RU2404812C1

RU2404812C1 - Способ получения радиоактивно меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина и способ его применения для диагностики злокачественных новообразований

Info

Publication number: RU2404812C1
Application number: RU2009109345/15A
Authority: RU
Inventors: Евгений Сергеевич Северин (RU); Евгений Сергеевич Северин; Виктор Николаевич Кулаков (RU); Виктор Николаевич Кулаков; Елизавета Юрьевна Москалева (RU); Елизавета Юрьевна Москалева; Тамара Петровна Климова (RU); Тамара Петровна Климова; Илья Игоревич Слободяник (RU); Илья Игоревич Слободяник; Сергей Евгеньевич Северин (RU); Сергей Евгеньевич Северин
Original assignee: Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи")
Priority date: 2009-03-16
Filing date: 2009-03-16
Publication date: 2010-11-27
Also published as: RU2009109345A

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Для приготовления меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина получают раствор альфа-фетопротеина, помещенного в ампулу. Ампулу с радиоактивным йодом-123, йодом-125 (¹²⁵I-АФП) или йодом-131 промывают фосфатным буферным раствором, который затем вводят в ампулу с альфа-фетопротеином. В результате получают смесь йодида и альфа-фетопротеина. В смесь добавляют раствор хлорамина-Б в фосфатном буферном растворе. Затем полученную смесь перемешивают в течение 2-5 с и вносят в нее натрий сульфит для остановки реакции с продолжением перемешивания в течение 50-70 с. После чего вносят сывороточный альбумин человека в фосфатном буферном растворе и наносят полученную смесь на колонку с сефадексом с последующим объединением фракций, содержащих радиоактивный белок. Для диагностики злокачественных новообразований пациенту вводят внутривенно меченный радионуклидами йода альфа-фетопротеин и в период от 5 до 24 часов после введения производят сцинтиграфию. Использование способа позволяет повысить чувствительность и оперативность диагностики злокачественных новообразований за счет применения полученного в соответствии с вышеуказанным способом меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина, который избирательно накапливается в опухолевой ткани. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

Description

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения радиоактивно меченных онкофетальных белков, в том числе альфа-фетопротеина, и их использования для диагностики злокачественных заболеваний.

Известен способ получения препарата альфа-фетопротеина из эмбриональной ткани человека, включающий обработку исходной ткани бутиловым спиртом, центрифугирование при 6000 об/мин в течение 30 минут, диализ водно-белковой фазы против 0.9% раствора хлористого натрия, аффинную хроматографию отдиализованной водно-белковой фазы на иммобилизованных эстрогенах с последующим элюированием альфа-фетопротеина бутиловым спиртом или смесью бутилового спирта с буферным раствором, при этом выход целевого продукта составляет 60-70%, а чистота - 90-95% [SU 583536, A61K 37/02, 05.10.1979].

Недостатками способа являются недостаточный выход и чистота целевого продукта.

Известен также способ получения альфа-фетопротеина, включающий измельчение и гомогенизацию эмбриональной ткани зародышей человека 8-12 недель, полученных при медицинских абортах, центрифугирование гомогената при 5000 об/мин, сбор супернатанта, осветление супернатанта центрифугированием при 12000 об/мин, очистку целевого продукта хроматографией на DE-целлюлозе, очистку целевого продукта хроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем Цибакрон-голубой F36A, очистку целевого продукта рехроматографией на сефадексе G-100 с иммобилизованным на нем красителем Цибакрон-голубой F36A и доочистку целевого продукта хроматографией на DE-целлюлозе [K. Hause et al. Clinica Chemica Acta, 133, 1983, 335-340].

Недостатками этого технического решения являются длительность и трудоемкость процесса выделения альфа-фетопротеина, значительные изменения состава пула альфа-фетопротеина и денатурация части молекул, приводящие к низкому выходу конечного продукта (25-30%) и к снижению его качества (чистота препарата 85-90%), а также низкая стабильность при хранении.

