным вектором может быть вектор любого типа, например рекомбинантный вектор, такой как экспрессионный вектор. При этом могут быть использованы любые клетки-хозяева. В одном из вариантов изобретения клеткой-хозяином является прокариотическая клетка, например E.coli. В одном из вариантов изобретения клеткой-хозяином является эукариотическая клетка, например клетка млекопитающего, такая как клетка яичника китайского хомячка (CHO).In one of its aspects, the present invention relates to host cells comprising a nucleic acid or a vector according to the invention. The specified vector can be any type of vector, for example, a recombinant vector, such as an expression vector. In this case, any host cells can be used. In one embodiment of the invention, the host cell is a prokaryotic cell, for example, E. coli . In one embodiment, the host cell is a eukaryotic cell, for example, a mammalian cell, such as a Chinese hamster ovary (CHO) cell.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам получения антитела согласно изобретению. Так, например, настоящее изобретение относится к способам получения анти-DLL4-антитела (которое, как определено в настоящей заявке, является полноразмерным антителом или фрагментом антитела) или иммуноконъюгата, где указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора согласно изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела. In one of its aspects, the present invention relates to methods for producing antibodies according to the invention. Thus, for example, the present invention relates to methods for producing an anti-DLL4 antibody (which, as defined herein, is a full-length antibody or antibody fragment) or an immunoconjugate, wherein said method comprises expressing in a suitable host cell a recombinant vector of the invention encoding the specified antibody (or fragment thereof), and the selection of the specified antibodies.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к промышленному изделию, включающему контейнер и композицию, содержащуюся в этом контейнере, где указанная композиция включает одно или несколько анти-DLL4-антител согласно изобретению. В одном из вариантов изобретения указанная композиция также содержит антиангиогенный агент. В одном из вариантов изобретения указанным антиангиогенным агентом является анти-VEGF-антитело, например бевацизумаб. В одном из вариантов изобретения указанная композиция содержит нуклеиновую кислоту согласно изобретению. В одном из вариантов изобретения указанная композиция, содержащая антитело, также содержит носитель, который, в некоторых вариантах изобретения, является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов изобретения в указанном контейнере присутствует вторая композиция, где указанная вторая композиция содержит антиангиогенный агент. В одном из вариантов изобретения указанным антиангиогенным агентом является анти-VEGF-антитело, например бевацизумаб. В одном из вариантов изобретения промышленное изделие согласно изобретению также включает инструкции по введению указанной(ых) композиции(й) (например, антитела) индивидууму (например, инструкции по применению любого из описанных здесь способов). In one of its aspects, the present invention relates to an industrial product comprising a container and a composition contained in that container, wherein said composition comprises one or more anti-DLL4 antibodies of the invention. In one embodiment of the invention, said composition also comprises an antiangiogenic agent. In one embodiment of the invention, said anti-angiogenic agent is an anti-VEGF antibody, for example, bevacizumab. In one embodiment of the invention, said composition comprises a nucleic acid according to the invention. In one embodiment of the invention, said antibody-containing composition also comprises a carrier, which, in some embodiments of the invention, is pharmaceutically acceptable. In one embodiment of the invention, a second composition is present in said container, wherein said second composition comprises an anti-angiogenic agent. In one embodiment of the invention, said anti-angiogenic agent is an anti-VEGF antibody, for example, bevacizumab. In one embodiment of the invention, an industrial product according to the invention also includes instructions for administering said composition (s) (e.g., antibodies) to an individual (e.g., instructions for using any of the methods described herein).

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, включающий композицию, содержащую одно или несколько анти-DLL4-антител согласно изобретению, и второй контейнер, включающий буфер. В одном из вариантов изобретения указанный буфер является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов изобретения композиция, содержащая антитело, также содержит носитель, который, в некоторых вариантах изобретения, является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов изобретения указанный набор также включает инструкции по введению указанной композиции (например, антитела) индивидууму.In one of its aspects, the present invention relates to a kit comprising a first container comprising a composition comprising one or more anti-DLL4 antibodies of the invention, and a second container comprising a buffer. In one embodiment of the invention, said buffer is pharmaceutically acceptable. In one embodiment of the invention, the composition comprising the antibody also comprises a carrier, which, in some embodiments of the invention, is pharmaceutically acceptable. In one embodiment of the invention, said kit also includes instructions for administering said composition (eg, antibody) to an individual.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению анти-DLL4-антитела согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В некоторых вариантах изобретения указанным расстройством является патологическое состояние, ассоциированное с ангиогенезом. In one aspect, the present invention relates to the use of an anti-DLL4 antibody of the invention for the manufacture of a medicament for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a disease, such as cancer, tumor and / or cell proliferative disorder. In some embodiments of the invention, said disorder is a pathological condition associated with angiogenesis.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению нуклеиновой кислоты согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В некоторых вариантах изобретения указанным расстройством является патологическое состояние, ассоциированное с ангиогенезом. In one of its aspects, the present invention relates to the use of a nucleic acid according to the invention for the preparation of a medicament for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a disease, such as cancer, tumor and / or cell proliferative disorder. In some embodiments of the invention, said disorder is a pathological condition associated with angiogenesis.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению экспрессионного вектора согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В некоторых вариантах изобретения указанным расстройством является патологическое состояние, ассоциированное с ангиогенезом.In one of its aspects, the present invention relates to the use of an expression vector according to the invention for the manufacture of a medicament for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a disease, such as cancer, tumor and / or cell proliferative disorder. In some embodiments of the invention, said disorder is a pathological condition associated with angiogenesis.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению клетки-хозяина согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В некоторых вариантах изобретения указанным расстройством является патологическое состояние, ассоциированное с ангиогенезом.In one aspect, the present invention relates to the use of a host cell according to the invention for the manufacture of a medicament for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a disease, such as cancer, tumor and / or cell proliferative disorder. In some embodiments of the invention, said disorder is a pathological condition associated with angiogenesis.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению промышленного изделия согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В некоторых вариантах изобретения указанным расстройством является патологическое состояние, ассоциированное с ангиогенезом.In one aspect, the present invention relates to the use of an industrial product according to the invention for the manufacture of a medicament for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a disease, such as cancer, tumor and / or cell proliferative disorder. In some embodiments of the invention, said disorder is a pathological condition associated with angiogenesis.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению набора согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В некоторых вариантах изобретения указанным расстройством является патологическое состояние, ассоциированное с ангиогенезом.In one of its aspects, the present invention relates to the use of a kit according to the invention for the preparation of a medicament for the therapeutic and / or prophylactic treatment of a disease, such as cancer, tumor and / or cell proliferative disorder. In some embodiments of the invention, said disorder is a pathological condition associated with angiogenesis.

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, которые могут быть применены для лечения патологических состояний, ассоциированных с экспрессией и/или активностью DLL4, например с повышенной или пониженной экспрессией и/или активностью, или нежелательной экспрессией и/или активностью DLL4. The present invention relates to methods and compositions that can be used to treat pathological conditions associated with the expression and / or activity of DLL4, for example, with increased or decreased expression and / or activity, or undesired expression and / or activity of DLL4.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения опухоли, рака и/или клеточно-пролиферативного расстройства, ассоциированных с повышенной экспрессией и/или активностью DLL4, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. In one aspect, the present invention provides methods for treating or preventing a tumor, cancer, and / or cell proliferative disorder associated with increased expression and / or activity of DLL4, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need such a treatment.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам ослабления, ингибирования, блокирования или предупреждения роста опухоли или раковой опухоли, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении.In one aspect, the present invention provides methods for attenuating, inhibiting, blocking, or preventing the growth of a tumor or cancer, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need of such treatment.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам лечения опухоли, рака и/или клеточно-пролиферативного расстройства, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении.In one of its aspects, the present invention relates to methods for treating a tumor, cancer and / or cell proliferative disorder, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need of such treatment.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам ингибирования ангиогенеза, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении.In one aspect, the present invention relates to methods for inhibiting angiogenesis, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need of such treatment.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам лечения патологического состояния, ассоциированного с нарушением ангиогенезов, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. В некоторых вариантах изобретения указанным патологическим состоянием, ассоциированным с ангиогенезом, является опухоль, рак и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В некоторых вариантах изобретения указанным патологическим состоянием, ассоциированным с ангиогенезом, является внутриглазное неоваскулярное заболевание. In one of its aspects, the present invention relates to methods for treating a pathological condition associated with impaired angiogenesis, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need of such treatment. In some embodiments of the invention, said pathological condition associated with angiogenesis is a tumor, cancer, and / or cell proliferative disorder. In some embodiments of the invention, said pathological condition associated with angiogenesis is an intraocular neovascular disease.

Способы согласно изобретению могут быть применены для лечения любого релевантного патологического состояния. Репрезентативные расстройства описаны в настоящей заявке, и такими расстройствами являются раковые заболевания, выбранные из группы, состоящей из мелкоклеточного рака легких, нейробластомы, меланомы, карциномы молочной железы, рака желудка, рака прямой и ободочной кишки (CRC) и гепатоцеллюлярной карциномы, включая метастазы указанных раковых заболеваний. The methods of the invention can be used to treat any relevant pathological condition. Representative disorders are described herein, and such disorders are cancers selected from the group consisting of small cell lung cancer, neuroblastoma, melanoma, breast carcinoma, stomach cancer, colon and colon cancer (CRC), and hepatocellular carcinoma, including metastases of these cancer diseases.

Способы согласно изобретению могут также включать дополнительные стадии лечения. Так, например, в одном из вариантов изобретения указанный способ дополнительно включает стадию, в которой клетку- и/или ткань-мишень (например, раковую клетку) подвергают лучевой терапии или химиотерапии, или обрабатывают антиангиогенным агентом.The methods of the invention may also include additional treatment steps. Thus, for example, in one embodiment of the invention, the method further comprises a step in which the target cell and / or target tissue (eg, cancer cell) is subjected to radiation therapy or chemotherapy, or treated with an antiangiogenic agent.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам детектирования DLL4, где указанные способы включают детектирование комплекса «DLL4-анти-DLL4-антитело» в образце. Используемый здесь термин «детектирование» включает качественное и/или количественное детектирование (на измеримых уровнях) в присутствии или в отсутствие контроля. In another aspect, the present invention relates to methods for detecting DLL4, where these methods include detecting the complex "DLL4-anti-DLL4 antibody" in the sample. As used herein, the term “detection” includes qualitative and / or quantitative detection (at measurable levels) in the presence or absence of control.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам диагностики расстройства, ассоциированного с экспрессией и/или активностью DLL4, где указанные способы включают детектирование комплекса «DLL4-анти-DLL4-антитело» в биологическом образце, взятом у пациента, страдающего указанным расстройством или с подозрением на указанное расстройство. В некоторых вариантах изобретения экспрессия DLL4 является повышенной или аномальной. В некоторых вариантах изобретения указанным расстройством является опухоль, рак и/или клеточно-пролиферативное расстройство. In another aspect, the present invention relates to methods for diagnosing a disorder associated with the expression and / or activity of DLL4, where these methods include the detection of the complex "DLL4-anti-DLL4 antibody" in a biological sample taken from a patient suffering from the specified disorder or with suspicion to the specified disorder. In some embodiments of the invention, the expression of DLL4 is increased or abnormal. In some embodiments of the invention, said disorder is a tumor, cancer, and / or cell proliferative disorder.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к любому из описанных здесь анти-DLL4-антител, где указанное анти-DLL4-антитело содержит детектируемую метку. In another aspect, the present invention relates to any of the anti-DLL4 antibodies described herein, wherein said anti-DLL4 antibody contains a detectable label.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к комплексу, состоящему из любых описанных здесь анти-DLL4-антител и DLL4. В некоторых вариантах изобретения указанный комплекс присутствует in vivo или in vitro. В некоторых вариантах изобретения указанный комплекс включает раковые клетки. В некоторых вариантах изобретения анти-DLL4-антитело является детектируемо меченным. In another aspect, the present invention relates to a complex consisting of any anti-DLL4 antibodies and DLL4 described herein. In some embodiments of the invention, said complex is present in vivo or in vitro o. In some embodiments of the invention, said complex comprises cancer cells. In some embodiments, the anti-DLL4 antibody is detectably labeled.

Краткое описание графического материалаA brief description of the graphic material

Фигура 1а, b: Последовательности петли HVR тяжелой цепи и легкой цепи анти-DLL4-антител. На этих фигурах представлены последовательности HVR тяжелой цепи, H1, H2 и H3, и последовательности HVR легкой цепи, L1, L2 и L3. Последовательности пронумерованы следующим образом: клон 152.26 (HVR-H1 представляет собой SEQ ID NO:1; HVR-H2 представляет собой SEQ ID NO:3; HVR-H3 представляет собой SEQ ID NO:9; HVR-L1 представляет собой SEQ ID NO:10; HVR-L2 представляет собой SEQ ID NO:11; HVR-L3 представляет собой SEQ ID NO:12); клон 152.26.6 (HVR-H1 представляет собой SEQ ID NO:1; HVR-H2 представляет собой SEQ ID NO:4; HVR-H3 представляет собой SEQ ID NO:9; HVR-L1 представляет собой SEQ ID NO:10; HVR-L2 представляет собой SEQ ID NO:11; HVR-L3 представляет собой SEQ ID NO:13); клон 152.26.14 (HVR-H1 представляет собой SEQ ID NO:2; HVR-H2 представляет собой SEQ ID NO:3; HVR-H3 представляет собой SEQ ID NO:9; HVR-L1 представляет собой SEQ ID NO:10; HVR-L2 представляет собой SEQ ID NO:11; HVR-L3 представляет собой SEQ ID NO:14); клон 152.26.20 (HVR-H1 представляет собой SEQ ID NO:1; HVR-H2 представляет собой SEQ ID NO:5; HVR-H3 представляет собой SEQ ID NO:9; HVR-L1 представляет собой SEQ ID NO:10; HVR-L2 представляет собой SEQ ID NO:11; HVR-L3 представляет собой SEQ ID NO:15); клон 152.26.34 (HVR-H1 представляет собой SEQ ID NO:1; HVR-H2 представляет собой SEQ ID NO:6; HVR-H3 представляет собой SEQ ID NO:9; HVR-L1 представляет собой SEQ ID NO:10; HVR-L2 представляет собой SEQ ID NO:11; HVR-L3 представляет собой SEQ ID NO:16); клон 152.26.40 (HVR-H1 представляет собой SEQ ID NO:1; HVR-H2 представляет собой SEQ ID NO:7; HVR-H3 представляет собой SEQ ID NO:9; HVR-L1 представляет собой SEQ ID NO:10; HVR-L2 представляет собой SEQ ID NO:11; HVR-L3 представляет собой SEQ ID NO:17); и клон 152.26.82 (HVR-H1 представляет собой SEQ ID NO:1; HVR-H2 представляет собой SEQ ID NO:8; HVR-H3 представляет собой SEQ ID NO:9; HVR-L1 представляет собой SEQ ID NO:10; HVR-L2 представляет собой SEQ ID NO:11; HVR-L3 представляет собой SEQ ID NO:18).Figure 1a, b: HVR loop sequences of the heavy chain and light chain of anti-DLL4 antibodies. The figures show the heavy chain HVR sequences, H1, H2 and H3, and the light chain HVR sequences, L1, L2 and L3. The sequences are numbered as follows: clone 152.26 (HVR-H1 represents SEQ ID NO: 1; HVR-H2 represents SEQ ID NO: 3; HVR-H3 represents SEQ ID NO: 9; HVR-L1 represents SEQ ID NO: 10; HVR-L2 represents SEQ ID NO: 11; HVR-L3 represents SEQ ID NO: 12); clone 152.26.6 (HVR-H1 represents SEQ ID NO: 1; HVR-H2 represents SEQ ID NO: 4; HVR-H3 represents SEQ ID NO: 9; HVR-L1 represents SEQ ID NO: 10; HVR -L2 is SEQ ID NO: 11; HVR-L3 is SEQ ID NO: 13); clone 152.26.14 (HVR-H1 represents SEQ ID NO: 2; HVR-H2 represents SEQ ID NO: 3; HVR-H3 represents SEQ ID NO: 9; HVR-L1 represents SEQ ID NO: 10; HVR -L2 is SEQ ID NO: 11; HVR-L3 is SEQ ID NO: 14); clone 152.26.20 (HVR-H1 represents SEQ ID NO: 1; HVR-H2 represents SEQ ID NO: 5; HVR-H3 represents SEQ ID NO: 9; HVR-L1 represents SEQ ID NO: 10; HVR -L2 is SEQ ID NO: 11; HVR-L3 is SEQ ID NO: 15); clone 152.26.34 (HVR-H1 represents SEQ ID NO: 1; HVR-H2 represents SEQ ID NO: 6; HVR-H3 represents SEQ ID NO: 9; HVR-L1 represents SEQ ID NO: 10; HVR -L2 is SEQ ID NO: 11; HVR-L3 is SEQ ID NO: 16); clone 152.26.40 (HVR-H1 represents SEQ ID NO: 1; HVR-H2 represents SEQ ID NO: 7; HVR-H3 represents SEQ ID NO: 9; HVR-L1 represents SEQ ID NO: 10; HVR -L2 is SEQ ID NO: 11; HVR-L3 is SEQ ID NO: 17); and clone 152.26.82 (HVR-H1 is SEQ ID NO: 1; HVR-H2 is SEQ ID NO: 8; HVR-H3 is SEQ ID NO: 9; HVR-L1 is SEQ ID NO: 10; HVR-L2 is SEQ ID NO: 11; HVR-L3 is SEQ ID NO: 18).

Положения аминокислот пронумерованы в соответствии с системой нумерации Кэбата, как описано ниже. The amino acid positions are numbered according to the Kabat numbering system, as described below.

Фигуры 2 и 3: репрезентативные акцепторные человеческие консенсусные последовательности каркасной области, которые используются для осуществления настоящего изобретения с применением нижеследующих идентификаторов последовательности: Figures 2 and 3: representative human acceptor framework consensus sequences that are used to implement the present invention using the following sequence identifiers:

Консенсусные каркасные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) (фиг.2a, b)Consensus framework sequences of the variable region of the heavy chain (VH) (figa, b)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области VH подгруппы I минус CDR по Кэбату (SEQ ID NO:19)The consensus sequence of the human framework region VH subgroup I minus Kabat CDR (SEQ ID NO: 19)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области VH подгруппы I минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO:20-22)The consensus sequence of the human framework region VH subgroup I minus the elongated hypervariable region (SEQ ID NO: 20-22)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области VH подгруппы II минус CDR по Кэбату (SEQ ID NO:23)The consensus sequence of the human framework region VH subgroup II minus Kabat CDR (SEQ ID NO: 23)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области VH подгруппы I минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO:24-26)The consensus sequence of the human framework region VH subgroup I minus the elongated hypervariable region (SEQ ID NO: 24-26)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области VH подгруппы II минус удлиненные The consensus sequence of the human framework region VH subgroup II minus elongated

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области VH подгруппы III минус CDR по Кэбату (SEQ ID NO:27)The consensus sequence of the human framework region VH subgroup III minus Kabat CDR (SEQ ID NO: 27)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области VH подгруппы III минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO:28-30)The consensus sequence of the human framework region VH subgroup III minus the elongated hypervariable region (SEQ ID NO: 28-30)

Акцепторная последовательность человеческой каркасной области VH минус CDR по Кэбату (SEQ ID NO:31)The acceptor sequence of the human framework region VH minus Kabat CDR (SEQ ID NO: 31)

Акцепторная последовательность человеческой каркасной области VH минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO:32-33)The acceptor sequence of the human framework region VH minus the elongated hypervariable region (SEQ ID NO: 32-33)

Акцепторная последовательность 2 человеческой каркасной области VH минус CDR по Кэбату (SEQ ID NO:34)Kabat acceptor sequence 2 of the human framework region VH minus CDR (SEQ ID NO: 34)

Акцепторная последовательность 2 человеческой каркасной области VH минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO:35-37)The acceptor sequence 2 of the human framework region VH minus the elongated hypervariable region (SEQ ID NO: 35-37)

Консенсусные последовательности каркасной области вариабельной области легкой цепи (VL) (фиг.3)Consensus sequence of the frame region of the variable region of the light chain (VL) (figure 3)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области цепи каппа VL подгруппы I (SEQ ID NO:38)Consensus sequence of the human framework region of the kappa VL chain of subgroup I (SEQ ID NO: 38)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области цепи каппа VL подгруппы II (SEQ ID NO:39)Consensus sequence of the human framework region of the kappa VL subgroup II chain (SEQ ID NO: 39)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области цепи каппа VL подгруппы III (SEQ ID NO:40)Consensus sequence of the human framework region of the kappa VL subgroup III chain (SEQ ID NO: 40)

Консенсусная последовательность человеческой каркасной области цепи каппа VL подгруппы IV (SEQ ID NO:41)Consensus sequence of the human framework region of the kappa chain VL subgroup IV (SEQ ID NO: 41)

Фигура 4: Последовательности каркасной области легкой и тяжелой цепей huMAb4D5-8. Числа в верхнем индексе выделенные жирным шрифтом указывают на положения аминокислот, пронумерованные по Кэбату.Figure 4: The sequence of the frame region of the light and heavy chains of huMAb4D5-8. The numbers in the upper index in bold indicate the Kabat numbered amino acid positions.

Фигура 5: Модифицированные/измененные последовательности каркасной области легкой и тяжелой цепей huMAb4D5-8. Числа в верхнем индексе выделенные жирным шрифтом указывают на положения аминокислот, пронумерованные по Кэбату.Figure 5: Modified / altered sequences of the frame region of the light and heavy chains of huMAb4D5-8. The numbers in the upper index in bold indicate the amino acid positions numbered by Kabat.

Фигура 6: Вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи клонов антител 26.20, 26.14 и 26.82.Figure 6: Variable regions of the heavy chain and variable regions of the light chain of antibody clones 26.20, 26.14 and 26.82.

Фигура 7: DLL4-опосредуемая передача сигнала Notch регулирует пролиферацию ЭК. a-c, f: анализы на разрастание HUVEC в 3-мерных фибриновых гелях. Анти-DLL4-антитело (YW26.82) или DBZ стимулируют разрастание HUVECs (a). Ki67-окрашивание показало, что анти-DLL4-антитело или DBZ вызывают гиперпролиферацию HUVEC (b). Анти-DLL4-антитело или DBZ повышают уровень разрастания HUVEC в присутствии SF-кондиционированной среды (c). d, h: Системная доставка анти-DLL4-антитела вызывает массивную аккумуляцию ЭК в сетчатке новорожденных. Изображения сосудистой системы сетчатки, полученные на конфокальном микроскопе с небольшим увеличением (вверху) и с большим увеличением (внизу) (окрашивание изолектином). (d): Ki67-окрашивание указывало на увеличение уровня пролиферации ЭК в сетчатке новорожденных, обработанной анти-DLL4-антителом (h). e: активация Notch под действием иммобилизованного DLL4 приводила к ингибированию пролиферации HUVEC. f: Анти-VEGF-антитело ингибировало разрастание HUVEC в присутствии или в отсутствие DBZ. g: Регуляция VEGFR2 под действием Notch. Количественный ПЦР-анализ на экспрессию VEGFR2 в ответ на блокаду Notch в культуре клеток HUVEC в 3-мерном фибриновом геле (7 дней) под действием анти-DLL4-антитела или DBZ (слева) или активация Notch в культуре клеток HUVEC в 2-мерном геле (36 часов) под действием иммобилизованного DLL4 (справа). Анти-DLL4-антитело и DBZ использовали при 5 мкг/мл и 0,08 мкМ, соответственно (a-c, e-g).Figure 7: DLL4-mediated Notch signaling regulates EC proliferation. a-c, f: HUVEC proliferation assays in 3-dimensional fibrin gels. Anti-DLL4 antibody (YW26.82) or DBZ stimulate proliferation of HUVECs (a). Ki67 staining showed that anti-DLL4 antibody or DBZ induces HUVEC hyperproliferation (b). Anti-DLL4 antibody or DBZ increase HUVEC proliferation in the presence of SF-conditioned medium (c). d, h: Systemic delivery of anti-DLL4 antibodies induces massive EC accumulation in the neonatal retina. Images of the vascular system of the retina obtained with a confocal microscope with a small increase (top) and a large increase (bottom) (staining with isolectin). (d): Ki67 staining indicated an increase in EC proliferation in the neonatal retina treated with anti-DLL4 antibody (h). e: Notch activation by immobilized DLL4 resulted in inhibition of HUVEC proliferation. f: Anti-VEGF antibody inhibited the proliferation of HUVEC in the presence or absence of DBZ. g: Regulation of VEGFR2 by Notch. Quantitative PCR analysis for VEGFR2 expression in response to Notch blockade in a 3-dimensional fibrin gel HUVEC cell culture (7 days) by anti-DLL4 antibody or DBZ (left) or Notch activation in a 2-dimensional gel HUVEC cell culture (36 hours) under the influence of immobilized DLL4 (right). Anti-DLL4 antibody and DBZ were used at 5 μg / ml and 0.08 μM, respectively (a-c, e-g).

Фигура 8: DLL4-опосредуемая передача сигнала Notch регулирует дифференцировку ЭК. a: Полость-подобные структуры (белые стрелки), образованные клетками HUVEC, растущими в фибриновых гелях, элиминировались в присутствии анти-DLL4-антитела или DBZ. Вместо этого эти разрастания были плотно упакованы клетками (черные стрелки). b: Регуляция TGFβ2 под действием Notch. Количественный ПЦР-анализ экспрессии TGFβ2 в ответ на блокаду Notch в культуре клеток HUVEC в 3-мерном фибриновом геле (7 дней) под действием анти-DLL4-антитела или DBZ (слева) или активация Notch в культуре клеток HUVEC в 2-мерном геле (36 часов) под действием иммобилизованного DLL4 (справа). c: Анти-DLL4-антитело блокирует развитие артерий. Изображения сетчатки, окрашенной альфа-актином гладкой мышцы (ASMA) и изолектином, полученные для новорожденной мыши на конфокальном микроскопе. Новорожденных мышей обрабатывали как показано на Фиг.1d. d: Изображения окрашенной ASMA и изолектином сетчатки, полученные на конфокальном микроскопе для взрослой мыши. 8-недельных мышей обрабатывали PBS или анти-DLL4-антителом (10 мг/кг, два раза в неделю) в течение двух недель.Figure 8: DLL4-mediated Notch signaling regulates EC differentiation. a: Cavity-like structures (white arrows) formed by HUVEC cells growing in fibrin gels were eliminated in the presence of an anti-DLL4 antibody or DBZ. Instead, these growths were densely packed with cells (black arrows). b: Regulation of TGFβ2 by Notch. Quantitative PCR analysis of TGFβ2 expression in response to Notch blockade in HUVEC cell culture in 3-dimensional fibrin gel (7 days) by anti-DLL4 antibody or DBZ (left) or Notch activation in HUVEC cell culture in 2-dimensional gel ( 36 hours) under the influence of immobilized DLL4 (right). c: Anti-DLL4 antibody blocks the development of arteries. Images of retina stained with alpha-actin smooth muscle (ASMA) and isolectin obtained for a newborn mouse using a confocal microscope. Newborn mice were treated as shown in Fig. 1d. d: Images of a stained ASMA and retinal isolectin obtained with a confocal microscope for an adult mouse. 8-week-old mice were treated with PBS or anti-DLL4 antibody (10 mg / kg, twice a week) for two weeks.

Фигура 9: Селективное блокирование DLL4 и/или VEGF нарушает ангиогенез опухоли и ингибирует рост опухоли. a-f: Результаты, полученные для опухолевых моделей: HM7 (a), Colo205 (b), Calu6 (c), MDA-MB-435 (d), MV-522 (e) и WEHI3 (f). Представлен средний объем опухоли со среднеквадратической ошибкой. g-h: Гистологический анализ сосудов опухолей. Иммуногистохимический анализ на анти-CD31-антитела, проводимый на срезах опухолей EL4, взятых у контрольных мышей и у мышей, обработанных анти-DLL4-антителом и анти-VEGF-антителом (g): Перфузия лектина и окрашивание анти-CD31-антителом в срезах опухоли EL4 (h). i-p: Результаты, полученные для опухолевых моделей: SK-OV-3X1 (i), LL2 (j), EL4 (k), H1299 (l), SKMES-1(m), MX-1(n), SW620(o) и LS174T(p).Figure 9: Selective blocking of DLL4 and / or VEGF disrupts tumor angiogenesis and inhibits tumor growth. a-f: Results for tumor models: HM7 (a), Colo205 (b), Calu6 (c), MDA-MB-435 (d), MV-522 (e) and WEHI3 (f). Presents the mean tumor volume with standard error. g-h: Histological analysis of tumor vessels. Immunohistochemical analysis for anti-CD31 antibodies performed on sections of EL4 tumors taken from control mice and mice treated with anti-DLL4 antibody and anti-VEGF antibody (g): Lectin perfusion and staining with anti-CD31 antibody in sections EL4 tumors (h). ip: Results for tumor models: SK-OV-3X1 (i), LL2 (j), EL4 (k), H1299 (l), SKMES-1 (m), MX-1 (n), SW620 (o ) and LS174T (p).

Фигура 10: DLL4/Notch не играет важной роли в гомеостазе мышиной тонкой кишки. Были проведены иммуногистохимические исследования тонкого кишечника, взятого у контрольных мышей (a, d, g, j), у мышей, обработанных анти-DLL4-антителом (10 мг/кг, два раза в неделю в течение 6 недель) (b, e, h, k), и у мышей, обработанных DBZ (30 мкмоль/кг ежедневно в течение 5 дней) (c, f, i, l). Как показало окрашивание H&E (a, b, c) и альциановым синим (d, e, f), DBZ вызывает замену популяции клеток TA бокаловидными клетками. Такое изменение полностью отсутствовало после обработки анти-DLL4-антителом. Окрашивание Ki67 (g, h, i) и HES-1 (j, k, l) дополнительно подтвердило, что анти-DLL4-антитело неспособно имитировать действие DBZ.Figure 10: DLL4 / Notch does not play an important role in mouse small intestine homeostasis. Immunohistochemical studies of the small intestine taken from control mice (a, d, g, j) and mice treated with anti-DLL4 antibody (10 mg / kg, twice a week for 6 weeks) were carried out (b, e, h, k), and in mice treated with DBZ (30 μmol / kg daily for 5 days) (c, f, i, l). As shown by staining with H&E (a, b, c) and Alcian blue (d, e, f), DBZ causes the replacement of the TA cell population with goblet cells. This change was completely absent after treatment with anti-DLL4 antibody. Staining of Ki67 (g, h, i) and HES-1 (j, k, l) further confirmed that the anti-DLL4 antibody was unable to mimic the effect of DBZ.

Фигура 11: Характеризация анти-DLL4-антитела. a: Картирование эпитопа моноклонального анти-DLL4-антитела (Mab) YW26.82. Схематическое представление набора мутантов DLL4, экспрессируемых в виде C-концевых гибридных белков щелочной фосфатазы (ЩФ) в человеческой плаценте. Среду, кондиционированную клетками 293T и содержащую гибридные белки, тестировали на 96-луночных микротитрационных планшетах, сенсибилизированных очищенным анти-DLL4-антителом (YW26.82, 0,5 мкг/мл). Связанный DLL4.AP детектировали с использованием 1-Step PNPP (Pierce) в качестве субстрата и измеряли оптическую плотность (OD) на 405 нм. b-d: Селективное связывание YW26.82 с DLL4. 96-луночные планшеты Nunc MaxiSorp™ покрывали очищенными рекомбинантными белками, как указано выше (1 мкг/мл). Связывание YW26.82 в указанных концентрациях измеряли с помощью ELISA-анализа. Связанные антитела детектировали с помощью конъюгата «античеловеческое антитело - ПХ» с использованием TMB в качестве субстрата и измеряли оптическую плотность (OD) на 405 нм. В качестве аналитического контроля использовали анти-HER2-антитело и рекомбинантный ErbB2-ECD (b). FACS-анализ клеток 293, временно трансфецированных вектором, полноразмерным DLL4, Jag1 или DLL1. Значительный уровень связывания YW26.82 детектировался только на DLL4-трансфецированных клетках (верхняя панель). Экспрессию Jag1 и DLL1 подтверждали путем связывания рекомбинантного крысиного Notch1-Fc (rrNotch1-Fc, средняя панель) и рекомбинантного крысиного Notch2-Fc (rrNotch2-Fc, нижняя панель) соответственно. YW26.82, rrNotch1-Fc или rrNotch2-Fc (систему R& D) использовали в концентрации 2 мкг/мл, затем использовали козье антитело против человеческого IgG, конъюгированное с ФЭ (1:500, Jackson ImmunoResearch) (c). Анти-DLL4-антитело блокировало связывание DLL4-AP, но не DLL1-AP, с нанесенным rNotch1, при вычисленной IC50 ~12 нМ (левая панель). Анти-DLL4-антитело блокировало связывание DLL4-His, но не Jag1-His, с нанесенным rNotch1, при вычисленной IC50 ~8 нМ (правая панель) (d). e: Специфическое связывание YW26.82 с эндогенно экспрессируемым DLL4. FACS-анализ HUVEC, трансфецированных контрольной или DLL4-специфической киРНК. YW26.82 использовали при 2 мкг/мл, затем использовали козье антитело против человеческого IgG, конъюгированное с ФЭ (1:500, Jackson ImmunoResearch) (e).Figure 11: Characterization of anti-DLL4 antibodies. a: Mapping of the epitope of the monoclonal anti-DLL4 antibody (Mab) YW26.82. Schematic representation of a set of DLL4 mutants expressed as C-terminal fusion proteins of alkaline phosphatase (ALP) in a human placenta. 293T cell conditioned media containing fusion proteins was tested on 96-well microtiter plates sensitized with purified anti-DLL4 antibody (YW26.82, 0.5 μg / ml). The associated DLL4.AP was detected using 1-Step PNPP (Pierce) as a substrate and absorbance (OD) was measured at 405 nm. b-d: Selective binding of YW26.82 to DLL4. Nunc MaxiSorp ™ 96-well plates were coated with purified recombinant proteins as described above (1 μg / ml). The binding of YW26.82 at the indicated concentrations was measured by ELISA analysis. Bound antibodies were detected using an anti-human antibody-HRP conjugate using TMB as a substrate and absorbance (OD) was measured at 405 nm. An anti-HER2 antibody and recombinant ErbB2-ECD (b) were used as an analytical control. FACS analysis of 293 cells temporarily transfected with a vector full-sized DLL4, Jag1 or DLL1. A significant level of binding of YW26.82 was detected only on DLL4-transfected cells (top panel). The expression of Jag1 and DLL1 was confirmed by binding of recombinant rat Notch1-Fc (rrNotch1-Fc, middle panel) and recombinant rat Notch2-Fc (rrNotch2-Fc, bottom panel), respectively. YW26.82, rrNotch1-Fc or rrNotch2-Fc (R & D system) was used at a concentration of 2 μg / ml, then a goat anti-human IgG antibody conjugated with PE was used (1: 500, Jackson ImmunoResearch) (c). Anti-DLL4 antibody blocked the binding of DLL4-AP, but not DLL1-AP, with rNotch1 deposited, with an IC50 of ~ 12 nM calculated (left panel). The anti-DLL4 antibody blocked the binding of DLL4-His, but not Jag1-His, to rNotch1, at an IC50 of ~ 8 nM (right panel) (d). e: Specific binding of YW26.82 to endogenously expressed DLL4. FACS analysis of HUVEC transfected with control or DLL4-specific siRNA. YW26.82 was used at 2 μg / ml, then a goat anti-human IgG antibody conjugated with PE (1: 500, Jackson ImmunoResearch) (e) was used.

Фигура 12: Позитивная регуляция DLL4 посредством активации Notch. HUVEC стимулировали иммобилизованным C-концевым His-меченным человеческим DLL4 (аминокислоты 1-404) в отсутствие или в присутствии DBZ (0,08 мкM). Через 36 часов после стимуляции эндогенную экспрессию DLL4 оценивали с помощью FACS-анализа, проводимого с использованием анти-DLL4-антитела.Figure 12: Positive regulation of DLL4 through activation of Notch. HUVECs were stimulated with immobilized C-terminal His-tagged human DLL4 (amino acids 1-404) in the absence or presence of DBZ (0.08 μM). 36 hours after stimulation, endogenous expression of DLL4 was evaluated by FACS analysis using anti-DLL4 antibody.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к анти-DLL4-антителам, которые могут быть использованы, например, для лечения или предупреждения патологических состояний, ассоциированных с экспрессией и/или активностью DLL4, например с повышенной экспрессией и/или активностью или с нежелательной и/или активностью DLL4. В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению используются для лечения опухоли, рака и/или клеточно-пролиферативного расстройства. В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению используются для лечения патологического состояния, ассоциированного с ангиогенезом.The present invention relates to anti-DLL4 antibodies that can be used, for example, to treat or prevent pathological conditions associated with the expression and / or activity of DLL4, for example, with increased expression and / or activity or with undesired and / or activity of DLL4. In some embodiments of the invention, the antibodies of the invention are used to treat a tumor, cancer and / or cell proliferative disorder. In some embodiments of the invention, the antibodies of the invention are used to treat a pathological condition associated with angiogenesis.

В другом аспекте изобретения анти-DLL4-антитела согласно изобретению могут быть использованы в качестве реагентов для детектирования и/или выделения DLL4, например для детектирования DLL4 в тканях и клетках различных типов. In another aspect of the invention, the anti-DLL4 antibodies of the invention can be used as reagents for detecting and / or isolating DLL4, for example, for detecting DLL4 in various types of tissues and cells.

Настоящее изобретение также относится к способам получения анти-DLL4-антител и полинуклеотидов, кодирующих анти-DLL4-антитела.The present invention also relates to methods for producing anti-DLL4 antibodies and polynucleotides encoding anti-DLL4 antibodies.

Общие методыGeneral methods

Описанные или цитируемые здесь методы и процедуры, по существу, хорошо известны специалистам и обычно применяются в соответствии со стандартной методикой, известной специалистам, например с широко применяемой методикой, описанной в руководствах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames и G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).The methods and procedures described or cited here are essentially well known to those skilled in the art and are generally used in accordance with standard techniques known to those skilled in the art, for example the widely used techniques described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. Eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).

ОпределенияDefinitions

“Выделенное” антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено от компонентов его природного окружения и/или выделено из таких компонентов. Примесными компонентами его природного окружения являются вещества, которые могут негативно влиять на диагностическое или терапевтическое применение указанного антитела, и такими веществами могут быть ферменты, гормоны и другие белковые или не-белковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения указанное антитело может быть очищено (1) более чем на 95% по массе антитела, как может быть определено методом Лаури, наиболее предпочтительно более чем на 99% по массе антитела, (2) до уровня, достаточного для продуцирования N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, состоящей, по меньшей мере, из 15 остатков, с использованием секвенатора с центрифужными чашками, или (3) до гомогенности, оцениваемой с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН в восстанавливающих или в невосстанавливающих условиях с использованием кумасси синего или предпочтительно серебряного красителя. Выделенным антителом является антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку в них отсутствует, по меньшей мере, один компонент природного окружения этого антитела. Аналогичным образом выделенным антителом является антитело в среде, окружающей рекомбинантные клетки. Однако обычно выделенное антитело может быть получено по меньшей мере в одну стадию очистки. An “isolated” antibody is an antibody that has been identified and separated from its natural environment components and / or isolated from such components. Impurity components of its natural environment are substances that can adversely affect the diagnostic or therapeutic use of this antibody, and such substances can be enzymes, hormones, and other protein or non-protein dissolved substances. In preferred embodiments of the invention, said antibody can be purified (1) by more than 95% by weight of the antibody, as can be determined by the Lauri method, most preferably by more than 99% by weight of the antibody, (2) to a level sufficient to produce N- terminal or internal amino acid sequence consisting of at least 15 residues using a sequencer with centrifuge cups, or (3) until homogeneity, assessed by SDS page-SDS under reducing or non-reducing conditions s using Coomassie blue or preferably, silver stain. An isolated antibody is an in situ antibody in recombinant cells because at least one component of the natural environment of the antibody is missing. A similarly isolated antibody is an antibody in a medium surrounding recombinant cells. However, usually isolated antibody can be obtained in at least one purification step.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая была идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной примесной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциируется в природном источнике нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты имеет форму или структуру, отличающиеся от формы или структуры природной молекулы. Следовательно, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от молекул нуклеиновой кислоты, присутствующих в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют антитело, где, например, молекула нуклеиновой кислоты присутствует в хромосоме в положении, отличающемся от положения этой нуклеиновой кислоты в природных клетках. An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that has been identified and separated from at least one impurity nucleic acid molecule with which it is usually associated in a natural source of nucleic acid encoding an antibody. An isolated nucleic acid molecule has a shape or structure that is different from the shape or structure of a natural molecule. Therefore, the isolated nucleic acid molecules are different from the nucleic acid molecules present in natural cells. However, the isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule contained in cells that typically express an antibody, where, for example, the nucleic acid molecule is present on the chromosome at a position different from that of the nucleic acid in natural cells.

Используемый здесь термин “остаток вариабельного домена, пронумерованный по Кэбату” или “аминокислотное положение, пронумерованное по Кэбату” и их варианты, означает систему, используемую для нумерации вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи антител, описанной в справочнике по антителам Кэбата (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). В соответствии с этой системой нумерации фактическая первичная аминокислотная последовательность может содержать меньшее число или дополнительное число аминокислот, соответствующее укороченной или удлиненной FR- или CDR-области вариабельного домена. Так, например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать инсерцию одной аминокислоты (остатка 52а в соответствии с нумерацией Кэбата) после остатка 52 Н2, и остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.п. в соответствии с нумерацией Кэбата), встроенные после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков данного антитела по Кэбату может быть осуществлена после выравнивания его последовательности в областях гомологии со “стандартной” последовательностью, пронумерованной по Кэбату. As used herein, the term “Kabat numbered variable domain residue” or “Kabat numbered amino acid position” and variants thereof, means a system used to number the heavy chain variable domains or light chain variable domains of the antibodies described in the Kabat Antibody Reference et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). In accordance with this numbering system, the actual primary amino acid sequence may contain a smaller number or an additional number of amino acids corresponding to a shortened or elongated FR or CDR region of the variable domain. So, for example, the variable domain of the heavy chain may include the insertion of one amino acid (residue 52a in accordance with Kabat numbering) after residue 52 of H2, and residues (for example, residues 82a, 82b and 82c and the like in accordance with Kabat numbering), embedded after the remainder of 82 FR heavy chain. Kabat residues of a given antibody can be numbered after aligning its sequence in areas of homology with a “standard” Kabat sequence.

Используемые здесь термины “по существу, аналогичный” или “по существу, тот же самый” означают достаточно высокую степень сходства между двумя численными величинами (обычно между одной величиной, соответствующей антителу согласно изобретению, и другой величиной, соответствующей эталонному/сравниваемому антителу) именно, такую степень сходства, которая позволяла бы специалисту в данной области считать различие между этими двумя величинами несущественным или биологически и/или статистически незначимым в отношении их биологических свойств, определяемых указанными величинами (например, величинами Kd). Различия между указанными двумя величинами составляют предпочтительно менее чем примерно 50%, более предпочтительно менее чем примерно 40%, еще более предпочтительно менее чем примерно 30%, еще более предпочтительно менее чем примерно 20%, наиболее предпочтительно менее чем примерно 10% по сравнению с величинами эталонного/сравниваемого антитела. As used herein, the terms “substantially similar” or “substantially the same” mean a fairly high degree of similarity between two numerical values (usually between one value corresponding to an antibody of the invention and another value corresponding to a reference / reference antibody) namely, such a degree of similarity that would allow a person skilled in the art to consider the difference between these two values as insignificant or biologically and / or statistically insignificant with respect to their biological voystv defined by said values (e.g., Kd values). The differences between the two values are preferably less than about 50%, more preferably less than about 40%, even more preferably less than about 30%, even more preferably less than about 20%, most preferably less than about 10%, compared to the values reference / comparison antibody.

Термин “аффинность связывания”, по существу, означает силу суммарных нековалентных взаимодействий одного сайта связывания молекулы (например, антитела) с его партнером по связыванию (например, с антигеном). Если это не оговорено особо, то используемый здесь термин “аффинность связывания” означает природную аффинность связывания, при которой происходит взаимодействие 1:1 между членами пар связывания (например, антитела с антигеном). Аффинность связывания молекулы Х с ее партнером Y, в общих чертах, может называться константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть определена стандартными методами, известными специалистам, включая описанные здесь методы. Низкоаффинные антитела обычно связываются с антигеном с меньшей скоростью и имеют тенденцию легко диссоциироваться, тогда как высокоаффинные антитела обычно связываются с антигеном с большей скоростью и имеют тенденцию оставаться связанными в течение более длительного периода времени. Специалистам в данной области известны различные методы измерения аффинности связывания, и для осуществления настоящего изобретения может быть применен любой из этих методов. Конкретные репрезентативные варианты осуществления изобретения описаны ниже. The term “binding affinity” essentially means the strength of the total non-covalent interactions of one binding site of a molecule (eg, an antibody) with its binding partner (eg, antigen). Unless otherwise specified, the term “binding affinity” as used herein means a natural binding affinity in which a 1: 1 interaction occurs between members of the binding pairs (eg, antibodies with antigen). The binding affinity of molecule X with its partner Y, in general terms, may be called the dissociation constant (Kd). Affinity may be determined by standard methods known to those skilled in the art, including those described herein. Low affinity antibodies usually bind to the antigen at a slower rate and tend to easily dissociate, whereas high affinity antibodies usually bind to the antigen at a faster rate and tend to remain bound for a longer period of time. Various methods for measuring binding affinity are known to those skilled in the art, and any of these methods may be used to implement the present invention. Specific representative embodiments of the invention are described below.

В одном из вариантов изобретения “Kd” или “величину Kd” согласно изобретению определяют с помощью анализа на связывание с радиоактивно меченным антигеном (РИА), осуществляемого с использованием Fab-варианта представляющего интерес антитела и его антигена, описанного ниже, где указанный анализ позволяет измерять аффинность связывания Fab с антигеном в растворе путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией ¹²⁵I-меченого антигена в присутствии титрационного набора немеченых антигенов, с последующей иммобилизацией связанного антигена на планшете, сенсибилизированном антителом против Fab-фрагмента (Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). В целях создания соответствующих условий для анализа микротитрационные планшеты (Dynex) сенсибилизируют в течение ночи 5 мкг/мл связывающего анти-Fab-антитела (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6), затем блокируют 2%-ным (масс/об) альбумином бычьей сыворотки в PBS в течение 2-5 часов при комнатной температуре (приблизительно при 23°С). В неадсорбирующем планшете (Nunc # 269620), 100 пМ или 26 пМ ¹²⁵I-антигена смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, в соответствии с оценкой анти-VEGF-антитела, Fab-12, Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи, однако для гарантии достижения равновесия инкубирование может быть проведено в течение более длительного периода времени (например, 65 часов). После этого смеси переносят в планшет для иммобилизации и инкубируют при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют и планшет восемь раз промывают 0,1% Твином-20 в PBS. После сушки планшетов добавляют 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости (MicroScint^ТМ-20; Packard), и планшеты подсчитывают на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, которые составляют 20% или менее от максимального связывания, отбирают для их использования в анализах на конкурентное связывание. В соответствии с другим вариантом изобретения Kd или величину Kd измеряют в анализе методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore^TM-2000 или BIAcore^TM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С с использованием чипов СМ5 с иммобилизованным на них антигеном при величине единиц отклика (RU), составляющей ~10. Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщиков. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ), затем инъецируют при скорости потока 5 мкл/мин до достижения величины единиц отклика (RU) связанного белка, составляющей ~10. После инъекции антигена, для блокирования непрореагировавших групп вводят 1М этаноламин. Для измерения кинетики реакции вводят инъекции двукратных серийных разведений Fab (0,78 нМ - 500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твина® 20 (PBSТ) при 25°С и при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k_on) и скорость диссоциации (k_off) вычисляют с использованием простой лангмюровской модели связывания 1:1 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) при одновременном построении сенсорограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Кd) вычисляют как отношение k_off/k_on. См., например, Chen, Y., et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Если скорость ассоциации превышает 10⁶ М^-1 · с^-1, как было определено выше методом поверхностного плазмонного резонанса, то такая скорость ассоциации может быть определена методом гашения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С для 20 нМ антитела против антигена (в Fab-форме) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, как было измерено на спектрометре, таком как спектрофотометр, снабженный ограничителем потока (Aviv Instrumtnts), или на спектрофотометре SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic), снабженном кюветой для перемешивания, содержащей красный краситель.In one embodiment of the invention, “Kd” or “Kd value” according to the invention is determined by a binding assay for a radiolabeled antigen (RIA) using a Fab variant of the antibody of interest and its antigen, described below, where the analysis allows measurement the affinity of Fab binding to antigen in solution by balancing Fab with a minimum concentration of ¹²⁵ I-labeled antigen in the presence of a titration set of unlabeled antigens, followed by immobilization of the associated antigen on a tablet sensitized with an anti-Fab antibody (Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881). In order to create appropriate conditions for analysis, microtiter plates (Dynex) were sensitized overnight with 5 μg / ml binding anti-Fab antibodies (Cappel Labs) in 50 mM sodium carbonate (pH 9.6), then blocked with 2% (mass / v) bovine serum albumin in PBS for 2-5 hours at room temperature (approximately 23 ° C). In a non-absorbent plate (Nunc # 269620), 100 pM or 26 pM ¹²⁵ I antigens are mixed with serial dilutions of the Fab of interest (e.g., according to the evaluation of the anti-VEGF antibody, Fab-12, Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599). The Fabs of interest are then incubated overnight, however, to ensure equilibrium, incubation can be carried out over a longer period of time (e.g. 65 hours). After this, the mixture is transferred to a plate for immobilization and incubated at room temperature (for example, for one hour). Then the solution was removed and the plate was washed eight times with 0.1% Tween-20 in PBS. After drying the plates, 150 μl / well of scintillation fluid (MicroScint ^™ -20; Packard) was added, and the plates were counted on a Topcount gamma counter (Packard) for ten minutes. The concentrations of each Fab, which are 20% or less of the maximum binding, are selected for their use in competitive binding assays. According to another embodiment of the invention, Kd or Kd value is measured in a surface plasmon resonance analysis using a BIAcore ^™ -2000 or BIAcore ^™ -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) at 25 ° C. using CM5 chips immobilized thereon antigen for response units (RU) of ~ 10. Briefly, carboxymethylated dextran biosensor chips (CM5, BIAcore Inc.) are activated with N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) according to the instructions of the suppliers. The antigen is diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8, to 5 μg / ml (~ 0.2 μM), then injected at a flow rate of 5 μl / min until the value of the response unit (RU) of the bound protein of ~ 10 is reached. After antigen injection, 1M ethanolamine is administered to block unreacted groups. To measure the kinetics of the reaction, two serial serial dilutions of Fab (0.78 nM - 500 nM) are injected in PBS containing 0.05% Tween® 20 (PBST) at 25 ° C and at a flow rate of approximately 25 μl / min. The association rate (k _on ) and the dissociation rate (k _off ) are calculated using a simple Langmuir 1: 1 binding model (BIAcore Evaluation Software version 3.2) while constructing association and dissociation sensograms. The equilibrium dissociation constant (Kd) is calculated as the ratio k _off / k _on . See, for example, Chen, Y., et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. If the association rate exceeds 10 ⁶ M ^-1 · s ^-1 , as was determined above by the surface plasmon resonance method, this association rate can be determined by the fluorescence quenching method, which allows one to measure an increase or decrease in the fluorescence intensity (excitation = 295 nm; = 340 nm, bandwidth 16 nm) at 25 ° C for 20 nM anti-antigen antibody (Fab form) in PBS, pH 7.2, in the presence of increasing antigen concentrations, as measured on a spectrometer such as a spectrophotometer, equipped with the first flow limiter (Aviv Instrumtnts), or a spectrophotometer series SLM-Aminco 8000 (ThermoSpectronic), equipped with a stirring cuvette containing red dye.

“Скорость ассоциации” или “k_on” согласно изобретению может быть также определена описанным выше методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore^TM-2000 или BIAcore^TM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С и с использованием чипов СМ5 с иммобилизованным на них антигеном при величине единиц отклика (RU), составляющей ~10. Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщиков. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ), затем инъецируют при скорости потока 5 мкл/мин до достижения величины единиц отклика (RU) связанного белка, составляющей ~10. После инъекции антигена, для блокирования непрореагировавших групп вводят 1М этаноламин. Для измерения кинетики реакции инъецируют двукратные серийные разведения Fab (0,78 нМ-500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твина® 20 (PBSТ) при 25°С и при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) вычисляют с использованием простой лангмюровской модели связывания 1:1 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) при одновременном построении сенсорограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Кd) вычисляют как отношение k_off/k_on. См., например, Chen, Y., et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Однако если скорость ассоциации превышает 10⁶ М^-1·с^-1, как было определено выше с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса, то такую скорость ассоциации предпочтительно определяют методом гашения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С для 20 нМ антитела против антигена (в Fab-форме) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, измеренных на спектрометре, таком как спектрофотометр, снабженный ограничителем потока (Aviv Instrumеtnts), или на спектрофотометре SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic), снабженном кюветой для перемешивания. The “association rate” or “k _on ” according to the invention can also be determined by the surface plasmon resonance method described above using BIAcore ^™ -2000 or BIAcore ^™ -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) at 25 ° C. and using chips CM5 with antigen immobilized on them with a response unit (RU) value of ~ 10. Briefly, carboxymethylated dextran biosensor chips (CM5, BIAcore Inc.) are activated with N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) according to the instructions of the suppliers. The antigen is diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8, to 5 μg / ml (~ 0.2 μM), then injected at a flow rate of 5 μl / min until the value of the response unit (RU) of the bound protein of ~ 10 is reached. After antigen injection, 1M ethanolamine is administered to block unreacted groups. To measure the kinetics of the reaction, two-fold serial dilutions of Fab (0.78 nM-500 nM) are injected in PBS containing 0.05% Tween® 20 (PBST) at 25 ° C and at a flow rate of approximately 25 μl / min. The association rate (k _on ) and dissociation rate (k _off ) are calculated using a simple Langmuir 1: 1 binding model (BIAcore Evaluation Software version 3.2) while constructing association and dissociation sensorograms. The equilibrium dissociation constant (Kd) is calculated as the ratio k _off / k _on . See, for example, Chen, Y., et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. However, if the association rate exceeds 10 ⁶ M ^-1 · s ^-1 , as was determined above by analysis of the surface plasmon resonance method, then this association rate is preferably determined by the fluorescence quenching method, which allows one to measure an increase or decrease in the fluorescence intensity (excitation = 295 nm; radiation = 340 nm, passband 16 nm) at 25 ° C for 20 nM anti-antigen antibody (Fab form) in PBS, pH 7.2, in the presence of increasing concentrations of antigen measured on a spectrometer such as with ektrofotometr provided with a flow limiter (Aviv Instrumetnts) or spectrophotometer series SLM-Aminco 8000 (ThermoSpectronic), equipped with a cuvette for mixing.

Используемый здесь термин “вектор” означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, к которой она присоединена. Одним типом векторов является “плазмида”, представляющая собой кольцевую двухцепочечную ДНК-петлю, с которой могут быть лигированы дополнительные ДНК-сегменты. Другим типом вектора является фаговый вектор. Еще одним типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные ДНК-сегменты могут быть лигированы с вирусным геномом. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они были введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, не-эписомные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки-хозяина после их введения в указанную клетку-хозяина, в результате чего они могут реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны регулировать экспрессию генов, к которым они были функционально присоединены. Такие векторы называются здесь “рекомбинантными экспрессионными векторами” (или просто “рекомбинантными векторами”). В общих чертах, экспрессионные векторы, обычно применяемые в методах рекомбинантных ДНК, часто имеют форму плазмид. В настоящем описании термины “плазмида” и “вектор” могут быть взаимозаменяемыми, поскольку плазмида является наиболее распространенной формой вектора.As used herein, the term “vector” means a nucleic acid molecule capable of transferring another nucleic acid to which it is attached. One type of vectors is a “plasmid", which is a circular double-stranded DNA loop with which additional DNA segments can be ligated. Another type of vector is a phage vector. Another type of vector is a viral vector in which additional DNA segments can be ligated to the viral genome. Some vectors are capable of autonomously replicating in the host cell into which they were introduced (for example, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors). Other vectors (for example, non-episomal mammalian vectors) can integrate into the genome of the host cell after they are introduced into the specified host cell, as a result of which they can replicate along with the host genome. In addition, some vectors are able to regulate the expression of genes to which they were functionally attached. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply “recombinant vectors”). In general terms, expression vectors commonly used in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids. As used herein, the terms “plasmid” and “vector” may be used interchangeably since plasmid is the most common form of vector.

Используемые здесь термины “полинуклеотид” или “нуклеиновая кислота” являются взаимозаменяемыми и означают полимеры любой длины, состоящие из нуклеотидов, и такими полимерами являются ДНК и РНК. Нуклеотидами могут быть дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть включен в полимер посредством ДНК- или РНК-полимеразы, либо посредством реакции синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если это необходимо, то модификация нуклеотидной структуры может быть осуществлена до или после сборки полимера. Нуклеотидные последовательности могут прерываться не-нуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после синтеза, например путем его конъюгирования с меткой. Модификациями других типов являются, например, “кэпы”; замена одного или нескольких природных нуклеотидов их аналогами; межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации путем введения незаряженных связей (например, метилфосфонатов, фосфотриэфиров, фосфоамидатов, карбаматов и т.п.) и заряженных связей (например, фосфортиоатов, фосфордитиоатов и т.п.); модификации, содержащие боковые группы, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин, и т.п.); модификации, содержащие интеркалирующие агенты (например, акридин, псорален и т.п.); модификации, содержащие хелатообразующие агенты (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, металлы-окислители и т.п.); модификации, содержащие алкилирующие агенты; модификации, содержащие модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.п.), также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любые гидроксильные группы, обычно присутствующие в сахарах, могут быть заменены, например, фосфонатными группами и фосфатными группами; защищены стандартными защитными группами; или активированы с образованием дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами; либо они могут быть конъюгированы с твердыми или полутвердыми носителями. 5'- и 3'-концевые ОН могут быть фосфорилированы или замещены аминами или органическими “кэпирующими” группами, состоящими из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы могут быть также дериватизированы стандартными защитными группами. Полинуклеотиды могут также содержать аналогичные формы сахаров, таких как рибоза или дезоксирибоза, известных специалистам, включая, например, 2'-О-метил-рибозу-2'-О-аллилрибозу; 2'-фтор- или 2'-азидорибозу; карбоциклические аналоги сахаров; альфа-аномерные сахара; эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилоза или ликсоза; сахар пиранозу, сахар фуранозу; седогептулозу; ациклические аналоги и основные нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными линкерными группами. Такими альтернативными линкерными группами являются, но не ограничиваются ими, варианты, в которых фосфат заменен Р(О)S (“тиоат”), Р(S)S (“дитиоат”), (О)NR₂ (“амидат”), Р(О)R, Р(О)ОR', СО или СН₂ (“формацеталь”), где каждый из R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (С_1-20), необязательно содержащий эфирную связь (-О-), арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Вышеприведенное описание относится ко всем используемым здесь полинуклеотидам, включая РНК и ДНК.As used herein, the terms “polynucleotide” or “nucleic acid” are used interchangeably to mean polymers of any length consisting of nucleotides, and such polymers are DNA and RNA. The nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases and / or their analogues, or any substrate that can be incorporated into the polymer via DNA or RNA polymerase, or through a synthesis reaction. The polynucleotide may contain modified nucleotides, such as methylated nucleotides and their analogues. If necessary, the modification of the nucleotide structure can be carried out before or after the assembly of the polymer. Nucleotide sequences may be interrupted by non-nucleotide components. The polynucleotide can be further modified after synthesis, for example by conjugating it to a label. Modifications of other types are, for example, “caps”; replacement of one or more natural nucleotides with their analogues; internucleotide modifications, such as, for example, modifications by introducing uncharged bonds (e.g. methylphosphonates, phosphotriethers, phosphoamidates, carbamates, etc.) and charged bonds (e.g. phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.); modifications containing side groups, such as, for example, proteins (for example, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.); modifications containing intercalating agents (for example, acridine, psoralen, etc.); modifications containing chelating agents (for example, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.); modifications containing alkylating agents; modifications containing modified bonds (for example, alpha-anomeric nucleic acids, etc.), also unmodified forms of polynucleotide (s). In addition, any hydroxyl groups typically present in sugars can be replaced, for example, with phosphonate groups and phosphate groups; protected by standard protective groups; or activated to form additional bonds with additional nucleotides; or they can be conjugated to solid or semi-solid carriers. 5'- and 3'-terminal OH can be phosphorylated or substituted by amines or organic “capping” groups consisting of 1-20 carbon atoms. Other hydroxyls may also be derivatized with standard protecting groups. Polynucleotides may also contain similar forms of sugars, such as ribose or deoxyribose, known to those skilled in the art, including, for example, 2'-O-methyl-ribose-2'-O-allylribose;2'-fluoro or 2'-azidoribose; carbocyclic analogues of sugars; alpha anomeric sugars; epimeric sugars such as arabinose, xylose or lyxose; pyranose sugar, furanose sugar; sedoheptulose; acyclic analogs and basic nucleoside analogs such as methylriboside. One or more phosphodiester bonds may be replaced by alternative linker groups. Such alternative linker groups include, but are not limited to, variants in which phosphate is replaced by P (O) S (“thioate”), P (S) S (“dithioate”), (O) NR ₂ (“amidate”), P (O) R, P (O) OR ', CO or CH ₂ (“formacetal”), where each of R or R' independently is H or substituted or unsubstituted alkyl (C _1-20 ), optionally containing an ether bond (-O-), aryl, alkenyl, cycloalkyl, cycloalkenyl or araldyl. Not all bonds in the polynucleotide must be identical. The above description applies to all polynucleotides used herein, including RNA and DNA.

