RU2410438C2 - Анализы и способы, использующие биомаркеры - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Представлены способы, исследующие экспрессию одного или нескольких биомаркеров в образце ткани и клеток млекопитающего. В соответствии с описанными способами определение экспрессии одного или нескольких таких биомаркеров является показателем или означает, что образец ткани или клеток будет чувствительным к апоптоз-индуцирующим веществам, таким как антителам-агонистам Apo2L/TRAIL и анти-DR5. Некоторые биомаркеры, которые можно исследовать, включают фукозилтрансферазы, в частности фукозилтрансферазу 3 (FUT3) и/или фукозилтрансферазу 6 (FUC6), а также и сиалил-Льюис А и/или Х антигены. Изобретение расширяет арсенал способа прогнозирования и лечения рака. 6 н. и 31 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл.

Description

Родственные заявки

В данной заявке испрашивается приоритет согласно разделу 119 (e) предварительной заявки США № 60/599393, зарегистрированной 6 августа 2004, содержание которой приведено здесь в полном объеме в качестве ссылки.

Область изобретения

Описанное здесь изобретение относится к способам и анализам для определения биомаркеров, прогнозирующих чувствительность клеток млекопитающих к антителам-агонистам Apo2L/TRAIL и/или рецептора смерти.

Предпосылки изобретения

Различные лиганды и рецепторы, принадлежащие к суперсемейству фактора некроза опухоли (TNF), были идентифицированы в данной области. Включенные в число таких лигандов представляют собой фактор некроза опухоли альфа ("TNF-альфа"), фактор некроза опухоли бета ("TNF-бета" или "лимфотоксин-альфа"), лимфотоксин-бета ("LT-бета"), CD30 лиганд, CD27 лиганд, CD40 лиганд, OX-40 лиганд, 4-1BB лиганд, LIGHT, Apo-1 лиганд (также обозначаемый Fas лигандом или CD95 лигандом), Apo-2 лиганд (также обозначаемый Apo2L или TRAIL), Apo-3 лиганд (также обозначаемый TWEAK), APRIL, OPG лиганд (также обозначаемый RANK лигандом, ODF, или TRANCE), и TALL-1 (также обозначаемый BlyS, BAFF или THANK) (см., например, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281: 1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992); WO 97/01633 опубликованный 16 января 1997; WO 97/25428, опубликованный 17 июля 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO98/28426, опубликованный 2 июля 1998; WO98/46751, опубликованный 22 октября 1998; WO/98/18921, опубликованный 7 мая 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).

Индукция различных клеточных ответов, опосредованная такими лигандами семейства TNF, обычно вызывается их связыванием со специфическими клеточными рецепторами. Некоторые, но не все, лиганды семейства TNF связываются и вызывают различные биологические активности посредством "рецепторов смерти" клеточной поверхности для активации каспаз или ферментов, которые осуществляют клеточную смерть или апоптотический путь (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997). Идентифицированные к настоящему времени включенные в число членов суперсемейства представляют собой TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (также обозначаемый Apo-1 или CD95), DR4 (также обозначаемый TRAIL-R1), DR5 (также обозначаемый Apo-2 или TRAIL-R2), DcR1, DcR2, остеопротегерин (OPG), RANK и Apo-3 (также обозначаемый DR3 или TRAMP) (см., например, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281: 1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417563, опубликованный 20 марта 1991; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)). Большинство из этих членов семейства рецептора TNF имеют характерную структуру рецепторов клеточной поверхности, включающую внеклеточную, трансмембранную и внутриклеточную области, тогда как другие обнаруживаются в природе в виде растворимых белков, не имеющих трансмембранного и внутриклеточного домена. Внеклеточный участок характерных TNFR содержит набор повторяющейся аминокислотной последовательности из множественных богатых цистеинов доменов (CRD), начиная с NH₂-конца.

Лиганд, именуемый Apo-2L или TRAIL, несколько лет назад был идентифицирован как член TNF семейства цитокинов, (см., например, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; патент США 5763223 выданный 9 июня 1998; патент США 6284236, выданный 4 сентября 2001). Apo2L/TRAIL полипептид человека полноразмерной нативной последовательности имеет 281 аминокислоту в длину, трансмембранный белок Типа II. Некоторые клетки могут вырабатывать природную растворимую форму полипептида путем ферментативного отщепления внеклеточной области полипептида (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Кристаллографические исследования растворимых форм Apo2L/TRAIL показали гомотримерную структуру, сходную со структурами TNF и других родственных белков (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Однако, в отличие от других членов семейства TNF, было обнаружено, что Apo2L/TRAIL обладает уникальным структурным свойством, заключающимся в том, что три цистеиновых остатка (в положении 230 каждой субъединицы гомотримера) сообща координируют атом цинка, и это связывание цинка важно для устойчивости тримера и биологической активности (Hymowitz et al., выше; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).

Как сообщалось в литературе, Apo2L/TRAIL может играть роль в модуляции иммунной системы, включая аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит [см., например, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].

Также сообщалось, что растворимые формы Apo2L/TRAIL вызывают апоптоз в разных раковых клетках, включая опухоли толстой кишки, легкого, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почки, яичника и мозга, а также и меланому, лейкоз и множественную миелому (см., например, Wiley et al., выше; Pitti et al., выше; патент США 6030945 опубликованный 29 февраля 2000; патент США 6746668 публикованный 8 июня 2004; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). В in vivo исследованиях на мышиных опухолевых моделях далее показали, что Apo2L/TRAIL, один или в сочетании с химиотерапией или лучевой терапией может обнаруживать значительные противоопухолевые эффекты (см., например, Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., выше; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); заявка PCT US/00/15512; заявка PCT US/01/23691). По-видимому, в отличие от многих типов раковых клеток большинство типов нормальных клеток человека устойчивы к индукции апоптоза определенными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., выше, Walzcak et al., выше). Jo et al. сообщали, что меченная полигистидином растворимая форма Apo2L/TRAIL вызывает апоптоз in vitro в нормальных выделенных человеческих, но не нечеловеческих, гепатоцитах (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); см. также Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Полагают, что определенные препараты рекомбинантных Apo2L/TRAIL могут различаться по биохимическим свойствам и биологическим активностям в больных клетках по сравнению с нормальными клетками, в зависимости, например, от присутствия или отсутствия маркерной молекулы, содержания цинка и проценты содержания тримера (см., Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).

Было обнаружено, что Apo2L/TRAIL, связывается, по крайней мере, с пятью различными рецепторами. По крайней мере, два рецептора, которые связывают Apo2L/TRAIL, содержат функциональный, цитоплазматический домен смерти. Один такой рецептор был обозначен как "DR4" (и альтернативно как TR4 или TRAIL-R1) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); см. также WO98/32856, опубликованный 30 июля 1998; WO99/37684, опубликованный 29 июля 1999; WO 00/73349, опубликованный 7 декабря 2000; патент США № 6433147, выданный 13 августа 2002; патент США № 6461823, выданный 8 октября 2002, и патент США № 6342383, выданный 29 января 2002).

Другой такой рецептор для Apo2L/TRAIL был обозначен как DR5 (также альтернативно обозначен как Apo-2; TRAIL-R или TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER) (см., например, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), WO98/51793, опубликованный 19 ноября 1998; WO98/41629, опубликованный 24 сентября 1998; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., l6:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO98/35986, опубликованный 20 августа 1998; EP870827, опубликованный 14 октября 1998; WO98/46643, опубликованный 22 октября 1998; WO99/02653, опубликованный 21 января 1999; WO99/09165, опубликованный 25 февраля 1999; WO99/11791, опубликованный 11 марта 1999; US 2002/0072091, опубликованный 13 августа 2002; US 2002/0098550, опубликованный 7 декабря 2001; US 6313269, выданный 6 декабря 2001; US 2001/0010924, опубликованный 2 августа 2001; US 2003/01255540, опубликованный 3 июля 2003; US 2002/0160446, опубликованный 31 октября 2002, US 2002/0048785, опубликованный 25 апреля 2002; US 6342369, выданный в феврале 2002; US 6569642, выданный 27 мая 2003, US 6072047 выданный 6 июня 2000, US 6642358, выданный 4 ноября 2003; IS 6743625, выданный 1 июня 2004). Сообщали, что подобные DR4, DR5 содержат цитоплазматический домен смерти и способны вызывать апоптоз при связывании лиганда (или при связывании молекулы, такой как антитело-агонист, которое имитирует активность лиганда). Кристаллическую структуру комплекса, образованного между Apo-2L/TRAIL и DR5, описали Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

При связывании лиганда и DR4, и DR5 могут вызывать апоптоз независимо друг от друга, рекрутируя и активируя инициатор апоптоза, каспазу-8, посредством содержащей домен смерти адапторной молекулы, обозначаемой FADD/Mort1 [Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)].

Сообщали, что Apo2L/TRAIL также связывают те рецепторы, которые обозначают DcRl, DcR2 и OPG, которые, как полагают, выполняют функцию скорее ингибиторов, чем трансдукторов передачи сигнала (см., например, DCR1 (также обозначенного как TRID, LIT или TRAIL-R3) [Pan et al., Science, 276: 111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:.1165-1170 (1997); и Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998); DCR2 (также названный TRUNDD или TRAIL-R4) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)], и OPG [Simonet et al., выше]. В отличие от DR4 и DR5, рецепторы DcR1 и DcR2 не вызывают апоптоз.

В литературе описаны некоторые антитела, которые связываются с DR4 и/или DR5 рецепторами. Например, анти-DR4 антитела, отнесенные к DR4 рецептору и обладающие агонистическим или апоптотическим действием в некоторых клетках млекопитающих, описаны, например, в WO 99/37684, опубликованной 29 июля 1999; WO 00/73349, опубликованной 12 июля 2000; WO 03/066661, опубликованной 14 августа 2003. См. также, например, Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001) ; WO 02/097033, опубликованной 2 декабря 2002; WO 03/042367, опубликованной 22 мая 2003; WO 03/038043, опубликованной 8 мая 2003; WO 03/037913, опубликованной 8 мая 2003. Описаны некоторые анти-DR5 антитела, сходные с описанными, см., например, WO 98/51793, опубликованную 8 ноября 1998; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada; WO 03/038043, опубликованный 8 мая 2003; WO 03/037913 опубликованный 8 мая 2003. К тому же были описаны некоторые антитела, которые обладают перекрестной реактивностью как к DR4, так и к DR5 рецепторам (см., например, патент США № 6252050, выданный 26 июня 2001).

Злокачественное перерождение некоторых клеток млекопитающих, имеющее место в некоторых случаях, было связано с характерными изменениями в экспрессии сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X антигенов. Относительно высокие количества сиалил-Льюис A/X присутствуют, например, в некоторых аденокарциномах человека толстой кишки, поджелудочной железы и желудка, и способы с использованием антител, направленных на углеводородные структуры этих антигенов, используют как средства для определения злокачественных опухолей поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта (см., например, Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 49:2:303-311 (2002). Уровень экспрессии этих углеводородных опухолевых маркеров также коррелирует с исходом болезни, временем выживаемости больного и индикацией метастазирования.

Как было показано, как и сиалил-Льюис A, так и сиалил-Льюис X связываются с семейством углеводород-связывающих белков, участвующих в выхождении в ткани из сосудистого русла клеток, названных селектинами. В некоторых отчетах показано, что сиалил-Льюис A и X представляют собой лиганды для E-селектина, и могут быть ответственными за адгезию клеток рака человека к эндотелию. Представленные на поверхности раковых клеток структуры сиалил-Льюис опираются углеводородными цепями гликопротеинов и гликолипидов и связывают представленный на поверхности эндотелиальных клеток E-селектин. Поэтому селектины и их углеводородные лиганды могут играть важную роль в избирательном хоминге опухолевых клеток во время метастазирования.

Полагают, что биосинтез сиалил-Льюис A и X зависит от конечного добавления фукозы из гуанозиндифосфата фукозы (GDP-Fuc) в альфа (1,3) и альфа (1,4) связи к сиализированным формам предшественников специфичными к типу клеток и специфичными для стадии развития ферментами, стадию катализировали альфа-1,3/1,4-фукозилтрансферазами (альфа 1,3/1,4 Fuc-T, FUT).

Несколько генов фукозилтрансферазы человека клонированы и охарактеризованы к настоящему времени. Экспрессия этих генов (FUT 3-7) и их ферментные продукты (Fuc-TIII-VII), по-видимому, тканеспецифичны. Кодируемые пятью генами ферменты обозначаются FUTIII, FUTIV, FUTV, FUTVI и FUTVII. Кодирующие FUTIII, FUTV и FUTVI три гена локализуются в закрытых естественных положениях на хромосоме 19pl3.3. В биохимических и молекулярного клонирования исследованиях показано, что линиеспецифическая экспрессия сиалил-Льюис A/X молекул обуславливается линиеспецифической экспрессией генов альфа-1,3-фукозилтрансферазы, чьи ферментные продукты оказывают влияние на конститутивно экспрессируемые олигосахаридные предшественники для образования поверхностно-локализованных детерминант сиалил-Льюис A/X. Ответственные за активность в эпителиальных тканях фукозилтрансферазы человека представляют собой FUT3 и FUT6. FUT3 [также названный геном Льюиса альфа(1,3/1,4) фукозилтрансферазы] и FUT6 [плазменный ген альфа(1,3) фукозилтрансферазы] транскрипты присутствуют как в нормальных, так и в трансформированных тканях. Транскрипты фукозилтрансферазы также преобладают во многих клеточных линиях аденокарциномы, с исключительно высокой экспрессией FUT3 и 6 в карциноме толстой кишки (см., например, Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 49:303-311 (2002); Nakamori et al., Dis. Colon Rectum., 40:420-431 (1997); Takada et al., Cancer Res., 53:354-361 (1993); Ichikawa et al., J. Surg. Oncol., 75:98-102 (2000)); Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res., 2002 Mar, 21 (1):107-13 ; Matsumoto et al., Br J Cancer. 2002 Jan 21; 86 (2):161-7; Ito et al., J Gastroenterol. 2001 Dec; 36(12): 823-9; Nakagoe et al., Cancer Detect Prev. 2001; 25 (3):299-308; Kumamoto et al., Cancer Res. 2001 Jun 1, 61(11):4620-7; Murata et al., Dis Colon Rectum. 2001 Apr; 44(4):A2-A4; Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res. 2001 Mar; 20(1):85-90; Nakagoe et al., J Gastroenterol. 2001 Mar; 36(3):166-72; Nakagoe et al., Tumour Biol. 2001 Mar-Apr; 22(2):115-22; Nakagoe et al., Can J Gastroenterol. 2000 Oct; 14(9):753-60; Izawa et al., Cancer Res. 2000 Mar 1; 60(5):1410-6; Tanaka et al., Hepatogastroenterology. 1999 Mar-Apr; 46(26):875-82; Matsushita et al., Cancer Lett. 1998 Nov 27; 133(2):151-60; Sato et al., Anticancer Res. 1997 Sep-Oct; 17(5A):3505-11; Yamada et al., Br J Cancer. 1997; 76 (5):582-7; Nakamori et al., Dis Colon Rectum. 1997 Apr; 40(4):420-31; Srinivas et al., Scand J Immunol. 1996 Sep; 44(3):197-203; Matsushita et al., Lab Invest. 1990 Dec; 63(6):780-91; Ashizawa et al., J Exp Clin Cancer Res. 2003 Mar; 22(1):91-8; Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res. 2002 Sep, 21 (3):363-9; Nakagoe et al., Anticancer Res. 2002 Jan-Feb; 22(1A):451-8; Nakagoe et al., J Clin Gastroenterol. 2002 Apr; 34(4):408-15; Nakagoe et al., Cancer Lett. 2002 Jan 25; 175(2):213-21; Tatsumi et al., Clin Exp Metastasis. 1998 Nov; 16(8):743-50; Ikeda et al., J Surg Oncol. 1996 Jul; 62(3):171-6; Ikeda et al., Eur J Surg Oncol. 1995 Apr; 21 (2):168-75; Togayachi et al., Int J Cancer. 1999 Sep 24; 83(1):70-9; Satoh et al., Clin Cancer Res. 1997 Apr; 3(4):495-9; Satoh et al., Respiration. 1998; 65(4):295-8; Satoh et al., Anticancer Res. 1998 Jul-Aug; 18(4B):2865-8; Fukuoka et al., Lung Cancer. 1998 May; 20(2):109-16; Fujiwara et al., Anticancer Res. 1998 Mar- Apr; 18(2A):1043-6; Ogawa et al., Int J Cancer. 1997 Apr 22; 74(2):189-92; Ogawa et al., J Thorac Cardiovasc Surg. 1994 Aug; 108(2):329-36; Asao et al., Cancer. 1989 Dec 15; 64(12):2541-5; Narita et al., Breast Cancer. 1996 Mar 29; 3(1):19-23; Yamaguchi et al., Oncology. 1998 Jul-Aug; 55(4):357-62; Sikut et al., Int J Cancer. 1996 May 29; 66(5):617-23; Saito et al., Anticancer Res. 2003 Jul-Aug; 23(4):3441-6; Fujii et al., Urol Int. 2000; 64(3):129-33; Idikio et al., Glycoconj J. 1997 Nov; 14(7):875-7; Inoue et al., Obstet Gynecol. 1992 Mar; 79(3):434-40; Yamashita et al., Eur J Cancer. 2000 Jan; 36(1):113-20; Hamanaka et al., Pancreas. 1996 Aug; 13(2):160-5; Ho et al., Cancer Res. 1995 Aug 15; 55(16):3659-63.

Сущность изобретения

В изобретении, раскрытом здесь, представлены способы и анализы контрольной экспрессии одного или нескольких биомаркеров в образце ткани или клеток млекопитающего, где экспрессия одного или нескольких таких биомаркеров является показателем того, будет ли образец ткани или клеток чувствительным к вызывающим апоптоз агентам, таким как антитела-агонистам Apo2L/TRAIL и анти-DR5. В различных примерах осуществления изобретения способы и анализы исследуют экспрессию биомаркеров таких как фукозилтрансферазы, в частности, фукозилтрансфераза 3 (FUT3) и/или фукозилтрансфераза 6 (FUT6), а также сиалил-Льюис A и/или X антигенов.

Как отмечалось выше, по-видимому, большинство типов нормальных клеток человека устойчивы к индукции апоптоза некоторыми рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше). Также было получено, что некоторые популяции поврежденных клеточных типов (такие как определенные популяции раковых клеток) устойчивы к индукции апоптоза определенными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 1999, выше; Walczak et al., Nature Med., 1999, выше). Следовательно, изучая образцы ткани или клеток млекопитающих в отношении экспрессии определенных биомаркеров посредством анализа, можно удобно и эффективно получить данные, полезные в оценке адекватной или эффективной терапии для лечения пациентов. Например, информация, полученная из анализа определения FUT3 или FUT6 экспрессии в образце ткани или клеток млекопитающих, может снабдить врачей полезными данными, которые можно использовать для определения оптимальной схемы лечения (с использованием антител-агонистов Apo2L/TRAIL или рецептора смерти) для больных, страдающих от такого нарушения как рак.

В изобретении представлены способы прогнозирования чувствительности образца ткани или клеток млекопитающего (такой как раковая клетка) к Apo2L/TRAIL или антителу-агонисту рецептора смерти. В некоторых вариантах осуществления способы включают получение образца ткани или клеток млекопитающих и исследование ткани или клетки на экспрессию фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6. Способы могут также включать исследование ткани или клетки на экспрессию других биомаркеров, таких как сиалил-Льюис A и/или X антигены. Способы могут быть проведены в различных форматах анализа, включающих анализы определения экспрессии мРНК, ферментные анализы определения наличия ферментной активности, иммуногистохимические анализы и другие описанные здесь. Определение экспрессии таких биомаркеров в вышеупомянутых тканях или клетках будет показателем того, что такие ткани или клетки будут чувствительны к апоптоз-индуцированной активности Apo2/TRAIL и/или антитела рецептора смерти. В дополнительных вариантах осуществления в тканях или клетках можно также исследовать экспрессию DR4, DR5, DcR1 или DcR2 рецепторов.