Наиболее близким по своей сущности к предложенному способу получения альфа-фетопротеина является способ, включающий осветление исходного сырья центрифугированием и хроматографическую очистку целевого продукта на аффинном сорбенте, причем перед центрифугированием в сырье добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 0,5M, а хроматографическую очистку проводят последовательно в три стадии, сначала на иммуноаффинном сорбенте, содержащем поликлональные антитела к альфа-фетопротеину, при этом элюцию альфа-фетопротеина с сорбента осуществляют 4M раствором хлорида магния, полученную фракцию альфа-фетопротеина дополнительно очищают ультрафильтрацией и гель-фильтрацией, а затем проводят хроматографическую очистку элюата на иммуноаффинном сорбенте, содержащем комплекс поликлональных антител против белков сыворотки крови человека и против иммуноглобулинов сыворотки крови животного, далее в целевой продукт вводят хлорид натрия и полисахарид, стерилизуют фильтрацией и лиофильно высушивают или хранят в виде раствора.

Кроме того, для приготовления аффинного сорбента используют BrCN-сефарозу или BrCN-агарозу, иммуноаффинная смола на стадии первой хроматографии содержит 5-10 мг/мл поликлональных антител к альфа-фетопротеину, истощенных против белков сыворотки крови человека, а на стадии второй иммуноаффинной хроматографии содержит 5-10 мг/мл комплекса антител против белков сыворотки крови человека и против иммуноглобулинов сыворотки крови животного, использованного для получения антител к альфа-фетопротеину, в качестве полисахарида используют полисахарид типа декстрана, выбранный из группы: полиглюкин, реополиглюкин, реомакродекс, лиофильное высушивание целевого продукта осуществляют в присутствии 5-50 мг/мл хлорида натрия и 2-30 мг/мл полисахарида, а в жидкую форму препарата альфа-фетопротеина вводят хлорид натрия в концентрации 9-50 мг/мл и полисахарид в концентрации 10-50 мг/мл [RU 2123009, C1, A61K 35/14, 10.12.1998].

Кроме того, альфа-фетопротеин используется для приготовления противоопухолевых препаратов направленного действия для избирательного поражения опухолевых клеток [Конъюгаты биологически активных веществ с альфа-фетопротеином, обладающие избирательным действием по отношению к раковым опухолям, способ их получения (варианты) и фармацевтическая композиция на их основе. Патент 2071351, (21) 96113877/14; (22) 23.07.96; (46) 10.01.96].

Недостатком способа является относительно узкая область применения, поскольку по известному способу не удается получить радиоактивно меченный альфа-фетопротеин, который, как будет показано ниже, может быть эффективно использован при диагностике злокачественных образований.

Требуемый результат относительно способа получения радиоактивно меченного альфа-фетопротеина достигается тем, что по способу, заключающемуся в получении раствора альфа-фетопротеина, помещенного в ампулу, дополнительно промывают ампулу с радиоактивным йодом-123, йодом-125 (¹²⁵I-АФП) или йодом-131 фосфатным буферным раствором, который затем вводят в ампулу с альфа-фетопротеином, получая смесь йодида и альфа-фетопротеина, в которую добавляют раствор хлорамина-Б в фосфатном буферном растворе, а затем полученную смесь перемешивают в течение 2-5 с и вносят в нее натрий сульфит для остановки реакции с продолжением перемешивания в течение 50-70 с, после чего вносят сывороточный альбумин человека в фосфатном буферном растворе и наносят полученную смесь на колонку с сефадексом с последующим объединением фракций, содержащих радиоактивный белок.

Кроме того, известны способы диагностики и лечения злокачественных новообразований.

Например, известен способ диагностики онкологических заболеваний с помощью радиоизотопного метода, при котором используются радиоактивные изотопы: ³²P, ⁸⁵Sr, ⁹⁹Tc, после внутривенных инъекций которых млекопитающее сканируют и определяют остаточную дозу излучения и по величине максимального излучения судят о месте расположения опухоли [Долгушин Б.И. Методы лучевой диагностики в онкологии. Энциклопедия клинической онкологии. Главный ред. Давыдов М.И. Москва, РЛС-2004, с.30-33].

Недостатком способа является относительно высокая опасность для здоровья пациента и окружающих.

