RU2400490C2 - Glyco-peg granulocyte colony-stimulating factor - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to granulocyte colony-stimulating factor peptide conjugates formed by linkage through an intact glycosyl linker group of (polyethylene glycol) PEG fragments. Said conjugates are obtained from glycosylated and non-glycosylated peptides under the effect of glycosyl transferase. Glycosyl transferase links a fragment of modified sugar to an amino acid or glycosyl peptide residue.

EFFECT: improved method.

35 cl, 24 dwg, 2 tbl, 6 ex

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявкиCross references to related applications

В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США № 60/526796, поданной 3 декабря 2003; предварительной заявке на патент США № 60/555813, поданной 23 марта 2004; предварительной заявке на патент США № 60/570282, поданной 11 мая 2004; предварительной заявке на патент США № 60/539387, поданной 26 января 2004; предварительной заявке на патент США № 60/592744, поданной 29 июля 2004; предварительной заявке на патент США № 60/614518, поданной 29 сентября 2004, и предварительной заявке на патент США № 60/623387, поданной 29 октября 2004, каждая из которых во всей своей полноте и для всех целей осуществления изобретения вводится в настоящее описание посредством ссылки.This application claims priority for provisional patent application US No. 60/526796, filed December 3, 2003; provisional application for US patent No. 60/555813, filed March 23, 2004; provisional application for US patent No. 60/570282, filed May 11, 2004; provisional application for US patent No. 60/539387, filed January 26, 2004; provisional application for US patent No. 60/592744, filed July 29, 2004; provisional application for US patent No. 60/614518, filed September 29, 2004, and provisional application for US patent No. 60/623387, filed October 29, 2004, each of which in its entirety and for all purposes of the invention is incorporated into this description by reference .

Уровень техникиState of the art

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) представляет собой гликопротеин, который стимулирует выживание, пролиферацию, дифференцировку и осуществление функций клеток-предшественников нейтрофилов-гранулоцитов и зрелых нейтрофилов. В клинических целях используются две формы рекомбинантного человеческого G-CSF, которые являются сильными стимуляторами гранулопоэза нейтрофилов и имеют продемонстрированную эффективность в предупреждении инфекционных осложнений при некоторых нейтропениях. Они могут быть использованы для ускорения восстановления нейтрофилов после лечения миелодепрессантами.Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is a glycoprotein that stimulates the survival, proliferation, differentiation and implementation of the functions of progenitor cells of granulocyte neutrophils and mature neutrophils. For clinical purposes, two forms of recombinant human G-CSF are used, which are potent stimulators of neutrophil granulopoiesis and have been shown to be effective in preventing infectious complications in certain neutropenia. They can be used to accelerate the recovery of neutrophils after treatment with myelosuppressants.

G-CSF способствует снижению тяжести осложнений, вызываемых противораковой химиотерапией, благодаря уменьшению случаев развития фебрильной нейтропении и тяжести осложнений, вызываемых высокодозовой химиотерапией, проводимой в сочетании с трансплантацией костного мозга, а также способствует уменьшению случаев возникновения и продолжительности инфекционных заболеваний у пациентов с тяжелой хронической нейтропенией. Недавно было продемонстрировано, что G-CSF обладает терапевтическим действием при его введении после начала инфаркта миокарда.G-CSF helps reduce the severity of complications caused by anticancer chemotherapy by reducing the incidence of febrile neutropenia and the severity of complications caused by high-dose chemotherapy in combination with bone marrow transplantation, and also reduces the incidence and duration of infectious diseases in patients with severe chronic neutropenia . It has recently been demonstrated that G-CSF has a therapeutic effect when administered after the onset of myocardial infarction.

Человеческая форма G-CSF была клонирована исследователями Японии и США в 1986 (см., например, Nagata et al., Nature 319:415-418, 1986). Природный человеческий гликопротеин присутствует в двух формах: одна из них состоит из 175 аминокислот, а другая - из 178 аминокислот. Превалирующая и более активная форма, состоящая из 175 аминокислот, была использована в продуцировании фармацевтических продуктов методом рекомбинантных ДНК.The human form of G-CSF was cloned by researchers in Japan and the United States in 1986 (see, for example, Nagata et al., Nature 319: 415-418, 1986). Natural human glycoprotein is present in two forms: one of them consists of 175 amino acids, and the other of 178 amino acids. The prevailing and more active form, consisting of 175 amino acids, was used in the production of pharmaceutical products by the method of recombinant DNA.

Рекомбинантный человеческий G-CSF, синтезированный в экспрессионной системе E.coli, был назван филграстимом. Структура филграстима несколько отличается от структуры природного гликопротеина. Другая форма рекомбинантного человеческого G-CSF называется ленограстимом и была синтезирована в клетках яичника китайского хомячка (СНО).Recombinant human G-CSF synthesized in the E. coli expression system was called filgrastim. The structure of filgrastim is somewhat different from the structure of natural glycoprotein. Another form of recombinant human G-CSF is called lenograstim and was synthesized in Chinese hamster ovary (CHO) cells.

hG-CSF представляет собой мономерный белок, который димеризует рецептор G-CSF посредством образования комплекса 2:2 из 2 молекул G-CSF и двух рецепторов (Horan et al., Biochemistry 35(15):4886-96 (1996)). В исследованиях, проводимых с помощью рентгеновской кристаллографии, нижеследующие остатки hG-CSF были идентифицированы как часть контактных областей, связывающихся с рецептором, а именно такие остатки, как G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123 и L124 (см., например, Aritomi et al. (1999) Nature 401:713).hG-CSF is a monomeric protein that dimers the G-CSF receptor by forming a 2: 2 complex of 2 G-CSF molecules and two receptors (Horan et al., Biochemistry 35 (15): 4886-96 (1996)). In X-ray crystallography studies, the following hG-CSF residues were identified as part of the contact areas binding to the receptor, namely, residues such as G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, L15 , K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123 and L124 (see, for example, Aritomi et al. (1999) Nature 401: 713).

Коммерчески доступные формы rhG-CSF имеют кратковременный фармакологический эффект, и в большинстве случаев они должны быть введены более одного раза в день на протяжении всего курса лечения лейкопении. Использование молекулы с более длительным временем полужизни в кровотоке позволяет уменьшить число введений, необходимых для ослабления лейкопении и предупреждения последующих возможных инфекций. Другой проблемой, связанной с использованием существующих в настоящее время продуктов rG-CSF, является возникновение дозозависимой боли в костях. Поскольку боль в костях, возникающая у пациентов, является серьезным побочным эффектом, вызываемым лечением с применением rG-CSF, то было бы желательно получить такой продукт rG-CSF, который не вызывал бы боли в костях, либо использовать такой продукт, который по своей природе не обладает таким эффектом или является эффективным в достаточно малых дозах, не вызывающих боли в костях. Таким образом, необходимость в улучшении свойств рекомбинантных молекул G-CSF является совершенно очевидной.Commercially available forms of rhG-CSF have a short-term pharmacological effect, and in most cases they should be administered more than once a day throughout the course of treatment of leukopenia. The use of a molecule with a longer half-life in the bloodstream reduces the number of administrations needed to reduce leukopenia and prevent possible subsequent infections. Another problem associated with the use of current rG-CSF products is the occurrence of dose-related bone pain. Since bone pain in patients is a serious side effect caused by treatment with rG-CSF, it would be desirable to obtain a product of rG-CSF that would not cause bone pain, or to use a product that is inherently does not have such an effect or is effective in sufficiently small doses that do not cause bone pain. Thus, the need to improve the properties of recombinant G-CSF molecules is quite obvious.

В литературе сообщалось о получении сконструированных на основе белка вариантов hG-CSF (патенты США № 5581476, 5214132, 5362853, 4904584 и Riedhaar-Olson et al., Biochemistry 35:9034-9041, 1996). Была также описана модификация hG-CSF и других полипептидов, которая заключается во введении, по меньшей мере, одной дополнительной углеводной цепи по сравнению с природным полипептидом (патент США № 5218092). Кроме того, были описаны и исследованы полимерные модификации природного hG-CSF, включая присоединение групп ПЭГ (см., например, Satake-Ishikawa et al. (1992) Cell Structure and Function 17:157; Bowen et al. (1999) Experimental Hematology 27:425; патент США № 5824778; патент США № 5824784, WO 96/11953, WO 95/21629 и WO 94/20069).In the literature, it has been reported that protein-engineered hG-CSF variants have been obtained (US Pat. Nos. 5,581,476, 5,214,132, 5,362,853, 4,904,584 and Riedhaar-Olson et al., Biochemistry 35: 9034-9041, 1996). A modification of hG-CSF and other polypeptides has also been described, which consists in introducing at least one additional carbohydrate chain compared to a naturally occurring polypeptide (US Patent No. 5218092). In addition, polymer modifications of natural hG-CSF have been described and investigated, including the addition of PEG groups (see, for example, Satake-Ishikawa et al. (1992) Cell Structure and Function 17: 157; Bowen et al. (1999) Experimental Hematology 27: 425; US patent No. 5824778; US patent No. 5824784, WO 96/11953, WO 95/21629 and WO 94/20069).

Присоединение синтетических полимеров к пептидному остову в целях улучшения фармакокинетических свойств терапевтического гликопротеина известно специалистам. Репрезентативным полимером, который был конъюгирован с пептидами, является полиэтиленгликоль (“ПЭГ”). Было продемонстрировано использование ПЭГ в целях дериватизации терапевтических пептидов для снижения иммуногенности данных пептидов. Так, например, в патенте США № 4179337 (Davis et al.) описаны неиммуногенные полипептиды, такие как ферменты и пептидные гормоны, присоединенные к полиэтиленгликолю (ПЭГ) или к полипропиленгликолю. Увеличение размера ПЭГ-конъюгата рассматриваемых полипептидов, помимо снижения иммуногенности, также приводит к увеличению времени выведения из кровотока.The addition of synthetic polymers to the peptide backbone in order to improve the pharmacokinetic properties of therapeutic glycoprotein is known to those skilled in the art. A representative polymer that has been conjugated to peptides is polyethylene glycol (“PEG”). The use of PEG for the derivatization of therapeutic peptides has been demonstrated to reduce the immunogenicity of these peptides. So, for example, in US patent No. 4179337 (Davis et al.) Describes non-immunogenic polypeptides, such as enzymes and peptide hormones attached to polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol. An increase in the size of the PEG conjugate of the considered polypeptides, in addition to decreasing immunogenicity, also leads to an increase in the time of elimination from the bloodstream.

Основным способом присоединения ПЭГ и его производных к пептидам является неспецифическое связывание посредством аминокислотного остатка пептида (см., например, патент США № 4088538, патент США № 4496689, патент США № 4414147, патент США № 4055635 и РСТ WO 87/00056). Другим способом присоединения ПЭГ к пептидам является неспецифическое окисление гликозильных остатков на гликопептиде (см., например, WO 94/05332).The main way of attaching PEG and its derivatives to peptides is non-specific binding by means of the amino acid residue of the peptide (see, for example, US patent No. 4088538, US patent No. 4496689, US patent No. 4414147, US patent No. 4055635 and PCT WO 87/00056). Another way to attach PEG to peptides is by nonspecific oxidation of glycosyl residues on a glycopeptide (see, for example, WO 94/05332).

Эти неспецифические методы предусматривают рандомизированное неспецифическое присоединение полиэтиленгликоля к реакционноспособным остаткам на пептидном остове. Очевидно, что рандомизированное присоединение молекул ПЭГ имеет свои недостатки, включая отсутствие гомогенности конечного продукта и возможное снижение биологической или ферментативной активности такого пептида. Поэтому, для продуцирования терапевтических пептидов, наилучшей стратегией является дериватизация, которая приводит к образованию специфически меченного легко характеризуемого и, по существу, гомогенного продукта. И такие методы были разработаны.These non-specific methods involve randomized, non-specific addition of polyethylene glycol to reactive residues on the peptide backbone. Obviously, the randomized addition of PEG molecules has its drawbacks, including the lack of homogeneity of the final product and the possible decrease in the biological or enzymatic activity of such a peptide. Therefore, for the production of therapeutic peptides, the best strategy is derivatization, which leads to the formation of a specifically labeled, easily characterized and essentially homogeneous product. And such methods have been developed.

Специфически меченные гомогенные пептиды с терапевтическими свойствами могут быть продуцированы in vitro под действием ферментов. В отличие от стандартных неспецифических методов присоединения синтетического полимера или другой метки к пептиду, ферментативный синтез имеет те преимущества, что он является региоселективным и стереоселективным. Двумя основными классами ферментов, используемых в синтезе меченых пептидов, являются гликозилтрансферазы (например, сиалилтрансферазы, олигосахарилтрансферазы, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы) и гликозидазы. Эти ферменты могут быть использованы для специфического присоединения сахаров, которые могут быть затем модифицированы так, чтобы они содержали терапевтический фрагмент. Альтернативно, гликозилтрансферазы и модифицированные гликозидазы могут быть использованы для прямого переноса модифицированных сахаров на пептидный остов (см., например, патент США № 6399336 и публикации заявок на патенты США 20030040037, 20040132640, 20040137557, 20040126838 и 20040142856, каждая из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки). Методы комбинирования элементов, полученных химическим и ферментативным синтезом, также известны специалистам (см., например, работу Yamamoto et al. Carbohydr. Res. 305:415-422 (1998) и публикацию заявки на патент США 20040137557, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки).Specifically labeled homogeneous peptides with therapeutic properties can be produced in vitro by enzymes. Unlike standard non-specific methods for attaching a synthetic polymer or other label to a peptide, enzymatic synthesis has the advantages of being regioselective and stereoselective. The two main classes of enzymes used in the synthesis of labeled peptides are glycosyl transferases (e.g., sialyl transferases, oligosaccharyl transferases, N-acetylglucosaminyl transferases) and glycosidases. These enzymes can be used to specifically attach sugars, which can then be modified so that they contain a therapeutic fragment. Alternatively, glycosyltransferases and modified glycosidases can be used to directly transfer modified sugars to the peptide backbone (see, for example, US Pat. by reference). Methods for combining elements obtained by chemical and enzymatic synthesis are also known to those skilled in the art (see, for example, Yamamoto et al. Carbohydr. Res. 305: 415-422 (1998) and U.S. Patent Application 20040137557, which are incorporated herein by links).

Для решения проблемы, связанной с необходимостью создания более эффективного терапевтического G-CSF, настоящее изобретение было направлено на получение гликопэгилированного G-CSF, который является терапевтически активным и обладает улучшенными фармакокинетическими параметрами и свойствами по сравнению с идентичными или близкородственными аналогами негликопэгилированного пептида G-CSF. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу высокоэффективного и промышленного синтеза пептидов G-CSF с улучшенными свойствами.To solve the problem associated with the need to create a more effective therapeutic G-CSF, the present invention was directed to obtaining glycopegylated G-CSF, which is therapeutically active and has improved pharmacokinetic parameters and properties compared to identical or closely related analogues of the non-glycopegylated peptide G-CSF. In addition, the present invention relates to a method for highly efficient and industrial synthesis of G-CSF peptides with improved properties.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Было обнаружено, что регулируемая модификация гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) одной или несколькими полиэтиленгликолевыми группами позволяет получить новые производные G-CSF с улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с соответствующим природным (непэгилированным) G-CSF (фиг.3). Кроме того, фармакологическая активность гликопэгилированного G-CSF является примерно такой же, как активность коммерчески доступного монопэгилированного филграстима (фиг.4).It was found that the controlled modification of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) with one or more polyethylene glycol groups allows to obtain new derivatives of G-CSF with improved pharmacokinetic properties compared with the corresponding natural (non-pegylated) G-CSF (Fig. 3). In addition, the pharmacological activity of glycopegylated G-CSF is approximately the same as the activity of commercially available monopegylated filgrastim (Figure 4).

В репрезентативном варианте изобретения “гликопэгилированные” молекулы G-CSF согласно изобретению получают путем опосредуемого ферментом образования конъюгата, содержащего гликозилированный или негликозилированный пептид G-CSF и ферментативно переносимый сахарный фрагмент, в структуру которой входит остаток полиэтиленгликоля. Остаток ПЭГ присоединен к сахарному фрагменту непосредственно (т.е. посредством одной группы, образованной в результате взаимодействия двух реакционноспособных групп) или посредством линкера, например замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и т.п. Пример переносимой ПЭГ-сахарной структуры приводится на фиг.5.In a representative embodiment of the invention, the “glycopegylated” G-CSF molecules of the invention are obtained by enzyme-mediated conjugate formation containing a glycosylated or non-glycosylated G-CSF peptide and an enzymatically tolerated sugar moiety which includes a polyethylene glycol residue. The PEG residue is attached to the sugar moiety directly (i.e., via one group formed by the interaction of two reactive groups) or via a linker, for example, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, and the like. An example of a portable PEG sugar structure is shown in FIG.

Таким образом, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему остаток ПЭГ, например ПЭГ и пептид, который обладает in vivo активностью, аналогичной или почти аналогичной активности известного G-CSF. В конъюгате согласно изобретению остаток ПЭГ ковалентно присоединен к пептиду посредством интактной гликозильной линкерной группы. Репрезентативными интактными гликозильными линкерными группами являются молекулы сиаловой кислоты, дериватизированные полиэтиленгликолем (ПЭГ).Thus, in one of its aspects, the present invention relates to a conjugate containing a PEG residue, for example PEG and a peptide, which has in vivo activity similar to or almost similar to the activity of the known G-CSF. In the conjugate according to the invention, the PEG residue is covalently attached to the peptide via an intact glycosyl linker group. Representative intact glycosyl linker groups are sialic acid molecules derivatized with polyethylene glycol (PEG).

В одном из своих репрезентативных аспектов настоящее изобретение относится к пептиду G-CSF, который включает фрагмент:In one of its representative aspects, the present invention relates to a peptide G-CSF, which includes a fragment:

В вышеуказанной формуле, D представляет собой -ОН или R¹-L-НN-. Символ G означает R¹-L или С(О)(С₁-С₆)алкил. R¹ представляет собой группу, содержащую линейный или разветвленный остаток полиэтиленглиголя, а L означает линкер, который выбран из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. В общих чертах, если D представляет собой ОН, то G представляет собой R¹-L, а если G представляет собой -С(О)(С₁-С₆)алкил, то D представляет собой R¹-L-NН-. В модифицированных структурах сиаловой кислоты, описанных в настоящей заявке, СООН также представляет собой СОO^- и/или его соль.In the above formula, D is —OH or R ¹ —L — HN—. The symbol G means R ¹ -L or C (O) (C ₁ -C ₆ ) alkyl. R ¹ represents a group containing a linear or branched residue of polyethylene glycol, and L means a linker that is selected from a bond, substituted or unsubstituted alkyl, and substituted or unsubstituted heteroalkyl. In general terms, if D is OH, then G is R ¹ -L, and if G is —C (O) (C ₁ -C ₆ ) alkyl, then D is R ¹ -L-NH—. In the modified sialic acid structures described herein, COOH also represents CoO ^- and / or its salt.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ПЭГилированного G-CSF, содержащего фрагмент, описанный выше. Способ согласно изобретению включает (а) контактирование субстрата пептида G-CSF с донорным фрагментом “ПЭГ-сиаловая кислота” и с ферментом, переносящим ПЭГ-сиаловую кислоту на аминокислотный или гликозильный остаток G-CSF в условиях, подходящих для такого переноса. Репрезентативный донорный фрагмент “ПЭГ-сиаловая кислота” имеет формулу:In another aspect, the present invention relates to a method for producing PEGylated G-CSF containing the fragment described above. The method according to the invention comprises (a) contacting a substrate of the G-CSF peptide with a PEG-sialic acid donor fragment and with an enzyme transferring PEG-sialic acid to the amino acid or glycosyl residue of G-CSF under conditions suitable for such a transfer. The representative donor fragment “PEG-sialic acid” has the formula:

В одном из вариантов изобретения указанным хозяином является клетка млекопитающего. В других вариантах осуществления изобретения клеткой-хозяином является клетка насекомого, растения, бактерий или грибов.In one embodiment of the invention, said host is a mammalian cell. In other embodiments, the host cell is an insect, plant, bacterial or fungal cell.

Фармакокинетические свойства соединений согласно изобретению могут быть легко изменены путем изменения структуры, числа или положения сайта(ов) гликозилирования пептида. Таким образом, объем настоящего изобретения включает способ добавления одной или нескольких мутаций, которые вводят сайт О- или N-связанного гликозилирования в пептид G-CSF и которые отсутствуют в молекуле дикого типа. Антитела против этих мутантов и их гликозилированных конечных продуктов и промежуточных соединений также входят в объем настоящего изобретения.The pharmacokinetic properties of the compounds according to the invention can be easily changed by changing the structure, number or position of the peptide glycosylation site (s). Thus, the scope of the present invention includes a method for adding one or more mutations that introduce the O- or N-linked glycosylation site into the G-CSF peptide and which are absent in the wild-type molecule. Antibodies against these mutants and their glycosylated end products and intermediates are also within the scope of the present invention.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к G-CSF-конъюгату, содержащему набор остатков ПЭГ, например ПЭГ, ковалентно связанного с G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы. В конъюгате согласно изобретению, по существу, каждый член данного набора связан посредством гликозильной линкерной группы с гликозильным остатком пептида и каждый гликозильный остаток имеет идентичную структуру.In another aspect, the present invention relates to a G-CSF conjugate comprising a set of PEG residues, such as PEG, covalently linked to G-CSF via an intact glycosyl linker group. In the conjugate according to the invention, essentially each member of this kit is linked via a glycosyl linker group to the glycosyl residue of the peptide and each glycosyl residue has an identical structure.

В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к G-CSF-конъюгату, содержащему набор остатков ПЭГ, например ПЭГ, ковалентно связанного с G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы. В конъюгате согласно изобретению, по существу, каждый член данного набора связан с аминокислотным остатком пептида и каждый аминокислотный остаток, к которому присоединен данный полимер, имеет идентичную структуру. Так, например, если один из пептидов включает связанный с Thr гликозильный остаток, то, по меньшей мере, примерно 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99,2%, 99,4%, 99,6% или, более предпочтительно, 99,8% пептидов в данном наборе будут иметь одинаковое число гликозильных остатков, ковалентно связанных с одним и тем же остатком Thr. Представленное выше обсуждение в равной степени относится к сайтам О-гликозилирования и N-гликозилирования.In a representative embodiment, the present invention relates to a G-CSF conjugate comprising a set of PEG residues, such as PEG, covalently linked to G-CSF via an intact glycosyl linker group. In the conjugate according to the invention, essentially, each member of this kit is associated with the amino acid residue of the peptide and each amino acid residue to which the polymer is attached has an identical structure. So, for example, if one of the peptides includes a Thr-linked glycosyl residue, then at least about 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, or more preferably 99.8% of the peptides in this set will have the same number of glycosyl residues covalently linked to the same Thr residue. The above discussion applies equally to O-glycosylation and N-glycosylation sites.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции. Такая композиция включает фармацевтически приемлемый носитель и ковалентный конъюгат, содержащий неприродный остаток ПЭГ и гликозилированный или негликозилированный пептид G-CSF.The present invention also relates to a pharmaceutical composition. Such a composition includes a pharmaceutically acceptable carrier and a covalent conjugate containing an unnatural PEG residue and a glycosylated or non-glycosylated G-CSF peptide.

Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения.Other objectives and advantages of the present invention will be apparent from the following detailed description of the invention.

Описание графического материалаDescription of graphic material

На фиг.1 представлена структура G-CSF, которая иллюстрирует наличие и локализацию потенциального гликозилирования у остатка Thr 133 (Thr 134, если присутствует метионин).Figure 1 presents the structure of G-CSF, which illustrates the presence and localization of potential glycosylation at residue Thr 133 (Thr 134, if methionine is present).

На фиг.2 представлена схема, иллюстрирующая репрезентативный вариант настоящего изобретения, в котором углеводный остаток на пептиде СGS ремоделирован путем ферментативного присоединения группы GаlNac к гликозильному остатку у Thr 133 (Thr 134, если присутствует метионин) с последующим присоединением ПЭГ-дериватизированного сахарного фрагмента.Figure 2 is a diagram illustrating a representative embodiment of the present invention in which the carbohydrate residue on the CGS peptide is remodeled by enzymatically linking the GalNac group to the glycosyl residue of Thr 133 (Thr 134 if methionine is present) followed by the addition of the PEG derivatized sugar moiety.

На фиг.3 представлены графики, иллюстрирующие сравнение времени пребывания in vivo негликозилированного G-CSF, Neulasta^ТМ и ферментативно гликопэгилированного G-CSF.FIG. 3 is a graph illustrating a comparison of the in vivo residence time of non-glycosylated G-CSF, Neulasta ^TM and enzymatically glycopegylated G-CSF.

На фиг.4 представлены графики, иллюстрирующие сравнение активностей различных молекул, указанных на фиг.3.Figure 4 presents graphs illustrating a comparison of the activities of various molecules indicated in figure 3.

На фиг.5 представлена схема синтеза для продуцирования репрезентативного предшественника “ПЭГ-гликозилированная линкерная группа” (модифицированного сахара) согласно изобретению в целях получения конъюгатов согласно изобретению.Figure 5 presents the synthesis scheme for the production of the representative precursor "PEG-glycosylated linker group" (modified sugar) according to the invention in order to obtain conjugates according to the invention.

На фиг.6 представлены репрезентативные аминокислотные последовательности G-CSF. SEQ ID NO:1 представляет собой вариант, состоящий из 175 аминокислот, где первой аминокислотой является метионин и где треониновый остаток присутствует в положении 134. SEQ ID NO:2 представляет собой вариант, который содержит 174 аминокислоты и имеет такую же последовательность, как и последовательность, состоящая из 175 аминокислот, за исключением того, что в ней отсутствует инициирующий метионин, а поэтому эта последовательность начинается с Т, а треониновый остаток находится в положении 133.Figure 6 shows representative amino acid sequences of G-CSF. SEQ ID NO: 1 is a 175 amino acid variant where the first amino acid is methionine and where the threonine residue is at position 134. SEQ ID NO: 2 is a variant that contains 174 amino acids and has the same sequence as the sequence , consisting of 175 amino acids, except that it lacks initiating methionine, and therefore this sequence begins with T, and the threonine residue is at position 133.

На фиг.7 проиллюстрированы некоторые репрезентативные содержащие модифицированный сахар нуклеотиды, используемые для осуществления настоящего изобретения.7 illustrates some representative modified sugar containing nucleotides used to implement the present invention.

На фиг.8 проиллюстрированы другие репрезентативные, содержащие модифицированный сахар нуклеотиды, используемые для осуществления настоящего изобретения.On Fig illustrates other representative, containing modified sugar nucleotides used to implement the present invention.

На фиг.9 продемонстрировано продуцирование рекомбинантного G-CSF в бактериях, выращенных в различных средах и индуцированных IPTG.Figure 9 shows the production of recombinant G-CSF in bacteria grown in various media and induced by IPTG.

На фиг.10 проиллюстрирован Вестерн-блот-анализ подвергнутого рефолдингу G-CSF после хроматографии на SР-сефарозе.Figure 10 illustrates a Western blot analysis of refolded G-CSF after chromatography on SP-Sepharose.

На фиг.11 представлена таблица сиалилтрансфераз, которые используются для переноса описанных здесь модифицированной молекулы сиаловой кислоты и немодифицированной сиаловой кислоты на акцептор.11 is a table of sialyl transferases that are used to transfer the modified sialic acid molecule and unmodified sialic acid described herein to an acceptor.

Подробное описание настоящего изобретения и его предпочтительных вариантовDetailed description of the present invention and its preferred options

СокращенияAbbreviations

ПЭГ - полиэтиленгликоль; PPG (ППГ) - полипропиленгликоль; Ara - арабинозил; Fru - фруктозил; Fuc - фукозил; Gal - галактозил; GalNac - N-ацетилгалактозаминил; Glc - глюкозил; GlcNAc - N-ацетилглюкозаминил; Man - маннозил; ManAc - маннозаминилацетат; Xyl - ксилозил; NeuAc - сиалил(N-ацетилнейраминил); М6Р - маннозо-6-фосфат; Sia - сиаловая кислота, N-ацетилнейраминил и их производные и аналоги.PEG - polyethylene glycol; PPG (PPG) - polypropylene glycol; Ara is arabinosyl; Fru - fructosyl; Fuc fucosyl; Gal is galactosyl; GalNac N-acetylgalactosaminyl; Glc - glucosyl; GlcNAc - N-acetylglucosaminyl; Man is mannosyl; ManAc - mannosaminyl acetate; Xyl - xylosyl; NeuAc - sialyl (N-acetylneuraminyl); M6P - mannose-6-phosphate; Sia - sialic acid, N-acetylneuraminil and their derivatives and analogues.

ОпределенияDefinitions

Если это не определено особо, то все используемые здесь технические и научные термины имеют общепринятое значение, известное специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. В общих чертах, используемая здесь номенклатура и лабораторные процедуры, применяемые в культивировании клеток, молекулярной генетике, органической химии и химии синтеза нуклеиновых кислот, а также в методе гибридизации, являются хорошо известными и подробно описаны в литературе. Для синтеза нуклеиновых кислот и пептидов применяются стандартные методы. Такие методы и процедуры обычно осуществляют стандартными способами, описанными в литературе и в различных общих руководствах (в общих чертах, см. руководство Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки), и эти способы также описаны в данном документе. Используемая здесь номенклатура и лабораторные процедуры, применяемые в аналитической химии и в химии органического синтеза и описанные ниже, хорошо известны и подробно описаны в литературе. Для химического синтеза и химических анализов применяются стандартные методы или их модификации.Unless otherwise specifically defined, all technical and scientific terms used herein have generally accepted meanings known to those skilled in the art to which the present invention relates. In general terms, the nomenclature used here and the laboratory procedures used in cell culture, molecular genetics, organic chemistry and nucleic acid synthesis chemistry, as well as in the hybridization method, are well known and described in detail in the literature. For the synthesis of nucleic acids and peptides, standard methods are used. Such methods and procedures are usually carried out by standard methods described in the literature and in various general guidelines (for general outline, see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, which is incorporated herein by reference), and these methods are also described herein. The nomenclature used here and laboratory procedures used in analytical chemistry and in the chemistry of organic synthesis and described below are well known and described in detail in the literature. For chemical synthesis and chemical analyzes, standard methods or their modifications are used.

Все описанные здесь олигосахариды имеют названия или сокращения, принятые для невосстанавливающего сахарида (т.е. Gаl) и соответствующие конфигурации гликозидной связи (α или β), связи в кольце (1 или 2) и положению восстанавливающего сахарида в кольце, участвующего в образовании связи (2, 3, 4, 6 или 8), а также названия или сокращения, принятые для восстанавливающего сахарида (т.е. GlcNAc). Каждый из сахаридов предпочтительно является пиранозой. Описание стандартной номенклатуры, используемой в биологии гликозилирования, можно найти в руководстве Essentials of Glycobiology Varki et al., eds. CSHL Press (1999).All oligosaccharides described herein have the names or abbreviations adopted for the non-reducing saccharide (i.e., Gal) and the corresponding configuration of the glycosidic bond (α or β), the bond in the ring (1 or 2) and the position of the reducing saccharide in the ring involved in the formation of the bond (2, 3, 4, 6, or 8), as well as the names or abbreviations used for the reducing saccharide (i.e., GlcNAc). Each of the saccharides is preferably pyranose. A description of the standard nomenclature used in glycosylation biology can be found in Essentials of Glycobiology Varki et al., Eds. CSHL Press (1999).

Считается, что олигосахариды должны иметь восстанавливающий конец и невосстанавливающий конец, независимо от того, является ли сахарид, находящийся у восстанавливающего конца, действительно восстанавливающим сахаром или нет. В соответствии с общепринятой номенклатурой описанные здесь олигосахариды слева имеют невосстанавливающий конец, а справа - восстанавливающий конец.It is believed that oligosaccharides should have a reducing end and a non-reducing end, regardless of whether the saccharide at the reducing end is really a reducing sugar or not. In accordance with generally accepted nomenclature, the oligosaccharides described here have a non-reducing end on the left and a reducing end on the right.

Термин “сиаловая кислота” означает любой член семейства карбоксилированных сахаров из девяти атомов углерода. Наиболее распространенным членом семейства сиаловых кислот является N-ацетил-нейраминовая кислота (2-кето-5-ацетамидо-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галактононулопирано-1-оновая кислота (часто сокращенно называемая Neu5Ac, NeuAc или NANA)). Вторым членом такого семейства является N-гликолил-нейраминовая кислота (Neu5Gc или NeuGc), в которой N-ацетильная группа NeuAc является гидроксилированной. Третьим членом семейства сиаловых кислот является 2-кето-3-дезокси-нонулозоновая кислота (KDN) (Nadano et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:11550-11557; Kanamori et al. J. Biol. Chem. 265:21811-21819 (1990)). В объем настоящего изобретения также входят 9-замещенные сиаловые кислоты, такие как 9-О-С₁-С₆ацил-Neu5Ac, например 9-О-лактил-Neu5Ac или 9-О-ацетил-Neu5Ac, 9-дезокси-9-фтор-Neu5Ac и 9-азидо-9-дезокси-Neu5Ac. Описание семейства сиаловых кислот можно найти, например, в публикации Varki, Glycobiology 2:25-40 (1992) Sialic Acids: Chemistry, Methabolism and Function, R. Schauer Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). Синтез и использование соединений сиаловой кислоты в процедуре сиалилирования описаны в Международной заявке WO 92/16640, опубликованной 1 октября 1992.The term “sialic acid” means any member of the family of carboxylated sugars of nine carbon atoms. The most common member of the sialic acid family is N-acetyl-neuraminic acid (2-keto-5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulopyrano-1-one acid (often abbreviated as Neu5Ac, NeuAc or NANA) ) The second member of this family is N-glycolyl-neuraminic acid (Neu5Gc or NeuGc), in which the N-acetyl group of NeuAc is hydroxylated. A third member of the sialic acid family is 2-keto-3-deoxy-nonulonosonic acid (KDN) (Nadano et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al. J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). Also included within the scope of the present invention are 9-substituted sialic acids, such as 9-O-C ₁ -C ₆ acyl-Neu5Ac, for example 9-O-lactyl-Neu5Ac or 9-O-acetyl-Neu5Ac, 9-deoxy-9- fluoro-Neu5Ac and 9-azido-9-deoxy-Neu5Ac. A description of the sialic acid family can be found, for example, in Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992) Sialic Acids: Chemistry, Methabolism and Function, R. Schauer Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). The synthesis and use of sialic acid compounds in the sialylation procedure is described in International Application WO 92/16640, published October 1, 1992.

Термин “гранулоцитарный колониестимулирующий фактор”, или “пептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора”, или “G-CSF”, или “пептид G-CSF” относится к любому пептиду дикого типа или к мутированному пептиду, к рекомбинантному или нативному G-CSF или любому его фрагменту, обладающему активностью, аналогичной активности нативного G-CSF или имитирующей эту активность. Обычно, этот термин также охватывает непептидные миметики G-CSF. В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. В других репрезентативных вариантах изобретения пептид G-CSF имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO:3-11.The term “granulocyte colony stimulating factor” or “peptide of a granulocyte colony stimulating factor” or “G-CSF” or “peptide G-CSF” refers to any wild-type peptide or mutated peptide, to recombinant or native G-CSF, or any of its a fragment having activity similar to or simulating that of native G-CSF. Typically, this term also encompasses non-peptide G-CSF mimetics. In a representative embodiment of the invention, the G-CSF peptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In other representative embodiments of the invention, the G-CSF peptide has a sequence selected from SEQ ID NO: 3-11.

Термин “активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора” означает любую активность, включая, но не ограничиваясь ими, связывание с рецептором и активацию рецептора, ингибирование связывания с рецептором или любую биохимическую или физиологическую реакцию, которая обычно происходит под действием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора дикого типа. Активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора может быть индуцирована под действием любого пептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, определенного выше.The term “granulocyte colony-stimulating factor activity” means any activity, including, but not limited to, receptor binding and receptor activation, inhibition of receptor binding, or any biochemical or physiological reaction that usually occurs under the influence of a wild-type granulocyte colony stimulating factor. Granulocyte colony stimulating factor activity can be induced by any granulocyte colony stimulating factor peptide as defined above.

Термин “пептид” означает полимер, в котором мономеры представляют собой аминокислоты и соединены друг с другом амидными связями и который, альтернативно, называется полипептидом. Кроме того, этот термин также охватывает неприродные аминокислоты, например β-аланин, фенилглицин и гомоаргинин. В настоящем изобретении могут быть также использованы аминокислоты, которые не кодируются генами. Кроме того, в настоящем изобретении могут быть также использованы аминокислоты, которые были модифицированы путем включения реакционноспособных групп, сайтов гликозилирования, полимеров, терапевтических молекул, биомолекул и т.п. Все аминокислоты, используемые в настоящем изобретении, могут быть либо D-изомерами, либо L-изомерами. Обычно, предпочтительным является L-изомер. Кроме того, в настоящем изобретении могут быть также использованы другие пептидомиметики. Используемый здесь термин “пептид” означает гликозилированные и негликозилированные пептиды. Могут быть также использованы пептиды, которые являются неполностью гликозилированными в системе, экспрессирующей данный пептид. Общий обзор можно найти у Spatola A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983).The term “peptide” means a polymer in which the monomers are amino acids and are connected to each other by amide bonds and which, alternatively, is called a polypeptide. In addition, the term also encompasses non-natural amino acids, such as β-alanine, phenylglycine and homoarginine. Amino acids that are not encoded by genes may also be used in the present invention. In addition, amino acids that have been modified to include reactive groups, glycosylation sites, polymers, therapeutic molecules, biomolecules, and the like can also be used in the present invention. All amino acids used in the present invention can be either D-isomers or L-isomers. Generally, the L isomer is preferred. In addition, other peptidomimetics may also be used in the present invention. The term “peptide” as used herein means glycosylated and non-glycosylated peptides. Peptides that are incompletely glycosylated in a system expressing the peptide may also be used. A general overview can be found at Spatola A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983).

Термин “пептидный конъюгат” означает молекулу согласно изобретению, в которой пептид конъюгирован с описанным здесь модифицированным сахаром.The term “peptide conjugate” means a molecule according to the invention in which the peptide is conjugated to the modified sugar described herein.

Термин “аминокислота” означает природные и синтетические аминокислоты, а также аналоги и миметики аминокислот, которые имеют такие же функции, как и природные аминокислоты. Природными аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые были затем модифицированы, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамин и О-фосфосерин. “Аминокислотные аналоги” означают соединения, которые имеют такую же основную химическую структуру, как и природные аминокислоты, то есть содержат α-углерод, связанный с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Эти аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но, при этом, сохраняют основную химическую структуру, присущую природной аминокислоте. Термин “аминокислотные миметики” означает химические соединения, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислот, но обладающую функцией, аналогичной функции природной аминокислоты. Используемый здесь термин “аминокислота”, независимо от того, присутствует ли она в линкере или в компоненте пептидной последовательности, означает D- и L-изомер аминокислоты, а также смеси этих двух изомеров.The term “amino acid” means natural and synthetic amino acids, as well as analogs and mimetics of amino acids that have the same functions as natural amino acids. Natural amino acids are those encoded by the genetic code, as well as amino acids that were then modified, such as hydroxyproline, γ-carboxyglutamine and O-phosphoserine. “Amino acid analogs” means compounds that have the same basic chemical structure as natural amino acids, that is, contain α-carbon bound to hydrogen, a carboxyl group, an amino group and an R group, for example homoserin, norleucine, methionine sulfoxide, methionine methyl sulfonium. These analogues have modified R-groups (for example, norleucine) or modified peptide backbones, but at the same time retain the basic chemical structure inherent in a natural amino acid. The term “amino acid mimetics” means chemical compounds that have a structure different from the general chemical structure of amino acids, but having a function similar to that of a natural amino acid. As used herein, the term “amino acid”, whether present in the linker or in the component of the peptide sequence, means the D- and L-isomer of the amino acid, as well as mixtures of these two isomers.

Используемый здесь термин “модифицированный сахар” означает природный или неприродный углевод, который ферментативно присоединен к аминокислоте или к гликозильному остатку пептида способом согласно изобретению. Модифицированный сахар выбирают из ряда субстратов фермента, включая, но не ограничиваясь ими, сахарсодержащие нуклеотиды (моно-, ди- и трифосфаты), активированные сахара (например, гликозилгалогениды, гликозилмезилаты) и сахара, которые не являются активированными и не содержатся в нуклеотидах. “Модифицированный сахар” ковалентно связан с функциональной “модифицирующей” группой. Подходящими модифицирующими группами являются, но не ограничиваются ими, молекулы ПЭГ, терапевтические молекулы, диагностические молекулы, биомолекулы и т.п. Модифицирующая группа, предпочтительно, не является природным или немодифицированным углеводом. Положение функциональной модифицирующей группы выбирают так, чтобы эта группа не препятствовала образованию “модифицированного сахара” в результате ферментативного присоединения этой группы к пептиду.As used herein, the term “modified sugar” means a natural or non-natural carbohydrate that is enzymatically attached to an amino acid or to a glycosyl residue of a peptide by the method of the invention. Modified sugar is selected from a number of enzyme substrates, including, but not limited to, sugar-containing nucleotides (mono-, di- and triphosphates), activated sugars (e.g., glycosyl halides, glycosyl mesylates) and sugars that are not activated and are not contained in nucleotides. “Modified sugar” is covalently linked to a functional “modifying” group. Suitable modifying groups include, but are not limited to, PEG molecules, therapeutic molecules, diagnostic molecules, biomolecules, and the like. The modifying group is preferably not a natural or unmodified carbohydrate. The position of the functional modifying group is chosen so that this group does not interfere with the formation of “modified sugar” as a result of enzymatic addition of this group to the peptide.

Термин “водорастворимый” относится к молекулам, которые обладают определенной детектируемой степенью растворимости в воде. Методы детекции и/или оценки растворимости в воде хорошо известны специалистам. Репрезентативными ПЭГ-частями являются пептиды, сахариды, полиэфиры, полиамины, поликарбоновые кислоты и т.п. Пептиды могут иметь смешанные последовательности или могут состоять из одной аминокислоты, например полилизина. Аналогичным образом, сахариды могут иметь смешанные последовательности или могут состоять из одной сахаридной субъединицы, например декстрана, амилозы, хитозана и полисиаловой кислоты. Примером полиэфира является полиэтиленгликоль. Примером полиамина является полиэтиленимин, а репрезентативной поликарбоновой кислотой является полиакриловая кислота.The term “water soluble” refers to molecules that have a detectable degree of solubility in water. Methods for detecting and / or evaluating solubility in water are well known in the art. Representative PEG moieties are peptides, saccharides, polyesters, polyamines, polycarboxylic acids, and the like. Peptides may have mixed sequences or may consist of a single amino acid, for example polylysine. Similarly, saccharides may have mixed sequences or may consist of a single saccharide subunit, for example, dextran, amylose, chitosan and polysialic acid. An example of a polyester is polyethylene glycol. An example of a polyamine is polyethyleneimine, and a representative polycarboxylic acid is polyacrylic acid.

Используемый здесь термин “гликозильная линкерная группа” означает гликозильный остаток, к которому ковалентно присоединен агент (например, остаток ПЭГ, терапевтическая молекула, биомолекула). В способах согласно изобретению “гликозильная линкерная группа” ковалентно присоединяется к гликозилированному или к негликозилированному пептиду и тем самым связывает данный агент с аминокислотой и/или гликозильным остатком пептида. “Гликозильная линкерная группа” обычно образуется из “модифицированного сахара” в результате ферментативного присоединения “модифицированного сахара” к аминокислоте и/или к гликозильному остатку данного пептида. Термин “интактная гликозильная линкерная группа” означает линкерную группу, образующуюся из гликозильной части, в которой отдельные сахаридные мономеры, связывающие элементы конъюгата, не разлагаются, например не окисляются, например, под действием метапериодата натрия. “Интактные гликозильные линкерные группы” согласно изобретению могут образовываться из природного олигосахарида путем присоединения гликозильной(ых) единицы(единиц) или удаления одной или нескольких гликозильных единиц из исходной сахаридной структуры.As used herein, the term “glycosyl linker group” means a glycosyl residue to which an agent is covalently attached (eg, PEG residue, therapeutic molecule, biomolecule). In the methods of the invention, a “glycosyl linker group” is covalently attached to a glycosylated or non-glycosylated peptide and thereby binds the agent to an amino acid and / or glycosyl residue of the peptide. A “glycosyl linker group” is usually formed from “modified sugar” as a result of the enzymatic addition of “modified sugar” to an amino acid and / or to the glycosyl residue of this peptide. The term “intact glycosyl linker group” means a linker group formed from the glycosyl moiety in which individual saccharide monomers linking the conjugate elements do not decompose, for example, are not oxidized, for example, by the action of sodium metaperiodate. The “intact glycosyl linker groups” according to the invention can be formed from a natural oligosaccharide by attaching the glycosyl unit (s) or removing one or more glycosyl units from the original saccharide structure.

