RU2413531C2 - Method of producing oral preparation of proinsulin c-peptide - Google Patents
Method of producing oral preparation of proinsulin c-peptide Download PDFInfo
- Publication number
- RU2413531C2 RU2413531C2 RU2009111530/15A RU2009111530A RU2413531C2 RU 2413531 C2 RU2413531 C2 RU 2413531C2 RU 2009111530/15 A RU2009111530/15 A RU 2009111530/15A RU 2009111530 A RU2009111530 A RU 2009111530A RU 2413531 C2 RU2413531 C2 RU 2413531C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- proinsulin
- polyethylene glycol
- preparation
- insulin
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности к эндокринологии, и может быть использовано для получения лекарственных средств, в частности С-пептида проинсулина, предназначенных для перорального применения.The invention relates to pharmacology and medicine, in particular to endocrinology, and can be used to obtain drugs, in particular C-peptide proinsulin, intended for oral use.
Человеческий С-пептид проинсулина (соединительный пептид) является пептидом, состоящим из 31 аминокислоты со следующей последовательностью: EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ. С-пептид является показателем образования инсулина из проинсулина в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин и С-пептид являются конечными продуктами преобразования проинсулина в результате воздействия эндопептидазы.The human proinsulin C-peptide (connecting peptide) is a peptide consisting of 31 amino acids with the following sequence: EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ. The C-peptide is an indicator of the formation of insulin from proinsulin in the beta cells of the pancreatic islets of Langerhans. Insulin and C-peptide are the end products of the conversion of proinsulin as a result of exposure to endopeptidase.
После пероральной нагрузки глюкозой отмечается 5-6 кратное увеличение уровня С-пептида, которое сохраняется значительно дольше, чем у инсулина. В настоящее время начинают появляться отдельные данные (Cotter M.A, Ekberg К, Wahren J, Cameron N.E. Effects of proinsulin C-peptide in experimental diabetic neuropathy: vascular actions and modulation by nitric oxide synthase inhibition.Diabetes. 2003 Jul; 52(7):1812-7, Wahren J, Ekberg K, Samnegard B, Johansson B.L. C-peptide: a new potential in the treatment of diabetic nephropathy. Curr Diab Rep.2001 Dec; l(3):261-6. Review. PMID: 12643208 [PubMed - indexed for MEDLINE), свидетельствующие об умеренной эффективности С-пептида в лечении сахарного диабета и его осложнений, в частности для профилактики микроангиопатий: нефропатии и ретинопатии. Однако пока основным назначением С-пептида в медицине является его использование преимущественно в диагностических целях, в частности для контроля за функционированием бета-клеток и продуцированной ими инсулина; для оценки остаточной синтетической функции бета- клеток; при подборе дозы инсулина, в особенности в случае неэффективности применения пероральных сахароснижающих препаратов и для подтверждения ремиссии сахарного диабета; и т.д. ("Insulin, C-peptide and proinsulin in nondiabetics and insulin-treated diabetics". Heding LG. // Diabetes 1978; 27 Suppi 1:178-183).After an oral glucose load, a 5-6-fold increase in the level of C-peptide is observed, which remains much longer than that of insulin. Separate data is now beginning to appear (Cotter MA, Ekberg K, Wahren J, Cameron NE Effects of proinsulin C-peptide in experimental diabetic neuropathy: vascular actions and modulation by nitric oxide synthase inhibition.Diabetes. 2003 Jul; 52 (7): 1812-7, Wahren J, Ekberg K, Samnegard B, Johansson BL C-peptide: a new potential in the treatment of diabetic nephropathy. Curr Diab Rep. 2001 Dec; l (3): 261-6. Review. PMID: 12643208 [PubMed - indexed for MEDLINE), indicating a moderate effectiveness of the C-peptide in the treatment of diabetes mellitus and its complications, in particular for the prevention of microangiopathies: nephropathy and retinopathy. However, while the main purpose of the C-peptide in medicine is its use mainly for diagnostic purposes, in particular for monitoring the functioning of beta cells and the insulin produced by them; to assess the residual synthetic function of beta cells; when selecting a dose of insulin, especially in case of ineffectiveness of the use of oral hypoglycemic drugs and to confirm the remission of diabetes; etc. ("Insulin, C-peptide and proinsulin in nondiabetics and insulin-treated diabetics." Heding LG. // Diabetes 1978; 27 Suppi 1: 178-183).
Единственным общепринятым методом лечения сахарного диабета до настоящего времени остается использование препаратов на основе инсулина. Инсулин является полипептидным гормоном с молекулярной массой около 6000. Он оказывает влияние на все виды обмена веществ в организме: повышает проникновение глюкозы в ткани организма и ее использование ими, снижает содержание гликогена в печени и повышает его количество в мышцах, повышает интенсивность синтеза белка и т.д. Однако при инсулинотерапии развивается целый ряд диабетических осложнений, в частности появляется ангиопатия (нефропатия и ретинопатия), нейропатия, выработка антител к инсулину и развитие инсулинорезистентности, следствием чего является неэффективность коррекции гликемии и развитие кетоацидоза.The only generally accepted method for treating diabetes to date is the use of insulin-based drugs. Insulin is a polypeptide hormone with a molecular weight of about 6000. It affects all types of metabolism in the body: it increases the penetration of glucose into the body tissues and its use, reduces the glycogen content in the liver and increases its amount in the muscles, increases the intensity of protein synthesis, and t .d. However, with insulin therapy, a number of diabetic complications develop, in particular, angiopathy (nephropathy and retinopathy), neuropathy, the development of antibodies to insulin and the development of insulin resistance appear, which leads to inefficiency in the correction of glycemia and the development of ketoacidosis.