Далее способы изобретения включают способы индукции апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающие стадии получения образца ткани или клеток млекопитающего, исследование экспрессии в ткани или клетке одного или нескольких биомаркеров, таких как фукозилтрансфераза 3, фукозилтрансфераза 6, сиалил-Льюис A и/или X антиген(ы), и на основании определения того, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует указанный один или несколько биомаркеров, воздействие на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством антитело-агониста Apo2L/TRAIL или рецептора смерти. Стадии способов исследования экспрессии одного или нескольких биомаркеров можно проводить при различных форматах анализа, включающих анализы определения экспрессии мРНК, ферментные анализы определения наличия ферментной активности, и иммуногистохимические анализы. В дополнительных вариантах осуществления в способы также включают исследование в образце ткани или клетки экспрессии DR4, DR5, DcR1 или DcR2 рецепторов. Необязательно, образец ткани или клеток включает ткань или клетки злокачественной опухоли.

Более того, способы изобретения включают способы лечения нарушений у млекопитающего, таких как иммунно-связанное нарушение или рак, включающие стадии получения образца ткани и клеток млекопитающего, исследование в ткани и клетках экспрессии одного или нескольких биомаркеров, таких как фукозилтрансфераза 3, фукозилтрансфераза 6, сиалил-Льюис A и/или X антиген(ы), и на основании определения того, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует указанный один или несколько биомаркеров, введение эффективного количества антитело-агониста Apo2L/TRAIL или рецептора смерти указанному млекопитающему. Стадии способов исследования экспрессии одного или нескольких биомаркеров можно проводить в различных форматах анализа, включающих анализы определения экспрессии мРНК, ферментные анализы определения наличия ферментной активности, и иммуногистохимические анализы. В дополнительных вариантах осуществления способы также включают исследование в образце ткани или клеток экспрессии DR4, DR5, DcR1 или DcR2 рецепторов. Необязательно способы включают лечение рака у млекопитающего. Необязательно способы включают в дополнение к введению эффективного количества антитела-агониста Apo2L/TRAIL и/или рецептора смерти, назначение химиотерапевтического средств(а) или лучевой терапии указанному млекопитающему.

Далее варианты осуществления более конкретно описываются следующими формулами изобретения:

1. Способ прогнозирования чувствительности образца ткани или клеток млекопитающего к антителу рецептора смерти, включающий стадии:

получение образца ткани или клеток млекопитающего;

исследование образца ткани или клетки для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис A и/или X антигена (антигенов), где экспрессия указанных одного или нескольких биомаркеров является показателем того, что указанный образец ткани или клеток является чувствительным к апоптоз-индуцирующей активности одного или нескольких антител рецептора смерти.

2. Способ по п.1 формулы изобретения, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют путем определения экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

3. Способ по п.1 формулы изобретения, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют иммуногистохимией для определения экспрессии сиалил-Льюис A и/или X антигена (антигенов).

4. Способ по п.1 формулы изобретения, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии DR4, DR5, DcR1 или DcR2 рецепторов в указанном образце ткани или клеток.

5. Способ по п.1 формулы изобретения, где образец ткани или клеток включает в ткань или клетки злокачественной опухоли.

6. Способ по п.5 формулы изобретения, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой раковые клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

7. Способ по п.1 формулы изобретения, где указанное одно или несколько антител рецептора смерти представляют собой антитела DR5 или DR4.

8. Способ индукции апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающий стадии:

получение образца ткани или клеток млекопитающего;

исследование образца ткани или клеток для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис A и/или X антигена (антигенов), и после определения экспрессии указанных одного или нескольких биомаркеров,

воздействие на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством антитела-агониста рецептора смерти.

9. Способ по п.8 формулы изобретения, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют тестированием экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

10. Способ по п.8 формулы изобретения, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют иммуногистохимией для определения сиалил-Льюис A и/или X антигена (антигенов).

11. Способ по п.8 формулы изобретения, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии DR4, DR5, DcR1 или DcR2 рецепторов в указанном образце ткани или клеток.

12. Способ по п.8 формулы изобретения, где указанный образец ткани или клеток включает ткань или клетки злокачественной опухоли.

13. Способ по п.11 формулы изобретения, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой раковые клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

14. Способ по п.8 формулы изобретения, где указанные клетки подвергаются действию эффективного количества DR5 или DR4 антител-агонистов.

15. Способ лечения нарушения у млекопитающих, такого как связанное с иммунитетом нарушение или рак, включающий стадии:

получение образца ткани или клеток из указанного млекопитающего;

исследование образца ткани или клеток для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис A и/или X антигена (антигенов), и после определения экспрессии указанных одного или нескольких биомаркеров, введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела-агониста рецептора смерти.

16. Способ по п.15 формулы изобретения, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют определением экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

17. Способ по п.15 формулы изобретения, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют иммуногистохимией для определения экспрессии сиалил-Льюис A и/или X антигена (антигенов).

18. Способ по п.15 формулы изобретения, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии DR4, DR5, DcR1 или DcR2 рецепторов в указанной ткани или клетке.

19. Способ по п.15 формулы изобретения, где образец ткани или клеток включает ткань или клетки злокачественной опухоли.

20. Способ по п.19 формулы изобретения, где указанные клетки или ткани злокачественной опухоли включают раковые клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

21. Способ по п.14 формулы изобретения, где указанному млекопитающему вводят эффективное количество антитела-агониста DR5 или DR4.

22. Способ по п.15 формулы изобретения, где указанному млекопитающему также назначают химиотерапевтическое средство(а) или лучевую терапию.

23. Способ по п.15 формулы изобретения, где указанному млекопитающему также вводят цитокин, цитотоксический агент, или агент, ингибирующий рост.

24. Способ по любому из пп.7, 14 или 21 формулы изобретения, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело DR5.

25. Способ по любому из пп.7, 14 или 21 формулы изобретения, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело DR4.

26. Способ по любому из пп.7, 14 или 21 формулы изобретения, где указанное антитело представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывает DR5.

27. Способ по любому из пп.7, 14 или 21 формулы изобретения, где указанное антитело представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывает DR4.

28. Способ по любому из пп.7, 14 или 21 формулы изобретения, где указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное моноклональное антитело, которое связывает DR5.

29. Способ по любому из пп.7, 14 или 21 формулы изобретения, где указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное моноклональное антитело, которое связывает DR4.

30. Способ по любому из пп.7, 14 или 21 формулы изобретения, где указанное антитело представляет собой антитело DR5, которое связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-411 из фиг.3A (SEQ ID NO:5).

31. Способ по любому из пп.7, 14 или 21 формулы изобретения, где указанное антитело представляет собой антитело DR4, которое связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-468 из фиг.2 (SEQ ID NO:3).

32. Способ прогнозирования чувствительности клеток злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальных раковых клеток млекопитающего к антителу DR5 рецептора, включающий стадии: получение клеток злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальных раковых клеток млекопитающего;

исследование раковых клеток для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис A и/или X антигена(ов), где экспрессия указанных одного или нескольких биомаркеров является показателем того, что указанные раковые клетки чувствительны к апоптоз-индуцирующей активности антитела DR5 рецептора.

33. Способ по п.32 формулы изобретения, где указанное антитело DR5 рецептора представляет собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.

34. Способ по п.32 формулы изобретения, где указанное антитело DR5 рецептора связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-411 из фиг.3A (SEQ ID NO:5).

35. Способ индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальных раковых клеток млекопитающих, включающий стадии:

получение клеток злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальных раковых клеток млекопитающих,

исследование раковых клеток для определения экспрессия одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис A и/или X антигена(ов), и

после определения экспрессии вышеупомянутых одного или нескольких биомаркеров,

воздействие на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством антитела-агониста DR5.

36. Способ по п.35 формулы изобретения, где указанное антитело-агонист DR5 представляет собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.

37. Способ по п.35 формулы изобретения, где указанное антитело-агонист DR5 связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-411 из фиг.3A (SEQ ID NO:5).

38. Способ лечения рака толстой кишки и колоректального рака у млекопитающего, включающий стадии:

получение образца рака толстой кишки или колоректального рака из указанного млекопитающего;

исследование образца рака для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис A и/или X антигена(ов), и

после определения экспрессии указанного одного или нескольких биомаркеров,

введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела-агониста DR5.

39. Способ по п.38 формулы изобретения, где указанное антитело-агонист DR5 представляет собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.

40. Способ по п.38 формулы изобретения, где указанное антитело-агонист DR5 связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-411 из фиг.3A (SEQ ID NO:5).

Краткое описание фигур

На фиг.1 изображены нуклеотидная последовательность человеческого Apo-2 лиганда кДНК (SEQ ID N0:2) и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1). "N" в нуклеотидном положении 447 используется для обозначения нуклеотидного основания, которое может быть "T" или "G".

На фиг.2A и 2B изображена нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) для человеческого DR4 полной длины и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности для DR4 человека также опубликованы в Pan et al., Science, 276:111 (1997).

На фиг.3A изображена последовательность из 411 аминокислот (SEQ ID NO:5) человеческого DR5, как опубликовано в WO 98/51793 19 ноября 1998. Транскрипционный сплайсинговый вариант человеческого DR5 известен специалисту в данной области. Этот сплайсинговый вариант DR5 кодируется последовательностью из 440 аминокислот (SEQ ID NO:6) человеческого DR5, изображенного на фиг.3B и 3C, как опубликовано в WO 98/35986 20 августа 1998.

На фиг.3D изображены нуклеотидные последовательности кДНК (SEQ ID NO:7) для человеческого DcR1 полной длины и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8). Соответствующий нуклеотид и аминокислотные последовательности человеческого DcR1 (и его конкретные домены) также изображены и опубликованы в WO 98/58062.

На фиг.3E изображены нуклеотидные последовательности кДНК (SEQ ID NO:9) для человеческого DcR2 полной длины и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:10). Соответствующий нуклеотид и аминокислотные последовательности человеческого DcR2 (и его конкретные домены) изображены в WO 99/10484.

На фиг.4 изображены нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:11) для человеческой (1,3/1,4)фукозилтрансферазы (FUT3) полной длины и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12). Эти последовательности соответствуют инвентарному номеру GenBank HSU27328, и описаны, например, в Kukowska-Latallo et al., Genes Dev. 1990 Aug;4 (8):1288-303.

На фиг.5 изображена нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:13) для человеческой альфа (1,3) фукозилтрансферазы (FUT6) полной длины и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:14). Эти последовательности соответствуют инвентарному номеру GenBank HSU27333 и описаны, например, в Koszdin and Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 1992 Aug 31;187 (1):152-7.

На фиг.6 представлено краткое изложение схемы данных, полученных при анализе 28 кишечных или колоректальных раковых клеточных линий на чувствительность или резистентность к апоптотической активности Apo2L (+ 0,5% эмбриональной бычьей сыворотки "FBS" или 10% FBS) или DR5 моноклональным антителам "mab", перекрестно-связанным "XL" или не перекрестно-связанным (+ 0,5% эмбриональной бычьей сыворотки "FBS" или 10% FBS) и экспрессия FUT 3, FUT 6, сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X.

На фиг.7 представлено сравнение чувствительности различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий к DR5 антителу и экспрессия FUT 3, как измеренная количественной PCR.

На фиг.8 представлены сравнение различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий на чувствительность или резистентность к DR5 антителам (плюс перекрестная связь) и экспрессия сиалил-Льюис X или A, как установлено FACS.

На фи.9A изображен критерий ранговой корреляции Спирмана, анализирующий чувствительность или резистентность различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий и корреляция с экспрессией FUT3.

На фиг.9В изображены результаты точного критерия Фишера, анализирующие чувствительность или резистентность различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий, и статистическая значимость между FUT3 и экспрессией сиалил-Льюис A/X и чувствительностью соответствующих клеточных линий к апоптотической активности DR5 антитела.

На фиг.10 представлено сравнение экспрессии рецепторов DcR1 или DcR2 различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий (как установлено количественным PCR) и состояние (чувствительность или резистентность) постоянных клеточных линий к антителу Apo2L или DR5.

На фиг.11 представлено сравнение экспрессии рецепторов DcR1 или DcR2 различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий (что установлено FACS) и состояние (чувствительность или резистентность) постоянных клеточных линий к антителу Apo2L или DR5.

На фиг.12 изображено иммуногистохимическое окрашивание для сиалил-Льюис A и X в четырех колоректальных раковых клеточных линиях, CaCO₂, SW 1417, DLD-1 и Colo 205, и их корреляции с экспрессией сиалил-Льюис A и X, определяемой FACS, и их корреляции с чувствительностью к Apo2L.

На фиг.13 изображено краткое описание IHC экспериментов, демонстрирующих экспрессию сиалил-Льюис A и X в образцах ткани нормальной слизистой кишечника, нормальной ткани печени, первичного рака кишечника и кишечных раковых метастазов.

Подробное описание изобретения

Способы и процедуры, описанные или упомянутые в данном описании, как правило, хорошо изучены и обычно применяемы специалистами в данной области, используя общепринятый способ, такие как, например, широко используемые способы молекулярного клонирования, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. В соответствующих случаях процедуры, предполагающие применение коммерчески доступных наборов и реагентов, как правило, проводятся в соответствии с определяемыми производителем протоколами и/или параметрами производителя, если не указано иначе.

Перед описанием настоящих способов и анализов следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретным способом, а протоколы, клеточные линии, виды или роды животных, конструкции и реактивы, описанные как таковые, можно, безусловно, менять. Также следует понимать, что используемая в данном описании терминология служит исключительно в целях описания конкретных вариантов осуществления и не направлена на ограничение пределов настоящего изобретения, которое будет ограничено исключительно прилагаемыми формулами изобретения.

Следует отметить, что, как использовано в данном описании и в прилагаемых формулах изобретения, единственные формы "некоторый" "и" и "этот" включают множественные формы, если в контексте не указано иначе. Так, например, ссылка на "генетическое изменение" включает множество таких изменений, а ссылка на "образец" включает ссылку на один или несколько образцов и их эквиваленты, известные специалисту в данной области, и так далее.

Все упомянутые в данном описании публикации включены в данное описание посредством ссылки для описания и раскрытия способов и/или данных, в связи с которыми цитировали публикации. Цитированные в данном описании публикации цитируются для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто из указанного в настоящей заявке не следует рассматривать как признание того, что авторы не имеют права датировать задним числом публикации на основании более ранней даты приоритета или более ранней даты изобретения. Далее подлинные даты опубликования могут отличаться от указанных дат опубликования и требуют независимой проверки.

I. Определения

Термины "Apo2L/TRAIL", "Apo-2L" и "TRAIL" использованы в данном описании для ссылки на полипептидную последовательность, которая включает аминокислотные остатки 114-281, включительно, остатки 95-281, включительно, остатки 92-281, включительно, остатки 41-281, включительно, остатки 15-281, включительно, или остатки 1-281, включительно, аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1, а также биологически активные фрагменты, делеционные, инсерционные или замещающие варианты вышеупомянутых последовательностей. В одном варианте осуществления полипептидная последовательность содержит остатки 114-281 фиг.1, и необязательно, состоит из остатков 114-281 фиг.1. Необязательно, полипептидная последовательность содержит остатки 92-281 или остатки 91-281 фиг.1. Apo-2L полипептиды могут кодироваться нативной нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг.1. Необязательно, кодон, который кодирует остаток Proll9 (фиг.1) может представлять собой "CCT" или "CCG". В других вариантах осуществления фрагменты или варианты являются биологически активными и имеют, по меньшей мере, примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно, 90% идентичности последовательности, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательности с любой из вышеупомянутых описанных Apo2L/TRAIL последовательностей. Необязательно, Apo2L/TRAIL полипептид кодируется нуклеотидной последовательностью которая гибридизуется в жестких условиях с кодирующей полинуклеотидной последовательностью, представленной на фиг.1. Определение включает замещающие варианты Apo2L/TRAIL, в которых, по меньшей мере, одна из их нативных аминокислот замещается на остаток аланина. Конкретные замещающие варианты Apo2L/TRAIL включают варианты, в которых, по меньшей мере, одна аминокислота замещается остатком аланина. Эти замещающие варианты включают идентифицированные варианты, например, такие как "D203A"; "D218A" и "D269A." Эту номенклатуру используют для идентификации Apo2L/TRAIL вариантов, в которых остатки аспарагиновой кислоты в положениях 203, 218 и/или 269 (используя нумерацию, показанную на фиг.1) замещаются остатками аланина. Необязательно, Apo2L варианты могут включать одну или более аланиновых замен, которые изложены в таблице 1 опубликованной PCT заявки WO 01/00832. Замещенные варианты включают одно или несколько замещений остатков, идентифицированных в таблице 1 патента WO 01/00832, опубликованного 4 января 2001. Определение также включает нативную последовательность Apo2L/TRAIL, выделенную из источника Apo2L/TRAIL или приготовленную рекомбинантными или синтетическими способами. Apo2L/TRAIL изобретения включает полипептиды, рассматриваемые как Apo2L/TRAIL или TRAIL, описанные в PCT публикации № WO97/01633 и WO97/25428. Термины "Apo2L/TRAIL" или "Apo2L" используют для ссылки, как правило, на формы Apo2L/TRAIL, которые включают мономерные, димерные или тримерные формы полипептида. Вся нумерация аминокислотных остатков, о которых идет речь в Apo2L последовательности, использует нумерацию в соответствии с фиг.1, если специально не изложены иначе. Например, "D203" или "Asp203" относятся к остатку аспарагиновой кислоты в положении 203 в последовательности, представленной на фиг.1.

Термин "Apo2L/TRAIL внеклеточный домен" или "Apo2L/TRAIL ECD" относится к форме Apo2L/TRAIL, который представляет собой преимущественно свободные трансмембранные и цитоплазматические домены. Как правило, ECD будет содержать менее чем 1% таких трансмембранных и цитоплазматических доменов, и предпочтительно, будет содержать менее чем 0,5% таких доменов. Следует понимать, что некоторые трансмембранные домены, идентифицированные для полипептидов настоящего изобретения, идентифицированы в соответствии с критерием, как принято, применяемым в данной области техники для идентифицирования домена такого типа. Точные границы трансмембранного домена могут изменяться, но наиболее вероятно, не больше чем приблизительно на 5 аминокислот на любом конце домена, который первоначально идентифицировали. В предпочтительном варианте осуществления ECD будет состоять из растворимой последовательности внеклеточного домена полипептида, который представляет собой свободные трансмембранные и цитоплазматические или внутриклеточные домены (и не является мембраносвязанным). Конкретные последовательности внеклеточного домена Apo-2L/TRAIL описаны в PCT публикации WO 97/01633 и WO 97/25428.

Термин "Apo2L/TRAIL мономер" или "Apo2L мономер" относится к ковалентной цепи последовательности внеклеточного домена Apo2L.

Термин "Apo2L/TRAIL димер" или "Apo2L димер" относится к двум мономерам Apo-2L, принимающим участие в ковалентной связи с помощью дисульфидного мостика. Как использовано в данном описании, термин включает свободные постоянные димеры Apo2L и димеры Apo2L, то есть внутри тримерных форм Apo2L (то есть связанных с другим, третьим мономером Apo2L).

Термин "Apo2L/TRAIL тример" или "Apo2L тример" относится к трем мономерам Apo2L, которые связаны нековалентно.

Термин "Apo2L/TRAIL комплекс" используют для ссылки на самоассоциированные высокоолигомерные формы Apo2L/TRAIL, такие как тримеры Apo2L/TRAIL, которые образуют, например, гексамерные и наномерные формы Apo2L/TRAIL. Анализ наличия и количества мономера Apo2L/TRAIL, димера или тримера (или других комплексов) можно получить, используя способы и анализы, известные специалисту в данной области (и используя доступные для приобретения материалы), такие как нативная гель-фильтрационная HPLC ("SEC"), денатурирующая гель-фильтрация с использованием додецилсульфата натрия ("SDS-SEC"), HPLC с обращенной фазой и капиллярный электрофорез.