Используемый здесь термин “нацеливающая молекула” означает молекулу, которая может селективно локализоваться в конкретной ткани или области организма. Такая локализация опосредуется специфическим распознаванием молекулярных детерминант, размером молекулы указанного нацеливающего агента или конъюгата, ионными взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями и т.п. Другие механизмы доставки агента в конкретную ткань или область известны специалистам. Примерами нацеливающих молекул являются антитела, фрагменты антител, трансферрин, НS-гликопротеин, факторы свертывания крови, сывороточные белки, β-гликопротеин, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, ЕРО и т.п.As used herein, the term “targeting molecule” means a molecule that can selectively localize to a specific tissue or region of the body. Such localization is mediated by specific recognition of molecular determinants, the size of the molecules of the specified targeting agent or conjugate, ionic interactions, hydrophobic interactions, etc. Other mechanisms for delivering the agent to a particular tissue or region are known to those skilled in the art. Examples of targeting molecules are antibodies, antibody fragments, transferrin, HS-glycoprotein, blood coagulation factors, serum proteins, β-glycoprotein, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO and the like.

Используемый здесь термин “фармацевтически приемлемый носитель” включает любой материал, который, при его объединении с конъюгатом, сохраняет активность данного конъюгата и не реагирует с иммунной системой пациента. Примерами таких носителей являются, но не ограничиваются ими, любой стандартный фармацевтический носитель, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсии типа “масло в воде”, и смачивающие агенты различных типов. Другими носителями могут быть также стерильные растворы, таблетки, включая таблетки с покрытиями и капсулы. Обычно, такие носители содержат наполнители, такие как крахмал, молоко, сахар, глины некоторых типов, желатин, стеариновую кислоту или ее соли, стеарат магния или кальция, тальк, растительные жиры или масла, смолы, гликоли или другие известные наполнители. Такими носителями могут быть также ароматизаторы, красители или другие ингредиенты. Композиции, содержащие такие носители, приготавливают хорошо известными стандартными методами.As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carrier” includes any material that, when combined with the conjugate, retains the activity of the conjugate and does not react with the patient’s immune system. Examples of such carriers are, but are not limited to, any standard pharmaceutical carrier, such as phosphate buffered saline, water, emulsions, such as oil-in-water emulsions, and various types of wetting agents. Other carriers may also be sterile solutions, tablets, including coated tablets and capsules. Typically, such carriers contain excipients such as starch, milk, sugar, some types of clays, gelatin, stearic acid or its salts, magnesium or calcium stearate, talc, vegetable fats or oils, resins, glycols or other known excipients. Flavoring agents, colorants or other ingredients may also be such carriers. Compositions containing such carriers are prepared by well-known standard methods.

Используемый здесь термин “введение” означает пероральное введение, введение в виде суппозиториев, введение путем местного контакта, внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечное введение, введение в пораженный участок, интраназальное введение или подкожное введение либо имплантацию индивидууму устройства пролонгированного высвобождения, например миниосмотического насоса. Введение может быть осуществлено любым способом, включая парентеральное и трансмукозальное введение (например, пероральное, интраназальное, вагинальное, ректальное или трансдермальное введение). Парентеральное введение включает, например, внутривенное, внутримышечное, интраартериолярное, внутрикожное, подкожное, внутрибрюшинное, интравентрикулярное и внутричерепное введение. Кроме того, если инъекцию вводят в целях уничтожения опухоли, например в целях индуцирования апоптоза, то такое введение может быть осуществлено непосредственно в опухоль и/или в ткани, окружающие опухоль. Другими способами введения являются, но не ограничиваются ими, использование липосомных препаратов, внутривенное вливание, использование чрезкожных пластырей и т.п.The term “administration” as used herein means oral administration, suppository administration, local contact administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, administration to the affected area, intranasal administration or subcutaneous administration or implantation of a sustained release device, such as a mini-osmotic pump, to an individual. Administration can be carried out by any method, including parenteral and transmucosal administration (e.g., oral, intranasal, vaginal, rectal or transdermal administration). Parenteral administration includes, for example, intravenous, intramuscular, intraarterial, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, intraventricular and intracranial administration. In addition, if the injection is administered in order to destroy the tumor, for example in order to induce apoptosis, then this injection can be carried out directly in the tumor and / or in the tissues surrounding the tumor. Other routes of administration include, but are not limited to, the use of liposome preparations, intravenous infusion, the use of transdermal patches, and the like.

Термин “облегчение” или “облегчать” означает любой признак положительной динамики в лечении патологии или состояния, включая объективные или субъективные параметры, такие как ослабление, ремиссия или уменьшение симптомов заболевания, или улучшение физического или психического состояния пациента. Облегчение симптомов может быть основано на объективных или субъективных параметрах, включая результаты обследования физического и/или психического состояния пациента.The term “alleviation” or “alleviate” means any sign of positive dynamics in the treatment of a pathology or condition, including objective or subjective parameters, such as a weakening, remission or reduction of symptoms of the disease, or improvement in a patient’s physical or mental condition. Relief of symptoms can be based on objective or subjective parameters, including the results of an examination of the patient's physical and / or mental state.

Термин “терапия” означает “лечение” или “устранение” заболевания или состояния, включая предупреждение данного заболевания или состояния у животного, которое может иметь предрасположенность в развитию данного заболевания, но у которого еще отсутствуют или пока не обнаружены симптомы заболевания (профилактическое лечение), подавление развития заболевания (замедление или прекращение его развития), ослабление симптомов или побочных эффектов заболевания (включая паллиативное лечение) и улучшение динамики заболевания (приводящей к регрессии, т.е. к обратному развитию заболевания).The term “therapy” means “treatment” or “elimination” of a disease or condition, including the prevention of a given disease or condition in an animal that may have a predisposition to develop the disease, but which does not yet have or has not yet detected symptoms of the disease (preventive treatment) suppressing the development of the disease (slowing down or stopping its development), weakening the symptoms or side effects of the disease (including palliative treatment) and improving the dynamics of the disease (leading to progression, i.e. a regression of the disease).

Термин “эффективное количество”, или “количество, эффективное для...”, или “терапевтически эффективное количество”, или любой грамматически эквивалентный термин означает количество, которое, при его введении животному для лечения заболевания, является достаточным для эффективного лечения такого заболевания.The term “effective amount” or “amount effective for ...” or “therapeutically effective amount” or any grammatically equivalent term means an amount which, when administered to an animal to treat a disease, is sufficient to effectively treat such a disease.

Термин “выделенный” относится к материалу, который, по существу или в основном, не содержит компонентов, используемых для получения такого материала. Что касается пептидных конъюгатов согласно изобретению, то термин “выделенный” относится к материалу, который, по существу или в основном, не содержит компонентов, которые обычно присутствуют вместе с этим материалом в смеси, используемой для получения пептидного конъюгата. Термины “выделенный” и “чистый” являются взаимозаменяемыми. Выделенные пептидные конъюгаты согласно изобретению обычно имеют уровень чистоты, выражаемый, предпочтительно, в виде интервала значений. Нижняя граница интервала значений чистоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 60%, примерно 79% или примерно 80%, а верхняя граница интервала значений чистоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% или более чем примерно 90%.The term “isolated” refers to a material that essentially or substantially does not contain the components used to make such a material. As for the peptide conjugates according to the invention, the term “isolated” refers to a material that essentially or mainly does not contain components that are usually present with this material in the mixture used to obtain the peptide conjugate. The terms “highlighted” and “pure” are used interchangeably. Isolated peptide conjugates according to the invention usually have a purity level expressed, preferably, as a range of values. The lower limit of the purity range for peptide conjugates is about 60%, about 79%, or about 80%, and the upper limit of the purity range for peptide conjugates is about 70%, about 80%, about 90%, or more than about 90%.

Если пептидные конъюгаты имеют чистоту более чем примерно 90%, то их чистота также, предпочтительно, выражена в виде интервала значений. Нижняя граница этого интервала значений чистоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 90%, примерно 92%, примерно 94%, примерно 96% или примерно 98%. Верхняя граница интервала значений чистоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 92%, примерно 94%, примерно 96%, примерно 98% или примерно 100%.If the peptide conjugates have a purity of more than about 90%, then their purity is also preferably expressed as a range of values. The lower limit of this purity range for peptide conjugates is about 90%, about 92%, about 94%, about 96%, or about 98%. The upper limit of the purity range for peptide conjugates is about 92%, about 94%, about 96%, about 98%, or about 100%.

Чистоту определяют хорошо известными аналитическими методами (например, по интенсивности полосы на окрашенном серебром геле, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, с помощью ВЭЖХ или аналогичными методами).The purity is determined by well-known analytical methods (for example, by the intensity of the strip on a silver-stained gel, by polyacrylamide gel electrophoresis, by HPLC or similar methods).

Используемый здесь термин “в основном, каждый член популяции” описывает свойства популяции пептидных конъюгатов согласно изобретению, в которых множество идентичных акцепторных сайтов на пептиде содержит выбранный процент модифицированных сахаров, присоединенных к пептиду. Термин “в основном, каждый член популяции”, упоминаемый в связи с “гомогенностью” этих сайтов на пептиде, конъюгированном с модифицированным сахаром, относится к конъюгатам согласно изобретению, которые являются гомогенными, по меньшей мере, примерно на 80%, предпочтительно, примерно, по меньшей мере, на 90%, а более предпочтительно, примерно, по меньшей мере, на 95%.As used herein, the term “basically, each member of a population” describes the properties of a population of peptide conjugates according to the invention, in which a plurality of identical acceptor sites on a peptide contain a selected percentage of modified sugars attached to the peptide. The term “basically, each member of the population”, referred to in connection with the “homogeneity” of these sites on a peptide conjugated with a modified sugar, refers to the conjugates according to the invention, which are homogeneous, at least about 80%, preferably about at least 90%, and more preferably, at least about 95%.

Термин “гомогенность” относится к структурному составу всей популяции акцепторных фрагментов, с которыми конъюгированы модифицированные сахара. Так, например, говорят, что пептидный конъюгат согласно изобретению, в котором каждый фрагмент модифицированного сахара конъюгирован с акцепторным сайтом, имеющим такую же структуру, как и акцепторный сайт, с которым конъюгирован любой другой модифицированный сахар, является гомогенным примерно на 100%. Гомогенность обычно выражена в виде интервала значений. Нижняя граница интервала гомогенности для пептидных конъюгатов составляет примерно 60%, примерно 70% или примерно 80%, а верхняя граница интервала частоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% или более чем примерно 90%.The term “homogeneity” refers to the structural composition of the entire population of acceptor fragments with which modified sugars are conjugated. For example, it is said that the peptide conjugate according to the invention, in which each fragment of the modified sugar is conjugated to an acceptor site having the same structure as the acceptor site with which any other modified sugar is conjugated, is approximately 100% homogeneous. Homogeneity is usually expressed as a range of values. The lower limit of the homogeneity range for peptide conjugates is about 60%, about 70%, or about 80%, and the upper limit of the frequency interval for peptide conjugates is about 70%, about 80%, about 90%, or more than about 90%.

Если пептидные конъюгаты имеют гомогенность, равную или составляющую примерно более 90%, то их гомогенность также, предпочтительно, выражена в виде интервала значений. Нижняя граница интервала гомогенности для пептидных конъюгатов составляет примерно 90%, примерно 92%, примерно 94%, примерно 96% или примерно 98%. Верхняя граница интервала гомогенности для пептидных конъюгатов составляет примерно 92%, примерно 94%, примерно 96%, примерно 98% или примерно 100%. Чистоту пептидных конъюгатов обычно определяют одним или несколькими методами, известными специалистам, например, с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), лазерной десорбционной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDITOF), капиллярного электрофореза и т.п.If the peptide conjugates have homogeneity equal to or constituting approximately 90%, then their homogeneity is also preferably expressed as a range of values. The lower limit of the homogeneity interval for peptide conjugates is about 90%, about 92%, about 94%, about 96%, or about 98%. The upper limit of the homogeneity interval for peptide conjugates is about 92%, about 94%, about 96%, about 98%, or about 100%. The purity of peptide conjugates is usually determined by one or more methods known to those skilled in the art, for example, by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), laser desorption time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF), capillary electrophoresis, and the like.

Термины “по существу, однородная гликозилированная форма” или “по существу, однородная картина гликозилирования”, если они относятся к гликопептидам, означают процент акцепторных фрагментов, гликозилированных под действием представляющей интерес гликозилтрансферазы (например, фукозилтрансферазы). Так, например, в случае α-1,2-фукозилтрансферазы, по существу, однородная картина фукозилирования наблюдается в том случае, когда в пептидном конъюгате согласно изобретению фукозилированы почти все (как определено ниже) фрагменты Gаlβ1,4-GlcNac-R и их сиалилированные аналоги. Для специалистов в этой области очевидно, что исходный материал может содержать гликозилированные акцепторные фрагменты (например, фукозилированные молекулы Gаlβ1,4-GlcNac-R). Таким образом, вычисленный процент гликозилирования означает число акцепторных фрагментов, гликозилированных способами согласно изобретению, а также число акцепторных фрагментов, которые уже были гликозилированы в исходном материале.The terms “substantially homogeneous glycosylated form” or “substantially homogeneous glycosylation pattern”, when referring to glycopeptides, mean the percentage of acceptor fragments glycosylated by the glycosyl transferase of interest (e.g., fucosyl transferase). For example, in the case of α-1,2-fucosyltransferase, a substantially uniform fucosylation pattern is observed when almost all (as defined below) Galβ1,4-GlcNac-R fragments and their sialylated fucosylated in the peptide conjugate according to the invention analogues. For specialists in this field it is obvious that the source material may contain glycosylated acceptor fragments (for example, fucosylated molecules of Galβ1,4-GlcNac-R). Thus, the calculated glycosylation percentage means the number of acceptor fragments glycosylated by the methods of the invention, as well as the number of acceptor fragments that have already been glycosylated in the starting material.

Слово “по существу”, входящее в вышеуказанное определение термина “по существу, однородный”, обычно означает, что акцепторные фрагменты для конкретной гликозилтрансферазы гликозилированы, по меньшей мере, примерно на 40%, по меньшей мере, примерно на 70%, по меньшей мере, примерно на 80% или, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 90%, а еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 95%.The word “substantially” in the above definition of “substantially homogeneous” usually means that acceptor fragments for a particular glycosyl transferase are glycosylated at least about 40%, at least about 70%, at least about 80%, or preferably at least about 90%, and even more preferably at least about 95%.

Если группы-заместители определяются их стандартными химическими формулами, записанными слева направо, то они в равной степени включают химически идентичные заместители, имеющие структурную формулу, которая должна быть записана справа налево, например -СН₂О- также означает -ОСН₂-.If substituent groups are defined by their standard chemical formulas, written from left to right, then they equally include chemically identical substituents having a structural formula that must be written from right to left, for example, —CH ₂ O— also means —OSH ₂ -.

Термин “алкил”, сам по себе или составляющий часть другого заместителя, если это не оговорено особо, означает радикал с линейной или разветвленной цепью, или циклический углеводородный радикал, или их комбинацию, которые могут быть полностью насыщенными, моно- или полиненасыщенными и могут включать ди- и поливалентные радикалы, имеющие указанное число атомов углерода (то есть С₁-С₁₀ имеет от одного до десяти атомов углерода). Примерами насыщенных углеводородных радикалов являются, но не ограничиваются ими, такие группы, как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, циклогексил, (циклогексил)метил, циклопропилметил и их гомологи и изомеры, например н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил и т.п. Ненасыщенной алкильной группой является алкильная группа, имеющая одну или несколько двойных или тройных связей. Примерами ненасыщенных алкильных групп являются, но не ограничиваются ими, винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил и высшие гомологи и изомеры. Термин “алкил”, если это не оговорено особо, также означает производные алкила, более подробно определенные ниже, такие как “гетероалкил”. Алкильные группы, ограниченные углеводородными группами, называются “гомоалкилами”.The term “alkyl”, alone or as part of another substituent, unless otherwise indicated, means a linear or branched chain radical, or a cyclic hydrocarbon radical, or a combination thereof, which may be fully saturated, mono- or polyunsaturated and may include di- and polyvalent radicals having the indicated number of carbon atoms (i.e., C ₁ -C ₁₀ has from one to ten carbon atoms). Examples of saturated hydrocarbon radicals include, but are not limited to, groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, tert-butyl, isobutyl, sec-butyl, cyclohexyl, (cyclohexyl) methyl, cyclopropylmethyl and their homologs and isomers, for example n-pentyl, n-hexyl, n-heptyl, n-octyl and the like. An unsaturated alkyl group is an alkyl group having one or more double or triple bonds. Examples of unsaturated alkyl groups include, but are not limited to, vinyl, 2-propenyl, crotyl, 2-isopentenyl, 2- (butadienyl), 2,4-pentadienyl, 3- (1,4-pentadienyl), ethynyl, 1- and 3-propynyl, 3-butynyl and higher homologues and isomers. The term “alkyl”, unless otherwise indicated, also means derivatives of alkyl, as defined in more detail below, such as “heteroalkyl”. Alkyl groups limited to hydrocarbon groups are called “homoalkyls."

Термин “алкилен” сам по себе или составляющий часть другого заместителя, если это не оговорено особо, означает происходящий от алкана двухвалентный радикал, примерами которого являются, но не ограничиваются ими, -СН₂СН₂СН₂СН₂- и который, кроме того, включает группы, определенные ниже как “гетероалкилен”. Обычно, алкильная (или алкиленовая) группа имеет от 1 до 24 атомов углерода, однако согласно настоящему изобретению предпочтительными являются группы, имеющие 10 или менее атомов углерода. “Низший алкил” или “низший алкилен” представляет собой алкильную или алкиленовую группу с более короткой цепью, обычно имеющей восемь или менее атомов углерода.The term “alkylene” alone or as part of another substituent, unless otherwise indicated, means a divalent radical derived from alkane, examples of which are, but are not limited to, —CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ - and which, moreover, includes groups defined below as “heteroalkylene”. Typically, an alkyl (or alkylene) group has from 1 to 24 carbon atoms, however, according to the present invention, groups having 10 or less carbon atoms are preferred. “Lower alkyl” or “lower alkylene” is a shorter chain alkyl or alkylene group, usually having eight or fewer carbon atoms.

Термины “алкокси”, “алкиламино” или “алкилтио” (или тиоалкокси) используются в их общепринятом смысле и означают алкильные группы, присоединенные к остальной части молекулы посредством атома кислорода, аминогруппы или атома серы соответственно.The terms “alkoxy”, “alkylamino” or “alkylthio” (or thioalkoxy) are used in their conventional sense and mean alkyl groups attached to the rest of the molecule via an oxygen atom, an amino group or a sulfur atom, respectively.

Термин “гетероалкил”, сам по себе или в комбинации с другим термином, означает, если это не оговорено особо, стабильный радикал с линейной или разветвленной цепью, или циклический углеводородный радикал, или их комбинации, состоящие из указанного числа атомов углерода и, по меньшей мере, одного гетероатома, выбранного из группы, состоящей из О, N, Si и S, где атомы азота и серы могут быть, но необязательно, окисленными, а гетероатом азота может быть, но необязательно, кватернизирован. Гетероатом(ы) О, N, S и Si может (могут) находиться в любом внутреннем положении гетероалкильной группы или в положении, в котором алкильная группа присоединена к остальной части молекулы. Примерами таких групп являются, но не ограничиваются ими, -СН₂-СН₂-О-СН₃, -СН₂-СН₂-NH-СН₃, -СН₂-СН₂-N(СН₃)-СН₃, -СН₂-S-СН₂-СН₃, -СН₂-СН₂, -S(O)-СН₃, -СН₂-СН₂-S(O)₂-СН₃, -СН=СН-О-СН₃, -Si(СН₃)₃, -СН₂-СН=N-OСН₃ и -СН=СН-N(СН₃)-СН₃. Два гетероатома могут быть расположены друг за другом, например -СН₂-NН-ОСН₃ и -СН₂-О-Si(СН₃)₃. Аналогичным образом, термин “гетероалкилен”, сам по себе или как часть другого заместителя, означает происходящий от гетероалкила двухвалентный радикал, примерами которого являются, но не ограничиваются ими, -СН₂-СН₂-S-СН₂-СН₂- и -СН₂-S-СН₂-СН₂-NН-СН₂-. В случае гетероалкиленовых групп гетероатомы могут также присутствовать на любом конце или на обоих концах цепи (например, в алкиленокси-, алкилендиокси-, алкиленамино-, алкилендиаминогруппах и т.п.). Кроме того, в случае алкиленовых и гетероалкиленовых линкерных групп ориентация линкерных групп не должна обязательно соответствовать направлению, в котором записана формула такой линкерной группы. Так, например, формула -С(О)₂R' представляет структуру, которая может быть записана формулами -С(О)₂R' и -R'С(О)₂-.The term “heteroalkyl”, alone or in combination with another term, means, unless otherwise indicated, a linear or branched chain stable radical, or a cyclic hydrocarbon radical, or combinations thereof, consisting of a specified number of carbon atoms and at least at least one heteroatom selected from the group consisting of O, N, Si and S, where the nitrogen and sulfur atoms can be, but not necessarily, oxidized, and the nitrogen heteroatom can be, but not necessarily, quaternized. The heteroatom (s) O, N, S and Si may (may) be in any internal position of the heteroalkyl group or in the position in which the alkyl group is attached to the rest of the molecule. Examples of such groups include, but are not limited to, —CH ₂ —CH ₂ —O — CH ₃ , —CH ₂ —CH ₂ —NH — CH ₃ , —CH ₂ —CH ₂ —N (CH ₃ ) —CH ₃ , -CH ₂ -S-CH ₂ -CH ₃ , -CH ₂ -CH ₂ , -S (O) -CH ₃ , -CH ₂ -CH ₂ -S (O) ₂ -CH ₃ , -CH = CH-O —CH ₃ , —Si (CH ₃ ) ₃ , —CH ₂ —CH = N — OCH _3, and —CH = CH — N (CH ₃ ) —CH ₃ . Two heteroatoms can be arranged one after another, for example, —CH ₂ —NH — OCH ₃ and —CH ₂ —O — Si (CH ₃ ) ₃ . Similarly, the term “heteroalkylene”, by itself or as part of another substituent, means a divalent radical derived from heteroalkyl, examples of which are, but are not limited to, —CH ₂ —CH ₂ —S — CH ₂ —CH ₂ - and - CH ₂ —S — CH ₂ —CH ₂ —NH — CH ₂ -. In the case of heteroalkylene groups, heteroatoms may also be present at either end or both ends of the chain (for example, alkyleneoxy, alkylenedioxy, alkyleneamino, alkylenediamine groups and the like). In addition, in the case of alkylene and heteroalkylene linker groups, the orientation of the linker groups need not necessarily correspond to the direction in which the formula of such a linker group is written. So, for example, the formula —C (O) ₂ R ′ represents a structure that can be written with the formulas —C (O) ₂ R ′ and —R′C (O) ₂ -.