Для профилактики и лечения диабетической ангиопатии применяют ангиопротекторы пармидин (продектин, ангинин), добезилаткальций (доксиум), этамзилат (дицинон); спазмолитические средства пентоксифиллин (трентал), ксантинола никотинат (теоникол, компламин); препараты, улучшающие мозговое кровообращение,- кавинтон и др. Некоторые из этих препаратов оказывают положительное действие на систему гемостаза и реологические свойства крови, хотя с этой целью специально назначают антикоагулянты, антиагреганты, препараты, влияющие на коронарное кровообращение, гепарин, реополиглюкин, дипиридамол (курантил), ацетилсалициловую кислоту и др. (Старкова Н.Т. Клиническая эндокринология, с.189, М., 1983).For the prevention and treatment of diabetic angiopathy, parmidin angioprotectors (prodectin, anginin), dobesylcalcium (doxium), etamsylate (dicinone) are used; antispasmodics pentoxifylline (trental), xanthinol nicotinate (theonicol, compliance); drugs that improve cerebral circulation, such as cavinton and others. Some of these drugs have a positive effect on the hemostatic system and rheological properties of the blood, although for this purpose anticoagulants, antiplatelet agents, drugs that affect coronary circulation, heparin, reopoliglyukin, dipyridamole (chimes) are specifically prescribed ), acetylsalicylic acid, etc. (Starkova N.T. Clinical endocrinology, p. 189, M., 1983).
Существует несколько комплексов и схем лечения диабетических осложнений, например сочетанный прием в течение 1-11/2 месяцев курантила, фитина и глутаминовой кислоты; курс внутривенных инфузий реополиглюкина (400 мл), трентала (5 мл), гепарина (раствор для инъекций с активностью 5000 ЕД в 1 мл, 6,5 мл) в течение 7-10 дней; курс из 10-15 ретробульбарных инъекций реополиглюкина (0,3 мл), дексазона (0,2 мл), гепарина (0,2 мл) (Ефимов А.С. Диабетические ангиопатии, М., 1989).There are several systems and treatment regimens of diabetic complications such sochetannyj reception for 1-1 1/2 months curantyl, phytin and glutamic acid; a course of intravenous infusions of reopoliglukin (400 ml), trental (5 ml), heparin (solution for injection with an activity of 5000 PIECES in 1 ml, 6.5 ml) for 7-10 days; a course of 10-15 retrobulbar injections of reopoliglyukin (0.3 ml), dexazone (0.2 ml), heparin (0.2 ml) (Efimov A.S. Diabetic angiopathies, M., 1989).
Однако эффективных методов предупреждения и лечения диабетической ангиопатии в настоящее время не существует. Использование многочисленных лекарственных средств, влияющих на состояние сосудистой стенки и системы свертывания крови, при прогрессировании нарушений углеводного обмена, не оказывает существенного профилактического действия на появление и неуклонное прогрессирование диабетической ангиопатии у многих больных сахарным диабетом.However, effective methods for the prevention and treatment of diabetic angiopathy currently do not exist. The use of numerous drugs that affect the state of the vascular wall and blood coagulation system, with the progression of disorders of carbohydrate metabolism, does not have a significant preventive effect on the appearance and steady progression of diabetic angiopathy in many patients with diabetes mellitus.
Известно средство для лечения диабета и для предотвращения его осложнений (патент GB 2104382, опубликованный 09.03.1983), представляющее собой смесь инсулина и С-пептида, взятых в определенном весовом соотношении, и в ассоциации с фармацевтически приемлемым носителем.Known drug for the treatment of diabetes and to prevent its complications (patent GB 2104382, published 09.03.1983), which is a mixture of insulin and C-peptide, taken in a certain weight ratio, and in association with a pharmaceutically acceptable carrier.
Однако это средство предназначено исключительно для парентерального введения внутримышечно или внутривенно и не пригодно для перорального применения. С-пептид в кровяном русле в норме очень быстро разлагается под действием ферментов крови. А при сахарном диабете он, как производный проинсулина, вырабатывается в ограниченном количестве.However, this agent is intended solely for parenteral administration intramuscularly or intravenously and is not suitable for oral use. C-peptide in the bloodstream normally decomposes very quickly under the influence of blood enzymes. And with diabetes, it, as a derivative of proinsulin, is produced in limited quantities.
Известен способ получения препарата С-пептида проинсулина, пригодного для перорального применения (WO 2004083234, on. 30.09.2004), заключающийся в том, что сначала химическим путем активируют олигомер, содержащий гидрофильный участок и/или липофильный участок, в качестве которого используют полиэтиленгликоль, затем обеспечивают контактирование проинсулинового полипептида с активированным олигомером в условиях, достаточных для присоединения олигомера к С-полипептиду и создания конъюгата С- полипептида-олигомер, для чего используют такие растворители, как диметилсульфоксид (dimethylsulfoxide) и триэтиламин (triethylamine). Кроме того, способ требует использования активирующих химических агентов, таких как N-гидроксисукцинимид (N-hydroxysuccinimide), p-нитрофенилхлолроформиат (p-nitrophenylchloroformate), 1,3-дициклогексилкарбодиимид (1,3-dicyclohexylcarbodiimide), гидроксибензотриазид (hydroxybenzotriazide).A known method of obtaining a preparation of proinsulin C-peptide suitable for oral use (WO 2004083234, on. 09.30.2004), which consists in first chemically activating an oligomer containing a hydrophilic site and / or lipophilic site, which is used as polyethylene glycol, then, the proinsulin polypeptide is contacted with the activated oligomer under conditions sufficient to attach the oligomer to the C-polypeptide and create a conjugate of the C-polypeptide-oligomer, for which such solutions are used bodies like dimethylsulfoxide (dimethylsulfoxide) and triethylamine (triethylamine). In addition, the method requires the use of activating chemical agents, such as N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide), p-nitrophenylchloroformate (p-nitrophenylchloroformate), 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (1,3-dicyclohexylcarbodiimide), hydroxybenzotriazide.