Наиболее близким по своей сущности к предложенному является способ диагностики злокачественных заболеваний, заключающийся в том, что последовательно внутривенно вводят 1-1000 мкл 1-10% золя декстранферрита в виде наночастиц диаметром 20-900 нм в полиглюкине из расчета не более 2,92 мг Fe/кг веса животного, магневист в дозе 3-12 мкл с последующим проведением магнитно-резонансной томографии тела животного при T₁-, Т₂-взвешенной градиент-эхопоследовательности и на основании результатов визуального анализа полученных изображений диагностируют наличие опухолей, метастазов и границ инвазии опухолевых клеток в здоровые ткани, при этом декстран феррит вводят за 20-40 ч, а магневист за 4-12 мин до проведения магнитно-резонансной томографии [RU 2343828, C2, A61B 5/055, A61K 49/06, 20.01.2009].

Недостатком наиболее близкого решения является относительно низкая оперативность диагностики, поскольку она проводится через 20-40 часов после введения первого из препаратов - декстрана феррита.

Требуемый технический результат относительно способа диагностики злокачественных новообразований заключается в повышении оперативности и повышении чувствительности диагностики.

Требуемый технический результат относительно способа диагностики злокачественных новообразований достигается тем, что вводят пациенту внутривенно радиоактивный препарат, после чего производят сцинтиграфию для визуализации злокачественных новообразований, причем в качестве радиоактивного препарата используют радиоактивно меченный радионуклидами йода-123, йода-125 или йода-131 альфа-фетопротеин в форме водно-солевого раствора, содержащего сывороточный альбумин человека, а сцинтиграфию производят в период от 1 до 5 часов после введения пациенту радиоактивно меченного радионуклидами йода-123, йода-125 или йода-131 альфа-фетопротеина.

В качестве графических материалов представлены: таблица 1 - характеристика меченных разными радионуклидами йода препаратов альфа-фетопротеина, таблица 2 - влияние степени йодирования АФП на его иммунохимическую активность, таблица 3 - распределение ¹²⁵I-АФП в органах и крови (внутривенное введение), фиг.1 - динамика изменения концентрации ¹²⁵I в мышцах в сравнении с опухолевой тканью, фиг.2 - отношение радиоактивности опухоли и мышц и опухоли и крови, на фиг.3 - скорость выведения ¹³¹I-АФП из места инъекции.

Реализуются предложенные способ получения радиоактивно меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина и способ его применения для диагностики злокачественных новообразований следующим образом.

Создание новых высокоэффективных препаратов для диагностики и терапии онкологических заболеваний заставляет искать соединения с высокой тропностью к раковым клеткам. Одним из перспективных путей решения этой проблемы является поиск опухолевых рецепторов, отсутствующих в нормальных тканях, и использование их в качестве специфических мишеней для выявления методами радионуклидной медицины.

В зависимости от особенностей экспрессии различают три группы опухолевых антигенов.

Антигены первой группы кодируются генами, которые экспрессируются в опухолях различных типов, но не в нормальных тканях взрослого организма (за исключением семенников и плаценты). Это семейства генов MAGE, BAGE, GAGE, RAGE и др.

К опухолевым антигенам другой группы относятся белки, гены которых в опухоли мутированы, например ген циклин-зависимой киназы 4 в различных меланомах или ген p53 в различных опухолях.

Опухолевые антигены третьей группы составляют белки, гены которых гиперэкспрессированы в опухоли. К последнему типу могут быть отнесены некоторые тканеспецифические антигены и такие белки, как рецепторы некоторых факторов роста, например эпидермального фактора роста, трансферрина и рецептора альфа-фетопротеина. С этой точки зрения рецептор альфа-фетопротеина представляет большой интерес, т.к. этот белок во взрослом организме обнаруживается исключительно в опухолевых клетках различных типов. Важно подчеркнуть, что его экспрессия не обнаруживается в нормальных клетках даже в зоне опухоли и отсутствует в доброкачественных опухолях, за исключением миксомы сердца - доброкачественной опухоли эмбрионального происхождения. В настоящее время рецептор альфа-фетопротеина рассматривается как универсальный опухолевый маркер. Для выявления этого рецептора, а значит и опухолевых клеток в исследуемых тканях организма, может использоваться природный или рекомбинантный альфа-фетопротеин, или его фрагменты, или антитела к его рецептору, или их фрагметы, способные связываться с рецептором альфа-фетопротеина.