"Рецептор Apo-2 лиганда" включает рецепторы, названные специалистами в данной области изобретения "DR4" и "DR5", чьи полинуклеотидные и полипептидные последовательности показаны на фиг. 2 и 3 соответственно. Pan et al. описали члена семейства TNF рецептора, названного "DR4" (Pan et al., Science, 276: 111-113 (1997); см. также WO98/32856, опубликованный 30 июля 1998; WO 99/37684, опубликованный 29 июля 29 1999; WO 00/73349, опубликованный 7 декабря 2000; патент США 6433147, выданный 13 августа 2002; патент США 6461823, выданный 8 октября 2002 и патент США 6342383, выданный 29 января 2002). Sheridan et al., Science, 277: 818-821 (1997) и Pan et al., Science, 277: 815-818 (1997) описывает другой рецептор для Apo2L/TRAIL (см. также, WO98/51793, опубликованный 19 ноября, 1998; WO 98/41629, опубликованный 24 сентября 1998). Этот рецептор называют DR5 (рецептор также альтернативно был назван Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER; Screaton et al., Curr. Biol., 7: 693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17: 141-143 (1997); WO 98/35986, опубликованный 20 августа 1998; EP 870827, опубликованный 14 октября 1998; WO 98/46643, опубликованный 22 октября 1998; WO 99/02653, опубликованный 21 января 1999; WO 99/09165, опубликованный 25 февраля 1999; WO 99/11791, опубликованный 11 марта 1999; US 2002/0072091, опубликованный 13 августа 2002; US 2002/0098550, опубликованный 7 декабря 2001; US 6313269, выданный 6 декабря 2001; US 2001/0010924, опубликованный 2 августа 2001; US 2003/01255540, опубликованный 3 июля 2003; US 2002/0160446, опубликованный 31 октября 2002, US 2002/0048785, опубликованный 25 апреля 2002; US 6569642, выданный 27 мая 2003, US 6072047, выданный 6 июня 2000, US 6642358, выданный 4 ноября 2003). Как описано выше, другие рецепторы для Apo-2L включают DcRl, DcR2 и OPG (см., Sheridan et al., выше; Marsters et al., выше; and Simonet et al., выше). Термин "Apo-2L рецептор" при использовании в данном описании включает нативный рецептор заданной последовательности и варианты рецептора. Эти термины включают рецептор Apo-2L, экспрессируемый у ряда млекопитающих, включая людей. Apo-2L рецептор может эндогенно экспрессироваться, как природный, в ряду происхождений человеческих тканей или может экспрессироваться рекомбинантными либо синтетическими способами. "Нативная последовательность Apo-2L рецептора" включает полипептид, содержащий аналогичную аминокислотную последовательность, так как рецептор Apo-2L получен естественным путем. Таким образом, нативная последовательность рецептора Apo-2L может содержать аминокислотную последовательность природного рецептора Apo-2L из любого млекопитающего. Такая нативная последовательность рецептора Apo-2L может быть выделена естественным путем или получена рекомбинантными или синтетическими способами. Термин "нативная последовательность рецептора Apo-2L", в частности, включает процессируемые в организме или секретируемые формы рецептора (например, растворимая форма содержащая, например, последовательность внеклеточного домена), природные вариантные формы (например, формы альтернативного сплайсинга) и природные аллельные варианты. Варианты рецептора могут включать фрагменты или делеционные мутанты природной последовательности рецептора Apo-2L. На фиг.3A показаны 411 аминокислотные последовательности человеческого DR5, которые опубликованы в WO 98/51793 19 ноября 1998. Транскрипционный сплайсинговый вариант человеческого DR5 известен в данной области. Этот DR5 сплайсинговый вариант кодирует 440 аминокислотную последовательность человеческого DR5, показанную в фиг.3B и 3C, которая опубликована в WO 98/35986 20 августа 1998.

Термин "антитело рецептора смерти" используют в данном описании, как правило, для ссылки на антитело или антитела, относящиеся к рецептору суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли и содержащие домен смерти, способный вызывать апоптоз, и такие антитела включают в себя антитело DR5 и антитело DR4.

Термины "антитело рецептора DR5", "DR5 антитело" или "анти-DR5 антитело" используют в широком смысле для ссылки на антитела, которые связываются, по крайней мере, с одной формой рецептора DR5 или их внеклеточным доменом. Необязательно антитело DR5 сливается или связывается с гетерологичной последовательностью или молекулой. Предпочтительно гетерологичная последовательность помогает или способствует антителу образовывать комплексы более высокого порядка или олигомерные комплексы. Необязательно антитело DR5 связывает рецептор DR5, но не связывает или перекрестно не реагирует ни с каким добавочным рецептором Apo-2L (например, DR4, DcR1 или DcR2). Необязательно антитело представляет собой агонист DR5 сигнальной активности.

Необязательно DR5 антитело изобретения связывает DR5 рецептор в диапазоне концентраций примерно от 0,1 нМ до примерно 20 мМ, как измерено BIAcore связывающим анализом. Необязательно антитела DR5 изобретения показывают Ic 50 содержание приблизительно от 0,6 нМ до приблизительно 18 мМ, как измерено BIAcore связывающим анализом.

Термины "антитело рецептора DR4 ", "антитело DR4 " или "анти-DR4 антитело" используют в широком смысле для ссылки на антитела, которое связывает, по крайней мере, одну форму рецептора DR4 или их внеклеточный домен. Необязательно антитело DR4 сливается или связывается с гетерологичной последовательностью или молекулой. Предпочтительно гетерологичная последовательность помогает или способствует антителу образовывать комплексы более высокого порядка или олигомерные комплексы. Необязательно DR4 антитело связывает рецептор DR4, но не связывает или перекрестно не реагирует ни с каким добавочным рецептором Apo-2L (например, DR5, DcR1 или DcR2). Необязательно антитело представляет собой агонист DR4 сигнальной активности.

Необязательно антитело DR4 изобретения связывает рецептор DR4 в диапазоне концентраций примерно от 0,1 нМ до примерно 20 мМ, как измерено BIAcore связывающим анализом. Необязательно антитела DR5 изобретения показывают Ic 50 содержание приблизительно от 0,6 нМ до приблизительно 18 мМ, как измерено BIAcore связывающим анализом.

Термин "агонист" используется в широком смысле и включает некоторые молекулы, которые частично или полностью усиливают, стимулируют или активируют одну или более биологические активности Apo2L/TRAIL, DR4 или DR5, in vitro, in situ или in vivo. Примеры таких биологических активностей, связывающих Apo2L/TRAIL с DR4 или DR5, включают в себя апоптоз, а также активности, о которых далее сообщается в литературе. Агонист может функционировать прямым или опосредованным способом. Например, агонист может функционировать, чтобы частично или полностью усиливать, стимулировать или активировать одну или более биологических активностей DR4 или DR5, in vitro, in situ или in vivo в результате его прямого связывания с DR4 или DR5, которое вызывает активация рецептора или сигнальная трансдукция. Агонист может также функционировать опосредованно, чтобы частично или полностью усилить, стимулировать или активировать одну или более биологических активностей DR4 или DR5, in vitro, in situ или in vivo в результате, например, стимуляции другой эффекторной молекулы, которая затем вызывает активацию DR4 или DR5 или сигнальную трансдукцию. Предполагается, что агонист может действовать в качестве энхансерной молекулы, которая функционирует опосредованно, чтобы усилить или увеличить активацию DR4 или DR5, или активность. Например, агонист может увеличить активность эндогенного Apo-2L у млекопитающего. Это может быть осуществлено, например, DR4 или DR5 до комплексообразования или стабилизирующими комплексами соответствующего лиганда с рецептором DR4 или DR5 (такие как стабилизирующий нативный комплекс, образованный между Apo-2L и DR4 или DR5).

Термин "биомаркер", как использовано в настоящей заявке, как правило, относится к молекуле, включающей ген, белок, углеводородную структуру или гликолипид, экспрессию которого внутри или в ткани, или клетке млекопитающего можно определить стандартными способами (или способами, раскрытыми в данном описании) и прогнозировать чувствительность к антителу Apo2L/TRAIL или рецептора смерти для клеток или тканей млекопитающих. Такие биомаркеры, предполагаемые настоящим изобретением, включают, но ими не ограничиваются "(1,3/1,4) фукозилтрансферазу" или "FUT3", "альфа (1,3) фукозилтрансферазу" или "FUT6", " сиалил-Льюис A" и " сиалил-Льюис X". Необязательно определяют экспрессию такого биомаркера, которая выше, чем экспрессия, измеренная для контрольного образца ткани или клетки. Необязательно, например, будут определять экспрессию такого биомаркера в PCR или FACS анализом, которая, по крайней мере, 50-кратно или, предпочтительно, по крайней мере, 100-кратно выше в испытываемом образце ткани или клетки, чем измеренная для контрольного образца ткани или клетки. Необязательно будут определять экспрессию такого биомаркера в IHC анализе для оценки по крайней мере 2 или выше для интенсивности окраски.

Термины "(1,3/1,4) фукозилтрансфераза" или "FUT3" используют в данном описании для ссылки на молекулу, обладающую структурными отличительными признаками, как раскрыто в данном описании, и, необязательно, катализирующую перемещение остатка фукозы от субстрата-донора, GDP-фукозы, к субстрату-акцептору в α3- или α4- связи с GlcNAc (FUTs III-VII и IX). Последовательности ДНК и аминокислотные последовательности для FUT3 человека представлены на фиг.4. Эти последовательности соответствуют инвентарному номеру HSU27328 GenBank и описаны, например, в Kukowska-Latallo et al., Genes Dev. 1990 Aug;4(8):1288-303. Как правило, FUTs представляют собой трансмембранные гликопротеины II типа, находящихся в Гольджи vaccules, и общепризнанно состоящие из N-терминального внутриклеточного концевого сегмента, мембрано-связанной области и каталитического домена, ориентированного lumenally в комплексе Гольджи. Между мембрано-связанной областью и каталитическим доменом существует область, названная стволовой (Paulson и Colley, J. Biol. Chem., 264:17615-17618 (1989)).

Термин "альфа (1,3) фукозилтрансфераза" или "FUT6" используют в данном описании для ссылки на молекулу, которая структурно относится, например, к ДНК последовательности и аминокислотной последовательности для FUT6 человека, представленных на фиг.5. Эти последовательности относятся к инвентарному номеру HSU27333 GenBank и описаны, например, в Koszdin и Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 1992 Aug 31;187(1):152-7. Общепринято, FUT 6 экспрессируется в эпителиальных клетках и в печени, почках, и желудочно-кишечных тканях, особенно желудка, тонкой кишки и толстой кишки (и общепринято минимально экспрессированы в селезенке, легком и шейке матки). Общепринято, FUT 6 не определяется в мозге, коре надпочечников или лейкоцитах периферической крови.

Термин " сиалил-Льюис A" используют в данном описании для ссылки на углеводную структуру тетрасахарида или антиген, содержащий следующую последовательность или структуру, которая может быть мембрано-связанной или в растворимой форме, циркулирующую, например, в сыворотке:

NeuAcα2-->3Galβ1-->3[Fucα1-->4]GlcNAcβ1-->R (NeuAcalpha2-->3Galbeta1-->3(Fucalpha1-->4)GlcNAcbeta1-->R)

Термин "сиалил-Льюис X" используют в данном описании для ссылки на углеводную структуру тетрасахарида или антиген, содержащий следующую последовательность или структуру, которая может быть мембрано-связанной или в растворимой форме, циркулирующую, например, в сыворотке:

NeuAcα2-->3Galβ1-->4[Fucα1-->3]GlcNAcβ1-->R (NeuAcalpha2-->3Galbeta1-->4(Fucalpha1-->3)GlcNAcbeta1-->R)

Под терминами "объект" или "пациент" подразумевают один какой-либо объект, которому требуется терапия, включая людей, крупный рогатый скот, собак, морских свинок, кроликов, кур, насекомых и тому подобное. Также предполагаемые для включения в качестве объекта представляют собой какие-либо объекты, участвующие в клинических обследованиях, исследования, не показавшие никаких клинических признаков болезни, или объекты, участвующие в эпидемиологических исследованиях, или объекты, использованные в качестве контролей.

Термин "млекопитающее", как использовано в данном описании, относится к какому-либо млекопитающему, классифицированного как млекопитающее, включая людей, коров, лошадей, собак и кошек. В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее - человек.

Под терминами "образец ткани или клеток" подразумевают коллекцию аналогичных клеток, полученных из ткани объекта или пациента. Источник образца ткани или клеток может быть твердой тканью, как, например, из свежего, замороженного и/или консервированного образца органа или ткани, или биопсии, или аспирационного биоптата; кровью или какими-нибудь компонентами крови; жидкостями тела, такими как спинномозговая жидкость, околоплодная жидкость, жидкость брюшной полости или интерстициальная жидкость; клетки любой длительности периода беременности или развития объекта. Образец ткани также может быть первичным или культивируемыми клетками, или клеточными линиями. Необязательно образец ткани или клетки получают из первичной или метастатической опухоли. Образец ткани может содержать соединения, которые не являются естественно-смешанными с тканью в природе, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксирующие вещества, питательные вещества, антибиотики или подобные им.

Для указанных целей данного описания термин "срез" образца ткани подразумевает одну часть или кусок образца ткани, например, тонкий слой ткани или клеток, вырезанный из образца ткани. Следует понимать, что можно взять множественные срезы образцов тканей и подвергнуть исследованию согласно настоящему изобретению, предполагают, что следует понимать, что настоящее изобретение включает способ, тем самым один и тот же срез образца ткани исследуют как на морфологических, так и на молекулярных уровнях, или исследуют относительно как белка, так и нуклеиновой кислоты.

Под терминами "коррелировать" или "корреляция" подразумевают сравнение, во всяком случае, характеристик и/или результатов первого анализа или протокола. Например, можно использовать результаты первого анализа или протокола в выполнении второго протокола и/или можно использовать результаты первого анализа или протокола для определения, следует ли производить второй анализ или протокол. Относительно варианта осуществления иммуногистохимического анализа или протокола можно использовать результаты IHC для определения, следует ли производить специальную схему лечения.

Под термином "нуклеиновая кислота" подразумевают включение какой-либо ДНК или РНК. Например, хромосомная, митохондриальная, вирусная и/или бактериальная нуклеиновая кислота представлена в образце ткани. Термин "нуклеиновая кислота" включает любую из двух или обе вместе цепи двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты и включает какой-либо фрагмент или участок интактной молекулы нуклеиновой кислоты.

Под термином "ген" подразумевают любую последовательность нуклеиновой кислоты или их участок с функциональным значением в кодировании и транскрипции белка или регуляции экспрессии другого гена. Ген может состоять из всех нуклеиновых кислот, ответственных за кодирование функционального белка, или только участка нуклеиновой кислоты, ответственного за кодирование или экспрессию белка. Последовательность нуклеиновой кислоты может содержать генетические нарушения в экзонах, интронах, инициаторных или терминаторных областях, промотерных последовательностях, других регуляторных последовательностях или уникальных смежных областях гена.

Слово "метка" при использовании в данном описании относится к соединению или смеси, которые конъюгируют или сливаются прямо или опосредованно с исходным реагентом, таким как зонд для нуклеиновой кислоты или антитело, и способствует определению реагента, с которым конъюгируют или сливаются. Метка может себя обнаруживать (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, может катализировать химическую перестройку соединения субстрата или смеси, которая обнаруживается.

Термин "антитело" в данном описании используют в широком смысле и специфически распространяется на интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные, по крайней мере, из двух интактных антител, и фрагменты антител, поскольку они проявляют желательную биологическую активность.

Термин "фрагменты антитела" включает участок интактного антитела, предпочтительно включающие их антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты; димеры; линейные антитела; молекулы одноцепочечного антитела; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Термин "нативные антитела", как правило, представляет собой гетеротетрамерные гликопротеины примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей отличается среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также содержит правильно расположенные внутрицепные дисульфидные связи. Каждая тяжелая цепь содержит на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует несколько константных доменов. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен на одном конце (V_L) и константный домен на ее другом конце; константный домен легкой цепи смыкается с первым константным доменом тяжелой цепи, и легкоцепочечный вариабельный домен смыкается с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что отдельные аминокислотные остатки образуют область контакта между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин "вариабельный" относится к факту, что некоторые участки вариабельных доменов сильно отличаются в последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности каждого отдельного антитела для его отдельного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена по всем вариабельным доменам антител. Она сосредоточена в трех сегментах, названных гипервариабельными или определяющими комплементарность областями в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высоко консервативные участки вариабельных доменов называются скелетными областями (FRs). Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей каждый включает четыре FRs, широко принимает конфигурацию β-sheet, соединенную тремя гипервариабельными областями, которые образуют соединяющие петли, и в ряде случаев образующие часть, структуру β-sheet. Гипервариабельные области в каждой цепи скреплены в непосредственной близости FRs и, с гипервариабельной областью другой цепи, способствуют образованию антиген-связывающего участка антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не вовлекаются непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).

Расщепление антител папаином образовывает два идентичных антиген-связывающих фрагмента, названных "Fab" фрагментами, каждый с одним антиген-связывающим участком, и оставшийся "Fc" фрагмент, чье название отражает его способность легко кристаллизоваться. Лечение пепсином образовывает F(ab')₂ фрагмент, который содержит два антиген-связывающих участка и все еще способен к перекрестному связыванию антигена.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий участок. Эта область состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в прочной, нековалентной связи. Она существует в этой конфигурации, в которой три гипервариабельные области каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антиген-связывающего участка на поверхности V_H-V_L димера. В совокупности шесть гипервариабельных областей придают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащего только три специфичных для антигена гипервариабельных области) обладают способностью узнавать и связывать антиген, даже при более низком сродстве, чем у целого участка связывания. Fab фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов прибавлением нескольких остатков на карбокси-конце тяжелой цепи CH1 домена, включающих в себя один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH представляет собой обозначение в данном описании для Fab', в котором цистеиновый остаток(ки) константных доменов связывает, по крайней мере, одну свободную тиольную группу. F(ab')₂ фрагменты антитела первоначально изготавливались как пары Fab' фрагментов, между которыми находятся шарнирные цистеины. Также известны другие химические соединения фрагментов антитела.

Термин "легкие цепи" антител (иммуноглобулины) из любых видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко выраженных типов, названных каппа (κ) и лямбда (λ), основанных на аминокислотных последовательностях их константных доменов.

В зависимости от аминокислотных последовательностей константного домена их тяжелых цепей антитела могут быть отнесены к различным классам. Существует пять классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них далее могут быть разделены на субклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Тяжелая цепь константных доменов, которая соответствует различным классам антител, называется α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Структуры субъединицы и пространственные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Термины "одноцепочечная Fv" или "scFv" фрагментов антитела включают в себя V_H и V_L домены антитела, где эти домены представлены простой полипептидной цепью. Предпочтительно Fv полипептид далее включает полипептидный линкер между V_H и V_L доменами, которые дают возможность scFv образовать желательную структуру для связывания антигена. Для обзора scFv см. Plϋckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин "димерные антитела" относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антиген-связывающими участками, фрагменты которых содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в аналогичной полипептидной цепи (V_H - V_L). Путем использования линкера, который слишком короткий для осуществления спаривания между двумя доменами в аналогичной цепи, домены вынуждены соединяться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антиген-связывающих участка. Димерные антитела более подробно описаны в, например, патенте EP 404097; патенте WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Термин "моноклональное антитело", как использовано в данном описании, относится к антителу, полученного из популяции гомологичных в большой степени антител, то есть отдельные антитела, включающие популяцию, являются идентичными, если бы не вероятные встречающиеся в природе мутации, которые могут быть представлены в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против одного антигенного участка. Кроме того, в отличие от общепринятых способов получения (поликлонального) антитела, в которые общепринято включать различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопы), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. В дополнение к их специфичности моноклональные антитела эффективны в том, что они синтезируются гибридомной культурой, не содержащей других иммуноглобулинов. Модификатор "моноклональный" указывает на характер антитела, как на полученный из гомологичной в большой степени популяции антител, и не следует считать, что каким-нибудь конкретным способом объясняется желательное получение антитела. Например, для использования в соответствии с настоящим изобретением моноклональные антитела могут получать гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут получать способами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США No. 4816567). "Моноклональные антитела" также можно выделить из библиотек антител вирусных фагов с использованием способов, описанных в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. MoI. Biol., 222:581-597 (1991), например.