Применение высокотоксичных реагентов для химической активации полимеров требует для очистки продуктов синтеза применения сложных и дорогих хроматографических методов очистки. Кроме того, многие из указанных реактивов не производятся в промышленных масштабах и поэтому дороги и малодоступны.The use of highly toxic reagents for the chemical activation of polymers requires the use of complex and expensive chromatographic purification methods for the purification of synthesis products. In addition, many of these reagents are not produced on an industrial scale and therefore are expensive and inaccessible.
Недостатками известного способа являются технологическая сложность получения коньюгатов С-пептида проинсулина с олигомером, необходимость использования для активации полиэтиленгликоля высокотоксичных химических агентов, от которых необходимо очищать препарат хроматографическими методами, а также высокая стоимость полученных препаратов. Кроме того, авторы изобретения, описанного в заявке WO 2004083234, не подтвердили наличие биологической активности у коньюгатов С-пептида проинсулина с полиэтиленгликолем.The disadvantages of this method are the technological complexity of obtaining conjugates of the C-peptide of proinsulin with an oligomer, the need to use highly toxic chemical agents for the activation of polyethylene glycol, which must be purified by chromatographic methods, as well as the high cost of the preparations obtained. In addition, the inventors described in WO2004083234 did not confirm the presence of biological activity in conjugates of the proinsulin C-peptide with polyethylene glycol.
Технической задачей предлагаемого изобретения является упрощение и удешевление способа получения препарата С-пептида проинсулина для перорального применения, а также повышение его терапевтической эффективности при пероральном применении.The technical task of the invention is to simplify and reduce the cost of the method of obtaining the preparation of the pro-insulin C-peptide for oral administration, as well as increasing its therapeutic efficacy in oral administration.
Решение поставленной задачи достигается тем, что предложен способ получения препарата С-пептида проинсулина для перорального применения с использованием активированного полиэтиленгликоля, в котором согласно изобретению полиэтиленгликоль активируют путем облучения ионизирующим излучением в кислой среде в присутствии катионов кальция и/или цинка до конечной концентрации 5-10 мМ, а затем смешивают с С-пептидом проинсулина, при этом берут полиэтиленгликоль с мол. массой 0,4-40 кДа и концентрацией 1,0-50,0% в соотношении С-пептид проинсулина:полиэтиленгликоль, равном 1:(1-500), до конечной концентрации С-пептида проинсулина в смеси 1-10 мг/мл.The solution to this problem is achieved by the fact that the proposed method for the preparation of proinsulin C-peptide for oral administration using activated polyethylene glycol, in which according to the invention polyethylene glycol is activated by irradiation with ionizing radiation in an acidic environment in the presence of calcium and / or zinc cations to a final concentration of 5-10 mm, and then mixed with the C-peptide of proinsulin, while taking polyethylene glycol with a mol. weighing 0.4-40 kDa and a concentration of 1.0-50.0% in the ratio of proinsulin C-peptide: polyethylene glycol equal to 1: (1-500), to a final concentration of proinsulin C-peptide in a mixture of 1-10 mg / ml .
Полиэтиленгликоль активируют путем облучения потоком ускоренных электронов или гамма-излучением в дозах 1,0-5,0 Мрад.Polyethylene glycol is activated by irradiation with a stream of accelerated electrons or gamma radiation in doses of 1.0-5.0 Mrad.
Для подкисления полиэтиленгликоля берут преимущественно органическую кислоту, например уксусную, лимонную, яблочную, и поддерживают при активации полиэтиленгликоля pH 2,5-4,5.To acidify the polyethylene glycol, they take predominantly an organic acid, for example, acetic, citric, malic, and maintain the pH 2.5-4.5 upon activation of the polyethylene glycol.
Для подкисления полиэтиленгликоля можно использовать и другие органические кислоты, например фумаровую, янтарную, молочную и другие, не токсичные для организма кислоты.Other organic acids can be used to acidify polyethylene glycol, for example fumaric, succinic, lactic and other acids that are not toxic to the body.
В качестве водорастворимого полимера, кроме полиэтиленгликоля можно также использовать декстраны, поливинилпирролидон, изопренолы, полиакриламид, полиуретан молекулярной массы не более 20000 Да, предпочтительно от 400 до 20000 Да и наиболее предпочтительно молекулярной массы от 400 до 4000 Да.As a water-soluble polymer, in addition to polyethylene glycol, dextrans, polyvinylpyrrolidone, isoprenols, polyacrylamide, polyurethane with a molecular weight of not more than 20,000 Da, preferably from 400 to 20,000 Da and most preferably from 400 to 4000 Da, can also be used.
В качестве С-пептида используют выделенный и очищенный натуральный или синтетический, или генно-инженерный рекомбинантный С-пептид проинсулина.As a C-peptide, isolated and purified natural or synthetic, or genetically engineered recombinant C-peptide of proinsulin are used.