Альфа-фетопротеин - гликопротеин с молекулярной массой 70 кДа, состоящий из одной полипептидной цепи. Альфа-фетопротеин является одним из основных белков периферической крови млекопитающих в период эмбрионального развития. Система альфа-фетопротеин-рецептор альфа-фетопротеина в период эмбрионального развития обеспечивает транспорт пластического материала - жирных кислот - в интенсивно пролиферирующие клетки плода по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза. Этот же механизм функционирует в опухолевых клетках. Альфа-фетопротеин отличается высокой степенью консервативности и незначительными межвидовыми различиями, что позволяет исследовать некоторые свойства альфа-фетопротеина человека на экспериментальных животных.

Важно также подчеркнуть, что для высокого накопления меченого белка в ткани-мишени важно избежать его инактивации в процессе введения радиоактивного йода в результате воздействия окислителя или в результате замены в белке части остатков тирозина на его йодированные аналоги.

Для приготовления радиоактивно меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина в зависимости от задач используют один из радионуклидов йода - йод-123, йод-125 (¹²⁵I-АФП) или йод-131.

Ниже подробно рассмотрен пример для йода-125. Для этого ампулу с радиоактивным йодом (йод-125 в щелочном растворе без восстановителей, в химической форме йодид, общая радиоактивность 185 МБк) промывали 0,5 мл фосфатного буферного раствора (PBS - ионная сила 0,1, pH 7,2) последовательно порциями по 0,2, 0,2 и 0,1 мл. Полученный раствор (содержание йодида - 185 МБк) добавляли во флакон с 1 мг альфа-фетопротеина (АФП) и затем в смесь йодида и АФП добавляли раствор, содержащий 100 мкг хлорамина-Б в 0,1 мл PBS. Через 3 с перемешивания в раствор вносили 40 мкл водного раствора с 400 мкг натрия сульфита для остановки реакции. Через 1 мин перемешивания в реакционную смесь вносили 1 мг сывороточного альбумина человека (HSA) в 0,5 мл PBS. Смесь наносили на колонку PD-10 (Pharmacia) с сефадексом G-25 (средний). На всех этапах использовали стерильные растворы, приготовленные на апирогенной воде. Фракции, содержащие радиоактивный белок, объединяли. Общий объем раствора, меченного иодом-125 АФП, - 6,5 мл, выход - 60,2%.

Очистку от оставшегося несвязанного с АФП радиоактивного йодида осуществляли методом «ловушек», внося в раствор меченного йодом-125 белка анионообменную смолу MSA-1 в Cl^--форме [Bajenova T.L., Mojaisky A.M., Kulakov V.N. et al. Получение радиоактивных препаратов. IV. Выбор оптимального адсорбента для очистки меченых микроагрегатов альбумина от неорганических форм йода. // Isotopenpraxis, 1972, Bd. 8, №11-12, 460-462]. Полученный препарат стерилизовали с помощью фильтрования через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Радиохимическую чистоту ¹²⁵I-АФП определяли с помощью электрофореза на бумаге [Кулаков В.Н. Экспресс-метод определения радиохимической чистоты радиофармацевтических препаратов на основе белков. Экспресс-метод определения радиохимической чистоты радиофармацевтических препаратов на основе белков. // Хим.-фарм. журнал, 1988, № 4, 503-506] (350 B, 30 мин, фосфатный буферный раствор, pH 8,0).

Сущность предложенного способа приготовления радиоактивно меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина заключается в следующем.

Альфа-фетопротеин человека выделяют из ретроплацентарной сыворотки рожениц с помощью аффинной хроматографии после осаждения высокомолекулярных белков с использованием моноклональных антител к альфа-фетопротеину [Severin S.Е., Е.Yu.Moskaleva, G.A.Posypanova et al. In vivo antitumor activity of cytotoxic drugs conjugated with human alfa-fetoprotein. Tumor targeting 1996, 2, 299-306; Северин C.E., Посыпанова Г.A., Сотниченко А.И., Посыпанова Г.А., Москалева Е.Ю., Григорьев М.И., Северин Е.С., Петров Р.В. "Противоопухолевая активность ковалентного конъюгата ендиинового антибиотика эсперамицина A_1b, с α-фетопротеином человека" Доклады Академии наук, 1999, т.366, № 4, стр.561-564]. Очищенный белок стерилизуют с помощью фильтрования через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, лиофилизируют и хранят при +4°C.