Термины “циклоалкил” и “гетероциклоалкил”, сами по себе или в комбинации с другими терминами, означают, если это не оговорено особо, циклические варианты “алкила” и “гетероалкила” соответственно. Кроме того, в случае гетероциклоалкила гетероатом может находиться в положении, в котором указанный гетероцикл присоединен к остальной части молекулы. Примерами циклоалкила являются, но не ограничиваются ими, циклопентил, циклогексил, 1-циклогексенил, 3-циклогексенил, циклогептил и т.п. Примерами гетероциклоалкилов являются, но не ограничиваются ими, 1-(1,2,5,6-тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-морфолинил, 3-морфолинил, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил, тетрагидротиен-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил и т.п.The terms “cycloalkyl” and “heterocycloalkyl”, alone or in combination with other terms, mean, unless otherwise indicated, cyclic variants of “alkyl” and “heteroalkyl, respectively. In addition, in the case of heterocycloalkyl, the heteroatom may be in a position in which said heterocycle is attached to the rest of the molecule. Examples of cycloalkyl include, but are not limited to, cyclopentyl, cyclohexyl, 1-cyclohexenyl, 3-cyclohexenyl, cycloheptyl, and the like. Examples of heterocycloalkyls include, but are not limited to, 1- (1,2,5,6-tetrahydropyridyl), 1-piperidinyl, 2-piperidinyl, 3-piperidinyl, 4-morpholinyl, 3-morpholinyl, tetrahydrofuran-2-yl, tetrahydrofuran -3-yl, tetrahydrothien-2-yl, tetrahydrothien-3-yl, 1-piperazinyl, 2-piperazinyl and the like.

Термины “галогено” или “галоген” сами по себе или как часть другого заместителя означают, если это не оговорено особо, атом фтора, хлора, брома или иода. Кроме того, термины, такие как “галогеналкил”, означают моногалогеналкил и полигалогеналкил. Так, например, термин “галоген(С₁-С₄)алкил” включает, но не ограничивается ими, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4-хлорбутил, 3-бромпропил и т.п.The terms “halogen” or “halogen” by themselves or as part of another substituent means, unless otherwise indicated, a fluorine, chlorine, bromine or iodine atom. In addition, terms such as “haloalkyl” mean monohaloalkyl and polyhaloalkyl. For example, the term “halogen (C ₁ -C ₄ ) alkyl” includes, but is not limited to, trifluoromethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, 4-chlorobutyl, 3-bromopropyl, and the like.

Термин “арил” означает, если это не оговорено особо, полиненасыщенный ароматический заместитель, который может представлять собой одиночное кольцо или множество колец (предпочтительно, от 1 до 3 колец), которые являются либо конденсированными, либо ковалентно связанными друг с другом. Термин “гетероарил” означает арильные группы (или кольца), содержащие от одного до четырех гетероатомов, выбранных из N, O и S, где атомы азота и серы могут быть, но необязательно, окисленными, а атом(ы) азота является(ются), но необязательно, кватернизированным(ыми). Гетероарильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы посредством гетероатома. Неограничивающими примерами арильных и гетероарильных групп являются фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-бифенил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3-пиразолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил, пиразинил, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5-оксазолил, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил, 5-изоксазолил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3-фурил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5-бензотиазолил, пуринил, 2-бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 3-хинолил, тетразолил,The term “aryl” means, unless otherwise specified, a polyunsaturated aromatic substituent, which may be a single ring or multiple rings (preferably 1 to 3 rings) that are either fused or covalently linked to each other. The term “heteroaryl” means aryl groups (or rings) containing from one to four heteroatoms selected from N, O and S, where the nitrogen and sulfur atoms can be, but are not necessarily oxidized, and the nitrogen atom (s) is , but not necessarily, quaternized (s). A heteroaryl group may be attached to the rest of the molecule via a heteroatom. Non-limiting examples of aryl and heteroaryl groups are phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 4-biphenyl, 1-pyrrolyl, 2-pyrrolyl, 3-pyrrolyl, 3-pyrazolyl, 2-imidazolyl, 4-imidazolyl, pyrazinyl, 2-oxazolyl 4-oxazolyl, 2-phenyl-4-oxazolyl, 5-oxazolyl, 3-isoxazolyl, 4-isoxazolyl, 5-isoxazolyl, 2-thiazolyl, 4-thiazolyl, 5-thiazolyl, 2-furyl, 3-furyl, 2 -thienyl, 3-thienyl, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-pyrimidyl, 4-pyrimidyl, 5-benzothiazolyl, purinyl, 2-benzimidazolyl, 5-indolyl, 1-isoquinolyl, 5-isoquinolyl, 2 -quinoxalinyl, 5-quinoxalinyl, 3-quinolyl, tetrazolyl,

бензо[b]фуранил, бензо[b]тиенил, 2,3-дигидробензо[1,4]диоксин-6-ил, бензо[1,3]диоксол-5-ил и 6-хинолил. Заместители для каждой из вышеописанных арильных и гетероарильных циклических систем выбраны из группы приемлемых заместителей, описанных ниже.benzo [b] furanyl, benzo [b] thienyl, 2,3-dihydrobenzo [1,4] dioxin-6-yl, benzo [1,3] dioxol-5-yl and 6-quinolyl. Substituents for each of the above aryl and heteroaryl ring systems are selected from the group of acceptable substituents described below.

Для краткости, термин “арил”, если он используется в комбинации с другими терминами (например, арилокси, арилтиокси, арилалкил), включает арильные и гетероарильные кольца, определенные выше. Так, например, термин “арилалкил” означает радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (например, бензил, фенетил, пиридилметил и т.п.), включая алкильные группы, в которых атом углерода (например, метиленовая группа) заменен, например, атомом кислорода (например, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и т.п.).For brevity, the term “aryl,” if used in combination with other terms (eg, aryloxy, arylthioxy, arylalkyl), includes aryl and heteroaryl rings as defined above. Thus, for example, the term “arylalkyl” means radicals in which an aryl group is attached to an alkyl group (eg, benzyl, phenethyl, pyridylmethyl, etc.), including alkyl groups in which a carbon atom (eg, methylene group) is replaced, for example, an oxygen atom (e.g. phenoxymethyl, 2-pyridyloxymethyl, 3- (1-naphthyloxy) propyl, etc.).

Каждый из вышеуказанных терминов (например, “алкил”, “гетероалкил”, “арил” и “гетероарил”) означает как замещенные, так и незамещенные формы указанного радикала. Предпочтительные заместители для каждого типа радикала описаны ниже.Each of the above terms (for example, “alkyl”, “heteroalkyl”, “aryl” and “heteroaryl”) means both substituted and unsubstituted forms of the indicated radical. Preferred substituents for each type of radical are described below.

Заместители для алкильных и гетероалкильных радикалов (включая такие группы, которые часто называются алкиленом, алкенилом, гетероалкиленом, гетероалкенилом, алкинилом, циклоалкилом, гетероциклоалкилом, циклоалкенилом и гетероциклоалкенилом) имеют общее родовое название “заместители алкильных групп”, и эти заместители могут представлять собой одну или несколько различных групп, выбранных из групп, но не ограничивающихся ими, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R”, -SR', галоген, -SiR'R”R”', -ОС(О)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R”, -ОС(О)NR'R”-, NR”C(O)R', -NR'-C(O)NR”R”', -NR”C(O)₂R', -NR-C(NR'R”R”')=NR””, -NR-C(NR'R”)=NR”', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R”, -NRSO₂R', -CN и -NO₂, где число заместителей составляет от 0 до 2m'+1, а m' означает общее число атомов углерода в таком радикале. Каждый из R', R”, R”' и R”” независимо и предпочтительно означает водород, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, например арил, замещенный 1-3 галогенами, замещенной или незамещенной алкильной, алкокси или тиоалкоксигруппами или арилалкильными группами. Если соединение согласно изобретению, например, включает более чем одну группу R, то каждая группа R независимо выбрана из групп R', R”, R”' и R””, если присутствует более чем одна из этих групп. Если R' и R” присоединены к одному и тому же атому азота, то эти группы, вместе с атомом азота, образуют 5-, 6- или 7-членное кольцо. Так, например, -NR'R” включает, но не ограничивается ими, 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Исходя из вышеупомянутого обсуждения заместителей очевидно, что термин “алкил” означает группы, включающие атомы углерода, связанные с группами, не являющимися водородными группами, такие как галогеналкил (например, -CF₃ и -СН₂СF₃) и ацил (например, -С(О)СН₃, -С(О)СF₃, -С(О)СН₂ОСН₃ и т.п.).Substituents for alkyl and heteroalkyl radicals (including those groups often referred to as alkylene, alkenyl, heteroalkylene, heteroalkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, cycloalkenyl and heterocycloalkenyl) have the generic name “substituents of alkyl groups” and these or substituents can be several different groups selected from, but not limited to, groups -OR ', = O, = NR', = N-OR ', -NR'R ”, -SR', halogen, -SiR'R” R ”” , -OC (O) R ', -C (O) R', -CO ₂ R ', -CONR'R ”, -OC (O) NR'R” -, NR ”C (O) R', - NR'-C (O) NR "R"', -NR "C (O) ₂ R', -NR-C (NR'R " R ') = NR "", -NR -C (NR'R ") = NR"', -S (O) R ', -S (O) ₂ R', -S (O) ₂ NR'R ", —NRSO ₂ R ′, —CN and —NO ₂ , where the number of substituents is from 0 to 2m ′ + 1, and m ′ is the total number of carbon atoms in such a radical. Each of R ', R ", R"' and R "" independently and preferably means hydrogen, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, for example, aryl substituted by 1-3 halogens, substituted or unsubstituted alkyl, alkoxy or thioalkoxy groups or arylalkyl in groups. If the compound according to the invention, for example, includes more than one R group, then each R group is independently selected from the groups R ', R ", R""andR"", if more than one of these groups is present. If R 'and R ”are attached to the same nitrogen atom, then these groups, together with the nitrogen atom, form a 5-, 6- or 7-membered ring. So, for example, -NR'R ”includes, but is not limited to, 1-pyrrolidinyl and 4-morpholinyl. Based on the aforementioned discussion of substituents, it is apparent that the term “alkyl” means groups including carbon atoms bonded to non-hydrogen groups such as haloalkyl (eg —CF ₃ and —CH ₂ CF ₃ ) and acyl (eg, - C (O) CH ₃ , —C (O) CF ₃ , —C (O) CH ₂ OCH ₃ , etc.).

Аналогично заместителям, описанным для алкильного радикала, заместители для арильных и гетероарильных радикалов имеют общее родовое название “заместители арильных групп”. Такие заместители выбраны, например, из галогена, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R”, -SR', -галогена, -SiR'R”R”', -ОС(О)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R”, -ОС(О)NR'R”-, NR”C(O)R', -NR'-C(O)NR”R”', -NR”C(O)₂R', -NR-C(NR'R”R”')=NR””, -NR-C(NR'R”)=NR”', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R”, -NRSO₂R', -CN и -NO₂, -R', -N₃, -CH(Ph)₂, фтор(С₁-С₄)алкокси и фтор(С₁-С₄)алкила, где число заместителей составляет в пределах от 0 до общего числа свободных валентностей на ароматической системе, где R', R”, R”' и R”” предпочтительно и независимо выбраны из водорода, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероарила. Если соединение согласно изобретению, например, включает более чем одну группу R, то каждая группа R независимо выбрана из групп R', R”, R”' и R””, если присутствует более чем одна из этих групп. В приведенных ниже схемах символ Х представляет собой “R”, определенный выше.Similar to the substituents described for the alkyl radical, the substituents for aryl and heteroaryl radicals have the generic name “substituents of aryl groups”. Such substituents are selected, for example, from halogen, -OR ', = O, = NR', = N-OR ', -NR'R ", -SR', -halogen, -SiR'R" R "', -OC (O) R ', -C (O) R', -CO ₂ R ', -CONR'R ”, -OC (O) NR'R” -, NR ”C (O) R', -NR'- C (O) NR ”R” ', -NR ”C (O) ₂ R', -NR-C (NR'R” R ”') = NR” ”, -NR-C (NR'R”) = NR ", -S (O) R ', -S (O) ₂ R', -S (O) ₂ NR'R", -NRSO ₂ R ', -CN and -NO ₂ , -R', - N ₃ , -CH (Ph) ₂ , fluoro (C ₁ -C ₄ ) alkoxy and fluoro (C ₁ -C ₄ ) alkyl, where the number of substituents ranges from 0 to the total number of free valencies in the aromatic system, where R ' , R ”, R” ”and R” ”are preferably and independently selected from hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted nnogo or unsubstituted aryl, and substituted or unsubstituted heteroaryl. If the compound according to the invention, for example, includes more than one R group, then each R group is independently selected from the groups R ', R ", R""andR"", if more than one of these groups is present. In the diagrams below, the symbol X represents “R” as defined above.

Два заместителя на смежных атомах арила или гетероарила могут быть, но необязательно, заменены заместителем формулы -Т-С(О)-(CRR')_q-U, где T и U независимо представляют собой -NR-, -O, -CRR' или простую связь, а q равно целому числу от 0 до 3. Альтернативно, два заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть, но необязательно, заменены заместителем формулы А-(СН₂)_r-В-, где А и В независимо представляют собой -CRR'-, -О-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -S(O)₂NR' или простую связь, а r равно целому числу от 1 до 4. Одна из простых связей образованного таким образом нового кольца может быть, но необязательно, заменена двойной связью. Альтернативно, два заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть, но необязательно, заменены заместителем формулы (CRR')_S-Х-(CR”R”')_d, где s и d независимо равны целому числу от 0 до 3, а Х представляет собой -О-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂- или S(O)₂NR'-. Заместители R, R', R” и R”', предпочтительно, независимо выбраны из водорода или замещенного или незамещенного (С₁-С₆)алкила.Two substituents on adjacent aryl or heteroaryl atoms can be optionally replaced with a substituent of the formula —T — C (O) - (CRR ′) _q —U, where T and U are independently —NR—, —O, —CRR ′ or a single bond, and q is an integer from 0 to 3. Alternatively, two substituents on adjacent atoms of the aryl or heteroaryl ring may be, but are not necessarily, replaced by a substituent of the formula A- (CH ₂ ) _r -B-, where A and B are independently are -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S (O) -, -S (O) ₂ -, -S (O) ₂ NR 'or a single bond, and r is an integer a number from 1 to 4. One of the simple connections formed by that they way new ring can be optionally replaced with a double bond. Alternatively, two substituents on adjacent atoms of the aryl or heteroaryl ring may be optionally replaced with a substituent of the formula (CRR ′) _S —X— (CR ”R” ″) _d , where s and d are independently an integer from 0 to 3, and X represents —O—, —NR′—, —S—, —S (O) -, —S (O) ₂ -, or S (O) ₂ NR′—. The substituents R, R ′, R ″ and R ″ ″ are preferably independently selected from hydrogen or substituted or unsubstituted (C ₁ -C ₆ ) alkyl.

Используемый здесь термин “гетероатом” означает кислород (О), азот (N), серу (S) и кремний (Si).The term “heteroatom” as used herein means oxygen (O), nitrogen (N), sulfur (S), and silicon (Si).

ВведениеIntroduction

Настоящее изобретение относится к способу модификации гликановой структуры на G-CSF. G-CSF хорошо известен специалистам как цитокин, продуцируемый активированными Т-клетками, макрофагами, эндотелиальными клетками и стромальными фибробластами. G-CSF действует, главным образом, на костный мозг и повышает уровень продуцирования воспалительных лейкоцитов, и, кроме того, этот цитокин функционирует как эндокринный гормон, инициируя пополнение нейтрофилов, израсходованных в процессе воспалительных реакций. G-CSF также находит клиническое применение в восстановлении костного мозга после химиотерапии.The present invention relates to a method for modifying a glycan structure on G-CSF. G-CSF is well known in the art as a cytokine produced by activated T cells, macrophages, endothelial cells and stromal fibroblasts. G-CSF acts mainly on the bone marrow and increases the production of inflammatory leukocytes, and in addition, this cytokine functions as an endocrine hormone, initiating the replenishment of neutrophils consumed in the process of inflammatory reactions. G-CSF also finds clinical application in bone marrow recovery after chemotherapy.

Настоящее изобретение относится к конъюгату гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF). Настоящее изобретение также относится к конъюгатам гликозилированных и негликозилированных пептидов, обладающих гранулоцитарной колониестимулирующей активностью. Такие конъюгаты могут быть также модифицированы путем дополнительного конъюгирования с другими молекулами, такими как терапевтические молекулы, диагностические молекулы, молекулы для нацеленной доставки и т.п.The present invention relates to a conjugate of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). The present invention also relates to conjugates of glycosylated and non-glycosylated peptides having granulocyte colony stimulating activity. Such conjugates can also be modified by additional conjugation with other molecules, such as therapeutic molecules, diagnostic molecules, molecules for targeted delivery, and the like.

Настоящее изобретение также относится к способу ремоделирования и/или модификации G-CSF. G-CSF является ценным средством для лечения различных заболеваний, но, как было указано выше, его клиническая эффективность ограничена его относительно плохой фармакокинетикой.The present invention also relates to a method for remodeling and / or modifying a G-CSF. G-CSF is a valuable treatment for various diseases, but, as indicated above, its clinical efficacy is limited by its relatively poor pharmacokinetics.

В репрезентативных вариантах изобретения пептид G-CSF согласно изобретению может быть введен для предупреждения инфекции у раковых пациентов, подвергающихся лучевой терапии определенного типа, химиотерапии и трансплантации костного мозга, в целях мобилизации клеток-предшественников для сбора трансплантированных клеток-предшественников периферической крови, для лечения тяжелой хронической или относительной лейкопении, независимо от вызвавшей ее причины, и для поддерживающей терапии пациентов с острым миелоидным лейкозом. Кроме того, полипептидный конъюгат или композиция согласно изобретению могут быть использованы для лечения СПИДа или других иммунодефицитных заболеваний, а также бактериальных инфекций.In representative embodiments of the invention, the G-CSF peptide according to the invention can be introduced to prevent infection in cancer patients undergoing certain types of radiation therapy, chemotherapy and bone marrow transplantation, in order to mobilize progenitor cells to collect transplanted peripheral blood progenitor cells to treat severe chronic or relative leukopenia, regardless of the cause that caused it, and for maintenance treatment of patients with acute myeloid leukemia. In addition, the polypeptide conjugate or composition according to the invention can be used to treat AIDS or other immunodeficiency diseases, as well as bacterial infections.

G-CSF был клонирован и секвенирован. В репрезентативном варианте изобретения G-CSF имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. Для любого специалиста совершенно очевидно, что настоящее изобретение не ограничивается описанными здесь последовательностями, а также вариантами G-CSF, обсуждаемыми выше.G-CSF was cloned and sequenced. In a representative embodiment of the invention, G-CSF has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It will be apparent to any person skilled in the art that the present invention is not limited to the sequences described herein, as well as to the G-CSF variants discussed above.

Так, например, настоящее изобретение также охватывает варианты G-CSF, хорошо известные специалистам. В качестве примера, не ограничивающего настоящее изобретение, может служить вариант G-CSF, рассматриваемый в патенте США № 6166183, в котором описан G-CSF, содержащий природный комплемент лизиновых остатков и присоединенный к одной молекуле или к двум молекулам полиэтиленгликоля. Кроме того, в патентах США № 6004548, 5580755, 5582823 и 5676941 описан вариант G-CSF, в котором один или несколько цистеиновых остатков в положении 17, 36, 42, 64 и 74 заменены аланином или, альтернативно, серином. В патенте США № 5416195 описана молекула G-CSF, в которой цистеин в положении 17, аспарагиновая кислота в положении 27 и серины в положениях 65 и 66 заменены серином, серином, пролином и пролином соответственно. Специалистам хорошо известны и другие варианты, и эти варианты описаны, например, в патенте США № 5399345. Другие варианты имеют аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:3-11.For example, the present invention also encompasses G-CSF variants well known to those skilled in the art. As an example, not limiting the present invention, the G-CSF variant described in US Pat. No. 6,166,183, which describes a G-CSF containing a natural complement of lysine residues and attached to one molecule or two polyethylene glycol molecules, can be used. In addition, US Patent Nos. 6004548, 5580755, 5582823 and 5676941 describe a G-CSF variant in which one or more cysteine residues at position 17, 36, 42, 64 and 74 are replaced with alanine or, alternatively, serine. US Pat. No. 5,416,195 describes a G-CSF molecule in which cysteine at position 17, aspartic acid at position 27, and serines at positions 65 and 66 are replaced by serine, serine, proline, and proline, respectively. Other variants are well known to those skilled in the art, and these variants are described, for example, in US Pat. No. 5,399,345. Other variants have an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 3-11.

Экспрессия и активность модифицированной молекулы G-CSF согласно изобретению может быть проанализирована методами, хорошо известными специалистам и описанными, например, в патенте США № 4810643. Так, например, активность может быть измерена с помощью анализов на поглощение радиоактивно меченного тимидина. Вкратце, костный мозг, взятый от здорового человека, разрезают в градиенте плотности фиколла-гипака (1,077 г/мл, Pharmacia Piscataway, NJ) и клетки с низкой плотностью суспендируют в среде Исков (GIBCO, La Jolla, CA), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, глутамин и антибиотики. Примерно 2×10⁴ клеток человеческого костного мозга инкубируют либо с контрольной средой, либо с G-CSF согласно изобретению в 96-луночном плоскодонном планшете примерно при 37°С в атмосфере воздуха с 5% СО₂ в течение примерно 2 дней. Затем на культуры в течение примерно 4 часов подают импульсы 0,5 мкКи/лунку ³Н-тимидина (New England Nuclear, Boston, Mass.) и измеряют уровень поглощения, как описано, например, в работе Ventua et al. (1983, Blood 61:781). Увеличение уровня включения ³Н-тимидина в клетки костного мозга человека, по сравнению с клетками костного мозга, обработанного контрольным соединением, является показателем активности и стабильности соединения G-CSF.The expression and activity of the modified G-CSF molecule according to the invention can be analyzed by methods well known in the art and described, for example, in US Pat. No. 4,810,643. For example, activity can be measured using assays for the radiolabeled thymidine. Briefly, a bone marrow taken from a healthy person was cut in a density gradient of ficoll-hypak (1.077 g / ml, Pharmacia Piscataway, NJ) and low-density cells were suspended in Iscov medium (GIBCO, La Jolla, CA) containing 10% fetal bovine serum, glutamine and antibiotics. About 2 × 10 ⁴ human bone marrow cells are incubated with either the control medium or with the G-CSF according to the invention in a 96-well flat-bottom plate at about 37 ° C in an atmosphere of air with 5% CO ₂ for about 2 days. Then, 0.5 μCi / well of ³ H-thymidine (New England Nuclear, Boston, Mass.) Was applied to the cultures for about 4 hours, and the absorption level was measured, as described, for example, by Ventua et al. (1983, Blood 61: 781). An increase in the level of incorporation of ³ H-thymidine into human bone marrow cells compared to the bone marrow cells treated with the control compound is an indicator of the activity and stability of the G-CSF compound.