Полученный препарат можно использовать в лиофилизированной форме, или в форме раствора, или таблетированной, или капсулированной форме с содержанием С-пептида в терапевтически эффективном количестве для перорального и/или парэнтерального, и/или ингаляционного применения, например интраназально.The resulting preparation can be used in lyophilized form, or in the form of a solution, or in tablet or capsule form, containing a C-peptide in a therapeutically effective amount for oral and / or parenteral and / or inhalation, for example, intranasally.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом:The proposed method is as follows:
Готовят 1-50% водный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой от 400 до 4000 Да. Затем раствор подкисляют до рН 2,5-4,5, добавляют катионы кальция и/или цинка до конечной концентрации 5-10 мМ и облучают высокоэнергетическим ионизирующим излучением, преимущественно гамма-излучением или потоком ускоренных электронов в дозах, обеспечивающих протекание свободно-радикальных реакций, преимущественно 1,0-5,0 Мрад. Далее в раствор радиационно-активированного полиэтиленгликоля вводят С-пептид проинсулин до конечной концентрации (по белку) от 1-10 мг/мл в соотношении полиэтиленгликоль: С-пептид проинсулина, равном (1-500):1, смесь перемешивают в течение 10-30 минут до получения однородного прозрачного или слегка опалесцирующего раствора. Полученный препарат нейтрализуют. При облучении в ходе радиационно-химического окисления полиэтиленгликоля образуются высокоактивные карбонильные группы. Активированный таким способом полимер образует с С-пептидом проинсулина водорастворимый препарат, который эффективно уменьшает осложнения течения сахарного диабета, такие как диабетическая стопа, ретинулопатия, нефропатия, в том числе и при пероральном введении.Prepare a 1-50% aqueous solution of polyethylene glycol with a molecular weight of from 400 to 4000 Da. Then the solution is acidified to a pH of 2.5-4.5, calcium and / or zinc cations are added to a final concentration of 5-10 mM and irradiated with high-energy ionizing radiation, mainly gamma radiation or accelerated electron flux in doses that ensure free radical reactions Mostly 1.0-5.0 Mrad. Next, a pro-insulin C-peptide is introduced into a solution of radiation-activated polyethylene glycol to a final concentration (for protein) of 1-10 mg / ml in a ratio of polyethylene glycol: proinsulin C-peptide equal to (1-500): 1, the mixture is stirred for 10- 30 minutes until a uniform, clear or slightly opalescent solution is obtained. The resulting drug is neutralized. When irradiated during the radiation-chemical oxidation of polyethylene glycol, highly active carbonyl groups are formed. The polymer activated in this way forms a water-soluble preparation with the proinsulin C peptide, which effectively reduces the complications of diabetes mellitus, such as diabetic foot, retinulopathy, nephropathy, including when administered orally.
Экспериментально было показано, что препарат С-пептида проинсулина с полиэтиленгликолем при пероральном применении всасывается в кровь.It was experimentally shown that the preparation of the pro-insulin C-peptide with polyethylene glycol is absorbed into the blood when administered orally.
Кроме того, оказалось неожиданным, что присутствие при активировании полиэтиленгликоля катионов кальция и цинка позволило увеличить биологическую активность препарата и повысить его устойчивость в кислой среде.In addition, it turned out to be unexpected that the presence of calcium and zinc cations upon activation of polyethylene glycol made it possible to increase the biological activity of the preparation and increase its stability in an acidic environment.
В качестве источника ионизирующего излучения можно использовать электронное излучение (направленный поток ускоренных электронов), гамма-излучение, рентгеновское излучение, лазерное излучение и ультрафиолетовое излучение. Необходимая аппаратура и методики ионизации описаны в следующих публикациях: (Gonchar A.M. and Auslender V.L., 1996; Gonchar A.M. and Auslender V.L., 1998, Vereschagin E.I., et al., 2001).As a source of ionizing radiation, you can use electronic radiation (directed flow of accelerated electrons), gamma radiation, x-ray radiation, laser radiation and ultraviolet radiation. The necessary equipment and ionization techniques are described in the following publications: (Gonchar A.M. and Auslender V.L., 1996; Gonchar A.M. and Auslender V.L., 1998, Vereschagin E.I., et al., 2001).
В наиболее предпочтительном варианте предлагается воздействовать на полиэтиленгликоль направленным потоком ускоренных электронов. В конкретном случае осуществления способа облучение полиэтиленгликоля проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-6 или ИЛУ-10 с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/ч.In the most preferred embodiment, it is proposed to act on the polyethylene glycol with a directed stream of accelerated electrons. In the specific case of the method, the polyethylene glycol was irradiated with bremsstrahlung generated by an ILU-6 or ILU-10 accelerator with an electron energy of 2.5 MeV, an absorbed dose of 2 to 10 kGy, and a dose rate of 1.65 kGy / h.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного получения предлагаемого препарата, содержащего генно-инженерный (рекомбинантный) С-пептид проинсулина.The invention is illustrated by the following examples of specific preparation of the proposed drug containing a genetically engineered (recombinant) C-peptide of proinsulin.
Пример 1Example 1
10% водный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1500 Да (ПЭГ-1500) облучают потоком ускоренных электронов в дозе 2,0 Мрад в кислой среде в присутствии 5 мМ катионов кальция. Подкисление ведут 0,1 М раствором уксусной кислоты до pH 3, а катионы кальция вводят за счет добавления в раствор хлористого кальция до достижения концентрации в пересчете на Са2+ до 5 мМ, проверяют рН и, при необходимости, подтитровывают. В облученный раствор полиэтиленгликоля вносят С-пептид проинсулина (генно-инженерный рекомбинантный) до конечной концентрации 10 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленгликоль: С-пептид равно 10:1). Смесь перемешивают 10 мин и получают препарат С-пептида в виде слегка опалесцирующего раствора.A 10% aqueous solution of polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 1500 Da (PEG-1500) is irradiated with a stream of accelerated electrons in a dose of 2.0 Mrad in an acidic medium in the presence of 5 mM calcium cations. The acidification is carried out with a 0.1 M solution of acetic acid to
Пример 2Example 2
50,0% водный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 Да облучают тормозным гамма-излучением в дозе 1,0 Мрад в кислой среде рН 2,5 в присутствии катионов цинка. Для чего подкисление ведут 1 М раствором лимонной кислоты и добавляют к раствору полиэтиленгликоля 1 М раствор хлористого цинка до достижения концентрации 10 мМ Zn2+, проверяют рН и, при необходимости, подтитровывают 1М лимонной кислотой. В облученный раствор полиэтиленгликоля вносят С-пептид проинсулина до конечной концентрации 1 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленгликоль: С-пептид равно 500:1). Смесь перемешивают 30 минут и получают препарат С-пептида в виде прозрачного раствора.A 50.0% aqueous solution of polyethylene glycol with a molecular weight of 400 Da is irradiated with inhibitory gamma radiation at a dose of 1.0 Mrad in an acidic environment, pH 2.5 in the presence of zinc cations. For this, acidification is carried out with a 1 M solution of citric acid and a 1 M solution of zinc chloride is added to a solution of polyethylene glycol to a concentration of 10 mM Zn 2+ , the pH is checked and, if necessary, triturated with 1 M citric acid. Proinsulin C-peptide is added to the irradiated solution of polyethylene glycol to a final concentration of 1 mg in 1 ml (the ratio of polyethylene glycol: C-peptide is 500: 1). The mixture is stirred for 30 minutes and receive the preparation of the C-peptide in the form of a clear solution.