Используемый здесь термин “олигонуклеотид”, в общих чертах, означает короткие, в основном, одноцепочечные, обычно синтетические полинуклеотиды, длина которых составляет, главным образом, но необязательно, менее чем примерно 200 нуклеотидов. Термины “олигонуклеотид” и “полинуклеотид” не являются взаимоисключающими. Вышепривиденное описание полинуклеотидов может в равной степени и полностью относиться к олигонуклеотидам.As used herein, the term “oligonucleotide” generally means short, mostly single-stranded, usually synthetic polynucleotides, the length of which is mainly, but not necessarily, less than about 200 nucleotides. The terms “oligonucleotide” and “polynucleotide” are not mutually exclusive. The above description of polynucleotides can equally and fully relate to oligonucleotides.

“Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей” пептидов или полипептидов определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в конкретной пептидной или полипептидной последовательности, после выравнивания этих последовательностей и введения в них “пробелов”, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, причем какие-либо консервативные замены не рассматриваются как часть идентичных последовательностей. Выравнивание, осуществляемое в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, может быть проведено различными методами, известными специалистам, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или MеgAlign (DNASTAR). Специалист в данной области может самостоятельно определить соответствующие параметры выравнивания, включая использование любых алгоритмов, необходимых для достижения оптимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако в целях настоящего изобретения % идентичности аминокислотных последовательностей вычисляют с применением компьютерных программ ALIGN-2, используемой для сравнения последовательностей. Компьютерная программа ALIGN-2, предназначенная для сравнения последовательностей, была разработана фирмой Genentech, Inc. и указанный исходный код был зарегистрирован в документации для пользователей в Ведомстве по копирайту США, Вашингтон, D.C., 20559, под регистрационным номером U.S. Copyright Registration № TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной программой, поставляемой фирмой Genentech, Inc., South San Francisco, California. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения в операционной системе UNIX, предпочтительно в цифровой системе UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей были установлены в программе ALIGN-2 и не изменялись.The “percentage (%) amino acid sequence identity" of peptides or polypeptides is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to amino acid residues in a particular peptide or polypeptide sequence, after aligning these sequences and introducing “gaps” in them, if necessary, for achieving a maximum percentage of sequence identity, and any conservative substitutions are not considered as part of the identical sequence of the notes. Alignment carried out in order to determine the percent identity of amino acid sequences can be carried out by various methods known to those skilled in the art, for example using commonly available computer programs such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or MegAlign (DNASTAR). The person skilled in the art can independently determine the appropriate alignment parameters, including the use of any algorithms necessary to achieve optimal alignment along the entire length of the compared sequences. However, for the purposes of the present invention,% amino acid sequence identity is calculated using ALIGN-2 computer programs used for sequence comparison. The computer program ALIGN-2, designed to compare sequences, was developed by Genentech, Inc. and the specified source code was registered in the user documentation in the United States Copyright Office, Washington, D.C., 20559, under registration number U.S. Copyright Registration No. TXU510087. The ALIGN-2 program is a publicly available program provided by Genentech, Inc., South San Francisco, California. The ALIGN-2 program must be designed for use on a UNIX operating system, preferably a digital UNIX V4.0D system. All sequence comparison parameters were set in the ALIGN-2 program and were not changed.

В случае если для сравнения аминокислотных последовательностей используется программа ALIGN-2, то % идентичности данной аминокислотной последовательности А с данной аминокислотной последовательностью В (которая альтернативно может быть названа данной аминокислотной последовательностью А, имеющей или составляющей определенный % идентичности с данной аминокислотной последовательностью В) вычисляют следующим образом: If the ALIGN-2 program is used to compare amino acid sequences, then the% identity of a given amino acid sequence A with a given amino acid sequence B (which could alternatively be called a given amino acid sequence A having or constituting a certain% identity with a given amino acid sequence B) is calculated as follows way:

100·Х/Y,100 X / Y,

где Х представляет собой число аминокислотных остатков, которые были оценены как полностью соответствующие при выравнивании последовательностей с использованием программы ALIGN-2, с помощью которой проводили сравнение последовательностей А и В, и где Y представляет собой полное число аминокислотных остатков в последовательности В. При этом следует отметить, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, то % идентичности аминокислотной последовательности А аминокислотной последовательности В не равен % идентичности аминокислотной последовательности В аминокислотной последовательности А.where X represents the number of amino acid residues that were estimated to be completely consistent when aligning the sequences using the ALIGN-2 program, which compared sequences A and B, and where Y represents the total number of amino acid residues in sequence B. note that if the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, then% identity of amino acid sequence A of amino acid sequence In atelnosti not equal the% amino acid sequence identity in amino acid sequence A.

Если это не оговорено особо, то общий % идентичности используемых здесь аминокислотных последовательностей вычисляли как описано в предыдущем параграфе с использованием компьютерной программы ALIGN-2.Unless otherwise specified, the total% identity of the amino acid sequences used here was calculated as described in the previous paragraph using the ALIGN-2 computer program.

Используемый здесь термин «DLL4» (который является синонимом термину «дельта-подобный 4”), означает, если это не оговорено особо или не следует из контекста изобретения, любой нативный или модифицированный (природный или синтетический) полипептид DLL4. Термин «нативная последовательность», в частности, охватывает природные усеченные или секретированные формы (например, последовательность внеклеточного домена), природные варианты (например, альтернативно сплайсированные формы) и природные аллельные варианты. Термин «DLL4 дикого типа», в основном, означает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность природного белка DLL4. Термин «последовательность DLL4 дикого типа”, в основном, означает аминокислотную последовательность, присутствующую в природном DLL4. As used herein, the term “DLL4” (which is synonymous with the term “delta-like 4”) means, unless otherwise specified or from the context of the invention, any native or modified (natural or synthetic) DLL4 polypeptide. The term “native sequence”, in particular, encompasses natural truncated or secreted forms (eg, extracellular domain sequence), natural variants (eg, alternatively spliced forms), and natural allelic variants. The term "wild-type DLL4" basically means a polypeptide containing the amino acid sequence of the natural DLL4 protein. The term “wild-type DLL4 sequence” basically means the amino acid sequence present in native DLL4.

Используемый здесь термин «рецептор Notch» (который является синонимом термину «Notch»), означает, если это не оговорено особо или не следует из контекста изобретения, любой нативный или модифицированный (природный или синтетический) полипептид рецептора Notch. У человека присутствует четыре рецептора Notch (Notch1, Notch2, Notch3 и Notch4). Используемый здесь термин «рецептор Notch» включает любой один или все четыре человеческих рецептора Notch. Термин «нативная последовательность», в частности, охватывает природные усеченные или секретированные формы (например, последовательность внеклеточного домена), природные варианты (например, альтернативно сплайсированные формы) и природные аллельные варианты. Термин «рецептор Notch дикого типа», в основном, означает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность природного белка рецептора Notch. Термин «последовательность рецептора Notch дикого типа”, в основном, означает аминокислотную последовательность, присутствующую в природном рецепторе Notch. As used herein, the term "Notch receptor" (which is synonymous with the term "Notch") means, unless otherwise specified or as follows from the context of the invention, any native or modified (natural or synthetic) Notch receptor polypeptide. In humans, there are four Notch receptors (Notch1, Notch2, Notch3, and Notch4). As used herein, the term "Notch receptor" includes any one or all four human Notch receptors. The term “native sequence”, in particular, encompasses natural truncated or secreted forms (eg, extracellular domain sequence), natural variants (eg, alternatively spliced forms), and natural allelic variants. The term "wild-type Notch receptor" generally means a polypeptide containing the amino acid sequence of a natural Notch receptor protein. The term “wild-type Notch receptor sequence” generally means an amino acid sequence present in a Notch native receptor.

Используемые здесь термины «антитело» и «иммуноглобулин» являются синонимами, употребляемыми в самом широком смысле, и включают моноклональные антитела (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, при условии, что они обладают нужной биологической активностью), также могут включать некоторые фрагменты антител (более подробно описанные ниже). Антитело может быть человеческим, гуманизованным и/или аффинно зрелым. As used herein, the terms “antibody” and “immunoglobulin” are used synonymously in the broadest sense and include monoclonal antibodies (eg, full-size or intact monoclonal antibodies), polyclonal antibodies, polyvalent antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies, provided that they possess the desired biological activity) may also include some antibody fragments (described in more detail below). The antibody may be human, humanized and / or affinity matured.

Термин “вариабельный” относится к некоторым частям вариабельных доменов, которые имеют значительные отличия в последовательностях различных антител и участвуют в связывании каждого конкретного антитела с его конкретным антигеном, также определяют специфичность каждого конкретного антитела по отношению к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется по всем вариабельным доменам антител. Она концентрируется в трех сегментах, называемых комплементарность-определяющими областями (СDR) или гипервариабельными областями (HVR), присутствующими в вариабельных доменах как легкой, так и тяжелой цепи. Наиболее высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Каждый вариабельный домен нативной тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR, имеющих, главным образом, β-складчатую конфигурацию и соединенных тремя СDR, которые образуют петли, соединяющие, в некоторых случаях, образующие часть β-складчатой структуры. Гипервариабельные области (СDR) в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга посредством FR, и, вместе СDR другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности.The term “variable” refers to certain parts of the variable domains that have significant differences in the sequences of different antibodies and are involved in the binding of each specific antibody to its specific antigen, also determine the specificity of each specific antibody with respect to its specific antigen. However, variability is not evenly distributed across all variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments called complementarity determining regions (CDRs) or hypervariable regions (HVRs) present in the variable domains of both light and heavy chains. The most highly conserved parts of variable domains are called framework regions (FR). Each variable domain of the native heavy and light chains contains four FRs having mainly a β-folded configuration and connected by three CDRs that form loops connecting, in some cases, forming part of the β-folded structure. The hypervariable regions (CDRs) in each chain are held in close proximity to each other by FR, and, together with the CDRs of the other chain, are involved in the formation of the antigen-binding site of antibodies (see Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). The constant domains do not directly participate in the binding of the antibody to the antigen, but have various effector functions, such as the participation of the antibody in antibody-dependent cellular cytotoxicity.

Гидролиз антител папаином приводит к продуцированию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых Fab-фрагментами, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт, и другого Fc-фрагмента, обозначение которого указывает на его способность к быстрой кристаллизации. Обработка пепсином приводит к образованию F(ab')₂-фрагмента, который имеет два антигенсвязывающих сайта и обладает способностью перекрестно связываться с антигеном. Hydrolysis of antibodies by papain leads to the production of two identical antigen binding fragments, called Fab fragments, each of which has one antigen binding site, and another Fc fragment, the designation of which indicates its ability to rapidly crystallize. Pepsin treatment leads to the formation of an F (ab ') ₂ fragment, which has two antigen-binding sites and has the ability to cross-bind to the antigen.

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полноразмерный сайт распознавания антигена и антигенсвязывающий сайт антитела. В двухцепочечном Fv эта область состоит из димера, который включает один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи, жестко связанные нековалентной связью. В одноцепочечном Fv один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи может быть ковалентно связан гибким пептидным линкером, в результате чего легкая и тяжелая цепи могут ассоциироваться друг с другом с образованием «димерной» структуры, аналогичной структуре двухцепочечного Fv. Он имеет такую конфигурацию, при которой три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют друг с другом и определяют антигенсвязывающий сайт на поверхности димера VН-VL. В целом, шесть CDR сообщают данному антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных к антигену) может обладать способностью распознавать антиген и связываться с этим антигеном, хотя, возможно, с более низкой аффинностью, чем полный сайт связывания. "Fv" is a minimal antibody fragment containing a full-sized antigen recognition site and an antigen binding site of the antibody. In double-stranded Fv, this region consists of a dimer, which includes one variable domain of the heavy chain and one variable domain of the light chain, rigidly connected by a non-covalent bond. In a single-chain Fv, one variable domain of the heavy chain and one variable domain of the light chain can be covalently linked by a flexible peptide linker, as a result of which the light and heavy chains can be associated with each other to form a “dimeric” structure similar to the structure of a double-chain Fv. It has a configuration in which three CDRs of each variable domain interact with each other and define an antigen-binding site on the surface of the VH-VL dimer. In total, six CDRs confer antigen binding specificity to this antibody. However, even one variable domain (or half of the Fv containing only three CDRs specific for the antigen) may be able to recognize the antigen and bind to this antigen, although it may have a lower affinity than the full binding site.

Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов несколькими остатками, присоединенными у карбокси-конца домена СН1 тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов от шарнирной области антитела. Fab'-SH представляет собой Fab', в котором цистеиновый(е) остаток(тки) константных доменов имеют свободную тиоловую группу. По своей природе F(ab')₂-фрагменты антитела продуцируются как пары Fab'-фрагментов, которые связаны между собой шарнирными цистеиновыми остатками. Известны также и другие химические связи фрагментов антител.The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab'fragments differ from Fab fragments by several residues attached at the carboxy-end of the heavy chain CH1 domain, including one or more cysteines from the hinge region of the antibody. Fab'-SH is Fab 'in which the cysteine (e) residue (s) of the constant domains have a free thiol group. By their nature, F (ab ') ₂ fragments of an antibody are produced as pairs of Fab'fragments that are linked together by hinged cysteine residues. Other chemical bonds of antibody fragments are also known.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов), происходящих от позвоночных любого вида, могут быть отнесены к одному из двух абсолютно различных типов цепей, называемых каппа (k) и лямбда (λ), исходя из аминокислотных последовательностей их константных доменов.The "light chains" of antibodies (immunoglobulins) originating from vertebrates of any kind can be assigned to one of two completely different types of chains, called kappa (k) and lambda (λ), based on the amino acid sequences of their constant domains.

Иммуноглобулины в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей могут быть отнесены к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть также разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие иммуноглобулинам различных классов, обозначаются α, δ, ε, γ и μ соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов различных классов хорошо известны специалистам. Immunoglobulins, depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, can be assigned to different classes. There are five main classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and some of them can also be divided into subclasses (isotypes), for example, IgG ₁ , IgG ₂ , IgG ₃ , IgG ₄ , IgA ₁ and IgA ₂ . The heavy chain constant domains corresponding to immunoglobulins of various classes are denoted by α, δ, ε, γ, and μ, respectively. Subunit structures and three-dimensional configurations of immunoglobulins of various classes are well known in the art.

«Фрагменты антител» содержат только часть интактного антитела, где указанная часть, если она присутствует в интактном антителе, предпочтительно сохраняет, по меньшей мере, одну функцию, предпочтительно большинство функций или все функции, обычно присущие такой части природного интактного антитела. Примерами фрагментов антител являются Fab-, Fab'-, F(ab')₂- и Fv-фрагменты; диантитела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В одном из вариантов изобретения фрагмент антитела содержит антигенсвязывающий сайт интактного антитела, поэтому он сохраняет свою способность связываться с антигеном. В другом варианте изобретения фрагмент антитела, например фрагмент, содержащий Fc-область, если он присутствует в интактной антителе, сохраняет, по меньшей мере, одну из биологических функций, обычно присущих Fc-области интактного антитела, таких как связывание с FcRn, способность модулировать время полужизни антитела, ADCC-функция и связывание с комплементом. В одном из вариантов изобретения фрагментом антитела является одновалентное антитело, которое имеет время полужизни in vivo, в основном, аналогичное времени полужизни интактного антитела. Так, например, такой фрагмент антитела может содержать антигенсвязывающую область, присоединенную к последовательности Fc и способную сообщать указанному фрагменту стабильность in vivo. “Antibody fragments” contain only a portion of an intact antibody, wherein said portion, if present in the intact antibody, preferably retains at least one function, preferably most of the functions, or all functions normally found in that part of a natural intact antibody. Examples of antibody fragments are Fab, Fab'-, F (ab ') ₂ - and Fv fragments; diantibodies; linear antibodies; single chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments. In one embodiment of the invention, the antibody fragment contains the antigen-binding site of the intact antibody, therefore, it retains its ability to bind to the antigen. In another embodiment, an antibody fragment, for example, a fragment containing an Fc region, if present in an intact antibody, retains at least one of the biological functions typically found in the Fc region of an intact antibody, such as binding to FcRn, the ability to modulate time antibody half-life, ADCC function and complement binding. In one embodiment of the invention, the antibody fragment is a monovalent antibody that has an in vivo half-life substantially similar to the half-life of an intact antibody. So, for example, such an antibody fragment may contain an antigen binding region attached to the Fc sequence and capable of imparting stability to the said fragment in vivo .

Используемые здесь термины “гипервариабельная область”, “HVR” или “HV” означают области вариабельного домена антитела, которые являются в данной последовательности гипервариабельными и/или образуют петли определенной структуры. В общих чертах, указанные антитела содержат шесть гипервариабельных областей; три области в VH (Н1, Н2, Н3) и три области в VL (L1, L2, L3). В настоящей заявке используется ряд гипервариабельных областей, который входит в объем настоящего изобретения. Гипервариабельные области (комплементарность-определяющие области (CDR)) по Кэбату обладают высокой степенью вариабельности последовательности и находят наиболее частое применение (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Вместо определения гипервариабельных областей по Кэбату Чотия предложил определять гипервариабельные области по локализации структурных петель (Chothia & Lesk, J. Mol.Biol. 196:901-917 (1987)). Определение гипервариабельных областей AbМ представляет собой компромисс между “CDR” по Кэбату и “структурными петлями” по Чотия, и такие определения используются в компьютерной программе по моделированию антител Oxford Molecular's AbМ. “Контактные” гипервариабельные области определяют исходя из анализа имеющихся сложных кристаллических структур. Остатки каждой из этих гипервариабельных областей приводятся ниже:As used herein, the terms “hypervariable region”, “HVR” or “HV” mean regions of the variable domain of an antibody that are hypervariable in this sequence and / or form loops of a specific structure. In general terms, these antibodies contain six hypervariable regions; three areas in VH (H1, H2, H3) and three areas in VL (L1, L2, L3). This application uses a number of hypervariable regions, which is included in the scope of the present invention. Kabat hypervariable regions (complementarity determining regions (CDRs)) have a high degree of sequence variability and are most commonly used (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda , MD. (1991)). Instead of defining hypervariable regions by Kabat, Chotia proposed defining hypervariable regions by localization of structural loops (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). The definition of the hypervariable AbM regions is a compromise between the Kebat “CDR” and the Chotia “structural loops”, and such definitions are used in Oxford Molecular's AbM antibody modeling software. “Contact” hypervariable regions are determined based on an analysis of the existing complex crystalline structures. The remains of each of these hypervariable regions are given below:

ПетляThe loop По КэбатуKabatu AbМAbМ По ЧотияBy Chotia Контактные областиContact areas L1L1 L24-L34L24-L34 L24-L34L24-L34 L26-L32L26-L32 L30-L36L30-L36 L2L2 L50-L56L50-L56 L50-L56L50-L56 L50-L52L50-L52 L46-L55L46-L55 L3L3 L89-L97L89-L97 L89-L97L89-L97 L91-L96L91-L96 L89-L96L89-L96 Н1H1 Н31-Н35ВH31-H35V Н26-Н35ВH26-H35V Н26-Н32H26-H32 Н30-Н35ВN30-N35V (Нумерация по Кэбату)(Kabat numbering) Н1H1 Н31-Н35H31-H35 Н26-Н35H26-H35 Н26-Н32H26-H32 Н30-Н35H30-H35 (Нумерация по Чотия)(Cotia numbering) Н2H2 Н50-Н65H50-H65 Н50-Н58H50-H58 Н53-Н55H53-H55 Н47-Н58H47-H58 Н3H3 Н95-Н102H95-H102 Н95-Н102H95-H102 Н96-Н101H96-H101 Н93-Н101H93-H101

Термин “гипервариабельные области” может включать “удлиненные гипервариабельные области”, именно: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в VL; и 26-35 (Н1), 50-65 или 49-65 (Н2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (Н3) в VH. Остатки вариабельных доменов для каждого из указанных определений пронумерованы по Кэбату и др., см. выше.The term “hypervariable regions” may include “elongated hypervariable regions”, namely: 24-36 or 24-34 (L1), 46-56 or 50-56 (L2) and 89-97 (L3) in VL; and 26-35 (H1), 50-65 or 49-65 (H2) and 93-102, 94-102 or 95-102 (H3) in VH. The remains of the variable domains for each of these definitions are numbered according to Kebat et al., See above.

“Каркасными” или “FR” остатками являются остатки вариабельных доменов, за исключением остатков гипервариабельных областей, определенных выше.“Frame” or “FR” residues are those of the variable domains, with the exception of those of the hypervariable regions defined above.

Используемый здесь термин «моноклональное антитело» означает антитело, происходящее от популяции, в основном, гомогенных антител, то есть отдельные антитела, входящие в такую популяцию, являются идентичными и/или связываются с одним и тем же (одними и теми же) эпитопом(ами), за исключением возможных вариантов, которые могут образовываться в процессе продуцирования моноклонального антитела, где указанные варианты, в основном, присутствуют в незначительных количествах. Таким моноклональным антителом обычно является антитело, содержащее полипептидную последовательность, связывающуюся с мишенью, где указанную связывающуюся с мишенью полипептидную последовательность получают способом, который включает отбор одной связывающейся с мишенью полипептидной последовательности из множества полипептидных последовательностей. Так, например, такой способ отбора может представлять собой отбор уникального клона из множества клонов, таких как пул гибридомных клонов, фаговых клонов или рекомбинантных ДНК-клонов. При этом следует отметить, что выбранная связывающаяся с мишенью последовательность может быть также модифицирована, например, для повышения аффинности к мишени, для гуманизации связывающейся с мишенью последовательности, для улучшения ее продуцирования в клеточной культуре, для снижения ее иммуногенности in vivo, для создания мультиспецифического антитела и т.п., и что указанное антитело, содержащее модифицированную мишень-связывающую последовательность, также представляет собой моноклональное антитело согласно изобретению. В отличие от препаратов поликлональных антител, которыми обычно являются различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Препараты моноклональных антител, помимо их специфичности, обладают и другими преимуществами, то есть они обычно не содержат других примесных иммуноглобулинов. Термин «моноклональный» определяет характер антитела, полученного, в основном, из гомогенной популяции антител, но не означает, что это антитело должно быть продуцировано каким-либо конкретным методом. Так, например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены различными методами, включая, например, гибридомный метод (например, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), методы рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567), технологии фагового представления (см., например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); и Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004), и методы продуцирования человеческих или гуманизованных антител у животных, которые имеют части или все локусы человеческого иммуноглобулина или гены, кодирующие последовательности человеческого иммуноглобулина (см., например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); патенты США № 5545806; 5569825; 5591669 (все от GenPharm); 5545807; WO 1997/17852; патенты США № 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995). As used herein, the term “monoclonal antibody” means an antibody derived from a population of substantially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies within such a population are identical and / or bind to the same (same) epitope (s) ), with the exception of the possible variants that can be formed during the production of a monoclonal antibody, where these variants are mainly present in small quantities. Such a monoclonal antibody is typically an antibody containing a target binding polypeptide sequence, wherein said target binding polypeptide sequence is prepared by a method that comprises selecting one target binding polypeptide sequence from a plurality of polypeptide sequences. So, for example, such a selection method can be a selection of a unique clone from a variety of clones, such as a pool of hybridoma clones, phage clones or recombinant DNA clones. It should be noted that the selected target-binding sequence can also be modified, for example, to increase the affinity of the target, to humanize the sequence that binds to the target, to improve its production in cell culture, to reduce its immunogenicity in vivo , to create a multispecific antibody and the like, and that said antibody comprising a modified target binding sequence is also a monoclonal antibody of the invention. Unlike polyclonal antibody preparations, which are usually different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody in a monoclonal antibody preparation is directed against one determinant on an antigen. Monoclonal antibody preparations, in addition to their specificity, have other advantages, that is, they usually do not contain other impurity immunoglobulins. The term "monoclonal" defines the nature of the antibody, obtained mainly from a homogeneous population of antibodies, but does not mean that this antibody must be produced by any specific method. For example, the monoclonal antibodies used in accordance with the present invention can be obtained by various methods, including, for example, the hybridoma method (e.g., Kohler et al., Nature , 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, NY, 1981)), recombinant DNA methods (see , for example, US patent No. 4816567), phage presentation technologies (see, for example, Clackson et al., Nature , 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. , 222: 581- 597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol . 340 (5): 1073-1093 (2004) ; Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); and Lee et al. J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004), and methods for producing human or humanized antibodies in animals that have parts or all of the loci of the human immunoglobulin or genes encoding the sequences of the human immunoglobulin (see, for example, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature , 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); U.S. Patent Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (all from GenPharm); 5,545,807; WO 1997/17852; U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5633425 and 5661016; Marks et al., Bio / Technology , 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature , 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature , 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology , 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology , 14: 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

«Гуманизованные» формы не-человеческих антител (например, мышиных антител) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую от не-человеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизованные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело реципиента), в которых остатки, происходящие от гипервариабельной области данного антитела-реципиента, заменены остатками, происходящими от гипервариабельной области не-человеческого антитела (донорного антитела), такого как мышиное антитело, крысиное антитело, кроличье антитело или антитело приматов, не являющихся человеком, где указанные антитела обладают нужной специфичностью, аффинностью и связывающей способностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими не-человеческими остатками. Кроме того, гуманизованные антитела могут содержать остатки, не обнаруженные в антителе реципиента или в антителе донора. Эти модификации вводят для улучшения свойств антитела. В общих чертах, гуманизованное антитело может содержать, в основном, все или по меньшей мере один, обычно два вариабельных домена, в которых все или почти все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям не-человеческого иммуноглобулина, и все или почти все FR представляют собой FR с последовательностью человеческого иммуноглобулина. Гуманизованное антитело также содержит, но необязательно, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно области человеческого иммуноглобулина. Более подробное описание см. у Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-329 (1998) и у Presta Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). См. также нижеследующие обзорные статьи и цитируемые там работы: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).“Humanized” forms of non-human antibodies (eg, murine antibodies) are chimeric antibodies that contain a minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. For the most part, humanized antibodies are human immunoglobulins (a recipient antibody) in which residues derived from the hypervariable region of a given recipient antibody are replaced by residues derived from a hypervariable region of a non-human antibody (donor antibody), such as a mouse antibody, a rat antibody , a rabbit or non-human primate antibody, wherein said antibodies have the desired specificity, affinity and binding ability. In some instances, framework region (FR) residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. In addition, humanized antibodies may contain residues not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications are introduced to improve the properties of the antibodies. In general terms, a humanized antibody may comprise substantially all or at least one, typically two variable domains in which all or almost all of the hypervariable loops correspond to the hypervariable loops of a non-human immunoglobulin, and all or almost all of the FRs are FR with human immunoglobulin sequence. A humanized antibody also contains, but not necessarily, at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically a human immunoglobulin region. For a more detailed description, see Jones et al. Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332: 323-329 (1998) and Presta Curr. Op. Struct. Biol ., 2: 593-596 (1992). See also the following review articles and references cited there: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech 5: 428-433 (1994).

«Химерные антитела» (иммуноглобулины) имеют часть тяжелой и/или легкой цепи, идентичную или гомологичную соответствующим последовательностям антител, происходящих от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу, остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующим последовательностям антител, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, также от фрагментов таких антител, при условии, что они обладают нужной биологической активностью (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Используемое здесь гуманизованное антитело представляет собой подпоследовательность химерных антител. "Chimeric antibodies" (immunoglobulins) have a part of the heavy and / or light chain that is identical or homologous to the corresponding sequences of antibodies originating from a particular species or belonging to a particular class or subclass, the remaining chain (s) are identical (s) or homologous ( s) the corresponding sequences of antibodies derived from another species or belonging to another class or subclass of antibodies, also from fragments of such antibodies, provided that they have the desired biological activity (US patent No. 4816567; Morrison et al, Proc Natl Acad Sci USA 81:..... 6851-6855 (1984)). The humanized antibody used herein is a subsequence of chimeric antibodies.

«Одноцепочечный Fv-фрагмент» или «scFv-фрагмент» антител включает домены VH и VL антитела, где указанные домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид scFv также содержит между доменами VH и VL полипептидный линкер, который обеспечивает образование scFv со структурой, необходимой для связывания с антигеном. Описание scFv можно найти в работе Pluckthun «The Pharmacology of Monoclonal Antibodies», vol. 113, Rosenburg & Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994). A “single chain Fv fragment” or “scFv fragment” of an antibody includes the VH and VL domains of an antibody, wherein said domains are present in a single polypeptide chain. Typically, the scFv polypeptide also contains between the VH and VL domains a polypeptide linker that provides the formation of scFv with the structure necessary for binding to the antigen. A description of scFv can be found in Pluckthun's The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg & Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин «антиген» означает предварительно определенный антиген, с которым может селективно связываться антитело. Антигеном-мишенью может быть полипептид, углевод, нуклеиновая кислота, липид, гаптен или другое природное или синтетическое соединение. Предпочтительным антигеном-мишенью является полипептид. The term "antigen" means a predefined antigen with which an antibody can selectively bind. The target antigen may be a polypeptide, carbohydrate, nucleic acid, lipid, hapten, or other natural or synthetic compound. A preferred target antigen is a polypeptide.

Термин “диантитела” означает небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, где указанные фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). Если линкер является слишком коротким для образования пары между двумя доменами на одной и той же цепи, то домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих сайта. Диантитела более подробно описаны, например, в ЕР 404097; в WO 93/11161 и у Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448 (1993). The term “diantibodies” means small antibody fragments with two antigen-binding sites, where these fragments include the heavy chain variable domain (VH) linked to the light chain variable domain (VL) in the same polypeptide chain (VH-VL). If the linker is too short to form a pair between two domains on the same chain, then the domains are forced to mate with the complementary domains of the other chain and form two antigen-binding sites. Diantibodies are described in more detail, for example, in EP 404097; in WO 93/11161 and Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 6444-6448 (1993).

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого у человека и/или полученного любыми описанными здесь методами конструирования человеческих антител. Такое определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизованное антитело, содержащее не-человеческие антигенсвязывающие остатки.A “human antibody” is an antibody having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of an antibody produced in humans and / or obtained by any of the methods for constructing human antibodies described herein. Such a definition of a human antibody, in particular, excludes a humanized antibody containing non-human antigen binding residues.

«Аффинно зрелое» антитело представляет собой антитело, имеющее одну или несколько модификаций в одной или нескольких CDR, что позволяет повышать аффинность данного антитела к антигену, по сравнению с родительским антителом, не имеющим такой(их) модификации(й). Предпочтительные аффинно зрелые антитела имеют наномолярные или даже пикомолярные аффинности по отношению к антигену-мишени. Аффинно зрелые антитела получают известными методами. В публикации Marks и др. (Bio/Technology 10:779-783 (1992) описано созревание аффинности в результате перестановки доменов VH и VL. Неспецифический мутагенез CDR и/или каркасных остатков описан в публикациях Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995) и Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). An "affinity matured" antibody is an antibody having one or more modifications in one or more CDRs, which allows to increase the affinity of the antibody for the antigen, as compared to the parent antibody that does not have such (their) modification (s). Preferred affinity matured antibodies have nanomolar or even picomolar affinities for the target antigen. Affinity matured antibodies are prepared by known methods. Marks et al. ( Bio / Technology 10: 779-783 (1992) describe affinity maturation resulting from permutation of the VH and VL domains. Nonspecific mutagenesis of CDRs and / or framework residues is described in Barbas et al., Proc. Natl. Acad . Sci., USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995) and Hawkins et al., J. Mol. Biol . 226: 889-896 (1992).

Термин «эффекторные функции» антител означает биологические активности, присущие Fc-области (Fc-области нативной последовательности или Fc-области варианта аминокислотной последовательности) антитела и варьирующиеся в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторых функций антитела являются связывание с С1q и комплемент-зависимая цитотоксичность; связывание с Fc-рецептором; антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; негативная регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и активация В-клеток.The term "effector functions" of antibodies means biological activities inherent in the Fc region (Fc region of a native sequence or Fc region of a variant of an amino acid sequence) of an antibody and varying depending on the isotype of the antibody. Examples of antibody effector functions are C1q binding and complement dependent cytotoxicity; binding to the Fc receptor; antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; negative regulation of cell surface receptors (e.g., B-cell receptor); and B cell activation.

“Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность” или “ADCC” означает форму цитотоксичности, при которой секретированный Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на некоторых цитотоксических клетках (например, природных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), позволяет этим цитотоксическим эффекторым клеткам специфически связываться с антигенсодержащими клетками-мишенями и вызывать гибель клеток-мишеней под действием цитотоксинов. Эти антитела «вооружают» цитотоксические клетки и являются абсолютно необходимыми для такого цитолиза. Первичные клетки, опосредующие ADCC, то есть NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные, полученные для экспрессии FcR на гемопоэтических клетках, систематизированы в таблице 3 на странице 464 Ravetch & Kinet Annu. Rev. Immunol. (1991) 9:457-92. Для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы может быть проведен анализ на ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в патентах США №№ 5500362 или 5821337, или Presta, в патенте США № 6737056. Эффекторными клетками, подходящими для таких анализов, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно ADCC-активность представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на модели животного, такой как модель, описанная Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:652-656 (1998). “Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity” or “ADCC” means a form of cytotoxicity in which secreted Ig bound to Fc receptors (FcRs) present on certain cytotoxic cells (eg, natural killer cells (NK), neutrophils and macrophages ) allows these cytotoxic effector cells to specifically bind to antigen-containing target cells and cause the death of target cells under the action of cytotoxins. These antibodies “arm” cytotoxic cells and are absolutely necessary for such cytolysis. Primary cells mediating ADCC, i.e., NK cells, express FcγRIII only, while monocytes express FcγRI, FcγRII and FcγRIII. The data obtained for the expression of FcR on hematopoietic cells are summarized in Table 3 on page 464 of Ravetch & Kinet Annu. Rev. Immunol. (1991) 9: 457-92. In order to evaluate the ADCC activity of the molecule of interest, an in vitro ADCC assay can be performed, such as the assay described in US Pat. Nos. 5,500,362 or 5,821,337, or Presta, in US Pat. No. 6,737,056. Mononuclear effector cells suitable for such assays are peripheral blood cells (MCPC) and natural killer cells (NK). Alternatively or additionally, the ADCC activity of the molecule of interest can be evaluated in vivo , for example, in an animal model, such as the model described by Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95: 652-656 (1998).

«Человеческие эффекторные клетки» представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно такие клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и осуществляют эффекторную ADCC-функцию. Примерами человеческих лейкоцитов, опосредующих ADCC, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, при этом предпочтительными являются МКПК и NK. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника, например из крови. “Human effector cells” are white blood cells that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably, such cells express at least FcγRIII and perform an ADCC effector function. Examples of human leukocytes mediating ADCC are peripheral blood mononuclear cells (MCPCs), natural killer cells (NK), monocytes, cytotoxic T cells and neutrophils, with MCPC and NK being preferred. Effector cells can be isolated from a natural source, for example from blood.

Термины «Fc-рецептор» или «FcR» используются для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является человеческий FcR с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор), и рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторами FcγRII являются FcγRIIA (“активирующий рецептор”) и FcγRIIB (“ингибирующий рецептор”), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, отличающиеся, главным образом, своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в своем цитоплазматическом домене активирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в своем цитоплазматическом домене ингибирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITIM). (см. обзор М. Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). FcR описаны в публикациях Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Используемый здесь термин “FcR” также охватывает и другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем. Этот термин также включает рецептор, имеющийся у новорожденных, FcRn, который является ответственным за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)), и регулирует гомеостаз иммуноглобулинов. В WO 00/42072 (Presta) описаны варианты антител с повышенным или пониженным уровнем связывания с FcR. Содержание данной патентной публикации конкретно вводится в настоящее описание посредством ссылки. См., также Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).The terms “Fc receptor” or “FcR” are used to describe a receptor that binds to the Fc region of an antibody. Preferred FcR is human sequence native FcR. In addition, a preferred FcR is FcR, which binds to an IgG antibody (gamma receptor), and receptors of subclasses FcγRI, FcγRII and FcγRIII, including allelic variants and alternatively spliced forms of these receptors. FcγRII receptors are FcγRIIA (“activating receptor”) and FcγRIIB (“inhibitory receptor”), which have similar amino acid sequences that differ mainly in their cytoplasmic domains. The activating receptor FcγRIIA contains in its cytoplasmic domain an tyrosine-based immunoreceptor motif (ITAM). The inhibitory receptor FcγRIIB contains in its cytoplasmic domain an tyrosine-based immunoreceptor inhibitory motif (ITIM). (see review by M. Daeron, Annu. Rev. Immunol ., 15: 203-234 (1997)). FcRs are described in Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34 (1994) and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med ., 126: 330-41 (1995). As used herein, the term “FcR” also covers other FcRs, including FcRs, which will be identified in the future. The term also includes a neonatal receptor, FcRn, which is responsible for the transmission of maternal IgG to the fetus (Guyer et al., J. Immunol ., 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol ., 24: 249 (1994)), and regulates immunoglobulin homeostasis. WO 00/42072 (Presta) describes antibody variants with increased or decreased levels of binding to FcR. The contents of this patent publication are specifically incorporated into this description by reference. See also Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001).

Методы измерения уровня связывания с FcRn известны специалистам (см., например, Ghetie 1997, Hinton, 2004). Связывание с человеческим FcRn in vivo и время полужизни полипептидов, обладающих высокой аффинностью связывания с человеческим FcRn, в сыворотке, могут быть оценены, например, у трансгенных мышей или в трансфецированных человеческих клеточных линиях, экспрессирующий человеческий FcRn, или у приматов, которым были введены варианты полипептидов Fc.Methods for measuring the level of binding to FcRn are known to those skilled in the art (see, for example, Ghetie 1997, Hinton, 2004). In vivo binding to human FcRn and the half-life of polypeptides having high binding affinity for human FcRn in serum can be evaluated, for example, in transgenic mice or in transfected human cell lines expressing human FcRn, or in primates that have been introduced with variants Fc polypeptides.

“Комплемент-зависимая цитотоксичность” или “CDС” означает лизис клеток-мишеней в присутствии комплемента. Классический путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (С1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связываются с их когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ на CDС, например, как описано Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996). “Complement dependent cytotoxicity” or “CDC” means the lysis of target cells in the presence of complement. The classical complement activation pathway is initiated by the binding of the first component of the complement system (C1q) to antibodies (corresponding subclass) that bind to their cognate antigen. To assess complement activation, a CDC assay can be performed, for example, as described by Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996).

Полипептидные варианты, имеющие модифицированные аминокислотные последовательности Fc-области и обладающие повышенной или пониженной способностью связываться с C1q, описаны в патенте США № 6194551B1 и в WO 99/51642. Содержание этих патентных публикаций конкретно вводится в настоящее описание посредством ссылки. См. также Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).Polypeptide variants having modified amino acid sequences of the Fc region and having increased or decreased ability to bind to C1q are described in US patent No. 6194551B1 and in WO 99/51642. The contents of these patent publications are specifically incorporated into this description by reference. See also Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Термин «полипептид, содержащий Fc-область» означает полипептид, такой как антитело или иммуноадгезин (определение см. ниже), которые содержат Fc-область. C-концевой лизин (остаток 447 в соответствии с Европейской системой нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, в процессе очистки полипептида или путем рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей данный полипептид. В соответствии с этим композиция, содержащая полипептид, имеющий Fc-область согласно изобретению, может содержать полипептиды с остатком K447; полипептиды, где все K447 были удалены; или смесь полипептидов, содержащих и не содержащих остаток K447.The term “Fc region containing polypeptide” means a polypeptide, such as an antibody or immunoadhesin (as defined below), which contains an Fc region. The C-terminal lysine (residue 447 according to the European Numbering System EU) of the Fc region can be removed, for example, by purification of the polypeptide or by recombinant construction of a nucleic acid encoding the polypeptide. Accordingly, a composition comprising a polypeptide having an Fc region of the invention may comprise polypeptides with a K447 residue; polypeptides where all K447 have been removed; or a mixture of polypeptides containing and not containing residue K447.

“Блокирующее” антитело или “антитело-антагонист” представляет собой антитело, ингибирующее или снижающее биологическую активность антигена, с которым оно связывается. Предпочтительные блокирующие антитела или антитела-антагонисты, в основном, или полностью ингибируют биологическую активность антигена. A “blocking” antibody or “antagonist antibody” is an antibody that inhibits or reduces the biological activity of the antigen with which it binds. Preferred blocking antibodies or antagonist antibodies substantially or completely inhibit the biological activity of the antigen.

Используемый здесь термин “антитело-агонист” означает антитело, которое имитирует по меньшей мере одну из функциональных активностей представляющего интерес полипептида.As used herein, the term “agonist antibody” means an antibody that mimics at least one of the functional activities of a polypeptide of interest.

«Акцептораная человеческая каркасная область», используемая в целях настоящего изобретения, представляет собой каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области VL или VH, происходящей от каркасной области человеческого иммуноглобулина или от консенсусной каркасной области человеческого иммуноглобулина. Акцепторная человеческая каркасная область, «происходящая от» каркасной области человеческого иммуноглобулина или от консенсусной каркасной области человеческого иммуноглобулина, может включать ту же самую аминокислотную последовательность, либо она может содержать аминокислотную последовательность с уже имеющимися модификациями. В случае если аминокислотные модификации уже присутствуют, то предпочтительно, чтобы их число составляло не более чем 5, предпочтительно 4 или менее или 3 или менее. В случае если аминокислотные модификации уже присутствуют в VH, то предпочтительно, чтобы такие модификации присутствовали только в трех, двух или в одном из положений 71H, 73H и 78H; так, например, аминокислотными остатками в таких положениях могут быть 71A, 73T и/или 78A. В одном из вариантов изобретения последовательность акцепторной человеческой каркасной области VL идентична последовательности каркасной области VL человеческого иммуноглобулина или консенсусной последовательности каркасной области человеческого иммуноглобулина. An “acceptor human framework region” used for the purposes of the present invention is a framework region comprising the amino acid sequence of a VL or VH framework region derived from a framework region of a human immunoglobulin or from a consensus framework region of a human immunoglobulin. The human acceptor framework region "originating from" the framework region of the human immunoglobulin or from the consensus framework region of the human immunoglobulin may include the same amino acid sequence, or it may contain an amino acid sequence with existing modifications. If amino acid modifications are already present, then it is preferable that their number be no more than 5, preferably 4 or less or 3 or less. If amino acid modifications are already present in VH, then it is preferable that such modifications are present only in three, two or in one of the positions 71H, 73H and 78H; for example, amino acid residues at such positions may be 71A, 73T and / or 78A. In one embodiment of the invention, the sequence of the acceptor human VL framework region is identical to the sequence of the VL framework region of the human immunoglobulin or the consensus sequence of the human immunoglobulin framework region.

«Консенсусная последовательность человеческой каркасной области» представляет собой каркасную область, которая имеет наиболее часто встречающийся аминокислотный остаток в наборе из каркасных последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина. Вообще говоря, последовательности VL или VH человеческого иммуноглобулина выбирают из подгруппы последовательностей вариабельного домена. Обычно подгруппа таких последовательностей представляет собой подгруппу, описанную Кэбатом и др. В одном из вариантов изобретения подгруппой для VL является подгруппа каппа I, описанная Кэбатом и др. В одном из вариантов изобретения подгруппой для VН является подгруппа III, описанная Кэбатом и др. A “consensus sequence of a human framework region” is a framework region that has the most common amino acid residue in a set of human immunoglobulin VL or VH framework sequences. Generally speaking, human immunoglobulin VL or VH sequences are selected from a subgroup of variable domain sequences. Typically, a subgroup of such sequences is a subgroup described by Kebat et al. In one embodiment of the invention, the subgroup for VL is the Kappa I subgroup described by Kebat and others. In one embodiment of the invention, the subgroup for VH is subgroup III described by Kebat et al.

«Консенсусная последовательность каркасной области VH подгруппы III» включает консенсусную последовательность, происходящую от аминокислотных последовательностей в вариабельной области тяжелой цепи подгруппы III, описанной Кэбатом и др. В одном из вариантов изобретения консенсусная аминокислотная последовательность каркасной области VH подгруппы III содержит по меньшей мере часть или все нижеследующие последовательности: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:44)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:45). "Consensus sequence of the VH framework region of subgroup III" includes a consensus sequence derived from amino acid sequences in the variable region of the heavy chain of subgroup III described by Kebat et al. In one embodiment of the invention, the consensus amino acid sequence of the framework region of VH subgroup III contains at least some or all the following sequences: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 42) -H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 43) -H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 44) -H3-WGG.

«Консенсусная последовательность каркасной области VL подгруппы I» включает консенсусную последовательность, происходящую от аминокислотных последовательностей в вариабельной области легкой цепи каппа подгруппы I, описанной Кэбатом и др. В одном из вариантов изобретения консенсусная аминокислотная последовательность каркасной области VL подгруппы I содержит по меньшей мере часть или все нижеследующие последовательности: A “consensus sequence of the VL subgroup I framework region” includes a consensus sequence derived from amino acid sequences in the variable region of the kappa subgroup I light chain described by Kabat et al. In one embodiment of the invention, the consensus amino acid sequence of the VL subgroup I framework region contains at least a portion or all of the following sequences:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:46)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:48)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:49). DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 46) -L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 47) -L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 48) -L3-FEQQTK

Термин «расстройство» или «заболевание» означает любое состояние, которое восприимчиво к лечению веществом/молекулой или способом согласно изобретению. Такими расстройствами являются хронические и острые расстройства или заболевания, включая патологические состояния, которые создают у данного млекопитающего предрасположенность к рассматриваемому расстройству. Неограничивающими примерами описанных здесь расстройств, подвергаемых лечению, являются злокачественные и доброкачественные опухоли: карцинома, бластома и саркома. The term “disorder” or “disease” means any condition that is susceptible to treatment with a substance / molecule or method of the invention. Such disorders are chronic and acute disorders or diseases, including pathological conditions that create a predisposition to a given disorder in a given mammal. Non-limiting examples of the disorders described herein to be treated are malignant and benign tumors: carcinoma, blastoma, and sarcoma.

Термины “клеточно-пролиферативное расстройство” и “пролиферативное расстройство” означают расстройства, ассоциированные с определенной степенью аномальной пролиферации клеток. В одном из вариантов изобретения указанным клеточно-пролиферативным расстройством является рак.The terms “cell proliferative disorder” and “proliferative disorder” mean disorders associated with a certain degree of abnormal cell proliferation. In one embodiment of the invention, said cell proliferative disorder is cancer.

Используемый здесь термин “опухоль” означает все неопластические клетки, подвергающиеся росту и пролиферации, независимо от того, являются ли они доброкачественными или злокачественными, и все предраковые и раковые клетки и ткани. Используемые здесь термины “рак”, “раковый”, “клеточно-пролиферативное расстройство”, “пролиферативное расстройство” и “опухоль” не являются взаимоисключающими. As used herein, the term “tumor” means all neoplastic cells undergoing growth and proliferation, whether they are benign or malignant, and all precancerous and cancerous cells and tissues. As used herein, the terms “cancer,” “cancerous,” “cell proliferative disorder,” “proliferative disorder,” and “tumor” are not mutually exclusive.

Используемые здесь термины “рак” и “раковый” относятся к физиологическому состоянию млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом/пролиферацией клеток. Примерами раковых заболеваний являются, но не ограничиваются ими, карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз. Более конкретными примерами таких раковых заболеваний являются плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легких, не-мелкоклеточный рак легких, аденокарцинома легких, плоскоклеточная карцинома легких, рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластома, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой и ободочной кишки, карцинома эндометрия или матки, карцинома слюнной железы, рак почек, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома печени, рак желудка, меланома и различные типы рака головы и шеи. Нарушение ангиогенеза может приводить к развитию многих расстройств, которые могут быть подвергнуты лечению композициями и способами согласно изобретению. Такими расстройствами являются не-неопластические и неопластические состояния. Неопластическими расстройствами являются, но не ограничиваются ими, состояния, описанные выше. Не-неопластическими состояниями являются, но не ограничиваются ими, нежелательная или аберрантная гипертрофия, артрит, ревматоидный артрит (РА), псориаз, псориазные бляшки, саркоидоз, атеросклероз, атеросклеротические бляшки, диабетическая и другие пролиферативные ретинопатии, включая ретинопатию недоношенных или ретролентальную фиброплазию, неоваскулярная глаукома, старческая дегенерация желтого пятна, диабетический отек желтого пятна, неоваскуляризация роговицы глаза, неоваскуляризация трансплантата роговицы глаза, отторжение трансплантата роговицы глаза, неоваскуляризация сетчатки/сосудистой оболочки глаза, неоваскуляризация угла глазного яблока (покраснение глаза), неоваскулярное заболевание глаз, рестеноз сосудов, артериовенозные мальформации (АВМ), менингиома, гемангиома, ангиофиброма, гиперплазия щитовидной железы (включая болезнь Грейвса), заболевания, ассоциированные с трансплантацией роговицы глаза и других тканей; хроническое воспаление, воспаление легких, острое поражение легких/респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ), сепсис, первичная легочная гипертензия, злокачественные экссудаты в области легких, отек головного мозга (например, ассоциированный с инсультом/закрытым повреждением/травмой головы), синовит, образование паннуса при РА, оссифицирующий миозит, гипертрофия костей, остеоартрит (ОА), не поддающийся лечению асцит, поликистоз яичника, эндометриоз, заболевания, ассоциированные с секвестрацией жидкости в третьем пространстве (полости полых органов) (панкреатит, туннельный синдром, ожоги, заболевание кишечника), фиброма матки, преждевременные роды, хроническое воспаление, такое как ВЗК (болезнь Крона и язвенный колит), отторжение почечного аллотрансплантата, воспалительное заболевание кишечника, нефротический синдром, нежелательный или аберрантный рост тканевой массы (не-раковых тканей), гемофилическая артропатия, гипертрофированные рубцы, подавление роста волос, синдром Ослера-Вебера, пиогенная гранулема, ретролентальная фиброплазия, склеродермия, трахома, васкулярная адгезия (сращение сосудов), синовит, дерматит, преэклампсия, асциты, выпоты в область перикарда (например, ассоциированные с перикардитом) и плевральные выпоты.The terms “cancer” and “cancerous” as used herein refer to the physiological state of mammals, which is usually characterized by unregulated cell growth / proliferation. Examples of cancers include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia. More specific examples of such cancers are squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma of the lung, abdominal cancer, hepatocellular cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, cancer of the bladder, hepatoma, breast cancer, colon cancer, cancer of the rectum and colon, endometrial or uterine carcinoma, salivary carcinoma, kidney cancer, liver cancer, pre prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver carcinoma, stomach cancer, melanoma and various types of head and neck cancer. Violation of angiogenesis can lead to the development of many disorders that can be treated with the compositions and methods of the invention. Such disorders are non-neoplastic and neoplastic conditions. Neoplastic disorders are, but are not limited to, the conditions described above. Non-neoplastic conditions include, but are not limited to, unwanted or aberrant hypertrophy, arthritis, rheumatoid arthritis (RA), psoriasis, psoriasis plaques, sarcoidosis, atherosclerosis, atherosclerotic plaques, diabetic and other proliferative retinopathy, neuropathic retinopathy, retinopathy and neuropathy glaucoma, senile macular degeneration, diabetic macular edema, corneal neovascularization, corneal neovascularization, corneal rejection corneal graft, neovascularization of the retina / choroid, neovascularization of the angle of the eyeball (redness of the eye), neovascular disease of the eyes, vascular restenosis, arteriovenous malformations (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, thyroid gland hyperplasia, including disease, associated with corneal transplantation of the eye and other tissues; chronic inflammation, pneumonia, acute lung injury / adult respiratory distress syndrome (RDSV), sepsis, primary pulmonary hypertension, malignant exudates in the lung area, cerebral edema (e.g. associated with stroke / closed injury / head injury), synovitis, pannus formation in RA, ossifying myositis, bone hypertrophy, osteoarthritis (OA), untreatable ascites, polycystic ovary, endometriosis, diseases associated with fluid sequestration in the third space (polo hollow organs) (pancreatitis, tunnel syndrome, burns, bowel disease), uterine fibroids, premature birth, chronic inflammation such as IBD (Crohn’s disease and ulcerative colitis), renal allograft rejection, inflammatory bowel disease, nephrotic syndrome, unwanted or aberrant tissue mass (non-cancerous tissue) growth, hemophilic arthropathy, hypertrophic scars, hair growth suppression, Osler-Weber syndrome, pyogenic granuloma, retrolental fibroplasia, scleroderma, trachoma, vask lar adhesion (fusion vessels), synovitis, dermatitis, preeclampsia, ascites, pericardial effusions region (e.g., associated with pericarditis) and pleural effusions.

Используемый здесь термин “лечение” означает клиническое вмешательство в целях изменения природных процессов, происходящих в организме индивидуума и в клетках, подвергаемых лечению, и такое лечение может быть профилактическим, либо оно может быть осуществлено в процессе развития клинической патологии. Желательными эффектами лечения являются предотвращение рецидива или снижение частоты рецидивов, ослабление симптомов, уменьшение любых прямых или опосредованных патологических последствий заболевания, предупреждение метастазов, снижение степени прогрессирования заболевания, ослабление или снижение степени патологического состояния, также ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению используются для замедления развития заболевания или расстройства. As used herein, the term “treatment” means clinical intervention in order to alter the natural processes occurring in the body of an individual and in the cells being treated, and such treatment can be prophylactic, or it can be carried out in the process of developing clinical pathology. The desired effects of treatment are the prevention of relapse or a decrease in the frequency of relapses, the alleviation of symptoms, the reduction of any direct or indirect pathological consequences of the disease, the prevention of metastases, the reduction in the degree of progression of the disease, the weakening or reduction in the degree of the pathological condition, and the remission or improvement in prognosis. In some embodiments of the invention, the antibodies of the invention are used to slow the progression of a disease or disorder.

Термин «индивидуум» означает позвоночное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человек. Термин «млекопитающие» включает, но не ограничивается ими, сельскохозяйственных животных (таких как коровы), животных, участвующих в спортивных состязаниях, домашних питомцев (таких как кошки, собаки и лошади), приматов, мышей и крыс. The term “individual” means a vertebrate, preferably a mammal, most preferably a human. The term “mammals” includes, but is not limited to, farm animals (such as cows), animals participating in sports, pets (such as cats, dogs and horses), primates, mice and rats.

«Млекопитающими», подвергаемыми лечению, являются любые животные, классифицированные как млекопитающие, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, также животных, содержащихся в зоопарках, животных, участвующих в спортивных состязаниях или домашних питомцев, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.п. Предпочтительным млекопитающим является человек.“Mammals” to be treated are any animals classified as mammals, including humans, domestic and farm animals, also animals kept in zoos, animals involved in sports or pets, such as dogs, horses, cats, cows and etc. Preferred mammals are humans.

Термин “эффективное количество” означает количество, которое является эффективным в определенных дозах и в течение определенного периода времени, необходимых для достижения нужного терапевтического или профилактического результата. The term “effective amount” means an amount that is effective at certain doses and for a certain period of time necessary to achieve the desired therapeutic or prophylactic result.

“Терапевтически эффективное количество” вещества/молекулы согласно изобретению, агониста или антагониста может варьироваться в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и масса индивидуума, также способность данного вещества/молекулы, агониста или антагониста вырабатывать нужный ответ у индивидуума. Терапевтически эффективным количеством также является количество, при введении которого терапевтически благоприятные эффекты указанного вещества/молекулы, агониста или антагониста преобладают над любыми их токсическими или побочными эффектами. Термин “профилактически эффективное количество” означает количество, которое является эффективным в определенных дозах и в течение определенного периода времени, необходимых для достижения нужного профилактического результата. Поскольку профилактическую дозу вводят индивидуумам перед началом развития заболевания или на ранней стадии развития заболевания, то обычно, но необязательно, такое профилактически эффективное количество должно быть меньше терапевтически эффективного количества.The “therapeutically effective amount” of a substance / molecule according to the invention, an agonist or antagonist may vary depending on factors such as the pathological condition, age, gender and weight of the individual, as well as the ability of the substance / molecule, agonist or antagonist to produce the desired response in the individual. A therapeutically effective amount is also the amount upon administration of which the therapeutically beneficial effects of said substance / molecule, agonist or antagonist prevail over any toxic or side effects thereof. The term “prophylactically effective amount” means an amount that is effective at certain doses and for a certain period of time necessary to achieve the desired preventive result. Since the prophylactic dose is administered to individuals before the onset of the disease or at an early stage of the development of the disease, usually, but not necessarily, such a prophylactically effective amount should be less than a therapeutically effective amount.

Используемый здесь термин “цитотоксическое средство” означает вещество, ингибирующее или предотвращающее функцию клеток и/или вызывающее деструкцию клеток. Этот термин включает радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², Р³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства, например метотрексат, адриамицин, винкаалкалоиды (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, такие как токсины в виде небольших молекул, или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые средства, описанные ниже. Ниже описаны и другие цитотоксические средства. Противоопухолевое средство вызывает деструкцию опухолевых клеток. As used herein, the term “cytotoxic agent” means a substance that inhibits or prevents the function of cells and / or causes destruction of cells. This term includes radioactive isotopes (e.g. At ²¹¹ , I ¹³¹ , I ¹²⁵ , Y ⁹⁰ , Re ¹⁸⁶ , Re ¹⁸⁸ , Sm ¹⁵³ , Bi ²¹² , P ³² and Lu radioactive isotopes), chemotherapeutic agents, e.g. methotrexate, adriamycin, vinca alkaloids ( vincristine, vinblastine, etoposide), doxorubicin, melphalan, mitomycin C, chlorambucil, daunorubicin or other intercalating agents, enzymes and their fragments, such as nucleolytic enzymes, antibiotics and toxins, such as small molecule toxins, or enzymatically active bacterial toxins, fungal, vegetable or animal origin, including fragments and / or variants thereof, and various antitumor or anticancer agents described below. Other cytotoxic agents are described below. An antitumor agent causes the destruction of tumor cells.

“Химиотерапевтическое средство” представляет собой химическое соединение, используемое для лечения рака. Примерами химиотерапевтических средств являются алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид цитоксан®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (а в частности, буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, маринол®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновая кислота; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (гикамтин®), СРТ-11 (иринотекан, камптозар®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги, такие как адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофилотоксин; подофиллиновая кислота; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, КW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные аналоги горчичного газа, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый аналог горчичного газа; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности, калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин, также неокарзиностатиновый хромофор и родственные хромофоры, такие как хромопротеиновые энедииновые антибиотики), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксирубицин адриамицин® (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренергические средства, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; заменитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидный гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтазин и анзамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамнол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантон; 2-этилгидразид; прокарбиазцин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2”-трихлортриэтиламин; трихотецены (а в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин (элдизин®, филдезин®); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (“Ara-C”); тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел Таксол® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.); не содеражащий кремофора Абраксан^ТМ, сконструированная на основе альбумина композиция из наночастиц паклитаксела (American Pharmaceuticals Partners, Schaumberg, Illinois) и доцетаксел Таксотер® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабин (Гемзар®); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (Велбан®); платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (Онковин®); оксалиплатин; лейковорин; винорелбин (Навелбин®); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДМФО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин (Кселода®); фармацевтически приемлемые соли, оксиды или производные всех вышеуказанных соединений, также комбинации из двух или более вышеуказанных соединений, такие как СНОР, где указанная аббревиатура используется в комбинированной терапии и означает циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизолон, и FOLFOX, где указанная аббревиатура используется в комбинированной терапии и означает оксалиплатин (Элоксатин®), 5-FU и лейкововин. A “chemotherapeutic agent” is a chemical compound used to treat cancer. Examples of chemotherapeutic agents are alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide cytoxan®; alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines, such as benzodopa, carboxwon, meturedopa and uredopa; ethyleneimines and methylamelamines, including altretamine, triethylene melamine, triethylene phosphoramide, triethylene thiophosphoramide and trimethylol melamine; acetogenins (and in particular, bullatacin and bullatacin); delta-9-tetrahydrocannabinol (dronabinol, marinol®); beta lapachone; lapachol; colchicines; betulinic acid; camptothecin (including the synthetic analogue of topotecan (gikamtin®), CPT-11 (irinotecan, camptosar®), acetyl camptothecin, scopolectin, and 9-aminocamptothecin); bryostatin; callistatin; CC-1065 (including its synthetic analogues, such as adoselesin, carzelesin and biselezin); podophyllotoxin; podophyllic acid; teniposide; cryptophycin (in particular, cryptophycin 1 and cryptophycin 8); dolastatin; duocarmycin (including synthetic analogues, KW-2189 and CB1-TM1); eleutherobin; pankratistatin; sarcodiktiin; spongistatin; nitrogen analogues of mustard gas, such as chlorambucil, chlorofazine, holophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembikhine, phenesterol, prednimustine, trophosphamide, uracil analog of mustard gas; nitrosoureas such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine and ranimnustine; antibiotics such as enediin antibiotics (e.g. calicheamicin, in particular calicheamicin gamma II and calicheamicin omega II (see, for example, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. , 33: 183-186 (1994)); dynamin, including dynemycin A; esperamycin, also neocarzinostatin chromophore and related chromophores, such as chromoprotein enediin antibiotics), aclacinomisins, actinomycin, autramycin, azaserin, bleomycin, cactinomycin, carcinomycinin, carcinomycininazin, 5-oxo-L-norleucine, doxirubicin ad iamycin® (including morpholinodoxorubicin, cyanomorpholinodoxorubicin, 2-pyrrolinodoxorubicin and deoxydoxorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycin, ritomicinomycinomycinomycin, pomidicinomycinomycinomycinomycetomyrinomyrinomycinomycinomyrolithrominomyrinomycinomycinomycinomyrolithrominomyrinomycinomycinomyrolithrominomyrinomycinomycinomycinomyrolithinomycinomycinomycinomyrolithinomycinomycinomyrolithinomycinomycinomycinomyrolithinomycinomycinomyrolithinomyrinomycinomycinomycinomyrolithinomyrinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomyrolithinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomyretinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomyr? , tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); folic acid analogues such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimerexate; purine analogues such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; pyrimidine analogs such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, karmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxyfluuridine, enocytabine, phloxuridine; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epithiostanol, mepitiostan, testolactone; antiadrenergic agents such as aminoglutethimide, mitotan, trilostane; a folic acid substitute such as frolinic acid; Aceglaton; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; eniluracil; amsacrine; bestrabucil; bisanthrene; edatraxate; defofamine; demecolcin; diaziquon; elfornithine; elliptinium acetate; epothilone; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidainin; maytansinoids such as maytazine and ansamitocins; mitoguazone; mitoxantrone; mopidamnol; nitraerine; pentostatin; phenamet; pyrarubicin; losoxantone; 2-ethyl hydrazide; procarbiazcin; PSK® polysaccharide complex (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxane; rhizoxin; sisofiran; spiro germanium; tenuazonic acid; triaziquon; 2,2 ', 2 ”trichlorotriethylamine; trichotecenes (and in particular, T-2 toxin, verracurin A, roridin A and anguidin); urethane; vindesine (eldizin®, fildesin®); dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosin; arabinoside (“Ara-C”); thiotepa; taxoids, for example, paclitaxel Taxol® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ); non-cremophoric Abraxan ^TM , albumin-based composition of paclitaxel nanoparticles (American Pharmaceuticals Partners, Schaumberg, Illinois) and docetaxel Taxotere® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); chloranbucil; gemcitabine (Gemzar®); 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; vinblastine (Velban®); platinum; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxantrone; vincristine (Oncovin®); oxaliplatin; leucovorin; vinorelbine (Navelbin®); novantron; edatrexate; daunomycin; aminopterin; ibandronate; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMF); retinoids such as retinoic acid; capecitabine (Xeloda®); pharmaceutically acceptable salts, oxides or derivatives of all of the above compounds, also combinations of two or more of the above compounds, such as CHOP, where the abbreviation is used in combination therapy and means cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisolone, and FOLFOX, where the abbreviation is used in combination therapy and means oxaliplatin (Eloxatin®), 5-FU and leukovin.