Пример приготовления радиоактивно меченного альфа-фетопротеина ¹²⁵I-АФП.

Для приготовления ¹²⁵I-АФП ампулу с радиоактивным йодом (йод-125 в щелочном растворе без восстановителей, в химической форме йодид, общая радиоактивность 185 МБк, промывали 0,5 мл фосфатного буферного раствора (PBS, ионная сила 0,1; pH 7,2) последовательно порциями по 0,2, 0,2 и 0,1 мл. Полученный раствор (содержание йодида - 185 МБк) добавляли во флакон с 1 мг АФП и затем в смесь йодида и АФП добавляли раствор, содержащий 100 мкг хлорамина-Б в 0,1 мл PBS. Через 3 с перемешивания в раствор вносили 40 мкл водного раствора с 400 мкг натрия сульфита для остановки реакции. Через 1 мин перемешивания в реакционную смесь вносили 1 мг сывороточного альбумина человека (HSA) в 0,5 мл PBS. Смесь наносили на колонку PD-10 (Pharmacia) с сефадексом G-25 (средний). Фракции, содержащие радиоактивный белок, объединяли. Общий объем раствора, меченного иодом-125 АФП, - 6,5 мл, выход - 60,2%. Очистку от оставшегося несвязанного с АФП радиоактивного йодида осуществляли методом «ловушек», внося в раствор меченного йодом-125 белка анионообменную смолу MSA-1 в Cl^--форме. Радиохимическую чистоту ¹²⁵I-АФП определяли с помощью электрофореза на бумаге (350 B, 30 мин, фосфатный буферный раствор, pH 8,0).

При изучении влияния степени модификации АФП йодом по остаткам тирозина на его иммунохимическую активность были выполнены эксперименты с использованием для йодирования АФП нерадиоактивного монохлористого йода. Количество модифицированных остатков тирозина в АФП определяли с помощью метода разностной спектрофотометрии.

Известно, что в молекуле АФП содержится 17 остатков тирозина. Полученные результаты представлены в таблице 1 и из них следует, что обнаруженное статистически малозначимое изменение иммунохимической активности АФП практически не зависит от количества модифицированных остатков при йодировании от 1 до 10 из 17 остатков тирозина, присутствующих в молекуле этого белка. Наблюдаемое при йодировании небольшое снижение иммунохимических свойств АФП, возможно, связано с действием окислителей, присутствующих в реакционной смеси. Полученные результаты позволяют полагать, что модификация остатков тирозина АФП при введении в его молекулу радиоактивного йода не приведет к необратимым структурным повреждениям белковой молекулы, а следовательно, и его способности связываться со своим специфическим рецептором на опухолевых клетках. Для введения йода-125 в молекулу белка использован хлорамин-Б, который является более слабым окислителем, чем монохлористый йод, что позволяет проводить йодирование в более мягких условиях и снизить риск повреждения белка в процессе введения радиоактивного йода.

Приготовленный стерильный раствор меченного радиоактивным йодом-125 препарата АФП - 1251-АФП - имел следующие характеристики: pH - 7,2; ионная сила - 0,1; общая радиоактивность - 111 МБк; удельная радиоактивность - 17,2 МБк/мл, концентрация АФП - 91 мкг/мл. Образец ¹²⁵I-АФП, предназначенный для исследования фармакокинетики, характеризовали, кроме того, по уровню радиохимической чистоты. Радиохимическая чистота препарата ¹²⁵I-АФП, определенная с помощью электрофореза на бумаге, составила 98,5%.

Сущность способа диагностики злокачественных новообразований заключается в следующем.

Эффект от применения радиоактивно меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина для диагностики злокачественных новообразований был выявлен при проведении радиоизотопных фармакокинетических исследований и заключается в следующем.

Полученный описанным выше способом радиоактивно меченный радионуклидами йода альфа-фетопротеин в форме стерильного водно-солевого раствора, содержащего сывороточный альбумин человека в качестве стабилизатора, вводят пациенту внутривенно, после чего в период от 5 до 24 часов после введения производят сцинтиграфию для визуализации злокачественных образований.