Пример 3Example 3
Для сравнения биологической активности готовили препарат генно-инженерного (рекомбинантного) С-пептида проинсулина, смешанного с раствором полиэтиленгликоля, активированного путем облучения потоком ускоренных электронов в нейтральной среде в отсутствии двухвалентных ионов металлов.To compare the biological activity, a preparation of the genetically engineered (recombinant) C-peptide of proinsulin was prepared, mixed with a solution of polyethylene glycol, activated by irradiation with a stream of accelerated electrons in a neutral medium in the absence of divalent metal ions.
Для этого 10% водный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1500 Да (ПЭГ-15 00) облучали потоком ускоренных электронов в дозе 2,0 Мрад. В облученный раствор вносили генно-инженерный С-пептид проинсулина до конечной концентрации 10 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленгликоль: С-пептид проинсулина равно 10:1). Смесь перемешивали 10 минут и получали препарат С-пептида проинсулина в виде слегка опалесцирующего раствора.For this, a 10% aqueous solution of polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 1500 Da (PEG-15 00) was irradiated with a stream of accelerated electrons in a dose of 2.0 Mrad. The genetically engineered C-peptide of proinsulin was introduced into the irradiated solution to a final concentration of 10 mg in 1 ml (the ratio of polyethylene glycol: C-peptide of proinsulin is 10: 1). The mixture was stirred for 10 minutes and received the preparation of the pro-insulin C-peptide in the form of a slightly opalescent solution.
В таблице представлены данные по исследованию эффективности внутрижелудочного введения препарата человеческого геннно-инженерного (рекомбинантного) С-пептида, полученного как описано в примере 1 (опыт 1), на модели аллоксанового диабета у крыс в сравнении с контролем 1 (физиологический раствор), контролем 2 (геннно-инженерный С-пептид без полиэтиленгликоля) и опытом 2 (геннно-инженерный С-пептид, полученный по примеру 3).The table presents data on the study of the effectiveness of intragastric administration of a human genetically engineered (recombinant) C-peptide preparation, obtained as described in Example 1 (experiment 1), on a model of alloxan diabetes in rats in comparison with control 1 (physiological saline), control 2 (genetically engineered C-peptide without polyethylene glycol) and experiment 2 (genetically engineered C-peptide obtained in Example 3).
Эксперименты были проведены на 80 крысах-самцах Вистар массой 200-250 г. Аллоксановый диабет индуцировали введением животным 60 мг аллоксана 2 раза энтерально (Spadella C.T, Lerco M.M, Machado J.L, Macedo C.S, Long-term effects of insulin therapy, islet transplantation, and pancreas transplantation in the prevention of glomerular changes in kidneys of alloxan-induced diabetic rats. Transplant Proc. 2005 Oct;37(8):3468-71; Liu J, Yu Y, Fan Y.Z, Chang H, Liu H.M, Cui Y, Chen Q, Wang R. Cardiovascular effects of endomorphins in alloxan-induced diabetic rats. Peptides. 2005 Apr; 26(4):607-14.).The experiments were conducted on 80 Wistar male rats weighing 200-250 g. Alloxan diabetes was induced by administering 60 mg of
Кровь для исследования забирали из надрезов на хвосте. Содержание глюкозы в крови определяли на приборе "SmartScan" ("Johnson & Johnson company", USA).Blood for examination was taken from incisions in the tail. Blood glucose was determined on a SmartScan instrument (Johnson & Johnson company, USA).
Препарат генно-инженерного рекомбинантного С-пептида проинсулина, полученный по примеру 1, вводили ежедневно внутрижелудочно в дозе 10 мг одной группе животных (опыт 1). Препарат генно-инженерного С-пептида проинсулина, полученный по примеру 3, также вводили ежедневно внутрижелудочно в дозе 10 мг другой группе животных (опыт 2). В контрольной группе 1 животным вводили физиологический раствор, в другой контрольной группе 2 животным вводили генно-инженерный С-пептид проинсулина, не содержащий полиэтиленгликоля, в дозе 10 мг.The preparation of the genetic engineering recombinant pro-insulin C-peptide obtained in Example 1 was administered daily intragastrically at a dose of 10 mg to one group of animals (experiment 1). The preparation of the genetically engineered C-peptide of proinsulin obtained in Example 3 was also administered daily intragastrically at a dose of 10 mg to another group of animals (experiment 2). In
Эффект препарата С-пептида проинсулина при пролонгированном энтеральном введении у крыс с аллоксановым диабетом.Table
The effect of the pro-insulin C-peptide preparation upon prolonged enteral administration in rats with alloxan diabetes.