В это определение также входят противогормональные средства, регулирующие, снижающие, блокирующие или ингибирующие действие гормонов, которые могут стимулировать рост раковой опухоли, и эти средства часто применяются для системного или общего лечения. Такими средствами могут быть сами гормоны. Примерами таких средств являются антиэстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен Нолвадекс®), ралоксифен Эвиста®, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен Фарестон®; антипрогестероны; ингибиторы рецептора эстрогена (ERD); средства, подавляющие или блокирующие функции яичников, например, агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (LHRH), такие как Лупрон® и ацетат лейпролида Элигард®, ацетат гозерелина, ацетат бузерелина и триптерелин; другие антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; и ингибиторы ароматазы, ингибирующие фермент ароматазу и регулирующие продуцирование эстрогенов в коре надпочечника, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, ацетат мегестрола Мегаза®, экземестан Аромазин®, форместан, фадрозол, ворозол Ривизор®, летрозол Фемара® и анастрозол Аримидекс®. Кроме того, в такое определение химиотерапевтических средств входят бифосфонаты, такие как клодронат (например, Бонефос® или Остак®), этидронат Дидрокал®, NE-58095, золедроновая кислота/золедронат Зомета®, алендронат Фозамакс®, памидронат Аредия®, тилудронат Скелид® или ризедронат Актонел®, также троксацитабин (нуклеозидный аналог 1,3-диоксоланцитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, ингибирующие экспрессию генов пути передачи сигнала, участвующих в нежелательной пролиферации клеток, такие как, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина Тератопа® и вакцины, применяемые в генотерапии, например вакцина Алловектин®, вакцина Лейвектин® и вакцина Ваксид®; ингибитор топоизомеразы 1 Луртотекан®; rmRH Абареликс®; дитозилат лапатиниба (ингибитор тирозинкиназы, состоящий из двух небольших молекул Erb-2 и EGFR, также известный как GW 572016) и фармацевтически приемлемые соли, оксиды или производные всех вышеуказанных соединений. This definition also includes anti-hormonal agents that regulate, reduce, block or inhibit the action of hormones that can stimulate the growth of a cancerous tumor, and these agents are often used for systemic or general treatment. These may include hormones themselves. Examples of such agents are antiestrogens and selective estrogen receptor modulators (SERMs), including, for example, tamoxifen (including tamoxifen Nolvadex®), raloxifene Evista®, droloxifene, 4-hydroxy tamoxifen, trioxifen, keoxifen, LY117018, onapristone toremone; antiprogesterones; estrogen receptor inhibitors (ERD); agents that suppress or block ovarian function, for example, luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) agonists such as Lupron® and Eligard® leuprolide acetate, goserelin acetate, buzerelin acetate and trypterelin; other antiandrogens such as flutamide, nilutamide and bicalutamide; and aromatase inhibitors that inhibit the aromatase enzyme and regulate the production of estrogen in the adrenal cortex, such as, for example, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimide, megestrol acetate Megaz®, exemestane Aromazin®, formestane, fadrozole, Vorozol Rivizor®, letrozole Anastrozole Arimidex®. In addition, this definition of chemotherapeutic agents includes bisphosphonates such as clodronate (e.g. Bonefos® or Ostak®), ethidronate Didrocal®, NE-58095, zoledronic acid / zoledronate Zometa®, alendronate Fozamax®, pamidronate Aredia®, tiludronate Skelid® or risedronate Actonel®, also troxacitabine (nucleoside analogue of 1,3-dioxolancytosine); antisense oligonucleotides, in particular oligonucleotides that inhibit gene expression of signaling pathways involved in unwanted cell proliferation, such as, for example, PKC alpha, Raf, H-Ras and epidermal growth factor receptor (EGF-R); vaccines such as Teratopa® vaccine and vaccines used in gene therapy, for example Allovectin® vaccine, Leivectin® vaccine and Vaxid® vaccine; topoisomerase 1 inhibitor Lurtotecan®; rmRH Abarelix®; lapatinib ditosylate (a tyrosine kinase inhibitor consisting of two small molecules Erb-2 and EGFR, also known as GW 572016) and pharmaceutically acceptable salts, oxides or derivatives of all of the above compounds.

Используемый здесь термин “рост-ингибирующее средство” означает соединение или композицию, ингибирующие рост клеток (таких как клетки, экспрессирующие DLL4), либо in vitro, либо in vivo. Таким образом, средством, ингибирующим рост клеток, может быть средство, значительно снижающее процент клеток (таких как клетки, экспрессирующие DLL4) в фазе S. Примерами средств, ингибирующих рост клеток, являются средства, блокирующие прохождение клеточного цикла (в другой фазе, кроме фазы S), такие как средства, индуцирующие блокирование фазы G1 и фазы М. Классическими средствами, блокирующими фазу М, являются винкаалкалоиды (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Средствами, блокирующими фазу G1, также блокирующими переход в фазу S, являются, например, ДНК-алкилирующие агенты, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительную информацию можно найти в публикации The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn & Israel, eds., Chapter 1, entitled “Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs”, Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), в частности, на стр.13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой противораковые лекарственные средства, получаемые из дерева тис. Доцетаксел (Таксотер®, Rhone-Poulenc Rorer), получаемый из Европейского тиса, представляет собой полусинтетический аналог паклитаксела (Таксола®, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел индуцируют сборку микротрубочек из тубулиновых димеров и стабилизируют микротрубочки путем предупреждения деполимеризации, что приводит к ингибированию митоза клеток. The term “growth inhibitory agent” as used herein means a compound or composition that inhibits cell growth (such as cells expressing DLL4), either in vitro or in vivo . Thus, an agent that inhibits cell growth can be an agent that significantly reduces the percentage of cells (such as cells expressing DLL4) in phase S. Examples of agents that inhibit cell growth are agents that block the cell cycle (in a phase other than phase S), such as phase G1 and phase M blocking agents. Classical phase M blocking agents are vinca alkaloids (vincristine and vinblastine), taxanes and topoisomerase II inhibitors such as doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etop ozide and bleomycin. G1 phase blocking agents that also block S phase transitions are, for example, DNA alkylating agents such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechlorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil and ara-C. Further information can be found in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn & Israel, eds., Chapter 1, entitled “Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs”, Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), in particular, on page 13. Taxanes (paclitaxel and docetaxel) are anticancer drugs derived from the yew tree. Docetaxel (Taxotere®, Rhone-Poulenc Rorer), obtained from European yew, is a semi-synthetic analogue of paclitaxel (Taxola®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel and docetaxel induce the assembly of microtubules from tubulin dimers and stabilize microtubules by preventing depolymerization, which leads to inhibition of cell mitosis.

“Доксорубицин” представляет собой антрациклиновый антибиотик. Доксорубицин имеет полное химическое название (8S-цис)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-α-L-ликсо-гексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион. “Doxorubicin” is an anthracycline antibiotic. Doxorubicin has the full chemical name (8S-cis) -10 - [(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-dioxo-hexapyranosyl) oxy] -7,8,9,10-tetrahydro-6, 8,11-trihydroxy-8- (hydroxyacetyl) -1-methoxy-5,12-naphthacenedione.

Термин “противоопухолевая композиция” означает композицию, которая может быть использована для лечения рака и содержащая по меньшей мере одно активное терапевтическое средство, например «противораковое средство». Примерами терапевтических средств (противораковых средств, также называемых здесь «противоопухолевым средством») являются, но не ограничиваются ими, например, химиотерапевтические средства, рост-ингибирующие средства, цитотоксические средства, средства, используемые в лучевой терапии, антиангиогенные средства, апоптотические средства, антитубулиновые средства, токсины и другие средства для лечения рака, например нейтрализующее анти-VEGF-антитело, антагонист VEGF, анти-HER-2-антитело, анти-CD20-антитело, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR, эрлотиниб, ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с одним или несколькими рецепторами ErbB2, ErbB3, ErbB4 или VEGF, ингибиторы тирозинкиназных рецепторов тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и/или фактор стволовых клеток (SCF) (например, мезилат иматиниба (Gleevec ® Novartis)), TRAIL/Apo2L, и другие биологически активные средства и органические химические соединения и т.п. The term “antitumor composition” means a composition that can be used to treat cancer and containing at least one active therapeutic agent, for example, “anti-cancer agent”. Examples of therapeutic agents (anti-cancer agents, also referred to herein as “anti-tumor agents”) include, but are not limited to, for example, chemotherapeutic agents, growth inhibitory agents, cytotoxic agents, agents used in radiation therapy, anti-angiogenic agents, apoptotic agents, anti-tubulin agents , toxins and other cancer treatments, for example, a neutralizing anti-VEGF antibody, a VEGF antagonist, an anti-HER-2 antibody, an anti-CD20 antibody, an epidermal receptor antagonist growth factor (EGFR) (e.g. tyrosine kinase inhibitor), HER1 / EGFR inhibitor, erlotinib, COX-2 inhibitor (e.g. celecoxib), interferons, cytokines, antagonists (e.g. neutralizing antibodies) that bind to one or more ErbB2 receptors, ErbB3, ErbB4 or VEGF, inhibitors of platelet growth factor tyrosine kinase receptors (PDGF) and / or stem cell factor (SCF) (e.g. imatinib mesylate (Gleevec ® Novartis)), TRAIL / Apo2L, and other biologically active agents and organic chemicals etc.

Используемый в данной заявке термин “пролекарство” означает предшественник или производное фармацевтически активного вещества, которые по сравнению с родительским лекарственным средством являются менее цитотоксичными по отношению к опухолевым клеткам и способны ферментативно активироваться или превращаться в более активную зрелую форму. См., например, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast (1986) и Stella et al. “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). Пролекарствами согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, фосфатсодержащие пролекарства; тиофосфатсодержащие пролекарства; сульфатсодержащие пролекарства; пептидсодержащие пролекарства; лекарственные средства, модифицированные D-аминокислотой; гликозилированные пролекарства; β-лактамсодержащие пролекарства; пролекарства, содержащие необязательно замещенный феноксиацетамид; или пролекарства, содержащие, но необязательно, замещенный фенилацетамид; 5-фторцитозиновые и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активное цитотоксическое свободное лекарственное средство. Примерами цитотоксических лекарственных средств, которые могут быть дериватизированы с получением пролекарственной формы для ее использования в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, химиотерапевтические средства, описанные выше.As used herein, the term “prodrug” means a precursor or derivative of a pharmaceutically active substance that, compared to the parent drug, is less cytotoxic to tumor cells and is capable of enzymatically activating or transforming into a more active mature form. See, for example, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al. “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (Ed.), Pp. 247-267, Humana Press (1985). Prodrugs of the invention include, but are not limited to, phosphate-containing prodrugs; thiophosphate-containing prodrugs; sulfate-containing prodrugs; peptide-containing prodrugs; D-amino acid modified drugs; glycosylated prodrugs; β-lactam-containing prodrugs; prodrugs containing optionally substituted phenoxyacetamide; or prodrugs containing, but not necessarily, substituted phenylacetamide; 5-fluorocytosine and other 5-fluoruridine prodrugs that can be converted into a more active cytotoxic free drug. Examples of cytotoxic drugs that can be derivatized to produce a prodrug form for use in the present invention include, but are not limited to, the chemotherapeutic agents described above.

Термин «антиангиогенное средство» или «ингибитор ангиогенеза» означает вещество с небольшой молекулярной массой, полинуклеотид (включая, например, ингибирующую РНК (РНКи или киРНК)), полипептид, выделенный белок, рекомбинантный белок, антитело или его конъюгаты или гибридные белки, которые прямо или опосредованно ингибируют ангиогенез, васкулогенез или нежелательную проницаемость сосудов. Так, например, антиангиогенным средством является антитело или другой антагонист, направленный против ангиогенного агента, определенные выше, например антитела против VEGF, антитела против рецепторов VEGF, фрагменты растворимых рецепторов VEGF или небольшие молекулы, блокирующие передачу сигнала рецептора VEGF (например, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (малат сунитиниба), AMG706 или молекулы, описанные, например, в Международной патентной заявке WO 2004/113304). Антиангиогенными средствами также являются природные ингибиторы ангиогенеза, например антиостатин, эндостатин и т.п. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (например, таблицу 3, в которой перечислены антиангиогенные средства для лечения злокачественной меланомы); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, таблица 2, в которой перечислены антиангиогенные факторы); и Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (например, таблицу 1, в которой перечислены антиангиогенные средства, используемые в клинических испытаниях).The term “anti-angiogenic agent” or “angiogenesis inhibitor” means a low molecular weight substance, a polynucleotide (including, for example, an inhibitory RNA (RNAi or siRNA)), a polypeptide, an isolated protein, a recombinant protein, an antibody or its conjugates, or fusion proteins that are directly or indirectly inhibit angiogenesis, vasculogenesis, or unwanted vascular permeability. So, for example, an anti-angiogenic agent is an antibody or other antagonist against an angiogenic agent as defined above, for example, anti-VEGF antibodies, antibodies against VEGF receptors, fragments of soluble VEGF receptors or small molecules that block VEGF receptor signaling (e.g. PTK787 / ZK2284, SU6668, SUTENT® / SU11248 (sunitinib malate), AMG706 or the molecules described, for example, in International Patent Application WO 2004/113304). Antiangiogenic agents are also natural angiogenesis inhibitors, for example, anti-statin, endostatin, and the like. See, for example, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene , 22: 3172-3179 (2003) (for example, Table 3, which lists antiangiogenic agents for treating malignant melanoma); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5 (12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene , 22: 6549-6556 (2003) (e.g., Table 2, which lists antiangiogenic factors); and Sato Int. J. Clin. Oncol. , 8: 200-206 (2003) (for example, table 1, which lists antiangiogenic agents used in clinical trials).

Композиции согласно изобретению и способы их полученияCompositions according to the invention and methods for their preparation

Настоящее изобретение относится к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие анти-DLL4-антитело, и к полинуклеотидам, содержащим последовательности, кодирующие анти-DLL4-антитело. Используемые здесь композиции содержат одно или несколько антител, связывающихся с DLL4, и/или один или несколько полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или несколько антител, связывающихся с DLL4. Такие композиции могут также содержать подходящие носители, такие как фармацевтически приемлемые наполнители, включая буферы, хорошо известные специалистам.The present invention relates to compositions, including pharmaceutical compositions containing an anti-DLL4 antibody, and to polynucleotides containing sequences encoding an anti-DLL4 antibody. The compositions used herein comprise one or more antibodies that bind to DLL4 and / or one or more polynucleotides containing sequences encoding one or more antibodies that bind to DLL4. Such compositions may also contain suitable carriers, such as pharmaceutically acceptable excipients, including buffers well known in the art.

Настоящее изобретение также охватывает варианты выделенных антител и полинуклеотидов. Настоящее изобретение также охватывает варианты, в основном, чистых антител и полинуклеотидов. The present invention also encompasses variants of isolated antibodies and polynucleotides. The present invention also encompasses variants of substantially pure antibodies and polynucleotides.

Анти-DLL4-антителами согласно изобретению являются предпочтительно моноклональные антитела. В объем настоящего изобретения также входят Fab, Fab'-, Fab'-SH- и F(ab')₂-фрагменты рассматриваемых здесь анти-DLL4-антител. Указанные фрагменты антител могут быть получены традиционными способами, такими как ферментативный гидролиз, либо они могут быть продуцированы методами рекомбинантных ДНК. Указанные фрагменты антител могут быть химерными или гуманизованными. Эти фрагменты могут быть использованы в диагностических или терапевтических целях, описанных ниже. Anti-DLL4 antibodies of the invention are preferably monoclonal antibodies. Fab, Fab'-, Fab'-SH- and F (ab ') ₂ fragments of the anti-DLL4 antibodies described herein are also within the scope of the present invention. These antibody fragments can be obtained by conventional methods, such as enzymatic hydrolysis, or they can be produced by recombinant DNA methods. These antibody fragments may be chimeric or humanized. These fragments can be used for diagnostic or therapeutic purposes, described below.

Моноклональные антитела получают из популяции, в основном, гомогенных антител, то есть отдельные антитела, входящие в состав такой популяции, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Таким образом, термин «моноклональный» определяет характер антитела, которое не является смесью дискретных антител. Monoclonal antibodies are obtained from a population of mainly homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies that make up such a population are identical, with the exception of possible natural mutations, which may be present in small amounts. Thus, the term "monoclonal" defines the nature of the antibody, which is not a mixture of discrete antibodies.

Моноклональные анти-DLL4-антитела согласно изобретению могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), либо они могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (патент США № 4816567).The monoclonal anti-DLL4 antibodies of the invention can be prepared by the hybridoma method first described by Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), or they can be prepared by recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816,567).

В гибридомном методе мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют для вырабатывания у него лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, используемым для иммунизации. Антитела против DLL4 обычно вырабатываются у животных после многократных подкожных (sc) или внутрибрюшинных (ip) инъекций DLL4 и адъюванта. DLL4 может быть получен хорошо известными методами, некоторые из которых более подробно описаны ниже. Так, например, рекомбинантное продуцирование DLL4 описано ниже. В одном из вариантов изобретения животных иммунизируют производным DLL4, которое содержит внеклеточный домен (ECD) DLL4, присоединенный к Fc-части тяжелой цепи иммуноглобулина. В предпочтительном варианте изобретения животных иммунизуют гибридным белком DLL4-IgG1. Животных обычно иммунизируют монофосфориллипидом A (MPL)/дикриномиколятом трегалозы (TDM) для вырабатывания ответа против иммуногенных конъюгатов или производных DLL4 (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT), и полученный раствор инъецируют чрескожно во множество участков. Через две недели животным вводят ударную дозу. Еще через 7-14 дней у животных берут кровь, и сыворотку анализируют на титры анти-DLL4-антител. Животным вводят ударную дозу до тех пор, пока титр не будет достигать «плато» (то есть постоянного уровня).In the hybridoma method, a mouse or other suitable host animal, such as a hamster, is immunized to produce lymphocytes in it that produce or are capable of producing antibodies that specifically bind to the protein used for immunization. Antibodies against DLL4 are usually produced in animals after repeated subcutaneous (sc) or intraperitoneal (ip) injections of DLL4 and adjuvant. DLL4 can be obtained by well-known methods, some of which are described in more detail below. So, for example, recombinant production of DLL4 is described below. In one embodiment of the invention, animals are immunized with a DLL4 derivative that contains the extracellular domain (ECD) DLL4 attached to the Fc portion of the immunoglobulin heavy chain. In a preferred embodiment, the animals are immunized with a DLL4-IgG1 fusion protein. Animals are usually immunized with monophosphoryl lipid A (MPL) / trehalose dicrinomycolate (TDM) to elicit a response against immunogenic conjugates or DLL4 derivatives (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT), and the resulting solution is injected transdermally into multiple sites. After two weeks, the animals are given a loading dose. After another 7-14 days, the animals were bled and the serum was analyzed for anti-DLL4 antibody titers. The animals are given a loading dose until the titer reaches a "plateau" (that is, a constant level).

Альтернативно лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты подвергают слиянию с миеломными клетками с использованием подходящего агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, в результате чего образуются гибридомные клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro . The lymphocytes are then fused to myeloma cells using a suitable fusion agent such as polyethylene glycol, resulting in hybridoma cells (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice , pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и культивируют в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание не-слитых родительских миеломных клеток. Так, например, если родительские миеломные клетки не содержат фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), то культуральная среда, используемая для получения гибридом, обычно включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), то есть вещества, предупреждающие рост HGPRT-дефицитных клеток.The hybridoma cells thus obtained are seeded and cultured in a suitable culture medium, which preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of non-fused parental myeloma cells. For example, if the parent myeloma cells do not contain the hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase enzyme (HGPRT or HPRT), then the culture medium used to produce the hybridomas usually includes hypoxanthine, aminopterin and thymidine (NAT medium), that is, substances that prevent the growth of HGPRT -deficient cells.

Предпочтительными миеломными клетками являются клетки, которые способны подвергаться эффективному слиянию, поддерживать стабильное продуцирование высоких уровней антител выбранными антитело-продуцирующими клетками и являются чувствительными к среде, такой как среда НАТ. Из этих клеток предпочтительными миеломными клеточными линиями являются мышиные миеломные линии, такие как клеточные линии, происходящие от клеток мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11, имеющихся в институте Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, и клеток SP-2 или Х63-Ag8-653, имеющихся в Американской коллекции типовых культур, Rockville, Maryland USA. Для продуцирования человеческих моноклональных антител также используются человеческие миеломные клеточные линии и гетеромиеломные клеточные линии “мышь - человек” (Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984) & Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Preferred myeloma cells are cells that are able to undergo efficient fusion, maintain stable production of high levels of antibodies by selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium, such as NAT medium. Of these cells, the preferred myeloma cell lines are murine myeloma lines, such as cell lines derived from murine tumor cells MORS-21 and MPC-11, available from the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, and SP- cells. 2 or X63-Ag8-653, available from the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Human myeloma cell lines and mouse-human heteromyeloma cell lines are also used to produce human monoclonal antibodies (Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984) & Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , pp. 51- 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Культуральную среду для роста гибридомных клеток анализируют на продуцирование моноклональных антител против DLL4. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, определяют предпочтительно путем иммунопреципитации или путем проведения in vitro анализа на связывание, такого как радиоиммуноанализ (РИА) или твердофазный иммунноферментный анализ (ELISA).The culture medium for the growth of hybridoma cells is analyzed for the production of monoclonal antibodies against DLL4. The specificity of binding of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is preferably determined by immunoprecipitation or by in vitro binding assays such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Аффинность связывания моноклонального антитела может быть, например, определена с помощью анализа Скэтчарда, описанного Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). The binding affinity of a monoclonal antibody can, for example, be determined using the Scatchard assay described by Munson et al., Anal. Biochem . 107: 220 (1980).

После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела с нужной специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть субклонированы путем проведения процедур лимитирующего разведения и культивированы стандартными методами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящими культуральными средами, предназначенными для достижения данной цели, являются, например, среда D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут быть выращены in vivo в качестве асцитных опухолей у животных. After identifying hybridoma cells that produce antibodies with the desired specificity, affinity, and / or activity, clones can be subcloned by limiting dilution procedures and cultured using standard methods (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice , pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Suitable culture media designed to achieve this goal are, for example, D-MEM or RPMI-1640 medium. In addition, hybridoma cells can be grown in vivo as ascites tumors in animals.

Моноклональные антитела, секретированные субклонами, соответствующим образом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки путем проведения стандартных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, хроматография на белке А-сефарозе, хроматография на гидроксиапатитах, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. Monoclonal antibodies secreted by subclones are appropriately isolated from culture medium, ascites fluid, or serum by standard immunoglobulin purification procedures, such as, for example, protein chromatography on A-Sepharose, chromatography on hydroxyapatites, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography.

Анти-DLL4-антитела согласно изобретению могут быть получены с использованием комбинаторных библиотек для скрининга на клоны синтетических антител с нужной активностью или активностями. В принципе, клоны синтетических антител отбирают путем скрининга фаговых библиотек, содержащих фаг, который представляет различные фрагменты вариабельной области антитела (Fv), присоединенные к белку оболочки фага. Такие фаговые библиотеки подвергают пэннингу с помощью аффинной хроматографии против нужного антигена. Клоны, экспрессирующие Fv-фрагменты, способные связываться с нужным антигеном, подвергают адсорбции на антигене и тем самым их отделению от несвязывающихся клонов в библиотеке. Затем связывающиеся клоны элюируют с антигена, после чего число этих клонов может быть увеличено путем проведения дополнительных циклов адсорбции/элюирования антигена. Любое из анти-DLL4-антител согласно изобретению может быть получено с применением подходящей процедуры скрининга антигена для отбора на представляющий интерес клон фага с последующим конструированием полноразмерного клона анти-DLL4-антитела с использованием последовательностей Fv, происходящих от представляющего интерес клона фага, и подходящих последовательностей константной области (Fc), описанных Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.Anti-DLL4 antibodies according to the invention can be obtained using combinatorial libraries for screening for clones of synthetic antibodies with the desired activity or activities. In principle, clones of synthetic antibodies are selected by screening phage libraries containing a phage that represents various fragments of the antibody variable region (Fv) attached to the phage coat protein. Such phage libraries are subjected to panning by affinity chromatography against the desired antigen. Clones expressing Fv fragments capable of binding to the desired antigen are adsorbed on the antigen and thereby separate them from non-binding clones in the library. Binding clones are then eluted from the antigen, after which the number of these clones can be increased by conducting additional antigen adsorption / elution cycles. Any of the anti-DLL4 antibodies of the invention can be prepared using a suitable antigen screening procedure for selection for a phage clone of interest, and then constructing a full-sized anti-DLL4 antibody clone using Fv sequences derived from the phage clone of interest and suitable sequences constant region (Fc) described by Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

Антигенсвязывающий домен антитела образуется из двух вариабельных (V) областей, состоящих примерно из 110 аминокислот, одна из которых находится в легкой цепи (VL), другая в тяжелой цепи (VH), и в этих вариабельных областях присутствуют три гипервариабельные петли или комплементарность-определяющие области (CDR). Вариабельные домены могут быть функционально представлены на фаге либо как одноцепочечные Fv- (scFv)-фрагменты, в которых VH и VL ковалентно связаны друг с другом посредством короткого гибкого пептида, либо как Fab-фрагменты, в которых каждый их этих вариабельных доменов присоединен к константному домену и подвергается нековалентному взаимодействию, как описано Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Используемые здесь scFv-кодирующие фаговые клоны и Fab-кодирующие фаговые клоны, в целом, называются «фаговыми Fv-клонами» или «Fv-клонами».The antigen binding domain of an antibody is formed from two variable (V) regions of approximately 110 amino acids, one in the light chain (VL), the other in the heavy chain (VH), and three hypervariable loops or complementarity determining in these variable regions region (CDR). Variable domains can be functionally represented on the phage either as single-chain Fv (scFv) fragments in which VH and VL are covalently linked to each other via a short flexible peptide, or as Fab fragments in which each of these variable domains is attached to a constant domain and undergoes non-covalent interaction, as described by Winter et al. Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994). As used herein, scFv-encoding phage clones and Fab-encoding phage clones are generally referred to as “phage Fv clones” or “Fv clones”.

Наборы генов VH и VL могут быть отдельно клонированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и подвергнуты неспецифической рекомбинации в фаговых библиотеках, затем они могут быть проанализированы на антигенсвязывающие клоны, как описано в публикации Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Библиотеки от иммунизованных источников позволяют получить антитела, обладающие высокой аффинностью к иммуногену, и при этом не требуют проведения процедуры конструирования гибридом. Альтернативно может быть клонирован набор человеческих антител дикого типа с получением одного источника человеческих антител против не-аутоантигенов, также аутоантигенов широкого ряда, не прибегая при этом к какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). И наконец, исходные библиотеки могут быть также синтезированы путем клонирования неаранжированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с использованием ПЦР-праймеров, содержащих рандомизированную последовательность, кодирующую в высокой степени вариабельные CDR3-области, в целях достижения реаранжировки in vitro, как описано Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).The VH and VL gene sets can be separately cloned by polymerase chain reaction (PCR) and subjected to non-specific recombination in phage libraries, then they can be analyzed for antigen-binding clones as described in Winter et al. Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994). Libraries from immunized sources make it possible to obtain antibodies with high affinity for the immunogen, and thus do not require the construction of hybridomas. Alternatively, a wild-type human antibody kit can be cloned to produce a single source of human antibodies against non-autoantigens, as well as a wide range of autoantigens, without resorting to any immunization as described by Griffiths et al. EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finally, the source libraries can also be synthesized by cloning unranged segments of the V gene from stem cells and using PCR primers containing a randomized sequence encoding highly variable CDR3 regions in order to achieve in vitro rearrangement as described by Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992).

Для представления фрагментов антител путем их присоединения к минорному оболочечному белку pIII используют нитчатый фаг. Фрагменты антител могут быть представлены в виде одноцепочечных Fv-фрагментов, в которых домены VH и VL присоединены на одной и той же полипептидной цепи посредством гибкого полипептидного спейсера, например, как описано Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), или в виде Fab-фрагментов, в которых одна цепь присоединена к pIII, другая секретируется в периплазму бактериальной клетки хозяина, где происходит сборка структуры оболочечного белка Fab, который отображается на поверхности фага посредством замены некоторых из оболочечных белков дикого типа, например, как описано в публикации Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).Filamentous phage are used to represent antibody fragments by attaching them to the minor envelope protein pIII. Antibody fragments can be represented as single-chain Fv fragments in which the VH and VL domains are joined on the same polypeptide chain through a flexible polypeptide spacer, for example, as described by Marks et al. , J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), or in the form of Fab fragments in which one chain is attached to pIII, the other is secreted into the periplasm of the bacterial host cell, where the structure of the Fab envelope protein is assembled, which is displayed on the surface of the phage by replacement some of the wild-type envelope proteins, for example, as described in Hoogenboom et al. , Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137 (1991).

Обычно нуклеиновые кислоты, содержащие гены, кодирующие фрагменты антител, получают из иммунных клеток, взятых у человека или животных. Если необходимо получить библиотеку, состоящую преимущественно из клонов анти-DLL4-антител, то индивидуума иммунизируют DLL4 для вырабатывания у него гуморального ответа, затем для конструирования библиотеки выделяют клетки селезенки и/или циркулирующие В-клетки, не принадлежащие к популяции лимфоцитов периферической крови (ЛПК). В предпочтительном варианте изобретения библиотеку генов фрагментов человеческого антитела, содержащую преимущественно клоны анти-DLL4-антитела, получают посредством вырабатывания ответа в виде продуцирования анти-DLL4-антител у трансгенных мышей, несущих массив функциональных генов человеческого иммуноглобулина (и не содержащих функциональной системы продуцирования эндогенного антитела), где такая DLL4-иммунизация будет приводить к образованию В-клеток, продуцирующих человеческие антитела против DLL4. Генерирование трансгенных мышей, продуцирующих человеческое антитело, описано ниже. Typically, nucleic acids containing genes encoding antibody fragments are derived from immune cells taken from humans or animals. If it is necessary to obtain a library consisting mainly of clones of anti-DLL4 antibodies, the individual will be immunized with DLL4 to produce a humoral response, then spleen cells and / or circulating B cells that do not belong to the peripheral blood lymphocyte population (LPC) are isolated ) In a preferred embodiment of the invention, a gene library of fragments of a human antibody containing predominantly anti-DLL4 antibody clones is obtained by generating an anti-DLL4 antibody response in transgenic mice carrying an array of functional human immunoglobulin genes (and not containing a functional endogenous antibody producing system ), where such DLL4 immunization will lead to the formation of b cells producing human antibodies against DLL4. The generation of transgenic mice producing a human antibody is described below.

Дополнительное обогащение клеточной популяции реактивными анти-DLL4-антителами может быть достигнуто с помощью подходящей процедуры скрининга для выделения В-клеток, экспрессирующих DLL4-специфическое мембрано-связанное антитело, например путем разделения клеток с помощью DLL4-аффинной хроматографии или адсорбции клеток на DLL4, меченном флуорохромом, и последующего клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS). Additional enrichment of the cell population with reactive anti-DLL4 antibodies can be achieved using a suitable screening procedure to isolate B cells expressing a DLL4-specific membrane-bound antibody, for example, by cell separation using DLL4 affinity chromatography or cell adsorption on DLL4 labeled fluorochrome, and subsequent cell sorting with activation of fluorescence (FACS).

Альтернативно использование клеток селезенки и/или В-клеток или других ЛПК, взятых от неиммунизованного донора, обеспечивает лучшее представление возможного репертуара антител, также позволяет конструировать библиотеку антител у животных любого вида (у человека или у других животных), у которых DLL4 не является антигенным. Для создания библиотек, включающих конструкцию генов антител in vitro, у индивидуума берут стволовые клетки и выделяют нуклеиновые кислоты, кодирующие не-аранжированные сегменты генов антител. Представляющие интерес иммунные клетки могут быть выделены у животных различных видов, таких как человек, мыши, крысы, зайцеобразные, волки, собаки, кошки, свиньи, коровы, лошади, птицы и т.п. Alternatively, the use of spleen cells and / or B cells or other lipoproteins taken from an unimmunized donor provides a better representation of a possible antibody repertoire, and also allows the construction of an antibody library in animals of any kind (humans or other animals) in which DLL4 is not antigenic . To create libraries that include the construction of antibody genes in vitro , stem cells are taken from an individual and nucleic acids that encode un-arranged segments of antibody genes are isolated. Immune cells of interest can be isolated from animals of various species, such as humans, mice, rats, lagomorphs, wolves, dogs, cats, pigs, cows, horses, birds, and the like.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую сегменты генов вариабельных областей антитела (включая VH- и VL-сегменты), выделяют из представляющих интерес клеток и амплифицируют. В случае использования библиотек реаранжированных генов VH и VL нужная ДНК может быть получена путем выделения геномной ДНК или мРНК из лимфоцитов с последующим проведением полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, соответствующих 5'- и 3'-концам реаранжированных генов VH и VL, описанных в публикации Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), и тем самым получения различных наборов V-генов для экспрессии. V-гены могут быть амплифицированы из кДНК и геномной ДНК с использованием обратных праймеров у 5'-конца экзона, кодирующего зрелый V-домен, и прямых праймеров, полученных на основе J-сегмента, как описано в публикациях Orlandi et al. (1989) и Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Однако для амплификации из кДНК обратные праймеры могут быть также получены на основе лидерного экзона, как описано в публикации Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), прямые праймеры могут быть введены в константную область, как описано в публикации Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Для максимизации комплементарности могут быть получены вырожденные праймеры, описанные в публикации Orlandi et al. (1989) или Sastry et al. (1989). Предпочтительно разнообразие библиотек максимизируют с использованием ПЦР-праймеров, нацеленных на каждое семейство V-генов, в целях амплификации всех имеющихся аранжировок VH и VL, присутствующих в образце нуклеиновой кислоты иммунной клетки, например методом, описанным в публикации Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), или методом, описанным в публикации Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Для клонирования амплифицированной ДНК в экспрессионные векторы в ПЦР-праймер могут быть введены редкие рестрикционные сайты в качестве метки у одного конца, как описано Orlandi et al. (1989), либо такое введение может быть осуществлено с помощью ПЦР-амплификации с использованием меченого праймера, как описано Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).Nucleic acid encoding the antibody variable region gene segments (including VH and VL segments) are isolated from the cells of interest and amplified. In the case of using libraries of rearranged VH and VL genes, the desired DNA can be obtained by isolating genomic DNA or mRNA from lymphocytes followed by polymerase chain reaction (PCR) using primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ ends of the rearranged VH and VL genes, described in Orlandi et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), and thereby obtaining various sets of V genes for expression. V genes can be amplified from cDNA and genomic DNA using reverse primers at the 5 ′ end of the exon encoding the mature V domain and direct primers derived from the J segment as described in Orlandi et al. (1989) and Ward et al., Nature , 341: 544-546 (1989). However, for amplification from cDNA, reverse primers can also be obtained based on leader exon, as described in Jones et al. , Biotechnol. 9: 88-89 (1991), direct primers can be introduced into the constant region as described in Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 5728-5732 (1989). To maximize complementarity, degenerate primers can be prepared as described in Orlandi et al. (1989) or Sastry et al. (1989). Preferably, library diversity is maximized using PCR primers targeting each family of V genes in order to amplify all available VH and VL arrangements present in an immune cell nucleic acid sample, for example, by the method described in Marks et al., J. Mol . Biol. 222: 581-597 (1991), or by the method described in Orum et al., Nucleic Acids Res. 21: 4491-4498 (1993). For cloning amplified DNA into expression vectors, rare restriction sites may be introduced into the PCR primer as a label at one end, as described by Orlandi et al. (1989), or such an introduction can be carried out using PCR amplification using labeled primers, as described by Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Наборы синтетически реаранжированных генов V могут быть получены in vitro из V-генных сегментов. Большинство сегментов человеческих генов VH были клонированы и секвенированы (как сообщалось в публикации Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), затем картированы (как сообщалось в публикации Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); и эти клонированные сегменты (включая все основные конформации петли H1 и H2) могут быть использованы для получения различных наборов генов VH с использованием ПЦР-праймеров, кодирующих петли H3, имеющие различные последовательности и различные длины, как описано в публикации Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Могут быть также получены наборы VH, имеющие все разнообразие последовательностей, сосредоточенное в длинной петле H3 одной длины, как описано в публикации Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Были клонированы и секвенированы человеческие сегменты Vκ и Vλ (как сообщалось в публикации Williams & Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) и такие сегменты могут быть использованы для получения синтетических наборов легких цепей. Наборы синтезированных генов V, полученных на основе складчатой структуры ряда VH и VL, и L3 и H3 различной длины, будут кодировать антитела со значительно варьирующейся структурой. После амплификации кодирующей ДНК гена V сегменты гена V зародышевой линии могут быть реаранжированы in vitro методами, описанными в публикации Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).Sets of synthetically rearranged V genes can be obtained in vitro from V gene segments. Most segments of human VH genes were cloned and sequenced (as reported in Tomlinson et al. , J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), then mapped (as reported in Matsuda et al. , Nature Genet ., 3: 88-94 (1993); and these cloned segments (including all major conformations of the H1 and H2 loops) can be used to obtain different sets of VH genes using PCR primers encoding H3 loops having different sequences and different lengths , as described in Hoogenboom and Winter, J. Mol Biol, 227:... 381-388 (1992) may also be prepared by n burs VH, having all the sequence diversity is centered in a long H3 loop of a single length as described in Barbas et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89:...... 4457-4461 (1992) have been cloned and sequenced human segments Vκ and Vλ (as reported in Williams & Winter, Eur. J. Immunol ., 23: 1456-1461 (1993)) and such segments can be used to make synthetic light chain kits. The sets of synthesized V genes obtained on the basis of the folded structure of the VH and VL series, and L3 and H3 of different lengths will encode antibodies with a significantly varying structure. After amplification of the V gene coding DNA, the germline V gene segments can be rearranged in vitro by the methods described in Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

Наборы фрагментов антител могут быть сконструированы путем объединения наборов генов VH и VL несколькими путями. Каждый набор может быть создан в различных векторах, и эти векторы подвергают рекомбинации in vitro, например, как описано в публикации Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), или in vivo путем комбинаторного инфицирования, например, системой loxP, описанной в публикации Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). В методе рекомбинации in vivo используется двухцепочечная природа Fab-фрагментов для устранения ограничения, налагаемого на размер библиотеки и связанного с эффективностью трансформации E. coli. Исходные наборы VH и VL клонируют отдельно: один - в фагмиду, другой - в фаговый вектор. Затем две библиотеки объединяют путем инфицирования бактерии, содержащей фагмиду, фагом, так, чтобы каждая клетка содержала различные комбинации, размер библиотеки был ограничен только числом присутствующих клеток (примерно 10¹² клонов). Оба вектора содержат сигналы рекомбинации in vivo, в результате чего гены VH и VL подвергаются рекомбинации с образованием одного репликона и совместно упаковываются в фаговые вирионы. Эти огромные библиотеки представляют большое число различных антител с высокой аффинностью (K_d ^-1 примерно 10^-8 M).Antibody fragment sets can be constructed by combining the VH and VL gene sets in several ways. Each set can be created in different vectors, and these vectors are subjected to in vitro recombination, for example, as described in the publication of Hogrefe et al. Gene , 128: 119-126 (1993), or in vivo by combinatorial infection, for example, with the loxP system described in Waterhouse et al. , Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993). The in vivo recombination method uses the double-stranded nature of the Fab fragments to remove the restriction on library size and transformation efficiency of E. coli . The original sets of VH and VL are cloned separately: one into the phagemid, the other into the phage vector. Then the two libraries are combined by infection of the bacterium containing the phagemid, phage, so that each cell contains different combinations, the size of the library was limited only by the number of cells present (approximately 10 ¹² clones). Both vectors contain in vivo recombination signals, as a result of which the VH and VL genes undergo recombination to form one replicon and are together packaged in phage virions. These huge libraries represent a large number of different antibodies with high affinity (K _d ^-1 approximately 10 ^-8 M).

Альтернативно такие наборы могут быть последовательно клонированы в один и тот же вектор, например, как описано в публикации Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), либо они могут быть собраны вместе с помощью ПЦР, затем клонированы, например, как описано в публикации Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). ПЦР-сборка может быть также осуществлена для присоединения ДНК VH и VL к ДНК, кодирующей гибкий пептидный спейсер, с образованием наборов одноцепочечных Fv (scFv). В еще одном методе «ПЦР-сборка в клетках» применяется для объединения генов VH и VL в лимфоцитах с помощью ПЦР с последующим клонированием наборов сцепленных генов, как описано в публикации Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).Alternatively, such kits can be sequentially cloned into the same vector, for example, as described in Barbas et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), or they can be assembled using PCR, then cloned, for example, as described in the publication of Clackson et al. , Nature , 352: 624-628 (1991). PCR assembly can also be carried out to attach VH and VL DNA to DNA encoding a flexible peptide spacer to form single chain Fv (scFv) sets. In another method, “PCR assembly in cells” is used to combine VH and VL genes in lymphocytes by PCR followed by cloning of sets of linked genes, as described in Embleton et al. , Nucl. Acids Res. 20: 3831-3837 (1992).

Антитела, продуцируемые исходными библиотеками (природными или синтетическими), могут иметь невысокую аффинность (K_d ^-1 примерно от 10⁶ дo 10⁷ M^-1), однако созревание аффинности может быть также смоделировано in vitro путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек, как описано в публикации Winter et al. (1994), см. выше. Так, например, мутация может быть введена случайно in vitro с использованием полимеразной реакции с вероятностью ошибки (reported in Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) в методе, описанном Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) или методе, описанном Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Кроме того, созревание аффинности может быть осуществлено посредством случайной мутации одной или нескольких CDR, например, с помощью ПЦР, проводимой с использованием праймеров, несущих рандомизированную последовательность, охватывающую представляющую интерес CDR в отдельно выбранных Fv-клонах, и с помощью скрининга клонов с более высокой аффинностью. В заявке WO 9607754 (опубликованной 14 марта 1996 года) описан метод индуцирования мутагенеза в гипервариабельной области легкой цепи иммуноглобулина с получением библиотеки генов легкой цепи. Другим эффективным методом является рекомбинация доменов VH или VL, отобранных с помощью фагового представления, с наборами природных вариантов V-домена, выделенных у неиммунизованных доноров, и скрининг на более высокую аффинность, проводимый в несколько раундов перестановки цепей, как описано в публикации Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Этот метод позволяет продуцировать антитела и фрагменты антител с аффинностями в пределах 10^-9 M.Antibodies produced by the source libraries (natural or synthetic) may have low affinity (K _d ^-1 from about 10 ⁶ to 10 ⁷ M ^-1 ), however, affinity maturation can also be modeled in vitro by constructing and re-selecting from secondary libraries, as described in Winter et al. (1994), see above. For example, a mutation can be introduced accidentally in vitro using a polymerase reaction with a probability of error (reported in Leung et al. , Technique, 1: 11-15 (1989)) in the method described by Hawkins et al. , J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) or the method described by Gram et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 3576-3580 (1992). In addition, affinity maturation can be accomplished by randomly mutating one or more CDRs, for example, by PCR using primers carrying a randomized sequence spanning CDR of interest in selected Fv clones, and by screening for clones with higher affinity. WO 9607754 (published March 14, 1996) describes a method for inducing mutagenesis in the hypervariable region of an immunoglobulin light chain to produce a library of light chain genes. Another effective method is the recombination of VH or VL domains selected by phage representation with sets of natural variants of the V domain isolated from non-immunized donors, and screening for higher affinity carried out in several rounds of chain permutation, as described in Marks et al . Biotechnol. 10: 779-783 (1992). This method allows the production of antibodies and antibody fragments with affinities in the range of 10 ^-9 M.

Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности DLL4 известны специалистам. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая DLL4, может быть сконструирована с использованием аминокислотной последовательности нужной области DLL4. Альтернативно последовательность кДНК (или ее фрагменты) депонирована в GenBank под рег. № NM_019074. DLL4 представляет собой трансмембранный белок. Внеклеточная область содержит 8 EGF-подобных повторов, также домен DSL, который является консервативным для всех лигандов Notch и необходимым для связывания с рецептором. Предсказанный белок также содержит трансмембранную область и цитоплазматический «хвост», не содержащий каких-либо каталитических мотивов. Человеческий белок DLL4 представляет собой белок из 685 аминокислот и содержит следующие области: сигнальный пептид (аминокислоты 1-25); MNNL (аминокислоты 26-92); DSL (аминокислоты 155-217); EGF-подобную область (аминокислоты 221-251); EGF-подобную область (аминокислоты 252-282); EGF-подобную область (аминокислоты 284-322); EGF- подобную область (аминокислоты 324-360); EGF-подобную область (аминокислоты 366-400); EGF-подобную область (аминокислоты 402-438); EGF-подобную область (аминокислоты 440-476); EGF-подобную область (аминокислоты 480-518); трансмембранную область (аминокислоты 529-551); цитоплазматический домен (аминокислоты 552-685). Человеческий DLL4 имеет регистрационный номер NM_019074, мышиный DLL4 имеет регистрационный номер NM_019454.Nucleic acid sequences and amino acid sequences of DLL4 are known to those skilled in the art. The nucleic acid sequence encoding DLL4 can be constructed using the amino acid sequence of the desired region of DLL4. Alternatively, the cDNA sequence (or fragments thereof) is deposited in GenBank under reg. No. NM_019074. DLL4 is a transmembrane protein. The extracellular region contains 8 EGF-like repeats, also the DSL domain, which is conserved for all Notch ligands and necessary for binding to the receptor. The predicted protein also contains a transmembrane region and a cytoplasmic tail, which does not contain any catalytic motifs. The human DLL4 protein is a protein of 685 amino acids and contains the following areas: signal peptide (amino acids 1-25); MNNL (amino acids 26-92); DSL (amino acids 155-217); EGF-like region (amino acids 221-251); EGF-like region (amino acids 252-282); EGF-like region (amino acids 284-322); EGF-like region (amino acids 324-360); EGF-like region (amino acids 366-400); EGF-like region (amino acids 402-438); EGF-like region (amino acids 440-476); EGF-like region (amino acids 480-518); transmembrane region (amino acids 529-551); cytoplasmic domain (amino acids 552-685). Human DLL4 has registration number NM_019074, mouse DLL4 has registration number NM_019454.

ДНК, кодирующие DLL4, могут быть получены различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничивается ими, химический синтез, проводимый любыми методами, описанными в публикации Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989), такими как методы с использованием триэфира, фосфита, фосфорамидита и Н-фосфоната. В одном из вариантов изобретения для конструирования DLL4-кодирующей ДНК используют кодоны, являющиеся предпочтительными при экспрессии в клетках-хозяевах. Альтернативно ДНК, кодирующая DLL4, может быть выделена из геномной библиотеки или библиотеки кДНК. DNAs encoding DLL4 can be obtained by various methods known to those skilled in the art. Such methods include, but are not limited to, chemical synthesis carried out by any of the methods described in Engels et al. , Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 28: 716-734 (1989), such as methods using triester, phosphite, phosphoramidite and H-phosphonate. In one embodiment of the invention, codons that are preferred for expression in host cells are used to construct the DLL4 coding DNA. Alternatively, DNA encoding DLL4 may be isolated from a genomic library or cDNA library.

После конструирования молекулы ДНК, кодирующей DLL4, эту молекулу ДНК функционально присоединяют к последовательности регуляции экспрессии в экспрессионном векторе, таком как плазмида, где указанная регуляторная последовательность распознается клеткой-хозяином, трансформированной данным вектором. В общих чертах, плазмидные векторы содержат последовательности репликации и регуляторные последовательности, происходящие от видов, совместимых с клеткой-хозяином. Такой вектор обычно содержит сайт репликации, также последовательности, кодирующие белки, позволяющие осуществлять фенотипический отбор в трансформированных клетках. Подходящие векторы для экспрессии в прокариотических и в эукариотических клетках-хозяевах известны специалистам, и некоторые из них более подробно описаны ниже. При этом могут быть использованы эукариотические организмы, такие как дрожжи, или клетки, происходящие от многоклеточных организмов, таких как млекопитающие. After constructing the DNA molecule encoding DLL4, this DNA molecule is functionally attached to the expression control sequence in an expression vector, such as a plasmid, where the regulatory sequence is recognized by a host cell transformed by this vector. In general terms, plasmid vectors contain replication sequences and regulatory sequences derived from species compatible with the host cell. Such a vector typically contains a replication site, as well as sequences encoding proteins that allow phenotypic selection in transformed cells. Suitable vectors for expression in prokaryotic and eukaryotic host cells are known in the art, and some of them are described in more detail below. In this case, eukaryotic organisms such as yeast or cells derived from multicellular organisms such as mammals can be used.

ДНК, кодирующая DLL4, может быть, но необязательно, функционально присоединена к секреторной лидерной последовательности, что может приводить к секреции продукта экспрессии клеткой-хозяином в культуральной среде. Примерами секреторных лидерных последовательностей являются stII, экотин, lamB, ГД (глутамат-дегидрогеназа) вируса герпеса, lpp, щелочная фосфотаза, инвертаза и альфа-фактор. В настоящем изобретении может быть также использована лидерная последовательность белка А, состоящая из 36 аминокислот (Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985)).DNA encoding DLL4 may optionally be operably linked to a secretory leader sequence, which may result in secretion of the expression product by the host cell in the culture medium. Examples of secretory leader sequences are stII, ecotin, lamB, HD (glutamate dehydrogenase) of the herpes virus, lpp, alkaline phosphatase, invertase and alpha factor. The leader sequence of protein A consisting of 36 amino acids can also be used in the present invention (Abrahmsen et al. , EMBO J. , 4: 3901 (1985)).

Клетки-хозяева трансфецируют, предпочтительно трансформируют вышеописанными экспрессионными или клонирующими векторами согласно изобретению и культивируют в подходящих питательных средах, модифицированных, если это необходимо, для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности. Host cells are transfected, preferably transformed with the above expression or cloning vectors according to the invention and cultured in suitable culture media, modified, if necessary, to induce promoters, select transformants or amplify genes encoding the desired sequences.

Термин «трансфекция» означает поглощение экспрессионного вектора клеткой-хозяином независимо от того, экспрессирует ли она какие-либо кодирующие последовательности или нет. Различные методы трансфекции известны среднему специалисту в данной области, и такими методами являются, например, CaPO₄-преципитация и электропорация. Успешную трансфекцию обычно определяют по любому признаку, указывающему на присутствие указанного вектора в клетке-хозяине. Методы трансфекции хорошо известны специалистам, и некоторые из них более подробно описаны в настоящей заявке. The term "transfection" means the absorption of the expression vector by the host cell, regardless of whether it expresses any coding sequences or not. Various transfection methods are known to those of ordinary skill in the art, and such methods are, for example, CaPO ₄ precipitation and electroporation. Successful transfection is usually determined by any sign indicating the presence of the indicated vector in the host cell. Transfection methods are well known in the art, and some of them are described in more detail in this application.

Термин «трансформация» означает введение ДНК в организм так, чтобы она могла реплицироваться как внехромосомный элемент или как хромосомный компонент. В зависимости от используемой клетки-хозяина трансформацию осуществляют с применением стандартных методов, подходящих для таких клеток. Методы трансформации хорошо известны специалистам и некоторые из них более подробно описаны в настоящей заявке. The term "transformation" means the introduction of DNA into the body so that it can replicate as an extrachromosomal element or as a chromosomal component. Depending on the host cell used, the transformation is carried out using standard methods suitable for such cells. Methods of transformation are well known to those skilled in the art and some of them are described in more detail in this application.

Прокариотические клетки-хозяева, используемые для продуцирования DLL4, могут быть культивированы, в основном, как описано в руководстве Sambrook et al., см. выше.Prokaryotic host cells used to produce DLL4 can be cultured mainly as described in Sambrook et al. , see above.

Клетки-хозяева млекопитающих, используемые для продуцирования DLL4, могут быть культивированы в различных средах, которые хорошо известны специалистам, и некоторые из которых описаны в настоящей заявке. Mammalian host cells used to produce DLL4 can be cultured in various media that are well known in the art, and some of which are described in this application.

Клетки-хозяева, описанные в настоящей заявке, включают клетки в культуре in vitro, также клетки животного-хозяина. The host cells described in this application include cells in an in vitro culture, also cells of an animal host.

Очистка DLL4 может быть осуществлена хорошо известными методами, некоторые из которых описаны в настоящей заявке. The cleaning of DLL4 can be accomplished by well-known methods, some of which are described in this application.

Очищенные DLL4 могут быть связаны с соответствующей матрицей, такой как сферы с агарозным гелем, акриламидные сферы, стеклянные шарики, целлюлоза, различные акриловые сополимеры, гидроксилметакрилатные гели, сополимеры полиакриловой и полиметакриловой кислоты, найлон, нейтральные и ионные носители и т.п., в целях их использования в аффинной хроматографии для разделения клонов, представленных на фагах. Присоединение белка DLL4 к матрице может быть осуществлено любыми методами, описанными в Methods in Enzymology, vol. 44 (1976). Методы, обычно применяемые для присоединения лигандов белков к полисахаридным матрицам, например агарозе, декстрану или целлюлозе, включают активацию носителя циангалогенидами и последующее связывание первичных алифатических или ароматических аминов пептидных лигандов с активированной матрицей.Purified DLL4 can be bound to an appropriate matrix, such as agarose gel spheres, acrylamide spheres, glass beads, cellulose, various acrylic copolymers, hydroxyl methacrylate gels, polyacrylic and polymethacrylic acid copolymers, nylon, neutral and ionic carriers, etc., in their use in affinity chromatography for the separation of clones represented on phages. Attachment of the DLL4 protein to the matrix can be accomplished by any of the methods described in Methods in Enzymology , vol. 44 (1976). Methods commonly used to attach protein ligands to polysaccharide matrices, such as agarose, dextran, or cellulose, include activating the carrier with cyanogen halides and then binding the primary aliphatic or aromatic amines of the peptide ligands to the activated matrix.

Альтернативно DLL4 может быть использован для покрытия лунок адсорбционных планшетов и экспрессирован на клетках-хозяевах, прикрепленных к адсрорбционным планшетам, либо он может быть использован в клеточном сортинге или конъюгирован с биотином для связывания со сферами, покрытыми стрептавидином, либо он может быть использован в любом другом известном методе для пэннинга библиотек фагового представления. Alternatively, DLL4 can be used to coat the wells of adsorption plates and expressed on host cells attached to adsorption plates, or it can be used in cell sorting or conjugated with biotin to bind to streptavidin coated spheres, or it can be used in any other a well-known method for panning phage view libraries.

Образцы фаговых библиотек подвергают контактированию с иммобилизованным DLL4 в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере части фаговых частиц с адсорбентом. Обычно для имитации физиологических условий выбирают соответствующие рН, ионную силу, температуру и т.п. Фаги, связанные с твердой фазой, промывают, затем элюируют кислотой, например, как описано в публикации Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), или щелочью, например, как описано в публикации Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), или путем конкурентного связывания с антигеном DLL4, например, в соответствии с процедурой, аналогичной процедуре, осуществляемой в методе конкурентного связывания с антигеном, как описано в публикации Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Фаги могут быть подвергнуты 20-1000-кратному обогащению в одном раунде отбора. Кроме того, обогащенные фаги могут быть выращены в бактериальной культуре и подвергнуты дополнительным раундам отбора. Samples of phage libraries are contacted with immobilized DLL4 under conditions suitable for binding at least a portion of the phage particles to an adsorbent. Typically, appropriate pH, ionic strength, temperature, and the like are chosen to simulate physiological conditions. The phages associated with the solid phase are washed, then eluted with acid, for example, as described in Barbas et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA , 88: 7978-7982 (1991), or alkali, for example, as described in Marks et al. , J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), or by competitive binding to the DLL4 antigen, for example, in accordance with a procedure similar to that performed in the competitive antigen binding method, as described in Clackson et al. , Nature , 352: 624-628 (1991). Phages can be subjected to 20-1000-fold enrichment in one round of selection. In addition, enriched phages can be grown in bacterial culture and subjected to additional rounds of selection.

Эффективность отбора зависит от многих факторов, включая кинетику диссоциации во время промывки, и от способности множества фрагментов антитела одновременно связываться с антигеном на одном фаге. Антитела с быстрой кинетикой диссоциации (и слабой аффинностью связывания) могут быть фиксированы благодаря кратковременным промывкам, применению мультивалентного фагового представления и высокой плотности покрытия антигена на твердой фазе. Такая высокая плотность не только позволяет стабилизировать фаг благодаря мультивалентным взаимодействиям, но также благоприятствует повторному связывания фага, который является диссоциированным. Отбор антител со слабой кинетикой диссоциацией (и с высокой аффинностью связывания) может быть улучшен благодаря более длительным промывкам и применению моновалентного фагового представления, описанного в публикации Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) и в WO 92/09690, также благодаря низкой плотности покрытия антигена, как описано в публикации Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).The effectiveness of the selection depends on many factors, including the kinetics of dissociation during washing, and on the ability of multiple antibody fragments to simultaneously bind to the antigen on the same phage. Antibodies with fast dissociation kinetics (and weak binding affinity) can be fixed due to short-term washes, the use of multivalent phage representation and high density coating of antigen on the solid phase. Such a high density not only stabilizes the phage due to multivalent interactions, but also favors the re-binding of the phage, which is dissociated. The selection of antibodies with weak dissociation kinetics (and with high binding affinity) can be improved through longer washes and the use of the monovalent phage representation described in Bass et al. , Proteins , 8: 309-314 (1990) and in WO 92/09690, also due to the low density of antigen coating, as described in Marks et al. Biotechnol. 10: 779-783 (1992).

Может быть проведен отбор между фаговыми антителами с различными аффинностями, даже с немного отличающейся аффинностью по отношению к DLL4. Однако случайная мутация выбранного антитела (например, внесенная при осуществлении некоторых из описанных выше методов созревания аффинности), вероятно, будет приводить к образованию множества мутантов, большинство из которых будут связываться с антигеном, некоторые из них с еще большей аффинностью. При ограниченном уровне DLL4 редкий фаг с высокой аффинностью может выдержать такую конкуренцию. Для сохранения всех мутантов с более высокой аффинностью фаги могут быть инкубированы с избытком биотинилированного DLL4, но этот биотинилированный DLL4 должен иметь более низкую молярную концентрацию, чем молярная константа аффинности мишени для DLL4. Затем фаги с высокой аффинностью связывания могут быть захвачены парамагнитными сферами, покрытыми стрептавидином. Такой «равновесный захват» дает возможность проводить отбор антител по их аффинности связывания с чувствительностью, которая позволяет из большого избытка фагов с меньшей аффинностью выделить мутантные клоны, имеющие лишь в два раза более высокую аффинность. Условия, используемые для промывки фагов, связанных с твердой фазой, могут быть также изменены для выявления их отличий исходя из кинетики диссоциации. Selection can be made between phage antibodies with different affinities, even with a slightly different affinity for DLL4. However, a random mutation of a selected antibody (for example, introduced during the implementation of some of the methods for affinity maturation described above) is likely to lead to the formation of many mutants, most of which will bind to the antigen, some of them with even greater affinity. With a limited level of DLL4, a rare phage with high affinity can withstand this competition. To preserve all mutants with higher affinity, phages can be incubated with an excess of biotinylated DLL4, but this biotinylated DLL4 must have a lower molar concentration than the molar target affinity constant for DLL4. Then, phages with high binding affinity can be captured by paramagnetic spheres coated with streptavidin. Such an “equilibrium capture” makes it possible to select antibodies according to their binding affinity with sensitivity, which allows mutant clones with only twice as high affinity to be isolated from a large excess of phages with lower affinity. The conditions used for washing the phages associated with the solid phase can also be changed to reveal their differences based on the kinetics of dissociation.