Как описано выше, конъюгаты согласно изобретению образуются посредством ферментативного присоединения модифицированного сахара к гликозилированному или негликозилированному пептиду G-CSF. Модифицированный сахар, если он находится между пептидом G-CSF и модифицирующей группой на сахаре, будет образовывать группу, которая может называться здесь, например, “интактной гликозильной линкерной группой”. С применением способа согласно изобретению, в котором предусматривается использование в высокой степени селективных ферментов, таких как гликозилтрансферазы, можно получить пептиды, несущие нужную группу в одном или нескольких специфических положениях. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением модифицированный сахар присоединяют непосредственно в выбранном сайте пептидной цепи G-CSF, или, альтернативно, модифицированный сахар присоединяют к углеводной части гликопептида. Пептиды, в которых модифицированные сахара связаны с углеводом гликопептида и непосредственно связаны с аминокислотным остатком пептидного остова G-CSF, также входят в объем настоящего изобретения.As described above, the conjugates of the invention are formed by enzymatically coupling a modified sugar to a glycosylated or non-glycosylated G-CSF peptide. Modified sugar, if located between the G-CSF peptide and the modifying group on the sugar, will form a group, which may be referred to herein, for example, as an “intact glycosyl linker group”. Using the method according to the invention, which envisages the use of highly selective enzymes, such as glycosyltransferases, it is possible to obtain peptides bearing the desired group in one or more specific positions. In addition, in accordance with the present invention, the modified sugar is attached directly to the selected G-CSF peptide chain site, or, alternatively, the modified sugar is attached to the carbohydrate portion of the glycopeptide. Peptides in which modified sugars are linked to a glycopeptide carbohydrate and directly linked to the amino acid residue of the G-CSF peptide backbone are also included in the scope of the present invention.

В отличие от известных стратегий химического и ферментативного синтеза пептидов способы согласно изобретению дают возможность получать пептиды и гликопептиды, которые имеют, по существу, гомогенный характер дериватизации; причем ферменты, используемые в настоящем изобретении, являются, по существу, селективными к конкретному аминокислотному остатку или к комбинации аминокислотных остатков пептида G-CSF. Такие способы также позволяют осуществлять крупномасштабное продуцирование модифицированных пептидов и гликопептидов. Таким образом, способы согласно изобретению могут найти практическое применение в крупномасштабном синтезе гликопептидов, имеющих предварительно выбранный однородный характер дериватизации. Эти способы являются особенно подходящими для модификации терапевтических пептидов, включая, но не ограничиваясь ими, гликопептиды, которые не полностью гликозилируются в процессе их синтеза в клеточных культурах (например, в клетках млекопитающих, насекомых, растений, грибов, дрожжей или прокариотов) или в трансгенных растениях или животных.In contrast to the known strategies for chemical and enzymatic synthesis of peptides, the methods according to the invention make it possible to obtain peptides and glycopeptides that have a substantially homogeneous derivatization character; moreover, the enzymes used in the present invention are essentially selective for a particular amino acid residue or for a combination of amino acid residues of the G-CSF peptide. Such methods also allow large-scale production of modified peptides and glycopeptides. Thus, the methods of the invention can find practical application in large-scale synthesis of glycopeptides having a pre-selected homogeneous derivatization pattern. These methods are particularly suitable for modifying therapeutic peptides, including but not limited to glycopeptides that are not fully glycosylated during their synthesis in cell cultures (e.g., mammalian, insect, plant, fungal, yeast, or prokaryotic cells) or transgenic plants or animals.

Настоящее изобретение также относится к конъюгатам гликозилированных и негликозилированных пептидов G-CSF с повышенным терапевтическим временем полужизни, что обусловлено, например, пониженной скоростью клиренса или пониженной скоростью поглощения иммунной или ретикулоэндотелиальной системой (РЭС). Кроме того, способы согласно изобретению позволяют осуществлять маскировку антигенных детерминант на пептидах, что приводит к снижению или предотвращению вырабатывания иммунного ответа хозяина против данного пептида. Селективное присоединение агентов для нацеленной доставки может также применяться для доставки пептида в конкретную ткань или на рецептор клеточной поверхности, который является специфичным по отношению к конкретному нацеливающему агенту.The present invention also relates to conjugates of glycosylated and non-glycosylated G-CSF peptides with an increased therapeutic half-life, due, for example, to a reduced clearance rate or a decreased absorption rate of the immune or reticuloendothelial system (RES). In addition, the methods according to the invention allow masking of antigenic determinants on peptides, which leads to a decrease or prevention of the development of an immune response of the host against this peptide. Selective attachment of agents for targeted delivery can also be used to deliver the peptide to a specific tissue or to a cell surface receptor that is specific for a particular targeting agent.

КонъюгатыConjugates

В первом своем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату, состоящему из селективной модифицирующей группы и пептида G-CSF.In a first aspect, the present invention relates to a conjugate consisting of a selective modifying group and a G-CSF peptide.

Связь между пептидом G-CSF и выбранным фрагментом включает интактную гликозильную линкерную группу, расположенную между пептидом и выбранным фрагментом. Как обсуждается в настоящем описании, выбранным фрагментом может быть, по существу, любой фрагмент, который способен присоединяться к сахаридному звену, в результате чего образуется “модифицированный сахар”, распознаваемый соответствующим ферментом трансферазой, который присоединяет модифицированный сахар к пептиду G-CSF. Сахаридный компонент модифицированного сахара, если он расположен между пептидом G-CSF и выбранным фрагментом, становится “интактной гликозильной линкерной группой”. Такая гликозильная линкерная группа образуется из любого моно- или олигосахарида, который после модификации выбранным фрагментом представляет собой субстрат для соответствующей трансферазы.The relationship between the G-CSF peptide and the selected fragment includes an intact glycosyl linker group located between the peptide and the selected fragment. As discussed in the present description, the selected fragment can be essentially any fragment that is capable of attaching to a saccharide unit, resulting in a “modified sugar” recognized by the corresponding transferase enzyme that attaches the modified sugar to the G-CSF peptide. The saccharide component of the modified sugar, if located between the G-CSF peptide and the selected fragment, becomes an “intact glycosyl linker group”. Such a glycosyl linker group is formed from any mono- or oligosaccharide, which, after modification with the selected fragment, is a substrate for the corresponding transferase.

Конъюгаты согласно изобретению обычно соответствуют общей структуре:The conjugates according to the invention usually correspond to the general structure:

в которой символы а, b, с, d и s означают положительное целое число, не равное нулю, а t равно 0 или является положительным целым числом. Термин “агент” обычно означает водорастворимый фрагмент, например остаток ПЭГ. Термин “линкер” может включать широкий набор любых связывающих групп, см. ниже. Альтернативно, линкер может представлять собой простую связь или “линкер нулевого порядка”.in which the characters a, b, c, d and s denote a positive integer that is not equal to zero, and t is 0 or is a positive integer. The term “agent” usually means a water-soluble fragment, for example a PEG residue. The term “linker” may include a wide variety of any linking groups, see below. Alternatively, the linker may be a single bond or a “zero order linker”.

В репрезентативном варианте изобретения выбранной модифицирующей группой является водорастворимый полимер, например м-ПЭГ. Такой водорастворимый полимер ковалентно связан с пептидом G-CSF посредством гликозильной линкерной группы, которая ковалентно присоединена к аминокислотному остатку или к гликозильному остатку пептида G-CSF. Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, в которых аминокислотный остаток и гликозильный остаток модифицированы гликозильной линкерной группой.In a representative embodiment of the invention, the selected modifying group is a water-soluble polymer, for example m-PEG. Such a water-soluble polymer is covalently linked to the G-CSF peptide via a glycosyl linker group that is covalently attached to the amino acid residue or to the glycosyl residue of the G-CSF peptide. The present invention also relates to conjugates in which the amino acid residue and glycosyl residue are modified by a glycosyl linker group.

Репрезентативным водорастворимым полимером является полиэтиленгликоль, например метоксиполиэтиленгликоль. Полиэтиленгликоль, используемый в настоящем изобретении, не ограничен какой-либо конкретной формой или молекулярной массой. Для неразветвленных молекул полиэтиленгликоля молекулярная масса, предпочтительно, составляет 500-100000. Предпочтительная молекула имеет молекулярную массу 2000-60000, а более предпочтительно, примерно от 5000 до 30000.A representative water-soluble polymer is polyethylene glycol, for example methoxypolyethylene glycol. The polyethylene glycol used in the present invention is not limited to any particular form or molecular weight. For unbranched polyethylene glycol molecules, the molecular weight is preferably 500-100000. A preferred molecule has a molecular weight of 2,000-60000, and more preferably about 5,000 to 30,000.

В другом варианте изобретения указанный полиэтиленгликоль представляет собой разветвленный ПЭГ, имеющий более чем один присоединенный остаток ПЭГ. Примеры разветвленных ПЭГ описаны в патентах США № 5932462, 5342940, 5643575, 5919455, 6113906, 5183660; в WO 02/09766 и у Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5:283-288 (1994) и Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52:2125-2127, 1998. Другие подходящие разветвленные структуры ПЭГ описаны в настоящей заявке.In another embodiment of the invention, said polyethylene glycol is a branched PEG having more than one attached PEG residue. Examples of branched PEGs are described in US patent No. 5932462, 5342940, 5643575, 5919455, 6113906, 5183660; in WO 02/09766 and Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994) and Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998. Other suitable branched PEG structures are described herein.

В репрезентативных вариантах изобретения молекулярная масса каждого разветвленного полиэтиленгликоля (ПЭГ) равна или превышает примерно 2000, 5000, 10000, 15000, 20000, 40000 или 60000 дальтон.In representative embodiments of the invention, the molecular weight of each branched polyethylene glycol (PEG) is equal to or greater than about 2000, 5000, 10000, 15000, 20,000, 40,000 or 60,000 daltons.

Пептиды согласно изобретению включают, по меньшей мере, сайт N- или О-связанного гликозилирования. Помимо конъюгатов, которые образуются посредством ферментативно присоединяемой гликозильной линкерной группы, настоящее изобретение относится к конъюгатам, которые являются в высокой степени гомогенными по своему характеру замещения. С применением способов согласно изобретению могут быть получены пептидные конъюгаты, в которых почти все модифицированные сахарные группы по всей популяции конъюгатов согласно изобретению присоединены к множеству копий структурно идентичных аминокислотных или гликозильных остатков. Таким образом, во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, имеющему совокупность водорастворимых полимерных фрагментов, которые ковалентно связаны с пептидом G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы. В предпочтительном конъюгате согласно изобретению, по существу, каждый член такой группы связан через гликозильную линкерную группу с гликозильным остатком пептида G-CSF, а каждый гликозильный остаток пептида G-CSF, к которому присоединена гликозильная линкерная группа, имеет идентичную структуру.The peptides of the invention include at least an N- or O-linked glycosylation site. In addition to conjugates that are formed by an enzymatically attached glycosyl linker group, the present invention relates to conjugates that are highly homogeneous in nature of substitution. Using the methods of the invention, peptide conjugates can be prepared in which almost all modified sugar groups throughout the population of conjugates of the invention are attached to multiple copies of structurally identical amino acid or glycosyl residues. Thus, in a second aspect, the present invention relates to a peptide conjugate having a plurality of water-soluble polymer fragments that are covalently linked to a G-CSF peptide via an intact glycosyl linker group. In a preferred conjugate according to the invention, essentially each member of such a group is linked through a glycosyl linker group to the glycosyl residue of the G-CSF peptide, and each glycosyl residue of the G-CSF peptide to which the glycosyl linker group is attached has an identical structure.

Настоящее изобретение также относится к пептидному конъюгату, имеющему группу водорастворимых полимерных фрагментов, ковалентно связанных друг с другом посредством гликозильной линкерной группы. В предпочтительном варианте изобретения, по существу, каждый член группы водорастворимых полимерных фрагментов связан с аминокислотным остатком пептида G-CSF посредством гликозильной линкерной группы, а каждый аминокислотный остаток, содержащий присоединенную гликозильную линкерную группу, имеет идентичную структуру.The present invention also relates to a peptide conjugate having a group of water-soluble polymer fragments covalently linked to each other via a glycosyl linker group. In a preferred embodiment of the invention, essentially each member of the group of water-soluble polymer fragments is linked to the amino acid residue of the G-CSF peptide via a glycosyl linker group, and each amino acid residue containing an attached glycosyl linker group has an identical structure.

Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, аналогичным конъюгатам, описанным выше, в которых пептид G-CSF конъюгирован с терапевтической молекулой, диагностической молекулой, нацеливающей молекулой, молекулой токсина или т.п. посредством интактной гликозильной линкерной группы. Каждая из вышеуказанных молекул может представлять собой небольшую молекулу, природный полимер (например, полипептид) или синтетический полимер.The present invention also relates to conjugates similar to those described above, in which the G-CSF peptide is conjugated to a therapeutic molecule, a diagnostic molecule, a targeting molecule, a toxin molecule, or the like. through an intact glycosyl linker group. Each of the above molecules can be a small molecule, a natural polymer (eg, a polypeptide), or a synthetic polymer.

По существу, любой пептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора или агент, имеющий любую последовательность, может быть использован в качестве пептидного компонента конъюгатов согласно изобретению. Был клонирован и секвенирован гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:1:Essentially, any granulocyte colony-stimulating factor peptide or agent having any sequence can be used as the peptide component of the conjugates of the invention. A granulocyte colony stimulating factor was cloned and sequenced. In a representative embodiment of the invention, the G-CSF peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 1:

В другом репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:2:In another representative embodiment of the invention, the G-CSF peptide has the sequence shown in SEQ ID NO: 2:

В другом репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF имеет последовательность, представленную ниже в SEQ ID NO:3-11:In another representative embodiment of the invention, the G-CSF peptide has the sequence shown below in SEQ ID NO: 3-11:

Настоящее изобретение не ограничивается представленными здесь последовательностями.The present invention is not limited to the sequences presented here.

В репрезентативном варианте изобретения пептиды G-CSF согласно изобретению включают, по меньшей мере, один сайт О-связанного гликозилирования, который гликозилирован гликозильным остатком, включающим фрагмент ПЭГ. ПЭГ ковалентно связан с пептидом G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы. Такая гликозильная линкерная группа ковалентно связана либо с аминокислотным остатком, либо с гликозильным остатком пептида G-CSF. Альтернативно, гликозильная линкерная группа присоединена к одному или нескольким гликозильным звеньям гликопептида. Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, в которых гликозильная линкерная группа присоединена к аминокислотному остатку и к гликозильному остатку.In a representative embodiment of the invention, the G-CSF peptides of the invention comprise at least one O-linked glycosylation site that is glycosylated with a glycosyl residue comprising a PEG moiety. PEG is covalently linked to the G-CSF peptide via an intact glycosyl linker group. Such a glycosyl linker group is covalently linked to either an amino acid residue or a glycosyl residue of the G-CSF peptide. Alternatively, a glycosyl linker group is attached to one or more glycosyl units of the glycopeptide. The present invention also relates to conjugates in which a glycosyl linker group is attached to an amino acid residue and to a glycosyl residue.

ПЭГ-часть присоединена к интактному гликозильному линкеру непосредственно или посредством негликозильного линкера, например замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила.The PEG moiety is attached to the intact glycosyl linker directly or via a non-glycosyl linker, for example, substituted or unsubstituted alkyl and substituted or unsubstituted heteroalkyl.

В предпочтительном варианте изобретения пептид G-CSF содержит группу, имеющую формулу I.In a preferred embodiment of the invention, the G-CSF peptide contains a group having the formula I.

Формула IFormula I

где D выбран из -ОН и R¹-L-НN; G выбран из R¹-L или С(О)(С₁-С₆)алкил; R¹ представляет собой группу, содержащую фрагмент, выбранный из линейных или разветвленных остатков полиэтиленглиголя, а L означает линкер, который выбран из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила, при условии, что если D представляет собой ОН, то G представляет собой R¹-L, а если G представляет собой С(О)(С₁-С₆)алкил, то D представляет собой R¹-L-NН-. В описанных здесь модифицированных структурах сиаловой кислоты СООН также представляет собой СОO^- и/или его соль.where D is selected from —OH and R ¹ —L — HN; G is selected from R ¹ -L or C (O) (C ₁ -C ₆ ) alkyl; R ¹ represents a group containing a moiety selected from linear or branched polyethylene glycol residues, and L means a linker that is selected from a bond, substituted or unsubstituted alkyl and substituted or unsubstituted heteroalkyl, provided that if D represents OH, then G represents R ¹ -L, and if G is C (O) (C ₁ -C ₆ ) alkyl, then D is R ¹ -L-NH-. In the modified sialic acid structures described herein, COOH also represents CoO ^- and / or its salt.

В одном из вариантов изобретения R¹-L имеет формулу:In one embodiment of the invention, R ¹ -L has the formula:

где а равно целому числу от 0 до 20.where a is an integer from 0 to 20.

В репрезентативном варианте изобретения R¹ имеет структуру, которая выбрана из:In a representative embodiment of the invention, R ¹ has a structure that is selected from:

где е и f независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500, а q равно целому числу от 1 до 20. В других вариантах изобретения R¹ имеет структуру, которая представляет собой член, выбранный из:where e and f are independently equal to integers selected from 1-2500, and q is an integer from 1 to 20. In other embodiments of the invention, R ¹ has a structure that is a member selected from:

где е, f и f' равны целым числам, независимо выбранным из 1-2500, а q и q' означают целые числа, независимо выбранные из 1-20.where e, f and f 'are integers independently selected from 1-2500, and q and q' are integers independently selected from 1-20.

В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к конъюгату пептида фактора IX, где R¹ имеет структуру, которая выбрана из:In yet another embodiment, the present invention relates to a conjugate of a factor IX peptide, where R ¹ has a structure that is selected from:

где е, f и f' независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500, а q, q' и q” равны целым числам, независимо выбранным из 1-20.where e, f and f 'are independently equal to integers selected from 1-2500, and q, q' and q ”are equal to integers independently selected from 1-20.

В других вариантах изобретения R¹ имеет структуру, которая выбрана из:In other embodiments of the invention, R ¹ has a structure that is selected from:

где е и f независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500.where e and f are independently equal to integers selected from 1-2500.

В еще одном своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему группу, имеющую формулу:In another representative embodiment, the present invention relates to a peptide containing a group having the formula:

где Gal может быть присоединен к аминокислотному или к гликозильному остатку, который непосредственно или опосредованно (например, через гликозильный остаток) присоединен к аминокислоте.where Gal can be attached to an amino acid or glycosyl residue, which directly or indirectly (for example, via a glycosyl residue) is attached to an amino acid.

В других вариантах изобретения молекула имеет формулу:In other embodiments of the invention, the molecule has the formula:

где GalNac может быть присоединен к аминокислотному или к гликозильному остатку, который непосредственно или опосредованно (например, через гликозильный остаток) присоединен к аминокислоте.where GalNac can be attached to an amino acid or glycosyl residue, which directly or indirectly (for example, via a glycosyl residue) is attached to an amino acid.

В еще одном репрезентативном варианте изобретения пептид содержит группу формулы:In another representative embodiment of the invention, the peptide contains a group of the formula:

где AA представляет собой аминокислотный остаток указанного пептида, а в каждой из вышеуказанных структур D и G являются такими, как они были определены в описании настоящего изобретения.where AA represents the amino acid residue of the indicated peptide, and in each of the above structures, D and G are as defined in the description of the present invention.

Репрезентативным аминокислотным остатком пептида G-CSF, в котором одна или несколько вышеуказанных молекул могут быть конъюгированы, является серин и треонин, например треонин 133 SEQ ID NO:1.A representative amino acid residue of the G-CSF peptide in which one or more of the above molecules can be conjugated is serine and threonine, for example, threonine 133 SEQ ID NO: 1.

В другом своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к конъюгату G-CSF, который включает гликозильный остаток, имеющий формулу:In another representative embodiment, the present invention relates to a conjugate of G-CSF, which includes a glycosyl residue having the formula:

где а, b, c, d, i, r, s, t и u независимо равны целым числам, выбранным из 0 и 1. Индекс q равен 1. Индексы е, f, g и h независимо равны целым числам, выбранным из целых чисел от 0 до 6. Индексы j, k, l и m равны целым числам, независимо выбранным из целых чисел от 0 до 100. Индексы v, w, x и y независимо равны числу, выбранному из 0 и 1, а, по меньшей мере, один из v, w, x и y равен 1. Символ AA означает аминокислотный остаток пептида G-CSF.where a, b, c, d, i, r, s, t and u are independently equal to integers selected from 0 and 1. The index q is 1. The indices e, f, g and h are independently equal to integers selected from integers numbers from 0 to 6. The indices j, k, l and m are equal to integers independently selected from integers from 0 to 100. The indices v, w, x and y are independently equal to a number selected from 0 and 1, and at least at least one of v, w, x, and y is 1. The symbol AA means the amino acid residue of the G-CSF peptide.

Символ Sia-(R) означает группу, имеющую формулу:The symbol Sia- (R) means a group having the formula:

где D выбран из -ОН и R¹-L-HN. Символ G означает R¹-L- или -С(О)(С₁-С₆)алкил. R¹ представляет собой группу, которая включает линейный или разветвленный остаток полиэтиленгликоля. L представляет собой линкер, который выбран из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. В общих чертах, если D означает ОН, то G означает R¹-L, и если G означает -С(О)(С₁-С₆)алкил, то D означает R¹-L-NH-.where D is selected from —OH and R ¹ —L — HN. The symbol G means R ¹ -L- or -C (O) (C ₁ -C ₆ ) alkyl. R ¹ represents a group that includes a linear or branched residue of polyethylene glycol. L is a linker that is selected from a bond, substituted or unsubstituted alkyl, and substituted or unsubstituted heteroalkyl. In general terms, if D is OH, then G is R ¹ -L, and if G is —C (O) (C ₁ -C ₆ ) alkyl, then D is R ¹ -L-NH—.