железеSclerotic changes in the pancreas
iron
Как видно из представленных в таблице результатов, препарат С-пептида проинсулина, полученный по примеру 1, при энтеральном введении крысам с аллоксановой моделью диабета нормализовал функцию почек и у 95% животных стабилизировал уровень сахара в крови. Кроме того, из данных в таблице видно, что препарат, полученный предлагаемым способом, позволяет не только снизить, но и стабилизировать уровень глюкозы по сравнению с интактными животными, что свидетельствует о его высокой лечебной эффективности. При морфологическом исследовании также было установлено, что у животных опытной группы (опыт 1) патологические изменения во внутренних органах, связанные с микроангиопатиями, практически отсутствовали. Напротив, у животных контрольных групп 1 и 2 эти изменения были явно выражены, что свидетельствует о высокой лечебной и профилактической активности полученного предлагаемым способом препарата С-пептида в отношении осложнений сахарного диабета.As can be seen from the results presented in the table, the proinsulin C-peptide preparation obtained according to Example 1, when administered to rats with an alloxan model of diabetes, was normalized for kidney function and stabilized blood sugar in 95% of the animals. In addition, from the data in the table it can be seen that the drug obtained by the proposed method can not only reduce, but also stabilize the level of glucose compared with intact animals, which indicates its high therapeutic efficacy. A morphological study also found that in animals of the experimental group (experiment 1), pathological changes in the internal organs associated with microangiopathies were practically absent. On the contrary, in animals of
Исследование фармакокинетики С-пептида (С-пептид проинсулина человеческий рекомбинантный) при подкожном введении проводили на 21 крысах-самцах Вистар массой 430-540 г. При этом одной группе животных (7 особей) вводили нативный препарат С-пептид проинсулина человеческого рекомбинантного, не содержащий полиэтиленгликоль (контроль), другой группе животных (7 особей) вводили препарат С-пептид проинсулина человеческого рекомбинантного, полученного по примеру 1 (опыт 1), и третьей группе животных (7 особей) вводили препарат С-пептида проинсулина человеческого рекомбинантного, полученного по примеру 3 (опыт 2). Животные содержались на стандартном рационе вивария и на время проведения исследования имели свободный доступ к воде и пище в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Препараты вводили подкожно в дозе 5 мг/кг (в пересчете на С-пептид проинсулина). Пробы крови (0,3 мл) забирали из хвостовой вены бодрствующих животных в гепаринизированные капилляры, отделяли плазму центрифугированием и до момента анализа плазму хранили при температуре 3-5°С не более 3 сут.The study of the pharmacokinetics of the C-peptide (human recombinant pro-insulin C-peptide) with subcutaneous administration was carried out on 21 male Wistar rats weighing 430-540 g. In this case, one group of animals (7 animals) was introduced the native recombinant human pro-insulin C-peptide, not containing polyethylene glycol (control), another recombinant human proinsulin C peptide preparation obtained in Example 1 (experiment 1) was administered to another group of animals (7 animals), and human proinsulin C peptide preparation was administered to a third group of animals (7 animals) recombinant obtained in example 3 (experiment 2). The animals were kept on a standard diet of vivarium and at the time of the study had free access to water and food in accordance with the rules adopted by the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for experimental and other scientific purposes. The drugs were administered subcutaneously at a dose of 5 mg / kg (in terms of the pro-insulin C-peptide). Blood samples (0.3 ml) were taken from the tail vein of awake animals into heparinized capillaries, the plasma was separated by centrifugation, and until analysis, the plasma was stored at a temperature of 3-5 ° C for no more than 3 days.
Для количественного определения содержания в плазме С-пептида использовали иммуноферментный тест Mercodia C-peptide ELISA specific.To quantify the plasma C-peptide content, the Mercodia C-peptide ELISA specific enzyme immunoassay was used.
Пробы крови у каждого животного отбирали в каждой временной точке.Blood samples from each animal were taken at each time point.
При исследовании фармакокинетики С-пептида забор проб крови проводили до и через 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4, 6 и 12 ч после введения препарата.In the study of the pharmacokinetics of the C-peptide, blood samples were taken before and after 0.25; 0.5; one; 2; 3; 4, 6 and 12 hours after administration of the drug.
Для построения фармакокинетических кривых использовали кратность между исходным содержанием С-пептида (до введения препарата) и найденным содержанием препарата в каждой временной точке.To construct the pharmacokinetic curves, we used the multiplicity between the initial content of the C-peptide (before drug administration) and the found drug content at each time point.
Выбор временных точек для исследования концентрации С-пептида в крови производили по данным предварительных исследований с учетом рекомендаций [Холодов Л.Е., Яковлев В.П., 1985].The choice of time points for studying the concentration of C-peptide in the blood was performed according to preliminary studies taking into account the recommendations [Kholodov L.E., Yakovlev V.P., 1985].
На фиг.1 представлена динамика концентрации С-пептида в плазме крови крыс после подкожного введения препарата нативного С-пептида проинсулина (линия 1), препарата С-пептида проинсулина, полученного по примеру 1 (линия 3), и препарата С-пептида проинсулина, полученного по примеру 3 (линия 2).Figure 1 presents the dynamics of the concentration of C-peptide in rat blood plasma after subcutaneous administration of a native proinsulin C-peptide preparation (line 1), proinsulin C-peptide preparation obtained in Example 1 (line 3), and proinsulin C-peptide preparation, obtained in example 3 (line 2).
Как видно из представленных результатов, содержание С-пептида в крови крыс, получавших препарат, приготовленный по примеру 3, было выше, чем у крыс, получавших нативный С-пептид, через 30 мин в 1.54 раза, через 1 час в 2.1 раза, через 3 часа в 93 раза, через 4 часа в 107 раз. В то же время содержание С-пептида в крови крыс, получавших препарат, приготовленный по примеру 1, было выше, чем у крыс, получавших препарат, приготовленный по примеру 3, через 30 мин в 2,1 раза, через 1 час в 3 раза, через 3 часа в 110 раз, через 4 часа в 140 раз.As can be seen from the presented results, the content of C-peptide in the blood of rats treated with the preparation prepared according to example 3 was higher than in rats treated with native C-peptide, after 30 minutes 1.54 times, after 1 hour 2.1 times, after 3 hours 93 times, after 4 hours 107 times. At the same time, the content of C-peptide in the blood of rats receiving the drug prepared according to example 1 was higher than that of rats receiving the drug prepared according to example 3, 2.1 times after 30 minutes, 3 times after 1 hour after 3 hours 110 times, after 4
Это свидетельствует о том, что препарат С-пептида проинсулина, полученный по примеру 1, более стоек к действию пептидаз крови, чем препарат, полученный по примеру 3. О пролонгированном действии препарата С-пептида проинсулина, полученного по примеру 1, свидетельствует тот факт, что он определялся в крови через 12 часов после введения, нативный - через 6 часов, а препарат, полученный по примеру 3, определялся в крови через 8 часов после подкожного введения.This indicates that the proinsulin C-peptide preparation obtained in example 1 is more resistant to the action of blood peptidases than the preparation obtained in example 3. The prolonged action of the proinsulin C-peptide preparation obtained in example 1 is evidenced by the fact that it was determined in the
Определение фармакокинетики С-пептида человеческого генно-инженерного (рекомбинантного) при энтеральном введении.Determination of the pharmacokinetics of the C-peptide of human genetic engineering (recombinant) upon enteral administration.