Клоны анти-DLL4-антител могут быть отобраны по их активности. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к анти-DLL4-антителам, которые блокируют связывание рецептора Notch (такого как Notch1, Notch2, Notch3 и/или Notch4) с DLL4, но не блокируют связывание рецептора Notch со вторым белком. Fv-клоны, соответствующие таким анти-DLL4-антителам, могут быть отобраны путем: (1) выделения клонов анти-DLL4-антител из фаговой библиотеки как описано выше, и, но необязательно, амплификации выделенной популяции фаговых клонов путем культивирования такой популяции в подходящем бактериальном хозяине; (2) выбора DLL4 и второго белка, против которого необходимо продуцировать блокирующую и не-блокирующую активность соответственно; (3) адсорбции фаговых клонов анти-DLL4-антител на иммобилизованном DLL4; (4) использования избытка второго белка для элюирования любых нежелательных клонов, распознающих DLL4-связывающиеся детерминанты, которые перекрываются со связывающими детерминантами второго белка или имеют общие с ним связывающие детерминанты; и (5) элюирования клонов, которые остаются адсорбированными после проведения стадии (4). Клоны с нужными блокирующими/неблокирующими свойствами могут быть также, но необязательно, обогащены путем проведения одной или нескольких повторных процедур отбора, описанных в настоящей заявке. Clones of anti-DLL4 antibodies can be selected for their activity. In one embodiment, the present invention provides anti-DLL4 antibodies that block the binding of a Notch receptor (such as Notch1, Notch2, Notch3 and / or Notch4) to DLL4, but do not block the binding of a Notch receptor to a second protein. Fv clones corresponding to such anti-DLL4 antibodies can be selected by: (1) isolating the anti-DLL4 antibody clones from the phage library as described above, and, optionally, amplifying the isolated phage clone population by culturing such a population in a suitable a bacterial host; (2) selecting DLL4 and the second protein against which it is necessary to produce blocking and non-blocking activity, respectively; (3) adsorption of phage clones of anti-DLL4 antibodies on immobilized DLL4; (4) using an excess of the second protein to elute any unwanted clones that recognize DLL4-binding determinants that overlap with the binding determinants of the second protein or share binding determinants with it; and (5) eluting clones that remain adsorbed after stage (4). Clones with the desired blocking / non-blocking properties may also be, but not necessarily, enriched by one or more of the repeated selection procedures described in this application.

ДНК, кодирующая продуцируемые гибридомой моноклональные антитела или Fv-клоны фагового представления согласно изобретению, могут быть легко выделены и секвенированы в соответствии со стандартными процедурами (например, с использованием олигонуклеотидных праймеров, которые способны специфически амплифицировать представляющие интерес кодирующие области тяжелой и легкой цепей из гибридомы или фаговой ДНК-матрицы). После выделения эта ДНК может быть встроена в экспрессионные векторы, которые затем трансфецируют в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, обезьяньи клетки СОS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, которые в иных случаях не продуцируют белок иммуноглобулина, в результате чего в этих рекомбинантных клетках-хозяевах синтезируются нужные моноклональные антитела. Обсуждение рекомбинантной экспрессии антитело-кодирующей ДНК в бактериях можно найти в обзорных статьях Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992). DNA encoding the hybridoma-produced monoclonal antibodies or Fv clones of the phage representation of the invention can be easily isolated and sequenced according to standard procedures (for example, using oligonucleotide primers that are able to specifically amplify the coding regions of the heavy and light chains of interest from the hybridoma or phage DNA template). After isolation, this DNA can be inserted into expression vectors, which are then transfected into host cells, such as E. coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells or myeloma cells, which otherwise do not produce immunoglobulin protein, as a result, the desired monoclonal antibodies are synthesized in these recombinant host cells. A discussion of recombinant expression of antibody-coding DNA in bacteria can be found in the review articles by Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).

ДНК, кодирующая Fv-клоны согласно изобретению, может быть объединена с известными последовательностями ДНК, кодирующими константные области тяжелой цепи и/или легкой цепи (например, соответствующие последовательности ДНК могут быть получены, как описано в публикации Kabat et al., см. выше) с образованием клонов, кодирующих полноразмерные тяжелые и/или легкие цепи или их фрагменты. Следует отметить, что в этих целях могут быть использованы константные области любого изотипа, включая константные области IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, и такие константные области могут быть получены от человека или животных любых видов. В определение используемого здесь термина «химерное» и «гибридное» антитело входит Fv-клон, происходящий от ДНК вариабельного домена животного одного вида (например, человека), который был затем присоединен к ДНК константной области животного другого вида с образованием кодирующей(их) последовательности(ей) «гибрида» полноразмерной тяжелой цепи и/или легкой цепи. В предпочтительном варианте изобретения Fv-клон, происходящий от ДНК человеческого вариабельного домена, присоединяют к ДНК человеческой константной области с образованием кодирующей(их) последовательности(ей) для всех человеческих полноразмерных тяжелых и/или легких цепей и/или их фрагментов. DNA encoding the Fv clones of the invention can be combined with known DNA sequences encoding constant regions of the heavy chain and / or light chain (for example, the corresponding DNA sequences can be obtained as described in Kabat et al. , See above) with the formation of clones encoding full-sized heavy and / or light chains or fragments thereof. It should be noted that for this purpose, constant regions of any isotype can be used, including constant regions of IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, and such constant regions can be obtained from humans or animals of any species. The definition of the term “chimeric” and “hybrid” antibody as used herein includes an Fv clone derived from the DNA of the variable domain of an animal of one species (eg, human), which was then attached to the DNA of a constant region of an animal of another species to form the coding sequence (s) (s) a “hybrid” of a full-sized heavy chain and / or light chain. In a preferred embodiment of the invention, an Fv clone derived from human variable domain DNA is coupled to the human constant region DNA to form the coding sequence (s) for all human full-sized heavy and / or light chains and / or fragments thereof.

ДНК, кодирующая анти-DLL4-антитело, происходящее от гибридомы согласно изобретению, может быть также модифицирована, например, путем замены гомологичных мышиных последовательностей, происходящих от гибридомного клона, кодирующей последовательностью для человеческих константных доменов тяжелой и легкой цепи (например, как в способе, описанном Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). ДНК, кодирующая антитело, происходящее от гибридомы или Fv-клона, или его фрагмент, может быть также модифицирована путем ковалентного связывания иммуноглобулин-кодирующей последовательности с полноразмерной последовательностью, кодирующей не-иммуноглобулиновый полипептид, или с ее частью. Таким образом могут быть получены «химерные» или «гибридные» антитела, обладающие специфичностью связывания с антителами, происходящими от Fv-клона или гибридомного клона. DNA encoding an anti-DLL4 antibody derived from a hybridoma according to the invention can also be modified, for example, by replacing homologous mouse sequences derived from a hybridoma clone with a coding sequence for human constant domains of the heavy and light chains (for example, as in the method described by Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81: 6851-6855 (1984)). DNA encoding an antibody derived from a hybridoma or Fv clone, or a fragment thereof, can also be modified by covalently linking an immunoglobulin coding sequence to a full-length sequence encoding a non-immunoglobulin polypeptide, or a part thereof. In this way, “chimeric” or “hybrid” antibodies can be obtained having binding specificities for antibodies derived from an Fv clone or hybridoma clone.

Фрагменты антителAntibody Fragments

Настоящее изобретение охватывает фрагменты антител. В некоторых случаях предпочтительней использовать фрагменты антител, не полноразмерные антитела. Чем меньше размер фрагментов, тем быстрее их клиренс и выше вероятность улучшения доставки в солидные опухоли. The present invention encompasses antibody fragments. In some cases, it is preferable to use fragments of antibodies, not full-sized antibodies. The smaller the size of the fragments, the faster their clearance and the higher the likelihood of improved delivery to solid tumors.

Для получения фрагментов антител были разработаны различные методы. Традиционно эти фрагменты образуются в результате протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты могут продуцироваться непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител могут экспрессироваться в клетках E.coli и секретироваться из этих клеток, что облегчает продуцирование этих фрагментов в больших количествах. Фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно выделены из E.coli и химически связаны с образованием F(ab')₂-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом F(ab')₂-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантной клетки-хозяина. Fab- и F(ab')₂-фрагменты с увеличенным временем полужизни in vivo, содержащие остатки эпитопа, связывающегося с рецептором «спасения», описаны в патенте США № 5869046. Специалистам известны и другие способы получения фрагментов антител. В других вариантах изобретения, выбранным антителом является одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185, патенты США №№ 5571894 и 5587458. Fv и sFv принадлежат только к тем видам, которые содержат интактные комбинированные сайты, лишенные константных областей, поэтому они могут быть подходящими для снижения уровней неспецифического связывания при их использовании in vivo. Гибридные scFv-белки могут быть сконструированы с получением гибрида эффекторного белка у амино- или карбокси-конца scFv. См. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, см. выше. Фрагментом антитела может быть также “линейное антитело”, например антитело, описанное в патенте США № 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими. Various methods have been developed to obtain antibody fragments. Traditionally, these fragments are formed by proteolytic cleavage of intact antibodies (see, for example, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science , 229: 81 (1985)) . However, these fragments can be produced directly by recombinant host cells. Fab, Fv, and scFv fragments of antibodies can be expressed in and secreted from E. coli cells, which facilitates the production of these fragments in large quantities. Antibody fragments can be isolated from the phage antibody libraries discussed above. Alternatively, Fab'-SH fragments can be directly isolated from E. coli and chemically coupled to form F (ab ') ₂ fragments (Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992)). According to another approach, F (ab ′) ₂ fragments can be isolated directly from a culture of a recombinant host cell. Fab and F (ab ') ₂ fragments with an increased in vivo half-life containing residues of an epitope that binds to the rescue receptor are described in US Pat. No. 5,869,046. Other methods for preparing antibody fragments are known to those skilled in the art. In other embodiments, the selected antibody is a single chain Fv fragment (scFv). See WO 93/16185, US Pat. Nos. 5,571,894 and 5,587,458. Fv and sFv belong only to species that contain intact combination sites lacking constant regions, and therefore may be suitable to reduce levels of nonspecific binding when used in vivo . Hybrid scFv proteins can be designed to produce an effector protein hybrid at the amino or carboxy terminus of scFv. See Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, see above. An antibody fragment may also be a “linear antibody,” for example, the antibody described in US Pat. No. 5,641,870. Such linear antibody fragments may be monospecific or bispecific.

Гуманизованные антителаHumanized Antibodies

Настоящее изобретение охватывает гуманизованные антитела. Специалистам известны различные методы гуманизации не-человеческих антител. Так, например, гуманизованное антитело может иметь один или несколько введенных в него аминокислотных остатков, происходящих от источника, не являющегося человеком. Эти не-человеческие аминокислотные остатки часто называют “импортными” остатками, которые обычно берут из “импортного” вариабельного домена. Гуманизация может быть осуществлена, в основном, методом Винтера (Winter) и сотрудниками (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), путем замены последовательностей гипервариабельной области соответствующими последовательностями человеческого антитела. В соответствии с этим такие “гуманизованные” антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4816567), в которых, в основном, меньшая часть по сравнению с вариабельным доменом интактного человеческого антитела заменена соответствующей последовательностью, происходящей от не-человеческого антитела. Фактически гуманизованные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и, возможно, некоторые остатки каркасной области (FR) заменены остатками, происходящими от аналогичных участков антител грызунов.The present invention encompasses humanized antibodies. Various methods of humanizing non-human antibodies are known to those skilled in the art. Thus, for example, a humanized antibody may have one or more amino acid residues introduced into it, originating from a non-human source. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are usually taken from the “import” variable domain. Humanization can be carried out mainly by the method of Winter (Winter) and collaborators (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988 ) Science 239: 1534-1536), by replacing the sequences of the hypervariable region with the corresponding sequences of a human antibody. Accordingly, such “humanized” antibodies are chimeric antibodies (US Pat. No. 4,816,567), in which a substantially smaller portion than the variable domain of an intact human antibody is replaced by a corresponding sequence derived from a non-human antibody. In fact, humanized antibodies are typically human antibodies in which some residues of the hypervariable region and, possibly, some residues of the framework region (FR) are replaced by residues derived from similar regions of rodent antibodies.

Для снижения антигенности при создании гуманизованных антител очень важно выбрать вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепи человеческого антитела. В соответствии с так называемым методом подгонки последовательность вариабельного домена антитела грызуна скринируют по всей библиотеке известных последовательностей вариабельных доменов человеческого антитела. Затем человеческую последовательность, которая является наиболее схожей с последовательностью грызунов, берут в качестве человеческой каркасной области для создания гуманизованного антитела (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987), J. Mol. Biol. 196:901). В другом методе используют конкретную каркасную область, происходящую от консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Та же самая каркасная область может быть использована для нескольких различных гуманизованных антител (Carter et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285; Presta et al. (1993), J. Immunol, 151:2623). To reduce antigenicity when creating humanized antibodies, it is very important to choose the variable domains of both the light and heavy chains of a human antibody. In accordance with the so-called fitting method, the sequence of the variable domain of a rodent antibody is screened throughout the library of known variable domain sequences of a human antibody. The human sequence, which is most similar to the rodent sequence, is then taken as the human framework region for creating a humanized antibody (Sims et al. (1993) J. Immunol . 151: 2296; Chothia et al. (1987), J. Mol. Biol . 196: 901). Another method uses a specific framework region, derived from the consensus sequence of all human antibodies of a particular subgroup of light or heavy chains. The same framework region can be used for several different humanized antibodies (Carter et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci ., USA, 89: 4285; Presta et al. (1993), J. Immunol , 151 : 2623).

Важно также то, что антитела могут быть гуманизованы с сохранением высокой аффинности по отношению к данному антигену и других благоприятных биологических свойств. В соответствии с одним из методов, для достижения этой цели гуманизованные антитела могут быть получены путем анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизованных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизованных последовательностей. Трехмерные иммуноглобулиновые модели являются общедоступными и хорошо известны специалистам. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и представляют вероятные трехмерные конформационные структуры отобранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. Исследование этих представлений позволяет проанализировать вероятную роль данных остатков в функционировании последовательностей иммуноглобулина-кандидата, то есть остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с его антигеном. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны из реципиентных и “импортных” последовательностей и объединены, в результате чего может быть получено желаемое антитело с нужными свойствами, такими как повышенная аффинность по отношению к антигену(ам)- мишени(ям). В общих чертах, остатки гипервариабельной области непосредственно влияют на связывание с антигеном, в основном, участвуют в таком связывании.It is also important that antibodies can be humanized while maintaining high affinity for this antigen and other favorable biological properties. In accordance with one of the methods, to achieve this goal, humanized antibodies can be obtained by analyzing the source sequences and various conceptual humanized products using three-dimensional models of the parent and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are publicly available and are well known in the art. Computer programs exist that illustrate and represent probable three-dimensional conformational structures of selected immunoglobulin candidate sequences. The study of these ideas allows us to analyze the likely role of these residues in the functioning of the candidate immunoglobulin sequences, that is, residues that affect the ability of the candidate immunoglobulin to bind to its antigen. Thus, FR residues can be selected from recipient and “import” sequences and combined, as a result of which the desired antibody can be obtained with the desired properties, such as increased affinity for the target antigen (s) (s). In general terms, residues of the hypervariable region directly affect antigen binding, and are mainly involved in such binding.

Человеческие антителаHuman antibodies

Человеческие анти-DLL4-антитела согласно изобретению могут быть сконструированы путем объединения последовательности(ей) вариабельного домена Fv-клона, выбранной(ых) из библиотек фагового представления, происходящих от человека, с известной(ыми) последовательностью(тями) человеческого константного домена, как описано выше. Альтернативно человеческие моноклональные анти-DLL4-антитела согласно изобретению могут быть получены гибридомным методом. Человеческие миеломные клеточные линии и гетеромиеломные клеточные линии «мышь - человек», используемые для продуцирования человеческих моноклональных антител, описаны, например, в публикациях Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).Human anti-DLL4 antibodies of the invention can be constructed by combining the sequence (s) of the variable domain of the Fv clone selected from libraries of phage presentation originating from humans with the known sequence (s) of the human constant domain, as described above. Alternatively, the human monoclonal anti-DLL4 antibodies of the invention can be prepared by the hybridoma method. Human myeloma cell lines and mouse-human heteromyeloma cell lines used to produce human monoclonal antibodies are described, for example, in Kozbor J. Immunol publications . 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol ., 147: 86 (1991).

В настоящее время могут быть получены трансгенные животные (например, мыши), которые будут способны после иммунизации продуцировать полный репертуар человеческих антител без продуцирования эндогенного иммуноглобулина. Так, например, сообщалось, что гомозиготная делеция гена области стыка в тяжелой цепи (J_Н) антитела у химерных и мутантных мышей зародышевой линии приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Перенос набора генов иммуноглобулина человеческой зародышевой линии таким мутантным мышам зародышевой линии может приводить к продуцированию человеческих антител после стимуляции антигеном. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggerman et al., Year in Immunol, 7:33 (1993).Currently, transgenic animals (e.g., mice) can be obtained which, after immunization, will be able to produce a complete repertoire of human antibodies without producing endogenous immunoglobulin. For example, it was reported that a homozygous deletion of the gene of the junction region in the heavy chain (J _H ) of an antibody in chimeric and mutant germ line mice leads to complete inhibition of the production of endogenous antibodies. Transferring a set of human germline immunoglobulin genes to such mutant germline mice can lead to the production of human antibodies after antigen stimulation. See, for example, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci ., USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggerman et al., Year in Immunol , 7:33 (1993).

Для получения человеческих антител от животных, не являющихся человеком, например грызунов, где человеческое антитело обладает такой же аффинностью и специфичностью по отношению к исходному не-человеческому антителу, может быть также применен метод перестановки генов. В соответствии с этим методом, который также называется «импринтингом эпитопа», вариабельную область тяжелой или легкой цепи фрагмента не-человеческого антитела, полученную методами фагового представления, описанными выше, заменяют набором человеческих генов V-домена с получением популяции химер «не-человеческая цепь/человеческая цепь scFv или Fab». Отбор с использованием антигена позволяет выделять химеры «не-человеческая цепь/человеческая цепь scFv или Fab», где указанная человеческая цепь восстанавливает антигенсвязывающий сайт, разрушенный после удаления соответствующей не-человеческой цепи в первичном клоне фагового представления, то есть эпитоп определяет (закрепляет) выбор партнера для человеческой цепи. Если этот процесс повторить для замены оставшейся не-человеческой цепи, то может быть получено человеческое антитело (см. заявку PCT WO 93/06213, опубликованную 1 апреля, 1993). В отличие от традиционного способа гуманизации не-человеческих антител путем присоединения CDR, этот способ позволяет получить полностью человеческие антитела, которые не имеют остатков FR или CDR, происходящих не от человека. To obtain human antibodies from non-human animals, such as rodents, where the human antibody has the same affinity and specificity for the original non-human antibody, a gene swapping method can also be used. According to this method, also called “epitope imprinting,” the variable region of the heavy or light chain of a non-human antibody fragment obtained by the phage presentation methods described above is replaced with a set of human V-domain genes to produce a population of non-human chain chimeras / human scFv or Fab chain. " Selection using antigen allows the selection of “non-human chain / scFv or Fab human” chimeras, where the indicated human chain restores the antigen binding site that is destroyed after removal of the corresponding non-human chain in the primary clone of the phage representation, that is, the epitope determines (fixes) the choice partner for the human chain. If this process is repeated to replace the remaining non-human chain, then a human antibody can be obtained (see PCT application WO 93/06213, published April 1, 1993). Unlike the traditional method of humanizing non-human antibodies by attaching a CDR, this method allows you to get fully human antibodies that do not have FR or CDR residues derived from non-human.

Биспецифические антителаBispecific Antibodies

Биспецифические антитела представляют собой моноклональные, предпочтительно человеческие или гуманизованные антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными антигенами. В данном случае одной из специфичностей связывания является специфичность связывания с DLL4, другой специфичностью является специфичность к любому другому антигену. Репрезентативные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами белка DLL4. Биспецифические антитела могут быть также использованы для определения локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют DLL4. Такие антитела имеют DLL4-связывающую ветвь, и ветвь, которая связывается с цитотоксическим агентом (например, с сапорином, антителом против интерферона-α, винкаалкалоидом, цепью рицина А, метотрексатом или гаптеном, связанным с радиоактивным изотопом). Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифических F(ab')₂-антител). Bispecific antibodies are monoclonal, preferably human or humanized antibodies that have binding specificity for at least two different antigens. In this case, one of the binding specificities is the specificity of binding to DLL4, the other specificity is specificity to any other antigen. Representative bispecific antibodies can bind to two different epitopes of the DLL4 protein. Bispecific antibodies can also be used to determine the localization of cytotoxic agents in cells that express DLL4. Such antibodies have a DLL4-binding branch and a branch that binds to a cytotoxic agent (e.g., saporin, anti-interferon-α antibody, vinca alkaloid, ricin A chain, methotrexate or hapten linked to a radioactive isotope). Bespecifically antibodies can be obtained in the form of full-sized antibodies or fragments of antibodies (for example, bespecifically F (ab ') ₂ antibodies).

Методы получения биспецифических антител известны специалистам. Традиционное рекомбинантное продуцирование биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелой цепи - легкой цепи иммуноглобулина, где две тяжелые цепи обладают различной специфичностью (Millstein & Cuello, Nature, 305:537 (1983)). Эти гибридомы (квадромы) из-за рандомизированного набора тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна молекула имеет “правильную” биспецифическую структуру. Очистка такой “правильной” молекулы, которую обычно осуществляют путем постадийного проведения аффинной хроматографии, достаточно затруднена и дает низкий выход продукта. Аналогичные процедуры описаны в заявке WO93/08829, опубликованной 13 мая 1993, и в работе Traunecker et al., EMBO J., 10:3655 (1991).Methods for producing bispecific antibodies are known in the art. The traditional recombinant production of bispecific antibodies is based on coexpression of two pairs of the heavy chain — the immunoglobulin light chain, where the two heavy chains have different specificities (Millstein & Cuello, Nature , 305: 537 (1983)). Due to the randomized set of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadroms) produce a potential mixture of 10 different antibody molecules, of which only one molecule has the “correct” bispecific structure. The purification of such a “correct” molecule, which is usually carried out by stepwise affinity chromatography, is rather difficult and gives a low yield of the product. Similar procedures are described in WO93 / 08829, published May 13, 1993, and in Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991).

В соответствии с другим и более предпочтительным подходом вариабельные домены антитела с нужными специфичностями связывания (объединенные сайты “антитело-антиген”) присоединяют к последовательностям константного домена иммуноглобулина. Такое слияние предпочтительно осуществляют с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, СН2 и СН3. При этом предпочтительно, чтобы по меньшей мере в одном из гибридов присутствовала первая константная область тяжелой цепи (СН1), содержащая сайт, необходимый для связывания с легкой цепью. ДНК, кодирующую гибриды тяжелой цепи иммуноглобулина и, если это необходимо, легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессионные векторы, и ко-трансфецируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает высокую степень гибкости при коррекции соотношений трех полипептидных фрагментов в тех вариантах изобретения, в которых неравные содержания трех полипептидных цепей, используемых в данной конструкции, дают оптимальные выходы. Однако можно встраивать кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей при равных соотношениях дает высокие выходы, или если такие соотношения не имеют решающего значения.In accordance with another and more preferred approach, the variable domains of an antibody with the desired binding specificities (combined antibody-antigen sites) are attached to immunoglobulin constant domain sequences. Such a fusion is preferably carried out with the constant domain of an immunoglobulin heavy chain containing at least a portion of the hinge region, CH2 and CH3. In this case, it is preferable that at least one of the hybrids contains the first constant region of the heavy chain (CH1) containing the site necessary for binding to the light chain. DNA encoding immunoglobulin heavy chain hybrids and, if necessary, immunoglobulin light chain hybrids are inserted into separate expression vectors and co-transfected into a suitable host organism. This provides a high degree of flexibility in correcting the ratios of three polypeptide fragments in those embodiments of the invention in which unequal contents of the three polypeptide chains used in this design provide optimal yields. However, coding sequences for two or all three polypeptide chains can be inserted into one expression vector if expression of at least two polypeptide chains in equal proportions gives high yields, or if such ratios are not critical.

В предпочтительном варианте такого подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющей первую специфичность связывания, в одной ветви, и гибридной пары “тяжелая цепь - легкая цепь” иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) в другой ветви. Было обнаружено, что такая асимметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновых цепей, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает простой способ его выделения. Этот способ описан в WO 94/04690. Более подробное описание получения биспецифических антител можно найти, например, в работе Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). In a preferred embodiment of this approach, the bispecific antibodies consist of a hybrid immunoglobulin heavy chain having a first binding specificity in one branch, and an immunoglobulin “heavy chain - light chain” hybrid pair (providing a second binding specificity) in another branch. It was found that such an asymmetric structure facilitates the separation of the desired bispecific compound from undesirable combinations of immunoglobulin chains, since the presence of the immunoglobulin light chain in only one half of the bispecific molecule provides an easy way to isolate it. This method is described in WO 94/04690. A more detailed description of the preparation of bispecific antibodies can be found, for example, in Suresh et al., Methods in Enzymology , 121: 210 (1986).

В соответствии с другим подходом граница между парой молекул антитела может быть сконструирована в целях максимизации процента гетеродимеров, выделенных из рекомбинантной клеточной культуры. Такая граница, предпочтительно содержит по меньшей мере часть домена С_Н3 константного домена антитела. В этом методе небольшие боковые цепи одной или нескольких аминокислот в пограничной области первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). В пограничной области второй молекулы антитела создают компенсирующие “полости”, имеющие размер, идентичный или аналогичный размеру более крупной(ых) боковой(ых) цепи(ей), путем замены крупных боковых цепей аминокислот более мелкими боковыми цепями (например, аланина или треонина). Это позволяет увеличить выход гетеродимеров по отношению к другим нежелательным конечным продуктам, таким как гомодимеры. According to another approach, the boundary between a pair of antibody molecules can be constructed in order to maximize the percentage of heterodimers isolated from recombinant cell culture. Such a boundary preferably contains at least a portion of the C _H 3 domain of the constant domain of an antibody. In this method, the small side chains of one or more amino acids in the boundary region of the first antibody molecule are replaced by larger side chains (e.g. tyrosine or tryptophan). In the boundary region of the second molecule of the antibody, compensating “cavities” are created having a size identical or similar to the size of the larger side chain (s) by replacing the large side chains of amino acids with smaller side chains (for example, alanine or threonine) . This allows you to increase the yield of heterodimers in relation to other undesirable end products, such as homodimers.

Биспецифическими антителами являются перекрестно-связанные или «гетероконъюгированные» антитела. Так, например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, другое с биотином. Было высказано предположение, что такие антитела могут быть, например, нацеливать клетки иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980), поэтому они могут быть использованы для лечения ВИЧ-инфекций (WO 91/00360, WO 92/00373 и EP 03089). Гетероконъюгированные антитела могут быть получены с применением любых стандартных методов перекрестного связывания. Подходящие перекрестно-связывающие агенты хорошо известны специалистам и описаны в патенте США № 4676980 наряду с различными методами перекрестного связывания. Bespecifically antibodies are cross-linked or "heteroconjugate" antibodies. So, for example, one of the antibodies in the heteroconjugate may be associated with avidin, the other with biotin. It has been suggested that such antibodies can, for example, target cells of the immune system to unwanted cells (US Pat. No. 4,676,980), so they can be used to treat HIV infections (WO 91/00360, WO 92/00373 and EP 03089) . Heteroconjugate antibodies can be prepared using any standard cross-linking methods. Suitable crosslinking agents are well known in the art and are described in US Pat. No. 4,676,980, along with various crosslinking methods.

Методы продуцирования биспецифических антител из фрагментов антител были также описаны в литературе. Так, например, биспецифические антитела могут быть получены путем химического связывания. В работе Brennan et al., Science, 229:81 (1985) описана процедура, в которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению с образованием F(ab')₂-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего дитиоловый комплекс, такого как арсенит натрия, для стабилизации смежных дитиолов и предотвращения образования межмолекулярной дисульфидной связи. Затем полученные Fab'-фрагменты превращают в производные тионитробензоата (TNВ). После этого одно из производных Fab'-TNВ снова превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого Fab'-TNВ-производного, в результате чего получают биспецифическое антитело. Такие продуцированные биспецифические антитела могут быть использованы в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.Methods for producing bispecific antibodies from antibody fragments have also been described in the literature. So, for example, bespecifically antibodies can be obtained by chemical binding. Brennan et al., Science , 229: 81 (1985) describes a procedure in which intact antibodies are proteolytically cleaved to form F (ab ') ₂ fragments. These fragments are reduced in the presence of a dithiol complex forming agent, such as sodium arsenite, to stabilize adjacent dithiols and prevent the formation of an intermolecular disulfide bond. Then the obtained Fab'-fragments are converted into derivatives of thionitrobenzoate (TNB). Thereafter, one of the Fab'-TNB derivatives is again converted to the Fab'-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of the other Fab'-TNB derivative, whereby a bispecific antibody is obtained. Such bispecific antibodies produced can be used as agents for the selective immobilization of enzymes.

Последние достижения в данной области позволяют проводить прямое выделение из E.coli Fab'-SH-фрагментов, которые могут быть химически связаны с образованием биспецифических антител. В работе Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) описано продуцирование полностью гуманизованной молекулы F(ab')₂ биспецифического антитела. Каждый Fab'-фрагмент был отдельно секретирован из E.coli и подвергнут прямому химическому связыванию in vitro с образованием биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело обладает способностью связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор НЕR2 и с нормальными человеческими Т-клетками, также запускать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов, направленную против человеческих клеток-мишеней опухоли молочной железы. Recent advances in this field allow direct isolation of Fab'-SH fragments from E. coli that can be chemically coupled to form bispecific antibodies. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describes the production of a fully humanized F (ab ') ₂ molecule of a bispecific antibody. Each Fab'fragment was separately secreted from E. coli and subjected to direct chemical binding in vitro with the formation of bespecifically antibodies. The bispecific antibody thus obtained has the ability to bind to cells overexpressing the HER2 receptor and normal human T cells, and also to trigger the lytic activity of human cytotoxic lymphocytes directed against human breast tumor target cells.

Были также описаны другие методы получения и выделения фрагментов биспецифического антитела непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Так, например, биспецифические антитела были продуцированы с использованием “лейциновых молний”. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии, происходящие от белков Fos и Jun, были присоединены к Fab'-частям двух других антител путем лигирования генов. Гомодимеры антитела были восстановлены в шарнирной области с образованием мономеров, затем снова окислены с образованием гетеродимеров антитела. Этот метод может быть также использован для продуцирования гомодимеров антитела. Технология “диантител”, описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448 (1993), обеспечивает альтернативный механизм получения фрагментов биспецифического антитела. Эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_Н), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) посредством линкера, который является слишком коротким для создания пары между двумя доменами одной и той же цепи. В соответствии с этим VН- и VL-домены одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными VL- и VH-доменами другого фрагмента, образуя тем самым два антигенсвязывающих сайта. Также была описана другая стратегия получения фрагментов биспецифического антитела с использованием одноцепочечных Fv(sFv)-димеров. См. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Other methods for producing and isolating fragments of a bispecific antibody directly from a recombinant cell culture have also been described. For example, bispecific antibodies were produced using “leucine zippers”. Kostelny et al., J. Immunol ., 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucine zipper peptides derived from Fos and Jun proteins were coupled to the Fab ′ portions of two other antibodies by ligation of genes. Antibody homodimers were reduced in the hinge region to form monomers, then oxidized again to form antibody heterodimers. This method can also be used to produce antibody homodimers. Diantibody technology described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 6444-6448 (1993), provides an alternative mechanism for producing bispecific antibody fragments. These fragments contain the variable domain of the heavy chain (V _H ) connected to the variable domain of the light chain (V _L ) via a linker that is too short to create a pair between two domains of the same chain. Accordingly, the VH and VL domains of one fragment are forced to pair with the complementary VL and VH domains of another fragment, thereby forming two antigen-binding sites. Another strategy has also been described for producing bispecific antibody fragments using single chain Fv (sFv) dimers. See Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

Рассматриваются также антитела с более чем двумя валентностями. Так, например, могут быть получены и триспецифические антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). Antibodies with more than two valencies are also contemplated. So, for example, trispecific antibodies can also be obtained. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Поливалентные антителаPolyvalent Antibodies

Поливалентное антитело может быть быстрее интернализовано (и/или оно может быстрее подвергаться катаболизму), чем двухвалентное антитело, благодаря экспрессии антигена в клетке, с которым связываются антитела. Антителами согласно изобретению могут быть поливалентные антитела (не принадлежащие к классу IgM) с тремя или более антигенсвязывающими сайтами (например, четырехвалентные антитела), которые могут быть легко продуцированы посредством рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи данного антитела. Поливалентное антитело может содержать домен димеризации и три или более антигенсвязывающих сайтов. Предпочтительный домен димеризации содержит (или состоит из них) Fc-область или шарнирную область. В этом случае антитело может содержать Fc-область и три или более антигенсвязывающих сайта, расположенных от амино-конца по отношению к Fс-области. Описанное здесь предпочтительное поливалентное антитело содержит (или состоит из них) от трех примерно до восьми антигенсвязывающих сайтов, предпочтительно четыре антигенсвязывающих сайта. Поливалентное антитело содержит по меньшей мере одну полипептидную цепь (а предпочтительно две полипептидных цепи), где указанная(ые) полипептидная(ые) цепь(и) содержит(ат) два или более вариабельных доменов. Так, например, полипептидная(ые) цепь(и) может (могут) содержать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, Fc представляет собой одну полипептидную цепь Fc-области, X1 и X2 представляют собой аминокислоту или полипептид, и n равно 0 или 1. Так, например, полипептидная(ые) цепь(и) может (могут) содержать: цепь «VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-Fc-область»; или цепь «VH-CH1-VH-CH1-Fc-область». Поливалентное антитело согласно изобретению также предпочтительно содержит по меньшей мере два (а предпочтительно четыре) полипептида вариабельного домена легкой цепи. Описанное здесь поливалентное антитело может, например, содержать примерно от двух до восьми полипептидов вариабельного домена легкой цепи. Рассматриваемые здесь полипептиды вариабельного домена легкой цепи содержат вариабельный домен легкой цепи, также, но необязательно, домен CL. A polyvalent antibody can be internalized more quickly (and / or it can undergo catabolism faster) than a divalent antibody due to the expression of the antigen in the cell to which the antibodies bind. Antibodies according to the invention can be polyvalent antibodies (not belonging to the IgM class) with three or more antigen-binding sites (e.g., tetravalent antibodies), which can be easily produced by recombinant expression of a nucleic acid encoding the polypeptide chains of this antibody. A polyvalent antibody may contain a dimerization domain and three or more antigen binding sites. A preferred dimerization domain comprises (or consists of) an Fc region or a hinge region. In this case, the antibody may contain an Fc region and three or more antigen binding sites located from the amino terminus with respect to the Fc region. The preferred multivalent antibody described herein contains (or consists of) from three to about eight antigen binding sites, preferably four antigen binding sites. A polyvalent antibody contains at least one polypeptide chain (and preferably two polypeptide chains), where the specified polypeptide (s) chain (s) contains (at) two or more variable domains. So, for example, the polypeptide (s) chain (s) may (may) contain VD1- (X1) n-VD2- (X2) n-Fc, where VD1 represents the first variable domain, VD2 represents the second variable domain, Fc represents represents one polypeptide chain of the Fc region, X1 and X2 are an amino acid or a polypeptide, and n is 0 or 1. So, for example, the polypeptide (s) chain (s) may (may) contain: a chain "VH-CH1-flexible linker "VH-CH1-Fc region"; or the chain "VH-CH1-VH-CH1-Fc region." The polyvalent antibody of the invention also preferably contains at least two (and preferably four) light chain variable domain polypeptides. The multivalent antibody described herein may, for example, contain from about two to eight polypeptides of the light chain variable domain. The light chain variable domain polypeptides described herein comprise a light chain variable domain, also, but not necessarily, a CL domain.

Варианты антителAntibody Options

В некоторых вариантах изобретения рассматривается модификация(и) аминокислотной последовательности описанных здесь антител. Так, например, может оказаться желательным повысить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают путем введения соответствующих нуклеотидных замен в нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такими модификациями являются, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. При этом в конечную конструкцию могут быть введены любые комбинации делеций, инсерций и замен при условии, что такая конечная конструкция будет обладать нужными свойствами. Аминокислотные модификации могут быть введены в рассматриваемую аминокислотную последовательность антитела в процессе получения такой последовательности.In some embodiments of the invention, modification (s) of the amino acid sequence of the antibodies described herein is contemplated. So, for example, it may be desirable to increase the binding affinity and / or other biological properties of the antibody. Variants of the amino acid sequence of an antibody are obtained by introducing appropriate nucleotide substitutions into the nucleic acid encoding the antibody, or by peptide synthesis. Such modifications are, for example, deletions and / or insertions and / or substitutions of residues in the amino acid sequences of antibodies. In this case, any combination of deletions, insertions and substitutions can be introduced into the final structure, provided that such a final structure will have the desired properties. Amino acid modifications can be introduced into the considered amino acid sequence of an antibody in the process of obtaining such a sequence.

Метод, применяемый для идентификации некоторых остатков или областей антитела, которые имеют предпочтительную локализацию для мутагенеза, называется “аланин-сканирующим мутагенезом” и описан Cunningham & Wells (1989), Science, 244:1081-1085. В этом методе остаток или группу нужных остатков (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином) для влияния на взаимодействие этих аминокислот с антигеном. Затем локализацию аминокислот, проявляющих функциональную чувствительность к таким заменам, уточняют путем введения дополнительных или других модификаций в положения замены. Так, например, положение для введения замены в аминокислотную последовательность может быть определено заранее, тогда как природа мутации per se необязательно должна быть определена заранее. Так, например, для анализа эффективности мутации в данном сайте Ala-сканирующий или неспецифический мутагенез осуществляют в нужном кодоне или в нужной области, и экспрессированные иммуноглобулины скринируют на нужную активность.The method used to identify certain residues or regions of an antibody that have a preferred location for mutagenesis is called “alanine scanning mutagenesis” and is described by Cunningham & Wells (1989), Science, 244: 1081-1085. In this method, a residue or group of desired residues (e.g., charged residues such as Arg, Asp, His, Lys and Glu) is identified and replaced with a neutral or negatively charged amino acid (most preferably alanine or polyalanine) to influence the interaction of these amino acids with the antigen. Then, the localization of amino acids exhibiting functional sensitivity to such substitutions is specified by introducing additional or other modifications to the substitution position. So, for example, the position for introducing a substitution in the amino acid sequence can be determined in advance, while the nature of the mutation per se need not be determined in advance. So, for example, to analyze the effectiveness of a mutation at a given site, Ala-scanning or nonspecific mutagenesis is performed in the desired codon or in the desired region, and expressed immunoglobulins are screened for the desired activity.

Вставками в аминокислотные последовательности являются вставки у амино- и/или карбокси-концов, образующие гибриды, имеющие длину от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, также вставки внутри последовательности, состоящие из одного или множества аминокислотных остатков. Примерами концевых инсерций является антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело, присоединенное к цитотоксическому полипептиду. Другими инсерционными вариантами молекулы антитела являются гибриды, например N- или С-концов антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который увеличивает время полужизни антитела в сыворотке. Insertions into amino acid sequences are insertions at the amino and / or carboxy terminus, forming hybrids having a length from one residue to polypeptides containing one hundred or more residues, and also inserts within a sequence consisting of one or multiple amino acid residues. Examples of terminal insertions are an antibody with an N-terminal methionyl residue or an antibody attached to a cytotoxic polypeptide. Other insertion variants of the antibody molecule are hybrids, for example the N- or C-terminus of an antibody with an enzyme (for example, for ADEPT) or a polypeptide that increases the half-life of the antibody in serum.

Гликозилирование полипептидов обычно является либо N-связанным либо О-связанным. N-связанное гликозилирование означает присоединение углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности “аспарагин-Х-серин” и “аспарагин-Х-треонин”, где Х означает любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде способствует созданию потенциального сайта гликозилирования. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного из сахаров, таких как N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза к гидроксиаминокислоте, главным образом, к серину или треонину, хотя ими могут быть также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.Glycosylation of polypeptides is usually either N-linked or O-linked. N-linked glycosylation means the attachment of a carbohydrate group to the side chain of an aspartic moiety. The tripeptide sequences “asparagine-X-serine” and “asparagine-X-threonine”, where X is any amino acid except proline, are recognition sequences for the enzymatic attachment of the carbohydrate moiety to the asparagine side chain. Thus, the presence of any of these tripeptide sequences in the polypeptide contributes to the creation of a potential glycosylation site. O-linked glycosylation means the addition of one of the sugars, such as N-acetylgalactosamine, galactose or xylose, to a hydroxy amino acid, mainly to serine or threonine, although they may also be 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine.

Присоединение сайтов гликозилирования к антителу обычно осуществляют путем такой модификации аминокислотной последовательности, в результате которой эта аминокислотная последовательность будет содержать одну или несколько вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Такая модификация может быть также осуществлена путем добавления к последовательности одного или нескольких сериновых или треониновых остатков или их замены в последовательности исходного антитела (для сайтов О-связанного гликозилирования). The attachment of glycosylation sites to an antibody is usually carried out by modifying the amino acid sequence such that the amino acid sequence will contain one or more of the above-described tripeptide sequences (for N-linked glycosylation sites). Such a modification can also be carried out by adding to the sequence one or more serine or threonine residues or replacing them in the sequence of the original antibody (for O-linked glycosylation sites).

Если антитело содержит Fc-область, то может быть модифицирован углевод, присоединенный к этой области. Так, например, антитела, имеющие углевод со зрелой структурой, в котором отсутствует фукоза и который присоединен к Fc-области антитела, описаны в заявке на патент США № 2003/0157108, (Presta, L.). См. также US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Антитела, содержащие в своем углеводе N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), разделяющий молекулу антитела пополам, где указанный углевод присоединен к Fc-области антитела, описаны в WO 03/011878, Jean-Mairet et al., и в патенте США № 6602684, Umana et al. Антитела, имеющие по меньшей мере один галактозный остаток в олигосахариде, присоединенном к Fc-области антитела, описаны в WO 1997/30087, Patel et al. См. также заявки WO 98/58964 (Raju, S.) и WO 99/22764 (Raju, S.), которые относятся к антителам с модифицированным углеводом, присоединенным к Fc-области антитела. См. также заявку США 2005/0123546 (Umana et al.), в которой описаны антигенсвязывающие молекулы с модифицированным гликозилированием.If the antibody contains an Fc region, a carbohydrate attached to this region can be modified. For example, antibodies having a mature carbohydrate structure in which there is no fucose and which is attached to the Fc region of an antibody are described in US patent application No. 2003/0157108, (Presta, L.). See also US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Antibodies containing N-acetylglucosamine (GlcNAc) in their carbohydrate, bisecting the antibody molecule in half, where the carbohydrate is attached to the Fc region of the antibody, are described in WO 03/011878, Jean-Mairet et al., And in US patent No. 6602684, Umana et al. Antibodies having at least one galactose residue in an oligosaccharide attached to the Fc region of an antibody are described in WO 1997/30087, Patel et al. See also WO 98/58964 (Raju, S.) and WO 99/22764 (Raju, S.), which relate to modified carbohydrate antibodies attached to the Fc region of an antibody. See also U.S. Application 2005/0123546 (Umana et al.) For antigen binding molecules with modified glycosylation.

Предпочтительный с точки зрения настоящего изобретения вариант гликозилирования включает Fc-область, где углеводная структура, присоединенная к Fc-области, не содержит фукозу. Такие варианты обладают улучшенной ADCC-функцией. Fc-область также содержит, но необязательно, одну или несколько аминокислотных замен, которые также улучшают ADCC-функцию, например замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (нумерация остатков дана по Европейской системе нумерации). Публикациями, в которых описаны “дефукозилированные” или “дефицитные по фукозе” антитела, являются, например, заявки на патент США №№ 2003/0157108; WO 2001/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035778; WO 2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примерами клеточных линий, продуцирующих дефукозилированные антитела, являются клетки Lec13 CHO, дефицитные по фукозилированию белка (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявка на патент США № 2003/0157108 A1, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Adams et al., в частности пример 11), и дефицитные клеточные линии, такие как клетки СНО, дефицитные по гену альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).A preferred glycosylation variant from the point of view of the present invention includes the Fc region, where the carbohydrate structure attached to the Fc region does not contain fucose. Such options have an improved ADCC function. The Fc region also contains, but not necessarily, one or more amino acid substitutions that also improve ADCC function, for example, substitutions at positions 298, 333 and / or 334 of the Fc region (residue numbering is given according to the European numbering system). Publications that describe "defucosylated" or "deficient in fucose" antibodies are, for example, US patent application No. 2003/0157108; WO 2001/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US2002 / 0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035778; WO 2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech Bioeng. 87: 614 (2004). Examples of defucosylated antibody producing cell lines are Lec13 CHO cells deficient in protein fucosylation (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); US Patent Application No. 2003/0157108 A1, Presta, L ; and WO 2004/056312 A1, Adams et al ., in particular Example 11), and deficient cell lines, such as CHO cells, deficient in the alpha-1,6-fucosyltransferase gene, FUT8, (Yamane-Ohnuki et al. Biotech Bioeng. 87: 614 (2004)).

Вариантом другого типа является вариант аминокислотной замены. Такие варианты антител имеют в своей молекуле по меньшей мере один аминокислотный остаток, замененный другим остатком. Сайтами, которые представляют наибольший интерес для мутагенеза путем замен, являются гипервариабельные области, однако могут также рассматриваться FR-модификации. Консервативные замены представлены в табл.1 под заголовком «Предпочтительные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены более значительные замены, называемые в табл.1 «репрезентативными заменами», или также описанные ниже в разделе, относящемся к классу аминокислот, затем полученные продукты могут быть скринированы. A variant of another type is the amino acid substitution variant. Such antibody variants have in their molecule at least one amino acid residue replaced by another residue. The sites that are of most interest for mutagenesis by substitutions are hypervariable regions, however, FR modifications can also be considered. Conservative substitutions are presented in table 1 under the heading "Preferred substitutions". If such substitutions lead to a change in biological activity, more significant substitutions can be introduced, referred to in Table 1 as “representative substitutions”, or also described below in the section relating to the class of amino acids, then the resulting products can be screened.

Таблица 1Table 1 Исходные остаткиOriginal Residues Репрезентативные заменыRepresentative Substitutions Предпочтительные заменыPreferred Substitutions Ala (A)Ala (A) Val; Leu; IleVal; Leu Ile ValVal Arg (R)Arg (R) Lys; Gln; AsnLys; Gln; Asn LysLys Asn (N)Asn (n) Gln; His; Asp, Lys; ArgGln; His; Asp, Lys; Arg GlnGln Asp (D)Asp (D) Glu; AsnGlu; Asn GluGlu Cys (C)Cys (c) Ser; AlaSer; Ala SerSer Gln (Q)Gln (Q) Asn; GluAsn; Glu AsnAsn Glu (E)Glu (E) Asp; GlnAsp; Gln AspAsp Gly (G)Gly (G) AlaAla AlaAla His (H)His (H) Asn; Gln; Lys; ArgAsn; Gln; Lys; Arg ArgArg Ile (I)Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцинLeu Val; Met; Ala; Phe; norleucine LeuLeu Leu (L) Leu (L) Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; PheNorleucine; Ile Val; Met; Ala; Phe IleIle Lys (K)Lys (K) Arg; Gln; AsnArg; Gln; Asn ArgArg Met (M)Met (M) Leu; Phe; IleLeu Phe; Ile LeuLeu Phe (F)Phe (f) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; TyrTrp; Leu Val; Ile Ala; Tyr TyrTyr Pro (P)Pro (P) AlaAla AlaAla Ser (S)Ser (S) ThrThr ThrThr Thr (T)Thr (t) Val; SerVal; Ser SerSer Trp (W)Trp (w) Tyr; PheTyr; Phe TyrTyr Tyr (Y)Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; SerTrp; Phe; Thr; Ser PhePhe Val (V)Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцинIle Leu Met; Phe; Ala; norleucine LeuLeu

Значительные изменения биологических свойств антитела могут быть достигнуты путем выбора замен, которые значительно отличаются по своему влиянию на (а) структуру полипептидного остова в области замены, например складчатую или спиральную конформацию, (b) заряд или гидрофобность молекулы в нужном сайте, или (с) объем боковой цепи. Природные остатки подразделяются на нижеследующие группы по общим свойствам боковых цепей:Significant changes in the biological properties of antibodies can be achieved by selecting substitutions that significantly differ in their effect on (a) the structure of the polypeptide backbone in the substitution region, for example, a folded or helical conformation, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the desired site, or (c) side chain volume. Natural residues are divided into the following groups according to the general properties of the side chains:

(1) гидрофобные остатки: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;(1) hydrophobic residues: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные остатки: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;(2) neutral hydrophilic residues: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные остатки: Asp, Glu;(3) acidic residues: Asp, Glu;

(4) основные остатки: His, Lys, Arg;(4) basic residues: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и(5) residues that affect chain orientation: Gly, Pro; and

(6) ароматические остатки: Trp, Tyr, Phe.(6) aromatic residues: Trp, Tyr, Phe.

Не-консервативные замены приводят к заменам члена одного из этих классов членом другого класса.Non-conservative substitutions lead to replacements of a member of one of these classes with a member of another class.

Одним из репрезентативных вариантов замены является замена одного или нескольких остатков гипервариабельной области родительского антитела (например, гуманизованного или человеческого антитела). В общих чертах, полученный(ые) вариант(ы), выбранный(ные) для дальнейшей разработки, будет способствовать улучшению биологических свойств по сравнению со свойствами родительского антитела, от которого они происходят. Стандартный способ генерирования таких вариантов с заменами предусматривает созревание аффинности с применением метода фагового представления. Для этого несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации для генерирования всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Генерированные таким образом антитела могут быть представлены на частицах нитчатого фага в виде гибридов с продуктом гена III, упакованных в каждой частице фага М13. Затем варианты, представленные на фаге, скринируют на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано в настоящей заявке. Для идентификации сайтов гипервариабельной области, являющихся кандидатами на модификацию, может быть осуществлен аланин-сканирующий мутагенез, который позволяет идентифицировать остатки гипервариабельной области, играющие важную роль в связывании с антигеном. Альтернативно или дополнительно может оказаться полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации контактных участков между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами на замену, осуществляемую в соответствии с разработанными здесь способами. После генерирования таких вариантов панель этих вариантов подвергают скринингу, описанному в настоящей заявке, и антитела, обнаруживающие превосходные свойства в одном или нескольких релевантных анализах, могут быть выбраны для дальнейшего исследования.One representative replacement option is the replacement of one or more residues of the hypervariable region of the parent antibody (e.g., a humanized or human antibody). In general terms, the obtained option (s) selected for further development will improve the biological properties compared to the properties of the parent antibody from which they originate. The standard way of generating such variants with substitutions involves the maturation of affinity using the phage representation method. For this, several hypervariable region sites (for example, 6-7 sites) are mutated to generate all possible amino acid substitutions at each site. Antibodies generated in this way can be represented on filamentous phage particles in the form of hybrids with the product of gene III, packaged in each particle of phage M13. Then the options presented on the phage, screened for their biological activity (for example, binding affinity), as described in this application. To identify sites of the hypervariable region that are candidates for modification, alanine scanning mutagenesis can be carried out, which allows the identification of residues of the hypervariable region, which play an important role in binding to the antigen. Alternatively or additionally, it may be useful to analyze the crystal structure of the antigen-antibody complex to identify contact sites between the antibody and antigen. Such contact residues and adjacent residues are candidates for replacement carried out in accordance with the methods developed here. After generating such variants, a panel of these variants is subjected to the screening described in this application, and antibodies exhibiting excellent properties in one or more relevant assays can be selected for further study.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антитела, получают различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничивается ими, выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью опосредуемого олигонуклеотидом (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кластерного мутагенеза ранее полученного варианта или немодифицированного варианта антитела.Nucleic acid molecules encoding variants of the amino acid sequences of an antibody are prepared by various methods known to those skilled in the art. Such methods include, but are not limited to, isolation from a natural source (in the case of natural variants of amino acid sequences) or obtaining, using an oligonucleotide-mediated (or site-directed) mutagenesis, PCR mutagenesis, and cluster mutagenesis of a previously obtained variant or unmodified antibody variant.

Может оказаться желательным введение одной или нескольких модификаций аминокислот в Fc-области иммуноглобулиновых полипептидов согласно изобретению с получением варианта Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, человеческой Fc-области IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), включающую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких положениях аминокислот, включая положение шарнирного цистеина. В соответствии с настоящим описанием и известным уровнем техники следует отметить, что в некоторых вариантах изобретения антитело, используемое в способах согласно изобретению, может содержать одну или несколько модификаций по сравнению с аналогом антитела дикого типа, например в Fc-области. Тем не менее такие антитела должны, по существу, сохранять свойства его аналога дикого типа, необходимые для его терапевтического применения. Так, например, считается, что некоторые модификации могут быть введены в Fc-область, что будет приводить к изменению (то есть к улучшению или ослаблению) связывания с C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в WO 99/51642. См., также Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); патент США №. 5648260; патент США №. 5624821; и заявку WO 94/29351, в которых рассматриваются другие примеры вариантов Fc-области. В WO 00/42072 (Presta) и WO 2004/056312 (Lowman) описаны варианты антител с повышенным или пониженным уровнем связывания с FcRs. Содержание этих патентных публикаций конкретно вводится в настоящее описание посредством ссылки. См., также Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Антитела с более длительным временем полужизни и с повышенным уровнем связывания с Fc-рецептором, имеющимся у новорожденных, (FcRn), который является ответственным за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в US 2005/0014934 A1 (Hinton et al.). Такие антитела включают Fc-область с одной или несколькими описанными заменами, которые повышают уровень связывания Fc-области с FcRn. Полипептидные варианты с модифицированными аминокислотными последовательностями в Fc-области и с повышенной или пониженной способностью к связыванию с C1q описаны в патенте США № 6194551B1 и в WO 99/51642. Содержание этих патентных публикаций конкретно вводится в настоящее описание посредством ссылки. См. также Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).It may be desirable to introduce one or more modifications of the amino acids in the Fc region of the immunoglobulin polypeptides of the invention to produce a variant Fc region. An Fc region variant may comprise a sequence of a human Fc region (e.g., human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc region) comprising an amino acid modification (e.g., substitution) at one or more amino acid positions, including the position of the hinge cysteine. In accordance with the present description and prior art, it should be noted that in some embodiments of the invention, the antibody used in the methods of the invention may contain one or more modifications compared to a wild-type antibody analogue, for example, in the Fc region. However, such antibodies should essentially retain the properties of its wild-type analogue necessary for its therapeutic use. So, for example, it is believed that some modifications can be introduced into the Fc region, which will lead to a change (i.e., to improvement or weakening) of the binding to C1q and / or complement dependent cytotoxicity (CDC), for example, as described in WO 99/51642. See also Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); US Patent No. 5,648,260; US Patent No. 5,624,821; and WO 94/29351, which discusses other examples of variants of the Fc region. WO 00/42072 (Presta) and WO 2004/056312 (Lowman) describe antibody variants with increased or decreased levels of binding to FcRs. The contents of these patent publications are specifically incorporated into this description by reference. See also Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001). Antibodies with longer half-lives and with increased binding to the Fc receptor found in newborns (FcRn), which is responsible for the transmission of maternal IgG to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)) described in US 2005/0014934 A1 (Hinton et al.). Such antibodies include an Fc region with one or more of the substitutions described that increase the binding of the Fc region to FcRn. Polypeptide variants with modified amino acid sequences in the Fc region and with increased or decreased ability to bind to C1q are described in US patent No. 6194551B1 and in WO 99/51642. The contents of these patent publications are specifically incorporated into this description by reference. See also Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Производные антителDerivatives of Antibodies

Антитела согласно изобретению могут быть дополнительно модифицированы так, чтобы они содержали другие не-белковые молекулы, которые известны специалистам и являются легко доступными. Предпочтительными молекулами, подходящими для дериватизации антител, являются водорастворимые полимеры. Неограничивающими примерами водорастворимых полимеров являются полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. При промышленном изготовлении следует отдать предпочтение пропиональдегиду полиэтиленгликоля благодаря его стабильности в воде. Этот полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединяемых к антителу, может варьироваться, и если присоединяют более чем один полимер, то эти полимеры могут иметь одинаковые или различные молекулы. В общих чертах, число и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, могут быть выбраны исходя из нескольких факторов, включая, но не ограничиваясь ими, конкретные свойства или функции антитела, которые должны быть улучшены, независимо от конкретных условий терапии, при которых будет использоваться указанное производное антитела и т.п. Antibodies according to the invention can be further modified so that they contain other non-protein molecules that are known in the art and are readily available. Preferred molecules suitable for derivatization of antibodies are water soluble polymers. Non-limiting examples of water-soluble polymers are polyethylene glycol (PEG), ethylene glycol / propylene glycol copolymers, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, poly-1,3-dioxolane, poly-1,3,6-trioxane, ethylene amide / ethylene amide copolymer homopolymers or random copolymers) and dextran or poly (n-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, polypropylene oxide / ethylene oxide copolymers, polyoxyethylene polyols (e.g. glycerol), poly vinyl alcohol and mixtures thereof. In industrial production, preference should be given to propionaldehyde of polyethylene glycol due to its stability in water. This polymer may have any molecular weight and may be branched or unbranched. The number of polymers attached to an antibody can vary, and if more than one polymer is attached, then these polymers can have the same or different molecules. In general terms, the number and / or type of polymers used for derivatization can be selected based on several factors, including, but not limited to, specific properties or functions of the antibody that need to be improved, regardless of the particular treatment conditions under which the specified derivative of an antibody or the like is used.

Скрининг антител с нужными свойствамиScreening for antibodies with desired properties

Антитела согласно изобретению могут быть охарактеризованы по их физическим/химическим свойствам и биологическим функциям с помощью различных анализов, известных специалистам. В некоторых вариантах изобретения антитела характеризуются по любому одному или нескольким свойствам, таким как связывание с DLL4; и/или ослабление или блокирование активации рецептора Notch; и/или ослабление или блокирование молекулярного сигнала, передаваемого после передачи сигнала рецептора Notch, и/или нарушение или блокирование связывания рецептора Notch с DLL4; и/или стимуляция пролиферации эндотелиальных клеток; и/или ингибирование дифференцировки эндотелиальных клеток; и/или ингибирование артериальной дифференциации; и/или ингибирование сосудистой перфузии опухоли; и/или лечение и/или предупреждение развития опухоли, клеточно-пролиферативного расстройства или рака; и/или лечение или предупреждение расстройства, ассоциированного с экспрессией и/или активностью DLL4; и/или лечение или предупреждение расстройства, ассоциированного с экспрессией и/или активностью рецептора Notch.Antibodies according to the invention can be characterized by their physical / chemical properties and biological functions using various assays known to those skilled in the art. In some embodiments of the invention, antibodies are characterized by any one or more of a property, such as binding to DLL4; and / or attenuation or blocking of Notch receptor activation; and / or attenuation or blocking of the molecular signal transmitted after transmission of the Notch receptor signal, and / or disruption or blocking of Notch receptor binding to DLL4; and / or stimulation of proliferation of endothelial cells; and / or inhibition of differentiation of endothelial cells; and / or inhibition of arterial differentiation; and / or inhibition of vascular tumor perfusion; and / or treating and / or preventing the development of a tumor, cell proliferative disorder, or cancer; and / or treating or preventing a disorder associated with the expression and / or activity of DLL4; and / or treating or preventing a disorder associated with Notch receptor expression and / or activity.

Очищенные антитела могут быть также охарактеризованы с помощью различных анализов, включая, но не ограничиваясь ими, N-концевое секвенирование, анализ аминокислот, эксклюзионная хроматография в не-денатурирующих условиях, жидкостная хроматография высокого давления (ЖХВД), масс-спектрометрия, ионообменная хроматография и гидролиз папаином.Purified antibodies can also be characterized by a variety of assays, including but not limited to N-terminal sequencing, amino acid analysis, size exclusion chromatography, high pressure liquid chromatography (HPLC), mass spectrometry, ion exchange chromatography and hydrolysis papain.