В другом репрезентативном варианте изобретения ПЭГ-модифицированный фрагмент сиаловой кислоты в конъюгате согласно изобретению имеет формулу:In another representative embodiment of the invention, the PEG-modified fragment of sialic acid in the conjugate according to the invention has the formula:

где индекс “s” означает целое число от 0 до 20, а n равно целому числу от 1 до 2500. В предпочтительном варианте изобретения s равно 1, а м-ПЭГ-часть имеет молекулярную массу примерно 20 кД.where the index “s” means an integer from 0 to 20, and n is an integer from 1 to 2500. In a preferred embodiment of the invention, s is 1, and the m-PEG part has a molecular weight of about 20 kD.

В еще одном репрезентативном варианте изобретения ПЭГ-модифицированная сиаловая кислота имеет формулу:In another representative embodiment of the invention, the PEG-modified sialic acid has the formula:

где L представляет собой замещенную или незамещенную алкильную или замещенную или незамещенную гетероалкильную линкерную группу, соединяющую молекулу сиаловой кислоты и молекулу ПЭГ.where L represents a substituted or unsubstituted alkyl or substituted or unsubstituted heteroalkyl linker group connecting the sialic acid molecule and the PEG molecule.

В предпочтительном варианте изобретения, по меньшей мере, два, более предпочтительно, три, а еще более предпочтительно, четыре вышеупомянутых аспарагиновых остатка функционализированы вышеуказанной N-связанной гликановой цепью.In a preferred embodiment of the invention, at least two, more preferably three, and even more preferably four of the aforementioned aspartic residues are functionalized with the above N-linked glycan chain.

Конъюгаты согласно изобретению включают интактные гликозильные линкерные группы, которые являются одновалентными или поливалентными (например, “антенные” структуры). Так, например, конъюгаты согласно изобретению включают обе молекулы, в которых выбранная группа присоединена к пептиду посредством одновалентной гликозильной линкерной группы и поливалентной линкерной группы. Настоящее изобретение также включает конъюгаты, в которых более чем одна выбранная молекула присоединена к пептиду посредством поливалентной линкерной группы.The conjugates of the invention include intact glycosyl linker groups that are monovalent or polyvalent (eg, “antenna” structures). Thus, for example, the conjugates of the invention include both molecules in which a selected group is attached to the peptide via a monovalent glycosyl linker group and a polyvalent linker group. The present invention also includes conjugates in which more than one selected molecule is attached to the peptide via a multivalent linker group.

Модифицированные сахараModified sugar

Настоящее изобретение относится к модифицированным сахарам, к модифицированным сахарсодержащим нуклеотидам и к конъюгатам модифицированных сахаров. В модифицированных сахарсодержащих соединениях согласно изобретению сахарная группа, предпочтительно, представляет собой сахарид, дезоксисахарид, аминосахарид или N-ацилсахарид. Термин “сахарид” и его эквиваленты, “сахарил”, “сахар” и “гликозил” означают мономеры, димеры, олигомеры и полимеры. Такая сахарная группа также функционализирована модифицирующей группой. Эта модифицирующая группа конъюгирована с сахарной группой, обычно, посредством конъюгирования с амином, сульфгидрилом или гидроксилом, например с первичным гидроксилом на указанном сахаре. В репрезентативном варианте изобретения модифицирующая группа присоединена к сахару посредством аминогруппы, например посредством амида, уретана или мочевины, которая образуется в результате реакции амина с реакционноспособным производным модифицирующей группы.The present invention relates to modified sugars, to modified sugar-containing nucleotides and to conjugates of modified sugars. In the modified sugar-containing compounds of the invention, the sugar group is preferably a saccharide, deoxysaccharide, aminosaccharide or N-acyl saccharide. The terms “saccharide” and its equivalents, “saccharyl”, “sugar” and “glycosyl” mean monomers, dimers, oligomers and polymers. Such a sugar group is also functionalized with a modifying group. This modifying group is conjugated to a sugar group, usually by conjugation with an amine, sulfhydryl or hydroxyl, for example with primary hydroxyl on said sugar. In a representative embodiment of the invention, the modifying group is attached to the sugar via an amino group, for example, an amide, urethane or urea, which is formed by the reaction of an amine with a reactive derivative of the modifying group.

В качестве сахарного “остова” конъюгатов согласно изобретению может быть использован любой сахар. Репрезентативными сахарами, которые могут быть использованы для получения композиций согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, глюкоза, галактоза, манноза, фукоза и сиаловая кислота. Другими подходящими сахарами являются аминосахара, такие как глюкозамин, галактозамин, маннозамин, 5-аминовый аналог сиаловой кислоты и т.п. Указанный сахарный остов может иметь структуру, обнаруживаемую в природе, либо он может быть модифицирован с образованием сайта для конъюгирования с модифицирующей группой. Так, например, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему производное сиаловой кислоты, в котором 9-гидроксигруппа заменена амином. Этот амин легко дериватизируется активированным аналогом выбранной модифицирующей группы.As the sugar “backbone” of the conjugates according to the invention, any sugar can be used. Representative sugars that can be used to prepare the compositions of the invention include, but are not limited to, glucose, galactose, mannose, fucose, and sialic acid. Other suitable sugars are amino sugars such as glucosamine, galactosamine, mannosamine, the 5-amine analogue of sialic acid, and the like. The specified sugar backbone may have a structure found in nature, or it can be modified to form a site for conjugation with a modifying group. So, for example, in one of its variants, the present invention relates to a peptide conjugate containing a sialic acid derivative in which the 9-hydroxy group is replaced by an amine. This amine is easily derivatized with an activated analog of the selected modifying group.

В обсуждении настоящего изобретения проиллюстрировано использование выбранных производных сиаловой кислоты. Специалистам в данной области очевидно, что такое обсуждение приводится лишь в иллюстративных целях и что описанные здесь структуры и композиции, по существу, могут быть применены ко всем видам сахаридных групп, модифицированных сахаридных групп, активированных модифицированных сахаридных групп и конъюгатов модифицированных сахаридных групп.In the discussion of the present invention, the use of selected sialic acid derivatives is illustrated. It will be apparent to those skilled in the art that such a discussion is for illustrative purposes only and that the structures and compositions described herein can essentially be applied to all kinds of saccharide groups, modified saccharide groups, activated modified saccharide groups, and conjugates of modified saccharide groups.

В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему амино-модифицированный сахар, имеющий формулу:In a representative embodiment, the present invention relates to a peptide conjugate containing an amino-modified sugar having the formula:

где G представляет собой гликозильную группу, L представляет собой связь или линкер, а R¹ представляет собой модифицирующую группу. Репрезентативной связью является связь, которая образуется между NH₂ на гликозильной части и группой с соответствующей реактивностью на модифицирующей группе. Таким образом, репрезентативными связями являются, но не ограничиваются ими, NHR¹, ОR¹, SR¹ и т.п. Так, например, если R¹ включает группу карбоновой кислоты, то эта группа может быть активирована и связана с группой NH₂- на гликозильном остатке с образованием связи, имеющей структуру NHC(O)R¹. Аналогичным образом, группы ОН и SH могут быть превращены в соответствующие эфирные или тиоэфирные производные соответственно.where G represents a glycosyl group, L represents a bond or a linker, and R ¹ represents a modifying group. A representative bond is a bond that forms between NH ₂ on the glycosyl moiety and a group with corresponding reactivity on the modifying group. Thus, representative bonds include, but are not limited to, NHR ¹ , OR ¹ , SR ^1, and the like. So, for example, if R ¹ includes a carboxylic acid group, then this group can be activated and linked to the NH ₂ - group on the glycosyl residue to form a bond having the structure NHC (O) R ¹ . Similarly, OH and SH groups can be converted to the corresponding ether or thioether derivatives, respectively.

Репрезентативными линкерами являются алкильные и гетероалкильные группы. Такими линкерами являются связывающие группы, например ацилсвязывающие группы, например -С(О)NH-, -ОС(О)NH- и т.п. Линкерные группы представляют собой связи, образованные между компонентами молекулы согласно изобретению, например, между гликозильной группой и линкером (L) или между линкером и модифицирующей группой (R¹). Другими линкерными группами являются эфиры, тиоэфиры и амины. Так, например, в одном из вариантов изобретения указанным линкером является аминокислотный остаток, такой как глициновый остаток. Группу карбоновой кислоты глицина превращают в соответствующий амид путем взаимодействия с амином на гликозильном остатке, а амин глицина превращают в соответствующий амид или уретан путем взаимодействия с активированной карбоновой кислотой или карбонатом модифицирующей группы.Representative linkers are alkyl and heteroalkyl groups. Such linkers are linking groups, for example, acyl linking groups, for example, —C (O) NH—, —OC (O) NH—, and the like. Linker groups are bonds formed between the components of a molecule according to the invention, for example, between a glycosyl group and a linker (L) or between a linker and a modifying group (R ¹ ). Other linker groups are esters, thioethers and amines. So, for example, in one embodiment of the invention, said linker is an amino acid residue, such as a glycine residue. The glycine carboxylic acid group is converted to the corresponding amide by reaction with an amine on the glycosyl residue, and the glycine amine is converted to the corresponding amide or urethane by reaction with an activated carboxylic acid or carbonate of the modifying group.

Другим репрезентативным линкером является молекула ПЭГ или молекула ПЭГ, функционализированная аминокислотным остатком. Такой ПЭГ связан с гликозильной группой посредством аминокислотного остатка на одном конце ПЭГ и с R¹ на другом конце ПЭГ. Альтернативно, этот аминокислотный остаток связан с R¹, а конец ПЭГ, не связанный с аминокислотой, присоединен к гликозильной группе.Another representative linker is a PEG molecule or a PEG molecule functionalized with an amino acid residue. Such a PEG is bound to the glycosyl group via an amino acid residue at one end of the PEG and to R ¹ at the other end of the PEG. Alternatively, this amino acid residue is bound to R ¹ , and the end of the PEG, not bound to the amino acid, is attached to the glycosyl group.

Репрезентативная молекула NН-L-R¹ имеет формулу:A representative NH-LR ¹ molecule has the formula:

-NН{С(О)(СН₂)_аNН}_s{С(О)(СН₂)_b(ОСН₂СН₂)_сО(СН₂)_dNH}_tR¹, где индексы s и t независимо равны 0 или 1. Индексы а, b и d независимо равны целым числам от 0 до 20, а с равно целому числу от 1 до 2500. Другие аналогичные линкеры получают на основе молекул, в которых группа -NН заменена, например, на -S, -О и -СН₂.—NH {C (O) (CH ₂ ) _a NH} _s {C (O) (CH ₂ ) _b (OCH ₂ CH ₂ ) _with O (CH ₂ ) _d NH} _t R ¹ , where the indices s and t are independently equal to 0 or 1. Indexes a , b and d are independently equal to integers from 0 to 20, and c is an integer from 1 to 2500. Other similar linkers are obtained on the basis of molecules in which the group -NН is replaced, for example, by -S , -O and -CH ₂ .

Более конкретно, настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему соединения, в которых NН-L-R¹ представляет собой:More specifically, the present invention relates to a peptide conjugate containing compounds in which NH-LR ¹ is:

NНС(О)(СН₂)_аNНС(О)(СН₂)_b(ОСН₂СН₂)_сО(СН₂)_dNHR¹,NCH (O) (CH ₂ ) _a NCH (O) (CH ₂ ) _b (OCH ₂ CH ₂ ) _with O (CH ₂ ) _d NHR ¹ ,

NНС(О)(СН₂)_b(ОСН₂СН₂)_сО(СН₂)_dNHR¹,NCH (O) (CH ₂ ) _b (OCH ₂ CH ₂ ) _with O (CH ₂ ) _d NHR ¹ ,

NНС(О)О(СН₂)_b(ОСН₂СН₂)_сО(СН₂)_dNHR¹,NCH (O) O (CH ₂ ) _b (OCH ₂ CH ₂ ) _c O (CH ₂ ) _d NHR ¹ ,

NНС(СН₂)_аNНС(О)(СН₂)_b(ОСН₂СН₂)_сО(СН₂)_dNHR¹, NНС(О)(СН₂)_аNНR¹,NHC (CH ₂ ) _a NHC (O) (CH ₂ ) _b (OCH ₂ CH ₂ ) _with O (CH ₂ ) _d NHR ¹ , NHC (O) (CH ₂ ) _a NHR ¹ ,

NН(СН₂)_аNНR¹ и NНR¹. В этих формулах индексы а, b и d независимо выбраны из целых чисел от 0 до 20, а предпочтительно, от 1 до 5. Индекс с равен целому числу от 1 до 2500.NH (CH ₂ ) _and NHR ¹ and NHR ¹ . In these formulas, indices a, b and d are independently selected from integers from 0 to 20, and preferably from 1 to 5. Index c is equal to an integer from 1 to 2500.

В иллюстративном варианте изобретения G представляет собой сиаловую кислоту, а выбранные соединения согласно изобретению имеют формулы:In an illustrative embodiment of the invention, G is sialic acid, and selected compounds according to the invention have the formula:

Как очевидно для специалистов в данной области, молекула сиаловой кислоты в описанных выше репрезентативных соединениях может быть заменена любым другим аминосахаридом, включая, но не ограничиваясь ими, глюкозамин, галактозамин, маннозамин, их N-ацетильные производные и т.п.As is apparent to those skilled in the art, the sialic acid molecule in the representative compounds described above can be replaced by any other aminosaccharide, including, but not limited to, glucosamine, galactosamine, mannosamine, their N-acetyl derivatives, and the like.

В другом иллюстративном варианте изобретения первичная гидроксильная группа сахара функционализирована модифицирующей группой. Так, например, 9-гидроксил сиаловой кислоты может быть превращен в соответствующий амин и функционализирован с получением соединений согласно изобретению. Соединения согласно этому варианту изобретения имеют формулы:In another illustrative embodiment of the invention, the primary hydroxyl group of the sugar is functionalized with a modifying group. So, for example, 9-hydroxyl sialic acid can be converted to the corresponding amine and functionalized to obtain compounds according to the invention. Compounds according to this embodiment of the invention have the formulas:

В другом своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему модифицированные сахара, в которых гидроксигруппа в 6 положении превращена в соответствующую аминогруппу, несущую кластер “линкер - модифицирующая группа”, такой как кластер, описанный выше. Репрезентативными сахарными группами, которые могут быть использованы в качестве остова этих модифицированных сахаров, являются Gаl, GаlNac, Glc, GlcNac, Fuc, Xyl, Man и т.п. Репрезентативный модифицированный сахар согласно этому варианту изобретения имеет формулу:In another representative embodiment, the present invention relates to a peptide conjugate containing modified sugars in which the 6-position hydroxy group is converted to the corresponding amino group carrying a “linker-modifying group” cluster, such as the cluster described above. Representative sugar groups that can be used as the backbone of these modified sugars are Gal, GalNac, Glc, GlcNac, Fuc, Xyl, Man, and the like. A representative modified sugar according to this embodiment of the invention has the formula:

где R³-R⁵ и R⁷ представляют собой члены, независимо выбранные из Н, ОН, С(О)СН₃, NH и NHC(O)СН₃, а R⁶ представляет собой ОR¹, NHR¹ или NH-L-R¹, определенные выше.where R ³ -R ⁵ and R ⁷ are members independently selected from H, OH, C (O) CH ₃ , NH and NHC (O) CH ₃ , and R ⁶ is OR ¹ , NHR ^1, or NH-LR ¹ as defined above.

Выбранные конъюгаты согласно изобретению получены на основе маннозы, галактозы или глюкозы или на основе молекул, имеющих стереохимическую структуру маннозы, галактозы или глюкозы.Selected conjugates according to the invention are derived from mannose, galactose or glucose, or based on molecules having the stereochemical structure of mannose, galactose or glucose.

Эти конъюгаты имеют общие формулы:These conjugates have the general formulas:

В другом своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к описанным выше соединениям, которые были активированы в виде соответствующих сахаров, содержащихся в нуклеотидах. Репрезентативными сахарсодержащими нуклеотидами, используемыми в настоящем изобретении в их модифицированной форме, являются моно-, ди- или трифосфаты нуклеотидов или их аналоги. В предпочтительном варианте изобретения модифицированный сахарсодержащий нуклеотид выбран из УДФ-глюкозы, ЦМФ-гликозида или ГДФ-гликозида. Еще более предпочтительно, чтобы сахарная часть модифицированного сахарсодержащего нуклеотида была выбрана из УДФ-галактозы, УДФ-галактозамина, УДФ-глюкозы, УДФ-глюкозамина, ГДФ-маннозы, ГДФ-фукозы, ЦМФ-сиаловой кислоты или ЦМФ-NeuAc. В репрезентативном варианте изобретения фосфат нуклеотида присоединен к С-1.In another representative embodiment, the present invention relates to the compounds described above, which have been activated as the corresponding sugars contained in the nucleotides. Representative sugar-containing nucleotides used in their modified form in the present invention are mono-, di- or triphosphates of nucleotides or their analogues. In a preferred embodiment, the modified sugar-containing nucleotide is selected from UDP glucose, CMP glycoside or HDF glycoside. Even more preferably, the sugar portion of the modified sugar-containing nucleotide is selected from UDP galactose, UDP galactosamine, UDP glucose, UDP glucosamine, HDF mannose, HDF-fucose, CMP-sialic acid, or CMP-NeuAc. In a representative embodiment of the invention, the nucleotide phosphate is attached to C-1.

Таким образом, в своем иллюстративном варианте, где гликозильная группа представляет собой сиаловую кислоту, настоящее изобретение относится к пептидным конъюгатам, которые были получены с использованием соединений, имеющих формулы:Thus, in its illustrative embodiment, where the glycosyl group is sialic acid, the present invention relates to peptide conjugates that have been prepared using compounds having the formulas:

где L-R¹ имеет значения, определенные выше, а L-R¹ представляет собой линкер, связанный с модифицирующей группой. Как и в случае L, репрезентативная линкерная молекула в соответствии с L¹ включает связь, алкильные или гетероалкильные группы. Репрезентативные нуклеотидные соединения, содержащие модифицированный сахар согласно этим вариантам изобретения, представлены на фиг.1 и фиг.2.where LR ¹ has the meanings given above, and LR ¹ is a linker linked to a modifying group. As in the case of L, a representative linker molecule in accordance with L ¹ includes a bond, alkyl or heteroalkyl groups. Representative nucleotide compounds containing a modified sugar according to these embodiments of the invention are shown in FIG. 1 and FIG. 2.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к конъюгату, образованному модифицированным сахаром согласно изобретению и субстратом, например пептидом, липидом, агликоном и т.п., а более конкретно, модифицированным сахаром и гликозильным остатком гликопетида или гликолипида. В этом варианте изобретения сахарная часть указанного модифицированного сахара становится гликозильной линкерной группой, расположенной между субстратом и модифицирующей группой. Репрезентативной гликозильной линкерной группой является интактная гликозильная линкерная группа, в которой гликозильная часть или части, образующие линкерную группу, не расщепляются под действием химических (например, под действием метапериодата натрия) или ферментативных (например, оксидазных) реакций. Выбранные конъюгаты согласно изобретению включают модифицирующую группу, которая присоединена к аминогруппе аминосахарида, например маннозамина, глюкозамина, галактозамина, сиаловой кислоты и т.п. Репрезентативный кластер “модифицирующая группа - интактная гликозильная линкерная группа” согласно этому варианту получен на основе структуры сиаловой кислоты, такой как структура, имеющая формулы:In another embodiment, the present invention relates to a conjugate formed by a modified sugar according to the invention and a substrate, for example a peptide, lipid, aglycon and the like, and more specifically, a modified sugar and glycosyl residue of a glycopetide or glycolipid. In this embodiment of the invention, the sugar portion of said modified sugar becomes a glycosyl linker group located between the substrate and the modifying group. A representative glycosyl linker group is an intact glycosyl linker group in which the glycosyl moiety or the moieties forming the linker moiety are not cleaved by chemical (e.g., sodium metaperiodate) or enzymatic (e.g., oxidase) reactions. Selected conjugates according to the invention include a modifying group that is attached to the amino group of an amino saccharide, for example mannosamine, glucosamine, galactosamine, sialic acid, and the like. The representative cluster “modifying group — intact glycosyl linker group” according to this embodiment is obtained based on a sialic acid structure, such as a structure having the formulas:

где, в вышеуказанной формуле, R¹, L¹ и L² имеют значения, указанные выше.where, in the above formula, R ¹ , L ¹ and L ² have the meanings indicated above.

В еще одном репрезентативном варианте изобретения конъюгат был образован субстратом и сахарной группой в 1 положении, и в этом конъюгате модифицирующая группа присоединена посредством линкера у атома углерода в 6 положении сахарной группы. Таким образом, иллюстративные конъюгаты согласно этому варианту изобретения имеют формулы:In another representative embodiment of the invention, the conjugate was formed by a substrate and a sugar group at the 1 position, and in this conjugate, a modifying group is attached via a linker at the carbon atom at the 6 position of the sugar group. Thus, the illustrative conjugates according to this embodiment of the invention have the formulas:

где указанные радикалы являются такими, как они были описаны выше. Для специалистов в данной области очевидно, что модифицированные сахарные группы, представленные выше, могут быть также конъюгированы с субстратом у атомов углерода в положениях 2, 3, 4 или 5.wherein said radicals are as described above. For specialists in this field it is obvious that the modified sugar groups presented above can also be conjugated with a substrate at carbon atoms in positions 2, 3, 4 or 5.

Иллюстративные соединения согласно этому варианту изобретения имеют формулы:Illustrative compounds according to this embodiment of the invention have the formulas:

где группы R и индексы являются такими, как они определены выше.where the R groups and indices are as defined above.

Настоящее изобретение также относится к сахарсодержащим нуклеотидам, модифицированным группой L-R¹ у атома углерода в 6 положении. Примером такой молекулы согласно этому варианту изобретения является:The present invention also relates to sugar-containing nucleotides modified with a LR ¹ group at the carbon atom in the 6 position. An example of such a molecule according to this embodiment of the invention is:

где группы R и L представляют собой группы, обсуждаемые выше. Индекс “у” равен 0, 1 или 2.where the groups R and L are the groups discussed above. The y index is 0, 1, or 2.