Исследование фармакокинетики С-пептида (С-пептид проинсулина человеческий рекомбинантный) при энтеральном введении проводили на 15 крысах-самцах Вистар массой 430-540 г. При этом одной группе животных (5 особей) вводили нативный препарат С-пептид проинсулина человеческого рекомбинантного, не содержащий полиэтиленгликоль (контроль), другой группе животных (5 особей) вводили препарат С-пептид проинсулина человеческого рекомбинантного, полученного по примеру 1 (опыт 1), и третьей группе животных (5 особей) вводили препарат С-пептида проинсулина человеческого рекомбинантного, полученного по примеру 3 (опыт 2). Животные содержались на стандартном рационе вивария и на время проведения исследования имели свободный доступ к воде и пище в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Препараты вводили внутрижелудочно при помощи зонда в дозе 10 мг/кг (в пересчете на С-пептид). Пробы крови (0,3 мл) забирали из хвостовой вены бодрствующих животных в гепаринизированные капилляры, отделяли плазму центрифугированием и до момента анализа плазму хранили при температуре 3-5°С не более 3 сут.The study of the pharmacokinetics of the C-peptide (human recombinant pro-insulin C-peptide) with enteral administration was carried out on 15 male Wistar rats weighing 430-540 g. In this case, one group of animals (5 individuals) was introduced the native recombinant human pro-insulin C-peptide, not containing polyethylene glycol (control), another recombinant human proinsulin C peptide preparation obtained in Example 1 (experiment 1) was administered to another group of animals (5 animals), and human proinsulin C peptide preparation was administered to a third group of animals (5 animals) recombinant human obtained in example 3 (experiment 2). The animals were kept on a standard diet of vivarium and at the time of the study had free access to water and food in accordance with the rules adopted by the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for experimental and other scientific purposes. The drugs were administered intragastrically using a probe at a dose of 10 mg / kg (in terms of C-peptide). Blood samples (0.3 ml) were taken from the tail vein of awake animals into heparinized capillaries, the plasma was separated by centrifugation, and until analysis, the plasma was stored at a temperature of 3-5 ° C for no more than 3 days.
Для количественного определения содержания в плазме С-пептида использовали иммуноферментный тест Mercodia C-peptide ELISA specific.To quantify the plasma C-peptide content, the Mercodia C-peptide ELISA specific enzyme immunoassay was used.
Пробы крови у каждого животного отбирали в каждой временной точке.Blood samples from each animal were taken at each time point.
При исследовании фармакокинетики С-пептида забор проб крови проводили до и через 1; 2; 3; 4, 5, 6 и 12 ч после введения препарата.In the study of the pharmacokinetics of the C-peptide, blood samples were taken before and after 1; 2; 3; 4, 5, 6 and 12 hours after administration of the drug.
Для построения фармакокинетических кривых использовали кратность между исходным содержанием С-пептида (до введения препарата) и найденным содержанием препарата в каждой временной точке.To construct the pharmacokinetic curves, we used the multiplicity between the initial content of the C-peptide (before drug administration) and the found drug content at each time point.
Результаты представлены на фиг.2.The results are presented in figure 2.
Как видно из представленных результатов, всасывание из желудка происходит только для препаратов С-пептида проинсулина, полученных по примерам 1 и 3. Нативный С-пептид не всасывается и не влияет на концентрацию С-пептида в крови.As can be seen from the presented results, absorption from the stomach occurs only for proinsulin C-peptide preparations obtained in Examples 1 and 3. The native C-peptide is not absorbed and does not affect the concentration of C-peptide in the blood.
Препарат С-пептида, полученный по примеру 3, хорошо всасывается из желудка, его максимальная концентрация в крови достигается через 5 часов и превышает исходный уровень в 147 раз, через 12 часов уровень превышения незначителен. Из желудка всасывалось 17% введенного препарата.The C-peptide preparation obtained in Example 3 is well absorbed from the stomach, its maximum concentration in the blood is reached after 5 hours and exceeds the initial level by 147 times, after 12 hours the excess level is negligible. 17% of the administered drug was absorbed from the stomach.
Препарат С-пептида, полученный по примеру 1, также хорошо всасывается из желудка, его максимальная концентрация в крови достигается через 6 часов и превышает исходный уровень в 175 раз, через 12 часов уровень превышения еще заметен. Из желудка всасывалось более 25% веденного препарата.The C-peptide preparation obtained in Example 1 is also well absorbed from the stomach, its maximum concentration in the blood is reached after 6 hours and exceeds the initial level by 175 times, after 12 hours the excess level is still noticeable. More than 25% of the administered drug was absorbed from the stomach.
Эти результаты подтверждают более высокую эффективность препарата С-пептида проинсулина, полученного по примеру 1, при пероральном применении.These results confirm the higher efficacy of the pro-insulin C-peptide preparation obtained in Example 1 when administered orally.