В некоторых вариантах изобретения продуцируемые здесь антитела анализируют на их биологическую активность. В некоторых вариантах изобретения антитело согласно изобретению тестируют на их антигенсвязывающую активность. Анализами на связывание с антигеном, которые известны специалистам и могут быть использованы в настоящей заявке, являются, но не ограничиваются ими, любой из анализов на прямое или конкурентное связывание, проводимых такими методами, как вестерн-блот-анализы, радиоиммуноанализы, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), «сэндвич»-иммуноанализы, анализы с применением иммунопреципитации, флуоресцентные иммуноанализы и иммуноанализы с использованием белка А. Репрезентативные анализы на связывание с антигеном описаны ниже в разделе «Примеры».In some embodiments of the invention, the antibodies produced herein are assayed for their biological activity. In some embodiments of the invention, the antibody of the invention is tested for their antigen binding activity. Antigen binding assays that are known to those skilled in the art and which can be used in this application include, but are not limited to, any of the direct or competitive binding assays performed by methods such as Western blot assays, radioimmunoassays, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay analysis), sandwich immunoassays, immunoprecipitation assays, fluorescence immunoassays and protein A immunoassays. Representative antigen binding assays are described below in the section “Pr measures. "

В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к моноклональным анти-DLL4-антителам, которые конкурируют с антителами 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 и/или 26.82 за связывание с DLL4. Такими антителами-конкурентами являются антитела, распознающие эпитоп DLL4, который является аналогичным эпитопу или перекрывается с эпитопом DLL4, распознаваемым антителами 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 и/или 26.82. Такие антитела-конкуренты могут быть получены путем скрининга супернатантов на анти-DLL4 гибридому по конкурентному связыванию иммобилизованного DLL4 с мечеными антителами 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 и/или 26.82. Супернатант гибридомы, содержащий антитело-конкурент, будет способствовать снижению количества связанного меченого антитела, детектируемого в рассматриваемой смеси для конкурентного связывания по сравнению с количеством связанного меченого антитела, детектируемого в контрольной смеси для связывания, содержащей иррелевантное антитело (или вообще не содержащей антитела). Любой из описанных здесь анализов на конкурентное связывание является подходящим для его применения в вышеописанной процедуре. In yet another embodiment, the present invention relates to monoclonal anti-DLL4 antibodies that compete with antibodies 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 and / or 26.82 for binding to DLL4. Such competing antibodies are antibodies that recognize the DLL4 epitope, which is similar to the epitope or overlaps with the DLL4 epitope recognized by antibodies 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 and / or 26.82. Such competing antibodies can be obtained by screening supernatants for an anti-DLL4 hybridoma to competitively bind immobilized DLL4 with labeled antibodies 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 and / or 26.82. A hybridoma supernatant containing a competitor antibody will help reduce the amount of bound labeled antibody detected in the competitive binding mixture in question compared to the amount of labeled labeled antibody detected in the binding control mixture containing an irrelevant antibody (or no antibody at all). Any of the competitive binding assays described herein is suitable for use in the above procedure.

В другом свое аспекте настоящее изобретение относится к моноклональному анти-DLL4-антителу, содержащему одну или несколько (например, 2, 3, 4, 5 и/или 6) HVR антител 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 и/или 26.82. Моноклональное анти-DLL4-антитело, содержащее одну или несколько HVR антител 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 и/или 26.82, может быть сконструировано путем присоединения одной или нескольких HVR антител 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 и/или 26.82 к матричной последовательности антитела, например к последовательности человеческого антитела, которое наиболее соответствует мышиной последовательности родительского антитела или консенсусной последовательности всех человеческих антител в конкретной подгруппе легкой цепи или тяжелой цепи родительского антитела, и экспрессии полученной(ых) химерной(ых) последовательности(ей) вариабельной области легкой и/или тяжелой цепи в присутствии или в отсутствие сопутствующей(их) последовательности(ей) константной области в рекомбинантных клетках-хозяевах, описанных в настоящей заявке.In another aspect, the present invention relates to a monoclonal anti-DLL4 antibody comprising one or more (e.g. 2, 3, 4, 5 and / or 6) HVR antibodies 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 and / or 26.82. A monoclonal anti-DLL4 antibody containing one or more HVR antibodies 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 and / or 26.82 can be constructed by attaching one or more HVR antibodies 26.6, 26.14, 26.20, 26.34 and / or 26.82 to the antibody matrix sequence for example, the sequence of a human antibody that most closely matches the mouse sequence of the parent antibody or the consensus sequence of all human antibodies in a particular subgroup of the light chain or heavy chain of the parent antibody, and expression is obtained second (s) chimera (s) sequence (s) variable light and / or heavy chain in the presence or absence of concomitant (s) sequence (s) of the constant region in the recombinant host cells described herein.

Анти-DLL4-антитела согласно изобретению, обладающие уникальными свойствами, описанными в настоящей заявке, могут быть получены путем скрининга клонов анти-DLL4 гибридом на нужные свойства любым стандартным методом. Так, например, если желательно использовать моноклональное анти-DLL4-антитело, блокирующее или неблокирующее связывание рецепторов Notch с DLL4, то такое антитело-кандидат может быть протестировано в анализе на конкурентное связывание, таком как ELISA на конкурентное связывание, где лунки планшетов покрывают DLL4, затем на эти покрытые планшеты наносят раствор антитела, в избыточном количестве представляющего интерес рецептора Notch, и связанное антитело подвергают ферментативному детектированию, например контактированию связанного антитела с ПХ-конъюгированным анти-Ig-антителом или биотинилированным анти-Ig-антителом с развитием цветовой ПХ-реакции, например, путем проявления планшетов с использованием стрептавидина-ПХ и/или пероксида водорода, и детектирования цветовой ПХ-реакции с помощью спектрофотометрии на 490 нм в планшет-ридере для ELISA. Anti-DLL4 antibodies of the invention having the unique properties described herein can be obtained by screening anti-DLL4 hybrid clones for desired properties using any standard method. So, for example, if it is desirable to use a monoclonal anti-DLL4 antibody that blocks or nonblocks the binding of Notch receptors to DLL4, then such a candidate antibody can be tested in a competitive binding assay, such as competitive binding ELISA, where the wells of the plates are coated with DLL4, then an antibody solution in an excess of Notch receptor of interest is applied to these coated plates, and the bound antibody is subjected to enzymatic detection, for example, contacting the bound antibody with PX- conjugated anti-Ig antibody or biotinylated anti-Ig antibody with the development of the color PC reaction, for example, by developing tablets using streptavidin-PC and / or hydrogen peroxide, and detecting the color PC reaction using spectrophotometry at 490 nm in a tablet reader for ELISA.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к модифицированному антителу, которое обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желательным антителом-кандидатом для применения в различных целях, где время полужизни антитела in vivo является важным фактором, некоторые эффекторные функции (такие как комплемент-зависимая цитотоксичность и ADCC) не являются необходимыми или даже являются нежелательными. В некоторых вариантах изобретения измеряют Fc-активности продуцируемого иммуноглобулина для гарантии сохранения только нужных свойств. Анализы на цитотоксичность in vitro и/или in vivo могут быть проведены для подтверждения ослабления/истощения CDC- и/или ADCC-активностей. Так, например, могут быть проведены анализы на связывание с Fc-рецептором (FcR) для гарантии того, что антитело не будет связываться с FcγR (а следовательно, вероятно, не будет обладать ADCC-активностью), но будет сохранять свою способность связываться с FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, то есть NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные, полученные для экспрессии FcR на гемопоэтических клетках, систематизированы в таблице 3 на странице 464 публикации Ravetch & Kinet Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Пример in vitro анализа для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы описан в патентах США № 5500362 или 5821337. Эффекторными клетками, подходящими для таких анализов, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно ADCC-активность представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на модели животного, такой как модель, описанная Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci.A 95:652-656 (1998). Для подтверждения того, что данное антитело не обладает способностью связываться с C1q, следовательно, не обладает CDC-активностью, могут быть также проведены анализы на связывание с C1q. Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ на CDC, например анализ, описанный в публикации Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Определение уровня связывания с FcRn и клиренса/времени полужизни in vivo может быть также осуществлено методами, известными специалистам, например, описанными в разделе «Примеры». In one embodiment, the present invention relates to a modified antibody that has some, but not all, effector functions, which makes it a desirable candidate antibody for various applications, where the half-life of the antibody in vivo is an important factor, some effector functions (such both complement dependent cytotoxicity and ADCC) are not necessary or even undesirable. In some embodiments, the Fc activity of the produced immunoglobulin is measured to ensure that only the desired properties are retained. In vitro and / or in vivo cytotoxicity assays can be performed to confirm attenuation / depletion of CDC and / or ADCC activities. For example, Fc receptor (FcR) binding assays can be performed to ensure that the antibody will not bind to FcγR (and therefore probably will not have ADCC activity), but will retain its ability to bind to FcRn . Primary cells mediating ADCC, i.e., NK cells, express FcγRIII only, while monocytes express FcγRI, FcγRII and FcγRIII. The data obtained for the expression of FcR on hematopoietic cells are summarized in table 3 on page 464 of the publication by Ravetch & Kinet Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). An example of an in vitro assay for evaluating the ADCC activity of a molecule of interest is described in US Pat. Nos. 5,500,362 or 5,821,337. Effector cells suitable for such assays are peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and natural killer cells (NKs). Alternatively or additionally, the ADCC activity of the molecule of interest can be evaluated in vivo , for example, in an animal model, such as the model described by Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. A 95: 652-656 (1998). To confirm that this antibody does not have the ability to bind to C1q, therefore, does not have CDC activity, tests for binding to C1q can also be performed. To assess complement activation, a CDC assay can be performed, for example, the assay described in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). The determination of the level of binding to FcRn and clearance / half-life in vivo can also be carried out by methods known to those skilled in the art, for example, described in the Examples section.

Векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные методыVectors, host cells and recombinant methods

Для рекомбинантного продуцирования антитела согласно изобретению нуклеиновую кислоту, кодирующую такое антитело, выделяют и встраивают в реплицируемый вектор для последующего клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. ДНК, кодирующая антитело, может быть легко выделена и секвенирована в соответствии со стандартными процедурами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела). Для этой цели подходящими являются многие векторы. Выбор вектора отчасти зависит от используемой клетки-хозяина. Обычно предпочтительными клетками-хозяевами являются либо прокариотические клетки либо эукариотические клетки (обычно клетки млекопитающих). Следует отметить, что для этой цели могут быть использованы константные области любого изотипа, включая константные области IgG, IgМ, IgА, IgD и IgЕ, и что такие константные области могут быть получены от человека или животных любых видов. For recombinant production of an antibody according to the invention, a nucleic acid encoding such an antibody is isolated and inserted into a replicated vector for subsequent cloning (DNA amplification) or expression. DNA encoding an antibody can be easily isolated and sequenced in accordance with standard procedures (for example, using oligonucleotide probes capable of specifically binding to genes encoding the antibody heavy and light chains). Many vectors are suitable for this purpose. The choice of vector depends in part on the host cell used. Typically, the preferred host cells are either prokaryotic cells or eukaryotic cells (usually mammalian cells). It should be noted that for this purpose, constant regions of any isotype can be used, including constant regions of IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, and that such constant regions can be obtained from humans or animals of any species.

а. Генерирование антител с использованием прокариотических клеток-хозяев but. Generation of antibodies using prokaryotic host cells

i. Конструирование вектораi. Vector design

Полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные компоненты антитела согласно изобретению, могут быть получены стандартными рекомбинантными методами. Нужные полинуклеотидные последовательности могут быть выделены и секвенированы из антитело-продуцирующих клеток, таких как гибридомные клетки. Альтернативно полинуклеотиды могут быть синтезированы с помощью синтезатора нуклеотидов или ПЦР-методами. После получения последовательностей, кодирующих полипептиды, эти последовательности встраивают в рекомбинантный вектор, способный реплицироваться и экспрессировать гетерологичные полинуклеотиды в прокариотических хозяевах. В целях настоящего изобретения могут быть использованы многие доступные и известные векторы. Выбор соответствующего вектора зависит, главным образом, от размера нуклеиновых кислот, встраиваемых в указанный вектор, и от конкретной клетки-хозяина, трансформируемой этим вектором. Каждый вектор содержит различные компоненты в зависимости от его функции (амплификации или экспрессии гетерологичного полинуклеотида или того и другого) и от его совместимости с конкретной клеткой-хозяином, в которой он находится. Компонентами векторов обычно являются, но не ограничиваются ими, ориджин репликации, селективный маркерный ген, промотор, сайт связывания с рибосомой (RBS), сигнальная последовательность, вставка гетерологичной нуклеиновой кислоты и последовательность терминации транскрипции.Polynucleotide sequences encoding the polypeptide components of an antibody of the invention can be obtained by standard recombinant methods. The desired polynucleotide sequences can be isolated and sequenced from antibody-producing cells, such as hybridoma cells. Alternative polynucleotides can be synthesized using a nucleotide synthesizer or PCR methods. After obtaining sequences encoding the polypeptides, these sequences are inserted into a recombinant vector capable of replicating and expressing heterologous polynucleotides in prokaryotic hosts. For the purposes of the present invention, many available and known vectors can be used. The choice of the appropriate vector depends mainly on the size of the nucleic acids inserted into the specified vector, and on the specific host cell transformed by this vector. Each vector contains various components depending on its function (amplification or expression of a heterologous polynucleotide or both) and on its compatibility with the particular host cell in which it is located. The components of the vectors are typically, but are not limited to, the origin of replication, a selective marker gene, a promoter, a ribosome binding site (RBS), a signal sequence, a heterologous nucleic acid insertion, and a transcription termination sequence.

В основном, плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, происходящие от видов, совместимых с клеткой-хозяином, используются вместе с этими же хозяевами. Такой вектор обычно содержит сайт репликации, также последовательности-маркеры, способствующие проведению фенотипического отбора в трансформированных клетках. Так, например, E.coli обычно трансформируют плазмидой рВR322, происходящей от E.coli определенного вида. рВR322 содержит гены, кодирующие резистентность к ампициллину (Аmp) и к тетрациклину (Теt), и позволяет легко идентифицировать трансформированные клетки. рВR322 и ее производные или другие микробные плазмиды или бактериофаг могут также содержать промоторы, которые могут быть использованы этим микробным организмом для экспрессии эндогенных белков, либо они могут быть модифицированы так, чтобы они содержали такие промоторы. Примеры производных рВR322, используемых для экспрессии конкретных антител, подробно описаны в патенте США № 5648237, Carter et al.Basically, plasmid vectors containing replicon and regulatory sequences derived from species compatible with the host cell are used together with the same hosts. Such a vector usually contains a replication site, as well as marker sequences that facilitate phenotypic selection in transformed cells. So, for example, E. coli is usually transformed with plasmid pBR322, derived from a certain type of E. coli . pBR322 contains genes encoding resistance to ampicillin (Amp) and tetracycline (Tet), and makes it easy to identify transformed cells. pBR322 and its derivatives or other microbial plasmids or bacteriophage can also contain promoters that can be used by this microbial organism to express endogenous proteins, or they can be modified to contain such promoters. Examples of pBR322 derivatives used to express specific antibodies are described in detail in US Pat. No. 5,648,237 to Carter et al.

Кроме того, фаговые векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, совместимые с микроорганизмом-хозяином, могут быть использованы в качестве трансформирующих векторов в комбинации с этими хозяевами. Так, например, бактериофаг, такой как λGEM^TM-11, может быть использован для получения рекомбинантного вектора, который может быть применен для трансформации восприимчивых клеток-хозяев, таких как E.coli LЕ392. In addition, phage vectors containing replicon and regulatory sequences compatible with the host microorganism can be used as transforming vectors in combination with these hosts. For example, a bacteriophage, such as λGEM ^™ -11, can be used to produce a recombinant vector that can be used to transform susceptible host cells, such as E. coli LE392.

Экспрессионный вектор согласно изобретению может содержать две или более пар промотор-цистрон, кодирующих каждый из полипептидных компонентов. Промотором является нетранслируемая регуляторная последовательность, локализованная выше (со стороны 5'-конца) от цистрона, модулирующего ее экспрессию. Прокариотические промоторы обычно подразделяются на два класса - индуцибельные и конститутивные. Индуцибельным промотором является промотор, который инициирует повышение уровней транскрипции цистрона, находящегося под его контролем, в ответ на изменения условий культивирования, например, в присутствии или в отсутствие питательных элементов или при изменении температуры.An expression vector according to the invention may contain two or more promoter-cistron pairs encoding each of the polypeptide components. The promoter is an untranslated regulatory sequence located above (from the 5'-end) from the cistron modulating its expression. Prokaryotic promoters are usually divided into two classes - inducible and constitutive. An inducible promoter is a promoter that initiates an increase in transcription levels of cistron under its control in response to changes in cultivation conditions, for example, in the presence or absence of nutrients or when the temperature changes.

Большинство промоторов, распознаваемых различными потенциальными клетками-хозяевами, хорошо известны специалистам. Выбранный промотор может быть функционально присоединен к цистронной ДНК, кодирующей легкую или тяжелую цепь, путем выделения промотора из ДНК-источника посредством ее гидролиза рестриктирующими ферментами и встраивания выделенной промоторной последовательности в вектор согласно изобретению. Нативная промоторная последовательность и многие гетерологичные промоторы могут быть использованы для прямой амплификации и/или экспрессии генов-мишеней. В некоторых вариантах изобретения используются гетерологичные промоторы, поскольку они по сравнению с нативным промотором для нужных полипептидов позволяют значительно повышать уровень транскрипции и увеличивать выходы экспрессируемого гена-мишени.Most promoters recognized by various potential host cells are well known in the art. The selected promoter may be operably linked to a cystron DNA encoding a light or heavy chain by isolating the promoter from the source DNA by hydrolyzing it with restriction enzymes and inserting the isolated promoter sequence into the vector of the invention. The native promoter sequence and many heterologous promoters can be used for direct amplification and / or expression of target genes. In some embodiments of the invention, heterologous promoters are used, since they can significantly increase the level of transcription and increase the yields of the expressed target gene compared to the native promoter for the desired polypeptides.

Промоторами, подходящими для использования в прокариотических хозяевах, являются промотор РhoA, промоторные системы β-галактамазы и лактозы, промоторная система триптофана (trp) и гибридные промоторы, такие как промотор tac или trc. Однако могут быть также использованы и другие промоторы, которые являются функциональными в бактериях (например, другие известные бактериальные или фаговые промоторы). Нуклеотидные последовательности этих промоторов были опубликованы, что облегчает специалистам в данной области проводить их функциональное лигирование с цистронами, кодирующими нужные легкие и тяжелые цепи (Siebenlist et al. (1980) Cell 20:269), с использованием линкеров или адаптеров для доставки всех требуемых рестрикционных сайтов. The promoters suitable for use in prokaryotic hosts are the PhoA promoter, β-galactamase and lactose promoter systems, tryptophan (trp) promoter system, and hybrid promoters such as the tac or trc promoter . However, other promoters that are functional in bacteria (for example, other known bacterial or phage promoters) can also be used. The nucleotide sequences of these promoters have been published, which makes it easier for those skilled in the art to carry out their functional ligation with cistrons encoding the desired light and heavy chains (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269), using linkers or adapters to deliver all the required restriction sites.

В одном из аспектов изобретения каждый цистрон в рекомбинантном векторе содержит такой компонент, как секреторная сигнальная последовательность, регулирующая транслокацию экспрессируемых полипептидов через мембрану. В общих чертах, указанной сигнальной последовательностью может быть компонент вектора либо такой последовательностью может быть часть нужного ДНК-полипептида, встраиваемого в этот вектор. Сигнальной последовательностью, выбранной в целях осуществления изобретения, должна быть последовательность, распознаваемая и процессируемая (то есть отщепляемая сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. В случае использования прокариотических клеток-хозяев, не распознающих и не процессирующих сигнальные последовательности, которые являются нативными для гетерологичных полипептидов, эту сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью, выбранной, например, из группы, состоящей из лидерной последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы, lpp или термостабильного энтеротоксина II (SТII), LamB, PhoE, PelB, OmpA и МВР. В одном из вариантов изобретения сигнальными последовательностями, используемыми в обоих цистронах экспрессионной системы, являются сигнальные последовательности SТII или их варианты.In one aspect of the invention, each cistron in a recombinant vector contains a component such as a secretory signal sequence that regulates the translocation of expressed polypeptides across the membrane. In general terms, the indicated signal sequence may be a component of a vector, or such a sequence may be part of the desired DNA polypeptide inserted into this vector. The signal sequence selected for the implementation of the invention should be a sequence recognized and processed (i.e. cleaved by signal peptidase) by the host cell. In the case of prokaryotic host cells that do not recognize and do not process signal sequences that are native to heterologous polypeptides, this signal sequence is replaced by a prokaryotic signal sequence selected, for example, from the group consisting of the leader sequence of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp or thermostable enterotoxin II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA and MBP. In one embodiment of the invention, the signal sequences used in both cistrons of the expression system are STII signal sequences or variants thereof.

В другом аспекте изобретения продуцирование иммуноглобулинов согласно изобретению может происходить в цитоплазме клетки-хозяина, поэтому в данном случае не требуется присутствия секретирующих сигнальных последовательностей в каждом цистроне. В соответствии с этим легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина экспрессируются и подвергаются укладке и сборке с образованием функциональных иммуноглобулинов в цитоплазме. Некоторые штаммы хозяев (например, trxB ^--штаммы E.coli) имеют соответствующие условия в цитоплазме, которые благоприятствуют образованию дисульфидных связей, и тем самым способствуют правильной укладке и сборке субъединиц экспрессируемого белка. Proba & Pluckthun, Gene, 159:203 (1995). In another aspect of the invention, the production of immunoglobulins according to the invention can occur in the cytoplasm of the host cell, therefore, in this case, the presence of secreting signal sequences in each cistron is not required. In accordance with this, light and heavy chains of immunoglobulin are expressed and subjected to folding and assembly with the formation of functional immunoglobulins in the cytoplasm. Some host strains (for example, trxB ^- strains of E. coli ) have appropriate cytoplasmic conditions that favor the formation of disulfide bonds, and thereby contribute to the proper folding and assembly of the expressed protein subunits. Proba & Pluckthun, Gene , 159: 203 (1995).

Прокариотическими клетками-хозяевами, подходящими для экспрессии антител согласно изобретению, являются архебактерии (Archaebacteria) и эубактерии (Eubacteria), такие как грамотрицательныые или грамположительные микроорганизмы. Примерами подходящих бактерий являются Esсherichia (например, E.coli), Bacilli (например, B.subtilis), энтеробактерии, бактерии вида Pseudomonas (например, P.aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescаns, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla или Paracoccus. В одном из вариантов изобретения используются грамотрицательные клетки. В одном из вариантов изобретения в качестве хозяев согласно изобретению используются клетки E.coli. Примерами штаммов E.coli являются штамм W3110 (Bachmann, Cellular & Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp.1190-1219; АТСС, номер депозита № 27325) и их производные, включая штамм 33D3, имеющий генотип W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 laq Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR (патент США № 5639635). Подходящими также являются и другие штаммы и их производные, такие как E.coli 294 (АТСС 31446), E.coli В, E.coliλ 1776 (АТСС 31537) и E.coli RV308 (ATCC 31608). Эти примеры являются иллюстративными, но не органичивающими. Методы конструирования производных любой из вышеупомянутых бактерий, имеющих определенные генотипы, известны специалистам и описаны, например, в публикации Bass et al., Proteins 8:309-314 (1990). Обычно соответствующие бактерии необходимо отбирать с учетом реплицируемости репликона в клетках бактерии. Так, например, бактерии E.coli, Serratia или Salmonella могут быть подходящими для их использования в качестве хозяина, если для доставки репликона используются хорошо известные плазмиды, такие как pBR322, pBR325, pACYC177 или pKN410. Обычно клетки-хозяева должны секретировать минимальные количества протеолитических ферментов, поэтому в клеточную культуру желательно включать дополнительные ингибиторы протеазы.Prokaryotic host cells suitable for expressing antibodies of the invention are archaebacteria (Archaebacteria) and eubacteria (Eubacteria), such as gram-negative or gram-positive microorganisms. Examples of suitable bacteria are Escherichia (e.g., E.coli), Bacilli (e.g., B.subtilis), enterobacteria, bacteria of the species Pseudomonas (e.g., P.aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia , Vitreoscilla or Paracoccus . In one embodiment of the invention, gram-negative cells are used. In one embodiment of the invention, E. coli cells are used as hosts according to the invention. Examples of E. coli strains are strain W3110 (Bachmann, Cellular & Molecular Biology, vol. 2 (Washington, DC: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC, deposit number No. 27325) and derivatives thereof, including strain 33D3 having the W3110 genotype Δ fhuA (ΔtonA) ptr3 laq Iq lacL8 ΔompTΔ (nmpc-fepE) degP41 kanR (US patent No. 5639635). Other strains and their derivatives are also suitable, such as E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli B, E. coli λ 1776 (ATCC 31537) and E. coli RV308 (ATCC 31608). These examples are illustrative, but not limiting. Methods for constructing derivatives of any of the aforementioned bacteria having certain genotypes are known to those skilled in the art and are described, for example, in Bass et al., Proteins 8: 309-314 (1990). Usually, the appropriate bacteria must be selected taking into account the replicability of the replicon in the bacterial cells. Thus, for example, E. coli , Serratia or Salmonella bacteria may be suitable for use as a host if well-known plasmids are used to deliver the replicon, such as pBR322, pBR325, pACYC177 or pKN410. Typically, host cells must secrete minimal amounts of proteolytic enzymes, therefore, additional protease inhibitors are desirable in the cell culture.

ii. Продуцирование антителii. Antibody production

Клетки-хозяева трансформируют вышеуказанными экспрессионными векторами и культивируют в стандартной питательной среде, модифицированной так, чтобы она была подходящей для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности.The host cells are transformed with the above expression vectors and cultured in a standard nutrient medium, modified to be suitable for inducing promoters, selecting transformants, or amplifying genes encoding the desired sequences.

Термин “трансформация” означает введение ДНК в прокариотического хозяина так, чтобы эта ДНК либо реплицировалась в виде внехромосомного элемента либо интегрировалась в хромосому. В зависимости от используемой клетки-хозяина трансформацию осуществляют стандартными методами, подходящими для таких клеток. Бактериальные клетки, содержащие прочные барьеры, такие клеточные стенки, обычно обрабатывают кальцием, именно хлоридом кальция. В другом методе трансформации используют полиэтиленгликоль/ДМСО. Еще одним методом трансформации является электропорация. The term “transformation” means the introduction of DNA into a prokaryotic host so that the DNA is either replicated as an extrachromosomal element or integrated into the chromosome. Depending on the host cell used, the transformation is carried out by standard methods suitable for such cells. Bacterial cells containing strong barriers, such cell walls, are usually treated with calcium, namely calcium chloride. Another transformation method uses polyethylene glycol / DMSO. Another method of transformation is electroporation.

Прокариотические клетки, используемые для продуцирования полипептидов согласно изобретению, культивируют в среде, известной специалистам и подходящей для культивирования выбранных клеток-хозяев. Примерами подходящей среды являются бульон Луриа (LВ) с необходимыми питательными добавками. В некоторых вариантах изобретения такая среда также содержит средство для отбора, выбранное исходя из конструирования экспрессионного вектора, которое способствуют селективному росту прокариотических клеток, содержащих экспрессионный вектор. Так, например, в среду для культивирования клеток, экспрессирующих ген резистентности к ампициллину, добавляют ампициллин.Prokaryotic cells used to produce the polypeptides of the invention are cultured in a medium known to those skilled in the art and suitable for culturing selected host cells. Examples of suitable media are Luria broth (LB) with essential nutritional supplements. In some embodiments of the invention, such a medium also comprises a selection agent selected based on the construction of the expression vector that promotes the selective growth of prokaryotic cells containing the expression vector. Thus, for example, ampicillin is added to a medium for culturing cells expressing an ampicillin resistance gene.

Помимо источников углерода, азота и неорганического фосфата в среду могут быть также включены любые необходимые добавки в соответствующих концентрациях, вводимые как отдельно, так и в смеси с другими добавками или средой, такими как комплексный источник азота. Культуральная среда может, но необязательно, содержать один или несколько восстанавителей, выбранных из группы, состоящей из глутатиона, цистеина, цистамина, тиогликолята, дитиоэритритола и дитиотреитола.In addition to sources of carbon, nitrogen and inorganic phosphate, any necessary additives in appropriate concentrations can be included in the medium, introduced either separately or in a mixture with other additives or medium, such as a complex source of nitrogen. The culture medium may, but not necessarily, contain one or more reducing agents selected from the group consisting of glutathione, cysteine, cystamine, thioglycolate, dithioerythritol and dithiothreitol.

Прокариотические клетки-хозяева культивируют при соответствующих температурах. Для культивирования E.coli предпочтительной температурой является, например, температура примерно от 20°С до 39°С, более предпочтительно примерно от 25°С до 37°С, еще более предпочтительно примерно при 30°С. рН среды может варьироваться в пределах примерно от 5 до 9 в зависимости, главным образом, от организма хозяина. Для E.coli рН составляет предпочтительно примерно от 6,8 до 7,4, более предпочтительно примерно 7,0.Prokaryotic host cells are cultured at appropriate temperatures. For culturing E. coli, a preferred temperature is, for example, a temperature of from about 20 ° C to 39 ° C, more preferably from about 25 ° C to 37 ° C, even more preferably at about 30 ° C. The pH of the medium can vary from about 5 to 9, depending mainly on the host organism. For E. coli, the pH is preferably about 6.8 to 7.4, more preferably about 7.0.

Если в экспрессионном векторе согласно изобретению используется индуцибельный промотор, то экспрессия белка индуцируется в условиях, подходящих для активации данного промотора. В одном из аспектов изобретения для регуляции транскрипции полипептидов используются промоторы РhoA. В соответствии с этим трансформированные клетки-хозяева культивируют в среде для индуцирования с ограниченным содержанием фосфата. Предпочтительной средой с ограниченным содержанием фосфата является среда С.R.А.Р. (см., например, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002) 263:133-147). В комбинации с используемой векторной конструкцией могут быть использованы и различные другие индукторы, известные специалистам.If an inducible promoter is used in the expression vector according to the invention, protein expression is induced under conditions suitable for activating the promoter. In one aspect of the invention, PhoA promoters are used to regulate the transcription of polypeptides. Accordingly, transformed host cells are cultured in a phosphate-limited induction medium. A preferred phosphate-limited medium is C.R.A.P. (see, for example, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002) 263: 133-147). Various other inductors known to those skilled in the art can be used in combination with the vector construction used.

В одном из вариантов изобретения экспрессируемые полипептиды согласно изобретению секретируются в периплазму клеток-хозяев и могут быть выделены из этой периплазмы. Выделение белка, главным образом, осуществляют путем дизрупции микроорганизма, обычно такими методами, как осмотический шок, обработка ультразвуком или лизис. После дизрупции клеток клеточный дебрис или целые клетки могут быть удалены путем центрифугирования или фильтрации. Эти белки могут быть дополнительно очищены, например, с помощью хроматографии на аффинной смоле. Альтернативно белки могут транспортироваться в клеточную среду и отделяться от нее. Клетки могут быть удалены из культуры, супернатант культуры может быть подвергнут фильтрации и концентированию для дополнительной очистки полученных белков. Экспрессированные полипептиды могут быть затем выделены и идентифицированы хорошо известными методами, такими как электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) и Вестерн-блот-анализ.In one embodiment of the invention, the expressed polypeptides of the invention are secreted into the periplasm of the host cells and can be isolated from this periplasm. Protein isolation is mainly carried out by disrupting the microorganism, usually by methods such as osmotic shock, sonication or lysis. After cell disruption, cell debris or whole cells can be removed by centrifugation or filtration. These proteins can be further purified, for example, by chromatography on affinity resin. Alternatively, proteins can be transported to and separated from the cell medium. Cells can be removed from the culture, the culture supernatant can be filtered and concentrated to further purify the resulting proteins. Expressed polypeptides can then be isolated and identified by well-known methods, such as polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and Western blot analysis.

В одном из аспектов изобретения антитела продуцируют в большом количестве посредством ферментации. Для получения рекомбинантных белков могут быть проведены различные крупномасштабные процедуры ферментации в культуре с подпиткой. Крупномасштабную ферментацию проводят в ферментере емкостью по меньшей мере 1000 л, предпочтительно, примерно от 1000 до 100000 л. Такие ферментеры снабжены лопастной мешалкой для равномерного распределения кислорода и микроэлементов, в частности глюкозы (предпочтительного источника углерода/энергии). Термин “лабораторная ферментация”, в общих чертах, означает ферментацию в ферментере объемом не более чем примерно 100 л, и такой объем может варьироваться примерно от 1 л до 100 л.In one aspect of the invention, antibodies are produced in large quantities by fermentation. To obtain recombinant proteins can be carried out various large-scale fermentation procedures in culture with water. Large-scale fermentation is carried out in a fermenter with a capacity of at least 1000 liters, preferably from about 1000 to 100,000 liters. Such fermenters are equipped with a paddle mixer for uniform distribution of oxygen and trace elements, in particular glucose (a preferred carbon / energy source). The term "laboratory fermentation", in General terms, means fermentation in a fermenter with a volume of not more than about 100 l, and such a volume can vary from about 1 l to 100 l.

В процессе ферментации индуцирование экспрессии белков обычно инициируют после того как клетки, культивируемые в подходящих условиях, достигнут нужной плотности, например OD₅₅₀, составляющей примерно 180-220, то есть ранней стационарной фазы. В комбинации с используемой векторной конструкцией могут быть использованы и различные другие индукторы, известные специалистам и описанные выше. Перед индуцированием клетки могут быть культивированы в течение меньшего периода времени. Клетки обычно индуцируют в течение примерно 12-50 часов, хотя время индуцирования может быть увеличено или уменьшено.In the fermentation process, the induction of protein expression is usually initiated after cells cultured under suitable conditions have reached the desired density, for example, OD _{550 of} about 180-220, i.e. the early stationary phase. Various other inductors known to those skilled in the art and described above can be used in combination with the vector construction used. Before induction, cells can be cultured for a shorter period of time. Cells usually induce for about 12-50 hours, although the induction time can be increased or decreased.

Для увеличения выхода продукта и для улучшения качества полипептидов согласно изобретению могут быть изменены различные условия ферментации. Так, например, для обеспечения “правильной” сборки и укладки секретированных полипептидов антител могут быть использованы дополнительные векторы, в которых происходит сверхэкспрессия белков-шаперонов, таких как белки Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD и/или DsbG) или FkpA (пептидилпролил- цис,транс-изомераза с шаперонной активностью), и которые предназначены для ко-трансформации прокариотических клеток-хозяев. Было продемонстрировано, что белки-шапероны облегчают правильную укладку и растворимость гетерологичных белков, продуцируемых в бактериальных клетках-хозяевах. Chen et al. (1999) J. Bio. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., патент США № 6083715; Georgiou et al., патент США № 6027888; Bothmann & Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm & Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210. To increase the yield of the product and to improve the quality of the polypeptides according to the invention, various fermentation conditions can be changed. For example, to ensure the “correct” assembly and folding of secreted antibody polypeptides, additional vectors can be used in which overexpression of chaperone proteins such as Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD and / or DsbG) or FkpA (peptidylprolyl - cis, trans isomerase with chaperone activity), and which are intended for co-transformation of prokaryotic host cells. Chaperone proteins have been shown to facilitate the proper folding and solubility of heterologous proteins produced in bacterial host cells. Chen et al. (1999) J. Bio. Chem . 274: 19601-19605; Georgiou et al., US patent No. 6083715; Georgiou et al., US patent No. 6027888; Bothmann & Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm & Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210.

Для минимизации протеолиза экспрессируемых гетерологичных белков (а в частности, белков, которые являются протеолитически чувствительными) в настоящем изобретении могут быть использованы некоторые штаммы-хозяева, дефицитные по протеолитическим ферментам. Так, например, штаммы клеток-хозяев могут быть модифицированы для введения генетической(их) мутации(й) в гены, кодирующие известные бактериальные протеазы, такие как протеаза III, OmpT, DegP, Tsp, протеаза I, протеаза Mi, протеаза V, протеаза VI и их комбинации. Некоторые дефицитные по протеазе штаммы E.coli являются доступными и описаны, например, в публикации Joly et al. (1998), см. выше; Georgiou et al., патент США № 5264365; Georgiou et al., патент США № 5508192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996). To minimize proteolysis of expressed heterologous proteins (and in particular, proteins that are proteolytically sensitive), some host strains deficient in proteolytic enzymes can be used in the present invention. For example, host cell strains can be modified to introduce genetic mutation (s) into genes encoding known bacterial proteases, such as protease III, OmpT, DegP, Tsp, protease I, protease Mi, protease V, protease VI and their combinations. Some protease-deficient E. coli strains are available and are described, for example, in Joly et al. (1998), see above; Georgiou et al., US patent No. 5264365; Georgiou et al., US patent No. 5508192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996).

В одном из вариантов изобретения штаммы E.coli, дефицитные по протеолитическим ферментам и трансформированные плазмидами, сверхэкспрессирующими один или несколько белков-шаперонов, используются в качестве клеток-хозяев в экспрессионной системе согласно изобретению.In one embodiment of the invention, E. coli strains deficient in proteolytic enzymes and transformed with plasmids overexpressing one or more chaperone proteins are used as host cells in the expression system of the invention.

iii. Очистка антителiii. Antibody purification

Могут быть применены стандартные методы очистки белков, известные специалистам. Примерами подходящих методов очистки являются следующие процедуры очистки: фракционирование на иммуноаффинных или ионообменных колонках, преципитация этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на двуокиси кремния или на катионообменной смоле, такой как DЕАЕ, хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ, преципитация сульфатом аммония и гель-фильтрация с использованием, например, сефадекса G-75. Standard protein purification methods known to those skilled in the art can be applied. Examples of suitable purification methods are the following purification procedures: fractionation on immunoaffinity or ion exchange columns, precipitation with ethanol, reverse phase HPLC, chromatography on silica or on a cation exchange resin such as DEAE, chromatofocusing, SDS-PAGE, ammonium sulfate precipitation -filtration using, for example, Sephadex G-75.

В одном из аспектов изобретения для иммуноаффинной очистки полноразмерных продуктов антител согласно изобретению используют белок А, иммобилизованный на твердой фазе. Белок А представляет собой 41 кД-белок клеточной стенки, происходящий от Staphylococcus aureus, который с высокой аффинностью связывается с Fc-областью антител. Lindmark et al. (1983), J. Immunol. Meth. 62:1-13. Твердой фазой, на которой иммобилизован белок А, является предпочтительно колонка, имеющая стеклянную поверхность или кремнийсодержащую поверхность, более предпочтительно стеклянная колонка с регулируемым размером пор или колонка с нанесенной на нее кремниевой кислотой. В некоторых вариантах указанная колонка покрыта реагентом, таким как глицерин, для предотвращения неспецифического присоединения примесей.In one aspect of the invention, protein A immobilized on a solid phase is used for immunoaffinity purification of the full length antibody products of the invention. Protein A is a 41 kD cell wall protein derived from Staphylococcus aureus , which binds to the Fc region of antibodies with high affinity. Lindmark et al. (1983), J. Immunol. Meth. 62: 1-13. The solid phase on which Protein A is immobilized is preferably a column having a glass surface or a silicon-containing surface, more preferably a glass column with an adjustable pore size or a column coated with silicic acid. In some embodiments, said column is coated with a reagent, such as glycerin, to prevent nonspecific addition of impurities.

В первой стадии очистки препарат, полученный из клеточной культуры, описанной выше, наносят на твердую фазу с иммобилизованным на ней белком А для специфического связывания представляющего интерес антитела с белком А. Затем твердую фазу промывают для удаления примесей, неспецифически связанных с твердой фазой. И наконец, представляющее интерес антитело отделяют от твердой фазы путем элюирования.In the first purification step, a preparation obtained from the cell culture described above is applied to the solid phase with protein A immobilized on it to specifically bind the antibody of interest to protein A. Then the solid phase is washed to remove impurities that are not specifically bound to the solid phase. Finally, the antibody of interest is separated from the solid phase by elution.

b. b. Продуцирование антител с использованием эукариотических клеток-хозяевAntibody Production Using Eukaryotic Host Cells

Компонентами векторов обычно являются, но не ограничиваются ими, один или несколько из следующих компонентов: сигнальная последовательность, ориджин репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции. The components of the vectors are usually, but are not limited to, one or more of the following components: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence.

(i) Компонент сигнальная последовательность (i) Component signal sequence

Вектор, используемый в эукариотических клетках-хозяевах, может также содержать сигнальную последовательность или другой полипептид, имеющий специфический сайт расщепления у N-конца зрелого белка, или представляющий интерес полипептид. Выбранной гетерологичной сигнальной последовательностью предпочтительно является последовательность, которая распознается и процессируется (то есть отщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. Для экспрессии в клетках млекопитающих используются сигнальные последовательности млекопитающих, также вирусные секреторные лидерные последовательности, например сигнальная последовательность gD вируса простого герпеса.The vector used in eukaryotic host cells may also contain a signal sequence or other polypeptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein, or a polypeptide of interest. The selected heterologous signal sequence is preferably a sequence that is recognized and processed (i.e. cleaved by signal peptidase) by the host cell. For expression in mammalian cells, mammalian signal sequences are used, as well as viral secretory leader sequences, for example, the herpes simplex virus gD signal sequence.

ДНК для такой области предшественника лигируют с антитело-кодирующей ДНК с сохранением рамки считывания.The DNA for such a precursor region is ligated to the antibody coding DNA while maintaining the reading frame.

(ii) Ориджин репликации (ii) Origin of replication

Обычно такой компонент как ориджин репликации не является необходимым для экспрессионных векторов млекопитающих. Так, например, ориджин репликации SV40 обычно используется только потому, что он содержит ранний промотор.Typically, a component such as the origin of replication is not necessary for mammalian expression vectors. So, for example, the origin of SV40 replication is usually used only because it contains an early promoter.

(iii) Компонент селективный ген (iii) Component Selective Gene

Экспрессионный и клонирующий векторы могут содержать селективный ген, также называемый селективным маркером. Обычно селективные гены кодируют белки, которые (а) сообщают резистентность к антибиотиками или к другим токсинам, например к ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) компенсируют дефицит, обусловленный ауксотрофией, если это необходимо, или (с) обеспечивают доставку важных питательных веществ, которые не поступают из комплексных сред. The expression and cloning vectors may contain a selective gene, also called a selective marker. Typically, selective genes encode proteins that (a) show resistance to antibiotics or to other toxins, such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) compensate for the deficiency caused by auxotrophy, if necessary, or (c) provide important nutrient substances that do not come from complex environments.

Одним из примеров схемы отбора является использование лекарственного средства, прекращающего рост клетки-хозяина. Клетки, которые были успешно трансформированы гетерологичным геном, продуцируют белок, сообщающий резистентность к лекарственному средству и тем самым способствующий выживанию этих клеток в селективной среде. Для такого доминантного отбора могут быть использованы лекарственные средства, такие как неомицин, микофеноловая кислота и гигромицин.One example of a screening scheme is the use of a drug that stops the growth of a host cell. Cells that have been successfully transformed with a heterologous gene produce a protein that reports drug resistance and thereby contributes to the survival of these cells in a selective medium. For such dominant selection, drugs such as neomycin, mycophenolic acid and hygromycin can be used.

Другими примерами подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих являются маркеры, которые позволяют идентифицировать клетки, способные встраивать в свой геном антитело-кодирующую нуклеиновую кислоту, например такие маркеры, как ген DHFR, тимидинкиназы, металлотионеина-I и II, предпочтительно гены, кодирующие металлотионеин приматов, ген аденозин-дезаминазы, орнитин-декарбоксилазы и т.п. Other examples of suitable selective markers for mammalian cells are markers that allow the identification of cells capable of incorporating an antibody encoding nucleic acid into their genome, for example, markers such as the DHFR gene, thymidine kinases, metallothionein-I and II, preferably genes encoding primate metallothionein, adenosine deaminase gene, ornithine decarboxylase, etc.

Так, например, клетки, трансформированные селективным геном DHFR, сначала идентифицируют путем культивирования всех трансформантов в культуральной среде, содержащей метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Если используется DHFR дикого типа, то подходящей клеткой-хозяином является клеточная линия яичника китайского хомячка (СНО), дефицитная по DHFR-активности (например, АТСС СRL-9069).Thus, for example, cells transformed with the DHFR selective gene are first identified by culturing all transformants in culture medium containing methotrexate (Mtx), a competitive DHFR antagonist. If wild-type DHFR is used, then a suitable host cell is a Chinese hamster ovary (CHO) cell line deficient in DHFR activity (e.g., ATCC CL-9069).

Альтернативно клетки-хозяева (в частности, хозяева дикого типа, содержащие эндогенный DHFR), трансформированные или ко-трансформированные ДНК-последовательностями, кодирующими антитело, белок DHFR дикого типа и другой селективный маркер, такой как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (АРН), могут быть отобраны путем культивирования клеток в среде, содержащей агент для отбора по селективному маркеру, такой как аминогликозидный антибиотик, например канамицин, неомицин или G418. См. патент США № 4965199.Alternatively, host cells (in particular wild-type hosts containing endogenous DHFR) transformed or co-transformed with DNA sequences encoding an antibody, wild-type DHFR protein and another selective marker, such as aminoglycoside-3'-phosphotransferase (APH), can be selected by culturing cells in a medium containing a selective marker selection agent, such as an aminoglycoside antibiotic, for example kanamycin, neomycin or G418. See U.S. Patent No. 4,965,199.

(iv) Компонент промотор (iv) Component promoter

Экспрессионные и клонирующие векторы обычно содержат промотор, распознаваемый организмом-хозяином и функционально присоединенный к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид антитела. Промоторные последовательности, подходящие для эукариотов, известны специалистам. Фактически все гены эукариотов имеют АТ-богатую область, локализованную приблизительно в области, расположенной на 25-30 нуклеотидов выше от сайта инициации транскрипции. Другой такой последовательностью, локализованной приблизительно в области, расположенной на 70-80 нуклеотидов выше от сайта инициации транскрипции многих генов, является область CNCAAT, где N может означать любой нуклеотид (SEQ ID NO:60). У 3'-конца большинства эукариотических генов расположена последовательность ААТААА, которая может служить сигналом для присоединения poly A-хвоста к 3'-концу кодирующей последовательности (SEQ ID NO:61). Все указанные последовательности могут быть соответствующим образом встроены в эукариотические экспрессионные векторы. Expression and cloning vectors typically contain a promoter recognized by the host organism and operably linked to a nucleic acid encoding an antibody polypeptide. Promoter sequences suitable for eukaryotes are known to those skilled in the art. In fact, all eukaryotic genes have an AT-rich region, located approximately in the region located 25-30 nucleotides higher from the site of transcription initiation. Another such sequence, located approximately in the region located 70-80 nucleotides higher from the transcription initiation site of many genes, is the CNCAAT region, where N can be any nucleotide (SEQ ID NO: 60). At the 3 ′ end of most eukaryotic genes is the AATAAA sequence, which can serve as a signal to attach the poly A tail to the 3 ′ end of the coding sequence (SEQ ID NO: 61). All of these sequences can be appropriately inserted into eukaryotic expression vectors.

Транскрипция полипептидов антител из векторов, присутствующих в клетках-хозяевах млекопитающих, регулируется, например, промоторами, полученными из геномов таких вирусов, как полиомавирус, вирус оспы домашней птицы, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус коровьей папиломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и обезьяний вирус 40 (SV40); гетерологичными промоторами млекопитающих, например промотором актина или промотором иммуноглобулина; и промоторами белков теплового шока, при условии, что такие промоторы являются совместимыми с системами клеток-хозяев.The transcription of antibody polypeptides from vectors present in mammalian host cells is regulated, for example, by promoters derived from the genomes of viruses such as poliomavirus, poultry smallpox virus, adenovirus (such as adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus retrovirus, hepatitis B virus and monkey virus 40 (SV40); heterologous mammalian promoters, for example an actin promoter or an immunoglobulin promoter; and promoters of heat shock proteins, provided that such promoters are compatible with host cell systems.

Ранние и поздние промоторы вируса SV40 обычно получают в виде рестрикционного фрагмента SV40, который также содержит ориджин репликации вируса SV40. Предранний промотор человеческого цитомегаловируса обычно получают в виде рестрикционного HindIII-фрагмента Е. Система экспрессии ДНК в клетках-хозяевах млекопитающих, полученная на основе коровьего папиломавируса, используемого в качестве вектора, описана в патенте США № 4419446. Модификация этой системы описана в патенте США № 4601978. Альтернативно в качестве промотора может быть использован вирус саркомы Рауса, имеющий длинный концевой повтор.The early and late promoters of the SV40 virus are usually obtained as an SV40 restriction fragment, which also contains the SV40 origin of replication. The early early promoter of human cytomegalovirus is usually obtained in the form of a restriction HindIII fragment E. The DNA expression system in mammalian host cells, derived from bovine papillomavirus used as a vector, is described in US Pat. No. 4,419,446. A modification of this system is described in US Pat. No. 4,601,978. Alternatively, a Routh sarcoma virus having a long terminal repeat may be used as a promoter.

(v) Компонент энхансерный элемент (v) Component enhancer element

Транскрипция ДНК, кодирующей полипептид антитела согласно изобретению в высших эукариотах, часто усиливается при встраивании в вектор энхансерной последовательности. В настоящее время известно много энхансерных последовательностей, происходящих от генов млекопитающих (генов глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина). Однако обычно используется энхансер от вируса эукариотической клетки. Примерами являются энхансер вируса SV40, локализованный в поздней области ориджина репликации (100-270 п.н.), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомавируса, локализованный в поздней области ориджина репликации, и энхансеры адновируса. См. также публикацию Yaniv, Nature 297:17-18 (1982), в которой описаны энхансерные элементы для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть встроен в вектор в 5'- или 3'-положении по отношению к последовательности, кодирующей полипептид антитела, но предпочтительно чтобы он был локализован в 5'-положении от промотора.Transcription of DNA encoding an antibody polypeptide according to the invention in higher eukaryotes is often enhanced when an enhancer sequence is inserted into a vector. Currently, there are many enhancer sequences derived from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin genes). However, an enhancer from a eukaryotic cell virus is commonly used. Examples are the SV40 virus enhancer located in the late region of the origin of replication (100-270 bp), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyomavirus enhancer located in the late region of the replication origin, and adnovirus enhancers. See also Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982), which describes enhancer elements for activating eukaryotic promoters. An enhancer can be inserted into the vector at the 5'- or 3'-position with respect to the sequence encoding the antibody polypeptide, but it is preferable that it be located at the 5'-position from the promoter.

(vi) Компонент сайт терминации транскрипции (vi) Component transcription termination site

Экспрессионные векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах, обычно также содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно расположены со стороны 5'-конца, иногда со стороны 3'-конца от нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибированные в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслированной части мРНК, кодирующей антитело. В качестве такого компонента, как сайт терминации транскрипции, может быть использована область полиаденилирования коровьего гормона роста. См. заявку WO 94/11026 и имеющееся там описание экспрессионных векторов. The expression vectors used in eukaryotic host cells usually also contain the sequences needed to terminate transcription and to stabilize mRNA. Such sequences are usually located on the 5'-end, sometimes on the 3'-end of the untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the antibody. As a component, such as a transcription termination site, the polyadenylation region of bovine growth hormone can be used. See WO 94/11026 and the description of expression vectors therein.

(vii) Отбор и трансформация клеток-хозяев (vii) Selection and transformation of host cells

Клетками-хозяевами, подходящими для клонирования или экспрессии ДНК в вышеописанных векторах, являются описанные здесь клетки высших эукариотов, включая клетки-хозяева позвоночных. Размножение клеток позвоночных в культуре (в тканевой культуре) уже стало рутинной процедурой. Примерами подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих являются клеточная линия CV1 почек обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); клеточная линия почек человеческого эмбриона (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); клетки почек детеныша хомячка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); мышиные клетки Сертоли (ТM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почек собак (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени лабораторной крысы Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (HepG2, HB 8065); опухолевые клетки мышиной молочной железы (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annal N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC5; клетки FS4 и клеточная линия человеческой гепатомы (Hep G2). Host cells suitable for cloning or expression of DNA in the above vectors are higher eukaryotic cells described herein, including vertebrate host cells. Reproduction of vertebrate cells in culture (in tissue culture) has already become a routine procedure. Examples of suitable mammalian host cell lines are monkey transfected cell line CV1 transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonic kidney cell line (293 cells or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); hamster cub kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); Chinese hamster ovary cells / DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); Sertoli mouse cells (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); monkey kidney cells (CVCC ATCC CCL 70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); Buffalo laboratory rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (HepG2, HB 8065); murine mammary tumor cells (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mather et al., Annal N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC5 cells; FS4 cells and human hepatoma cell line (Hep G2).

Клетки-хозяева трансформируют вышеописанными экспрессионными или клонирующими векторами для продуцирования антитела и культивируют в подходящих питательных средах, модифицированных, если это необходимо, для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности.Host cells are transformed with the above expression or cloning vectors to produce antibodies and cultured in suitable growth media, modified, if necessary, to induce promoters, select transformants or amplify genes encoding the desired sequences.

(viii) Культивирование клеток-хозяев (viii) Cultivation of host cells

Клетки-хозяева, используемые для продуцирования антитела согласно изобретению, могут быть культивированы в различных средах. Средами, подходящими для культивирования клеток-хозяев, являются коммерчески доступные среды, такие как среда Хэмса F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ((МЕМ)(Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Sigma). Кроме того, в качестве культуральной среды для культивирования клеток-хозяев может быть использована любая среда, описанная в публикации Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), в патентах США №№ 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 или 5122469; в WO 90103430; в WO 87/00195 или в патенте США Re.№ 30985. В любую из этих сред могут быть добавлены, если это необходимо, гормоны и/или другие факторы роста (такие как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), соли (такие как хлорид натрия и фосфат кальция и магния), буферы (такие как HEPES), нуклеотиды (такие как аднозин и тимидин), антибиотики (такие как лекарственное средство гентамицин^ТМ), микроэлементы (определенные как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярных дозах) и глюкоза или эквивалентный источник энергии. Могут быть также включены любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, известных специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., аналогичны условиям, ранее используемым для экспрессии выбранных клеток-хозяев, и известны среднему специалисту в данной области.The host cells used to produce the antibodies of the invention can be cultured in various media. Media suitable for culturing host cells are commercially available media such as Hams F10 (Sigma), Minimum Support Medium ((MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) and Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) , Sigma). In addition, any medium described in Ham et al., Meth. Can be used as a culture medium for culturing host cells . Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), in US Pat. in WO 90103430; in WO 87/00195 or in US patent Re.No 30985. Hormones and / or other growth factors (such as insulin, transferrin or epidermal growth factor), salts (such as sodium chloride and calcium and magnesium phosphate), buffers (such as HEPES), nucleotides (such as adnosine and thymidine), antibiotics (such as the drug gentamicin ^TM ), trace elements (defined as inorganic compounds, usually present in final concentrations in micromolar doses ) and glucose or equivalent sources energy. Any other necessary additives may also be included at appropriate concentrations known to those skilled in the art. Culturing conditions, such as temperature, pH, and the like, are similar to those previously used to express selected host cells, and are known to one of ordinary skill in the art.

(ix) Очистка антитела (ix) Purification of antibodies

C применением техники рекомбинантных ДНК антитело может быть продуцировано внутри клеток либо оно может быть непосредственно секретировано в среду. Если в первой стадии антитело продуцируется внутри клеток, то затем клеточный дебрис или клетки-хозяева, или их лизированные фрагменты удаляют, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. Если антитело секретируется в среду, то обычно сначала концентрируют супернатанты, полученные из таких экспрессионных систем, с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например устройства для ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon®. Для ингибирования протеолиза в любой из предшествующих стадий может быть использован ингибитор протеазы, такой как PMSF, для предупреждения размножения случайно вносимых примесных микроорганизмов могут быть использованы антибиотики.Using recombinant DNA techniques, an antibody can be produced inside the cells or it can be directly secreted into the medium. If in the first stage the antibody is produced inside the cells, then the cell debris or host cells or their lysed fragments are removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. If the antibody is secreted into the medium, then supernatants obtained from such expression systems are usually first concentrated using a commercially available protein concentration filter, such as an Amicon or Millipore Pellicon® ultrafiltration device. A protease inhibitor such as PMSF can be used to inhibit proteolysis in any of the preceding steps, antibiotics can be used to prevent the propagation of randomly introduced impurity microorganisms.

Композиция антитела, полученная из клеток, может быть очищена, например, с помощью хроматографии на гидроксиаппатитах, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, при этом предпочтительным методом очистки является аффинная хроматография. Пригодность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, присутствующего в данном антителе. Белок А может быть использован для очистки антител, содержащих тяжелые цепи γ1, γ2 или γ4 человеческого иммуноглобулина (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Для всех мышиных изотипов и для человеческой цепи γ3 рекомендуется G-белок (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). В качестве матрицы, с которой связывается аффинный лиганд, наиболее часто используется агароза, но могут быть использованы и другие матрицы. Однако механически стабильные матрицы, такие как стекло с регулируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол, обеспечивают более высокую скорость потока и позволяют сократить время обработки, чем это может быть достигнуто с использованием агарозы. Если антитело содержит домен С_Н3, то для его очистки может быть использована смола Bakerbond ABX^TM (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.). В зависимости от выделяемого антитела могут быть также применены и другие методы очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, преципитация этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на двуокиси кремния, хроматография на гепарин-сефарозе^ТМ, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ и преципитация сульфатом аммония. The antibody composition obtained from the cells can be purified, for example, by hydroxyappatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis and affinity chromatography, with affinity chromatography being the preferred method of purification. The suitability of protein A as an affinity ligand depends on the type and isotype of any immunoglobulin Fc domain present in the antibody. Protein A can be used to purify antibodies containing heavy chains of human immunoglobulin γ1, γ2 or γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). For all murine isotypes and for the human γ3 chain, G protein is recommended (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). Agarose is most commonly used as the matrix to which the affinity ligand binds, but other matrices can be used. However, mechanically stable matrices, such as glass with an adjustable pore size or poly (styrene divinyl) benzene, provide a higher flow rate and can reduce processing time than can be achieved using agarose. If the antibody contains a C _H 3 domain, then Bakerbond ABX ^™ resin (JT Baker, Phillipsburg, NJ) can be used to purify it. Other methods of protein purification, such as fractionation on an ion exchange column, precipitation with ethanol, reverse phase HPLC, chromatography on silica, chromatography on heparin-Sepharose ^TM , chromatography on anion or cation exchange resin, can also be applied depending on the antibody to be isolated ( for example, on a column with polyaspartic acid), chromatofocusing, SDS-PAGE electrophoresis and precipitation with ammonium sulfate.

После проведения любой(ых) предварительной(ых) стадии(й) очистки смесь, содержащая представляющее интерес антитело и примеси, может быть подвергнута гидрофобной хроматографии при низком рН с использованием элюирующего буфера при рН примерно 2,5-4,5, предпочтительно при низкой концентрации соли (например, примерно 0-0,25 М). After any preliminary purification step (s), any mixture containing the antibody of interest and impurities can be subjected to hydrophobic chromatography at low pH using an elution buffer at a pH of about 2.5-4.5, preferably at low salt concentration (e.g., about 0-0.25 M).

ИммуноконъюгатыImmunoconjugates

Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгатам (которые являются синонимами терминов «конъюгаты антитело - лекарственное средство» или «ADC»), включающим любые из описанных здесь анти-DLL4-антител, конъюгированных с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, рост-ингибирующий агент, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагменты), или радиоактивный изотоп (то есть радиоактивный конъюгат). The present invention also relates to immunoconjugates (which are synonymous with the terms “antibody-drug conjugates” or “ADC”), including any of the anti-DLL4 antibodies described herein conjugated to a cytotoxic agent such as a chemotherapeutic agent, drug, growth an inhibitory agent, a toxin (e.g., an enzymatically active toxin of a bacterial, fungal, plant or animal origin or fragments thereof), or a radioactive isotope (i.e., a radioactive conjugate).

Использование конъюгатов “антитело - лекарственное средство” в целях местной доставки цитотоксических или цитостатических агентов, то есть лекарственных средств для уничтожения или подавления опухолевых клеток при лечении рака (Syrigos & Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz & Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172; патент США № 4975278), теоретически позволяет осуществлять направленную доставку лекарственного средства в опухоли и обеспечивать его аккумуляцию внутри клеток, тогда как системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств может приводить к продуцированию уровней токсичности, которые являются неприемлемыми для нормальных клеток, также недостаточными для опухолевых клеток, которые необходимо уничтожить (Baldwin et al., 1986, Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, 1985, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review” in Monoclonal Antobodies 84:Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506). Таким образом, желательно, чтобы максимальная эффективность сочеталась с минимальной токсичностью. Сообщалось, что в этих стратегиях могут быть использованы как поликлональные, так и моноклональные антитела (Rowland et al., 1986, Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). Лекарственными средствами, используемыми в этих способах, являются дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al., (1986), см. выше). Токсинами, используемыми в конъюгатах “антитело - токсин”, являются бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, и небольшие молекулы-токсины, такие как гельданамицин (Mandler et al., (2000) Jour of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (ЕР 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) и калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Токсины могут оказывать свое цитотоксическое и цитостатическое действие в соответствии с механизмами, включающими связывание с тубулином, связывание с ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства при их конъюгировании с крупными антителами или лигандами рецепторов белков имеют тенденцию к потере активности или уменьшению активности.Use of antibody-drug conjugates for the local delivery of cytotoxic or cytostatic agents, that is, drugs for killing or suppressing tumor cells in the treatment of cancer (Syrigos & Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz & Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26: 151-172; US Pat. No. 4,975,278), theoretically allows targeted delivery of the drug to the tumor and its accumulation within the cells, while systemic administration of these unconjugated drugs can lead to the production of toxicity levels that are unacceptable for normal cells, also insufficient for the tumor cells that need to be destroyed (Baldwin et al., 1986, Lancet pp. (Mar. 15, 1986): 603-05; Thorpe, 1985, “ Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review ”in Monoclonal Antobodies 84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (Eds.), Pp. 475-506). Thus, it is desirable that maximum effectiveness is combined with minimal toxicity. It has been reported that both polyclonal and monoclonal antibodies can be used in these strategies (Rowland et al., 1986, Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87). The drugs used in these methods are daunomycin, doxorubicin, methotrexate and vindesine (Rowland et al., (1986), see above). The toxins used in antibody-toxin conjugates are bacterial toxins such as diphtheria toxin, plant toxins such as ricin, and small toxin molecules such as geldanamycin (Mandler et al., (2000) Jour of the Nat. Cancer Inst . 92 (19): 1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791) , maytansinoids (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623) and calicheamicin (Lode et al. (1998) Cancer Res . 58: 2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). Toxins can exert their cytotoxic and cytostatic effects in accordance with mechanisms including binding to tubulin, binding to DNA, or inhibition of topoisomerase. Some cytotoxic drugs, when conjugated to large antibodies or protein receptor ligands, tend to lose activity or decrease activity.