Моноклональные антитела в данном описании специфически включают в себя "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых участок тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученным из конкретных видов, или принадлежащим к конкретному классу или субклассу антителу, хотя оставшаяся цепь(и) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных из других видов, или принадлежащим к другому классу или субклассу антителу, а также фрагменты таких антител, поскольку они проявляют желаемую биологическую активность (патент США No. 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес, в данном описании включают "приматизированные (относящиеся к приматам)" антитела, содержащие антиген-связывающую последовательность вариабельного домена, полученного из нечеловеческого примата (например, обезьяна Старого света, такая как бабуин, резус-макак или макак-крабоед) и последовательности константной области человека (патент США No. 5693780).

Термин "гуманизированные" формы не относящихся к человеку (например, крысиные) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из не относящегося к человеку иммуноглобулина. Главным образом гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиент-антитело), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменяются остатками гипервариабельной области не относящихся к человеку видов (донор-антитело), таких как мышь, крыса, кролик или не относящийся к человеку примат, обладающих желательной специфичностью, сродством и способностью. В ряде случаев скелетная область (FR) остатков иммуноглобулина человека замещается соответствующими не относящимися к человеку остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в реципиенте-антителе или доноре-антителе. Эти модификации проводятся для дальнейшего улучшения качества антитела. Обычно гуманизированное антитело будет содержать в основном все из по крайней мере одного, и общепринято два, вариабельных домена, в которых все или в основном все из гипервариабельных петель, относящихся к такому не относящимся к человеку иммуноглобулину и все или в основном все из FRs представляют собой такие последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать, по крайней мере, участок константной области (Fc) иммуноглобулина, общепринято, что иммуноглобулина человека. Для получения более подробной информации см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Термин "гипервариабельная область" при использовании в данном описании относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из "комплементарной детерминированной области" или "CDR" (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Последовательности of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или такие остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia и Lesk J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)). "Скелетные" или "FR" остатки представляют собой те остатки вариабельного домена другие, чем остатки гипервариабельной области, как определено в данном описании.

Антитело "которое связывает" интересующий антиген, представляет собой антитело, способное связать этот антиген с достаточным сродством и/или авидностью, так что антитело используется в качестве терапевтического или диагностического средства, направленного на экспрессирующую антиген клетку.

Для целей данного описания "иммунотерапия" будет отнесена к способу лечения млекопитающего (предпочтительно больного человека) антителом, в данном описании антитело может быть неконъюгированным или "незащищенным" антителом, или антитело может быть конъюгированным или слитым с гетерологичной молекулой(ми) или веществом(ами), таким как один или больше цитотоксический агент(ы), таким образом образующие "иммуноконъюгат".

Термин "выделенное" антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделены и/или восстановлены от компонентов их естественной среды. Загрязняющие компоненты их естественной среды представляют собой вещества, которые, вероятно, препятствуют диагностическим и терапевтическим использованиям антагониста или антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до более чем 95% по весу антитела, как установили способом Лоури, и наиболее предпочтительно более чем 99% по весу, (2) до некоторой степени достаточного для получения по крайней мере 15 остатков N-терминальной или внутренней аминокислотной последовательности с применением spinning cup sequenator, или (3) для однородности путем SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях, с использованием кумасси синего или, предпочтительно, серебряного окрашивания. Выделенное антитело включает антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, поскольку, по крайней мере, один компонент естественного окружения антитела не будет присутствовать. Как правило, однако, выделенное антитело будет получено, по крайней мере, в одной стадии очистки.

Экспрессия "эффективного количества" относится к количеству вещества (например, антитело Apo2L/TRAIL, анти-DR4 или DR5 и так далее), которое эффективно для профилактики, улучшения или лечения болезни или изучаемого состояния.

Термины "обработка", "лечение" и "терапия", как использовано в данном описании, относится к лекарственной терапии, профилактической терапии и предупредительной терапии. Последовательное лечение или введение относится к лечению, по крайней мере, исходя из текущих потребностей беспрерывного стационарного лечения один или несколько дней.

Прерывистое лечение или применение, или лечение, или применение в прерывистом виде, относится к лечению, которое не последовательное, но точнее цикличное по характеру.

Термин "цитокин" представляет собой родовое понятие для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые действуют на другие клетки в качестве внутриклеточных посредников. Примеры таких цитокинов представляют собой лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. Включенные в число цитокинов представляют собой гормон роста, такой как гормон роста человека, N-метионил гормон роста человека, и гормон роста крупного рогатого скота; гормон околощитовидной железы; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреотропный гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста печени; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухоли α и β; мюллерова ингибирующая субстанция; мышиный гонадотропин-ассоциированный белок; ингибин; активин, фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α and TGF-β; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуцируемые факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β, и -γ; колониестимулирующие факторы (CSF) такие как макрофаг-CSF (M-CSF); гранулоцит-макрофаг-CSF (GM-CSF), и гранулоцит-CSF (G-CSF); интерлейкины (ILs) такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17; и другие полипептидные факторы, включая LIF и кит-лиганд (KL). Как использовано в данном описании, термин цитокин включает белки из естественных источников или из рекомбинантной клеточной культуры и биологически активных аналогов нативной последовательности цитокинов.

Термин "цитотоксическое средство", как использовано в данном описании, относится к веществу, которое препятствует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Термин предполагает включение в себя радиоактивных изотопов (например, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ и Re¹⁸⁶), химиотерапевтических веществ и токсинов, таких как ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или их фрагменты.

Термин "химиотерапевтическое вещество" представляет собой химическое соединение, эффективное при лечении рака. Примеры химиотерапевтических веществ включают алкилирующие вещества, такие как тиотепа и циклосфосфамид (CYTOXAN^TM); алкил сульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквин, метуредопа, и уредопа; этиленимины и метиламеламины включают алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентрифосфорамид и триметилолмеламин, ацетогенины (главным образом биллатакцин и биллатацинон); камптотецин (включающий синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включающий его адозелесин, карзелесин и бизелесин синтетические аналоги); криптофицины (по отдельности криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включающий синтетические аналоги, KW-2189 и CBI-TMI); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлоэтамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил горчичный; нитрозомочевины такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как енедииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма 1I и калихеамицин фи I1, см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); динемицин, включающий динемицин A; бифосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; так же как и неокарзиностатин хромофор и родственные хромопротеиновые хромофоры энедииновых антибиотиков), аклациномицины, актиномецин, аутрамицин, азасерин, блеомецины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (адриамицин^TM) (включающий морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пироллино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эсорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберсидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, анти-метаболиты, такие как метотрексат и 5-флуороурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как, деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат, пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пуримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксиридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; анти-адреналовые вещества, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; фолиевая кислота подкрепляющая, такая как фролиновая кислота; ацеглатон; аледофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; енилурацил; амсакрин, бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, элфорнитин; ацетат элиптиния, эпотилон, этоглюцид; нитрат галия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин, майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины, митогуазон, митоксантрон, мопидамол; нитракрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лосоксантрон; подофилининовая кислота; 2-этилгидразид, прокарбазин; PSK^®; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий, тениазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлоротриэтиламин; трихотецены (особенно T-2 токсин, веракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман, гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел (TAXOL^®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) и доксетаксел (TAXOTERE^®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин (Gemzar^TM); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; платиновые аналоги, такие как цисплатина и карбоплатина; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид, митоксантрон; винкристин; винорелбин (Navelbine^TM); новантрон; тенипозид; эдатрексат, дауномицин; амиптерин; кселода; ибандронат, CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды такие как ретиноевая кислота; капецитабин - и фармацефтически подходящие соли, кислоты или производные любого из рассмотренного выше.

Также включенные в это определение представляют собой антигормональные препараты, которые регулируют или подавляют действие гормона на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (SERMs), включающие, например, тамоксифен (включая Nolvadex^TM), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Fareston^TM); ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, которая регулирует выработку эстрогенов в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, мегестрол ацетат (Megace^TM), ексеместан, форместан, фадрозол, ворозол (Rivisor^TM), летрозол (Femara^TM) и анастрозол (Arimidex^TM); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых вышеупомянутых.

Термин "ингибитор роста" при использовании в данном описании относится к соединению или композиции, которое подавляет рост клетки, особенно раковой клетки, гиперэкспрессирующей какие-либо гены, идентифицированные в данном описании, или in vitro, или in vivo. Таким образом, ингибитор роста представляет собой вещество, которое в значительной степени уменьшает процент клеток, гиперэкспрессирующих такие гены в S-фазе. Примеры ингибиторов роста включают вещества, которые блокируют движение клеточного цикла (в месте кроме S-фазы), такие как вещества, которые вызывают задержку G1 и задержку M-фазы. Классические блокаторы M-фазы включают барвинок (винкристин и винбластин), таксол и топо-II ингибиторы, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те вещества, которые задерживают Gl, также сопутствуют задержке в S-фазе, например, ДНК алкилирующие средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дальнейшую информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., гл.1, озаглавленная "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), в частности p.13.

Термины "апоптоз" и "апоптотическая активность" используют в широком смысле и относят к планомерной или контролируемой форме клеточной смерти у млекопитающих, которая общепринято сопровождается одним или несколькими характерными клеточными изменениями, включая конденсацию цитоплазмы, утрачивание микроворсинок плазматической мембраны, сегментацию ядра, разрушение хромосомной ДНК или утрачивание митохондриальной функции. Эта активность может быть определена и измерена, например, анализами жизнеспособности клеток (такими как, анализы Аламар синим или MTT анализы), FACS, анализом, активацией каспаз, фрагментацией ДНК (см., например, Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139:271-279 (1991), и анализы расщепления поли-ADP рибоза полимеразы, "PARP", известные специалисту в данной области.

Как использовано в данном описании, термин "нарушение", как правило, относится к каким-либо состояниям, при которых, вероятно, пользовались лечением с составами, описанных в данном описании, включая любые заболевания или нарушения, которые могли лечиться эффективными количествами Apo2L/TRAIL, анти-DR4 антитела и/или анти-DR5 антитела. Он включает хронические и острые нарушения, а также и те патологические состояния, к которым предрасположены млекопитающее с изучаемым нарушением. Неограниченные примеры нарушений, которые лечат в данном описании, включают: доброкачественные и злокачественные опухоли; воспалительные, ангиогенные и иммунологические нарушения, аутоиммунные нарушения, артриты (включая ревматоидный артрит), рассеянный склероз и ВИЧ/СПИД.

Термины "рак", "раковый" или "злокачественный" относятся к или описаны физиологическим состоянием млекопитающих, которые общепринято характеризуются нерегулируемым клеточным ростом. Примеры рака включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, лейкоз, бластому и саркому. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают плоскоклеточный рак, миеломную болезнь, мелкоклеточный рак легких, глиому, рак желудочно-кишечного тракта, ренальный рак, рак яичников, рак печени, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, колоректальный рак, рак эндометрия, рак почки, рак простаты, рак щитовидной железы, нейробластому, рак поджелудочной железы, полиморфную глиобластому, рак шейки матки, рак мозга, рак желудка, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак кишки и рак головы и шеи.

Термин "иммуносвязанное заболевание" означает заболевание, при котором компонент иммунной системы млекопитающего вызывает, опосредует или иным образом в распространении болезни у млекопитающего. Включенные также представляют собой болезни, в которых стимуляция или вмешательство иммунного ответа оказывает благоприятный эффект на прогрессирование болезни. Включенные в этот термин представляют собой аутоиммунные заболевания, иммуно-опосредованные воспалительные заболевания, неиммунные опосредованные воспалительные заболевания, инфекционные заболевания и иммунодефицитные заболевания. Примеры иммуносвязанных и воспалительных заболеваний, некоторые из которых являются иммунными или опосредованными T-клетками, которые можно лечить, согласно изобретению включают системную красную волчанку, ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, спондилоартропатии, системный склероз (склеродермия), идиопатические воспалительные миопатии (дерматомиозит, полимиозит), синдром Шегрена, системный васкулит, саркоидоз, аутоиммунная гемолитическая анемия (иммунная панцитопения, параксизмальная ночная гемоглобинурия), аутоиммунная тромбоцитопения (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, иммуно-опосредованная тромбоцитопения), тиреоидит (диффузный токсический зоб, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит, атрофический тиреоидит), сахарный диабет, иммуно-опосредованная почечная болезнь (гломерулонефрит, тубулоинтерстициальный нефрит), демиелинизирующие болезни центральной и периферической нервной системы, такие как рассеянный склероз, идиопатическая демиелинизирующая полиневропатия или синдром Гийена-Барра, и хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, гепатобилиарные заболевания, такие как инфекционные гепатиты (гепатиты A, B, C, D, E и другие негепатотропные вирусы), аутоиммунный хронический активный гепатит, первичный биллиарный цирроз, гранулематозный гепатит и склерозирующий холангит, воспалительные и фиброзные легочные заболевания, такие как воспалительная болезнь кишечника (неспецифический язвенный колит: болезнь Крона), глютен-зависимая энтеропатия и болезнь Уиппла, аутоиммунные или иммуно-опосредованные кожные заболевания, включающие буллезные кожные заболевания, полиморфную эритему и контактный дерматит, псориаз, аллергические заболевания такие как астма, аллергический ринит, атопический дерматит, пищевая аллергия и крапивница, иммунологические заболевания легкого, такие как эозинофильная пневмония, идиопатический пульмональный фиброз и гиперчувствительный пневмонит, заболевания, связанные с трансплантацией, включающие отторжение трансплантата и реакция трансплантат против хозяина. Инфекционные заболевания включают в себя СПИД (ВИЧ-инфекция), гепатит A, B, C, D и E, бактериальные инфекции, грибковые инфекции, протозойные инфекции и паразитарные инфекции.

Термин "аутоиммунное заболевание" используют в данном описании в широком, общем смысле для ссылки на расстройства или состояния у млекопитающих, при которых разрушение нормальной или здоровой ткани является результатом гуморальных или клеточных иммунных ответов отдельного млекопитающего на его или ее собственные тканевые компоненты. Примеры включают, но ими не ограничиваются, красную волчанку, тиреоидит, ревматоидный артрит, псориаз, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет и воспалительную болезнь кишечника (IBD).

Термин "меченый" при использовании в данном описании относится к химерной молекуле, включающей антитело или полипептид, слившиеся в "меченый полипептид". Меченый полипептид содержит достаточно остатков для обеспечения эпитопа, против которого может вырабатываться антитело, или для обеспечения других функций, таких как способность олигомеризоваться (например, как происходит с белками, содержащими домены с лейциновыми застежками), однако существует краткосрочное достаточное количество, такое что, как правило, не препятствует активности антитела или полипептида. Меченый полипептид предпочтительно также достаточно уникален, чтобы метка-специфическое антитело в основном не давало перекрестной реакции с другими эпитопами. Подходящие меченые полипептиды, как правило, содержат, по крайней мере, шесть аминокислотных остатков и, как правило, между от примерно 8 до примерно 50 аминокислотных остатков (предпочтительно, от примерно 10 до примерно 20 остатков).

Термин "двухвалентный ион металла" относится к иону металла, обладающего двумя положительными зарядами. Примеры двухвалентных ионов металлов включают в себя, но не ограничиваются ими, цинк, кобальт, кадмий, магний и марганец. Конкретные формы таких металлов, которые могут использоваться, включают в себя солевые формы (например, фармацевтически приемлимые солевые формы), такие как формы хлорида, ацетата, карбоната, цитрата и сульфата вышеупомянутых двухвалентных ионов металлов. Необязательно, двухвалентный ион металла для использования в настоящем изобретении представляет собой цинк, и предпочтительно, солевая форма, сульфат цинка или хлорид цинка.

Термин "выделенный", когда используют для описания различных пептидов и белков, описанных в данном описании, подразумевает пептид или белок, который был идентифицирован и выделен и/или восстановлен от компонентов его естественного окружения. Загрязняющие компоненты его естественного окружения представляют собой материалы, которые общепринято, вероятно, препятствуют диагностическим или терапевтическим использованиям пептида или белка, и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления пептид или белок будет очищаться (1) с высокой степенью, достаточной для получения по крайней мере 15 остатков N-терминальной или внутренней аминокислотной последовательности, с использованием spinning cup sequenator, или (2) для однородности, путем SDS-PAGE в не восстанавливающих или восстанавливающих условиях с использованием кумасси синего или, предпочтительно, серебряное окрашивание, или (3) для однородности путем способов масс-спектроскопии или пептидного картирования. Выделенный материал включает пептид или белок in situ в рекомбинантных клетках, поскольку, по крайней мере, один компонент его естественного окружения не будет присутствовать. Как правило, однако, выделенный пептид или белок будут получены, по крайней мере, в одной стадии очистки.

"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" в отношении последовательности, идентифицированной в данном описании, определяется как процент аминокислотных остатков в подходящей последовательности, которая идентична с аминокислотными остатками в исходной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесенных разрывов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не принимая во внимание какие-либо консервативные замены в рамках идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотной последовательности может достигаться различными путями, которые находятся в пределах специалиста в данной области, можно определить подходящими параметрами для измерения выравнивания, включающего заданные алгоритмы, нужные для достижения максимального выравнивания последовательностей полной длины последовательности, которые сравниваются. Для целей данного описания процент значений аминокислотной идентичности может быть получен с использованием компьютерной программы сравнения последовательности, ALIGN-2, которая была разработана Genentech, Inc. исходная программа, которая была представлена документацией использования в US Copyright Office, Washington, DC, 20559, зарегистрированная под US Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 находится в открытом доступе посредством Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Все параметры сравнения устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются.

"Жесткость" реакций гибридизации легко поддается определению одним средним специалистом в данной области и, как правило, представляет собой эмпирическое вычисление, зависящего от длины образца, температуры промывания и концентрации соли. Как правило, более длинные образцы требуют более высоких температур для надлежащей ренатурации, тогда как более короткие образцы нуждаются в более низких температурах. Гибридизация, как правило, зависит от способности денатурированной ДНК к ренатурации, когда комплементарные нити присутствуют в окружении ниже своей температуры плавления. Более высокая степень желательной идентичности между образцом и гибридизуемой последовательностью, более высокой температурой плавления, которая может использоваться. Как результат, из этого следует, что более высокие температуры плавления, вероятно, имеют тенденцию создавать более жесткие условия реакции, тогда как более низкие температуры - более слабые. Дополнительные детали и объяснение жесткости реакций гибридизации см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Состояния высокой жесткости", как определено в данном описании, идентифицируется теми, которые: (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру для промывания; 0,015 М хлорид натрия/0,0015 М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°C; (2) используют во время гибридизации денатурирующий агент; 50% (v/v) формамид с 0,1% бычий сывороточный альбумин/0,1% фиколл/0,1% поливинилпирролидон/50 мМ натриево-фосфатный буфер при pH 6,5 с 750 мМ хлорид натрия, 75 мМ цитрат натрия при 42°C; или (3) используют 50% формамид, 5 x SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 x раствор Денхардта, ДНК из молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42°C, с промыванием при 42°C в 0,2 x SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамид при 55°C, с последующим высоко-жестким промыванием, состоящим из 0,1 x SSC, содержащего EDTA при 55°C.

"Сравнительно жесткие условия" можно идентифицировать, как описано Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, и включает ночную инкубацию при 37°C в растворе, содержащим: 20% формамид, 5 x SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатриевый цитрат), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5 x раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной резаной ДНК из молок лососевых, с последующим промыванием фильтров в 1 x SSC при примерно 37-50°C. Опытный специалист определит, как установить температуру, ионную силу и так далее, как необходимо для приспособления факторов, таких как длина образца и подобные им.

Термин "праймер" или " праймеры" относится к олигонуклеотидной последовательности, которая гибридизуется к комплементарной РНК или ДНК полинуклеотида-мишени и в качестве исходных точек для ступенчатого синтеза полинуклеотида из мононуклеотидов под действием нуклеотидилтрансферазы, как происходит, например, в полимеразной цепной реакции.