Таким образом, приведенные выше примеры показывают, что препарат С-пептида проинсулина, полученный предлагаемым способом, может быть использован для предупреждения диабетических осложнений, а именно уменьшения протеинурии и нефропатии.Thus, the above examples show that the pro-insulin C-peptide preparation obtained by the proposed method can be used to prevent diabetic complications, namely, reducing proteinuria and nephropathy.
Препарат, полученный предлагаемым способом, может вводиться в организм перорально, парэнтерально, а также интраназально и имеет более пролонгированное действие в организме, чем свободный С-пептид проинсулина.The drug obtained by the proposed method can be administered orally, parenterally, as well as intranasally and has a more prolonged effect in the body than the free C-peptide of proinsulin.
Кроме того, препараты С-пептида проинсулина, полученные предлагаемым способом, сохраняли свою активность при хранении в течение суток при рН 2-3 даже при комнатной температуре.In addition, preparations of the pro-insulin C-peptide obtained by the proposed method retained their activity during storage during the day at pH 2-3 even at room temperature.
Заявляемый способ получения препарата С-пептида проинсулина для перорального применения, в отличие от способа-прототипа, отличается простотой и экономичностью, так как его получение состоит всего из двух стадий, активация полиэтиленгликоля ионизирующим излучением в кислой среде в присутствии катионов кальция и/или цинка и смешивание его с С-пептидом проинсулина до требуемой концентрации (активности). Для его осуществления не требуется применение высокотоксичных реактивов. Препарат С-пептида проинсулина, получаемый заявляемым способом, обладает терапевтической активностью, определяемой по уменьшению протеинурии и нефропатии, и может быть использован для перорального, парентерального и интраназального введения.The inventive method for producing a proinsulin C-peptide preparation for oral administration, unlike the prototype method, is simple and economical, since its preparation consists of only two stages, activation of polyethylene glycol by ionizing radiation in an acidic environment in the presence of calcium and / or zinc cations and mixing it with a pro-insulin C peptide to the desired concentration (activity). For its implementation does not require the use of highly toxic reagents. The pro-insulin C-peptide preparation obtained by the claimed method has a therapeutic activity determined by a decrease in proteinuria and nephropathy, and can be used for oral, parenteral and intranasal administration.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009111530/15A RU2413531C2 (en) | 2009-03-31 | 2009-03-31 | Method of producing oral preparation of proinsulin c-peptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009111530/15A RU2413531C2 (en) | 2009-03-31 | 2009-03-31 | Method of producing oral preparation of proinsulin c-peptide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009111530A RU2009111530A (en) | 2010-10-10 |
| RU2413531C2 true RU2413531C2 (en) | 2011-03-10 |
Family
ID=44024538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009111530/15A RU2413531C2 (en) | 2009-03-31 | 2009-03-31 | Method of producing oral preparation of proinsulin c-peptide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2413531C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2522897C1 (en) * | 2013-04-16 | 2014-07-20 | Закрытое акционерное общество "ФАРМ-ХОЛДИНГ" | Solid enteric oral dosage form of proinsulin c-peptide (versions) and method for preparing it (versions) |
-
2009
- 2009-03-31 RU RU2009111530/15A patent/RU2413531C2/en active IP Right Revival
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2522897C1 (en) * | 2013-04-16 | 2014-07-20 | Закрытое акционерное общество "ФАРМ-ХОЛДИНГ" | Solid enteric oral dosage form of proinsulin c-peptide (versions) and method for preparing it (versions) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009111530A (en) | 2010-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gulati et al. | Effect of stroma-free hemoglobin and diaspirin cross-linked hemoglogbin on the regional circulation and systematic hemodynamics | |
| JP2007532495A5 (en) | ||
| RU2012136951A (en) | INTRODUCTION OF REG1 COLLISION SYSTEM | |
| IE904292A1 (en) | Pharmaceutical for subcutaneous administration containing polypeptides | |
| Churchill et al. | Nephrotoxicity associated with combined gentamicin–amphotericin B therapy | |
| Khan et al. | Toxicity of subacute intravenous manganese chloride administration in beagle dogs | |
| US20180303910A1 (en) | Methods and compositions for treating diseases | |
| RU2413531C2 (en) | Method of producing oral preparation of proinsulin c-peptide | |
| Baez et al. | Role of the neurohypophysis in ferritin-induced antidiuresis | |
| RU2316339C1 (en) | Method for preparing insulin preparation for oral using | |
| FI68970B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN NY MEDICINSKT ANVAENDBARHEMIN-FOERENING | |
| WO2009045122A1 (en) | Medicinal agent for treating and preventing diabetes complications | |
| WO2009058874A1 (en) | Methods and materials for treating or preventing diseases/disorders mediated by alcohol dehydrogenase | |
| Pelletier et al. | Ultrastructural study of the uptake of peroxidase by the rat median eminence | |
| Salleh et al. | Effects of epidermal growth factor and glutamine-supplemented parenteral nutrition on the small bowel of septic rats | |
| US20220195072A1 (en) | Targeted anticoagulant | |
| CA1103160A (en) | Infusion solution for the treatment of hepatic encephalopathy and method of using them | |
| Pera Jr et al. | Effects of mannitol or furosemide diuresis on cis-dichlorodiammineplatinum (II) antitumor activity and toxicity to host-renewing cell populations in rats | |
| CN107412741B (en) | Mineralized exenatide sustained-release system and preparation method and application thereof | |
| Valuev et al. | Polymer Insulin Derivatives: Application Peculiarities | |
| JP3167763B2 (en) | Wound healing promoter | |
| RU2395296C1 (en) | Method for making oral proinsulin preparation | |
| RU2076733C1 (en) | Method of insulin derivatives preparing | |
| JP2007506683A (en) | Human growth hormone agent and its preparation and use | |
| Hilton | Rate of the Enzymatic Breakdown of Digitoxin. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120401 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20131020 |