Зевалин (Zevalin®) (ибритумомаб тиуксетан, Biogen/Idec) представляет собой конъюгат “антитело - радиоизотоп”, состоящий из мышиного моноклонального антитела IgG1-каппа, направленного против антигена CD20, присутствующего на поверхности нормальных и злокачественных В-лимфоцитов, и радиоактивных изотопов ¹¹¹In или ⁹⁰Y, связанных с хелатообразующим комплексом “тиомочевина - линкер” (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Хотя зевалин обладает активностью против В-клеточной не-ходжкинской лимфомы (НХЛ), однако, его введение приводит к тяжелой и хронической цитопении у большинства пациентов. В 2000 г. было получено разрешение на применение препарата милотарг (Mylotarg^ТМ (гемтузумаб озогамицин, Wyeth Pharmacеuticals), то есть конъюгата “антитело - лекарственное средство”, состоящего из антитела против человеческого CD33, связанного с калихеамицином, для лечения острого миелоидного лейкоза путем инъекции указанного препарата (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; патенты США №№ 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Кантузумаб мертанзин (Immunogen, Inc.), конъюгат “антитело - лекарственное средство”, состоящий из антитела против человеческого CD42, связанного посредством дисульфидного линкера SРР с майтанзиноидным лекарственным средством, DM1, был использован в испытаниях фазы II для лечения раковых опухолей, экспрессирующих СаnAg, таких как раковые опухоли толстой кишки, поджелудочной железы, желудка и т.п. MLN-2704 (Millenium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), конъюгат “антитело - лекарственное средство”, состоящий из моноклонального антитела против мембраносвязанного антигена предстательной железы (PSMA), присоединенного к майтанзиноидному лекарственному средству, DМ1, находится на стадии исследования его возможного применения для лечения опухолей предстательной железы. Ауристатиновые пептиды, ауристатин E (AE) и монометилауристатин (MMAE), синтетические аналоги доластатина, были конъюгированы с химерными моноклональными антителами cBR96 (специфичными к антигену Lewis Y на карциномах) и cAC10 (специфичным к CD30 на гематологических злокачественных опухолях) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) и находятся на стадии разработки терапевтических средств.Zevalin (Zevalin®) (ibritumab tiuksetan, Biogen / Idec) is an antibody-radioisotope conjugate consisting of a mouse monoclonal antibody IgG1-kappa directed against the CD20 antigen present on the surface of normal and malignant B-lymphocytes and ¹¹¹ radioactive isotopes In or ⁹⁰ Y associated with the thiourea-linker chelating complex (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7): 766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99 (12 ): 4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10): 2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol . 20 (15): 3262-69) . Although zevalin has activity against B-cell non-Hodgkin lymphoma (NHL), however, its administration leads to severe and chronic cytopenia in most patients. In 2000, permission was granted to use the drug Mylotarg (Mylotarg ^TM (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals), that is, the antibody-drug conjugate consisting of an anti-human CD33 antibody bound to calicheamicin for the treatment of acute myeloid leukemia by injection of the specified drug ( Drugs of the Future (2000) 25 (7): 686; US Pat. - drug ”, consisting of antibodies against human CD42, linked posre Using a disulfide linker, CPP with a maytansinoid drug, DM1, was used in phase II trials for the treatment of cancers expressing CanAg, such as cancers of the colon, pancreas, stomach, etc. MLN-2704 (Millenium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), an antibody-drug conjugate consisting of a monoclonal antibody against a membrane-bound prostate antigen (PSMA) attached to a maytansinoid drug, DM1, is under investigation for its possible Menenius for treating prostate tumors. Auristatin peptides, auristatin E (AE) and monomethylauristatin (MMAE), synthetic dolastatin analogues, were conjugated to chimeric monoclonal antibodies cBR96 (specific for Lewis Y antigen on carcinomas) and cAC10 (specific for CD30 on hematologic (malignant tumors 2003) Nature Biotechnology 21 (7): 778-784) and are at the developmental stage of therapeutic agents.

Химиотерапевтические средства, используемые для получения иммуноконъюгатов, описаны в настоящей заявке (например, выше). Ферментативно активными токсинами и их фрагментами, которые могут быть использованы для этих целей, являются А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (от Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белка диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, заявку WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 года. Для продуцирования радиоактивно конъюгированных антител могут быть использованы различные радионуклиды. Примерами таких радионуклидов являются ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического лекарственного средства получают с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Так, например, иммунотоксин рицин может быть получен как описано в публикации Vitetta et al. Science, 238:1098 (1987). ¹⁴С-меченая 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (МХ-DTPA) является репрезентативным хелатообразующим агентом для конъюгирования радионуклида с антителом. См. WO 94/11026.Chemotherapeutic agents used to prepare immunoconjugates are described herein (e.g., above). Enzymatically active toxins and their fragments that can be used for these purposes are diphtheria toxin A-chain, non-binding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A-chain (from Pseudomonas aeruginosa ), ricin A-chain, abrin A-chain, A- modecine chain, alpha-sarcinol, Aleurites fordii proteins, diantin protein, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII and PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcine, crotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocycin eritin, phenomycin . See, for example, WO 93/21232, published October 28, 1993. Various radionuclides can be used to produce radioactively conjugated antibodies. Examples of such radionuclides are ²¹² Bi, ¹³¹ I, ¹³¹ In, ⁹⁰ Y and ¹⁸⁶ Re. Antibody and cytotoxic drug conjugates are prepared using various bifunctional protein binding agents, such as N-succinimidyl-3- (2-pyridylthiol) propionate (SPDP), iminothiolan (IT), bifunctional imidoester derivatives (such as dimethyl adipimidate-HCl) active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) ethylenediamine), diisocyanates So e as toluene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene). Thus, for example, ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al. Science, 238: 1098 (1987). ¹⁴ C-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminopentaacetic acid (MX-DTPA) is a representative chelating agent for conjugating a radionuclide with an antibody. See WO 94/11026.

В настоящем изобретении также рассматриваются конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтанзиноиды, доластатины, ауристатины, трихотецен и СС1065, и производные этих токсинов, обладающие токсической активностью. The present invention also contemplates conjugates of an antibody and one or more low molecular weight toxins, such as calicheamicin, maytansinoids, dolastatins, auristatins, trichothecene and CC1065, and derivatives of these toxins having toxic activity.

i. Майтанзин и майтанзиноидыi. Maytansin and maytansinoids

В одном из вариантов изобретения иммуноконъюгат содержит антитело (полноразмерное антитело или его фрагменты) согласно изобретению, конъюгированное с одной или несколькими молекулами майтанзиноида.In one embodiment of the invention, the immunoconjugate comprises an antibody (full length antibody or fragments thereof) according to the invention conjugated to one or more maytansinoid molecules.

Майтанзиноиды представляют собой митотические ингибиторы, которые действуют посредством ингибирования полимеризации тубулина. Майтанзин был впервые выделен у восточно-африканской землеройки Maytenus serrata (патент США № 3896111). Затем было обнаружено, что некоторые микробы также продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и сложные эфиры С-3-майтанзинола (патент США № 4151042). Синтетический майтанзинол и его производные и аналоги описаны, например, в патентах США №№ 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 и 4371533. Maytansinoids are mitotic inhibitors that act by inhibiting tubulin polymerization. Maytansine was first isolated from the East African shrew Maytenus serrata (US patent No. 3896111). It was then discovered that some microbes also produce maytansinoids, such as maytansinol and C-3-maytansinol esters (US Pat. No. 4,151,042). Synthetic maytansinol and its derivatives and analogues are described, for example, in US patent No. 4137230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4322348; 4,331,598; 4,316,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4362663 and 4371533.

Молекулы майтанзиноидных лекарственных средств являются привлекательными молекулами лекарственных средств для использования в конъюгатах «антитело - лекарственное средство», поскольку они (i) могут быть относительно легко получены путем ферментации или химической модификации и дериватизации продуктов ферментации, (ii) являются пригодными для дериватизации функциональными группами, подходящими для конъюгирования посредством присоединения не-дисульфидных линкеров к антителам, (iii) являются стабильными в плазме и (iv) являются эффективными против различных опухолевых клеточных линий. Maytansinoid drug molecules are attractive drug molecules for use in antibody-drug conjugates since they (i) can be relatively easily prepared by fermentation or chemical modification and derivatization of fermentation products, (ii) functional groups suitable for derivatization, suitable for conjugation by attaching non-disulfide linkers to antibodies, (iii) are stable in plasma and (iv) are effective waged against various tumor cell lines.

Иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноиды, способы их получения и их терапевтическое применение, описаны, например, в патентах США №№ 5208020, 5416064 и в Европейском патенте ЕР 0425235В1, которые во всей своей полноте вводятся в настоящую заявку посредством ссылки. В публикации Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:8618-8623 (1996) описаны иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноид, обозначенный DМ1, который был связан с моноклональным антителом С242, направленным против рака ободочной кишки человека. Было обнаружено, что указанный конъюгат является в высокой степени цитотоксичным для культивированных раковых клеток толстой кишки и обладает противоопухолевой активностью в анализе на рост опухоли in vivo. В публикации Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) описаны иммуноконъюгаты, в которых майтанзиноид был конъюгирован посредством дисульфидного линкера с мышиным антителом А7, связывающимся с антигеном, присутствующим на клеточных линиях рака толстой кишки человека, или с другим мышиным моноклональным антителом ТА.1, которое связывается с онкогеном HER-2/neu. Цитотоксичность конъюгата «ТА.1-майтанзиноид» была протестирована in vitro на клеточной линии рака молочной железы человека SК-ВR-3, которая экспрессирует 3×10⁵ поверхностных антигенов HER-2 на клетку. Этот конъюгат лекарственного средства достигал степени цитотоксичности, аналогичной цитотоксичности свободного майтанзиноидного лекарственного средства, и такая цитотоксичность может быть повышена путем увеличения числа молекул майтанзиноида на молекулу антитела. Конъюгат “А7-майтанзиноид” обнаруживал низкую системную цитотоксичность у мышей.Immunoconjugates containing maytansinoids, methods for their preparation and their therapeutic use are described, for example, in US patents Nos. 5208020, 5416064 and in European patent EP 0425235B1, which in their entirety are incorporated into this application by reference. In the publication of Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93: 8618-8623 (1996) describes immunoconjugates containing a maytansinoid designated DM1 that has been coupled to a C242 monoclonal antibody directed against human colon cancer. It was found that the conjugate is highly cytotoxic for cultured colon cancer cells and has antitumor activity in an in vivo tumor growth assay. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describe immunoconjugates in which a maytansinoid is conjugated by a disulfide linker to a murine antibody A7 that binds to an antigen present on human colon cancer cell lines or another murine TA.1 monoclonal antibody, which binds to the HER-2 / neu oncogen. The cytotoxicity of the TA.1-maytansinoid conjugate was tested in vitro on the human breast cancer cell line SK-BR-3, which expresses 3 × 10 ⁵ HER-2 surface antigens per cell. This drug conjugate achieved a degree of cytotoxicity similar to that of the free maytansinoid drug, and such cytotoxicity can be enhanced by increasing the number of maytansinoid molecules per antibody molecule. The conjugate “A7-maytansinoid” showed low systemic cytotoxicity in mice.

Конъюгаты “антитело - майтанзиноид” получают путем химического связывания антитела с молекулой майтанзиноида, где указанное связывание не приводит к значительному снижению биологической активности антитела или молекулы майтанзиноида. См., например, патент США №5208020 (который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). Молекулы майтанзиноида, присутствующие в данном конъюгате, в среднем в количестве 3-4 молекулы на одну молекулу антитела, обнаруживают эффективность в повышении цитотоксичности по отношению к клеткам-мишеням, но при этом не оказывают негативного влияния на функцию или растворимость антитела, хотя предполагается, что даже одна молекула токсина на антитело по сравнению с неконъюгированным антителом будет повышать цитотоксичность конъюгата. Майтанзиноиды хорошо известны специалистам и могут быть синтезированы известными методами, либо они могут быть выделены из природных источников. Подходящие майтанзиноиды описаны, например, в патенте США № 5208020 и в других патентах и в непатентных публикациях, описанных выше. Предпочтительными майтанзиноидами являются майтанзинол и аналоги майтанзинола, имеющие модификации в ароматическом кольце или в других положениях молекулы майтанзинола, такие как различные сложные эфиры майтанзинола.Antibody-maytansinoid conjugates are prepared by chemically binding an antibody to a maytansinoid molecule, wherein said binding does not significantly reduce the biological activity of the antibody or maytansinoid molecule. See, for example, US patent No. 5208020 (which in its entirety is introduced into the present description by reference). The maytansinoid molecules present in this conjugate, on average, in the amount of 3-4 molecules per antibody molecule, show effectiveness in increasing cytotoxicity with respect to target cells, but do not adversely affect the function or solubility of the antibody, although it is assumed that even one toxin molecule per antibody, compared to an unconjugated antibody, will increase the cytotoxicity of the conjugate. Maytansinoids are well known in the art and can be synthesized by known methods, or they can be isolated from natural sources. Suitable maytansinoids are described, for example, in US Pat. No. 5,208,020 and in other patents and non-patent publications described above. Preferred maytansinoids are maytansinol and maytansinol analogues having modifications in the aromatic ring or at other positions of the maytansinol molecule, such as various maytansinol esters.

Для создания конъюгатов «антитело - майтанзиноид» может быть использовано множество линкерных групп, известных специалистам, включая, например, группы, описанные в патенте США № 5208020 или в Европейском патенте ЕР 0425235В1, и в публикации Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) и в заявке на патент США № 10/960602, поданной 8 октября 2004, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Конъюгаты «антитело - майтанзиноид», содержащие линкерный компонент SMCC, могут быть получены как описано в заявке на патент США № 10/960602, поданной 8 октября 2004 года. Линкерными группами являются дисульфидные группы, тиоэфирные группы, группы, чувствительные к воздействию кислоты, фотохимически неустойчивые группы, группы, чувствительные к действию пептидазы, или группы, чувствительные к действию эстеразы, описанные в вышеупомянутых патентах, при этом предпочтительными являются дисульфидные и тиоэфирные группы. Дополнительные линкерные группы описаны и проиллюстрированы в настоящей заявке.Many linker groups known to those skilled in the art can be used to create antibody-maytansinoid conjugates, including, for example, the groups described in US Pat. No. 5,208,020 or in European Patent EP 0425235B1, and in Chari et al., Cancer Research 52: 127 -131 (1992) and U.S. Patent Application No. 10/960602, filed Oct. 8, 2004, which are hereby incorporated by reference in their entirety. Antibody-maytansinoid conjugates containing the linker component of SMCC can be prepared as described in US Patent Application No. 10/960602, filed October 8, 2004. Linker groups are disulfide groups, thioether groups, acid sensitive groups, photochemically unstable groups, peptidase sensitive groups, or esterase sensitive groups described in the aforementioned patents, with disulfide and thioether groups being preferred. Additional linker groups are described and illustrated in this application.

Конъюгаты “антитело - майтанзиноид” могут быть получены с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Особенно предпочтительными связывающими агентами для создания дисульфидной связи являются N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPР).Antibody-maytansinoid conjugates can be prepared using various bifunctional protein binding agents, such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), iminothiolan (IT), bifunctional imidoester derivatives (such as dimethyl adipimidate-HCl), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azido-compounds (such as bis (p-azidene) bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-d azoniybenzoil) -ethylenediamine), diisocyanates (such as toluene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene). Particularly preferred binding agents for creating a disulfide bond are N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 [1978]) and N-succinimidyl-4- (2-pyridylthio) pentanoate (SPP).

Линкер может быть присоединен к молекуле майтанзиноида в различных положениях в зависимости от типа связи. Так, например, сложноэфирная связь может быть образована посредством реакции с гидроксильной группой стандартными методами связывания. Такая реакция может осуществляться в положении С-3, имеющем гидроксильную группу, в положении С-14, модифицированном гидроксиметилом, в положении С-15, модифицированном гидроксильной группой, и в положении С-20, имеющем гидроксильную группу. В предпочтительном варианте изобретения указанная связь образуется в положении С-3 майтанзинола или его аналога.The linker can be attached to the maytansinoid molecule in various positions depending on the type of bond. For example, an ester bond can be formed by reaction with a hydroxyl group by standard coupling methods. Such a reaction can be carried out at position C-3 having a hydroxyl group, at position C-14 modified with hydroxymethyl, at position C-15 modified with a hydroxyl group, and at position C-20 having a hydroxyl group. In a preferred embodiment of the invention, said bond is formed at the C-3 position of maytansinol or its analogue.

ii. Ауристатины и доластатины ii. Auristatins and Dolastatins

В некоторых вариантах изобретения иммуноконъюгат содержит антитело согласно изобретению, конъюгированное с доластатинами или с пептидными аналогами доластатина и их производными, также с ауристатинами (патенты США №№ 5635483, 5780588). Было обнаружено, что доластатины и ауристатины негативно влияют на динамику образования микротрубочек, гидролиз GTP и деление ядер и клеток (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584), и обладают противораковой (патент США 5663149) и противогрибковой активностью (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Молекулы доластатиновых или ауристатиновых лекарственных средств могут быть присоединены к антителу у N(амино)-конца или у С(карбокси)-конца молекулы пептидного лекарственного средства (WO 02/088172).In some embodiments of the invention, the immunoconjugate comprises an antibody of the invention conjugated to dolastatins or to peptide analogs of dolastatin and their derivatives, also to auristatins (US Pat. Nos. 5,635,483, 5,780,588). It was found that dolastatins and auristatins adversely affect the dynamics of microtubule formation, GTP hydrolysis, and nuclear and cell fission (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584) and have anti-cancer (US Pat. 5663149) and antifungal activity (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965). Molecules of dolastatin or auristatin drugs can be attached to the antibody at the N (amino) end or C (carboxy) end of the peptide drug molecule (WO 02/088172).

Репрезентативными вариантами ауристатина являются молекулы лекарственного средства, содержащие присоединенный к N-концу монометилауристатин, DE и DF, и описанные в заявке на патент США рег. № 10/983340, озаглавленной «Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands” и поданной 5 ноября, 2004 года, где описание указанной заявки во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Representative variants of auristatin are drug molecules containing monomethylauristatin, DE and DF attached to the N-terminus, and are described in US Pat. No. 10/983340, entitled "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" and filed November 5, 2004, where the description of this application in its entirety is incorporated into this description by reference.

Обычно пептидные молекулы лекарственного средства могут быть получены путем образования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи могут быть образованы, например, методом синтеза в жидкой фазе (см. E. Schröder and K. Lübke, “The Peptides”, volume 1, pp.76-136, 1965, Academic Press), хорошо известным специалистам в области пептидного синтеза. Молекулы ауристатиновых/доластатиновых лекарственных средств могут быть получены методами, описанными в патентах США №№5635483 и 5780588; и в публикациях Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Аnti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; and Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863. См., также публикацию Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784; и заявку на патент США рег. № 10/983340, озаглавленную «Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands» и поданную 5 ноября, 2004 года, где указанная заявка во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки (в данной заявке описаны, например, линкеры и методы получения монометилвалиновых соединений, таких как MMAE и MMAF, конъюгированных с линкерами).Typically, peptide molecules of a drug can be prepared by forming a peptide bond between two or more amino acids and / or peptide fragments. Such peptide bonds can be formed, for example, by liquid-phase synthesis (see E. Schröder and K. Lübke, “The Peptides”, volume 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press), well known to those skilled in the art peptide synthesis. Auristatin / dolastatin drug molecules can be prepared by methods described in US Pat. Nos. 5,635,483 and 5,780,588; and Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, GR, et al. Synthesis , 1996, 719-725; and Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5: 859-863. See also Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21 (7): 778-784; and US Patent Application Reg. No. 10/983340, entitled "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" and filed November 5, 2004, where this application is hereby incorporated by reference in its entirety (this application describes, for example, linkers and methods for producing monomethyl valine compounds such as MMAE and MMAF conjugated to linkers).

iii. Калихеамицин iii. Calicheamicin

В других вариантах изобретения иммуноконъюгат содержит антитело согласно изобретению, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Антибиотики семейства калихеамицинов способны продуцировать двухцепочечные ДНК-разрывы в субпикомолярных концентрациях. Описание получения конъюгатов семейства калихеамицинов можно найти в патентах США №№ 5712354, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5977296 (все патенты принадлежат компании American Cyanamid Company). Структурными аналогами калихеамицина, которые могут быть использованы в этих целях, являются, но не ограничиваются ими, γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-ацетил-γ₁ ^I, PSAG и θ₁ ^I (см. Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) и вышеупомянутые патенты США, принадлежащие компании American Cyanamid). Другим противоопухолевым лекарственным средством, с которым может быть конъюгировано антитело, является средство QFA, которое представляет собой антифолат. Калихеамицин и QFA имеют внутриклеточные активные сайты и с трудом проходят через плазматическую мембрану. Поэтому поглощение этих агентов клетками путем интернализации, опосредуемой антителом, приводит к значительному усилению их цитотоксических эффектов.In other embodiments, the immunoconjugate comprises an antibody of the invention conjugated to one or more calicheamicin molecules. Antibiotics of the calicheamicin family are capable of producing double-stranded DNA breaks in subpicomolar concentrations. A description of the preparation of calicheamicin family conjugates can be found in US Pat. Nos. 5,712,354, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5977296 (all patents are owned by American Cyanamid Company). Structural analogues of calicheamicin that can be used for this purpose include, but are not limited to, γ ₁ ^I , α ₂ ^I , α ₃ ^I , N-acetyl-γ ₁ ^I , PSAG, and θ ₁ ^I (see Hinman et al ., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) and the aforementioned U.S. patents owned by American Cyanamid). Another antitumor drug with which the antibody can be conjugated is a QFA, which is an antifolate. Calicheamicin and QFA have intracellular active sites and hardly pass through the plasma membrane. Therefore, the absorption of these agents by cells through internalization mediated by the antibody leads to a significant increase in their cytotoxic effects.

iv. Другие цитотоксические средства iv. Other cytotoxic agents

Другими противоопухолевыми средствами, которые могут быть конъюгированы с антителами согласно изобретению, являются ВСNU, стрептозоцин, винкристин и 5-фторурацил, семейство агентов, известных под общим названием комплекс LL-Е33288, описанный в патентах США №№ 5053394, 5770710, также эсперамицины (патент США № 5877296).Other antitumor agents that can be conjugated to antibodies of the invention are BCNU, streptozocin, vincristine and 5-fluorouracil, a family of agents known collectively as the LL-E33288 complex described in US Pat. Nos. 5,053,394, 5,770,710, and also esperamycins (patent US No. 5877296).

Ферментативно активными токсинами и их фрагментами, которые могут быть использованы в этих целях, являются А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (от Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белка диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, заявку WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 года.Enzymatically active toxins and their fragments that can be used for this purpose are diphtheria toxin A-chain, non-binding active diphtheria toxin fragments, exotoxin A-chain (from Pseudomonas aeruginosa ), ricin A-chain, abrin A-chain, A- modecine chain, alpha-sarcinol, Aleurites fordii proteins, Diantin protein, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII and PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcine, crotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocycin eritin, phenomycin . See, for example, WO 93/21232, published October 28, 1993.

В настоящем изобретении также рассматривается иммуноконъюгат, образуемый антителом и соединением, обладающим нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКазой).The present invention also contemplates an immunoconjugate formed by an antibody and a compound having nucleolytic activity (e.g., ribonuclease or DNA endonuclease, such as deoxyribonuclease; DNase).

Для селективной деструкции опухоли может быть использовано антитело, которое может содержать высокорадиоактивный атом. Для продуцирования радиоактивно конъюгированных антител могут быть использованы различные радиоактивные изотопы. Примерами таких радионуклидов являются ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ³²Р, ²¹²Рb и радиоактивные изотопы Lu. Если указанный конъюгат используется для детекции, то он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например ^99mТс или ¹²³I, или спин-метку для визуализации методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (известной так же как МР-визуализация, МРВ), такую как иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.For selective destruction of the tumor, an antibody can be used that may contain a highly radioactive atom. Various radioactive isotopes can be used to produce radioactively conjugated antibodies. Examples of such radionuclides are ²¹¹ At, ¹³¹ I, ¹²⁵ I, ⁹⁰ Y, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ¹⁵³ Sm, ²¹² Bi, ³² P, ²¹² Pb and radioactive isotopes Lu. If the indicated conjugate is used for detection, it may contain a radioactive atom for scintigraphic studies, for example ^99m Tc or ¹²³ I, or a spin tag for imaging by nuclear magnetic resonance (NMR) (also known as MR imaging, MRI), such as iodine-123, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.

Радиоактивные или другие метки могут быть включены в конъюгат известными методами. Так, например, пептид может быть синтезирован биологическими методами либо он может быть синтезирован методом химического синтеза аминокислот с использованием подходящих аминокислотных предшественников, включающих, например, фтор-19 вместо водорода. Такие метки, как ^99mТс или ¹²³I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re и ¹¹¹In, могут быть присоединены посредством цистеинового остатка пептида. Иттрий-90 может быть присоединен посредством лизинового остатка. Для введения иода-123 может быть применен метод IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57). Другие методы подробно описаны в публикации «Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989).Radioactive or other labels may be incorporated into the conjugate by known methods. For example, a peptide can be synthesized by biological methods or it can be synthesized by chemical synthesis of amino acids using suitable amino acid precursors, including, for example, fluorine-19 instead of hydrogen. Labels such as ^99m Tc or ¹²³ I, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re and ¹¹¹ In can be attached via the cysteine residue of the peptide. Yttrium-90 may be attached via a lysine residue. For the introduction of iodine-123, the IODOGEN method (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) can be used. Other methods are described in detail in Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989).

Конъюгаты антитела и цитотоксического лекарственного средства могут быть получены с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Так, например, иммунотоксин рицин может быть получен как описано в публикации Vitetta et al. Science, 238:1098 (1987). ¹⁴С-меченая 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (МХ-DTPA) является репрезентативным хелатообразующим агентом для конъюгирования радионуклида с антителом. См. WO 94/11026. Линкером может быть “отщепляемый линкер”, облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Так, например, могут быть использованы линкеры, чувствительные к воздействию кислоты; линкеры, чувствительные к действию пептидазы, фотохимически неустойчивые линкеры, диметиловые линкеры или дисульфидсодержащие линкеры (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992), патент США № 5208020).Antibody and cytotoxic drug conjugates can be prepared using various bifunctional protein binding agents, such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), iminothiolan (IT), bifunctional imidoester derivatives (such as dimethyl adipimidate-HCl), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azido-compounds (such as bis (p-azidebenzene) derivatives bis iazoniya (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as toluene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene). Thus, for example, ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al. Science , 238: 1098 (1987). ¹⁴ C-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminopentaacetic acid (MX-DTPA) is a representative chelating agent for conjugating a radionuclide with an antibody. See WO 94/11026. The linker may be a “cleavable linker” that facilitates the release of the cytotoxic drug in the cell. For example, acid sensitive linkers may be used; peptidase-sensitive linkers, photochemically unstable linkers, dimethyl linkers or disulfide-containing linkers (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992), US patent No. 5208020).

Соединениями, специально рассматриваемыми в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, ADC, полученные с использованием перекрестносвязывающих реагентов, таких как BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, поставляются фирмой Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., USA). См. руководство по применению и каталог (Application Handbook and Catalog), 2003-2004, стр. 467-498.Compounds specifically contemplated by the present invention include, but are not limited to, ADCs prepared using crosslinking reagents such as BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB , SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB and SVSB (succinimidyl- (4-vinyl sulfone) benzoate), which are commercially available (e.g. available from Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., USA). See Application Handbook and Catalog, 2003-2004, pp. 467-498.

v. Получение конъюгатов “антитело - лекарственное средство”v. Obtaining conjugates “antibody - drug”

В конъюгатах “антитело - лекарственное средство” (ADC) согласно изобретению антитело (Ab) конъюгировано с одной или с несколькими молекулами лекарственного средства (D) посредством линкера (L), где, например, на одну молекулу антитела приходится примерно от 1 до 20 молекул лекарственного средства. Конъюгаты ADC формулы I могут быть получены несколькими способами, предусматривающими проведение реакций органического химического синтеза с использованием условий и реагентов, известных специалистам, где указанные способы включают: (1) реакцию взаимодействия нуклеофильной группы антитела с двухвалентным линкерным реагентом с образованием Ab-L посредством ковалентной связи, затем реакцию взаимодействия с молекулой лекарственного средства D; и (2) реакцию взаимодействия нуклеофильной группы молекулы лекарственного средства с двухвалентным линкерным реагентом с образованием D-L посредством ковалентной связи, затем реакцию взаимодействия с нуклеофильной группой антитела. Дополнительные методы получения ADC описаны ниже:In the antibody-drug conjugates (ADC) of the invention, the antibody (Ab) is conjugated to one or more molecules of the drug (D) via a linker (L), where, for example, from about 1 to 20 molecules per antibody molecule medicinal product. The ADC conjugates of formula I can be obtained in several ways, involving organic chemical synthesis reactions using conditions and reagents known to those skilled in the art, wherein said methods include: (1) reacting an antibody nucleophilic group with a divalent linker reagent to form Ab-L via a covalent bond , then the reaction of interaction with the drug molecule D; and (2) a reaction of interaction of a nucleophilic group of a drug molecule with a divalent linker reagent to form D-L via a covalent bond, then a reaction of interaction with a nucleophilic group of an antibody. Additional methods for producing ADC are described below:

Ab-(L-D)_р (I)Ab- (LD) _p (I)

Линкер может состоять из одного или более линкерных компонентов. Репрезентативными примерами линкерных компонентов являются 6-малеимидокапроил («MC»), малеимидопропаноил («MP»), валин-цитруллин («val-cit»), аланин-фенилаланин («ala-phe»), п-аминобензилоксикарбонил («PAB»), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат («SPP»), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат («SMCC») и N-сукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоат («SIAB»). Специалистам известны и другие линкерные компоненты, некоторые из которых описаны в настоящей заявке. См., также заявку на патент США рег. № 10/983340, озаглавленную «Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands» и поданную 5 ноября, 2004 года, где указанная заявка во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. The linker may consist of one or more linker components. Representative examples of linker components are 6-maleimidocaproyl ("MC"), maleimidopropanoyl ("MP"), valine-citrulline ("val-cit"), alanine-phenylalanine ("ala-phe"), p-aminobenzyloxycarbonyl ("PAB" ), N-succinimidyl-4- (2-pyridylthio) pentanoate ("SPP"), N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate ("SMCC") and N-succinimidyl- (4-iodoacetyl ) aminobenzoate ("SIAB"). Other linker components are known to those skilled in the art, some of which are described herein. See also US patent application reg. No. 10/983340, entitled "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" and filed November 5, 2004, where this application is in its entirety incorporated herein by reference.

В некоторых вариантах изобретения линкер может содержать аминокислотные остатки. Репрезентативными аминокислотными линкерными компонентами являются дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Репрезентативными дипептидами являются валин-цитруллин (vc или val-cit) и аланин-фенилаланин (af или ala-phe). Репрезентативными трипептидами являются глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотными остатками, входящими в состав аминокислотного линкерного компонента, являются природные аминокислотные остатки, также небольшие аминокислоты и не-природные аминокислотные аналоги, такие как цитруллин. Аминокислотные линкерные компоненты могут быть сконструированы и оптимизированы по их селективности в отношении ферментативного расщепления конкретными ферментами, например опухоль-ассоциированной протеазой, катепсином В, C и D или плазминовой протеазой. In some embodiments of the invention, the linker may contain amino acid residues. Representative amino acid linker components are a dipeptide, tripeptide, tetrapeptide or pentapeptide. Representative dipeptides are valine-citrulline (vc or val-cit) and alanine-phenylalanine (af or ala-phe). Representative tripeptides are glycine-valine-citrulline (gly-val-cit) and glycine-glycine-glycine (gly-gly-gly). The amino acid residues that make up the amino acid linker component are natural amino acid residues, also small amino acids and non-natural amino acid analogues, such as citrulline. Amino acid linker components can be designed and optimized for their selectivity for enzymatic cleavage by specific enzymes, for example, tumor-associated protease, cathepsin B, C and D or plasmin protease.

Нуклеофильными группами, присутствующими на антителах, являются, но не ограничиваются ими: (i) N-концевые аминогруппы, (ii) аминогруппы боковой цепи, например лизина, (iii) тиоловые группы боковой цепи, например цистеина, и (iv) гидроксильные или аминогруппы сахаров, где указанное антитело является гликозилированным. Аминогруппы, тиольные группы и гидроксильные группы являются нуклеофильными и могут подвергаться реакции взаимодействия с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных молекулах или линкерных реагентах, включая: (i) активные сложные эфиры, такие как NНS-эфиры, HOBt-эфиры, галогенформиаты и галегенангидриды кислот; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы. Некоторые антитела имеют восстанавливаемые межцепьевые дисульфиды, то есть цистеиновые мостики. Для конъюгирования с линкерными реагентами антитела могут быть сделаны реакционноспособными путем их обработки восстановителем, таким как DТТ (дитиотреитол). Каждый цистеиновый мостик теоретически может образовывать два реакционноспособных тиоловых нуклеофила. В антитела могут быть введены дополнительные нуклеофильные группы посредством реакции взаимодействия лизинов с 2-иминотиоланом (реагентом Траута), что будет приводить к превращению амина в тиол. Реакционноспособные тиоловые группы могут быть включены в антитело (или его фрагмент) путем введения одного, двух, трех, четырех или более цистеиновых остатков (например, получения мутантных антител, содержащих один или несколько неприродных цистеиновых аминокислотных остатков).The nucleophilic groups present on antibodies are, but are not limited to: (i) N-terminal amino groups, (ii) side chain amino groups, e.g. lysine, (iii) side chain thiol groups, e.g. cysteine, and (iv) hydroxyl or amino groups sugars, where the specified antibody is glycosylated. Amino groups, thiol groups, and hydroxyl groups are nucleophilic and can undergo an interaction reaction to form covalent bonds with electrophilic groups on linker molecules or linker reagents, including: (i) active esters, such as NHS esters, HOBt esters, haloformates and galena anhydrides acids; (ii) alkyl and benzyl halides such as haloacetamides; (iii) aldehydes, ketones, carboxyl and maleimide groups. Some antibodies have reducible interchain disulfides, i.e. cysteine bridges. For conjugation with linker reagents, antibodies can be made reactive by treatment with a reducing agent such as DTT (dithiothreitol). Each cysteine bridge can theoretically form two reactive thiol nucleophiles. Additional nucleophilic groups can be introduced into antibodies through the reaction of interaction of lysines with 2-iminothiolane (Trout reagent), which will lead to the conversion of the amine to thiol. Reactive thiol groups can be incorporated into an antibody (or fragment thereof) by introducing one, two, three, four or more cysteine residues (for example, obtaining mutant antibodies containing one or more non-natural cysteine amino acid residues).

Конъюгаты “антитело - лекарственное средство” согласно изобретению могут быть также получены путем модификации антитела с введением в него электрофильных групп, которые могут реагировать с нуклеофильными заместителями на линкерном реагенте или лекарственном средстве. Сахара гликозилированных антител могут быть окислены, например, периодатными окислителями с образованием альдегидных или кетоновых групп, которые могут реагировать с аминогруппой линкерных реагентов или молекул лекарственного средства. Полученные иминовые группы шиффова основания могут образовывать стабильную связь либо они могут быть восстановлены, например, борогидридными реагентами с образованием стабильных аминовых связей. В одном из вариантов изобретения реакция взаимодействия углеводной части гликозилированного антитела с галактозооксидазой или с метапериодатом натрия может приводить к образованию карбонильных (альдегидных и кетоновых) групп в белке, которые могут реагировать с соответствующими группами на лекарственном средстве (Hermanson, Bioconjugate Techniques). В другом варианте изобретения белки, содержащие N-концевые сериновые или треониновые остатки, могут реагировать с метапериодатом натрия с образованием альдегида вместо первой аминокислоты (Geoghegan & Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3:138-146; патент США № 5362852). Такой альдегид может взаимодействовать с молекулой лекарственного средства или с линкерным нуклеофилом.Antibody-drug conjugates according to the invention can also be obtained by modifying the antibody with electrophilic groups that can react with nucleophilic substituents on a linker reagent or drug. Sugar glycosylated antibodies can be oxidized, for example, with periodic oxidizing agents to form aldehyde or ketone groups, which can react with the amino group of linker reagents or drug molecules. The resulting imine groups of the Schiff base can form a stable bond or they can be reduced, for example, with borohydride reagents to form stable amine bonds. In one embodiment of the invention, the reaction of the interaction of the carbohydrate moiety of a glycosylated antibody with galactose oxidase or with sodium meta-periodate can lead to the formation of carbonyl (aldehyde and ketone) groups in the protein that can react with the corresponding groups on the drug (Hermanson, Bioconjugate Techniques). In another embodiment of the invention, proteins containing N-terminal serine or threonine residues can react with sodium metaperiodate to form an aldehyde instead of the first amino acid (Geoghegan & Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US Pat. No. 5,362,852). Such an aldehyde may interact with a drug molecule or with a linker nucleophile.

Аналогичным образом нуклеофильными группами на молекуле лекарственного средства являются, но не ограничиваются ими, аминогруппы, тиольные, гидроксильные, гидразидные, оксимовые, гидразиновые, тиосемикарбазоновые, гидразинкарбоксилатные и арилгидразидные группы, способные реагировать, с образованием ковалентных связей, с электрофильными группами на линкерных молекулах и линкерных реагентах, включая: (i) активные сложные эфиры, такие как NНS-эфиры, HOBt-эфиры, галогенформиаты и галегенангидриды кислот; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы.Similarly, nucleophilic groups on a drug molecule include, but are not limited to, amino groups, thiol, hydroxyl, hydrazide, oxime, hydrazine, thiosemicarbazone, hydrazinecarboxylate and aryl hydrazide groups capable of reacting with the formation of covalent bonds with linker electrophilic groups reagents, including: (i) active esters, such as NHS esters, HOBt esters, acid halides and acid halides; (ii) alkyl and benzyl halides such as haloacetamides; (iii) aldehydes, ketones, carboxyl and maleimide groups.

Альтернативно гибридный белок, содержащий антитело и цитотоксическое средство, может быть получен, например, рекомбинантными методами или методом пептидного синтеза. Длина ДНК может составлять соответствующие области, кодирующие две части конъюгата, либо смежные друг с другом, либо разделенные областью, кодирующей линкерный пептид, который не оказывает негативного влияния на желаемые свойства данного конъюгата.Alternatively, a fusion protein containing an antibody and a cytotoxic agent can be obtained, for example, by recombinant methods or by peptide synthesis. The length of the DNA can be corresponding regions encoding two parts of the conjugate, either adjacent to each other or separated by a region encoding a linker peptide, which does not adversely affect the desired properties of the conjugate.

В еще одном варианте изобретения указанное антитело может быть конъюгировано с “рецептором” (таким как стрептавидин) для его предварительного нацеливания на опухоль, где указанный конъюгат “антитело - рецептор” вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровотока с использованием агента для клиренса, затем вводят “лиганд” (например, авидин), конъюгированный с цитотоксическим средством (например, радионуклеотидом).In yet another embodiment of the invention, said antibody can be conjugated to a “receptor” (such as streptavidin) to pre-target a tumor, where said antibody-receptor conjugate is administered to a patient, followed by removal of the unbound conjugate from the bloodstream using a clearance agent, then administer a “ligand” (eg, avidin) conjugated to a cytotoxic agent (eg, a radionucleotide).

Фармацевтические композиции Pharmaceutical Compositions

Терапевтические композиции, содержащие антитело согласно изобретению, получают в удобных для хранения формах путем смешивания антитела, имеющего нужную степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington; The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition (2000)) с получением водных растворов, лиофилизованных препаратов или других сухих препаратов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы в используемых дозах и концентрациях должны быть нетоксичными для реципиентов, и ими являются буферы, такие как фосфат, цитрат, гистидин и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; фенолоспирт, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (имеющие примерно менее чем 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлокомплексы (например, комплексы Zn - белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как твин^ТМ, плюроник^ТМ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).Therapeutic compositions containing the antibody of the invention are prepared in convenient storage forms by mixing the antibody of the desired purity with optional physiologically acceptable carriers, excipients or stabilizers ( Remington; The Science and Practice of Pharmacy , 20th edition (2000)) to obtain aqueous solutions, lyophilized preparations or other dry preparations. Acceptable carriers, excipients or stabilizers at the dosages and concentrations used should be non-toxic to the recipients, and these are buffers such as phosphate, citrate, histidine and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol alcohol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; 3-pentanol) low molecular weight polypeptides (having about less than 10 residues); proteins, such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt forming counterions, such as sodium; metal complexes (for example, Zn - protein complexes); and / or nonionic surfactants, such as Tween ^TM , Pluronic ^TM, or polyethylene glycol (PEG).

Описанная здесь композиция может также содержать несколько активных соединений, необходимых для конкретного показания, предпочтительно имеющих дополнительные активности, не оказывающие негативного влияния друг на друга. Такие молекулы могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для применения в нужных целях.The composition described herein may also contain several active compounds necessary for a particular indication, preferably having additional activities that do not adversely affect each other. Such molecules may be present in combination in amounts effective to be used for the intended purpose.

Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулу, полученную, например, методами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозную или желатиновую микрокапсулу и полиметилметакрилатную микрокапсулу соответственно, в системы для доставки коллоидальных лекарственных средств (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такая методика описана в руководстве Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000).The active ingredients can also be enclosed in a microcapsule obtained, for example, by coacervation or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethyl cellulose or gelatin microcapsule and polymethyl methacrylate microcapsule, respectively, in systems for the delivery of colloidal drugs (for example, in liposomes, albumin microsulfides nanoparticles and nanocapsules) or in macroemulsions. This technique is described in Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000).

Композиции, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это может быть легко достигнуто путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Compositions used for in vivo administration must be sterile. This can be easily achieved by filtration through sterile filtering membranes.

Могут быть получены препараты пролонгированного высвобождения. Подходящими примерами препаратов пролонгированного высвобождения являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих иммуноглобулин согласно изобретению, где указанные матрицы имеют форму готовых изделий, например пленок или микрокапсул. Примерами матриц пролонгированного высвобождения являются полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый сополимер этилена-винилацетата, разлагаемые сополимеры молочной кислоты - гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT^ТМ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты - гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Полимеры, такие как сополимер этилена - винилацетата и сополимер молочной кислоты - гликолевой кислоты способны высвобождать молекулы в течение более 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. Если инкапсулированные иммуноглобулины сохраняются в организме в течение длительного периода времени, то они могут денатурироваться или агрегироваться под воздействием влаги при 37^оС, что приводит к потере биологической активности и к возможным изменениям иммуногенности. Для стабилизации в зависимости от конкретного механизма могут быть разработаны рациональные стратегии. Так, например, если было обнаружено, что механизмом агрегации является образование межмолекулярной S-S-связи посредством тиодисульфидного обмена, то стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислотных растворов, регуляции содержания влаги с использованием соответствующих добавок и получения конкретных композиций на основе полимерной матрицы.Sustained release preparations may be prepared. Suitable examples of sustained release preparations are semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the immunoglobulin of the invention, wherein said matrices are in the form of finished products, for example films or microcapsules. Examples of sustained release matrices are polyesters, hydrogels (e.g. poly (2-hydroxyethyl methacrylate) or polyvinyl alcohol)), polylactides (US Pat. No. 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate, an indecomposable ethylene-vinyl acetate copolymer decomposable lactic acid-glycolic acid copolymers such as LUPRON DEPOT ^™ (injection microspheres consisting of a lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate) and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid. Polymers such as ethylene-vinyl acetate copolymer and lactic acid-glycolic acid copolymer are capable of releasing molecules for more than 100 days, some hydrogels release proteins in shorter periods of time. When encapsulated immunoglobulins retained in the body for a long period of time, they may denature or aggregate upon exposure to moisture at ³⁷ C, resulting in a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. To stabilize, depending on the particular mechanism, rational strategies can be developed. For example, if it was discovered that the aggregation mechanism is the formation of an intermolecular SS bond through thiodisulfide exchange, stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilization from acid solutions, regulating the moisture content using appropriate additives and obtaining specific polymer-based compositions matrices.

ПримененияApplications

Антитело согласно изобретению может быть использовано, например, в терапевтических методах in vitro, ex vivo и in vivo.The antibody according to the invention can be used, for example, in therapeutic methods in vitro , ex vivo and in vivo .

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения опухоли, рака или клеточно-пролиферативного расстройства, ассоциированного с повышенной экспрессией и/или активностью DLL4, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. In one aspect, the present invention relates to methods for treating or preventing a tumor, cancer, or cell proliferative disorder associated with increased expression and / or activity of DLL4, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need of such treatment .

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам ослабления, ингибирования, блокирования или предупреждения роста опухоли или раковой опухоли, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. In one aspect, the present invention provides methods for attenuating, inhibiting, blocking, or preventing the growth of a tumor or cancer, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need of such treatment.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам лечения опухоли, рака и/или клеточно-пролиферативного расстройства, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении.In one of its aspects, the present invention relates to methods for treating a tumor, cancer and / or cell proliferative disorder, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need of such treatment.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам ингибирования ангиогенеза, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. In one aspect, the present invention relates to methods for inhibiting angiogenesis, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need of such treatment.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам лечения патологического состояния, ассоциированного с ангиогенезом, где указанные способы включают введение эффективного количества анти-DLL4-антитела индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. В некоторых вариантах изобретения указанным патологическим состоянием, ассоциированным с ангиогенезом, является опухоль, рак и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В некоторых вариантах изобретения указанным патологическим состоянием, ассоциированным с ангиогенезом, является внутриглазное неоваскулярное заболевание. In one of its aspects, the present invention relates to methods for treating a pathological condition associated with angiogenesis, wherein said methods comprise administering an effective amount of an anti-DLL4 antibody to an individual in need of such treatment. In some embodiments of the invention, said pathological condition associated with angiogenesis is a tumor, cancer, and / or cell proliferative disorder. In some embodiments of the invention, said pathological condition associated with angiogenesis is an intraocular neovascular disease.

Кроме того, по меньшей мере некоторые антитела согласно изобретению могут связываться с антигеном, происходящим от других видов. В соответствии с этим антитела согласно изобретению могут быть использованы для связывания с антигеном, обладающим специфической активностью, например, в клеточной культуре, содержащей указанный антиген, и в организме человека или других млекопитающих, имеющих антиген, с которым перекрестно реагирует антитело согласно изобретению (например, у шимпанзе, павианов, игрунок, собакоподобных обезьян и макак-резусов, также свиней или мышей). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению может быть использовано для ингибирования антигенной активности путем контактирования указанного антитела с антигеном так, чтобы осуществлялось ингибирование активности антигена. Предпочтительным антигеном является человеческая белковая молекула. In addition, at least some antibodies of the invention may bind to antigens derived from other species. Accordingly, the antibodies of the invention can be used to bind to an antigen having specific activity, for example, in a cell culture containing the indicated antigen, and in humans or other mammals having the antigen with which the antibody of the invention cross-reacts (e.g. chimpanzees, baboons, marmosets, dog-like monkeys and rhesus monkeys, also pigs or mice). In one embodiment of the invention, an antibody of the invention can be used to inhibit antigenic activity by contacting said antibody with an antigen so that antigenic activity is inhibited. A preferred antigen is a human protein molecule.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению может быть использовано в способе связывания антигена у индивидуума, страдающего расстройством, ассоциированным с повышенным уровнем экспрессии и/или активности антигена, где указанный способ включает введение данному индивидууму антитела согласно изобретению для его связывания с антигеном. Предпочтительным антигеном является человеческая белковая молекула, предпочтительным индивидуумом является человек. Альтернативно указанным индивидуумом может быть млекопитающее, экспрессирующее антиген, с которым связывается антитело согласно изобретению. Кроме того, указанным индивидуумом может быть млекопитающее, которому был введен указанный антиген (например, путем прямого введения антигена или экспрессии антигенного трансгена). Антитело согласно изобретению может быть введено человеку в терапевтических целях. Кроме того, антитело согласно изобретению может быть введено млекопитающему, не являющемуся человеком (например, примату, свинье или мыши) и экспрессирующему антиген, с которым перекрестно реагирует иммуноглобулин, в целях лечения этого млекопитающего, либо оно может быть введено животному с моделью человеческого заболевания. Что касается животного-модели, то такие животные могут быть использованы для оценки терапевтической эффективности антител согласно изобретению (например, для определения доз и времени введения). In one embodiment of the invention, the antibody of the invention can be used in a method of antigen binding in an individual suffering from a disorder associated with an increased level of expression and / or antigen activity, wherein said method comprises administering to said individual an antibody of the invention to bind to the antigen. A preferred antigen is a human protein molecule, a preferred individual is a human. Alternatively, the specified individual may be a mammal expressing the antigen to which the antibody of the invention binds. In addition, the indicated individual may be a mammal to which the indicated antigen has been introduced (for example, by direct administration of an antigen or expression of an antigenic transgene). An antibody according to the invention can be administered to humans for therapeutic purposes. In addition, the antibody of the invention can be administered to a non-human mammal (e.g., a primate, pig or mouse) and expresses an immunoglobulin cross-reacting antigen to treat this mammal, or it can be administered to an animal with a human disease model. As for the animal model, such animals can be used to evaluate the therapeutic efficacy of antibodies according to the invention (for example, to determine doses and time of administration).

Антитела согласно изобретению могут быть использованы для лечения, ингибирования, замедления прогрессирования, предупреждения/замедления возникновения рецидивов, улучшения динамики или предупреждения заболеваний, расстройств или состояний, ассоциированных с экспрессией и/или активностью одной или нескольких молекул антигена.Antibodies according to the invention can be used to treat, inhibit, slow progression, prevent / slow the onset of relapse, improve the dynamics or prevention of diseases, disorders or conditions associated with the expression and / or activity of one or more antigen molecules.

Репрезентативными расстройствами являются карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз или лимфоидные злокачественные опухоли. Более конкретными примерами таких раковых заболеваний являются плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легких, включая мелкоклеточный рак легких, не-мелкоклеточный рак легких, аденокарцинома легких и плоскоклеточная карцинома легких, рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, включая рак желудочно-кишечного тракта; рак поджелудочной железы, глиобластома, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак мочевых путей, гепатома, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак ободочной кишки, карцинома эндометрия или матки, карцинома слюнных желез, рак почек, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома печени, карцинома заднего прохода, карцинома пениса, меланома, множественная миелома и В-клеточная лимфома, рак головного мозга, также рак головы и шеи, и ассоциированные с ними метастазы. В некоторых вариантах изобретения указанное раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из мелкоклеточного рака легких, нейробластомы, меланомы, карциномы молочной железы, рака желудка, рака ободочной кишки (СRC) и гепатоцеллюлярной карциномы. В некоторых вариантах изобретения указанное раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из не-мелкоклеточного рака легких, рака ободочной кишки и карциномы молочной железы, включая метастазы указанных раковых заболеваний.Representative disorders are carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma and leukemia or lymphoid malignancies. More specific examples of such cancers are squamous cell carcinoma (e.g., epithelial squamous cell carcinoma), lung cancer, including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma, abdominal cancer, hepatocellular cancer, gastric cancer, including cancer gastrointestinal tract; pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, urinary tract cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, colon cancer, colon cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary carcinoma kidney cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver carcinoma, anus carcinoma, penile carcinoma, melanoma, multiple myeloma and B-cell lymphoma, brain cancer, also head and neck cancer, and associated metastases . In some embodiments of the invention, said cancer is selected from the group consisting of small cell lung cancer, neuroblastoma, melanoma, breast carcinoma, stomach cancer, colon cancer (CRC), and hepatocellular carcinoma. In some embodiments of the invention, said cancer is selected from the group consisting of non-small cell lung cancer, colon cancer, and breast carcinoma, including metastases of said cancer.

В некоторых вариантах изобретения иммуноконъюгат, содержащий антитело, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими агентами, вводят указанному пациенту. В некоторых вариантах изобретения иммуноконъюгат и/или антиген, с которым он связывается, интернализуется в клетке, что приводит к повышению терапевтической эффективности иммуноконъюгата, направленной на уничтожение клетки-мишени, с которой он связывается. В одном из вариантов изобретения цитотоксический агент подавляет нуклеиновую кислоту или ингибирует ее активность в клетке-мишени. В одном из вариантов изобретения указанный цитотоксический агент подавляет полимеризацию микротрубочек или препятствует такой полимеризации. Примерами указанных цитотоксических агентов являются любые из описанных здесь химиотерапевтических средств (таких как майтанзиноид, ауристатин, доластатин или калихеамицин), радиоактивный изотоп, или рибонуклеаза или ДНК-эндонуклеаза.In some embodiments, an immunoconjugate comprising an antibody conjugated to one or more cytotoxic agents is administered to a specified patient. In some embodiments of the invention, the immunoconjugate and / or antigen with which it binds is internalized in the cell, which leads to an increase in the therapeutic effectiveness of the immunoconjugate aimed at killing the target cell with which it binds. In one embodiment of the invention, the cytotoxic agent inhibits the nucleic acid or inhibits its activity in the target cell. In one embodiment of the invention, said cytotoxic agent inhibits or inhibits microtubule polymerization. Examples of these cytotoxic agents are any of the chemotherapeutic agents described herein (such as maytansinoid, auristatin, dolastatin or calicheamicin), a radioactive isotope, or ribonuclease or DNA endonuclease.

Антитела согласно изобретению, взятые отдельно или в комбинации с другими композициями, могут быть использованы в терапевтических целях. Так, например, антитело согласно изобретению может быть введено вместе с другим антителом, химиотерапевтическим(и) средством(ами) (включая смеси химиотерапевтических средств), с другим(и) цитотоксическим(и) средством(ами), антиангиогенным(и) средством(ами), цитокинами и/или рост-ингибирующим(и) средством(ами). Если антитело согласно изобретению ингибирует рост опухоли, то может оказаться особенно желательным его объединение с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, которые также ингибируют рост опухоли, например, с анти-VEGF агентами, включая антитела против VEGF. Альтернативно или дополнительно пациент может быть подвергнут комбинированной лучевой терапии (например, облучением внешним пучком или терапии с использованием радиоактивно меченого агента, такого как антитело). Такой указанной выше комбинированной терапией является комбинированное введение (где два или более агентов включены в одну или ту же или в отдельные композиции) и отдельное введение, при котором антитело согласно изобретению может быть введено до и/или после проведения вспомогательной терапии.Antibodies according to the invention, taken separately or in combination with other compositions, can be used for therapeutic purposes. So, for example, the antibody according to the invention can be introduced together with another antibody, chemotherapeutic (s) agent (s) (including mixtures of chemotherapeutic agents), with other (s) cytotoxic (s) agent (s), antiangiogenic (s) agent ( s), cytokines and / or growth inhibitory (s) agent (s). If an antibody of the invention inhibits tumor growth, it may be especially desirable to combine it with one or more other therapeutic agents that also inhibit tumor growth, for example, with anti-VEGF agents, including anti-VEGF antibodies. Alternatively or additionally, the patient may be subjected to combination radiation therapy (for example, external beam irradiation or therapy using a radioactively labeled agent such as an antibody). Such combination therapy as indicated above is combination administration (where two or more agents are included in the same or separate compositions) and separate administration, in which the antibody of the invention can be administered before and / or after adjuvant therapy.

Комбинированная терапияCombination therapy

Как было указано выше, настоящее изобретение относится к комбинированной терапии, при которой анти-DLL4-антитело вводят одновременно с проведением другой терапии. Так, например, анти-DLL4-антитела используются в комбинациях с противораковой терапией или с терапией, направленной против образования новых сосудов, для лечения различных неопластических или не-неопластических состояний. В одном из вариантов изобретения указанное неопластическое или не-неопластическое состояние характеризуется патологическим расстройством, ассоциированным с аберрантным или нежелательным ангиогенезом. Анти-DLL4-антител может быть введено последовательно или в комбинации с другим средством, эффективным для таких целей, либо в виде одной композиции, либо в виде отдельных композиций. Альтернативно или дополнительно может быть введено множество ингибиторов DLL4.As indicated above, the present invention relates to combination therapy in which an anti-DLL4 antibody is administered concurrently with another therapy. So, for example, anti-DLL4 antibodies are used in combination with anticancer therapy or with therapy against the formation of new vessels to treat various neoplastic or non-neoplastic conditions. In one embodiment of the invention, said neoplastic or non-neoplastic condition is characterized by a pathological disorder associated with aberrant or unwanted angiogenesis. Anti-DLL4 antibodies can be administered sequentially or in combination with another agent effective for such purposes, either as a single composition or as separate compositions. Alternatively or additionally, multiple DLL4 inhibitors may be administered.

Введение анти-DLL4-антитела может быть осуществлено одновременно с другими средствами, например, в виде одной композиции или в виде двух или более отдельных композиций с применением одного и того же или различных способов введения. Альтернативно или дополнительно введение может быть осуществлено последовательно в любом порядке. В некоторых вариантах изобретения интервалы между введением двух или более композиций могут составлять от нескольких минут до нескольких дней или от нескольких недель до нескольких месяцев. Так, например, сначала может быть введено противораковое средство, затем ингибитор DLL4. Однако рассматривается также одновременное введение анти-DLL4-антитела с другими средствами или введение сначала анти-DLL4-антитела, затем введение другого средства. The introduction of anti-DLL4 antibodies can be carried out simultaneously with other means, for example, in the form of a single composition or in two or more separate compositions using the same or different methods of administration. Alternatively or additionally, administration can be carried out sequentially in any order. In some embodiments of the invention, the intervals between administration of two or more compositions may be from several minutes to several days or from several weeks to several months. So, for example, an anticancer agent can be introduced first, then a DLL4 inhibitor. However, simultaneous administration of an anti-DLL4 antibody with other agents or administration of an anti-DLL4 antibody first and then administration of another agent is also contemplated.

Эффективное количество терапевтических средств, вводимое в комбинации с анти-DLL4-антителом, назначается врачом или ветеринаром. Для достижения максимального эффекта лечения указанных состояний вводимую дозу соответствующим образом корректируют. Доза также зависит от таких факторов, как тип используемого терапевтического средства и от конкретного пациента, подвергаемого лечению. Подходящими дозами противоракового средства являются дозы, которые используются в современной терапии, и эти дозы могут быть снижены благодаря комбинированному действию (синергическому действию) противоракового средства и анти-DLL4-антитела. В некоторых вариантах изобретения комбинация ингибиторов усиливает эффективность одного ингибитора. Термин «потенцировать» означает повышать эффективность терапевтического средства, вводимого в обычной или допустимой дозе. См. также раздел настоящей заявки, озаглавленный «Фармацевтические композиции». An effective amount of therapeutic agent administered in combination with an anti-DLL4 antibody is prescribed by a doctor or veterinarian. To achieve the maximum treatment effect for these conditions, the administered dose is adjusted accordingly. The dose also depends on factors such as the type of therapeutic agent used and the particular patient being treated. Suitable doses of the anticancer agent are those used in modern therapy, and these doses can be reduced due to the combined action (synergistic effect) of the anticancer agent and anti-DLL4 antibody. In some embodiments, a combination of inhibitors enhances the effectiveness of a single inhibitor. The term "potentiate" means to increase the effectiveness of a therapeutic agent administered in a normal or acceptable dose. See also the section of this application entitled “Pharmaceutical Compositions”.

Обычно анти-DLL4-антитела и противораковые средства являются подходящими для лечения одних и тех же или аналогичных заболеваний путем предотвращения или ослабления патологического расстройства, такого как рост опухоли или рост раковых клеток. в одном из вариантов изобретения, указанным противораковым средством является антиангиогенное средство.Typically, anti-DLL4 antibodies and anti-cancer agents are suitable for treating the same or similar diseases by preventing or mitigating a pathological disorder such as tumor growth or cancer cell growth. in one embodiment of the invention, said anti-cancer agent is an antiangiogenic agent.

Ангиогенная терапия при раке представляет собой стратегию лечения рака, целью которой является ингибирование развития кровеносных сосудов опухоли, необходимых для подачи питательных веществ, требуемых для роста опухоли. Поскольку ангиогенез происходит как при росте первичной опухоли, так и при метастазах, то лечение антиангиогенными средствами, осуществляемое в соответствии с настоящим изобретением, может приводить к ингибированию роста опухоли в месте образования первичной опухоли, также к предупреждению развития метастазов опухоли, образующихся в других участках, что позволяет воздействовать на опухоль другими терапевтическими средствами.Angiogenic therapy for cancer is a cancer treatment strategy whose goal is to inhibit the development of the blood vessels of the tumor, which are necessary for supplying the nutrients required for tumor growth. Since angiogenesis occurs both with the growth of the primary tumor and with metastases, treatment with anti-angiogenic agents carried out in accordance with the present invention can lead to inhibition of tumor growth at the site of formation of the primary tumor, and also to prevent the development of tumor metastases that form in other areas, which allows you to affect the tumor with other therapeutic agents.