Другой репрезентативный сахарсодержащий нуклеотид согласно изобретению имеет в своей основе стереохимическую структуру ГДФ-маннозы. Репрезентативная молекула согласно этому варианту изобретения имеет структуру:Another representative sugar-containing nucleotide according to the invention is based on the stereochemical structure of HDF-mannose. A representative molecule according to this embodiment of the invention has the structure:

В еще одном своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к конъюгату, основанному на стереохимической структуре УДФ-галактозы. Репрезентативное соединение согласно этому варианту изобретения имеет структуру:In yet another representative embodiment, the present invention relates to a conjugate based on the stereochemical structure of UDP galactose. A representative compound according to this embodiment of the invention has the structure:

В другом репрезентативном варианте изобретения сахарсодержащий нуклеотид имеет в своей основе стереохимическую структуру глюкозы. Репрезентативная молекула согласно этому варианту изобретения имеет формулы:In another representative embodiment of the invention, the sugar-containing nucleotide is based on the stereochemical structure of glucose. A representative molecule according to this embodiment of the invention has the formulas:

Модифицирующая группа R¹ представляет собой любую группу, включая, но не ограничиваясь ими, водорастворимые полимеры, не растворимые в воде полимеры, терапевтические агенты, диагностические агенты и т.п. Природа репрезентативных модифицирующих групп более подробно обсуждается ниже.The modifying group R ¹ is any group, including, but not limited to, water-soluble polymers, water-insoluble polymers, therapeutic agents, diagnostic agents, and the like. The nature of representative modifying groups is discussed in more detail below.

Модифицирующие группыModifying groups

Водорастворимые полимерыWater soluble polymers

Многие водорастворимые полимеры известны специалистам и могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. Термин “водорастворимый” полимер охватывает такие молекулы, как сахариды (например, декстран, амилозу, гиалуроновую кислоту, полисиаловую кислоту, гепараны, гепарины и т.п.); полиаминокислоты, например полиаспарагиновую кислоту и полиглутаминовую кислоту; нуклеиновые кислоты; синтетические полимеры, например полиакриловую кислоту, полиэфиры, например полиэтиленгликоль; пептиды, белки и т.п. Настоящее изобретение может быть осуществлено с применением любого водорастворимого полимера, однако с одним лишь условием, что такой полимер должен иметь положение, у которого может быть присоединена остальная часть конъюгата.Many water-soluble polymers are known in the art and can be used to carry out the present invention. The term “water soluble” polymer encompasses molecules such as saccharides (eg, dextran, amylose, hyaluronic acid, polysialic acid, heparanes, heparins, etc.); polyamino acids, for example polyaspartic acid and polyglutamic acid; nucleic acids; synthetic polymers, for example polyacrylic acid, polyesters, for example polyethylene glycol; peptides, proteins, and the like. The present invention can be carried out using any water-soluble polymer, however, with the sole condition that such a polymer must have a position in which the rest of the conjugate can be attached.

Описание методов активации полимеров можно также найти в WO 94/17039, в патенте США № 5324844, в WO 94/18247, в WO 94/04193, в патенте США № 5219564, в патенте США № 5122614, в WO 90/13540, в патенте США № 5281698, а также в WO 93/15189, и в литературе также описаны методы конъюгирования активированных полимеров с пептидами, например фактором свертывания крови VIII (WO 94/15625), гемоглобином (WO 94/09027), молекулой, несущей кислород (патент США № 4412989), рибонуклеазой и супероксид-дисмутазой (Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11:141-45 (1985)).A description of polymer activation methods can also be found in WO 94/17039, in US patent No. 5324844, in WO 94/18247, in WO 94/04193, in US patent No. 5219564, in US patent No. 5122614, in WO 90/13540, in US patent No. 5281698, as well as in WO 93/15189, and the literature also describes methods for conjugating activated polymers with peptides, for example, coagulation factor VIII (WO 94/15625), hemoglobin (WO 94/09027), a molecule that carries oxygen ( US patent No. 4412989), ribonuclease and superoxide dismutase (Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)).

Предпочтительными водорастворимыми полимерами являются полимеры, в которых основная часть полимерных молекул в образце полимера имеет приблизительно идентичную молекулярную массу, и такие полимеры называются “гомодисперсными”.Preferred water-soluble polymers are polymers in which the bulk of the polymer molecules in the polymer sample have approximately the same molecular weight, and such polymers are called “homodisperse”.

Настоящее изобретение также проиллюстрировано на конъюгате полиэтиленгликоля. Существует ряд статей и монографий, в которых описаны функционализация и конъюгирование ПЭГ. См., например, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25:325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135:30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14:866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6:150-165 (1995) and Bhadra et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002). Методы получения реакционноспособных молекул ПЭГ и конъюгатов с использованием таких реакционноспособных молекул известны специалистам. Так, например, в патенте США № 5672662 описан водорастворимый и выделяемый конъюгат активного сложного эфира полимерной кислоты, выбранной из линейных или разветвленных полиалкиленоксидов, полиоксиэтилированных полиолов, полиолефиновых спиртов и полиакриломорфолина.The present invention is also illustrated on a polyethylene glycol conjugate. There are a number of articles and monographs that describe the functionalization and conjugation of PEG. See, for example, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995) and Bhadra et al., Pharmazie, 57: 5-29 (2002). Methods for preparing reactive PEG molecules and conjugates using such reactive molecules are known to those skilled in the art. So, for example, US patent No. 5672662 describes a water-soluble and secreted conjugate of an active ester of a polymer acid selected from linear or branched polyalkylene oxides, polyoxyethylated polyols, polyolefin alcohols and polyacrylomorpholine.

В патенте США № 6376604 описан метод получения водорастворимого сложного эфира 1-бензотриазолилкарбоновой кислоты водорастворимого и непептидного полимера путем взаимодействия концевого гидроксила данного полимера с ди(1-бензотриазолил)карбонатом в органическом растворителе. Активный сложный эфир используется для получения конъюгатов с биологически активным агентом, таким как белок или пептид.US Pat. No. 6,376,604 describes a method for preparing a water-soluble 1-benzotriazolylcarboxylic acid ester of a water-soluble and non-peptide polymer by reacting the terminal hydroxyl of this polymer with a di (1-benzotriazolyl) carbonate in an organic solvent. The active ester is used to formulate conjugates with a biologically active agent, such as a protein or peptide.

В WO 99/45964 описан конъюгат, содержащий биологически активный агент и активированный водорастворимый полимер, включающий полимерный остов, который, по меньшей мере, у одного своего конца связан с другим полимерным остовом посредством стабильной связи, где, по меньшей мере, один конец содержит разветвляющую группу, имеющую проксимальные реакционноспособные группы, присоединенные к такой разветвляющей группе, и где указанный биологически активный агент связан, по меньшей мере, с одной из проксимальных реакционноспособных групп. Другие разветвленные полиэтиленгликоли описаны в WO 96/21469. В патенте США № 5932462 описан конъюгат, образованный разветвленной молекулой ПЭГ, которая имеет разветвленный конец, содержащий реакционноспособные функциональные группы. Свободные реакционноспособные группы могут реагировать с биологически активной молекулой, такой как белок или пептид, с образованием конъюгатов полиэтиленгликоля и биологически активной молекулы. В патенте США № 5446090 описан бифункциональный линкер ПЭГ, и описано его использование для получения конъюгатов, содержащих пептид на каждом конце линкера ПЭГ.WO 99/45964 describes a conjugate comprising a biologically active agent and an activated water-soluble polymer comprising a polymer backbone that is bound at least at one end to the other polymer backbone via a stable bond, where at least one end contains a branching a group having proximal reactive groups attached to such a branching group, and wherein said biologically active agent is associated with at least one of the proximal reactive groups. Other branched polyethylene glycols are described in WO 96/21469. US Pat. No. 5,932,462 describes a conjugate formed by a branched PEG molecule that has a branched end containing reactive functional groups. Free reactive groups can react with a biologically active molecule, such as a protein or peptide, to form conjugates of a polyethylene glycol and a biologically active molecule. US Pat. No. 5,446,090 describes a bifunctional PEG linker and its use for preparing conjugates containing a peptide at each end of a PEG linker.

Конъюгаты, включающие разлагаемые ПЭГ-связи, описаны в WO 99/34883 и в WO 99/14259, а также в патенте США № 6348558. Такие разлагаемые линкеры могут быть использованы в настоящем изобретении.Conjugates comprising degradable PEG bonds are described in WO 99/34883 and WO 99/14259, as well as in US Pat. No. 6,348,558. Such degradable linkers can be used in the present invention.

Хорошо известные методы активации полимеров, описанные выше, используются в контексте изобретения для получения описанных здесь разветвленных полимеров, а также для конъюгирования этих разветвленных полимеров с другими молекулами, например сахарами, сахарсодержащими нуклеотидами и т.п.The well-known polymer activation methods described above are used in the context of the invention to obtain the branched polymers described herein, as well as to conjugate these branched polymers with other molecules, for example, sugars, sugar-containing nucleotides, and the like.

Репрезентативными молекулами полиэтиленгликоля, используемыми в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, молекулы, имеющие формулу:Representative polyethylene glycol molecules used in the present invention are, but are not limited to, molecules having the formula:

где R⁸ представляет собой Н, ОН, NH₂, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, например ацеталь, -ОНС-, H₂N-(СН₂)_q-, HS-(СН₂)_q или -(СН₂)_qС(Y)Z¹. Индекс “е” равен целому числу от 1 до 2500. Индексы b, d и q независимо равны целым числам от 0 до 20. Символы Z и Z¹ независимо представляют собой ОН, NH₂, удаляемые группы, например имидазол, п-нитрофенил, НОВТ, тетразол, галогенид, -S-R⁹, спиртовую часть активированных сложных эфиров; -(СН₂)_pС(Y¹)V или -(СН₂)_рU(СН₂)_sC(Y¹)_v. Символ Y представляет собой Н(2), =О, =S, =N-R¹⁰. Символы X, Y, Y¹, A¹ и U независимо представляют собой О, S, N-R¹¹. Символ V представляет собой ОН, NH₂, галоген, S-R¹², спиртовой компонент активированных сложных эфиров, аминовый компонент активированных амидов, сахарсодержащих нуклеотидов и белков. Индексы p, q, s и v равны целым числам, независимо выбранным из 0-20. Символы R⁹, R¹⁰, R¹¹ и R¹² независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный гетероарил.where R ⁸ represents H, OH, NH ₂ , substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, for example acetal, —OH—, H ₂ N- (CH ₂ ) _q -, HS- (CH ₂ ) _q or - (CH ₂ ) _q С (Y) Z ¹ . Index “e” is an integer from 1 to 2500. Indexes b, d and q are independently equal to integers from 0 to 20. The symbols Z and Z ¹ independently represent OH, NH ₂ , leaving groups, for example imidazole, p-nitrophenyl, NOVT, tetrazole, halide, -SR ⁹ , the alcohol part of the activated esters; - (CH ₂ ) _p C (Y ¹ ) V or - (CH ₂ ) _p U (CH ₂ ) _s C (Y ¹ ) _v . The symbol Y represents H (2), = O, = S, = NR ¹⁰ . The symbols X, Y, Y ¹ , A ^1, and U independently represent O, S, NR ¹¹ . Symbol V represents OH, NH ₂ , halogen, SR ¹² , the alcohol component of activated esters, the amine component of activated amides, sugar nucleotides and proteins. The indices p, q, s and v are equal to integers independently selected from 0-20. The symbols R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ and R ¹² independently represent H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, and substituted or unsubstituted heteroaryl.

В других репрезентативных вариантах изобретения молекула полиэтиленгликоля выбрана из:In other representative embodiments of the invention, the polyethylene glycol molecule is selected from:

Полиэтиленгликоль, используемый для получения конъюгата согласно изобретению, является либо линейным, либо разветвленным. Разветвленными молекулами полиэтиленгликоля, подходящими для использования в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, молекулы формулы:The polyethylene glycol used to produce the conjugate according to the invention is either linear or branched. Branched molecules of polyethylene glycol suitable for use in the present invention are, but are not limited to, molecules of the formula:

где R⁸ и R⁸' независимо выбраны из групп, определенных выше для R⁸. А¹ и А² независимо выбраны из групп, определенных выше для А¹. Индексы е, f, o и q определены выше. Z и Y также определены выше. Х¹ и Х¹' независимо выбраны из S, SС(О)NН, НNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH, NHC(O)O и ОС(О)NН.where R ⁸ and R ⁸ 'are independently selected from the groups defined above for R ⁸ . A ¹ and A ^{2 are} independently selected from the groups defined above for A ¹ . The indices e, f, o and q are defined above. Z and Y are also defined above. X ¹ and X ¹ ′ are independently selected from S, SC (O) NH, HNC (O) S, SC (O) O, O, NH, NHC (O), (O) CNH, NHC (O) O and OC (O) NH.

В других репрезентативных вариантах изобретения разветвленный ПЭГ получают на основе цистеинового, серинового или дилизинового остова. Так, например, другими репрезентативными разветвленными ПЭГ являются:In other representative embodiments of the invention, the branched PEG is prepared on the basis of a cysteine, serine, or dilizine backbone. So, for example, other representative branched PEGs are:

В другом варианте изобретения разветвленная молекула ПЭГ основана на пептиде, содержащем трилизин. Такой трилизин может быть моно-, ди-, три- или тетраПЭГилированным. Репрезентативные молекулы согласно этому варианту изобретения имеют формулы:In another embodiment, the branched PEG molecule is based on a peptide containing trilizine. Such trilizine may be mono-, di-, tri- or tetra-PEGylated. Representative molecules according to this embodiment of the invention have the formulas:

где е, f и f' независимо выбраны из целых чисел от 1 до 2500, а q, q' и q” независимо выбраны из целых чисел от 1 до 20.where e, f and f 'are independently selected from integers from 1 to 2500, and q, q' and q ”are independently selected from integers from 1 to 20.

В репрезентативных вариантах изобретения ПЭГ представляет собой м-ПЭГ (5 кД, 10 кД или 20 кД). Репрезентативным разветвленным ПЭГ является серин- или цистеин-(м-ПЭГ)₂, где м-ПЭГ имеет массу 20 кД.In representative embodiments of the invention, the PEG is m-PEG (5 kD, 10 kD or 20 kD). A representative branched PEG is serine- or cysteine- (m-PEG) ₂ , where m-PEG has a mass of 20 kD.

Как очевидно специалистам, разветвленные полимеры, используемые в настоящем изобретении, включают варианты молекул, описанных выше. Так, например, описанный выше конъюгат “дилизин - ПЭГ” может включать три полимерных субъединицы, где третья субъединица, связанная с α-амином, показана в вышеприведенной структуре как немодифицированная. Аналогичным образом, использование в данном полимере трех лизинов, функционализированных тремя или четырьмя полимерными субъединицами, входит в объем настоящего изобретения.As will be appreciated by those skilled in the art, the branched polymers used in the present invention include variants of the molecules described above. For example, the “Dilizin-PEG” conjugate described above may include three polymer subunits, where the third subunit associated with the α-amine is shown in the above structure as unmodified. Similarly, the use of three lysines functionalized with three or four polymer subunits in a given polymer is within the scope of the present invention.

Конкретными вариантами настоящего изобретения являются:Specific embodiments of the present invention are:

и их карбонаты и активные сложные эфиры, такие как:and their carbonates and active esters, such as:

Другими активирующими или удаляемыми группами, подходящими для активации линейных ПЭГ, используемых для получения описанных здесь соединений, являются, но не ограничиваются ими, следующие группы:Other activating or removable groups suitable for activating linear PEGs used to prepare the compounds described herein include, but are not limited to, the following groups:

Молекулы ПЭГ, которые активируются этими и другими молекулами, и методы получения активированных ПЭГ описаны в WO 04/083259.PEG molecules that are activated by these and other molecules, and methods for producing activated PEG are described in WO 04/083259.

Специалистам в данной области очевидно, что одна или несколько ветвей м-ПЭГ разветвленного полимера могут быть заменены ПЭГ-частью с различными концами, например с ОН, СООН, NH₂, С₂-С₁₀алкилом и т.п. Кроме того, вышеуказанные структуры могут быть легко модифицированы путем встраивания алкильных линкеров (или удаления атомов углерода) между α-углеродным атомом и функциональной группой боковой цепи. Таким образом, “гомо”-производные и высшие гомологи, а также низшие гомологи входят в объем остовов для разветвленных ПЭГ, используемых в настоящем изобретении.It will be apparent to those skilled in the art that one or more branches of the m-PEG branched polymer can be replaced by the PEG part at different ends, for example, OH, COOH, NH ₂ , C ₂ -C ₁₀ alkyl, and the like. In addition, the above structures can be easily modified by incorporating alkyl linkers (or removing carbon atoms) between the α-carbon atom and the side chain functional group. Thus, “homo” derivatives and higher homologs, as well as lower homologs, are included in the volume of the backbone PEG backbones used in the present invention.

Представленные здесь разветвленные молекулы ПЭГ могут быть легко получены методами, проиллюстрированными в нижеследующей схеме:The branched PEG molecules presented here can be easily obtained by the methods illustrated in the following scheme:

где Х^а представляет собой О или S, а r равно целому числу от 1 до 5. Индексы е и f независимо выбраны из целых чисел от 1 до 2500.where X ^a represents O or S, and r is an integer from 1 to 5. The indices e and f are independently selected from integers from 1 to 2500.

Таким образом, в соответствии с этой схемой природную или неприродную аминокислоту подвергают контакту с активированным производным м-ПЭГ, в данном случае с тозилатом, в результате чего путем алкилирования гетероатома Х^а боковой цепи получают соединение 1. Монофункционализированную аминокислоту м-ПЭГ подвергают N-ацилированию реакционноспособным производным м-ПЭГ, в результате чего получают разветвленный м-ПЭГ 2. Для специалистов в данной области очевидно, что удаляемая группа тозилата может быть заменена любой подходящей удаляемой группой, например галогеном, мезилатом, трифлатом и т.п. Аналогичным образом, реакционноспособный карбонат, используемый для ацилирования амина, может быть заменен активным сложным эфиром, например N-гидроксисукцинимидом и т.п., либо кислота может быть активирована in situ c использованием дегидратирующего агента, такого как дициклогексилкарбодиимид, карбонилдиимидазол и т.п.Thus, according to this scheme, a natural or non-natural amino acid is contacted with an activated m-PEG derivative, in this case a tosylate, whereby compound 1 is obtained by alkylation of the side chain heteroatom X ^and N-acylation monofunctional amino acid a reactive derivative of m-PEG, resulting in a branched m-PEG 2. For specialists in this field it is obvious that the deleted tosylate group can be replaced by any suitable deleted g uppoy, for example halogen, mesylate, triflate, etc. Similarly, the reactive carbonate used to acylate an amine can be replaced with an active ester, for example N-hydroxysuccinimide and the like, or the acid can be activated in situ using a dehydrating agent such as dicyclohexylcarbodiimide, carbonyldiimidazole and the like.

В репрезентативном варианте изобретения указанной модифицирующей группой является группа ПЭГ, однако любая модифицирующая группа, например водорастворимый полимер, не растворяющийся в воде полимер, терапевтическая молекула и т.п., может быть включена в гликозильную часть посредством соответствующей связи. Модифицированный сахар получают ферментативными методами, химическими методами или их комбинацией. В репрезентативном варианте изобретения сахара подвергают реакции замещения с активным амином в любом положении, что позволяет присоединять модифицирующую группу, а также позволяет использовать сахар в качестве субстрата для фермента, способного присоединять модифицированный сахар к пептиду G-CSF. В репрезентативном варианте изобретения, если галактозамин представляет собой модифицированный сахар, то аминовая часть присоединяется у атома углерода в 6 положении.In a representative embodiment of the invention, said modifying group is a PEG group, however, any modifying group, for example, a water-soluble polymer, a water-insoluble polymer, a therapeutic molecule, and the like, can be incorporated into the glycosyl moiety via an appropriate bond. Modified sugar is obtained by enzymatic methods, chemical methods, or a combination thereof. In a representative embodiment of the invention, the sugars undergo a substitution reaction with the active amine at any position, which allows the modifying group to be attached, and also allows the use of sugar as a substrate for an enzyme capable of attaching the modified sugar to the G-CSF peptide. In a representative embodiment of the invention, if galactosamine is a modified sugar, then the amine moiety is attached at the carbon atom in the 6 position.

Молекулы, модифицированные водорастворимым полимеромMolecules Modified by Water Soluble Polymer

В настоящем изобретении используются молекулы сахаров нуклеотидов, модифицированных водорастворимым полимером, в которых сахарная группа модифицирована указанным водорастворимым полимером. Репрезентативный модифицированный сахарсодержащий нуклеотид несет сахарную группу, модифицированную аминогруппой на указанном сахаре. В способах согласно изобретению могут быть также использованы модифицированные сахарсодержащие нуклеотиды, например сахариламиновые производные сахарсодержащего нуклеотида. Так, например, сахариламин (без модифицирующей группы) может быть ферментативно конъюгирован с пептидом (или с другой молекулой), а затем свободная сахариламиногруппа может быть конъюгирована с нужной модифицирующей группой. Альтернативно, модифицированный сахарсодержащий нуклеотид может функционировать как субстрат для фермента, который переносит модифицированный сахар на сахарный рецептор на субстрате, например на пептиде, гликопептиде, липиде, агликоне, гликолипиде и т.п.The present invention uses sugar molecules of nucleotides modified with a water-soluble polymer, in which the sugar group is modified with said water-soluble polymer. A representative modified sugar-containing nucleotide carries a sugar group modified with an amino group on said sugar. Modified sugar-containing nucleotides, for example, saccharylamine derivatives of a sugar-containing nucleotide, can also be used in the methods of the invention. So, for example, saccharylamine (without a modifying group) can be enzymatically conjugated to a peptide (or to another molecule), and then the free saccharylamino group can be conjugated to the desired modifying group. Alternatively, the modified sugar-containing nucleotide may function as a substrate for an enzyme that transfers the modified sugar to a sugar receptor on a substrate, for example, a peptide, glycopeptide, lipid, aglycone, glycolipid and the like.

В одном из вариантов изобретения, в котором сахаридным остовом является галактоза или глюкоза, R⁵ представляет собой NHC(O)Y.In one embodiment of the invention in which the saccharide backbone is galactose or glucose, R ⁵ is NHC (O) Y.

В репрезентативном варианте изобретения модифицированный сахар получают на основе 6-амино-N-ацетилгликозильной молекулы. Как показано ниже для N-ацетилгалактозамина, 6-аминосахарная молекула может быть легко получена стандартными методами.In a representative embodiment of the invention, the modified sugar is derived from a 6-amino-N-acetylglycosyl molecule. As shown below for N-acetylgalactosamine, the 6-amino sugar molecule can be easily obtained by standard methods.