Для проведения радиоизотопных фармакокинетических исследований мышам-самкам линии DBA2 весом 20 г прививали опухолевые клетки лимфолейкоза мыши линии P388 (1 млн/мл в 0,1 мл физиологического раствора под кожу в область спины).

Животных содержали в стандартных клетках и кормили гранулированным кормом ad libitum. Спустя 2 недели у них развивались выявляемые при пальпации опухоли диаметром 1-2 мм. Для исследования распределения меченного иодом-125 альфа-фетопротеина человека в органах интактных мышей и мышей с привитой опухолью им внутривенно в хвостовую вену вводили ¹²⁵I-АФП в форме водно-солевого раствора, содержащего сывороточный альбумин человека в качестве стабилизатора. Вводимая доза: 0,1 мл раствора радиоактивного маркера (9 мкг белка). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таким образом, при использовании описанного способа приготовления стерильного радиоактивно меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина у животных с привитой опухолью наблюдается замедление скорости выведения маркера из организма и существенное накопление ¹²⁵I-альфа-фетопротеина в опухоли. Закономерности накопления радиоактивного альфа-фетопротеина в опухоли в поздние сроки (3 сутки) согласуются с известными литературными данными. В то же время, выявленные особенности фармакокинетики ¹²⁵I-альфа-фетопротеина в ранние сроки - до 5-24 часов после его введения - обнаружены впервые и позволяют полагать, что уже в период от 5 до 24 часов после введения препарата исследование его содержания в разных тканях и органах с помощью сцинтиграфии является информативным для визуализации опухолей.

Примеры осуществления способа диагностики злокачественных новообразований.

Пример 1.

К препарату нативного альфа-фетопротеина (1 мг), полученного из ретроплацентарной сыворотки рожениц, добавляли раствор йодида-125 (содержание йодида - 185 МБк) и затем в смесь йодида и альфа-фетопротеина добавляли раствор, содержащий 100 мкг хлорамина-Б в 0,1 мл PBS. Через 3 с перемешивания в раствор вносили 40 мкл водного раствора с 400 мкг натрия сульфита и через 1 мин перемешивания вносили 1 мг сывороточного альбумина человека (HSA) в 0,5 мл PBS. Радиоактивный белок выделяли на колонке PD-10 (Pharmacia) с сефадексом G-25 (средний). Радиохимическая чистота ¹²⁵I-альфа-фетопротеина составляла 97,5%.

Мышам-самкам линии C57Вlаск весом 22 г прививали опухолевые клетки рака молочной железы мыши линии Ca755 (1 млн/мл в 0,1 мл физиологического раствора под кожу в область подмышечной впадины). Животных содержали в стандартных клетках и кормили гранулированным кормом ad libitum. Спустя 2 недели у них развивались выявляемые при пальпации опухоли диаметром 1-2 мм. Для исследования распределения меченного иодом-125 альфа-фетопротеина человека в органах интактных мышей и мышей с привитой опухолью им внутривенно в хвостовую вену вводили ¹²⁵I-альфа-фетопротеин в форме водно-солевого раствора, содержащего сывороточный альбумин человека в качестве стабилизатора. Вводимая доза: 0,1 мл раствора радиоактивного маркера (10 мкг ¹²⁵I-альфа-фетопротеин, 0,72 МБк/мышь). Исследовали динамику изменения концентрации ¹²⁵I в мышцах мышей в сравнении с опухолевой тканью. Полученные результаты представлены на фиг.1.

Изменение концентрации ¹²⁵I в мышцах мышей в сравнении с опухолевой тканью свидетельствует о высокой избирательности содержания препарата в ткани опухоли в период от 1 до 72 часов включительно при максимальной концентрации в опухоли в период от 1 до 5 час.

При анализе отношения радиоактивности проб опухоли и мышц и опухоли и крови мышей с имплантированной опухолью Ca755 в динамике после в/в введения ¹²⁵I-альфа-фетопротеина, представленного на фиг.2 показано, что радиоактивный маркер накапливается в опухоли. Содержание радиоактивности в опухоли уже через 1 час после введения меченого альфа-фетопротеина превышает ее содержание в мышце более чем в 3 раза.