Многие антиангиогенные средства были идентифицированы и известны специалистам, включая средства, перечисленные в настоящей заявке, например, в разделе «Определения» и средства, описанные, например в публикациях Carmeliet & Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004); и Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). См. также заявку на патент США US 20030055006. В одном из вариантов изобретения, анти-DLL4-антитело используется в комбинации с нейтрализующим анти-VEGF-антителом (или его фрагментом) и/или другим антагонистом VEGF или антагонистом рецептора VEGF, включая, но не ограничиваясь ими, например, растворимый рецептор VEGF (например, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, нейропиллины (например, NRP1, NRP2)), их фрагменты, аптамеры, способные блокировать VEGF или VEGFR, нейтрализующие анти-VEGFR-антитела, низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR (RTK), антисмысловые последовательности для VEGF, рибозимы против VEGF или рецепторов VEGF, варианты антагонистов VEGF; и любые их комбинации. Альтернативно или дополнительно пациенту помимо антагониста VEGF и другого средства могут быть, но необязательно, одновременно введены два или более ингибиторов ангиогенеза. В некоторых вариантах изобретения один или несколько дополнительных терапевтических средств, например противораковых средств, могут быть введены в комбинации с анти-DLL4-антителом, антагонистом VEGF и антиангиогенным средством. Many anti-angiogenic agents have been identified and known to those skilled in the art, including the agents listed in this application, for example, in the Definitions section and the agents described, for example, in Carmeliet & Jain, Nature 407: 249-257 (2000); Ferrara et al., Nature Reviews: Drug Discovery , 3: 391-400 (2004); and Sato Int. J. Clin. Oncol. 8: 200-206 (2003). See also U.S. Patent Application US 20030055006. In one embodiment of the invention, an anti-DLL4 antibody is used in combination with a neutralizing anti-VEGF antibody (or fragment thereof) and / or another VEGF antagonist or VEGF receptor antagonist, including but not limited to, for example, a soluble VEGF receptor (e.g., VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, neuroprilins (e.g., NRP1, NRP2)), fragments thereof, aptamers capable of blocking VEGF or VEGFR, neutralizing anti-VEGFR- antibodies, small molecule VEGFR tyrosine kinase inhibitors (RTK), antisense sequences for VEGF, ribosis Imes against VEGF or VEGF receptors; VEGF antagonist variants; and any combination thereof. Alternatively or additionally, in addition to the VEGF antagonist and another agent, two or more angiogenesis inhibitors may be administered simultaneously, in addition to the patient. In some embodiments of the invention, one or more additional therapeutic agents, for example anti-cancer agents, can be administered in combination with an anti-DLL4 antibody, a VEGF antagonist, and an anti-angiogenic agent.

В некоторых аспектах изобретения другими терапевтическими методами, подходящими для комбинированной терапии опухоли с использованием анти-DLL4-антитела, является другая противораковая терапия (например, хирургическое вмешательство, лечение радиологическими средствами (например, лучевая терапия или введение радиоактивных веществ), химиотерапия, лечение противораковыми средствами, перечисленными в настоящей заявке и известными специалистам, или их комбинации). Альтернативно или дополнительно пациенту могут быть одновременно введены два или более антител, связывающихся с одними и теми же или с двумя или более различными антигенами, описанными в настоящей заявке. Иногда может также оказаться предпочтительным введение пациенту одного или нескольких цитокинов. In some aspects of the invention, other therapeutic methods suitable for combination therapy of a tumor using an anti-DLL4 antibody are other anti-cancer therapy (e.g., surgery, radiological treatment (e.g., radiation therapy or administration of radioactive substances), chemotherapy, anti-cancer treatment listed in this application and known to specialists, or combinations thereof). Alternatively or additionally, two or more antibodies that bind to the same or to two or more different antigens described herein can be simultaneously administered to a patient. Sometimes it may also be preferable to administer one or more cytokines to the patient.

Химиотерапевтические средстваChemotherapeutic agents

В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к способу блокирования или снижения роста опухоли или раковых клеток, где указанный способ включает введение эффективных количеств антагониста DLL4 и/или ингибитора(ов) ангиогенеза и одного или нескольких химиотерапевтических средств пациенту, восприимчивому к развитию рака, или пациенту, у которого был диагностирован рак. Различные химиотерапевтические средства могут быть использованы в комбинированных способах лечения согласно изобретению. Репрезентативный и неограничивающий список рассматриваемых химиотерапевтических средств приводится в настоящей заявке в разделе «Определения». In some of its aspects, the present invention relates to a method for blocking or reducing the growth of a tumor or cancer cells, wherein said method comprises administering effective amounts of a DLL4 antagonist and / or angiogenesis inhibitor (s) and one or more chemotherapeutic agents to a cancer susceptible patient or patient who has been diagnosed with cancer. Various chemotherapeutic agents can be used in the combined treatment methods of the invention. A representative and non-limiting list of chemotherapeutic agents considered is provided herein in the Definitions section.

Как очевидно для каждого среднего специалиста в данной области, соответствующие дозы химиотерапевтических средств приблизительно аналогичны дозам, уже применяемым в клинической терапии, где указанные химиотерапевтические средства вводят отдельно или в комбинации с другими химиотерапевтическими средствами. Дозы могут варьироваться в зависимости от состояния, подвергаемого лечению. Врач, назначающий данное лечение, может самостоятельно вычислить соответствующую дозу для каждого отдельного индивидуума.As is obvious to every person skilled in the art, the corresponding doses of chemotherapeutic agents are approximately the same as those already used in clinical therapy, where the indicated chemotherapeutic agents are administered alone or in combination with other chemotherapeutic agents. Doses may vary depending on the condition being treated. The doctor prescribing this treatment can independently calculate the appropriate dose for each individual individual.

Настоящее изобретение также относится к способам и композициям для ингибирования или предупреждения рецидивирующего роста опухоли или раковых клеток. Термин «рецидивирующий рост опухоли или раковых клеток» используется для определения состояния, которым страдает данный индивидуум, или состояния, лечение которого одним или несколькими методами терапии (например, противораковой терапии, такой как химиотерапия, лучевая терапия, хирургическое вмешательство, гормональная терапия и/или биологическая терапия/иммунотерапия, терапия анти-VEGF-антителом, в частности стандартный терапевтический метод лечения конкретного ракового заболевания), не является клинически адекватным или дает лишь кратковременный благоприятный эффект, поэтому такие пациенты нуждаются в дополнительной эффективной терапии. Используемый здесь термин может также означать состояние «невосприимчивости/резистентности» пациента, например состояние пациента, у которого наблюдается определенный ответ на данную терапию, но при этом возникают побочные эффекты; или пациента, у которого развивается резистентность, не наблюдается ответа на данную терапию или не наблюдается удовлетворительного ответа на данную терапию и т.п. В различных вариантах изобретения раковым заболеванием является рецидивирующий рост опухоли или раковых клеток, при которых не наблюдается заметного уменьшения числа раковых клеток или не наблюдается их увеличения, либо не наблюдается уменьшения размера опухоли или наблюдается его увеличения, либо не наблюдается какого-либо дополнительного уменьшения размера раковой опухоли или числа раковых клеток. Установление рецидивирующего роста раковой опухоли или раковых клеток может быть осуществлено любым методом in vivo или in vitro, известным специалистам, который включают анализ на эффективность подавления раковых клеток, где термины «рецидив» или «резистентность», или «невосприимчивость» употребляются в их общепринятом смысле. Примером рецидивирующего роста опухоли является опухоль, резистентная к лечению анти-VEGF-антителом. The present invention also relates to methods and compositions for inhibiting or preventing the recurrent growth of a tumor or cancer cells. The term “recurrent tumor or cancer cell growth” is used to define a condition that a given individual suffers from or a condition that is treated with one or more methods of therapy (eg, anti-cancer therapy such as chemotherapy, radiation therapy, surgery, hormone therapy and / or biological therapy / immunotherapy, anti-VEGF antibody therapy, in particular the standard therapeutic method for the treatment of a specific cancer), is not clinically adequate or only gives short-term beneficial effect, therefore, such patients need additional effective therapy. As used herein, the term may also mean the patient’s “immunity / resistance” state, for example, the condition of a patient who has a definite response to the therapy but has side effects; or a patient who develops resistance, there is no response to this therapy or a satisfactory response to this therapy, etc. In various embodiments of the invention, the cancer is a recurrent growth of the tumor or cancer cells, in which there is no noticeable decrease in the number of cancer cells or no increase, or no decrease in the size of the tumor or increase, or no further decrease in the size of the cancer tumors or cancer cell numbers. Establishment of the recurrent growth of a cancerous tumor or cancer cells can be carried out by any in vivo or in vitro method known to those skilled in the art, which include analysis of the effectiveness of cancer cell suppression, where the terms “relapse” or “resistance” or “immunity” are used in their generally accepted sense . An example of a recurring tumor growth is a tumor resistant to treatment with an anti-VEGF antibody.

Настоящее изобретение относится к способам блокирования или ослабления рецидивирующего роста опухоли или раковых клеток у индивидуума, где указанные способы включают введение индивидууму одного или нескольких анти-DLL4-антител в целях блокирования или ослабления рецидивирующего роста опухоли или раковых клеток. В некоторых вариантах изобретения антагонист может быть введен после проведения противораковой терапии. В некоторых вариантах изобретения анти-DLL4-антитела вводят одновременно с проведением противораковой терапии. Альтернативно или дополнительно терапию анти-DLL4-антителом проводят поочередно с другой противораковой терапией, и такая терапия может быть осуществлена в любом порядке. Настоящее изобретение также охватывает способы введения одного или нескольких ингибирующих антител для предупреждения развития или рецидива ракового заболевания у пациентов, предрасположенных к развитию такого ракового заболевания. Обычно такой индивидуум подвергался (или подвергается) комбинированной противораковой терапии. В одном из вариантов изобретения противораковой терапией является лечение антиангиогенным средством, например антагонистом VEGF. Антиангиогенными средствами являются средства, известные специалистам и перечисленные в настоящей заявке в разделе «Определения». В одном из вариантов изобретения антиангиогенным средством является нейтрализующее анти-VEGF-антитело или его фрагмент (например, AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA) или LUCENTIS® (Genentech, South San Francisco, CA)), Y0317, M4, G6, B20, 2C3 и т.п.). См., например, патенты США №№ 6582959, 6884879, 6703020; заявки WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; EP 0666868B1; заявки на патенты США №№20030206899, 20030190317, 20030203409 и 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); и WO 2005012359. Дополнительные средства могут быть введены в комбинации с антагонистом VEGF и анти-DLL4-антителом для блокирования или ослабления рецидивирующего роста опухоли или раковых клеток, например, см. раздел, озаглавленный здесь «Комбинированная терапия». The present invention relates to methods for blocking or attenuating the recurrent growth of a tumor or cancer cells in an individual, wherein said methods comprise administering to the individual one or more anti-DLL4 antibodies to block or attenuate the recurrent growth of a tumor or cancer cells. In some embodiments, the antagonist may be administered after anticancer therapy. In some embodiments, anti-DLL4 antibodies are administered concurrently with anti-cancer therapy. Alternatively or additionally, anti-DLL4 antibody therapy is administered alternately with other anti-cancer therapy, and such therapy may be carried out in any order. The present invention also encompasses methods for administering one or more inhibitory antibodies to prevent the development or relapse of cancer in patients predisposed to develop such cancer. Typically, such an individual has undergone (or is undergoing) combination anticancer therapy. In one embodiment of the invention, anti-cancer therapy is treatment with an antiangiogenic agent, for example, a VEGF antagonist. Antiangiogenic agents are those known to those skilled in the art and listed in the Definitions section of this application. In one embodiment, the antiangiogenic agent is a neutralizing anti-VEGF antibody or fragment thereof (e.g., AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA) or LUCENTIS® (Genentech, South San Francisco, CA)), Y0317, M4, G6 , B20, 2C3, etc.). See, for example, US patents Nos. 6582959, 6884879, 6703020; WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; EP 0666868B1; U.S. Patent Application Nos. 20030206899, 20030190317, 20030203409 and 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004); and WO 2005012359. Additional agents may be administered in combination with a VEGF antagonist and anti-DLL4 antibody to block or attenuate the recurrent growth of a tumor or cancer cells, for example, see the section entitled “Combination Therapy”.

Антитело согласно изобретению (и вспомогательное терапевтическое средство) вводят различными способами, включая парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение, если необходимо местное лечение, то антитело вводят в пораженный участок или в стекловидное тело. Парентеральной инфузией является внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, подходящим способом введения антитела является периодическое вливание, в частности вливание антитела в уменьшающихся дозах. Такие дозы могут быть введены любым подходящим способом, например путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, и эти дозы отчасти зависят от того, является ли такое введение периодическим или постоянным.An antibody according to the invention (and an adjuvant therapeutic agent) is administered in various ways, including parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary and intranasal administration, if local treatment is necessary, the antibody is administered to the affected area or to the vitreous body. Parenteral infusion is intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous administration. In addition, a suitable route of administration of the antibody is a periodic infusion, in particular an infusion of the antibody in decreasing doses. Such doses may be administered by any suitable method, for example by injection, such as intravenous or subcutaneous injection, and these doses depend in part on whether such administration is periodic or continuous.

Антитело-содержащую композицию согласно изобретению приготавливают, разделяют на дозы и вводят в соответствии с хорошо известной медицинской практикой. Факторами, учитываемыми для приготовления таких композиций, являются конкретное расстройство, подвергаемое лечению, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению, клиническое состояние конкретного пациента, этиологический фактор, вызывающий данное расстройство, участок, на который направлено данное средство, способ введения, схема введения и другие факторы, известные практическим врачам. Указанное антитело должно быть, но необязательно, приготовлено в виде композиции с одним или несколькими современными средствами, используемыми для предупреждения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антитела согласно изобретению, присутствующих в данной композиции, типа расстройства или способа его лечения и от других факторов, обсуждаемых выше. Указанные другие средства обычно вводятся в тех же самых дозах и теми же способами, которые обычно использовались ранее, либо эти дозы составляют примерно 1-99% от используемых ранее доз.An antibody-containing composition according to the invention is prepared, divided into doses and administered in accordance with well-known medical practice. Factors considered for the preparation of such compositions are the particular disorder being treated, the particular mammal being treated, the clinical condition of the particular patient, the etiological factor causing the disorder, the site to which the agent is directed, the route of administration, the route of administration, and other factors known to practitioners. The specified antibody should be, but not necessarily, prepared in the form of a composition with one or more modern means used to prevent or treat the disorder in question. An effective amount of such other agents depends on the amount of the antibodies of the invention present in the composition, the type of disorder or method of treatment, and other factors discussed above. These other agents are usually administered in the same doses and in the same manner as previously used, or these doses comprise about 1-99% of the previously used doses.

Для предупреждения или лечения заболевания подходящие дозы антитела согласно изобретению (используемого отдельно или в комбинации с другими средствами, такими как химиотерапевтические средства) зависят от типа заболевания, подвергаемого лечению, типа антитела, тяжести и курса лечения заболевания, независимо от того, вводят ли указанное антитело в профилактических или терапевтических целях, от проводимого ранее лечения, от истории болезни пациента и его восприимчивости к антителу и от назначения лечащего врача. Такое антитело может быть введено пациенту один раз или несколько раз во время проведения курса лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания начальная предварительно установленная доза антитела, вводимого пациенту, составляет примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг), независимо от того, осуществляют ли одноразовое или многократное введение или непрерывную инфузию данного антитела. Типичная суточная доза может составлять примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней или более в зависимости от состояния лечение может проводиться до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое подавление симптомов заболевания. Репрезентативная доза антитела может составлять примерно от 0,05 мг/кг до 10 мг/кг. Так, например, пациенту могут быть введены одна или несколько доз, составляющих примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации). Такие дозы могут быть введены периодически, например еженедельно или раз в три недели (например, пациенту может быть введено примерно от двух до двадцати, например, примерно шесть доз антитела). При этом сначала может быть введена более высокая доза, затем могут быть введены одна или несколько более низких доз. Репрезентативная схема введения доз включает введение начальной дозы, составляющей примерно 4 мг/кг, с последующим еженедельным введением поддерживающей дозы, составляющей примерно 2 мг/кг антитела. Однако могут быть применены и другие схемы введения. Мониторинг эффекта такой терапии может быть легко проведен стандартными методами и с применением стандартных анализов.To prevent or treat a disease, suitable doses of an antibody according to the invention (used alone or in combination with other agents, such as chemotherapeutic agents) depend on the type of disease being treated, the type of antibody, the severity and the course of treatment of the disease, regardless of whether the antibody is administered for preventive or therapeutic purposes, from previous treatment, from the patient’s medical history and susceptibility to the antibody, and from the appointment of the attending physician. Such an antibody may be administered to a patient once or several times during a course of treatment. Depending on the type and severity of the disease, the initial preset dose of the antibody administered to the patient is from about 1 μg / kg to 15 mg / kg (e.g. 0.1 mg / kg to 10 mg / kg), regardless of whether single or multiple administration or continuous infusion of a given antibody. A typical daily dose may be from about 1 μg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the above factors. For repeated administration over a period of several days or more, depending on the condition, treatment may be carried out until the desired suppression of disease symptoms is achieved. A representative dose of the antibody may be from about 0.05 mg / kg to 10 mg / kg. For example, one or more doses of about 0.5 mg / kg, 2.0 mg / kg, 4.0 mg / kg or 10 mg / kg (or any combination thereof) may be administered to a patient. Such doses may be administered periodically, for example weekly or every three weeks (for example, about two to twenty, for example, about six doses of an antibody may be administered to a patient). In this case, a higher dose may be administered first, then one or more lower doses may be administered. A representative dose schedule includes administering an initial dose of about 4 mg / kg, followed by a weekly administration of a maintenance dose of about 2 mg / kg of antibody. However, other administration regimens may also be used. Monitoring the effect of such therapy can be easily carried out using standard methods and using standard assays.

Анти-DLL4-антитела согласно изобретению могут быть использованы в анализах для детектирования уровня экспрессии DLL4 (таких как диагностические или прогностические анализы) в конкретных клетках или тканях, где указанные антитела метят как описано ниже и/или иммобилизуют на нерастворимой матрице. The anti-DLL4 antibodies of the invention can be used in assays to detect the level of expression of DLL4 (such as diagnostic or prognostic assays) in specific cells or tissues where these antibodies are labeled as described below and / or immobilized on an insoluble matrix.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам детектирования DLL4, где указанные способы включают детектирование комплекса «DLL4 - анти-DLL4-антитело» в образце. Используемый здесь термин «детектирование» включает качественное и/или количественное детектирование (определение уровней) в присутствии или в отсутствие контроля. In another aspect, the present invention relates to methods for detecting DLL4, where these methods include detecting the complex "DLL4 - anti-DLL4 antibody" in the sample. As used herein, the term “detection” includes qualitative and / or quantitative detection (determination of levels) in the presence or absence of control.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам диагностики расстройства, ассоциированного с экспрессией и/или активностью DLL4, где указанные способы включают детектирование комплекса «DLL4 - анти-DLL4-антитело» в биологическом образце, взятом у пациента, страдающего указанным расстройством, или у пациента с подозрением на такое расстройство. В некоторых вариантах изобретения экспрессией DLL4 является повышенный уровень экспрессии или аномальная (нежелательная) экспрессия. В некоторых вариантах изобретения указанным расстройством является опухоль, рак и/или клеточно-пролиферативное расстройство. In another aspect, the present invention relates to methods for diagnosing a disorder associated with the expression and / or activity of DLL4, where these methods include the detection of the complex "DLL4 - anti-DLL4 antibody" in a biological sample taken from a patient suffering from the specified disorder, or a patient suspected of having this disorder. In some embodiments of the invention, the expression of DLL4 is an increased level of expression or abnormal (unwanted) expression. In some embodiments of the invention, said disorder is a tumor, cancer, and / or cell proliferative disorder.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к любому из описанных здесь анти-DLL4-антител, где указанное анти-DLL4-антитело содержит детектируемую метку. In another aspect, the present invention relates to any of the anti-DLL4 antibodies described herein, wherein said anti-DLL4 antibody contains a detectable label.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к комплексу, состоящему из любого из описанных здесь анти-DLL4-антител и DLL4. В некоторых вариантах изобретения указанный комплекс присутствует in vivo или in vitro. В некоторых вариантах изобретения указанный комплекс содержит раковую клетку. В некоторых вариантах изобретения анти-DLL4-антитело является детектируемо меченым. In another aspect, the present invention relates to a complex consisting of any of the anti-DLL4 antibodies and DLL4 described herein. In some embodiments of the invention, said complex is present in vivo or in vitro . In some embodiments of the invention, said complex comprises a cancer cell. In some embodiments, the anti-DLL4 antibody is detectably labeled.

Анти-DLL4-антитела могут быть использованы для детектирования DLL4 в любом одном из ряда хорошо известных аналитических методов детекции. Так, например, биологический образец может быть проанализирован на DLL4 путем взятия образца из нужного источника, смешивания образца с анти-DLL4-антителом с образованием комплекса «антитело/DLL4» с любым DLL4, присутствующим в данной смеси, и детектирования любого комплекса «антитело/DLL4», присутствующего в данной смеси. Биологический образец может быть получен для анализа методами, известными специалистам и подходящими для анализа конкретного образца. Методы смешивания образца с антителами и методы детектирования комплекса «антитело/DLL4» выбирают в зависимости от типа применяемого анализа. Такими анализами являются иммуногистохимический анализ, конкурентный анализ и «сэндвич»-анализ, также анализы на стерическое ингибирование. Anti-DLL4 antibodies can be used to detect DLL4 in any one of a number of well-known analytical detection methods. For example, a biological sample can be analyzed for DLL4 by taking a sample from the desired source, mixing the sample with an anti-DLL4 antibody to form the antibody / DLL4 complex with any DLL4 present in the mixture, and detecting any antibody / complex DLL4 ”present in this mixture. A biological sample can be obtained for analysis by methods known to those skilled in the art and suitable for analysis of a particular sample. The methods of mixing the sample with antibodies and the detection methods of the antibody / DLL4 complex are selected depending on the type of analysis used. Such analyzes are immunohistochemical analysis, competitive analysis and sandwich analysis, as well as steric inhibition assays.

В методах анализа на DLL4 используются один или несколько из нижеследующих реагентов, таких как: меченый аналог DLL4, иммобилизованный аналог DLL4, меченое анти-DLL4-антитело, иммобилизованное анти-DLL4-антитело и стерические конъюгаты. Меченые реагенты также известны как «метки». DLL4 assay methods use one or more of the following reagents, such as: labeled DLL4 analog, immobilized DLL4 analog, labeled anti-DLL4 antibody, immobilized anti-DLL4 antibody, and steric conjugates. Labeled reagents are also known as “tags.”

Используемой меткой является любая детектируемая функциональная группа, которая не влияет на связывание DLL4 и анти-DLL4-антитела. Известно, что в иммуноанализах используются различные метки, и примерами таких меток являются молекулы, которые могут быть детектированы непосредственно, такие как флуорохром, хемилюминесцентное вещество и радиоактивные метки, также молекулы, такие как ферменты, которые для их детектирования должны быть подвергнуты реакции взаимодействия или дериватизации. Примерами таких меток являются радиоизотопы ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H и ¹³¹I, флуорофоры, такие как хелатные комплексы редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахарид-оксидазы, например глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантин-оксидаза, присоединенные к ферменту, который использует пероксид водорода для окисления красителя-предшественника, такого как ПХ; лактопероксидаза или микропероксидаза; биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и т.п. The label used is any detectable functional group that does not affect the binding of DLL4 and anti-DLL4 antibodies. Various labels are known to be used in immunoassays, and examples of such labels are molecules that can be detected directly, such as fluorochrome, a chemiluminescent substance, and radioactive labels, as well as molecules such as enzymes that must undergo an interaction or derivatization reaction to detect them. . Examples of such labels are ³² P, ¹⁴ C, ¹²⁵ I, ³ H and ¹³¹ I radioisotopes, fluorophores such as rare earth metal chelate complexes and fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, dansil, umbelliferone, luciferase, for example firefly luciferase and bacterial luciferase (US Patent No. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihydrophthalazinedione, horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucoamylase, lysozyme, saccharide oxidase, for example glucose oxidase, galactose oxidase 6-glucose, heterocyclic oxidases Such as uricase and xanthine oxidase, attached to an enzyme that employs hydrogen peroxide to oxidize a dye precursor such as HRP; lactoperoxidase or microperoxidase; biotin / avidin, spin labels, bacteriophage labels, stable free radicals, etc.

Для ковалентного связывания этих меток с белками или полипептидами применяются стандартные методы. Так, например, для мечения антител вышеописанными флуоресцентными, хемилюминесцентными и ферментыми метками могут быть использованы связывающие реагенты, такие как диальдегиды, карбодиимиды, дималеимиды, бисимидаты, бис-диазотированный бензидин и т.п. См., например, патенты США №№. 3940475 (флуориметрия) и 3645090 (ферменты; Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); и Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982). Предпочтительными метками, используемыми в настоящей заявке, являются такие ферменты как пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Конъюгирование такой метки, включая ферменты, с данным антителом представляет собой стандартную технологическую процедуру, применяемую в методах иимуноанализов и известную среднему специалисту в данной области. См., например, O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166.Standard methods are used to covalently bind these labels to proteins or polypeptides. So, for example, binding agents such as dialdehydes, carbodiimides, dimaleimides, bisimidates, bis-diazotized benzidine and the like can be used to label antibodies with the above-described fluorescent, chemiluminescent and enzyme labels. See, for example, US Pat. 3940475 (fluorimetry) and 3645090 (enzymes; Hunter et al. , Nature , 144: 945 (1962); David et al. , Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al. , J. Immunol. Methods , 40: 219-230 (1981); and Nygren, J. Histochem. And Cytochem., 30: 407-412 (1982). Preferred labels used in this application are enzymes such as horseradish peroxidase and alkaline phosphatase. , including enzymes, with this antibody is a standard process used in immunoassay methods and is well known to one of ordinary skill in the art. See, for example, O'Sullivan et al. , "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, "in Methods in Enzymology , ed. JJ Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166.

Для проведения некоторых аналитических методов необходима иммобилизация реагентов. Иммобилизация приводит к отделению анти-DLL4-антитела от любого DLL4, оставшегося в растворе в свободном состоянии. Такую процедуру обычно осуществляют путем инсолюбилизации анти-DLL4-антитела или аналога DLL4 перед проведением процедуры анализа, как это происходит при адсорбции на не растворимой в воде матрице или поверхности (Bennich et al.., патент США №3720760), путем ковалентного связывания (например, перекрестного связывания с глутаральдегидом) или путем последующей инсолюбилизации анти-DLL4-антитела или аналога DLL4, например посредством иммунопреципитации. For some analytical methods, the immobilization of reagents is necessary. Immobilization results in the separation of the anti-DLL4 antibody from any DLL4 remaining in solution in the free state. This procedure is usually carried out by insolubilization of the anti-DLL4 antibody or analogue of DLL4 before the analysis procedure, as occurs when adsorption on a water-insoluble matrix or surface (Bennich et al ., US patent No. 3720760), by covalent binding (for example cross-linking with glutaraldehyde) or by subsequent insolubilization of an anti-DLL4 antibody or analogue of DLL4, for example by immunoprecipitation.

Экспрессия белков в образце может быть оценена в соответствии с протоколами иммуногистохимического анализа и окрашивания. Было показано, что иммуногистохимическое окрашивание тканевых срезов представляет собой надежный метод оценки или детектирования присутствия белков в образце. Иммуногистохимические (ИГХ) методы предусматривают использование антитела для зондирования и визуализации клеточных антигенов in situ, обычно с использованием хромогенных или флуоресцентных реагентов. Для приготовления образца может быть использован образец ткани или клетки, взятый у млекопитающего (обычно у человека). Примерами таких образцов являются, но не ограничиваются ими, раковые клетки, такие как раковые клетки толстой кишки, молочной железы, предстательной железы, яичника, легких, желудка, поджелудочной железы, лимфомы и лейкоза. Образец может быть получен с применением различных процедур, известных специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, хирургическая операция, аспирация или биопсия. Ткань может быть свежей или замороженной. В одном из вариантов изобретения образец фиксируют и заливают в парафин или т.п. Образец ткани может быть фиксирован (то есть пресервирован) стандартными методами. Среднему специалисту в данной области известно, что выбор фиксирующего вещества зависит от целей гистологического окрашивания образца или какого-либо другого анализа. Среднему специалисту в данной области также известно, что время фиксации зависит от размера образца ткани и от используемого фиксирующего вещества. The expression of proteins in the sample can be evaluated in accordance with immunohistochemical analysis and staining protocols. It has been shown that immunohistochemical staining of tissue sections is a reliable method for assessing or detecting the presence of proteins in a sample. Immunohistochemical (IHC) methods involve the use of antibodies to probe and visualize cell antigens in situ , usually using chromogenic or fluorescent reagents. To prepare a sample, a tissue or cell sample taken from a mammal (usually a human) can be used. Examples of such samples include, but are not limited to, cancer cells, such as cancer cells of the colon, breast, prostate, ovary, lung, stomach, pancreas, lymphoma, and leukemia. The sample can be obtained using various procedures known to those skilled in the art, including but not limited to surgery, aspiration, or biopsy. The fabric may be fresh or frozen. In one embodiment of the invention, the sample is fixed and embedded in paraffin or the like. A tissue sample can be fixed (i.e., reserved) by standard methods. The average person skilled in the art knows that the choice of fixing substance depends on the goals of histological staining of the sample or some other analysis. The average person skilled in the art also knows that the fixation time depends on the size of the tissue sample and on the fixing substance used.

Иммуногистохимический (ИГХ) анализ может быть осуществлен в комбинации с другими методами, такими как морфологическое окрашивание и/или флуоресцентная гибридизация in-situ. Специалистам известны два общих метода ИГХ-анализа: прямой и непрямой анализы. В соответствии с первым анализом связывание антитела с антигеном-мишенью (например, DLL4) определяют прямым методом. В указанном прямом анализе используют меченый реагент, такой как флуоресцентная метка или меченное ферментом «первое» антитело, которое может быть визуализировано без взаимодействия с другим антителом. В типичном непрямом анализе неконъюгированное «первое» антитело связывается с антигеном, затем меченое «второе» антитело связывается с первым антителом. Если «второе» антитело конъюгировано с ферментой меткой, то для визуализации антигена добавляют хромогенный или флуорогенный субстрат. Амплификация сигнала может происходить в результате реакции нескольких «вторых» антител с различными эпитопами на «первом» антителе. Immunohistochemical (IHC) analysis can be carried out in combination with other methods, such as morphological staining and / or in situ fluorescence hybridization. Two general methods of IHC analysis are known to specialists: direct and indirect analyzes. According to a first assay, the binding of an antibody to a target antigen (e.g., DLL4) is determined by a direct method. In this direct assay, a labeled reagent is used, such as a fluorescent label or an “first” antibody labeled with the enzyme, which can be visualized without interaction with another antibody. In a typical indirect assay, the unconjugated “first” antibody binds to the antigen, then the labeled “second” antibody binds to the first antibody. If the “second” antibody is conjugated to an enzyme tag, then a chromogenic or fluorogenic substrate is added to visualize the antigen. Amplification of the signal can occur as a result of the reaction of several "second" antibodies with different epitopes on the "first" antibody.

«Первое» и/или «второе» антитело, используемое для иммуногистохимического анализа, обычно метят детектируемой молекулой. Существует множество меток, которые могут быть, в основном, разделены на группы в соответствии с описанными ниже категориями. The “first” and / or “second” antibody used for immunohistochemical analysis is usually labeled with a detectable molecule. There are many labels that can be basically divided into groups according to the categories described below.

Помимо процедур получения образца, обсуждаемых выше, может оказаться желательной дополнительная обработка срезов ткани, осуществляемая до, во время или после проведения ИГХ-анализа. Так, например, могут быть применены методы восстановления эпитопа, такие как нагревание образца ткани в цитратном буфере (см., например, Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)). In addition to the sample preparation procedures discussed above, additional processing of tissue sections may be desirable prior to, during, or after the IHC analysis. Thus, for example, epitope recovery techniques such as heating a tissue sample in citrate buffer can be applied (see, for example, Leong et al. Appl. Immunohistochem . 4 (3): 201 (1996)).

После проведения необязательной стадии блокирования срез ткани обрабатывают «первым» антителом в течение определенного периода времени и в подходящих условиях, достаточных для связывания первого антитела с белковым антигеном-мишенью в образце ткани. Соответствующие условия, подходящие для достижения данной цели, могут быть определены путем рутинного экспериментирования. Уровень связывания антитела с образцом определяют с использованием любой одной из детектируемых меток, обсуждаемых выше. Предпочтительной меткой является ферментная метка (например, HRPO), которая катализирует химическое превращение хромогенного субстрата, такого как 3,3'-диаминобензидиновый хромоген. Предпочтительно указанную ферментативную метку конъюгируют с антителом, которое специфически связывается с «первым» антителом (например, «первым» антителом является кроличье поликлональное антитело, «вторым» антителом является козье антикроличье антитело). After the optional blocking step, the tissue section is treated with the “first” antibody for a certain period of time and under suitable conditions sufficient to bind the first antibody to the target protein antigen in the tissue sample. Appropriate conditions suitable for achieving this goal can be determined through routine experimentation. The level of binding of the antibody to the sample is determined using any one of the detectable labels discussed above. A preferred label is an enzyme label (e.g., HRPO) that catalyzes the chemical conversion of a chromogenic substrate, such as a 3,3'-diaminobenzidine chromogen. Preferably, said enzymatic label is conjugated to an antibody that specifically binds to the “first” antibody (for example, the “first” antibody is a rabbit polyclonal antibody, the “second” antibody is a goat anti-rabbit antibody).

Приготовленные таким образом образцы могут быть получены в виде гистологических срезов и нанесены на предметные стекла. Затем эти предметные стекла анализируют под микроскопом и оценивают в соответствии с критериями интенсивности окрашивания, обычно используемыми специалистами в рутинных процедурах анализа. Интенсивность окрашивания может быть оценена по следующим критериям в табл.2:Thus prepared samples can be obtained in the form of histological sections and applied to slides. These slides are then analyzed under a microscope and evaluated according to staining intensity criteria commonly used by those skilled in routine analysis procedures. The staining intensity can be estimated by the following criteria in table 2:

Таблица 2table 2 Картина окрашивания Painting stain ОценкаRating Окрашивания в клетках не наблюдалось.Cell staining was not observed. 00 Очень слабое/едва заметное окрашивание наблюдалось в более чем 10% клеток.Very faint / barely noticeable staining was observed in more than 10% of the cells. 1+1+ Слабое-умеренное окрашивание наблюдалось в более чем 10% клеток. Slight to moderate staining was observed in more than 10% of the cells. 2+2+ Умеренное-интенсивное окрашивание наблюдалось в более чем 10% клеток. Moderate-intense staining was observed in more than 10% of the cells. 3+3+

Обычно в иммуногистохимическом анализе оценка картины окрашивания примерно 2+ или выше является диагностической и/или прогностической. В некоторых вариантах изобретения в иммуногистохимическом анализе оценка картины окрашивания примерно 1+ или выше является диагностической и/или прогностической. В других вариантах изобретения оценка картины окрашивания примерно 3 или выше является диагностической и/или прогностической. При этом следует отметить, что если клетки и/или ткани опухоли или аденомы толстой кишки оценивают с помощью иммуногистохимического анализа, то окрашивание обычно определяют или оценивают в опухолевых клетках и/или тканях (а не в стромальных или окружающих тканях, которые могут присутствовать в образце). Typically, in an immunohistochemical analysis, an assessment of a staining pattern of about 2+ or higher is diagnostic and / or prognostic. In some embodiments of the invention, in an immunohistochemical analysis, an assessment of a staining pattern of about 1+ or higher is diagnostic and / or prognostic. In other embodiments of the invention, an assessment of a staining pattern of about 3 or higher is diagnostic and / or prognostic. It should be noted that if cells and / or tissues of a tumor or colon adenomas are evaluated by immunohistochemical analysis, staining is usually determined or evaluated in tumor cells and / or tissues (and not in stromal or surrounding tissues that may be present in the sample )

Существуют также и другие аналитические методы, известные как конкурентные анализы или «сэндвич»-анализы, и такие методы широко используются в промышленности по изготовлению коммерчески доступных диагностических средств. There are also other analytical methods known as competitive assays or sandwich analyzes, and such methods are widely used in the commercially available diagnostic industry.

Конкурентные анализы основаны на способности аналога меченого DLL4 конкурировать с тестируемым образцом DLL4 за связывание с ограниченным числом антигенсвязывающих сайтов анти-DLL4-антитела. Анти-DLL4-антитело обычно подвергают инсолюбилизации до или после конкурентного связывания, затем метку и DLL4, связанные с анти-DLL4-антителом, отделяют от несвязанной метки и DLL4. Такое разделение осуществляют путем декантирования (где указанный партнер по связыванию был предварительно подвергнут инсолюбилизации) или путем центрифугирования (где партнер по связыванию был осажден после конкурентной реакции). Количество тестируемого образца DLL4 обратно пропорционально количеству связанной метки, как было определено по количеству вещества-маркера. Были построены кривые «доза - ответ» по известным количествам DLL4, и полученные результаты сравнивали с результатами теста для определения количества DLL4, присутствующего в тестируемом образце. Если в качестве детектируемых маркеров используются ферменты, то такие анализы называются ELISA-системами.Competitive assays are based on the ability of a labeled DLL4 analog to compete with a DLL4 test sample for binding to a limited number of antigen-binding sites of an anti-DLL4 antibody. The anti-DLL4 antibody is usually solubilized before or after competitive binding, then the label and DLL4 associated with the anti-DLL4 antibody are separated from the unbound label and DLL4. This separation is carried out by decantation (where the specified binding partner was previously subjected to solubilization) or by centrifugation (where the binding partner was precipitated after a competitive reaction). The amount of DLL4 test sample is inversely proportional to the amount of bound label, as determined by the amount of marker substance. Dose-response curves were constructed from known amounts of DLL4, and the results were compared with test results to determine the amount of DLL4 present in the test sample. If enzymes are used as detectable markers, then such analyzes are called ELISA systems.

Конкурентный анализ другого типа, называемый «гомогенным» анализом, не предусматривает разделения фаз. В данном случае конъюгат фермента с DLL4 получают и используют так, чтобы анти-DLL4-антитело при его связывании с DLL4 могло модифицировать ферментативную активность. В этом случае DLL4 или его иммунологически активные фрагменты конъюгируют с ферментом, таким как пероксидаза, посредством бифункционального органического мостика. Конъюгаты, предназначенные для использования с анти-DLL4-антителом, выбирают так, чтобы связывание анти-DLL4-антитела приводило к ингибированию или потенцированию ферментативной активности метки. Этот метод per se широко применяется на практике и называется EMIT. Another type of competitive analysis, called "homogeneous" analysis, does not involve phase separation. In this case, the enzyme conjugate with DLL4 is prepared and used so that the anti-DLL4 antibody, when linked to DLL4, can modify the enzymatic activity. In this case, DLL4 or immunologically active fragments thereof are conjugated to an enzyme, such as peroxidase, via a bifunctional organic bridge. Conjugates intended for use with an anti-DLL4 antibody are selected such that binding of the anti-DLL4 antibody results in inhibition or potentiation of the enzymatic activity of the label. This method per se is widely used in practice and is called EMIT.

В методах гомогенного анализа с применением стерического затруднения используются стерические конъюгаты. Эти конъюгаты синтезируют путем ковалентного связывания низкомолекулярного гаптена с небольшим фрагментом DLL4 так, чтобы антитело против гаптена было, по существу, неспособно связываться с данным конъюгатом одновременно с анти-DLL4-антителом. В этой процедуре анализа DLL4, присутствующий в тестируемом образце, будет связываться с анти-DLL4-антителом, что позволяет антителу против гаптена связываться с данным конъюгатом и приводить к изменению свойств гаптенового конъюгата, например к изменению интенсивности флуоресценции в том случае, если гаптеном является флуорофор. In methods of homogeneous analysis using steric hindrance, steric conjugates are used. These conjugates are synthesized by covalent binding of a low molecular weight hapten to a small fragment of DLL4 so that the anti-hapten antibody is substantially unable to bind to the conjugate simultaneously with the anti-DLL4 antibody. In this analysis procedure, the DLL4 present in the test sample will bind to the anti-DLL4 antibody, which allows the anti-hapten antibody to bind to this conjugate and change the properties of the hapten conjugate, for example, change the fluorescence intensity if the hapten is a fluorophore .

«Сэндвич»-анализы, в частности, могут быть использованы для определения DLL4 или анти-DLL4-антител. В последовательно проводимых «сэндвич»-анализах иммобилизованное анти-DLL4-антитело используют для адсорбции тестируемого образца DLL4, затем тестируемый образец удаляют путем промывки, и связанный DLL4 используют для адсорбции «второго» меченого анти-DLL4-антитела, после чего связанное вещество отделяют от остальной метки. Количество связанной метки прямо пропорционально количеству тестируемого образца DLL4. В «одновременно» проводимых «сэндвич»-анализах тестируемый образец не отделяют от метки перед добавлением меченого анти-DLL4-антитела. В образцах, тестируемых на присутствие DLL4, применяется последовательно проводимый «сэндвич»-анализ, в котором в качестве одного антитела используется моноклональное анти-DLL4-антитело, в качестве другого антитела используется поликлональное анти-DLL4-антитело. Sandwich analyzes, in particular, can be used to detect DLL4 or anti-DLL4 antibodies. In sequential sandwich analyzes, an immobilized anti-DLL4 antibody is used to adsorb the test sample DLL4, then the test sample is removed by washing and the bound DLL4 is used to adsorb the “second” labeled anti-DLL4 antibody, after which the bound material is separated from the rest of the label. The number of linked tags is directly proportional to the number of sample DLL4 samples. In “simultaneously” conducted “sandwich” assays, the test sample is not separated from the label before the addition of labeled anti-DLL4 antibody. Samples tested for the presence of DLL4 use a sequential sandwich assay using a monoclonal anti-DLL4 antibody as one antibody and a polyclonal anti-DLL4 antibody as another antibody.

Выше были описаны лишь репрезентативные анализы на DLL4. Другие методы, применяемые в настоящее время, или методы, которые будут разработаны в будущем и в которых для определения DLL4 будет использоваться анти-DLL4-антитело, входят в объем рассматриваемых методов, включая описанные здесь биоанализы. Only representative analyzes on DLL4 have been described above. Other methods currently in use, or methods that will be developed in the future and in which an anti-DLL4 antibody will be used to determine DLL4, are included in the scope of the methods considered, including the bioassays described here.

Промышленные изделияIndustrial products

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к промышленному изделию, содержащему материалы, используемые для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше расстройств. Промышленное изделие содержит контейнер и этикетку или вкладыш, вложенный в упаковку или наклеенный на контейнер. Подходящими контейнерами являются, например, бутыли, флаконы, шприцы и т.п. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Этот контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в комбинации с другой(ими) композицией(ями) является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики данного состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, таким контейнером может быть пакет для внутривенного введения раствора или сосуд, имеющий пробку, протыкаемую безыгольной иглой для инъекций). В данной композиции по меньшей мере одним активным агентом является антитело согласно изобретению. На этикетке или во вкладыше, вложенном в упаковку, должно быть указано, что такая композиция используется для лечения данного конкретного заболевания, такого как рак. Кроме того, указанное промышленное изделие может включать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, включающей антитело согласно изобретению, и (b) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, включающей дополнительное терапевтическое средство, включая, например, химиотерапевтическое средство или антиангиогенное средство, включая, например, анти-VEGF-антитело (например, бевацизумаб). В этом варианте изобретения промышленное изделие согласно изобретению может дополнительно содержать вложенный в упаковку вкладыш, в котором указано, что композиции, содержащие «первое» и «второе» антитело, могут быть использованы для лечения конкретного состояния, например рака. Альтернативно или дополнительно указанное промышленное изделие может также содержать второй (или третий) контейнер, включающий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать и другие материалы, необходимые для коммерческого производства и для потребителя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.In another aspect, the present invention relates to an industrial product containing materials used for the treatment, prevention and / or diagnosis of the above disorders. The industrial product comprises a container and a label or liner enclosed in the package or glued to the container. Suitable containers are, for example, bottles, vials, syringes, and the like. Containers can be made of various materials, such as glass or plastic. This container contains a composition that, alone or in combination with other composition (s), is effective for treating, preventing and / or diagnosing this condition, and may have a sterile inlet (for example, such a container may be an intravenous bag the introduction of a solution or a vessel having a plug pierced by a needle for injection). In this composition, the at least one active agent is an antibody of the invention. On the label or in the insert enclosed in the package, it should be indicated that such a composition is used to treat this particular disease, such as cancer. Furthermore, said industrial product may include (a) a first container containing a composition comprising an antibody of the invention, and (b) a second container containing a composition comprising an additional therapeutic agent, including, for example, a chemotherapeutic agent or an antiangiogenic agent including, for example, an anti-VEGF antibody (e.g., bevacizumab). In this embodiment of the invention, the industrial product according to the invention may further comprise a package insert, which indicates that compositions containing the “first” and “second” antibody can be used to treat a particular condition, such as cancer. Alternatively or additionally, said industrial product may also comprise a second (or third) container comprising a pharmaceutically acceptable buffer, such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate buffered saline, Ringer's solution, and dextrose solution. In addition, it may include other materials necessary for commercial production and for the consumer, including other buffers, diluents, filters, needles and syringes.

Ниже приводятся примеры способов и композиций согласно изобретению. При этом следует отметить, что исходя из приведенного выше общего описания изобретения могут быть осуществлены и другие различные варианты изобретения.The following are examples of methods and compositions according to the invention. It should be noted that on the basis of the above general description of the invention, various other variants of the invention can be implemented.

ПРИМЕРЫ EXAMPLES

Материалы и методыMaterials and methods

Коммерчески доступные реагенты, описанные в примерах, использовали в соответствии с инструкциями производителей, если это не оговорено особо. Источником клеток, используемых в нижеследующих примерах и во всем описании изобретения, является Американская коллекция типовых культур, American Type Culture Collection Manassas, VA 20108, и эти клетки идентифицируют по их регистрационным номерам ATCC®. Работы, цитируемые в примерах, перечислены после примеров. Все эти работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Commercially available reagents described in the examples were used in accordance with the manufacturer's instructions, unless otherwise indicated. The source of cells used in the following examples and throughout the description of the invention is the American Type Culture Collection, American Type Culture Collection Manassas, VA 20108, and these cells are identified by their ATCC® serial numbers. The works cited in the examples are listed after the examples. All of these works are introduced into the present description by reference.

Пример 1: Материалы и методыExample 1: Materials and Methods

В примерах были использованы следующие материалы и методы.In the examples, the following materials and methods were used.

Анализ HUVEC на сферах с фибриновым гелем. Анализ HUVEC на сферах с фибриновым гелем подробно описан в литературе (Nakatsu, M. N. et al. Microvasc Res 66, 102-12 (2003)). Вкратце, 3 сферы Cytodex™ (Amersham Pharmacia Biotech) покрывали 350-400 клетками HUVEC на сферу. Примерно 200 сфер, покрытых HUVEC, заливали в фибриновый сгусток в одну из лунок 12-луночного планшета для культивирования тканей. На верхнюю часть сгустка высевали 8×10⁴ клеток SF. Анализы завершали на 7-9-й день для проведения иммуноокрашивания и визуализации. В некоторых экспериментах разрастание HUVEC визуализировали путем окрашивания конъюгированным с биотином анти-CD31 антителом (клон WM59, eBioscience) и стрептавидином-Cy3. Для окрашивания ядер HUVEC фибриновые гели фиксировали в течение ночи в 2% параформальдегиде (PFA) и окрашивали 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, Sigma). Для окрашивания Ki67 фибриновые гели обрабатывали 10× трипсином-EDTA в течение 5 минут для удаления верхнего слоя SF, затем нейтрализовали 10% FBS в PBS и фиксировали в течение ночи в 4% PFA. Затем фибриновые гели блокировали 10% козьей сывороткой в PBST в течение 4 часов, после чего инкубировали в течение ночи с кроличьим антимышиным Ki67 (готовый к употреблению клон Sp6, LabVision), затем осуществляли детектирование с использованием «второго» Cy3-конъюгированного антитела против кроличьих IgG (Jackson ImmunoResearch). Все ночные процедуры инкубирования проводили при 4°C. HUVEC analysis on fibrin gel spheres. HUVEC analysis on fibrin gel spheres is described in detail in the literature (Nakatsu, MN et al. Microvasc Res 66, 102-12 (2003)). Briefly, 3 Cytodex ™ spheres (Amersham Pharmacia Biotech) were coated with 350-400 HUVEC cells per sphere. Approximately 200 spheres coated with HUVEC were poured into a fibrin clot in one of the wells of a 12-well tissue culture plate. 8 × 10 ⁴ SF cells were seeded onto the top of the clot. Assays were completed on day 7-9 for immunostaining and imaging. In some experiments, the growth of HUVEC was visualized by staining with biotin-conjugated anti-CD31 antibody (clone WM59, eBioscience) and streptavidin-Cy3. To stain HUVEC nuclei, fibrin gels were fixed overnight in 2% paraformaldehyde (PFA) and stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma). To stain Ki67, the fibrin gels were treated with 10 × trypsin-EDTA for 5 minutes to remove the top layer of SF, then neutralized with 10% FBS in PBS and fixed overnight in 4% PFA. Fibrin gels were then blocked with 10% goat serum in PBST for 4 hours, then incubated overnight with rabbit anti-mouse Ki67 (ready-to-use Sp6 clone, LabVision), then detected using a “second” Cy3-conjugated anti-rabbit IgG antibody (Jackson ImmunoResearch). All overnight incubation procedures were performed at 4 ° C.

Исследование сетчатки новорожденных мышей. Новорожденным мышам CD1 от одного и того же помета i.p. инъекцировали PBS или YW26.82 (10 мг/кг) на P1 и P3. Глаза извлекали на P5 и фиксировали 4% PFA в PBS в течение ночи. Иссеченные сетчатки блокировали 10% козьей сывороткой в PBST в течение 3 часов, затем инкубировали в течение ночи с «первыми» антителами. Первая смесь включала биотинилированный изолектин B4 (25 мкг/мл, Bandeiraea simplicifolia; Sigma), и один из нижеследующих компонентов, таких как кроличье антимышиное Ki67 (1:1, готовый к употреблению клон Sp6, Lab Vision) или мышиное Cy3-конъюгированное антитело против альфа-SMA (1:2000, Sigma-Aldrich) и 10% сыворотку в PBLEC (1% тритон X-100, 0,1 мM CaCl₂, 0,1 мM MgCl₂, 0,1 мM MnCl₂ в PBS, pH 6,8). Затем сетчатки промывали в PBST и инкубировали в течение ночи с комбинацией «второго» антитела и стрептавидина Alexa Fluor® 488 (1:200; Molecular Probes) и с Cy3-конъюгированным антителом против кроличьих IgG (1:200; Jackson ImmunoResearch). После завершения окрашивания сетчатки фиксировали 4% PFA в PBS. Все ночные процедуры инкубирования проводили при 4°C. Изображения гистологических срезов сетчатки получали на предметном стекле с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.The study of the retina of newborn mice. Newborn CD1 mice from the same litter ip were injected with PBS or YW26.82 (10 mg / kg) on P1 and P3. Eyes were removed at P5 and fixed at 4% PFA in PBS overnight. Excised retinas were blocked with 10% goat serum in PBST for 3 hours, then incubated overnight with the “first” antibodies. The first mixture included biotinylated isolectin B4 (25 μg / ml, Bandeiraea simplicifolia ; Sigma), and one of the following components, such as rabbit anti-mouse Ki67 (1: 1, ready-to-eat clone Sp6, Lab Vision) or mouse Cy3-conjugated anti-mouse antibody alpha-SMA (1: 2000, Sigma-Aldrich) and 10% serum in PBLEC (1% Triton X-100, 0.1 mM CaCl ₂ , 0.1 mM MgCl ₂ , 0.1 mM MnCl ₂ in PBS, pH 6.8). The retinas were then washed in PBST and incubated overnight with a combination of the “second” antibody and streptavidin Alexa Fluor® 488 (1: 200; Molecular Probes) and with a Cy3-conjugated anti-rabbit IgG antibody (1: 200; Jackson ImmunoResearch). After retinal staining was completed, 4% PFA in PBS was fixed. All overnight incubation procedures were performed at 4 ° C. Images of histological sections of the retina were obtained on a slide using confocal fluorescence microscopy.

Модели опухоли. Были использованы 8-10-недельные самки «голых» мышей с врожденным отсутствием природных клеток-киллеров. Для генерирования подкожных опухолей мышам в правый задний бок инъецировали 0,1 мл клеточной суспензии, содержащей 50% матригеля (BD Bioscience). Каждой мыши инъецировали 5×10⁶ раковых клеток человеческой толстой кишки HM7, 10×10⁶ клеток карциномы человеческой толстой кишки Colo205, 10×10⁶ клеток карциномы легких человека Calu6, 10×10⁶ клеток карциномы легких человека MV-522, 10×10⁶ клеток мышиного лейкоза WEHI-3, 10×10⁶ клеток мышиной лимфомы EL4, 10×10⁶ клеток рака яичника человека SK-OV-3 X1, 10×10⁶ клеток мышиного рака легких LL2, 10×10⁶ клеток лейкоза/лимфомы EL4 или 10×10⁶ клеток немелкоклеточного рака легких H1299. Для получения модели человеческой меланомы MDA-MB-435 мышам в жировое тело молочной железы инъецировали 0,1 мл клеточной (5×10⁶) суспензии, содержащей 50% матригель. Анти-DLL4-антитело YW26.82 вводили i.p. (10 мг/кг массы тела, два раза в неделю). Для получения следующих моделей опухоли каждой исследуемой мыши в правый бок подкожно имплантировали фрагмент опухоли (1 мм³): не-мелкоклеточного рака легких SKMES-1, рака молочной железы человека MX-1, рака прямой и ободочной кишки человека SW620 и человеческой аденокарциномы LS174T. Размер опухоли оценивали с помощью штангенциркуля. Объем опухоли (мм³) определяли путем измерения длины (l) и ширины (w) и вычисляли по формуле (V = lw ²/2). Каждая группа включала 10-15 животных. Статистическое сравнение групп обработки осуществляли с помощью двухстороннего т-критерия Стьюдента. Tumor models. Were used 8-10-week-old female "naked" mice with a congenital absence of natural killer cells. To generate subcutaneous tumors, mice were injected with 0.1 ml of a cell suspension containing 50% matrigel in the right hind flank (BD Bioscience). Each mouse was injected with 5 × 10 ⁶ cancer cells of the human colon HM7, 10 × 10 ⁶ cells of carcinoma of the human colon Colo205, 10 × 10 ⁶ cells of human lung carcinoma Calu6, 10 × 10 ⁶ cells of human lung carcinoma MV-522, 10 × 10 ⁶ WEHI-3 mouse leukemia cells, 10 × 10 ⁶ EL4 murine lymphoma cells, 10 × 10 ⁶ human ovarian cancer cells SK-OV-3 X1, 10 × 10 ⁶ LL2 murine lung cancer cells, 10 × 10 ⁶ leukemia / lymphoma cells EL4 or 10 × 10 ⁶ non-small cell lung cancer cells H1299. To obtain a model of human melanoma MDA-MB-435, mice were injected with 0.1 ml of cell (5 × 10 ⁶ ) suspension containing 50% matrigel in the fatty body of the mammary gland. Anti-DLL4 antibody YW26.82 was administered ip (10 mg / kg body weight, twice a week). To obtain the following tumor models of each test mouse, a tumor fragment (1 mm ³ ) was implanted subcutaneously in the right flank: SKMES-1 non-small cell lung cancer, MX-1 human breast cancer, SW620 human colon and colon cancer, and LS174T human adenocarcinoma. Tumor size was evaluated using a caliper. Tumor volume ^(mm3) was determined by measuring the length (l) and width (w) and calculated by the formula (V = lw ^2/2). Each group included 10-15 animals. Statistical comparison of treatment groups was performed using two-tailed student t-test.

Мечение и иммуногистохимический анализ сосудов опухоли.Labeling and immunohistochemical analysis of tumor vessels.

Мышей анестезировали изофлураном. Затем i.v. инъецировали ФИТЦ-меченый лектин Lycopersicon esculentum (150 мкг в 150 мкл 0,9% NaCl; Vector Laboratories) и оставляли на 5 минут для его поступления в кровоток, затем осуществляли системную перфузию. Сосудистую сеть подвергали транскардиальной перфузии 1% PFA в PBS в течение 3 минут. Опухоли удаляли и фиксировали путем погружения в то же самое фиксирующее вещество на 2 часа, после чего инкубировали в течение ночи в 30% сахарозе для криозащиты, затем заливали в OCT. Срезы (толщиной 4 мкм) окрашивали антителом против мышиного CD31 (1:50, BD Pharmingen), затем козьим антителом против крысиных IgG Alexa 594 (1:800, Molecular Probes).Mice were anesthetized with isoflurane. Iv was then injected with an FITC-labeled Lycopersicon esculentum lectin (150 μg in 150 μl 0.9% NaCl; Vector Laboratories) and left for 5 minutes to enter the bloodstream, followed by systemic perfusion. The vasculature was transcardially perfused with 1% PFA in PBS for 3 minutes. Tumors were removed and fixed by immersion in the same fixing substance for 2 hours, after which they were incubated overnight in 30% sucrose for cryoprotection, then poured into OCT. Sections (4 μm thick) were stained with anti-mouse CD31 antibody (1:50, BD Pharmingen), then goat anti-rat IgG antibody Alexa 594 (1: 800, Molecular Probes).

Гистологический и иммуногистохимический анализ мышиной тонкой кишки.Histological and immunohistochemical analysis of the mouse small intestine.

Были получены фиксированные в формалине и залитые в парафин срезы тканей мышиной тонкой кишки толщиной 3 мкм. Гистохимическую идентификацию клеток тонкой кишки осуществляли с использованием альцианового синего в соответствии с рекомендациями производителей (PolyScientific). Для окрашивания анти-Ki67 антителом срезы предварительно обрабатывали раствором для восстановления мишени (S1700, DAKO) и инкубировали с кроличьим анти-Ki67-антителом (1:200, клон SP6, Neomarkers). «Второе» козье антикроличье антитело в концентрации 7,5 г/мл (Vector labs) детектировали с использованием набора Vectastain ABC Elite Kit (Vector labs). Все Ki67-окрашенные срезы подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином Мейера. Для окрашивания HES-1 использовали антитело против крысиного HES-1 (клон NM1, MBL, International), затем TSA-HRP.Formal fixed and paraffin embedded tissue sections of mouse small intestine with a thickness of 3 μm were obtained. Histochemical identification of small intestine cells was performed using alcian blue in accordance with the manufacturer's recommendations (PolyScientific). For staining with anti-Ki67 antibody, the sections were pretreated with the target reconstitution solution (S1700, DAKO) and incubated with rabbit anti-Ki67 antibody (1: 200, clone SP6, Neomarkers). A “second” goat anti-rabbit antibody at a concentration of 7.5 g / ml (Vector labs) was detected using the Vectastain ABC Elite Kit (Vector labs). All Ki67-stained sections were contrast stained with Meyer hematoxylin. An anti-rat HES-1 antibody (clone NM1, MBL, International), then TSA-HRP, was used to stain HES-1.

Интерференция РНК. Набор дуплексов короткой интерферирующей РНК (киРНК) (SMART), нацеленных на человеческий DLL4, и контрольную не-нацеленную киРНК (Si Control Non-Target siRNA #2) закупали у компании Dharmacon. Дуплексы киРНК (50 нМ) трансфецировали в клетки HUVEC при 40% конфлюэнтности с использованием реагента OptiMEM-1® и липофектамина^ТМ 2000 (Invitrogen). FACS-анализ проводили через 48 часов после трансфекции киРНК. Ниже представлены последовательности набора SMART из 4 киРНК, нацеленных на DLL4:RNA interference. A set of short interfering RNA (siRNA) duplexes (SMART) targeting human DLL4 and a control non-targeted siRNA (Si Control Non-Target siRNA # 2) were purchased from Dharmacon. SiRNA duplexes (50 nM) were transfected into HUVEC cells at 40% confluency using OptiMEM-1® reagent and Lipofectamine ^TM 2000 (Invitrogen). FACS analysis was performed 48 hours after siRNA transfection. Below are the sequences of the SMART set of 4 siRNAs targeting DLL4:

CAACTGCCCTTATGGCTTTTT (SEQ ID NO:62) (олигонуклеотид 1, смысловая последовательность), CAACTGCCCTTATGGCTTTTT (SEQ ID NO: 62) (oligonucleotide 1, sense sequence),

AAAGCCATAAGGGCAGTTGTT (SEQ ID NO:63) (олигонуклеотид 1, антисмысловая последовательность), AAAGCCATAAGGGCAGTTGTT (SEQ ID NO: 63) (oligonucleotide 1, antisense sequence),

CAACTGCCCTTCAATTTCATT (SEQ ID NO:64) (олигонуклеотид 2, смысловая последовательность), CAACTGCCCTTCAATTTCATT (SEQ ID NO: 64) (oligonucleotide 2, sense sequence),

TGAAATTGAAGGGCAGTTGTT (SEQ ID NO:65) (олигонуклеотид 2, антисмысловая последовательность), TGAAATTGAAGGGCAGTTGTT (SEQ ID NO: 65) (oligonucleotide 2, antisense sequence),

TGACCAAGATCTCAACTACTT (SEQ ID NO:66) (олигонуклеотид 3, смысловая последовательность), TGACCAAGATCTCAACTACTT (SEQ ID NO: 66) (oligonucleotide 3, sense sequence),

GTAGTTGAGATCTTGGTCATT (SEQ ID NO:67) (олигонуклеотид 3, антисмысловая последовательность), GTAGTTGAGATCTTGGTCATT (SEQ ID NO: 67) (oligonucleotide 3, antisense sequence),

GGCCAACTATGCTTGTGAATT (SEQ ID NO:68) (олигонуклеотид 4, смысловая последовательность), GGCCAACTATGCTTGTGAATT (SEQ ID NO: 68) (oligonucleotide 4, sense sequence),

TTCACAAGCATAGTTGGCCTT (SEQ ID NO:69) (олигонуклеотид 4, антисмысловая последовательность).TTCACAAGCATAGTTGGCCTT (SEQ ID NO: 69) (oligonucleotide 4, antisense sequence).