Термин "контрольные последовательности" относится к последовательности ДНК, необходимой для экспрессии фукционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Подходящие для прокариот контрольные последовательности, например, включают в себя промотер, необязательно операторную последовательность и участок связывания рибосом. Известно, что в эукариотических клетках используются промотеры, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", если находится в функциональной зависимости с другой последовательностью нуклеиновых кислот. Например, ДНК предпоследовательности или выделенной лидерной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в качестве предбелка, который участвует в выделении полипептида; промотер или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если действует на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательность, если он размещен с тем, чтобы способствовать трансляции. Как правило, термин "функционально связанный" означает, что ДНК последовательности, будучи связанными, контактируют, и, в случае выделенной лидерной последовательности, контактирующие и в стадии считывания. Однако энхансеры не должны быть контактирующими. Связывание осуществляется путем сшивания в подходящих участках рестрикции. Если таких участков нет, то синтетические олигонуклеотидные адапторы и линкеры используются в соответствии с состоянием техники.

"Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "ADCC" относятся к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc рецепторы (FcRs) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), узнают связанное на клетке-мишени и в дальнейшем вызывают разрушение клетки-мишени. Главные клетки для опосредования ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессии FcR в гемопоэтических клетках суммарно представлены таблицей 3 на странице 464 Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для определения активности ADCC интересующей молекулы, в in vitro ADCC анализе, такие как описанные в патенте США № 5500362 или 5821337, можно выполнять. Пригодные эффекторные клетки для таких анализов включают в себя мононуклеары периферической крови (PBMC) и естественные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно ADCC активность интересующей молекулы может оцениваться in vivo, например, на животной модели, такой как описанные Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcRs и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют по крайней мере FcγRIII и выполняют ADCC эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеары периферической крови (PBMC), естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические T клетки и нейтрофилы; будучи предпочтительным с PBMCs и NK-клетками.

Термины "Fc-рецептор" или "FcR" используются для описания рецептора, который связывает Fc-область антитела. Предпочтительный FcR представляет собой нативную последовательность человеческого FcR. Кроме того, предпочтительный FcR представляет собой рецептор, который связывает IgG антитело (гамма-рецептор) и включает субклассы рецепторов FcγRI, FcγRII и FсγRIII, включающие аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. FcγRII рецепторы включают в себя FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые содержат аминокислотные последовательности, которые главным образом отличаются в их цитоплазматических доменах. Активация рецептора FcγRIIA включает тирозин-основанный активационный мотив иммунорецептора (ITAM) в их цитоплазматическом домене. Ингибирование рецептора FcγRIIB включает tyrosine-based inhibition motif иммунорецептора (ITIM) в их цитоплазматическом домене, (см. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs изложены в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). В данном описании термин "FcR" включает другие FcR, в том числе те, которые будут выявлены в будущем. Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). В данном описании FcR включают в себя полиморфизмы, такие как генетический диморфизм в гене, который кодирует FcγRIIIa, приводящий либо к фенилаланину (F), либо валину (V) в аминокислотном положении 158, локализованной в области рецептора, которая связывает IgG1. Было показано, что гомозиготный валин FcγRIIIa (FcγRIIIa-158V) обладает более высоким сродством к человеческому IgG1 и опосредует увеличенную ADCC in vitro относительно гомозиготного фенилаланина FcγRIIIa (FcγRIIIa-158F) или гетерозиготными (FcγRIIIa-158F/V) рецепторами.

Термин "комплемент зависимая цитотоксичность" или "CDC" относится к способности молекулы разрушать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антитело), связанной с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента, может проводиться CDC анализ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

II. Общепринятые способы и материалы изобретения

Способы и анализы, раскрытые в данном описании, направлены на исследование экспрессии одного или нескольких биомаркеров в образце ткани или клетки млекопитающего, в данном описании определение этой экспрессии одного или нескольких таких биомаркеров прогнозируется или указывает на то, будет ли образец ткани и клетки чувствителен к апоптоз-индуцирующим веществам, таким как агонистам-антителам Apo2L/TRAIL и анти-DR5. Способы и анализы включают в себя те, которые исследуют экспрессию биомаркеров, таких как некоторые фукозилтрансферазы, в частности фукозилтрансферазы 3 (FUT3) и/или фукозилтрансферазы 6 (FUT6), а также сиалил-Льюис A и/или X антигенов.

Как обсуждалось выше, существуют несколько популяций типов клеток больного человека (такие как некоторые популяции раковых клеток), которые устойчивы к индукции апоптоза. Вследствие этого полагают, что описанные способы и анализы могут обеспечивать подходящие, эффективные и потенциально экономически целесообразные, направленные на получение данных и информации, пригодные в оценке надлежащих или эффективных вариантов терапии для лечения больных. Например, больной, которому был диагносцирован рак или иммунно-связанное состояние, мог бы сдать биопсию, проводившейся для получения образца ткани или клетки, и образец мог быть исследован посредством различных анализов in vitro для определения, действительно ли клетки больного будут чувствительны к таким терапевтическим веществам, как к антителу Apo2L/TRAIL или рецептора смерти.

Изобретение обеспечивает способы прогнозирования чувствительности образца ткани и клеток млекопитающего (такого как раковая клетка) к антитело-агонисту Apo2L/TRAIL или рецептора смерти. В способах получают образец ткани и клеток млекопитающего и исследуют экспрессию одного или нескольких биомаркеров. Способы могут проводиться в различных форматах анализа, включая анализы определения экспрессии мРНК, ферментные анализы определения присутствия ферментной активности и иммуногистохимические анализы. Определение экспрессии таких биомаркеров в вышеупомянутых тканях или клетках будет предсказывать, что такие ткани или клетки будут чувствительны к апоптоз-индуцируещей активности антитела Apo2L/TRAIL и/или рецептора смерти. Поразительно, заявители обнаружили, что экспрессия таких конкретных биомаркеров коррелирует с чувствительностью таких тканей и клеток к апоптоз-индуцирующим веществам, таким как агонисты-антитела Apo2L/TRAIL и рецептора смерти.

Как рассмотрено ниже, экспрессию различных биомаркеров в образце можно анализировать рядом способов, многие из которых известны в данной области и понятны квалифицированному специалисту, включающих в себя, но ими не ограничиваясь, иммуногистохимический и/или вестерн анализ, количественный анализ крови, анализы (как, например, сывороточная ELISA) (для исследования, например, уровней экспрессии белков), анализы биохимической ферментной активности, гибридизация in situ, Нозерн анализ и/или PCR анализ мРНК, и геномный Саузерн анализ (для исследования, например, генной делеции или амплификации), а также какого-либо одного из большого разнообразия анализов, которые могут проводится путем матричного анализа гена и/или ткани. Общепринятые протоколы для оценки статуса генов и продуктов гена найдены, например, в Ausubel et al. eds., 1995; Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Нозерн-блоттинг), 4 (Саузерн-блоттинг), 15 (Иммуноблоттинг) и 18 (PCR анализ). Протоколы ниже, относящиеся к определению конкретных биомаркеров, таких как фукозилтрансфераза 3 (FUT3), фукозилтрансфераза 6 (FUT6), сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X, в образце предоставлены ниже в целях иллюстрации.

*************************************

Дополнительные способы изобретения включают протоколы изучения или исследования присутствия сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X белков в образце ткани или клетки млекопитающего. Различные способы определения сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X-связанного белка могут применяться и включать, например, иммуногистохимический анализ, иммунопреципитацию, вестерн блот анализ, анализы молекулярного связывания, ELISA, ELIFA, флюоресцентно активированная сортировка клеток (FACS) и подобные им. Например, дополнительный способ определения экспрессии сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X-связанного белка в ткани или образце включает контакты образца с сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X антителами, сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X-реакционный фрагмент их, или рекомбинантный белок, содержащий антигенсвязывающий участок антитела сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X; и затем обнаруживающие связывание сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X-связанного белка в образце.

В конкретных вариантах осуществления экспрессия сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X белков в образце исследуется с использованием протоколов иммуногистохимии и окрашивания. Было показано, что иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани представляет собой надежный способ оценки или определения присутствия белков в образце. В иммуногистохимических ("IHC") способах используют антитела с зондом и визуализируют клеточные антигены in situ, как правило, это пигментообразующие или флюоресцентные способы.

Для приготовления образца, может быть использован образец ткани или клетки млекопитающего (как правило, больной человек). Примеры образцов включают в себя, но ими не ограничиваются, раковые клетки, такие как кишечника, молочной железы, простаты, яичников, легкого, желудка, поджелудочной железы, лимфомы, и лейкемических раковых клеток. Образец можно получить рядом способов, известных в данной области, включающих, но ими не ограничиваясь, хирургическое удаление, аспирацию или биопсию. Ткань может быть свежей или замороженной. В одном случае образец зафиксирован и вдавлен в парафин или подобное этому.

Ткань образца может быть зафиксирована (то есть сохраненная) общепринятым способом (см. например, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3^rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C). Специалист в данной области будет оценивать, что выбор фиксации определяется целью, ради которой образец подлежит гистологическому окрашиванию или иному анализу. Также специалист в данной области будет оценивать, что длина и фиксация зависят от размера образца ткани и использованного фиксатора. В качестве примера нейтральный буферный формалин, Bouin's или параформальдегид можно использовать при фиксации образца.

Как правило, образец сначала фиксируется и затем дегидрируется посредством возрастающего ряда из спиртов, пропитанных и залитых парафином или иным красящим раствором, так чтобы образец ткани можно было разрезать. Альтернативно можно разрезать ткань и фиксировать полученные срезы. В качестве примера образец ткани может быть залит и обработан парафином общепринятым способом (см. например, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", выше). Примеры парафина, которые можно использовать, включают в себя, но ими не ограничиваются, Paraplast, Broloid и Tissuemay. Один раз образец ткани заливают, образец может быть порезан на микротоме или подобным образом (см., например, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", выше). В качестве примера для этого способа толщина срезов может варьировать от 3 до 5 микрон. Однажды разрезанные срезы можно прикрепить на микроскопический препарат несколькими общепринятыми способами. Примеры клейкого вещества микроскопического препарата включают в себя, но ими не ограничиваются, силан, желатин, поли-L-лизин и подобные им. В качестве примера залитые парафином срезы могут быть закреплены положительно заряженными предметными стеклами и/или предметными стеклами, покрытыми поли-L-лизином.

Если парафин был использован как заливочный материал, срезы ткани, как правило, депарафинизируют и регидратируют водой. Срезы ткани можно депарафинизировать несколькими общепринятыми стандартными способами. Например, можно использовать диметилбензол и поэтапное удаление спирта (см., например, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", выше). Альтернативно можно использовать коммерчески доступные депарафинизирующие неорганические агенты, такие как Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas).

Необязательно вслед за препарированием образца срез ткани можно проанализировать с использованием IHC. IHC можно использовать в комбинации с дополнительными способами, такими как морфологическое окрашивание и/или флюоресцентная гибридизация in-situ. Доступны два общих способа IHC; прямой и непрямой анализы. Соответственно первый - связывание антитела с мишенью-антигеном (например, сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X) - представляет собой прямое определение. В этом прямом анализе используют меченые реагенты, такие как флюоресцентная метка или фермент-меченые первичные антитела, которые могут быть визуализированы без дальнейшего взаимодействия антител. В общепринятом непрямом анализе несвязанные первичные антитела связывают антиген, а затем меченые вторичные антитела связывают первичные антитела. Где вторичные антитела связываются с ферментативной меткой, хромогенный или флюоресцентный субстрат добавляют для обеспечения визуализации антигена. Усиление сигнала произойдет, так как некоторые вторичные антитела могут реагировать с другими эпитопами первичных антител.

Первичные и/или вторичные антитела, использованные для гистохимии, как правило, могут быть помечены с выявляемой половиной. Существуют многочисленные метки, которые, как правило, можно разделить на следующие категории:

(a) Радиоизотопы, такие как ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H и ¹³¹I. Антитела можно метить радиоизотопами с использованием способов, описанных в, например, Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991), и радиоактивность может измеряться с использованием сцинтилляционного измерения.

(b) Коллоидные золотые частицы.

(c) Флюоресцентные метки, включающие в себя, но ими не ограничиваясь, редкоземельные хелатные соединения (европиум хелатное соединение), Техас красный, родамин, флюоресцин, дансил, лизамин, умбеллиферон, фикокритерин, фикоцианин или коммерчески доступные флюорофоры, такие как SPECTRUM ORANGE7 и SPECTRUM GREEN7, и/или производные любого одного или нескольких вышеупомянутых. Флюоресцентные метки могут быть соединены с антителами, использующимися в способах, например, выявленных в Current Protocols in Immunology, выше. Флюоресценция может быть выражена количественно с помощью флюориметра.

(d) Существуют различные фермент-субстратные метки, и патент США No. 4275149 представляет обзор некоторых из них. Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного вещества, которое может измеряться с использованием различных способов. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое можно измерить спектрофотометрически. Альтернативно ферменты могут изменять флюоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Способы определения количественного изменения флюоресценции описаны выше. Хемилюминесценция субстрата превращает электронно возбужденную химическую реакцию и затем может излучать свет, который может быть измерен (с использованием хемилюминометра, например), или отдавать энергию флюоресцентному акцептору. Примеры ферментативных меток включают в себя люциферазы (например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза; патент США No. 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидазу хрена (HRPO), щелочную фосфотазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазу (например, глюкозооксидазу, галактозоксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказу и ксантиноксидазу), лактопероксидазу, микропероксидазу и подобные им. Способы связывания ферментов и антител описаны в O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981).

Примеры фермент-субстратных комбинаций включают в себя, например:

(i) пероксидаза хрена (HRPO) с перекисью водорода в качестве субстрата, где перекись водорода окисляет предшественник красителя (например, ортофенилдиамин (OPD) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидингидрохлорид (TMB));

(ii) щелочная фосфотаза (AP) с пара-нитрофенилфосфатом в качестве хромогенного вещества; и

(iii) β-D-галактозидаза (β-D-Gal) с хромогенным веществом (например, п-нитрофенил-β-D-галактозидаза) или флюорогенное вещество (например, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидаза).

Другие многочисленные фермент-субстратные комбинации имеются в распоряжении специалиста в данной области. Для общего обзора этого, см. патенты США No. 4275149 и 4318980. Иногда метка опосредованно соединяется с антителами. Квалифицированный младший специалист будет знать о различных способах достижения этого. Например, антитело может быть связано с биотином и любыми из четырех широких категорий из вышеуказанных меток, которые могут соединяться с авидином, или наоборот. Биотин выборочно связывается с авидином и поэтому метка может соединяться с антителами в этом непрямом способе. Альтернативно для достижения непрямого связывание метки с антителом антитело связывается с маленьким гаптеном, и одна из разнотипных указанных выше меток соединяется с анти-гаптеновыми антителами. Таким образом, достигается непрямое связывание метки с антителом.

Помимо способов подготовки образца, рассмотренных выше, дальнейшая обработка срезов ткани перед, во время или после IHC может быть необходима. Например, способы извлечения эпитопов, такие как нагревание образца ткани, могут выполняться в цитратном буфере (см., например, Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)).

После дополнительной блокирующей стадии срез ткани подвергают воздействию первичного антитела в течение достаточного периода времени и при соответствующих условиях таких, что первичное антитело связывается с мишенью белкового антигена в образце ткани. Подходящие условия для достижения этого могут определяться общепринятым проведением эксперимента. Величина связывания антитела в образце определяется использованием любой из детектируемых меток, рассмотренных выше. Предпочтительно метка представляет собой ферментную метку (например, HRPO), которая катализирует химическое изменение хромогенного вещества, такого как 3,3'-диаминобензидин хромоген. Предпочтительно ферментативная метка связывается с антителом, которое связывается специфически с первичным антителом (например, первичное антитело представляет собой кроличье поликлональное антитело, а вторичное антитело представляет собой козлиное анти-кроличье антитело).

Необязательно использованные в IHC-анализе антитела для определения экспрессии сиалил-Льюис A или анти-сиалил-Льюис X представляют собой антитело анти-сиалил-Льюис A и анти-сиалил- Льюис X, соответственно. Необязательно анти-сиалил-Льюис A и анти-сиалил-Льюис X антитело представляет собой моноклональное антитело. Анти-сиалил-Льюис A и анти-сиалил-Льюис X антитела более доступны в области, включающей различные коммерческие источники.

Приготовленные таким образом образцы могут быть приготовлены и закрыты препаровальными стеклами. Затем производят оценку предметного стекла, например, используя микроскоп, и может быть использован критерий интенсивности окрашивания, по стандартной методике использующейся в способе. Если антиген представляет собой сиалил-Льюис A и/или сиалил-Льюис X белок, критерий интенсивности окрашивания может оцениваться, как указанно ниже:

Окрашенный образец	Оценка
Не наблюдали окрашивания в клетках	0
Слабое/едва различимое окрашивание обнаружили в более чем 10% клеток	1+
Окрашивание от слабого до умеренного наблюдали в более чем 10% клеток	2+
Окрашивание от умеренного до сильного наблюдали в более чем 10% клеток	3+

Общепринято полагать, что оценка окрашенного образца из примерно 2+ или выше в таком IHC-анализе предсказывает и указывает на чувствительность клетки млекопитающего (такие, как раковая клетка млекопитающего) к Apo2L/TRAIL или антителу-агонисту-рецептора смерти.

В альтернативных способах образец может связываться с антителом, специфичным для вышеупомянутого маркера при условиях, достаточных для образования комплекса антитело-биомаркер, и затем определение вышеупомянутого комплекса. Присутствие биомаркера может определяться целым рядом способов, таких как вестерн-блоттинг и способы ELISA для анализа большого разнообразия тканей и образцов, включая плазму или сыворотку. Большое разнообразие способов иммуноанализа с использованием такого формата анализа приводятся, например, в патенте США No 4016043, 4424279 и 4018653. Данные включают в себя как моносайтовые и двухсайтовые или "сэндвич" анализы неконкурентных типов, так и традиционные варианты анализа конкурентного связывания. Эти анализы также включают в себя прямое связывание меченого антитела с биомаркером-мишенью.

Сэндвич-анализы принадлежат к числу наиболее успешных и широко используемых анализов. Существует ряд разновидностей способа сэндвич-анализа, и все имеют целью быть включенными в настоящее изобретение. Кратко, в общепринятом лидерном анализе, немеченное антитело фиксируется на твердом субстрате, и образец исследуют, приводя в соприкосновение со связанной молекулой. После подходящего периода инкубации, на срок, достаточный для признания образования комплекса антитело-антиген, затем второе антитело, специфичное к антигену, меченное репортерной молекулой, необходимой для выработки обнаружимого сигнала, добавляют и инкубируют, предоставляя достаточно времени для образования другого комплекса антитело-антиген-меченное антитело. Любые не прореагировавшие материалы отмывают, и присутствие антигена определяется наблюдением сигнала, выработанного репортерной молекулой. Результаты могут быть либо качественными, простым наблюдением за видимым сигналом, либо могут быть количественными путем сравнивания с контрольным образцом, содержащим известные количества биомаркера.

Изменения в лидерном анализе включают в себя синхронизированный анализ, в котором и образец, и меченое антитело добавляют одновременно к связанному антителу. Эти способы хорошо известны специалисту в данной области, включая какие-либо незначительные изменения, так как они легко становятся очевидными. В общепринятом лидерном сэндвич-анализе первое антитело, специфичное для биомаркера, представляет собой либо ковалентно, либо пассивно связанное с твердой поверхностью. Общепринято твердая поверхность представляет собой стекло или полимер, наиболее распространенными полимерами являются целлюлоза, полиакриламид, нейлон, полистерол, поливинилхлорид или полипропилен. Твердые подложки могут быть в форме пробирок, гранул, дисков микропланшет или любых других поверхностей, подходящих для проведения иммуноанализа. Процессы связывания хорошо известны специалисту в данной области и, как правило, включают в себя перекрестно-сшитое ковалентное связывание или физическое адсорбирование, комплекс полимер-антитело отмывают при подготовке исследуемого образца. Затем для исследования аликвота образца добавляется к твердофазному комплексу и инкубируется в течение достаточного времени (например, 2-40 минут или всю ночь, если удобнее) и при подходящих условиях (например, при комнатной температуре до 40°C, таких как между 25°C и 32°C включительно) для обеспечения связывания любой субединицы, представленной антителом. После периода инкубации отмывают твердую фазу субъединицы антитела, высушивают и инкубируют со вторым антителом, специфичным для участка биомаркера. Второе антитело связывается с репортерной молекулой, которую используют для выявления связывания второго антитела с молекулой-маркером.