Полученные различия достаточны для хорошей визуализации опухоли. В то же время величина отношения радиоактивности опухоль/кровь достигает 1 только через 1 сутки после введения маркера и продолжает возрастать в течение нескольких последующих суток.

Пример 2.

Саркому S-45 прививали крысам в мышцу задней конечности путем введения 0,5 млн опухолевых клеток и после развития опухоли животным интратуморально - в центр опухоли - вводили 0,1 мл раствора радиоактивного маркера ¹³¹I-альфа-фетопротеин (0,68 МБк, 7 мкг белка). Скорость элиминации радиоактивного препарата после внутримышечного и интратуморального введения раствора ¹³¹I-альфа-фетопротеина регистрировали с помощью интенсиметра фирмы Гамма (Венгрия). Животных закрепляли на станке, помещали под коллимированный детектор и затем инъецировали маркер. Сразу после инъекции начинали регистрацию изменения радиоактивности в месте введения. Распределение введенного внутривенно ¹³¹I-альфа-фетопротеина по органам и тканям экспериментальных животных проводили прямой радиометрией биологических образцов, выделенных из тушек забитых животных в разные сроки после инъекции маркера с помощью пересчетного устройства фирмы Гамма (Венгрия).

Такое исследование позволяет путем сравнительного изучения скорости выведения меченого маркера, введенного в мышцу и опухоль крысы (саркома S-45), оценить специфичность накопления и удержания альфа-фетопротеина в опухоли.

Полученные результаты представлены на фиг.3. Они показывают, что меченный иодом ¹³¹I альфа-фетопротеин избирательно накапливается и удерживается в опухолевой ткани. Так через 10 мин после введения ¹³¹I-альфа-фетопротеина в опухоль в месте инъекции обнаруживается 50% радиоактивности, через 30 мин - 42%, в то время как после введения в мышцу уже спустя 10 мин в этом месте обнаруживается только 24% радиоактивности, и этот же уровень сохраняется и через 30 мин.

Таким образом, предложен способ приготовления меченного радионуклидом йода стерильного препарата альфа-фетопротеина, который избирательно накапливается в опухолевой ткани и может быть использован в качестве основы радиофармпрепарата для раннего выявления опухолей с помощью радионуклидной сцинтиграфии и других методов ядерной медицины. Использование препарата позволяет повысить оперативность диагностики.

Таблица 2
№ п/п	Количество введенного ICl		Количество модифицированных остатков тирозина в молекуле АФП			Иммунохимическая активность, %
№ п/п	Объем (мкл)	Конечная концентрация (мМ)	МИТ	ДИТ	МИТ+ДИТ	Иммунохимическая активность, %
1	0	0	0	0	0	100,0±8,0
2	20	4	0,43±0,18	0,37±0,22	0,79±0,12	74,2±3,5
3	20	20	4,50±2,10	3,10±0,22	7,70±3,90	78,7±9,5

Таблица 3

Орган/ткань

Накопление АФП-¹²⁵I в разные сроки после введения, % от введенной радиоактивности

3 мин

15 мин

30 мин

60 мин

3 час

5 час

1 сут

2 сут

3 сут

Интактные мыши

Кровь

56.5±1.8

50.0±3.2

50.4±1.0

42.1±3.4

32.9±2.7

21.0±1.2

4.2±0.7

0.5±0.0

0

Печень

12.7±1.0

11.5±0.3

10.7±0.5

8.8±0.7

5.8±0.3

4.8±0.2

1.3±0.1

0.9±.0.2

0.8±0.1

Почки

3.1±0.1

3.0±0.2

2.6±0.2

2.2±0.1

1.8±0.1

1.6±0.0

0.2±0.0

0

Селезенка

0.8±0.1

0.6±0.0

1.0±0.2

0.6±0.1

0.5±0.0

0.6±0.1

0

Легкие

8.5±1.0

8.3±1.6

8.7±1.4

4.2±0.4

3.2±0.8

3.0±0.3

0.7±0.1

0

Желудок

1.5±0.2

3.2±0.3

2.7±0.3

2.5±0.1

4.1±0.4

2.1±0.2

0.9±0.1

0

Кишечник (%/г)

4.6±0.4

7.0±0.7

7.9±0.5

7.8±0.4

8.5±0.4

6.5±0.1

2.1±0.1

1.2±0.2

1.0±0.2

Мышца (%/г)