Лиганд Notch: ELISA-анализ на блокирование Notch. 96-луночные микротитрационные планшеты покрывали рекомбинантным крысиным Notch1-Fc (rrNotch1-Fc, R&D Systems) в концентрации 0,5 мкг/мл. В этом анализе использовали кондиционированную среду, содержащую DLL4-AP (аминокислоты 1-404 DLL4, присоединенные к щелочной фосфатазе (AP) человеческой плаценты). Для получения кондиционированной среды клетки 293 были временно трансфецированы DLL4-AP-экспрессирующей плазмидой с использованием реагента Fugen6 (Roche Molecular Biochemicals). Через пять дней после трансфекции кондиционированную среду собирали, фильтровали и помещали на хранение при 4°C. Очищенные антитела, которые титровали начиная от 0,15 и до 25 мкг/мл, предварительно инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с DLL4-AP-кондиционированной средой при разведении, которое обеспечивало 50% максимально достижимое связывание с покрытым rrNotch1-Fc. Затем смесь антитела/DLL4-AP добавляли в rrNotch1-Fc-покрытый планшет в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего планшеты несколько раз промывали PBS. Связанный DLL4-AP детектировали с использованием реагента 1-Step PNPP (Pierce), используемого в качестве субстрата, и измеряли оптическую плотность (OD) на 405 нм. Идентичный анализ осуществляли с использованием DLL1-AP (человеческого DLL1, аминокислоты 1-445). Аналогичные анализы осуществляли с использованием очищенного DLL4-His (C-концевого His-меченого человеческого DLL4, аминокислоты 1-404) и Jag1-His (R & D system). Связанные His-меченые лиганды детектировали с использованием мышиного анти-His mAb (1 мкг/мл, Roche Molecular Biochemicals), биотинилированного козьего антимышиного антитела (Jackson ImmunoResearch) и стрептавидина-AP (Jackson ImmunoResearch).Notch ligand: Notch blocking ELISA. 96-well microtiter plates were coated with recombinant rat Notch1-Fc (rrNotch1-Fc, R&D Systems) at a concentration of 0.5 μg / ml. This assay used a conditioned medium containing DLL4-AP (amino acids 1-404 DLL4 attached to human placenta alkaline phosphatase (AP)). To obtain a conditioned medium, 293 cells were temporarily transfected with a DLL4-AP-expressing plasmid using Fugen6 reagent (Roche Molecular Biochemicals). Five days after transfection, the conditioned medium was collected, filtered and stored at 4 ° C. The purified antibodies, which were titrated from 0.15 to 25 μg / ml, were pre-incubated for 1 hour at room temperature with a DLL4-AP-conditioned medium at dilution, which provided 50% maximum achievable binding to coated rrNotch1-Fc. The antibody / DLL4-AP mixture was then added to the rrNotch1-Fc-coated plate for 1 hour at room temperature, after which the plates were washed several times with PBS. Bound DLL4-AP was detected using 1-Step PNPP reagent (Pierce), used as a substrate, and absorbance (OD) was measured at 405 nm. Identical analysis was performed using DLL1-AP (human DLL1, amino acids 1-445). Similar analyzes were performed using purified DLL4-His (C-terminal His-labeled human DLL4, amino acids 1-404) and Jag1-His (R & D system). Bound His-labeled ligands were detected using mouse anti-His mAb (1 μg / ml, Roche Molecular Biochemicals), biotinylated goat anti-mouse antibody (Jackson ImmunoResearch) and streptavidin-AP (Jackson ImmunoResearch).

Экстракция РНК и количественная ОТ-ПЦР в реальном времени. Экстракцию полноразмерной РНК из HUVEC в 2-мерной культуре осуществляли с использованием набора RNeasy® Mini Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителей. Для экстракции полноразмерной РНК из клеток HUVEC, растущих в фибриновых гелях, эти фибриновые гели обрабатывали 10× трипсином-EDTA (Gibco) в течение 5 минут для удаления верхнего слоя фибробластов, затем нейтрализовали 10% FBS в PBS. После этого фибриновые сгустки удаляли из лунок для культивирования ткани и подвергали центрифугированию (10K в течение 5 минут) в микропробирках для удаления избыточной жидкости. Полученные гелевые «гранулы» подвергали лизису с использованием буфера для лизиса (с помощью набора RNeasy® Mini Kit), затем обрабатывали как и в случае HUVEC в 2-мерной культуре. Качество РНК оценивали с использованием 6000 наночипов с РНК и биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies). Количественные ОТ-ПЦР в реальном времени проводили с тремя повторностями с использованием ПЦР-системы в реальном времени 7500 (Applied Biosystems). В качестве эталонного гена для нормализации использовали человеческий ген GAPDH. Уровни экспрессии выражали как средняя (± среднеквадратическая ошибка) кратность изменений мРНК по отношению к контролю для 3 отдельных определений. Ниже представлены последовательности прямого и обратного праймера и зондов для VEGFR2, TGFβ2 и GAPDH.RNA extraction and quantitative RT-PCR in real time. Extraction of full-length RNA from HUVEC in a 2-dimensional culture was carried out using the RNeasy® Mini Kit (Qiagen) in accordance with the manufacturers instructions. To extract full-length RNA from HUVEC cells growing in fibrin gels, these fibrin gels were treated with 10 × trypsin-EDTA (Gibco) for 5 minutes to remove the top layer of fibroblasts, then neutralized with 10% FBS in PBS. Thereafter, fibrin clots were removed from tissue culture wells and centrifuged (10K for 5 minutes) in microtubes to remove excess fluid. The obtained gel "granules" were lysed using a lysis buffer (using the RNeasy® Mini Kit), then processed as in the case of HUVEC in a 2-dimensional culture. RNA quality was evaluated using 6,000 RNA nanochips and an Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies). Real-time quantitative RT-PCR was performed in triplicate using a real-time PCR system of 7500 (Applied Biosystems). The human GAPDH gene was used as a reference gene for normalization. Expression levels were expressed as the average (± standard error) of the multiplicity of mRNA changes relative to the control for 3 separate determinations. The forward and reverse primer and probe sequences for VEGFR2, TGFβ2 and GAPDH are shown below.

TGFb2TGFb2

Прямой праймер: GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TA (SEQ ID NO:70)Direct primer: GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TA (SEQ ID NO: 70)

Обратный праймер: CAT CAT CAT TAT CAT CAT CAT TGT C (SEQ ID NO:71)Reverse Primer: CAT CAT CAT TAT CAT CAT CAT TGT C (SEQ ID NO: 71)

Зонд: AAT TCT TGG AAA AGT GGC AAG ACC AAA AT (SEQ ID NO:72)Probe: AAT TCT TGG AAA AGT GGC AAG ACC AAA AT (SEQ ID NO: 72)

VEGFR2VEGFR2

Прямой праймер: CTT TCC ACC AGC AGG AAG TAG (SEQ ID NO:73)Direct primer: CTT TCC ACC AGC AGG AAG TAG (SEQ ID NO: 73)

Обратный праймер: TGC AGT CCG AGG TCC TTT (SEQ ID NO:74)Reverse Primer: TGC AGT CCG AGG TCC TTT (SEQ ID NO: 74)

Зонд: CGC ATT TGA TTT TCA TTT CGA CAA CAG A (SEQ ID NO:75)Probe: CGC ATT TGA TTT TCA TTT CGA CAA CAG A (SEQ ID NO: 75)

GAPDHGAPDH

Прямой праймер: GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC (SEQ ID NO:76)Direct primer: GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC (SEQ ID NO: 76)

Обратный праймер: GAA GGT GAA GGT CGG AGT C (SEQ ID NO:77)Reverse Primer: GAA GGT GAA GGT CGG AGT C (SEQ ID NO: 77)

Зонд: CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC (SEQ ID NO:78)Probe: CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC (SEQ ID NO: 78)

Пример 2: Генерирование фаговых анти-DLL4-антител Example 2: Generation of phage anti-DLL4 antibodies

Библиотеки синтезированных фаговых антител конструировали на одной каркасной области (гуманизованное анти-ErbB2-антитело, 4D5) путем введения вариабельности в гипервариабельные области (CDR) тяжелой и легкой цепей (Lee, C. V. et al. J Mol Biol 340, 1073-93 (2004); Liang, W. C. et al. J Biol Chem 281, 951-61 (2006)). Пэннинг на планшетах с исходными библиотеками осуществляли в целях проведения анализа на His-меченый человеческий DLL4 (аминокислоты 1-404), иммобилизованный на иммунопланшетах MaxiSorp™. После четырех раундов обогащения клоны произвольно собирали и конкретные связывающиеся клоны идентифицировали с использованием фагового ELISA. Полученные hDLL4-связывающиеся клоны были затем скринированы с использованием His-меченого мышиного белка DLL4 для идентификации перекрестно-связывающихся клонов. Для каждого позитивного фагового клона вариабельные области тяжелой и легкой цепей субклонировали в экспрессионные векторы pRK, которые были сконструированы так, чтобы они были способны экспрессировать полноразмерные цепи IgG. Конструкции тяжелой и легкой цепи котрансфецировали в клетки 293 или CHO, и экспрессированные антитела выделяли из бессывороточной среды на аффинной колонке с белком А. Очищенные антитела тестировали с помощью ELISA на блокирование взаимодействия DLL4 с крысиным Notch1-Fc и с помощью FACS на связывание со стабильными клеточными линиями, экспрессирующими либо полноразмерный человеческий DLL4 либо мышиный DLL4. Для созревания аффинности фаговые библиотеки с тремя различными комбинациями CDR-петель (CDR-L3, -H1 и -H2), происходящих от представляющего интерес исходного клона, конструировали с применением стратегии мягкой рандомизации так, чтобы каждое выбранное положение было модифицировано с получением остатка не-дикого типа или чтобы поддерживалось соотношение остатков не-дикого типа к остаткам дикого типа, составляющее примерно 50:50 . Затем клоны с высокой аффинностью идентифицировали в четыре раунда пэннинга в жидкой фазе, проводимого для анализа на человеческие и мышиные His-меченые белки DLL4 в условиях постоянно возрастающей жесткости. Libraries of synthesized phage antibodies were constructed on a single framework region (humanized anti-ErbB2 antibody, 4D5) by introducing variability in the heavy and light chain hypervariable regions (CDRs) (Lee, CV et al. J Mol Biol 340, 1073-93 (2004) ; Liang, WC et al. J Biol Chem 281, 951-61 (2006)). Panning on tablets with source libraries was performed to analyze His-labeled human DLL4 (amino acids 1-404) immobilized on MaxiSorp ™ immuno-plates. After four rounds of enrichment, clones were randomly collected and specific binding clones were identified using phage ELISA. The resulting hDLL4-binding clones were then screened using His-labeled mouse DLL4 mouse protein to identify cross-linking clones. For each positive phage clone, the variable regions of the heavy and light chains were subcloned into pRK expression vectors that were designed to express full-length IgG chains. The heavy and light chain constructs were cotransfected into 293 or CHO cells, and the expressed antibodies were isolated from serum-free medium on an affinity column with protein A. Purified antibodies were tested by ELISA to block the interaction of DLL4 with rat Notch1-Fc and FACS to bind to stable cell lines expressing either full-sized human DLL4 or mouse DLL4. For affinity maturation, phage libraries with three different combinations of CDR loops (CDR-L3, -H1, and -H2) originating from the original clone of interest were constructed using a soft randomization strategy so that each selected position was modified to produce a non-residual wild-type or to maintain a ratio of non-wild-type residues to wild-type residues of about 50:50. Clones with high affinity were then identified in four rounds of liquid phase panning performed for analysis on human and mouse His-tagged DLL4 proteins under conditions of ever increasing stiffness.

Пример 3: Характеризация анти-DLL4-антителExample 3: Characterization of anti-DLL4 antibodies

Для определения аффинности связывания анти-DLL4 Mab проводили измерение с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SRP) на устройстве BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активировали гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщиков. Анти-DLL4-антитело разводили 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл, затем инъецировали при скорости потока 5 мкл/минуту до достижения величины единиц отклика (RU) связанного антитела, составляющей примерно 500. Затем для блокирования непрореагировавших групп вводили 1М этаноламин. Для измерения кинетики реакции вводили инъекции двухкратных серийных разведений человеческих или мышиных молекул DLL4-His (0,7 нМ-500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твина^ТМ 20 при 25°С и при скорости потока 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k_on) и скорость диссоциации (k_off) вычисляли с использованием простой лангмюровской модели связывания 1:1 (BIAcore Evaluation Software version 3.2). Константу равновесной диссоциации (Кd) вычисляли как отношение k_off/k_on. Результаты этого эксперимента представлены в табл.3. Антитело YW26.81 давало аналогичные величины Kd для человеческого и мышиного DLL4 (величины Kd составляли 0,1 нМ и 0,09 нМ соответственно), что позволяет проводить оценку эффективного действия антител на мышиных моделях. To determine the binding affinity of anti-DLL4 Mab, measurements were made using surface plasmon resonance (SRP) on a BIAcore ™ -3000 device (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Briefly, carboxymethylated dextran biosensor chips (CM5, BIAcore Inc.) were activated with N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) according to the instructions of the suppliers. The anti-DLL4 antibody was diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8, to 5 μg / ml, then injected at a flow rate of 5 μl / min until the response unit (RU) of the bound antibody was approximately 500. Then, to block unreacted groups were injected with 1M ethanolamine. To measure the reaction kinetics, two serial dilutions of human or murine DLL4-His molecules (0.7 nM-500 nM) were injected in PBS containing 0.05% ^TM 20 tween at 25 ° C and at a flow rate of 25 μl / min. Association rate (k _on ) and dissociation rate (k _off ) were calculated using a simple 1: 1 Langmuir binding model (BIAcore Evaluation Software version 3.2). The equilibrium dissociation constant (Kd) was calculated as the ratio k _off / k _on . The results of this experiment are presented in table.3. Antibody YW26.81 yielded similar Kd values for human and mouse DLL4 (Kd values were 0.1 nM and 0.09 nM, respectively), which allows an assessment of the effective effect of antibodies in mouse models.

Таблица 3
Аффинность и кинетика связывания анти-DLL4-антител с человеческим и мышиным DLL4. «NA» означает, что измерения не проводилиTable 3
The affinity and kinetics of binding of anti-DLL4 antibodies to human and murine DLL4. “NA” means no measurements КлонClone мышиный дельта 4 (ECD5.5)mouse delta 4 (ECD5.5) человеческий дельта4 (ECD5.5)human delta4 (ECD5.5) k_on/10⁵ k _on / 10 ⁵ k_off/10^-4 k _off / 10 ^-4 Kd(нМ)Kd (nM) k_on/10⁵ k _on / 10 ⁵ k_off/10^-4 k _off / 10 ^-4 Kd(нМ)Kd (nM) YW26Yw26 0,570.57 1616 2828 0,30.3 7,47.4 2525 YW26.6YW26.6 4,14.1 0,610.61 0,150.15 22 0,490.49 0,250.25 YW26.14YW26.14 3,33.3 0,730.73 0,220.22 1,81.8 0,660.66 0,370.37 YW26.20YW26.20 3,33.3 1one 0,30.3 1,71.7 0,790.79 0,460.46 YW26.34YW26.34 3,63.6 0,650.65 0,180.18 1,91.9 0,670.67 0,350.35 YW26.82YW26.82 5,45,4 0,460.46 0,090.09 2,42,4 0,370.37 0,150.15

Пример 4: Дополнительная характеризация анти-DLL4-антителаExample 4: Additional characterization of anti-DLL4 antibodies

Картирование эпитопов анти-DLL4 Mab YW26.82: Анти-DLL4 Mab 26.82 распознавало детерминанту связывания, присутствующую в EGF-подобном повторе # 2 (EGL2) человеческого внеклеточного домена DLL4 (ECD). EGL2 содержит аминокислоты 252-282 человеческого ECD DLL4. Вкратце, мутанты ECD DLL4 были экспрессированы как гибридные белки со щелочной фосфатазой и было проанализировано их связывание с антителом. На фиг.11a схематически представлен набор мутантов DLL4, экспрессируемых в виде С-концевых гибридных белков с щелочной фосфатазой (AP) в плаценте человека. В скобках указаны последовательности DLL4, включенные в гибридные белки. Среду, кондиционированную клетками 293T и содержащую гибридные белки, тестировали на 96-луночных микротитрационных планшетах, покрытых очищенным анти-DLL4 Mab (YW26.82, 0,5 мкг/мл). Связанный DLL4.AP детектировали с использованием реагента 1-Step PNPP (Pierce) в качестве субстрата и измеряли оптическую плотность OD на 405 нм. Mab YW26.82 связывалось с конструкциями, содержащими домен EGL2 DLL4, и не связывалось с конструкцией, не содержащей домена EGL2 DLL4. Эти результаты показали, что анти-DLL4 Mab YW 26.82 распознавало эпитоп в домене EGL2 человеческого ECD DLL4.Mapping epitopes of anti-DLL4 Mab YW26.82: Anti-DLL4 Mab 26.82 recognized the binding determinant present in EGF-like repeat # 2 (EGL2) of the human extracellular domain DLL4 (ECD). EGL2 contains amino acids 252-282 of the human ECD DLL4. Briefly, ECD DLL4 mutants were expressed as alkaline phosphatase fusion proteins and their binding to the antibody was analyzed. 11 a is a schematic representation of a set of DLL4 mutants expressed as C-terminal fusion proteins with alkaline phosphatase (AP) in a human placenta. The parentheses indicate the DLL4 sequences included in the fusion proteins. 293T cell conditioned media containing fusion proteins was tested on 96-well microtiter plates coated with purified anti-DLL4 Mab (YW26.82, 0.5 μg / ml). The associated DLL4.AP was detected using 1-Step PNPP reagent (Pierce) as a substrate and OD absorbance was measured at 405 nm. Mab YW26.82 associated with constructs containing the EGL2 DLL4 domain, and did not bind to constructs containing the EGL2 DLL4 domain. These results showed that anti-DLL4 Mab YW 26.82 recognized the epitope in the EGL2 domain of human ECD DLL4.

Mab YW26.82 селективно связывается с мышиным и человеческим DLL4. 96-луночные планшеты Nunc Maxisorp покрывали очищенными рекомбинантными белками как указано выше (1 мкг/мл). Связывание YW26.82 в указанных концентрациях измеряли с помощью ELISA. Связанные антитела детектировали с помощью ПХ-конъюгированного античеловеческого антитела с использованием TMB в качестве субстрата и измеряли оптическую плотность OD на 450 нм. В качестве аналитического контроля использовали анти-HER2-антитело и рекомбинантный ErbB2-ECD (фиг.11b). Результаты этого эксперимента представлены на фигуре 11b. Mab YW26.82 связывалось с человеческим и мышиным DLL4 и не связывалось с человеческим DLL1 и человеческим JAG1 на детектируемом уровне. Эти результаты показали, что Mab YW26.82 селективно связывается с DLL4.Mab YW26.82 selectively binds to murine and human DLL4. Nunc Maxisorp 96-well plates were coated with purified recombinant proteins as described above (1 μg / ml). The binding of YW26.82 at the indicated concentrations was measured by ELISA. Bound antibodies were detected using a PX-conjugated anti-human antibody using TMB as a substrate and OD absorbance was measured at 450 nm. As an analytical control, an anti-HER2 antibody and recombinant ErbB2-ECD were used (Fig. 11b). The results of this experiment are presented in figure 11b. Mab YW26.82 binds to human and mouse DLL4 and does not bind to human DLL1 and human JAG1 at a detectable level. These results showed that Mab YW26.82 selectively binds to DLL4.

FACS-анализ клеток 293, временно трансфецированных вектором, полноразмерным DLL4, Jag1 или DLL1, также продемонстрировал, что Mab YW26.82 селективно связывается с DLL4. Как показано на фиг.11c, значительный уровень связывания YW26.82 детектировался только на DLL4-трансфецированных клетках (верхняя панель). На DLL1- или Jag1-трансфецированных клетках какого-либо значимого связывания не наблюдалось. Экспрессия Jag1 и DLL1 была подтверждена посредством связывания рекомбинантного крысиного Notch1-Fc (rrNotch1-Fc, средняя панель) и рекомбинантного крысиного Notch2-Fc (rrNotch2-Fc, нижняя панель) соответственно. YW26.82, rrNotch1-Fc или rrNotch2-Fc (R & D system) использовали при 2 мкг/мл, затем использовали ФЭ-конъюгированное козье антитело против человеческих IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch). FACS analysis of 293 cells temporarily transfected with a vector full-sized DLL4, Jag1 or DLL1 also demonstrated that Mab YW26.82 selectively binds to DLL4. As shown in FIG. 11c, a significant level of binding of YW26.82 was detected only on DLL4-transfected cells (top panel). No significant binding was observed on DLL1 or Jag1 transfected cells. The expression of Jag1 and DLL1 was confirmed by binding of recombinant rat Notch1-Fc (rrNotch1-Fc, middle panel) and recombinant rat Notch2-Fc (rrNotch2-Fc, bottom panel), respectively. YW26.82, rrNotch1-Fc or rrNotch2-Fc (R & D system) was used at 2 μg / ml, then a PV-conjugated goat anti-human IgG antibody was used (1: 500, Jackson ImmunoResearch).

Эксперименты на конкурентное связывание показали, что Mab YW26.82 эффективно и селективно блокирует взаимодействие Notch с DLL4, но не с другими лигандами Notch. Как показано на фиг.11d, анти-DLL4 Mab блокирует связывание DLL4-AP, но не DLL1-AP, с покрытым rNotch1, при вычисленном IC50 ~12 нМ (левая панель). Анти-DLL4 Mab блокирует связывание DLL4-His, но не Jag1-His, с покрытым rNotch1, при вычисленном IC50 ~8 нМ (правая панель). Competitive binding experiments have shown that Mab YW26.82 effectively and selectively blocks Notch interaction with DLL4, but not with other Notch ligands. As shown in FIG. 11d, the anti-DLL4 Mab blocks the binding of the DLL4-AP, but not the DLL1-AP, with rNotch1 covered, with the calculated IC50 ~ 12 nM (left panel). Anti-DLL4 Mab blocks the binding of DLL4-His, but not Jag1-His, to rNotch1 coated, with an IC50 of ~ 8 nM calculated (right panel).

Анти-DLL4 Mab YW26.82 специфически связывалось с эндогенно экспрессируемым DLL4 в эндотелиальных человеческих клетках пупочной вены (HUVEC). Был проведен FACS-анализ HUVEC, трансфецированных контрольной или DLL4-специфической киРНК. YW26.82 использовали при 2 мкг/мл, затем использовали ФЭ-конъюгированное козье антитело против человеческого IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch). Результаты этого эксперимента представлены на фиг.11e. При этом наблюдалось связывание с нетрансфецированными HUVEC (контроль) и с HUVEC, трансфецированными контрольной киРНК. В противоположность этому уровень связывания с HUVEC, трансфецированных киРНК DLL4, значительно снижался. Эти эксперименты продемонстрировали, что анти-DLL4 Mab YW26.82 специфически связывается с эндогенно экспрессируемым DLL4 в HUVEC.Anti-DLL4 Mab YW26.82 specifically binds to endogenously expressed DLL4 in endothelial human umbilical vein cells (HUVEC). FACS analysis of HUVECs transfected with control or DLL4-specific siRNA was performed. YW26.82 was used at 2 μg / ml, then a PV-conjugated goat anti-human IgG antibody was used (1: 500, Jackson ImmunoResearch). The results of this experiment are presented in FIG. 11e. In this case, binding was observed with untransfected HUVEC (control) and with HUVEC transfected with control siRNA. In contrast, the level of binding to HUVEC transfected with DLL4 siRNA was significantly reduced. These experiments demonstrated that anti-DLL4 Mab YW26.82 specifically binds to endogenously expressed DLL4 in HUVEC.

Пример 5: Обработка анти-DLL4-антителом приводит к повышению уровня пролиферации эндотелиальных клеток in vitro Example 5: Treatment with anti-DLL4 antibody leads to increased in vitro endothelial cell proliferation

Эндотелиальные клетки человеческой пупочной вены (HUVEC), растущие в фибриновых гелях в присутствии совместно культивированных клеток фибробластов кожи человека (SF), дают отростки, имеющие четко выраженную полость-подобную структуру (Nakatsu, M. N. et al. Microvasc Res 66, 102-12 (2003)). Добавление анти-DLL4-антитела YW26.82 приводит к заметному увеличению длины и числа отростков (фиг.7a). Протеолитический процессинг Notch, катализируемый γ-секретазной активностью белкового комплекса, является основной стадией в процессе активации Notch (Baron, M. Semin Cell Dev Biol 14, 113-9 (2003)). Интересно отметить, что ингибитор γ-секретазы дибензазепин (DBZ) (van Es, J. H. et al. Nature 435, 959-63 (2005); Milano, J. et al. Toxicol Sci 82, 341-58 (2004)) оказывает такое же влияние на разрастание HUVEC. Принимая во внимание, что эти две обработки действуют по различным механизмам, следует отметить, что значительный уровень прорастания явно обусловлен ослаблением передачи сигнала Notch. Ki67-окрашивание показало, что усиленное прорастание ЭК вызвано повышением уровня пролиферации клеток (фиг.7b). В исходном анализе, проводимом в фибриновом геле, разрастание HUVEC и последующее образование полостей подтверждали путем совместного культивирования с клетками SF. При замене клеток SF кондиционированной средой, анти-DLL4 Mab и DBZ еще обладали способностью усиливать разрастание HUVEC (фиг.1c), что подтверждает автономную роль ЭК в передаче сигнала DLL4/Notch. В обратном эксперименте активация Notch иммобилизованным белком DLL4 приводила к значительному ингибированию роста клеток (фиг.7e). Эти результаты позволяют предположить, что состояние активации передачи сигнала DLL4/Notch тесно связано с пролиферацией ЭК. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), growing in fibrin gels in the presence of co-cultured human skin fibroblast (SF) cells, produce processes that have a distinct cavity-like structure (Nakatsu, MN et al. Microvasc Res 66, 102-12 ( 2003)). The addition of the anti-DLL4 antibody YW26.82 leads to a marked increase in the length and number of processes (Fig. 7a). Proteolytic processing of Notch, catalyzed by the γ-secretase activity of the protein complex, is the main stage in the activation of Notch (Baron, M. Semin Cell Dev Biol 14, 113-9 (2003)). It is interesting to note that the dibenzazepine (DBZ) γ-secretase inhibitor (van Es, JH et al. Nature 435, 959-63 (2005); Milano, J. et al. Toxicol Sci 82, 341-58 (2004)) has this same effect on the overgrowth of HUVEC. Taking into account that these two treatments act by different mechanisms, it should be noted that a significant level of germination is clearly due to the weakening of Notch signal transmission. Ki67 staining showed that enhanced EC germination is caused by an increase in cell proliferation (Fig. 7b). In the initial fibrin gel assay, HUVEC growth and subsequent cavity formation were confirmed by co-culture with SF cells. When replacing SF cells with conditioned medium, anti-DLL4 Mab and DBZ still had the ability to enhance HUVEC proliferation (Fig. 1c), which confirms the autonomous role of EC in the transmission of DLL4 / Notch signal. In a reverse experiment, Notch activation by the immobilized DLL4 protein resulted in significant inhibition of cell growth (Fig. 7e). These results suggest that the activation state of DLL4 / Notch signaling is closely related to EC proliferation.

Пример 6: Обработка анти-DLL4-антителом приводит к повышению уровня пролиферации эндотелиальных клеток in vivo Example 6: Treatment with anti-DLL4 antibody leads to increased in vivo endothelial cell proliferation

В сетчатке мышей сразу после рождения развивается стереотипический сосудистый рисунок в хорошо определенной последовательности событий (Stone, J. & Dreher, Z. J Comp Neurol 255, 35-49 (1987); Gerhardt, H. et al. J. Cell Biol. 161, 1163-77 (2003); Fruttiger, M. Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 522-7 (2002)). Явно выраженная и динамическая экспрессия DLL4 в растущих ЭК в сетчатке новорожденных мышей позволяет предположить о возможной роли DLL4 в регуляции развития сосудов сетчатки (Claxton, S. & Fruttiger, M. Gene Expr Patterns 5, 123-7 (2004)). Системная доставка YW26.82 приводила к значительному изменению сосудистой сети сетчатки. В сетчатке происходила массивная аккумуляция ЭК, в результате чего образовывалась складчатая структура с примитивной сосудистой морфологией (фиг.7d). В ЭК наблюдалось значительное увеличение интенсивности Ki67-мечения, что указывает на усиление пролиферации ЭК (фиг.7h). Поэтому такой гиперпролиферативный фенотип ЭК сетчатки после блокады DLL4 у новорожденных мышей подтвердил данные in vitro. In the retina of mice, immediately after birth, a stereotypical vascular pattern develops in a well-defined sequence of events (Stone, J. & Dreher, Z. J Comp Neurol 255, 35-49 (1987); Gerhardt, H. et al. J. Cell Biol. 161 1163-77 (2003); Fruttiger, M. Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 522-7 (2002)). The pronounced and dynamic expression of DLL4 in growing EC in the retina of newborn mice suggests a possible role for DLL4 in the regulation of retinal vascular development (Claxton, S. & Fruttiger, M. Gene Expr Patterns 5, 123-7 (2004)). Systemic delivery of YW26.82 led to a significant change in the retinal vasculature. Massive accumulation of EC occurred in the retina, resulting in the formation of a folded structure with primitive vascular morphology (Fig.7d). In EC, a significant increase in the intensity of Ki67-labeling was observed, which indicates an increase in EC proliferation (Fig.7h). Therefore, such a hyperproliferative phenotype of EC retina after blockade of DLL4 in newborn mice confirmed in vitro data.

Пример 7: Основная роль DLL4/Notch в регуляции пролиферации эпителиальных клетокExample 7: The main role of DLL4 / Notch in the regulation of epithelial cell proliferation

VEGF регулирует несколько фундаментальных процессов в ЭК (Ferrara, N. Exs, 209-31 (2005); Coultas, L. et al. Nature 438, 937-45 (2005)). Однако в этой связи не очень понятно, каким образом сигналы VEGF интегрируются в сложных процессах образования сосудов, таких как артериофенозная (AV) дифференциация и иерархическая сосудистая организация, то есть события, которые, как очевидно, требуют дополнительных в высокой степени скоординированных путей передачи сигнала. Генетические исследования, проводимые на рыбе зебре, дают основание предположить, что VEGF действует перед каскадом реакций Notch во время артериальной эндотелиальной дифференциации (Lawson, N. D. et al. Development 128, 3675-83 (2001)). Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что VEGF-стимуляция HUVEC приводит к повышению уровня поверхностной экспрессии DLL4 (данные не приводятся), что соответствует недавно высказанному сообщению об активации мРНК DLL4 посредством VEGF-стимуляции (Patel, N. S. et al. Cancer Res 65, 8690-7 (2005)). Интересно отметить, что сам DLL4 активируется после активации Notch (фиг.12), что дает основание предположить о существовании механизма позитивной обратной связи, благодаря которому DLL4 эффективно передает сигнал VEGF на путь Notch. Вкратце, HUVEC стимулировали иммобилизованным C-концевым His-меченым человеческим DLL4 (аминокислоты 1-404) в отсутствие или в присутствии DBZ (0,08 мкM). Через 36 часов после стимуляции эндогенную экспрессию DLL4 оценивали с помощью FACS-анализа, проводимого с использованием анти-DLL4-антитела.VEGF regulates several fundamental processes in EC (Ferrara, N. Exs , 209-31 (2005); Coultas, L. et al. Nature 438, 937-45 (2005)). However, in this regard, it is not very clear how VEGF signals are integrated in complex processes of vascular formation, such as arteriophenous (AV) differentiation and hierarchical vascular organization, that is, events that, obviously, require additional highly coordinated signal transmission paths. Genetic studies on zebra fish suggest that VEGF acts before a cascade of Notch reactions during arterial endothelial differentiation (Lawson, ND et al. Development 128, 3675-83 (2001)). The inventors of the present invention have found that VEGF stimulation of HUVEC leads to an increase in the surface expression level of DLL4 (data not shown), which is consistent with a recent report on activation of DLL4 mRNA by VEGF stimulation (Patel, NS et al. Cancer Res 65, 8690- 7 (2005)). It is interesting to note that DLL4 itself is activated after Notch activation (Fig. 12), which suggests the existence of a positive feedback mechanism, thanks to which DLL4 efficiently transfers the VEGF signal to the Notch path. Briefly, HUVEC was stimulated with immobilized C-terminal His-labeled human DLL4 (amino acids 1-404) in the absence or presence of DBZ (0.08 μM). 36 hours after stimulation, endogenous expression of DLL4 was evaluated by FACS analysis using anti-DLL4 antibody.

Следует отметить, что гиперпролиферация ЭК, возникающая в результате блокирования передачи сигнала Notch, все же зависит от VEGF. В культуре 3-мерного фибринового геля обработка анти-VEGF Mab приводит к прекращению значительного уровня разрастания ЭК в присутствии или в отсутствие DBZ (фиг.7f), что повышает вероятность того, что гиперпролиферативное поведение может быть отчасти обусловлено усилением сигнала VEGF. Действительно, блокирование Notch под действием YW26.82 или DBZ приводит к активации VEGFR2 (фиг.7g). И наоборот, активация Notch под действием иммобилизованного DLL4 подавляет экспрессию VEGFR2 (фиг.7g). Поэтому хотя VEGF может действовать перед прохождением каскада реакций DLL4/Notch, однако DLL4/Notch способен к тонкой настройке ответа посредством негативной регуляции экспрессии VEGFR2.It should be noted that EC hyperproliferation resulting from blocking Notch signal transmission still depends on VEGF. In a 3-dimensional fibrin gel culture, treatment with anti-VEGF Mab terminates a significant level of EC growth in the presence or absence of DBZ (Fig. 7f), which increases the likelihood that hyperproliferative behavior may be due in part to amplification of the VEGF signal. Indeed, blocking Notch under the action of YW26.82 or DBZ leads to the activation of VEGFR2 (Fig.7g). Conversely, Notch activation by immobilized DLL4 inhibits the expression of VEGFR2 (Fig. 7g). Therefore, although VEGF can act before undergoing the cascade of DLL4 / Notch reactions, DLL4 / Notch is capable of fine-tuning the response by negatively regulating VEGFR2 expression.

Пример 8: Обработка анти-DLL4-антителом блокирует дифференцировку эндотелиальных клеток и развитие артерий Example 8: Treatment with anti-DLL4 antibody blocks endothelial cell differentiation and arterial development

Помимо повышения уровня пролиферации ЭК антагонистическое действие DLL4/Notch приводит к резкому морфологическому изменению отростков ЭК в фибриновом геле. Многоклеточные полость-подобные структуры, в основном, отсустствовали (фиг.8a), что позволяет предположить о нарушении дифференцировки ЭК. В сетчатках, обработанных моноклональным антителом Mab YW26.82, характерная картина радиально чередующихся артерий и вен была в значительной степени нарушена. Окрашивание антителом против α-актина гладкой мышцы (ASMA), которое ассоциируется с артериями сетчатки, полностью отсутствовало (фиг.8c). Такое наблюдение очень напоминало нарушение развития артерий у DLL4^+/--эмбрионов. Эти данные, со всех точек зрения, подтверждают, что DLL4/Notch играет главную роль в регуляции дифференцировки ЭК.In addition to increasing the level of EC proliferation, the antagonistic effect of DLL4 / Notch leads to a sharp morphological change in the processes of EC in the fibrin gel. Multicellular cavity-like structures were mostly absent (Fig. 8a), which suggests a violation of EC differentiation. In the retinas treated with Mab YW26.82 monoclonal antibody, the characteristic pattern of radially alternating arteries and veins was significantly impaired. Staining with anti-α-actin smooth muscle antibody (ASMA), which is associated with retinal arteries, was completely absent (Fig. 8c). This observation was very similar to impaired arterial development in DLL4 ^+/- embryos. These data, from all points of view, confirm that DLL4 / Notch plays a major role in the regulation of EC differentiation.

Пример 9: Экспрессия TFGβ ассоциируется с активированным состоянием NotchExample 9: Expression of TFGβ Associated with an Activated Notch State

Аналогично каскаду реакций Notch передача сигнала TGFβ зависит от его окружения и оказывает различные и часто противоположные действия на ингибирование дифференцировки, пролиферации и роста клеток. Кроме того, каскад реакций TGFβ участвует в процессах развития сосудов (Urness, L. D. et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000); Oshima, M. et al, Dev Biol 179, 297-302 (1996); Larsson, J. et al. Embo J 20, 1663-73 (2001)). Так, например, дефицит киназы 1, подобной рецептору активина (ALK1), то есть специфическому рецептору TGFβ типа I ЭК, приводит к образованию примитивной сетчатой структуры ЭК в желточных мешках и к недостаточной артериовенозной функции (AVM), то есть общего фенотипа, присущего мышам с нарушением передачи сигнала Notch (Urness, L. D. et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000); Iso, T. et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 23, 543-53 (2003)). Это натолкнуло авторов настоящего изобретения на мысль об иследовании возможной взаимосвязи между этими двумя каскадами реакций. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что экспрессия TGFβ2 (фиг.8b) непосредственно связана с активированным состоянием Notch, что позволяет предположить, что каскад реакций TGFβ может проходить после каскада реакций Notch. В целом, данные, полученные авторами настоящего изобретения, подтверждают модель, в которой система DLL4/Notch, служащая в качестве «линии передачи сигнала», интегрирует сигналы VEGF посредством регуляции экспрессии DLL4 и направляет TGFβ-путь на стимуляцию дифференцировки ЭК.Similar to the cascade of Notch reactions, TGFβ signal transmission depends on its environment and has various and often opposite effects on the inhibition of differentiation, proliferation and cell growth. In addition, the cascade of TGFβ reactions is involved in vascular development processes (Urness, LD et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000); Oshima, M. et al, Dev Biol 179, 297-302 (1996); Larsson, J . et al. Embo J 20, 1663-73 (2001)). For example, a deficiency of kinase 1, similar to the activin receptor (ALK1), that is, a specific TGFβ receptor of type I EC, leads to the formation of a primitive network structure of EC in the yolk sacs and to insufficient arteriovenous function (AVM), that is, a common phenotype inherent in mice with impaired signal transmission Notch (Urness, LD et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000); Iso, T. et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 23, 543-53 (2003)). This prompted the authors of the present invention to investigate the possible relationship between these two cascades of reactions. The inventors have found that the expression of TGFβ2 (Fig. 8b) is directly related to the activated state of Notch, suggesting that a cascade of TGFβ reactions may occur after a cascade of Notch reactions. In General, the data obtained by the authors of the present invention confirm the model in which the DLL4 / Notch system, serving as a "signal line", integrates VEGF signals by regulating the expression of DLL4 and directs the TGFβ pathway to stimulate differentiation of EC.

Пример 10: Обработка анти-DLL4-антителом ингибирует рост опухоли in vivo Example 10: Treatment with anti-DLL4 antibody inhibits tumor growth in vivo

Для полного выявления возможной роли передачи сигнала DLL4/Notch в процессе ангиогенеза опухоли авторами настоящего изобретения было исследовано влияние блокирования DLL4 на рост опухоли в преклинических моделях опухоли (фиг.9a-d). В моделях с ксенотрансплантатами опухолей HM7, Colo205 и Calu6 (фиг.9a-c) обработка антителом YW26.82 была инициирована после стабильного развития опухоли (после достижения размера опухоли ≥250 мм³). Во всех трех моделях различие в скоростях роста опухоли у контрольной группы и групп обработки становилось заметным через три дня после введения дозы. Объем опухоли у группы обработки оставался неизменным в течение двухнедельной обработки. Помимо подкожных опухолей анти-DLL4 Mab также ингибировало рост опухолей в жировом теле мышиной молочной железы. В модели опухоли MDA-MB-435 обработку начинали через 14 дней после инъекции опухолевых клеток. Различие кривых роста опухолей у контрольной группы и у групп обработки наблюдалось через шесть дней после введения дозы и становилось все более заметным по мере продолжения обработки (фиг.9d). To fully identify the possible role of DLL4 / Notch signal transmission in tumor angiogenesis, the authors of the present invention investigated the effect of DLL4 blocking on tumor growth in preclinical tumor models (FIGS. 9a-d). In models with xenografts of HM7, Colo205 and Calu6 tumors (Fig. 9a-c), treatment with antibody YW26.82 was initiated after stable tumor development (after reaching a tumor size of ≥250 mm ³ ). In all three models, the difference in tumor growth rates between the control and treatment groups became noticeable three days after the dose. The tumor volume in the treatment group remained unchanged during the two-week treatment. In addition to subcutaneous tumors, anti-DLL4 Mab also inhibited tumor growth in the fatty body of the murine mammary gland. In the MDA-MB-435 tumor model, treatment was started 14 days after tumor cell injection. The difference in the tumor growth curves between the control group and the treatment groups was observed six days after the dose and became more noticeable as treatment continued (Fig. 9d).

Авторами настоящего изобретения было также исследовано влияние блокирования DLL4 и/или VEGF на рост большого числа опухолей у преклинических моделей опухолей (фиг.9e-f; i-p). В моделях ксенотрансплантата опухолей MV-522 и WEHI3 обработка антителом YW26.82 и/или анти-VEGF-антителом была инициирована после стабильного развития опухоли (после достижения размера опухоли ≥250 мм³). В модели MV-522 обработка антителом YW26.82 и анти-VEGF-антителом приводила к ингибированию роста отдельных опухолей, комбинация из двух обработок давала еще больший эффект. В модели WEHI3 обработка анти-VEGF-антителом не оказывала какого-либо влияния на рост опухоли, обработка антителом YW26.82 приводила к значительному ингибированию роста опухоли. В моделях SK-OV-3X1, LL2, EL4, H1299, SKMES-1, MX-1, SW620 и LS174T обработка антителом YW26.82 (5 мг/кг, i.р., два раза в неделю) и/или обработка анти-VEGF-антителом (5 мг/кг, i.р., два раза в неделю) была проведена после стабильного развития опухолей. В каждой из этих моделей обработка одним антителом YW26.82 приводила к ингибированию роста опухоли. Кроме того, во всех моделях, в которых была протестирована указанная комбинация, антитело YW26.82 обнаруживало повышенную эффективность в комбинации с анти-VEGF-антителом.The authors of the present invention also investigated the effect of blocking DLL4 and / or VEGF on the growth of a large number of tumors in preclinical tumor models (Fig. 9e-f; ip). In tumor xenograft models MV-522 and WEHI3, treatment with YW26.82 and / or anti-VEGF antibody was initiated after stable tumor development (after reaching a tumor size of ≥250 mm ³ ). In the MV-522 model, treatment with YW26.82 antibody and anti-VEGF antibody led to inhibition of the growth of individual tumors, a combination of two treatments gave an even greater effect. In the WEHI3 model, treatment with anti-VEGF antibody did not have any effect on tumor growth; treatment with antibody YW26.82 led to significant inhibition of tumor growth. In the SK-OV-3X1, LL2, EL4, H1299, SKMES-1, MX-1, SW620 and LS174T models, treatment with YW26.82 antibody (5 mg / kg, i.r., twice a week) and / or treatment anti-VEGF antibody (5 mg / kg, i.p., twice a week) was performed after stable tumor development. In each of these models, treatment with YW26.82 single antibody resulted in inhibition of tumor growth. In addition, in all models in which this combination was tested, the YW26.82 antibody showed increased efficacy in combination with the anti-VEGF antibody.

Пример 11: Обработка анти-DLL4-антителом приводит к усилению пролиферации опухолевых эндотелиальных клетокExample 11: Treatment with anti-DLL4 antibody leads to increased proliferation of tumor endothelial cells

В исследованиях на ингибирование роста опухоли авторами настоящего изобретения была использована модель опухоли мышиной лимфомы EL4 для гистологического анализа сосудистой системы. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что обработка анти-DLL4 Mab приводит к резкому увеличению плотности эндотелиальных клеток (фиг.9g). В противоположность этому анти-VEGF-антитело дает абсолютно противоположный эффект (фиг.9g), хотя обе эти обработки обнаруживают аналогичную эффективность в этой модели. In studies on the inhibition of tumor growth, the authors of the present invention used a tumor model of murine lymphoma EL4 for histological analysis of the vascular system. The authors of the present invention, it was found that the treatment of anti-DLL4 Mab leads to a sharp increase in the density of endothelial cells (Fig.9g). In contrast, the anti-VEGF antibody gives the exact opposite effect (Fig. 9g), although both of these treatments show similar efficacy in this model.

Пример 12: Обработка анти-DLL4-антителом приводит к ингибированию перфузии сосудистой системы опухолиExample 12: Treatment with anti-DLL4 antibody leads to inhibition of tumor vascular perfusion

Поскольку in vitro блокирование каскада реакций DLL4/Notch ухудшает образование полость-подобной структуры эндотелиальными клетками (фиг.8a), то было проведено исследование для того, чтобы определить, вызывает ли обработка анти-DLL4 Mab аналогичное нарушение сосудистой системы опухоли и влияет ли она на эффективное поступление крови. Системная перфузия ФИТЦ-лектином показала, что обработка анти-DLL4 Mab приводит к значительному снижению уровня мечения опухолевых сосудов лектином (фиг.9h). Следует отметить, что, как было показано, нарушение артериовенозной (АV) функции у ALK1-дефицитных мышей приводит к нарушению кровообращения (Urness, L. D. et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000)). Принимая во внимание важную роль передачи сигнала DLL4/Notch в AV-дифференциации, следует отметить, что в сетчатке эмбрионов и новорожденных мышей анти-DLL4 Mab может влиять на конкретные события жизненного цикла опухолевых ЭК и вызывать нарушение направленного кровотока. Действительно, в опухолях Colo205, обработанных анти-DLL4 Mab, имеются области, где высокая плотность ЭК ассоциируется с низким содержанием жизнеспособных опухолевых клеток, что обусловлено слабой сосудистой функцией. Для лучшего понимания природы конкретных сосудистых нарушений были проведены дополнительные исследования с применением методов визуализации сосудистой системы. Since in vitro blocking of the cascade of DLL4 / Notch reactions worsens the formation of a cavity-like structure by endothelial cells (Fig. 8a), a study was conducted to determine if treatment with anti-DLL4 Mab causes a similar violation of the tumor vascular system and whether it affects effective blood flow. Systemic perfusion with FITC-lectin showed that treatment with anti-DLL4 Mab leads to a significant decrease in the level of labeling of tumor vessels with lectin (Fig. 9h). It should be noted that, as shown, the violation of arteriovenous (AV) function in ALK1-deficient mice leads to circulatory disorders (Urness, LD et al, Nat Genet 26, 328-31 (2000)). Taking into account the important role of DLL4 / Notch signal transmission in AV differentiation, it should be noted that in the retina of embryos and newborn mice, anti-DLL4 Mab can affect specific events in the life cycle of tumor EC and cause impaired directed blood flow. Indeed, in Colo205 tumors treated with anti-DLL4 Mab, there are areas where high EC density is associated with a low content of viable tumor cells, due to weak vascular function. To better understand the nature of specific vascular disorders, additional studies have been carried out using methods of visualization of the vascular system.

Пример 13: DLL4/Notch не играет важной роли в гомеостазе мышиной тонкой кишкиExample 13: DLL4 / Notch does not play an important role in mouse small intestine homeostasis

Принимая во внимание плейотропную роль передачи сигнала Notch в регуляции гомеостаза самообновляюшихся систем у новорожденных, основная проблема общего ингибирования Notch заключается в том, что такое ингибирование может иметь негативный эффект. Так, например, передача сигнала Notch необходима для сохранения недифференцированных клеток-предшественников крипты в тонком кишечнике (van Es, J. H. et al. Nature 435, 959-63 (2005); Fre, S. et al. Nature 435, 964-8 (2005)). Действительно, ингибиторы γ-секретазы, которые должны без взякого различия блокировать все активности Notch, вызывают нежелательные побочные эффекты у грызунов, что обусловлено увеличением массы бокаловидных клеток в компартменте крипты (Milano, J. et al. Toxicol Sci 82, 341-58 (2004); Wong, G. T. et al. J Biol Chem 279, 12876-82 (2004)). Авторами настоящего изобретения были проведены иммуногистохимические анализы тонкого кишечника мышей, обработанных анти-DLL4 Mab. В отличие от DBZ-обработки каких-либо различий в профилях дифференцировки или пролиферации эпителиальных клеток крипты у групп, обработанных анти-DLL4 Mab, и у контрольной группы после 6-недельной обработки не наблюдалось (фиг.10). Кроме того, анти-DLL4 Mab не оказывало влияния на экспрессию гена-мишени Notch для HES-1 в быстро делящейся и временно амплифицирующейся популяции (TA) (фиг.10). Эти результаты подтверждают мнение, что передача сигнала DLL4/Notch в значительной степени зависит от сосудистой системы. Given the pleiotropic role of Notch signaling in the regulation of homeostasis of self-renewing systems in newborns, the main problem with general Notch inhibition is that such inhibition can have a negative effect. For example, Notch signaling is necessary to preserve undifferentiated crypt precursor cells in the small intestine (van Es, JH et al. Nature 435, 959-63 (2005); Fre, S. et al. Nature 435, 964-8 ( 2005)). Indeed, γ-secretase inhibitors, which should block all Notch activities without a distinct difference, cause unwanted side effects in rodents, due to the increase in the mass of goblet cells in the crypt compartment (Milano, J. et al. Toxicol Sci 82, 341-58 (2004 ); Wong, GT et al. J Biol Chem 279, 12876-82 (2004)). The authors of the present invention conducted immunohistochemical analyzes of the small intestine of mice treated with anti-DLL4 Mab. In contrast to the DBZ treatment, no differences in the differentiation or proliferation profiles of crypt epithelial cells were observed in the groups treated with anti-DLL4 Mab and in the control group after 6 weeks of treatment (Fig. 10). In addition, anti-DLL4 Mab did not affect the expression of the Notch target gene for HES-1 in the rapidly dividing and temporarily amplifying population (TA) (FIG. 10). These results confirm the view that DLL4 / Notch signaling is highly dependent on the vascular system.

Пример 14: Обработка анти-DLL4-антителом не влияет на сосудистую сеть сетчатки взрослых мышейExample 14: Treatment with anti-DLL4 antibody does not affect the retinal vasculature of adult mice

Хотя блокирование DLL4 оказывает сильное влияние на развитие сосудистой системы сетчатки у новорожденных мышей, однако введение анти-DLL4-антитела не оказывало заметного влияния на сосудистую систему сетчатки взрослого животного (фиг.8d). Таким образом, передача сигнала DLL4/Notch играет решающую роль в процессе активного ангиогенеза, однако она играет менее важную роль в поддержании нормальной сосудистой системы. В подтверждение этого мнения можно отметить, что в процессе обработки анти-DLL4 Mab какой-либо заметной потери массы или гибели мышей с опухолью, которым вводили дозу 10 мг/кг два раза в неделю в течение 8 недель, не наблюдалось. В опухолевых моделях анти-DLL4 Mab и анти-VEGF-антитело оказывали противоположное действие на сосудистую систему опухоли, что позволяет сделать предположение о существовании неперекрывающихся механизмов их действия. Although blocking of DLL4 has a strong influence on the development of the vascular system of the retina in newborn mice, however, the administration of anti-DLL4 antibody did not have a noticeable effect on the vascular system of the retina of an adult animal (Fig. 8d). Thus, DLL4 / Notch signaling plays a crucial role in the process of active angiogenesis, but it plays a less important role in maintaining a normal vascular system. In support of this opinion, it can be noted that during the treatment with anti-DLL4 Mab, no noticeable weight loss or death of tumor mice, which were injected with a dose of 10 mg / kg twice a week for 8 weeks, was observed. In tumor models, anti-DLL4 Mab and anti-VEGF antibody had the opposite effect on the vascular system of the tumor, which suggests the existence of non-overlapping mechanisms of their action.

Хотя представленное выше изобретение подробно описано на примерах, которые приводятся для иллюстрации и лучшего понимания настоящего изобретения, однако приведенное выше описание изобретения и примеры его осуществления не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.Although the invention presented above is described in detail with examples that are provided to illustrate and better understand the present invention, the above description of the invention and examples of its implementation should not be construed as limiting the scope of the invention.

Claims (27)

1. Выделенное анти-DLL4-антитело, содержащее шесть HVR, где каждая HVR включает в себя, состоит или по существу состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-18, причем SEQ ID NO:10 соответствует HVR-L1, SEQ ID NO:11 соответствует HVR-L2, SEQ ID NO:12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 соответствует HVR-L3, SEQ ID NO:1 или 2 соответствует HVR-H1, SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 или 8 соответствует HVR-H2, и SEQ ID NO:9 соответствует HVR-H3.1. The selected anti-DLL4 antibody containing six HVRs, where each HVR includes, consists or essentially consists of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-18, wherein SEQ ID NO: 10 corresponds to HVR -L1, SEQ ID NO: 11 corresponds to HVR-L2, SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17 or 18 corresponds to HVR-L3, SEQ ID NO: 1 or 2 corresponds to HVR-H1, SEQ ID NO : 3, 4, 5, 6, 7 or 8 corresponds to HVR-H2, and SEQ ID NO: 9 corresponds to HVR-H3. 2. Антитело по п.1, содержащее HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей содержит соответственно либо SEQ ID NO:10, 11, 14, 2, 3 и 9; либо SEQ ID NO:10, 11, 15, 1,5 и 9; либо SEQ ID NO:10, 11, 16, 1, 6 и 9; либо SEQ ID NO:10, 11, 17, 1, 7 и 9; либо SEQ ID NO:10, 11, 18, 1,8 и 9.2. The antibody according to claim 1, containing HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3, where each of these areas respectively contains either SEQ ID NO: 10, 11, 14 , 2, 3, and 9; or SEQ ID NO: 10, 11, 15, 1.5, and 9; or SEQ ID NO: 10, 11, 16, 1, 6, and 9; or SEQ ID NO: 10, 11, 17, 1, 7, and 9; or SEQ ID NO: 10, 11, 18, 1.8, and 9. 3. Антитело по п.1 или 2, где по меньшей мере часть каркасной последовательности представляет собой человеческую консенсусную каркасную последовательность.3. The antibody according to claim 1 or 2, where at least part of the frame sequence is a human consensus frame sequence. 4. Антитело по п.1 или 2, содержащее человеческую консенсусную каркасную последовательность подгруппы каппа.4. The antibody according to claim 1 or 2, containing the human consensus framework sequence of the Kappa subgroup. 5. Антитело по п.1 или 2, содержащее человеческую консенсусную каркасную последовательность тяжелой цепи подгруппы III.5. The antibody according to claim 1 or 2, containing the human consensus framework sequence of the heavy chain of subgroup III. 6. Антитело по п.5, где указанное антитело имеет замену в одном или нескольких из положений 71, 73 и 78, причем указанными заменами являются соответственно замены R71A, N73T и N78A.6. The antibody according to claim 5, where the specified antibody has a substitution in one or more of the provisions of 71, 73 and 78, and these substitutions are, respectively, substitutions R71A, N73T and N78A. 7. Полинуклеотид, кодирующий антитело по любому из пп.1-6.7. Polynucleotide encoding the antibody according to any one of claims 1 to 6. 8. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.7.8. The expression vector containing the polynucleotide according to claim 7. 9. Клетка-хозяин, способная экспрессировать экзогенный генетический материал, содержащая вектор по п.8.9. A host cell capable of expressing exogenous genetic material containing the vector of claim 8. 10. Клетка-хозяин по п.9, являющаяся прокариотической клеткой, эукариотической клеткой или клеткой млекопитающего.10. The host cell according to claim 9, which is a prokaryotic cell, a eukaryotic cell or a mammalian cell. 11. Способ получения анти-DLL4-антитела, предусматривающий (а) экспрессию вектора по п.8 в подходящей клетке-хозяине и (b) выделение указанного антитела.11. A method for producing an anti-DLL4 antibody, comprising (a) expressing the vector of claim 8 in a suitable host cell and (b) isolating said antibody. 12. Способ по п.11, где указанной клеткой-хозяином является прокариотическая клетка или эукариотическая клетка.12. The method according to claim 11, where the specified host cell is a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. 13. Способ детектирования DLL4, предусматривающий детектирование комплекса DLL4 и анти-DLL4-антитела по п.1 в биологическом образце.13. A method for detecting DLL4, comprising detecting a complex of DLL4 and the anti-DLL4 antibody of claim 1 in a biological sample. 14. Способ диагностики расстройства, ассоциированного с экспрессией DLL4, предусматривающий детектирование комплекса DLL4 и анти-DLL4-антитела по п.1 в биологическом образце, полученном у пациента, страдающего указанным расстройством, или у пациента с подозрением на такое расстройство.14. A method for diagnosing a disorder associated with the expression of DLL4, comprising detecting the complex of DLL4 and the anti-DLL4 antibody of claim 1 in a biological sample obtained from a patient suffering from said disorder, or from a patient suspected of having such a disorder. 15. Способ по п.13 или 14, где указанное анти-DLL4-антитело метят подходящим для детектирования образом.15. The method of claim 13 or 14, wherein said anti-DLL4 antibody is labeled in a manner suitable for detection. 16. Композиция для модулирования патологических состояний, ассоциированных с экспрессией и/или активностью DLL4, содержащая эффективное количество анти-DLL4-антитела по любому из пп.1-6.16. A composition for modulating pathological conditions associated with the expression and / or activity of DLL4, containing an effective amount of an anti-DLL4 antibody according to any one of claims 1 to 6. 17. Композиция для модулирования патологических состояний, ассоциированных с экспрессией и/или активностью DLL4, содержащая эффективное количество полинуклеотида по п.7.17. A composition for modulating pathological conditions associated with the expression and / or activity of DLL4, containing an effective amount of polynucleotide according to claim 7. 18. Композиция по п.16 или 17, которая дополнительно содержит носитель.18. The composition according to clause 16 or 17, which further comprises a carrier. 19. Способ лечения опухоли, рака или расстройства клеточной пролиферации, предусматривающий введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела по любому из пп.1-6.19. A method of treating a tumor, cancer or a disorder of cell proliferation, comprising administering to an individual in need of such treatment an effective amount of an antibody according to any one of claims 1 to 6. 20. Способ по п.19, где указанным опухолевым, раковым или клеточно-пролиферативным заболеванием является рак толстой кишки, рак легких или рак молочной железы.20. The method according to claim 19, where the specified tumor, cancer or cell proliferative disease is colon cancer, lung cancer or breast cancer. 21. Способ по п.19 или 20, дополнительно предусматривающий введение эффективного количества антиангиогенного средства.21. The method according to claim 19 or 20, further comprising administering an effective amount of an antiangiogenic agent. 22. Способ по п.21, где указанным антиангиогенным средством является антагонист фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF).22. The method according to item 21, where the specified antiangiogenic agent is an antagonist of vascular endothelial growth factor (VEGF). 23. Способ по п.22, где указанным антагонистом VEGF является анти-VEGF-антитело.23. The method of claim 22, wherein said VEGF antagonist is an anti-VEGF antibody. 24. Способ по п.23, где указанным анти-VEGF4-антителом является бевацизумаб.24. The method according to item 23, where the specified anti-VEGF4 antibody is bevacizumab. 25. Способ по любому из пп.19-20 или 22-24, дополнительно предусматривающий введение эффективного количества химиотерапевтического средства.25. The method according to any one of claims 19-20 or 22-24, further comprising administering an effective amount of a chemotherapeutic agent. 26. Способ повышения эффективности антиангиогенного средства у индивидуума, страдающего патологическим состоянием, ассоциированным с ангиогенезом, предусматривающий введение индивидууму, помимо антиангиогенного средства, эффективного количества антитела по любому из пп.1-6.26. A method of increasing the effectiveness of an antiangiogenic agent in an individual suffering from a pathological condition associated with angiogenesis, comprising administering to the individual, in addition to the antiangiogenic agent, an effective amount of an antibody according to any one of claims 1 to 6. 27. Способ по п.26, где указанным патологическим состоянием, ассоциированным с ангиогенезом, является опухоль, рак и/или расстройство клеточной пролиферации, или внутриглазное неоваскулярное заболевание. 27. The method of claim 26, wherein said pathological condition associated with angiogenesis is a tumor, cancer, and / or a disorder of cell proliferation, or an intraocular neovascular disease.

Images