Альтернативный способ включает фиксирование биомаркеров-мишеней в образце и затем подвержение действию фиксированных мишеней к специфическому антителу, которое может или не может быть меченой репортерной молекулой. В зависимости от количества мишени и силы сигнала репортерной молекулы связанная мишень может быть обнаружена путем прямого введения меченого антителa. Альтернативно второе меченое антитело, специфичное к первому антителу, подвергается воздействию комплекса мишень-первое антитело для образования комплекса третьего порядка мишень-первое антитело-второе антитело. Комплекс обнаруживается сигналом испускаемым репортерной молекулой. Под термином "репортерная молекула", как использовано в настоящем описании, подразумевают молекулу, которая по своей химической природе обеспечивает аналитически опознаваемый сигнал, который позволяет определить антиген-связанное антитело. В этом варианте анализа наиболее распространенные репортерные молекулы представляют собой ферменты, флюорофоры или содержащие радионуклиды молекулы (то есть радиоактивные изотопы) и хемилюминесцентные молекулы.

В случае ферментного иммуноанализа фермент конъюгирован со вторым антителом, как правило, посредством глутаральдегида или периодата. Однако, как легко узнать, существует большое разнообразие различных способов конъюгации, которые легко доступны квалифицированному специалисту в данной области. Распространенные ферменты включает пероксидазу хрена, глюкозоксидазу, галактозидазу и щелочную фосфатазу среди прочих. Как правило, используемые со специфическими ферментами вещества выбраны для получения обнаруживаемого изменения окраски, после гидролиза соответствующим ферментом. Примеры подходящих ферментов включают в себя щелочную фосфатазу и пероксидазу. Также можно использовать флюорогенные вещества, которые производят флюоренцентный продукт, а не хромогенные вещества, приведенные выше. Во всех случаях фермент-меченное антитело добавляют к комплексу первое антитело-молекулярный маркер, позволяющее связаться, и затем лишний реагент отмывают. Раствор, содержащий подходящие вещества, затем добавляют к комплексу антитело-антиген-антитело. Вещество будет реагировать с ферментом, связанным со вторым антителом, дающим качественный видимый сигнал, который далее можно количественно определить, как правило, спектрофотометрически, чтобы дать представление о количестве представленного в образце биомаркера. Альтернативно флюоресцентные соединения, такие как флюоресцеин и родамин, могут быть химически соединены с антителами без изменения их связывающей способности. При активировании освещением конкретной длиной волны флюорохром-меченное антитело поглощает энергию света, вызывающей состояние возбуждения в молекуле, с последующим выделением света характерного цвета, визуально обнаруживаемого световым микроскопом. Как в EIA, флюоресцентное меченное антитело позволяет связаться с комплексом первое антитело-молекулярный маркер. После смывания несвязанного реагента сохранившийся комплекс третьего порядка затем подвергается облучению соответствующей длиной волны, наблюдаемая флюоресценция служит признаком присутствия интересующего молекулярного маркера. Иммунофлюоресценция и EIA способы хорошо известны в данной области. Однако также могут использоваться и другие репортерные молекулы, такие как радиоизотопы, хемилюминесцентные или биолюминесцентные молекулы.

Следует предположить, что вышеописанные способы также могут использоваться для определения экспрессии полипептидов FUT3 или FUT6.

Далее способы изобретения включают в себя протоколы, которые исследуют присутствие и/или экспрессию мРНК, таких как FUT3 и/или FUT6 мРНК, в образце ткани или клетки. Способы оценки мРНК в клетках хорошо известны и включают в себя, например, гибридизационные анализы с использованием коплементарных образцов ДНК (таких как in situ гибридизация, использующий меченые FUT3 и/или FUT6 образцы РНК, Нозерн-блот и родственные способы) и различные анализы амплификации нуклеиновых кислот (таких как RT-PCR с использованием комплементарных праймеров, специфичных для FUT3 и/или FUT6, и другие способы определения типа амплификации, такие как, например, разветвленные ДНК, SISBA, TMA и подобные им).

Можно удобным образом анализировать образцы ткани и клетки млекопитающих, например, FUT3 и/или FUT6 мРНК, используя Нозерн-, дот-блот или PCR-анализ. Например, RT-PCR анализы, такие как количественные PCR-анализы, хорошо известны в данной области. В иллюстрированном варианте осуществления изобретения способ определения FUT3 и/или FUT6 мРНК в биологическом образце включает получение кДНК из образца путем обратной транскрипции с использованием, по крайней мере, одного праймера; амплификация кДНК, тоже полученной с использованием FUT3 и/или FUT6 полинуклеотида, в качестве смысловых и антисмысловых праймеров для увеличения FUT3 и/или FUT6 кДНК в данном описании; и определение присутствия амплифицированной FUT3 и/или FUT6 кДНК. Кроме того, такие способы могут включать в себя один или несколько стадий, которые позволяют стадии определять уровни FUT3 и/или FUT6 мРНК в биологическом образце (например, путем синхронного исследования уровней относительного контроля последовательности мРНК генов "домашнего хозяйства", таких как член семейства актина). Необязательно последовательность амплифицированной FUT3 и/или FUT6 кДНК может быть определена.

В фактические варианты осуществления этого аспекта изобретения включают FUT3 и/или FUT6 праймеры и праймеры, и пары праймеров, которые разрешают специфическую амплификацию полинуклеотидов изобретения или их каких-либо специфических частей, и образцы, которые выборочно или специфически гибридизуются к молекулам нуклеиновых кислот изобретения или к каким-либо их частям. Образцы можно метить определяемой меткой, такой как, например, радиоизотоп, флюоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металла или фермент. Такие образцы и праймеры можно использовать для определения присутствия FUT3 и/или FUT6 полинуклеотидов в образце и в качестве средства для определения клетки, экспрессирующей FUT3 и/или FUT6 белки. Как понимается квалифицированным специалистом в данной области, большое количество различных праймеров и образцов можно получить, основываясь на последовательности, предложенной в данном описании, и используя эффективно для амплификации, клонировании и/или определении присутствия и/или уровней FUT3 и/или FUT6 мРНК.

Дополнительные способы изобретения включают в себя протоколы, которые исследуют или определяют мРНК, такие как FUT3 и FUT6 или другие фукозилтрансферазные мРНК, в образце ткани или клетки способами с использованием микрочипов. С использованием микрочипов нуклеиновых кислот исследуемые и контрольные образцы мРНК из образцов исследуемых и контрольных тканей обратно транскрибируются и метятся для получения образцов кДНК. Образцы затем гибридизуются к матрице из нуклеиновых кислот, фиксированных на твердой подложке. Матрица имеет такую конфигурацию, что известны последовательность и положение каждого члена матрицы. Например, отбор генов, которые потенциально могут эскпрессироваться при состояниях конкретной болезни и могут быть расположены на твердой подложке. Гибридизация меченого образца с конкретным членом матрицы означает, что образец, из которого был получен образец, экспрессирует этот ген. Различный анализ экспрессии генов из ткани больного может предоставить ценную информацию. В способе микрочипов используют способы гибридизации нуклеиновых кислот и вычислительную технику для оценки профиля экспрессии мРНК тысяч генов в течение одного эксперимента (см., например, WO 01/75166, опубликованный 11 октября 2001; (см., например, патент США 5700637, 5445934 и 5807522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21 (Suppl):15-19 (1999) для обсуждения производства матриц). ДНК микрочипы представляют собой миниатюрные матрицы, содержащие фрагменты гена, которые или синтезировали, или наносили на стекло либо другие вещества. Как правило, в одной матрице представлены тысячи генов. Общепринятый эксперимент с использованием микрочипа включает следующие стадии: 1) получение флюоресцентно меченной мишени из РНК, выделенной из образца; 2) гибридизация меченой мишени к микрочипу; 3) отмывание, окрашивание и считывание матрицы; 4) анализ сканированного изображения и 5) образование профилей экспрессии гена. В настоящее время существуют два используемых главных типа ДНК микрочипов: олигонуклеотидные (как правило, от 25 до 70 мономеров) микрочипы и матрицы генной экспрессии, включающие продукты PCR, полученные из кДНК. При образовании матрицы олигонуклеотиды могут быть либо готовыми и нанесенными на поверхность либо непосредственно синтезированными на поверхности (in situ).

Affymetrix GeneChip^® система представляет собой коммерчески доступную систему микрочипов, которая включает матрицы, полученные прямым синтезом олигонуклеотидов на стеклянной поверхности. Образец/Ген Матрицы:

Олигонуклеотиды, как правило, из 25 мономеров непосредственно синтезируются на стеклянном диске сочетанием основанной на полупроводниках фотолитографии и способов твердофазного химического синтеза. Каждая матрица содержит вплоть до 400000 различных олиго, и каждый олиго представлен миллионами копий. Поскольку олигонуклеотидные образцы синтезируются в известных локализациях на матрице, примеры гибридизаций и интенсивности сигнала можно объяснить в терминах идентичности гена и уровнях относительной экспрессии путем программного обеспечения Affymetrix набора микрочипов. Каждый ген представлен на матрице серией различных образцов олигонуклеотидов. Каждая пара образцов состоит из идеально совместимого олигонуклеотида и плохо совместимого олигонуклеотила. Идеально совместимый образец содержит последовательность, точно комплементарную конкретному гену, и таким образом измеряет экспрессию гена. Плохо совместимый образец отличается от идеально совместимого образца одноосновной заменой в центре положения основания, нарушающей связывание транскрипта гена-мишени. Это способствует определению фоновой и неспецифической гибридизации, которая вносит вклад в сигнал, измеренный идеально совместимым олиго. Программное обеспечение набора микрочипов вычитает интенсивности гибридизации плохо совместимых образцов с таковыми идеально совместимых образцов, чтобы определить абсолютную или специфическую оценку интенсивности для каждого набора образца. Образцы выбираются исходя из текущей информации от Genbank и других нуклеотидных хранилищ. Полагают, что последовательности узнают уникальные области 3' конца гена. GeneChip гибридизационная реакционная камера ("гриль" реакционная камера) используется для проведения гибридизации вплоть до 64 матриц за один раз. Струйная автоматическая станция производит отмывание и окрашивание матриц образца. Это полностью автоматизировано и включает четыре отсека, содержащего матрицу одного образца в каждом отсеке. Каждый отсек контролируется независимо программным обеспечением набора микрочипов, использующего протоколы заранее запрограммированной струйной техники. Сканер представляет собой лазерный с конфокальными зеркалами флюоресцирующий сканер, который измеряет интенсивность флюоресценции, испущенную меченой кРНК, связанной с матрицами образца. Компьютерная рабочая станция с программным обеспечением набора микрочипов контролирует струйную технику и сканер. Программное обеспечение набора микрочипов может контролировать вплоть до восьми приборов струйной техники с использованием протоколов запрограммированной гибридизации, отмывки и окрашивания матрицы образца. Программное обеспечение также получает и преобразовывает данные об интенсивности гибридизации в присутствие/отсутствие запроса для каждого гена, используя соответствующие алгоритмы. Наконец, программное обеспечение определяет изменения в экспрессии гена в экспериментах сравнительным анализом и превращает результат в.txt файлы, которые можно использовать другими программами для дальнейшего анализа данных.

Экспрессию выбранного биомаркера можно также оценить путем исследования генной делеции или генной амплификации. Генная делеция или амплификация может измеряться любым одним из большого разнообразия протоколов, известной в данной области, например, обычным Саузерн-блоттингом, Нозерн-блоттингом для количественного анализа транскрипции мРНК (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), дот-блоттинг (ДНК анализ), или гибридизация in situ (например, FISH), используя соответственно меченый образец, цитогенетические способы или сопоставительную геномную гибридизацию (CGH), используя соответственно меченый образец. В качестве примера эти способы можно использовать для определения делеции из амплификации FUT3 и/или FUT6 генов.

Дополнительно можно исследовать состояние метилирования биомаркера, такого как FUT3 и/или FUT6 гена, в образце ткани и клетки. Неправильное деметилирование и/или гиперметилирование районов CpG в 5' регуляторной области гена часто происходит в иммортализированных и трансформированных клетках и может привести к изменению экспрессии различных генов. Различные анализы исследования состояния метилирования гена хорошо известны в данной области. Например, можно использовать в способе Саузерн гибридизации, метилчувствительные ферменты рестрикции, которые не могут разрезать последовательности, которые содержат метилированные участки CpG для оценки состояния метилирования районов CpG. Кроме того, MSP (метилспецифическая PCR) может быстро копировать состояние метилирования всех участков CpG, представленных в районах CpG данного гена. Этот способ включает изначальную модификацию ДНК бисульфитом натрия (который будет превращать все неметилированные цитозины в урацил) с последующей амплификацией, использующей специфические праймеры для метилированной в противовес неметилированной ДНК. Протоколы, включающие препятствия метилированию, также можно обнаружить, например, в Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995; De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks et al, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536); и Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998).

Экспрессия выбранного биомаркера в образце ткани или клетки также может исследоваться в качестве анализов функциональной или базовой активности. Например, если биомаркер представляет собой фермент, можно осуществлять анализы, известные в данной области, определения или обнаружения присутствия данной ферментативной активности в образце ткани и клетки.

В способах настоящего изобретения предполагают, что образец ткани и клетки можно также исследовать на экспрессию Apo2L/TRAIL или рецепторов в образце, который связывает антитело Apo2L/TRAIL или рецептора смерти. Как описано выше и в данной области, в настоящий момент полагают, что Apo2L/TRAIL связывает, по крайней мере, пять различных рецепторов: DR4, DR5, DcR1, DcR2 и OPG. Используя известные в данной области способы, в том числе и описанные здесь, экспрессия Apo2L/TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2 и/или OPG могут обнаруживаться на уровне мРНК и на белковом уровне. Как показано на фиг.10 и 11, в данных доказано, что исследование образца ткани и клетки на экспрессию рецепторов DcR1 и/или DcR2 может далее предоставлять информацию, будет ли образец ткани или клетки чувствителен либо к антителу Apo2L/TRAIL, либо антителу рецептора смерти. В качестве примера описанные выше способы IHC можно использовать для определения присутствия одной или нескольких таких молекул в образце. Предполагают, что в способах, в которых ткань или образец исследуют не только на присутствие FUT или Льюис антигенного маркера, но также на присутствие, например, DR4, DR5 или DcR1, можно приготовить разделенные предметные стекла с аналогичной тканью или образцом, и каждое предметное стекло исследовали со специфическим реагентом для каждого специфического биомаркера или рецептора. Альтернативно одно предметное стекло можно получить из образца ткани или клетки, и антитела, относящиеся к каждому биомаркеру или рецептору, можно использовать применительно к протоколу мультицветного окрашивания, чтобы осуществить визуализацию или определение соответственных биомаркеров или рецепторов.

Вслед за определением этого образец ткани или клетки экспрессирует один или несколько биомаркеров, выявляющих, будет ли образец ткани или клетки чувствительным к активности антитела Apo2L/TRAIL или рецептора смерти, предполагается, что эффективное количество антитела Apo2L/TRAIL или рецептора смерти может вводиться млекопитающему для лечения расстройств, таких как рак или связанные с иммунитетом расстройства, которые причиняют страдание млекопитающему. Диагносцирование у млекопитающего различных патологических состояний, изложенных в данном описании, может проводиться квалифицированным практиком. Способы диагностики доступны в данном описании, которое позволит, например, диагносцировать или определить рак или иммуносвязанное заболевание у млекопитающего. Например, можно выявить раковые заболевания с помощью способов, включающих в себя, но ими не ограничиваясь, пальпации, анализ крови, рентгеновское исследование, NMR и подобные им. Иммуносвязанные заболевания также можно легко выявить.

Антитело Apo2L/TRAIL или рецептора смерти можно вводить в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение, в качестве болюса, или путем непрерывного вливания в течение периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацеребральным, подкожным, внутрисуставным, внутрисиновиальным, интратекальным, оральным, локальным или ингаляционным путями введения. Необязательно введение может производиться вливанием мини-насосом с использованием различных коммерчески доступных устройств.

Эффективные дозы и программы введения антитела Apo2L/TRAIL или рецептора смерти можно определить эмпирически, специалист в данной области осуществляет такие определения. Может использоваться единичная или множественная дозы. В настоящее время полагают, что эффективная доза или количество Apo2L/TRAIL при единичном использовании может варьировать от примерно 1 мг/кг до примерно 100 мг/кг веса тела или более в сутки. Внутривидовые нормы доз могут быть представлены в некоторой степени, известной в данной области, например, как описано в Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991).

Когда используется введение Apo2L/TRAIL in vivo, количества нормальной дозировки могут варьировать от примерно 10 нг/кг вплоть до 100 мг/кг веса тела млекопитающего или более в сутки, предпочтительно от примерно 1 мкг/кг/сутки до 10 мг/кг/сутки, в зависимости от пути введения. Руководство относительно конкретных доз и способов доставки описывается в литературе; см., например, патенты США No. 4657760; 5206344; или 5225212. Ожидается, что различные составы будут эффективны для различных лечебных препаратов и различных расстройств, потому что введение, нацеленное на один орган или ткань, например, может вызвать доставку, в некоторой степени отличающуюся от доставки к другому органу или ткани.

Предполагается, что до сих пор можно использовать дополнительные варианты терапии в способах. Один или несколько других вариантов терапии могут включать в себя, но ими не ограничиваться, введение радиационной терапии, цитокина(ов), ингибитора(ов) роста, хемиотерапевтических веществ(а), цитотоксических веществ(а), ингибиторов тирозинкиназ, ингибиторов ras-фарнесил трансферазы, ингибиторов ангиогенеза и ингибиторов циклин-зависимых киназ, которые известны в данной области и далее определены с подробностью вышеизложенного. Предполагается, что такие другие варианты терапии можно использовать для разделения вещества из антитела Apo2L/TRAIL или рецептора смерти. Кроме того, виды терапии, основанные на терапевтических антителах, которые нацеливают опухолевые антигены, такие как Rituxan^TM или Herceptin^TM, а также анти-ангиогенные антитела, такие как анти-VEGF.

Приготовление и программы дозирования для хемиотерапевтических веществ можно использовать в соответствии с инструкциями производителей или, как определено эмпирически, квалифицированным практиком. Приготовление и программы дозирования для хемиотерапии также описаны в Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). Хемиотерапевтическое вещество может предшествовать, или следовать за введением антитела Apo2L/TRAIL или рецептора смерти, или можно вводить при этом совместно.

К тому же может быть желательно применение антител против других антигенов, таких как антитела, которые связывают CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), или других членов семейства TNFR (таких как OPG, TNFR1, TNFR2, GITR, Apo-3, TACI, BCMA, BR3). Альтернативно, или в дополнение, два или несколько антител, связывающих один и тот же или два, или несколько различных антигенов, раскрытых в данном описании, можно вводить одновременно больному. Иногда это может быть полезно при введении одного или нескольких цитокинов больному. Последующее введение, обработанные клетки можно анализировать in vitro. В случае, если было лечение in vivo, за обработанным млекопитающим можно наблюдать различными путями, хорошо известными специалистам. Например, опухолевые клетки можно исследовать патологически для анализа некроза или сыворотку крови можно исследовать на ответы иммунной системы.

Для использования в заявках, описанных или предложенных выше, наборы или промышленные изделия также описываются в изобретении. Такие наборы могут содержать информацию о способе упаковки, будучи разделенными на разные категории, для получения в закрытом виде одного или несколько способов упаковки, таких как ампулы, пробирки и подобные им, каждый из способов упаковки включает один из специальных элементов для использования в способе. Например, один из способов упаковки может содержать образец, который существует или может быть очевидно помеченным. Такой образец может представлять собой антитело или полинуклеотид, специфичный для FUT3 и/или FUT6 белка, или FUT3, и/или FUT6 гена или мессенджера, соответственно. Поскольку набор использует гибридизацию нуклеиновых кислот для определения нуклеиновой кислоты-мишени, набор может также содержать упаковки с нуклеотидом(ами) для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени и/или упаковку, содержащую репортерные средства, такие как биотин-связывающий белок, такие как авидин или стрептавидин, связанные с репортерной молекулой, такой как ферментная, флюоресцентная или радиоизотопная метка.