0.3±0.0

1.5±0.2

1.7±0.2

1.5±0.1

1.8±0.2

2.0±0.1

0

Щитовидная железа

-

8.2±0.1

-

21.3±3.5

21.4±3.1

15.2±2.7

Головной мозг

0.6±0.0

0.4±0.0

0.3±0.1

0.4±0.0

0.2±0.0

0

Моча

-

5.5±2.3

16.3±1.1

-

Бедро

0.6±0.0

0.5±0.0

0.4±0.1

0.7±0.1

0

-

Мыши с привитой опухолью (лимфолейкоз мыши P388)

Кровь

72.0±5.5

53.0±4.4

51.0±6.8

39.7±1.6

31.1±25

19.0±1.2

3.3±0.2

0.6±0.0

0.9±0.1

Печень

8.3±0.5

11.2±0.3

10.0±1.0

6.3±0.4

7.6±0.4

3.3±0.1

-

0.6±0.0

Почки

1.7±0.1

2.7±0.1

2.0±0.1

0.6±0.1

0.4±0.0

1.6±0.0

-

0

Селезенка

0.8±0.1

0.8±0.0

0.5±0.1

0.6±0.1

0.4±0.0

-

0

Легкие

4.6±1.0

6.5±0.7

3.2±0.2

3.3±0.7

2.3±0.6

1.8±0.1

-

0.1±0.0

Желудок

0.7±0.1

1.0±0.1

1.2±0.2

2.0±0.1

1.6±0.3

3.2±0.5

-

0.1±0.0

Кишечник (%/г)

2.1±0.2

4.7±0.4

3.4±0.2

4.9±0.3

5.5±0.6

5.2±0.2

-

0.5±0.0

Мышца (%/г)

1.1±0.1

1.4±0.1

1.3±0.1

1.6±0.2

1.9±0.1

1.5±0.1

0

Щитовидная железа

-

1.6±0.1

2.4±0.6

8.0±0.3

8.3±0.2

7.4±0.1

Головной мозг

0.3±0.0

0.4±0.0

0.3±0.0

0.2±0.0

0.1±0.0

0

Моча

-

1.7±0.7

-

Бедро

0.4±0.1

0.4±0.0

0.6±0.1

0.5±0.1

0.5±0.0

0.4±0.0

-

Опухоль

2.9±0.5

3.7±0.2

4.2±0.2

5.5±0.4

6.0±0.5

5.0±0.4

1.2±0.1

0.8±0.1

0.7±0.1

Claims

1. Способ получения радиоактивного меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина, заключающийся в получении раствора альфа-фетопротеина, помещенного в ампулу, для чего промывают ампулу с радиоактивным йодом-123, йодом-125 (¹²⁵I-АФП) или йодом-131 буферным раствором, который затем вводят в ампулу с альфа-фетопротеином, получая смесь йодида и альфа-фетопротеина, в которую добавляют хлорамин в буферном растворе, а затем в полученную смесь вносят натрий сульфит для остановки реакции, после чего через 50-70 с вносят сывороточный альбумин человека в буферном растворе и наносят полученную смесь на колонку с сефадексом с последующим объединением фракций, содержащих радиоактивный белок, отличающийся тем, что в качестве хлорамина в буферном растворе используют раствор хлорамина-Б в фосфатном буферном растворе, смесь йодида и альфа-фетопротеина с хлорамином в буферном растворе перед внесением в нее натрий сульфита для остановки реакции перемешивают в течение 2-5 с, а после внесения натрий сульфита перед внесением сывороточного альбумина человека в буферном растворе проводят перемешивание в течение 50-70 с, а в качестве буферного раствора используют фосфатный буферный раствор, а для дополнительной очистки после очистки на сефадексе используют метод ловушек с анионообменной смолой в Сl^--форме.

2. Способ диагностики злокачественных новообразований, основанный на введении пациенту внутривенно радиоактивного меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина, полученного по способу п.1, после чего производят сцинтиграфию для визуализации злокачественных новообразований, отличающийся тем, что сцинтиграфию производят в период от 5 до 24 ч после введения пациенту внутривенно указанного радиоактивного меченного радионуклидами йода альфа-фетопротеина.