Набор изобретения общепринято будет содержать упаковку, описанную выше, и одну или несколько других упаковок, содержащих нужные вещества с коммерческой и потребительской точки зрения, включая буферы, растворители, фильтры, шприцы, иглы, и вкладыш с инструкциями применения. Метка может быть использована в контейнере для выявления, какое соединение используется для специфической терапии или нетерапевтических применений, и может также означать указания для или in vivo, или in vitro применения, как описанные выше.

Наборы изобретения содержат ряд вариантов осуществления. Общепринятый вариант изобретения представляет собой набор, заключенный в упаковку, метку в вышеупомянутой упаковке, и соединение, содержащееся внутри вышеупомянутой упаковки; где соединение включает первичное антитело, которое связывает FUT3 и/или FUT6 полипептидную последовательность, метка в вышеупомянутой упаковке указывает, какое соединение можно использовать для оценки присутствия FUT3 и/или FUT6 белков в, по крайней мере, клетках млекопитающего одного типа, и инструкции по применению FUT3 и/или FUT6 антитела для оценки присутствия FUT3 и/или FUT6 белков в, по крайней мере, клетках млекопитающего одного типа. Набор далее может включать в себя инструкции и материалы для подготовки образца ткани и применяемое антитело и образец в одной и той же части образца ткани. Набор может включать в себя первичное и вторичное антитело, где вторичное антитело конъюгировано с меткой, например, энзиматической меткой.

Другой вариант осуществления представляет собой набор, содержащий упаковку, метку в вышеупомянутой упаковке, и соединение, содержащееся внутри вышеупомянутой упаковки; где соединение включает полинуклеотид, который гибридизуется к комплементарному FUT3 и/или FUT6 полинуклеотиду при жестких условиях, метка в вышеупомянутой упаковке указывает, какое соединение можно использовать для оценки присутствия FUT3 и/или FUT6 в, по крайней мере, клетках млекопитающего одного типа, и инструкции по применению FUT3 и/или FUT6 полинуклеотида для оценки присутствия FUT3 и/или FUT6 РНК или ДНК в, по крайней мере, клетках млекопитающего одного типа.

Другие необязательные компоненты набора включают в себя один или несколько буферов (например, блокирующий буфер, промывочный буфер, субстратный буфер и так далее), другие реагенты, такие как субстрат (например, хромоген), который химически изменяется под влиянием ферментной метки, раствор, восстанавливающий эпитоп, контрольные образцы (положительный и/или отрицательный контроли), контрольное предметное стекло(а) и так далее.

ПРИМЕРЫ

Различные аспекты изобретения далее описаны и проиллюстрированы путем примеров, ни один из которых не имеет целью ограничить область изобретения.

СПОСОБЫ И МАТЕРИАЛЫ

Клеточная культура и клеточные линии

Следующие клеточные линии колоректальной аденокарциномы человека: HCT-8, COLO 205, HCT 116, SW403, LoVo, SW948, Caco-2, COLO 201, SW1417, DLD-1, CX-1, HCT-15, LS 180, RKO, RKO-AS45-1, SK-CO-1, SW480, SW620, SW837, CL-40, COLO-206F, COLO 320DM, COLO 320HSR, COLO-678, HT-29, KM12, LS1034, SW1116 были получены из ATCC хранилища (Manassas, Virginia), DSMZ (Немецкая Коллекция Микроорганизмов и Клеточных Культур), JCRB (Японский Клеточный Ресурсный Банк) или ECACC (Европейская Коллекция Клеточных Культур) и культивировались в среде RPMI-1640, дополненной инактивированной нагреванием 10% эмбриональной бычьей сывороткой, 2 мМ L-глутамином и 10 мМ HEPES.

Цитотоксические анализы.

MTT анализ (CellTiter 96^® нерадиоактивный анализ клеточной пролиферации от Promega), который представляет собой колориметрический анализ, основанный на способности жизнеспособных клеток восстанавливать растворимую желтую тетразолиновую соль (MTT) до синих формазановых кристаллов, был использован для определения количества жизнеспособных клеток после обработки антителами Apo2L/TRAIL или DR5. MTT анализ был осуществлен путем добавления заранее перемешанным оптимизированным раствором красителя в культуральные лунки 96-луночного планшета, содержащего различные концентрации (от 0 до 1000 нг/мл) Apo2L/TRAIL или DR5 антител. В течение 4-часовой инкубации живые клетки преобразовывают тетразолиновый компонент раствора красителя в формазановый продукт. Затем добавляли в лунки с культурой растворитель/стоп реагент, делающий растворимым формазановый продукт, и регистрировали поглощение при 570 нм с использованием 96-луночного планшетного считывателя (SpectraMax). Полученное поглощение при 570 нм прямо пропорционально количеству клеток, обычно используемых в анализах пролиферации. Несмотря на то, что максимум поглощения для фармазанового продукта - это 570 нм и очищенный раствор показывает синий цвет, цвет в конце анализа может и не быть синим и зависит от количества представленного формазана по сравнению с другими компонентами (включая сыворотку, подкисленный феноловый красный и не восстановленный МТТ) в культуральной среде.

Количество клеток было оптимизировано путем осуществления клеточного титрования для получения сигнала анализа, приближающегося к высокому уровню линейного диапазона анализа. Поскольку различные клеточные типы имеют различные уровни метаболической активности, это было сделано для каждой клеточной линии отдельно. Для большинства изученных опухолевых клеток использовались от 5000 клеток на лунку до 20000 клеток на лунку.

Следующее представляет собой пошаговое описание использованных анализов:

1. В биоанализе использовались клетки из исходных культур.

2. Определение количества и жизнеспособности клеток трипановым синим и суспензия клеток до финального количества от 5000 до 20000 клеток на лунку.

3. Распределяли 50 мкл клеточную суспензию в 96-луночный планшет.

4. Инкубация планшетов при 37°С в увлажненной 5% CO₂-атмосфере в течение ночи.

5. Добавление 50 мкл культуральной среды, содержащей различные концентрации, изменяющиеся от 0 до 1000 нг/мл Apo2L/TRAIL или DR5 антител, к образцам 96-луночного планшета. Контроли представляли собой 50 мкл культуральной среды (без Apo2L/TRAIL или DR5 антител) и 100 мкл культуральной среды (без клеток). Каждый эксперимент был проведен в тройном наборе лунок и в три независимых дня. Общий объем лунок составлял 100 мкл/лунку.

6. Инкубация планшетов при 37°С в течение 72 часов в увлажненной 5% CO₂-атмосфере.

7. Добавление 15 мкл раствора красителя в каждую лунку.

8. Инкубация планшетов при 37°С в течение 4 часов в увлажненной 5% CO₂-атмосфере.

9. Добавление 100 мкл растворитель/стоп реагента в каждую лунку.

10. Ночная инкубация планшетов при 37°С всю ночь.

11. Регистрация поглощения при длине волны 570 нм с использованием 96-луночного планшетного считывателя. Ссылка на длину волны 750 нм была использована для уменьшения фона, вносимого клеточными остатками, отпечатками и другими неспецифическими сигналами.

12. Средняя величина уровней поглощения для отрицательного контроля используется в качестве пустого значения и вычитается из всех других показаний прибора. Средняя величина уровней поглощения для каждой концентрации Apo2L/TRAIL или DR5 антител была разделена на среднюю величину уровней поглощения положительного контроля (100% жизнеспособных клеток - необработанных), чтобы рассчитать сумму жизнеспособных клеток (в %).

13. Был нанесен процент жизнеспособных клеток (ось Y) в сравнении с концентрацией Apo2L/TRAIL или DR5 антителами (ось X, логарифмическая шкала), и положением X-оси уровня (нг/мл), соответствующий 50% жизнеспособных клеток, был определен уровень IC50.

Протокол введения метки Affymetrix

Взяли OD260/280 считывание для всех образцов и прогнали образцы в BioAnalyzer. Использовали 5 мкг общей РНК высокого качества.

A. Синтез первой нити кДНК:
1. Гибридизация праймера
DEPC-H2O x мкл	Смешать, интенсивно перемешивая. Быстро центрифугировать.
РНК (5 мкг) × мкл	Инкубировать при 70°С 10 минут.
Шпилька (1:4 разведение из исходного материала на 5 мкг) 1 мкл	Быстро центрифугировать и поместить на лед
T7-(dT)24	праймер 1 мкл
Объем	12 мкл
2. Регулирование температуры
5X-буфер для одноцепочечной кДНК	4 мкл
Добавить 7 мкл (смешать налево) каждого образца. 0,1 М DTT 2 мкл	Смешать встряхивая. Быстро центрифугировать.
10 мМ dNTP смешать 1 мкл объем 7 мкл	Инкубировать при 42°С 2 минуты.
3. Синтез первой цепи
Добавить 1 мкл SSII RT в каждый образец.
SSII RT 1 мкл	Смешать, пипетируя вверх и вниз -или- слегка встряхнуть.
Быстро центрифугировать
Общий объем 20 мкл	Инкубировать при 42°С 1 час.
B. Синтез второй цепи кДНК
1. Поместить реакции первой цепи на лед	Центрифугировать короткое время, осаждая сгустки на стенку пробирки.
2. Сделать следующую оригинал-смесь для второй цепи.
DEPC-обработанная H2O	91 мкл
5X-реагирующий буфер для 2-й цепи	30 мкл
10 мМ dNTP смесь	3 мкл
10 U/мкл ДНК лигаза	1 мкл
10 U/мкл ДНК полимераза I	4 мкл
2 U/мкл РНКазы H	1 мкл
Общий объем	130 мкл

3. Добавить 130 мкл оригинал-смесь для второй цепи к 20 мкл кДНК первой цепи. (Конечный объем = 150 мкл)

4. Смешать, пипетируя вверх и вниз -или- слегка встряхнуть. Быстро центрифугировать.

5. Инкубировать при 16°С 2 часа на охлаждающейся водяной бане.

6. Добавить 2 мкл [10 U] T4 ДНК полимеразу. Смешать, пипетируя вверх и вниз- или- слегка встряхнуть. Быстро центрифугировать.

7. Инкубировать 5 минут при 16°С.

8. Добавить 10 мкл 0,5 М EDTA. Слегка встряхнуть. Быстро центрифугировать.

9. Приступить к процедуре очистки кДНК -или- хранить при -20°C для дальнейшего использования.

Очистка двухцепочечной кДНК (GeneChip модуль очистки образца)

1. Добавить 600 мкл кДНК связывающего буфера к 162 мкл конечного продукта синтеза двухцепочечной кДНК.

Смешать встряхиванием 3 секунды.

2. Убедиться, что цвет смеси желтый (подобный кДНК связывающему буферу w/o реакции синтеза кДНК).

Если цвет смеси оранжевый или фиолетовый, добавить 10 мкл 3 М ацетата натрия, pH 5,0 и смешать.

Цвет смеси должен стать желтым.

3. Нанести 500 мкл образца на кДНК очистительную центрифужную колонку, помещенную в 2 мл собирающую пробирку, и центрифугировать

1 минуту при ≥8000 x g (≥10000 об/мин). Выбросить отфильтрованное, как опасные отходы.

4. Перегрузить центрифужную колонку оставшейся смесью (262 мкл) и центрифугировать, как указано выше.

Выбросить отфильтрованное, как опасные отходы, и выбросить собирающую пробирку.

5. Переместить центрифужную колонку в новую 2 мл собирающую пробирку (поставленную). Налить 750 мкл отмывочный буфер для кДНК в центрифужную колонку. Центрифугировать 1 минуту при ≥8,000 x g (≥10,000 об/мин).

Выбросить отфильтрованное.

6. Открыть крышку центрифужной колонки и центрифугировать 5 минут при максимальной скорости (≤25000 x g).

Поместить колонку в центрифугу, используя каждый второй стакан. Положение крышки поверх примыкающего стакана должна быть такое, чтобы

они ориентировались в противоположном направлении вращения, то есть, если вращение по часовой стрелке, ориентация крышки в направлении против движения часовой стрелки. Это позволит избежать повреждения крышек.

Выбросить отфильтрованное и собирающую пробирку.

7. Переместить центрифужную колонку внутрь 1,5 мл собирающей пробирки. Перелить 10 мкл кДНК элюирующего буфера непосредственно на мембрану центрифужной колонки. Следить за тем, чтобы кДНК элюирующий буфер распределился непосредственно на мембрану.

Инкубировать 1 минуту при комнатной температуре и центрифугировать 1 минуту при максимальной скорости (≤25000xg) для элюирования.

Установка и начало IVT реакции

Enzo: Bioarray HighYield РНК транскрипционный маркирующий набор (Part No. 900182)

1. Использовать 10 мкл очищенной двухцепочечной кДНК

2. Сделать следующую IVT оригинальную смесь:

дистиллированной или деионизованной H₂O 12 мкл

10X HY реакционный буфер 4 мкл

10x Биотинмеченные рибонуклеотиды 4 мкл

10X DTT 4 мкл

10X смесь ингибиторов РНКазы 4 мкл

20X T7 РНК полимераза 2 мкл

Общий объем: 30 мкл

3. Добавить 30 мкл IVT оригинальной-смеси к 10 мкл двухцепочечной кДНК. (Общий объем = 40 мкл)

4. Смешать, пипетируя вверх и вниз -или- слегка встряхивая. Быстро центрифугировать.

5. Немедленно поместить пробирку в 37°С водяную баню. Инкубировать 5 часов.

6. Хранить при -20°С, если не очищать РНК немедленно.

Очистка биотинмеченной кРНК (GeneChip модуль очистки образца)

1. Добавить 60 мкл H₂O к IVT реакции и смешать, интенсивно встряхивая 3 секунды.

2. Добавить 350 мкл IVT кРНК связывающего буфера в образец смешать, интенсивно встряхивая 3 секунды.

3. Добавить 250 мкл этанола (96-100%) к лизату и хорошо смешать, пипетируя. Не центрифугировать.

4. Нанести образец (700 мкл) на IVT кРНК очищающую центрифужную колонку, помещенную в 2 мл собирающую пробирку.

Центрифугировать 15 секунд при ≥8000xg (≥10000 rpm).

5. Провести прямое элюирование колонки еще раз.

Центрифугировать 15 секунд при ≥8000xg (≥10000 об/мин).

Выбросить отфильтрованное, как опасные отходы, и выбросить собирающую пробирку.

6. Переместить центрифужную колонку в новую 2-мл собирающую пробирку (поставленную).

7. Добавить 500 мкл IVT кРНК отмывочного буфера и центрифугировать 15 секунд при ≥8000xg (≥10000 об/мин), чтобы отмыть.

Выбросить отфильтрованное.

8. Перелить 500 мкл 80% (v/v) этанол на центрифужную колонку, и центрифугировать 15 секунд

при ≥8000хg (≥10000 об/мин). Выбросить отфильтрованное.

9. Открыть крышку центрифужной колонки и центрифугировать 5 минут при максимальной скорости (≤25000хg).

Выбросить отфильтрованное и собирающую пробирку.

10. Переместить центрифужную колонку в новую 1,5 мл собирающую пробирку.

11. Перелить 11 мкл свободную от РНКазы воду непосредственно на мембрану центрифужной колонки. Дать постоять 1 минуту.

Центрифугировать 1 минуту при максимальной скорости (≤25000xg) для элюирования.

12. Перелить 10 мкл свободную от РНКазы воду непосредственно на мембрану центрифужной колонки. Дать постоять 1 минуту.

Центрифугировать 1 минуту при максимальной скорости (≤25000xg) для элюирования.

Определение количества кРНК (IVT-продукт)

Использовать спектрометрический анализ для определения выхода РНК. Использовать условное обозначение, что 1 OD при 260 нм равняется 40 мкг/мл РНК.

Установить OD на 260 нм и 280 нм для определения концентрации и чистоты образца.

Сохранить отношение A260/A280, близкое к 2,0, для чистой РНК (отношение между 1,9 и 2,1 является приемлемым).

Для количественных показателей кРНК, когда общая РНК используется в качестве исходного материала, вычисленный выход кРНК должен быть рассчитан, чтобы отразить остаток немеченной общей РНК. Используя оценку относительно 100% остатка, для определения установленного выхода кРНК применяют приведенную ниже формулу:

вычисленный выход кРНК = РНКm - (общая РНКi) (y)

РНКm = количество кРНК, измеренная после IVT (мкг) общая РНКi = начальное количество общей РНК (мкг)

y = фракция кДНК реакции, использованной в IVT

Фрагментирование кРНК для приготовления мишени

Для фрагментации используют вычисленную концентрацию кРНК.

1. Добавить 2 мкл из 5x фрагментационного буфера на каждые 8 мкл РНК плюс H₂O.

20 мкг кРНК от 1 до 32 мкл

5X фрагментационный буфер 8 мкл

свободная от РНКаз вода в 40 мкл

Общий объем: 40 мкл

2. Инкубировать при 94°С в течение 30 минут. Немедленно опустить на лед после инкубации.

Приготовление гибридизационной мишени

1. Нагревать 20X контроли эукариотической гибридизации и олиго B2 в течение 5 минут при 65°С.

Affymetrix GeneChip набор контроля эукариотической гибридизации, Part #900362 (для 150 rxns)

2. Слегка встряхнуть, замедлить вращение.

3. Главная смесь (предполагаемая концентрация фрагментированной кРНК 0,5 мкг/мкл):

Стандартная установка (мкл)	конечная концентрация
фрагментированная кРНК 15 мкг	30 0,05 мкг/мкл
Олиго B2 (3 нМ) 5	50 пМ
20x контрольная шпилька 15	1,5; 5; 25; 100 пМ
(Bio B, C, D, Cre)
Селедочная сперма ДНК 3	0,1 мг/мл
Ацетилированный BSA 3	0,5 мг/мл
Hu cot-1 ДНК (1 мг/мл) 30	0,1 мг/мл
2X MES Гибр. буфер 150	1X
H2O	64
Конечный объем	300

4. Аликвотить 270 мкл главной смеси в пробирки и поместить 30 мкл фрагментированной кРНК в каждую. Это гибридизационная смесь.

5. Уравновесить матрицу образца при комнатной температуре немедленно перед использованием.

6. Наполнить матрицу образца 1x MES гибридизационным буфером и инкубировать в гриль духовом шкафу 10 минут при 45°С, 60 rpm.

7. Нагреть гибридизационную смесь в 99°С водяной бане 5 минут.

8. Переместить гибридизационную смесь в 45°С водяную баню на 5 минут.

9. Центрифугировать гибридизационную смесь 5 минут при максимальной скорости.

10. Удалить 1x MES гибридизационный буфер из матриц образца.

11. Наполнить матрицу образца с верхом 200 мкл гибридизационной смесью.

12. Изолировать мембрану с помощью Tough-Spots.

13. Гибридизировать матрицу образца при 45°С, 60 RPM 19 часов.

14. Отмыть, окрасить и сканировать матрицу образца в соответствии протоколами Affymetrix.

Материалы Affymetrix
Поставщик предметов	Каталог #
T7-(dT)24 праймер	Biosearch Technology custom
Контрольные шпильки	in-house
Верхний индекс II/5X однонитевой Буфер /0,1 М DTT	Invitrogen 18064-014
5X буфер второй нити	Invitrogen 10812-014
10 мМ dNTP	Invitrogen 18427-088
10 ед/мкл E. coli ДНК Лигаза	Invitrogen 18052-019
10 ед/мкл E. coli ДНК Полимераза I	Invitrogen 18010-025
2 ед/мкл РНКаза H	Invitrogen 18021-071
10 ед/мкл T4 ДНК Полимераза	Invitrogen 18005-025
0,5 М EDTA	Sigma E-7889
ENZO Высокопродуктивный РНК транскрипционный меченый набор	Affymetrix или ENZO 900182 (ENZO)
GeneChip модуль очистки образца	Affymetrix 900371
Ацетилированный бычий сывороточный альбумин	Invitrogen 15561-020
Козлиный IgG - химически чистый	Sigma I-5256
Анти-стрептавидиновые антитела (козлиные)	biotinylated Vector Labs BA-0500
R-фикоэритрин стрептавидиновые молекулярные зонды	S-866
2OX SSPE	BioWhittaker 51214
Эукариотический контрольный набор	Affymetrix 900362
Вода, молекулярно биологическое качество	Ambion 9934
человеческий Cot-1 ДНК	Roche 1-581-074
5 М NaCl РНКазо-свободный, ДНКазо-свободный	Ambion 9760
Пеногаситель 0-30	Sigma A-8082
10% Tween-20	Pierce Chemical 28320
MES свободная кислота моногидрат	Sigma M5287
MES хлорид натрия	Sigma M3885
EDTA динатривая соль, 0,5 М раствор	Sigma E7889
Tough Spots, Label Dots USA Scientific	9902
GeneChip "гриль" реакционная камера 640	Affymetrix 800139
GeneChip сканер 3000 w/Workstation	Affymetrix 00-0074
Струйная автоматическая станция	Affymetrix 00-0081
Автоматическое загрузочное устройство w/считыватель наружного штрихового кода	Affymetrix 00-0129

Количественная PCR

Синтез кДНК:

Соединения	Объем (мкл)
10Х RT Буфер	10
Смесь 25Х dNTR	4
Праймеры 10Х Random	10
MultiScribe RT (50 ед/мкл)	5
РНКаза - свободная Н2О	21
РНК (100 нг)	50
Конечный объем	100

Условия инкубации:

25° в течение 10 минут

37° в течение 2 часов

TaqMan реакция с использованием ABI Prism 7700 Sequencing Detector:

Соединения	Объем (мкл)
TagMan Universal PRC Мастер смеси (2Х)	25
TagMan-зонд (20Х) (Assays-on-DemandTM)	2,5
КДНК (100 нг)	2
Н2О	20,5
Конечный объем	50

Условия циклического изменения температуры:

95° в течение 10 минут

40 циклов: 95° в течение 15 секунд

60° в течение 1 минуты

- TaqMan зонды: Assays-on-Demand^TM (TaqMan^® MGB зонды, FAM^TM меченный красителем)

- Амплификация эндогенного контроля, GAPDH (концентрация зонда 100 нМ, концентрации переднего/заднего праймера 200нМ), была произведена стандартизация количества образца РНК (кДНК), добавленного в каждую реакцию.

Соответствующая количественная оценка была проведена с использованием способа калибровочной кривой. Для количественной оценки нормированной по эндогенному контролю, получили калибровочную кривую как для искомой, так и эндогенной точки отсчета. Для каждого экспериментального образца количество искомой и эндогенной точки отсчета было определено из распределения калибровочной кривой. Затем искомое количество делили на эндогенную точку отсчета для получения нормализованной искомой величины. Один из экспериментальных образцов служил в качестве калибровщика, или 1-й образец. Каждая нормализованная искомая величина была затем разделена на калибровочную нормализованную искомую величину для получения уровней относительной экспрессии.

FACS/ проточная цитометрия (2° протокол окрашивания антител):

Все инкубации и центрифугирования были осуществлены при 4°С, и пробирки помещали на лед, но не в холодильник.

1. Определить размер пробирки путем распознавания клеточных линий, которые будут применяться, интересующих антител и любых специальных условий или обработки.

a. Контроли.

i. Неокрашенные, 2є антитело, и уравновешенные, если флуорохромы имеют наложение спектра испускания.

b. Пример:

Пробирка	Клеточная линия	Время (мин)	1° Антитело	2° Антитело
1	e.g.,COLO-205	0	-	-
2	e.g.,COLO-205	0	-	Анти-мышиные FITC
3	e.g.,COLO-205	0	Анти сиалил-Льюис А	Анти-мышиные FITC
4	e.g.,COLO-205	0	Анти-CD15 (сиалил-Льюис Х)	Анти-мышиные FITC

2. Марка FACS пробирок.

a. BD Falcon 12x75мм круглодонные полистерол. Каталог #: 352052

3. Приготовление клеток для окрашивания.

a. Обработать прилипшие клетки акутазой или трипсином.

i. Innovative Cell Technologies Inc, акутаза.

ii. Gibco, трипсин. Каталог #: 25200-106.

b. Возобновить остающиеся шаги, если клетки в суспензии.

4. Аликвотить клетки в 15 мл или 50 мл конической пробирке.

5. Вращать клетки 5 мин, 1200 об/мин, 4°С.

6. Удалить супернатант.

7. Ресуспендировать клетки в 5 мл FACS буфера.

8. Вращать клетки 5 мин, 1200 об/мин, 4°С.

9. Удалить супернатант.

10. Ресуспендировать клетки в блокирующем буфере.

a. Определить объем нужного блокирующего буфера:

i. Число пробирок по клеточной линии/обработка x l00 мкл блокирующего буфера на пробирку.

ii. Желательно 1x10⁶ клеток на 100 мкл блокирующего буфера.

11. Аликвотить 100 мкл клеток в надлежащих пробирках.

a. Исходя из заранее заданного размера пробирки.

12. Добавить 1° антитело в заданную пробирку.

a. Льюис А:

i. Использовать 10 мкл 0,2 мкг/мкл исходного раствора на пробирку.

1. Конечная концентрация 2 мкг.

ii. Chemicon: анти-сиалил-Льюис A. Catalog #: MAB2095.

b. Льюис X:

i. Использовать 5 мкл 0,5 мкг/мкл исходного раствора на пробирку.

1. Конечная концентрация 2,5 мкг.

ii. BD Pharmingen: CD15s (сиалил-Льюис X). Catalog #: 551344.

13. Инкубировать 30 мин при 4°С.

14. Добавить 1 мл FACS буфера в каждую пробирку.

15. Вращать клетки в течение 5 мин, 1200 об/мин, 4°С.

16. Удалить супернатант.

17. Мягко сцеживать пробирки до удаления осадка.

a. "Сцеживание"- направить поперек плоскости пробирки из 12х75 мм штатива для пробирок.

18. Повторить стадии 14-17.

19. Добавить 100 мкл блокирующего буфера в каждую пробирку.

20. Добавить 2° антитело в надлежащую пробирку.

a. Использовать 10 мкл на пробирку.

b. Jackson, козлиные-анти-мышиные FITC. Каталог #: 115-096-068.

21. Инкубировать 30 мин при 4°С.

22. Повторить шаги 14-17 дважды.

23. Ресуспендировать клетки в FACS буфер/PI.

a. Определить нужный объем:

i. Нужно 1 мл раствора в пробирку.

ii. PI=1 мкл на 1 мл буфера.

b. Молекулярные зонды, пропидия йодит. Каталог #: P3566.

24. Поместить пробирки в ведерко со льдом или охлажденный штатив для пробирок.

25. Покрыть алюминиевой фольгой и взять FACS для лабораторного квалифицированного рабочего для получения информации и анализа образцов.

5% блокирующий буфер:

1. FBS до 5% общего объема.

2. FACS буфер.

3. Фильтровать раствор через 0,2 мкм фильтр.

FACS буфер:

1. 980 мл PBS.

2. 8 мл 0,25 М EDTA.

3. 20 мл FBS.

4. Фильтровать раствор через 0,2 мкм фильтр.

Иммуногистохимическая процедура: сиалил-Льюис A

Антитела: сиалил-Льюис A AB-1

Клон: 121SLE

Поставщик: NeoMarkers

Каталоговый No. MS-279-P

Ig виды: мышиный

IHC способ: парафин

Премедикация: нет

IHC управление: Autostainer

Изотип: мышиный IgM

Виды исследования: Человек

Концентрация IgG: 200 мкг/мл

Обычный способ:

Депарафинизировать и гидратировать дистиллированную воду.

Блокировать эндогенный биотин с векторной авидин-биотин блокирующей системой.

Промыть с TBS: 2 замены, 5 минут каждая.

Блокировать 10% нормальной лошадиной сывороткой в течение 30 минут при комнатной температуре.

Инкубировать с мышиными моноклональными сиалил-Льюис A антителами, разведенными до 5 мкг/мл 10% нормальной лошадиной сывороткой, 60 минут при комнатной температуре.

Использовать мышиный изотип IgM, разведенный до 5 мкг/мл 10% нормальной лошадиной сывороткой для отрицательного контроля.

Промыть с TBS: 2 замены, 5 минут каждая.

Инкубировать с биотинилированными лошадиными анти-мышиными антителами; разведенными 1:200 10% нормальной лошадиной сывороткой, в течение 30 минут при комнатной температуре.

Промыть с TBS: 2 замены, 5 минут каждая.

Инкубировать с разведенной Vector ABC Elite System в течение 30 минут при комнатной температуре.

Промыть с TBS: 2 замены, 5 минут каждая.

Инкубировать с Pierce Metal Enhanced DAB в течение 5 минут.

Промыть в проточной водопроводной воде в течение 5 минут.

Докрасить с Mayers гематоксилин в течение 1 минуты.

Промыть в проточной водопроводной воде в течение 5 минут.

Синий гематоксилин с Richard-Allan синим реагентом в течение 1 минуты.

Промыть в проточной водопроводной воде в течение 5 минут.

Удалить влагу, очистить и поместить между синтетическими крепежными материалами.

Иммуногистохимическая процедура: сиалил-Льюис X

Антитела: мышиные анти-сиалил-Льюис X

Клон: KM93

Поставщик: Chemicon

Каталоговый No. MAB2096

Виды Ig: мышиные

IHC способ: парафин

Премедикация: DAKO восстановление мишени

IHC управление: Autostainer

Изотип: мышиные IgM

Виды исследования: Человек

Концентрация IgG: 100 мкг/мл

Обычный способ:

Депарафинизировать и гидратировать дистиллированную воду.

Подавить эндогенную пероксидазную активность KPL блокирующим раствором - разбавить концентрацию 1:10 в dH₂О, при комнатной температуре в течение 4 минут.

Промыть в дистиллированной воде в течение 5 минут.

Инкубировать в DAKO Target Retrieval (S1700), разогретой до 99°С в течение 20 минут в кипящей водяной бане. Удалить из кипящей бани и охладить в течение 20 минут.

Блокировать эндогенный биотин с векторной авидин-биотин блокирующей системой.

Блокировать 10% нормальной лошадиной сывороткой в течение 30 минут при комнатной температуре.

Инкубировать с мышиными моноклональными сиалил-Льюис X антителами, разбавленными до 5 мкг/мл 10% нормальной лошадиной сывороткой, в течение 60 минут при комнатной температуре.

Использовать мышиный изотип IgM, разведенный до 5 мкг/мл 10% нормальной лошадиной сывороткой, для отрицательного контроля.

Промыть с TBS: 2 замены, 5 минут каждая.

Инкубировать с векторными биотинилированными лошадиными анти-мышиными антителами; 1:200 разведенными 10% нормальной лошадиной сывороткой, в течение 30 минут при комнатной температуре. Промыть с TBS: 2 замены, 5 минут каждая.

Инкубировать срезы с разведенной Vector ABC Elite System в течение 30 минут при комнатной температуре.

Промыть с TBS: 2 замены, 5 минут каждая.

Инкубировать срезы с Pierce Metal Enhaced DAB в течение 5 минут.

Промыть в проточной водопроводной воде в течение 5 минут.

Докрасить с Mayers гематоксилином в течение 1 минуты.

Промыть в проточной водопроводной воде в течение 5 минут.

Синий гематоксилин с Richard-Allan синим реагентом на 1 минуту.

Промыть в проточной водопроводной воде в течение 2 минут.

Удалить воду, очистить и поместить между синтетическими крепежными материалами.

Экспериментальные результаты

Эксперименты были проведены с использованием вышеописанных способов и материалов. Результаты этих экспериментов проиллюстрированы на фиг.6-13, как обсуждается ниже.

На фиг.6 представлено краткое изложение схемы данных, полученных при анализе 28 кишечных или колоректальных раковых клеточных линий на чувствительность или резистентность к апоптотической активности Apo2L (+0,5% эмбриональной бычьей сыворотки "FBS" или 10% FBS) или DR5 моноклональным антителам "mab", перекрестно-связанным "XL" или не перекрестно-связанным (+0,5% эмбриональной бычьей сыворотки "FBS" или 10% FBS) и экспрессия FUT 3, FUT 6, сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X.

На фиг.7 представлено сравнение чувствительности различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий к DR5 антителу и экспрессия FUT 3, как измеренная количественной PCR.

На фиг.8 представлено сравнение различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий на чувствительность или резистентность к DR5 антителам (плюс перекрестная связь) и экспрессия сиалил-Льюис X или A, как установлено FACS.

На фиг.9A изображен критерий ранговой корреляции Спирмана, анализирующий чувствительность или резистентность различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий и корреляция с экспрессией FUT3.

На фиг.9В изображены результаты точного критерия Фишера, анализирующие чувствительность или резистентность различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий и статистическая значимость между FUT3 и экспрессией сиалил-Льюис A/X и чувствительностью соответствующих клеточных линий к апоптотической активности DR5 антитела.

На фиг.10 представлено сравнение экспрессии рецепторов DcR1 или DcR2 различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий (как установлено количественным PCR) и состояние (чувствительность или резистентность) постоянных клеточных линий к антителу Apo2L или DR5.

На фиг.11 представлено сравнение экспрессии рецепторов DcR1 или DcR2 различных кишечных или колоректальных раковых клеточных линий (что установлено FACS) и состояние (чувствительность или резистентность) постоянных клеточных линий к антителу Apo2L или DR5.

На фиг.12 показано иммуногистохимическое окрашивание для сиалил-Льюис A и X в четырех колоректальных раковых клеточных линиях, CaCO₂ (Colo2), SW 1417, DLD-1 и Colo 205, и их корреляции с экспрессией сиалил-Льюис A и X, определяемой FACS, и их корреляция с чувствительностью к Apo2L/TRAIL.

Колоректальные раковые клеточные линии Colo 2 и SW1417 показывают никакое и слабое окрашивание, соответсвенно, или по сиалил-Льюис антигенам негативны и слабо положительны, соответственно, путем FACS и резистентны к Apo2L/TRAIL. Колоректальные раковые клеточные линии DLD-I и Colo 205 показывают умеренное и сильное окрашивание, соответственно для сиалил-Льюис антигенов умеренно и сильно положительны, соответственно, путем FACS и чувствительны к Apo2L/TRAIL.

На фиг.13 показано краткое описание IHC-экспериментов, демонстрирующих экспрессию сиалил-Льюис A и X в образцах ткани нормальной слизистой кишечника, нормальной ткани печени, первичного рака кишечника и кишечных раковых метастазов. Образцы ткани нормального кишечника и первичного рака кишечника, включенные в тканевой микрочип, были исследованы в IHC-эксперименте, в то время как образцы ткани нормальной печени и метастазирующего кишечного рака были помещены на индивидуальные предметные стекла. Преобладание экспрессии сиалил-Льюис A и X и интенсивность иммуногистохимического окрашивания усиливаются от нормальной ткани кишечника к первичному раку кишечника к метастазирующему раку кишечника. Клетки нормальной печени не окрашивались на сиалил-Льюис A или X.

Claims (37)

1. Способ прогнозирования чувствительности образца ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего к антителу рецептора смерти, включающий стадии:
получение образца ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего;
исследование образца ткани или клеток злокачественной опухоли для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис А и/или Х антигена (антигенов), где экспрессия указанных одного или нескольких биомаркеров является показателем того, что указанный образец ткани или клеток злокачественной опухоли является чувствительным к апоптоз-индуцирующей активности одного или нескольких антител рецептора смерти.

2. Способ по п.1, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют путем определения экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

3. Способ по п.1, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют иммуногистохимией для определения экспрессии сиалил-Льюис А и/или Х антигена (антигенов).

4. Способ по п,1 дополнительно включающий стадию исследования экспрессии DR4, DR5, DcR1 или DcR2 рецепторов в указанном образце ткани или клеток.

5. Способ по п.1, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой раковые клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

6. Способ по п.1, где указанное одно или несколько антител рецептора смерти представляют собой антитела DR5 или DR4.

7. Способ индукции апоптоза в образце ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего, включающий стадии:
получение образца ткани или клеток злокачественной опухоли млекопитающего;
исследование образца ткани или клеток злокачественной опухоли для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис А и/или Х антигена (антигенов), и после определения экспрессии указанных одного или нескольких биомаркеров,
воздействие на указанный образец ткани или клеток злокачественной опухоли эффективным количеством антитела-агониста рецептора смерти.

8. Способ по п.7, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют тестированием экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

9. Способ по п.7, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют иммуногистохимией для определения экспрессии сиалил-Льюис А и/или Х антигена (антигенов),

10. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии DR4, DR5, DcR1 или DcR2 рецепторов в указанном образце ткани или клеток.

11. Способ по п.7, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой раковые клетки или ткань толстой кишки колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

12. Способ по п.7, где указанные клетки подвергаются действию эффективного количества DR5 или DR4 антител-агонистов.

13. Способ лечения злокачественной опухоли у млекопитающих, включающий стадии:
получение образца ткани или клеток злокачественной опухоли из указанного млекопитающего;
исследование образца ткани или клеток злокачественной опухоли для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис А и/или Х антигена (антигенов), и после определения экспрессии указанных одного или нескольких биомаркеров, введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела-агониста рецептора смерти.

14. Способ по п.13, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют определением экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

15. Способ по п,13, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют иммуногистохимией для определения экспрессии сиалил-Льюис А и/или Х антигена (антигенов).

16. Способ по п.13, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии DR4, DR5, DcR1 или DcR2 рецепторов в указанной ткани или клетке.

17. Способ по п.13, где указанные клетки или ткани злокачественной опухоли включают раковые клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

18. Способ по п.13, где указанному млекопитающему вводят эффективное количество антитела-агониста DR5 или DR4.

19. Способ по п.13, где указанному млекопитающему также назначают химиотерапевтическое средство(а) или лучевую терапию.

20. Способ по п.13, где указанному млекопитающему также вводят цитокин, цитотоксический агент или агент, ингибирующий рост.

21. Способ по любому из пп.6, 12 или 18, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело DR5.

22. Способ по любому из пп.6, 12 или 18, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело DR4.

23. Способ по любому из пп.6, 12 или 18, где указанное антитело представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывает DR5.

24. Способ по любому из пп.6, 12 или 18, где указанное антитело представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывает DR4.

25. Способ по любому из пп.6, 12 или 18, где указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное моноклональное антитело, которое связывает DR5.

26. Способ по любому из пп.6, 12 или 18, где указанное антитело представляет собой химерное или гуманизированное моноклональное антитело, которое связывает DR4.

27. Способ по любому из пп.6, 12 или 18, где указанное антитело представляет собой антитело DR5, которое связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-411 из фиг.3А (SEQ ID NO:5).

28. Способ по любому из пп.6, 12 или 18, где указанное антитело представляет собой антитело DR4, которое связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-4 68 из фиг.2 (SEQ ID NO:3).

29. Способ прогнозирования чувствительности клеток злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальных раковых клеток млекопитающего к антителу DR5 рецептора, включающий стадии:
получение клеток злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальных раковых клеток млекопитающего;
исследование раковых клеток для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис А и/или Х антигена(ов), где экспрессия указанных одного или нескольких биомаркеров является показателем того, что указанные раковые клетки чувствительны к апоптоз-индуцирующей активности антитела DR5 рецептора.

30. Способ по п.29, где указанное антитело DR5 рецептора представляет собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.

31. Способ по п.29, где указанное антитело DR5 рецептора связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-411 из фиг.3А (SEQ ID NO:5).

32. Способ индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальных раковых клеток млекопитающих, включающий стадии: получение клеток злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальных раковых клеток млекопитающих, исследование раковых клеток для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис А и/или Х антигена(ов), и последующее определение экспрессии вышеупомянутых одного или нескольких биомаркеров, воздействие на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством антитела-агониста DR5.

33. Способ по п.32, где указанное антитело-агонист DR5 представляет собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.

34. Способ по п.32, где указанное антитело-агонист DR5 связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-411 из фиг.3А (SEQ ID NO:5).

35. Способ лечения рака толстой кишки и колоректального рака у млекопитающего, включающий стадии:
получение образца рака толстой кишки или колоректального рака из указанного млекопитающего;
исследование образца рака для определения экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, сиалил-Льюис А и/или Х антигена(ов), и последующее определение экспрессии указанного одного или нескольких биомаркеров, введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела-агониста DR5.

36. Способ по п.35, где указанное антитело-агонист DR5 представляет собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело.

37. Способ по п.35, где указанное антитело-агонист DR5 связывает аминокислотную последовательность, содержащую остатки 1-411 из фиг.3А (SEQ ID NO:5).

Images