В вышеуказанной схеме индекс n означает целое число от 1 до 2500, предпочтительно, от 10 до 1500, а более предпочтительно от 10 до 1200. Символ “А” означает активирующую группу, например галоген, компонент активированного сложного эфира (например, N-гидроксисукцинимидоэфир), компонент карбоната (например, п-нитрофенилкарбоната) и т.п. Для специалистов в данной области очевидно, что этими и аналогичными методами могут быть легко получены и другие сахара нуклеотидов, модифицированных ПЭГ-амидом.In the above scheme, the index n means an integer from 1 to 2500, preferably from 10 to 1500, and more preferably from 10 to 1200. The symbol “A” means an activating group, for example, a halogen, component of an activated ester (for example, N-hydroxysuccinimidino ester) , a carbonate component (e.g. p-nitrophenyl carbonate), and the like. For specialists in this field it is obvious that these and similar methods can easily be obtained and other sugar nucleotides modified with PEG-amide.

В других репрезентативных вариантах изобретения амидная группа заменена такой группой, как уретан или мочевина.In other representative embodiments of the invention, the amide group is replaced by a group such as urethane or urea.

В других вариантах изобретения R¹ представляет собой разветвленный ПЭГ, один из которых, например, описан выше. Иллюстративными соединениями согласно этому варианту изобретения являютсяIn other embodiments, R ¹ is a branched PEG, one of which, for example, is described above. Illustrative compounds according to this embodiment of the invention are

где Х⁴ означает связь или О.where X ⁴ means a bond or O.

Кроме того, как обсуждается выше, настоящее изобретение относится к пептидным конъюгатам, полученным с использованием сахарсодержащих нуклеотидов, модифицированных водорастворимым полимером, который имеет либо линейную, либо разветвленную цепь. Так, например, в объем настоящего изобретения входят соединения, имеющие формулы, представленные ниже:In addition, as discussed above, the present invention relates to peptide conjugates obtained using sugar-containing nucleotides modified with a water-soluble polymer that has either a linear or branched chain. So, for example, the scope of the present invention includes compounds having the formulas shown below:

где Х⁴ означает О или связь.where X ⁴ means O or bond.

Аналогичным образом, настоящее изобретение относится к пептидным конъюгатам, полученным с использованием сахарсодержащих нуклеотидов, имеющих молекулу модифицированного сахара, в которой атом углерода в 6 положении является модифицированным:Similarly, the present invention relates to peptide conjugates obtained using sugar-containing nucleotides having a modified sugar molecule in which the carbon atom in the 6 position is modified:

где Х⁴ означает связь или О.where X ⁴ means a bond or O.

Настоящее изобретение также относится к конъюгатам пептидов и гликопептидов, липидов и гликолипидов, которые включают композиции настоящего изобретения. Так, например, настоящее изобретение относится к конъюгатам, имеющим нижеследующие формулы:The present invention also relates to conjugates of peptides and glycopeptides, lipids and glycolipids, which include compositions of the present invention. So, for example, the present invention relates to conjugates having the following formulas:

Полимеры, нерастворимые в водеWater Insoluble Polymers

В другом варианте изобретения, аналогичном вариантам, обсуждаемым выше, модифицированные сахара включают вместо водорастворимого полимера полимер, не растворяющийся в воде. Конъюгаты согласно изобретению могут также включать одни или несколько не растворимых в воде полимеров. Этот вариант изобретения проиллюстрирован на примере применения конъюгата в качестве носителя, который обеспечивает регулируемую доставку терапевтического пептида. Системы доставки конъюгированных с полимером лекарственных средств известны специалистам. См., например, Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol.469, American Chemical Society, Washington, DC. 1991. Для специалистов в данной области очевидно, что к конъюгатам согласно изобретению может быть применена, по существу, любая известная система доставки лекарственного средства.In another embodiment of the invention, similar to the options discussed above, modified sugars include a water-insoluble polymer instead of a water-soluble polymer. The conjugates of the invention may also include one or more water insoluble polymers. This embodiment of the invention is illustrated by the use of a conjugate as a carrier that provides controlled delivery of a therapeutic peptide. Polymer conjugated drug delivery systems are known in the art. See, for example, Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, DC. 1991. It will be apparent to those skilled in the art that essentially any known drug delivery system can be applied to the conjugates of the invention.

Репрезентативными не растворимыми в воде полимерами являются, но не ограничиваются ими, полифосфазины, поливилиновые спирты, полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены, полиакриламиды, полиалкиленгликоли, полиалкиленоксиды, полиалкилентерефталаты, поливиниловые простые эфиры, поливиниловые сложные эфиры, поливинилгалогениды, поливинилпирролидон, полигликоли, полисилоксаны, полиуретаны, полиметилметакрилат, полиэтилметакрилат, полибутилметакрилат, полиизобутилметакрилат, полигексилметакрилат, полиизодецилметакрилат, полилаурилметакрилат, полифенилметакрилат, полиметилакрилат, полиизопропилакрилат, полиизобутилакрилат, полиоктадецилакрилат, полиэтилен, полипропилен, полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид, полиэтилентерефталат, поливинилацетат, поливинилхлорид, полистирол, поливинилпирролидон, плюроники и поливинилфенол и их сополимеры.Representative water-insoluble polymers include, but are not limited to, polyphosphazines, polyvinyl alcohols, polyamides, polycarbonates, polyalkylenes, polyacrylamides, polyalkylene glycols, polyalkylene oxides, polyalkylene terephthalates, polyvinyl ethers, polyvinyl esters, polyvinyl ethers, polyvinyl ethers, polyvinyl ethers, polyvinyl ethers, polyvinyl ethers, polyvinyl ethers, polyvinyl ethers polymethyl methacrylate, polyethyl methacrylate, polybutyl methacrylate, polyisobutyl methacrylate, polyhexyl methacrylate, polyisodecyl methacrylate, polilaurylmeta crylate, polyphenylmethacrylate, polymethylacrylate, polyisopropyl acrylate, polyisobutyl acrylate, polyoctadecyl acrylate, polyethylene, polypropylene, polyethylene glycol, polyethylene oxide, polyethylene terephthalate, polyvinyl acetate, polyvinyl chloride, polyvinylpyrrolylene and polyvinylpyrrolylene.

Синтетически модифицированными природными полимерами, подходящими для использования в конъюгатах согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, алкилцеллюлозы, гидроксиалкилцеллюлозы, простые эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы и нитроцеллюлоза. Особенно предпочтительными членами широкого класса синтетически модифицированных природных полимеров являются, но не ограничиваются ими, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксибутилметилцеллюлоза, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетат-бутират целлюлозы, ацетат-фталат целлюлозы, карбоксиметилцеллюлоза, триацетат целлюлозы, натриевая соль сульфата целлюлозы и полимеры сложных эфиров акриловой и метакриловой кислоты и альгиновой кислоты.Synthetically modified natural polymers suitable for use in the conjugates of the invention include, but are not limited to, alkyl celluloses, hydroxyalkyl celluloses, cellulose ethers, cellulose esters and nitrocellulose. Particularly preferred members of a wide class of synthetically modified natural polymers include, but are not limited to, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, hydroxybutyl methyl cellulose, cellulose acetate, cellulose propionate, cellulose acetate butyl cellulose acetate, cellulose cellulose acetate, carboxylate cellulose and polymers of esters of acrylic and methacrylic acid and alginic acid.

Эти и другие обсуждаемые здесь полимеры могут быть легко получены из коммерчески доступных источников, таких как Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Polysciences (Warrenton, PA), Aldrich (Milwaukee, WI), Fluka (Ronkonkoma, NY) и BioRad (Richmond, CA), или они могут быть синтезированы стандартными методами из мономеров, закупленных у этих поставщиков.These and other polymers discussed herein can be readily obtained from commercially available sources such as Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Polysciences (Warrenton, PA), Aldrich (Milwaukee, WI), Fluka (Ronkonkoma, NY) and BioRad (Richmond, CA), or they can be synthesized by standard methods from monomers purchased from these suppliers .

Репрезентативными биологически разлагаемыми полимерами, используемыми в конъюгатах согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, полилактиды, полигликолиды и их сополимеры, полиэтилентерефталат, полимасляная кислота, поливалериановая кислота, сополимер лактида и капролактона, сополимер лактида и гликолида, полиангидриды, полиортоэфиры, их смеси и сополимеры. Особенно подходящими являются композиции, образующие гели, такие как гели, включающие коллаген, плюроники и т.п.Representative biodegradable polymers used in the conjugates of the invention include, but are not limited to, polylactides, polyglycolides and their copolymers, polyethylene terephthalate, polybutyric acid, polyvaleric acid, a lactide-caprolactone copolymer, a lactide-glycolide copolymer, polyanhydrides, polyanhydrides thereof copolymers. Especially suitable are gel-forming compositions, such as gels including collagen, pluronics and the like.

Полимерами, используемыми в настоящем изобретении, являются “гибридные” полимеры, которые включают нерастворимые в воде материалы, содержащие, по меньшей мере, в части своей структуры биологически ресорбируемую молекулу. Примером такого полимера является полимер, который представляет собой нерастворимый в воде сополимер, имеющий биологически ресорбируемую область, гидрофильную область и множество перекрестносшиваемых функциональных групп на одну полимерную цепь.The polymers used in the present invention are “hybrid” polymers that include water-insoluble materials containing at least part of their structure a biologically resorbable molecule. An example of such a polymer is a polymer which is a water-insoluble copolymer having a biologically resorbable region, a hydrophilic region and a plurality of crosslinkable functional groups per polymer chain.

В соответствии с настоящим изобретением термин “нерастворимые в воде материалы” включают материалы, которые, по существу, не растворяются в воде или в водных средах. Таким образом, хотя некоторые области или сегменты сополимера могут быть гидрофильными или даже водорастворимыми, однако, в целом, такая полимерная молекула, по существу, не растворяется в воде.In accordance with the present invention, the term “water-insoluble materials” includes materials that are substantially insoluble in water or in aqueous media. Thus, although some regions or segments of the copolymer may be hydrophilic or even water soluble, however, in general, such a polymer molecule is not substantially soluble in water.

В соответствии с настоящим изобретением термин “биологически ресорбируемая молекула” включает область, способную подвергаться метаболизму или разлагаться в организме и ресорбироваться и/или элиминироваться этим организмом по обычным экскреторным путям. Предпочтительно, чтобы такие метаболиты или продукты распада были, в основном, нетоксичными для организма.In accordance with the present invention, the term “biologically resorbable molecule” includes a region capable of being metabolized or decomposed in the body and resorbed and / or eliminated by this organism through conventional excretory pathways. Preferably, such metabolites or breakdown products are substantially non-toxic to the body.

Биологически ресорбируемая область может быть либо гидрофобной, либо гидрофильной, при условии, что сополимерная композиция, в целом, не является водорастворимой. Так, например, биологически ресорбируемую область выбирают, предпочтительно, так, чтобы данный полимер, в целом, оставался не растворимым в воде. В соответствии с этим относительные свойства, то есть тип функциональных групп, содержащихся в указанной биологически ресорбируемой области, и относительное содержание биологически ресорбируемой области и гидрофильной области выбирают так, чтобы используемые биологически ресорбируемые композиции оставались не растворимыми в воде.A biologically resorbable region can be either hydrophobic or hydrophilic, provided that the copolymer composition is not generally water soluble. Thus, for example, a biologically resorbable region is preferably selected such that the polymer as a whole remains insoluble in water. Accordingly, the relative properties, that is, the type of functional groups contained in the indicated biologically resorbable region, and the relative content of the biologically resorbable region and the hydrophilic region, are selected so that the biologically resorbable compositions used remain insoluble in water.

Репрезентативными ресорбируемыми полимерами являются, например, синтетически продуцируемые ресорбируемые блок-сополимеры поли(α-гидрокси-карбоновая кислота)/поли(оксиалкилен)(см. Cohn et al., патент США № 4826945). Эти сополимеры не являются сшитыми, но являются водорастворимыми, а поэтому расщепленные блок-сополимерные композиции могут выводиться из организма. См. Younes et al., J. Biomed. Mater. Res. 21:1301-1316 (1987) и Cohn et al., J. Biomed. Mater. Res. 22:993-1009 (1988).Representative resorbable polymers are, for example, synthetically produced resorbable block copolymers of poly (α-hydroxy-carboxylic acid) / poly (oxyalkylene) (see Cohn et al., US patent No. 4826945). These copolymers are not crosslinked, but are water soluble, and therefore cleaved block copolymer compositions can be excreted from the body. See Younes et al., J. Biomed. Mater. Res. 21: 1301-1316 (1987) and Cohn et al., J. Biomed. Mater. Res. 22: 993-1009 (1988).

Предпочтительными биологически ресорбируемыми полимерами согласно изобретению являются один или несколько компонентов, выбранных из полиэфиров, полиоксикислот, полилактонов, полиамидов, полиэфироамидов, полиаминокислот, полиангидридов, полиортоэфиров, поликарбонатов, полифосфазинов, полифосфоэфиров, политиоэфиров, полисахаридов и их смесей. Еще более предпочтительно, чтобы биологически ресорбируемый полимер включал компонент полиоксикислоту. Из этих полиоксикислот предпочтительными являются полимолочная кислота, полигликолевая кислота, поликапроновая кислота, полимасляная кислота, поливалериановая кислота и их сополимеры и смеси.Preferred biologically resorbable polymers according to the invention are one or more components selected from polyesters, polyoxyacids, polylactones, polyamides, polyetheramides, polyamino acids, polyanhydrides, polyorthoesters, polycarbonates, polyphosphazines, polyphosphoesters, polythioesters, and mixtures thereof. Even more preferably, the biologically resorbable polymer comprises a polyoxy acid component. Of these polyoxy acids, polylactic acid, polyglycolic acid, polycaproic acid, polybutyric acid, polyvaleric acid and their copolymers and mixtures thereof are preferred.

Предпочтительные полимерные покрытия, используемые в способах согласно изобретению, помимо того, что они образуют фрагменты, которые абсорбируются in vivo (“биологически ресорбируются”), могут также образовывать и экскретируемые и/или подвергающиеся метаболизму фрагменты.Preferred polymer coatings used in the methods of the invention, in addition to forming fragments that are absorbed in vivo (“biologically resorbable”), can also form excreted and / or metabolized fragments.

В настоящем изобретении могут быть также использованы сополимеры высшего порядка. Так, например, в патенте США № 4438253, выданном 20 марта 1984, Casey et al., описаны трехкомпонентные блок-сополимеры, полученные из полигликолевой кислоты и гидроксиконцевого полиалкиленгликоля путем переэтерификации. Эти описанные композиции предназначены для использования в качестве ресорбируемых моноволокнистых шовных материалов. Эластичность таких композиций регулируется введением ароматического ортокарбоната, такого как тетра-п-толилортокарбонат, в структуру сополимера.Higher order copolymers can also be used in the present invention. So, for example, in US patent No. 4438253, issued March 20, 1984, Casey et al., Describes three-component block copolymers obtained from polyglycolic acid and hydroxy-terminal polyalkylene glycol by transesterification. These described compositions are intended for use as resorbable monofilament suture materials. The elasticity of such compositions is controlled by incorporating an aromatic orthocarbonate, such as tetra-p-tolyl orthocarbonate, into the copolymer structure.

Могут быть также использованы и другие полимеры, полученные на основе молочной и/или гликолевой кислот. Так, например, в патенте США № 5202413, выданном 13 апреля 1993, Spinu, описаны биологически разлагаемые многокомпонентные блок-сополимеры, содержащие последовательно расположенные блоки полилактида и/или полигликолида, продуцированные путем полимеризации с раскрытием кольца из лактида и/или гликолида с образованием либо олигомерного диола, либо диаминового остатка и последующего удлинения цепи с помощью бифункционального соединения, такого как диизоцианат, диацилхлорид или дихлорсилан.Other polymers based on lactic and / or glycolic acid may also be used. For example, US Pat. No. 5,202,413, issued April 13, 1993 to Spinu, describes biodegradable multicomponent block copolymers containing sequentially arranged blocks of polylactide and / or polyglycolide, produced by ring-opening polymerization of lactide and / or glycolide to form either oligomeric diol or diamine residue and subsequent chain extension with a bifunctional compound such as diisocyanate, diacyl chloride or dichlorosilane.

Биологически ресорбируемые области полимерных покрытий, используемых в настоящем изобретении, могут быть сконструированы так, чтобы они были гидролитически и/или ферментативно расщепляемыми. В соответствии с настоящим изобретением термин “гидролитически расщепляемый” относится к восприимчивости данного сополимера, а особенно биологически ресорбируемой области, к гидролизу в воде или в водной среде. Аналогичным образом, используемый здесь термин “ферментативно расщепляемый” относится к восприимчивости сополимера, а особенно биологически ресорбируемой области, к расщеплению эндогенными или экзогенными ферментами.The biologically resorbable regions of the polymer coatings used in the present invention can be designed to be hydrolytically and / or enzymatically cleavable. In accordance with the present invention, the term “hydrolytically cleavable” refers to the susceptibility of this copolymer, and especially the biologically resorbable region, to hydrolysis in water or in an aqueous medium. Similarly, the term “enzymatically cleavable” as used herein refers to the susceptibility of the copolymer, and especially the biologically resorbable region, to cleavage by endogenous or exogenous enzymes.

При введении в организм гидрофильная область может процессироваться с образованием экскретируемых и/или подвергающихся метаболизму фрагментов. Таким образом, гидрофильная область может включать, например, полиэфиры, полиалкиленоксиды, полиолы, поливинилпирролидин, поливиниловый спирт, полиалкилоксазолины, полисахариды, углеводы, пептиды, белки и их сополимеры и смеси. Кроме того, гидрофильной областью может быть также, например, полиалкиленоксид. Такими полиалкиленоксидами могут быть, например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и их смеси и сополимеры.When introduced into the body, the hydrophilic region can be processed to form excreted and / or metabolized fragments. Thus, the hydrophilic region may include, for example, polyesters, polyalkylene oxides, polyols, polyvinyl pyrrolidine, polyvinyl alcohol, polyalkyloxazolines, polysaccharides, carbohydrates, peptides, proteins and their copolymers and mixtures thereof. In addition, the hydrophilic region may also be, for example, polyalkylene oxide. Such polyalkylene oxides can be, for example, polyethylene oxide, polypropylene oxide and mixtures and copolymers thereof.

В настоящем изобретении могут быть также использованы полимеры, которые являются компонентами гидрогелей. Гидрогели представляют собой полимерные материалы, способные абсорбировать относительно большое количество воды. Примерами гидрогельобразующих соединений являются, но не ограничиваются ими, полиакриловые кислоты, натрийсодержащая карбоксиметилцеллюлоза, поливиниловый спирт, поливинилпирролидин, желатин, карагенан и другие полисахариды, гидроксиэтиленметакриловая кислота (НЕМА), а также их производные и т.п. Могут быть получены гидрогели, которые являются стабильными, биологически разлагаемыми и биологически ресорбируемыми. Кроме того, гидрогелевые композиции могут включать субъединицы, обладающие одним или несколькими из указанных свойств.Polymers that are components of hydrogels can also be used in the present invention. Hydrogels are polymeric materials capable of absorbing a relatively large amount of water. Examples of hydrogel forming compounds include, but are not limited to, polyacrylic acids, sodium carboxymethyl cellulose, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidine, gelatin, carrageenan and other polysaccharides, hydroxyethylene methacrylic acid (NEMA), as well as their derivatives and the like. Hydrogels that are stable, biodegradable, and biodegradable can be prepared. In addition, hydrogel compositions may include subunits having one or more of these properties.

Биологически совместимые гидрогелевые композиции, целостность которых может регулироваться посредством образования поперечных связей (сшивания), являются известными и предпочтительными для использования в способах согласно изобретению. Так, например, в патенте США № 5410016, выданном 25 апреля 1995, и в патенте США № 5529914, выданном 25 июня 1996, Hubbell et al., описаны водорастворимые системы, которые представляют собой сшитые блок-сополимеры, имеющие водорастворимый центральный блок-сегмент, расположенный по типу “сэндвича” между двумя гидролитически лабильными удлиняющими сегментами. Такие сополимеры “кэпированы” по концу фотополимеризуемыми акрилатными функциональными группами. При сшивании такие системы образуют гидрогели. Водорастворимый центральный блок таких сополимеров может включать полиэтиленгликоль, тогда как гидролитически активные удлиняющие фрагменты могут представлять собой поли-α-гидроксикислоту, такую как полигликолевая или полимолочная кислота. См. Sawhney et al., Macromolecules 26:581-587 (1993).Biologically compatible hydrogel compositions, the integrity of which can be controlled by crosslinking (crosslinking), are known and preferred for use in the methods of the invention. So, for example, in US patent No. 5410016, issued April 25, 1995, and in US patent No. 5529914, issued June 25, 1996, Hubbell et al., Describes water-soluble systems, which are crosslinked block copolymers having a water-soluble central block segment located like a “sandwich” between two hydrolytically labile extension segments. Such copolymers are “capped” at the end by photopolymerizable acrylate functional groups. When crosslinked, such systems form hydrogels. The water soluble central block of such copolymers may include polyethylene glycol, while the hydrolytically active extension moieties may be a poly-α-hydroxy acid, such as polyglycolic or polylactic acid. See Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-587 (1993).

В другом предпочтительном варианте изобретения указанным гелем является термообратимый гель. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными являются термообратимые гели, включающие такие компоненты, как плюроники, коллаген, желатин, гиалуроновая кислота, полисахариды, полиуретановый гидрогель, гидрогель, состоящий из полиуретана-мочевины, и их комбинации.In another preferred embodiment of the invention, said gel is a heat-reversible gel. In accordance with the present invention, thermoreversible gels are preferred, including components such as pluronics, collagen, gelatin, hyaluronic acid, polysaccharides, polyurethane hydrogel, polyurethane-urea hydrogel, and combinations thereof.

В еще одном репрезентативном варианте изобретения конъюгат согласно изобретению включает такой компонент, как липосомы. Липосомы могут быть получены методами, известными специалистам, например, как описано Eppstein et al. в патенте США № 4522811, выданном 11 июня 1985. Так, например, липосомные композиции могут быть получены путем растворения соответствующего липида(ов) (такого, как стеароилфосфотидилэтаноламин, стеароилфосфатидилхолин, араходоилфосфатидилхолин и холестерин) в неорганическом растворителе, который затем выпаривают, после чего на поверхности сосуда остается тонкая пленка из сухого липида. Затем в этот сосуд вводят водный раствор активного соединения или его фармацевтически приемлемой соли. После этого содержимое сосуда встряхивают вручную для отделения липидного материала от боковых стенок сосуда и для диспергирования липидных агрегатов, в результате чего получают липосомную суспензию.In yet another representative embodiment of the invention, the conjugate of the invention comprises a component such as liposomes. Liposomes can be obtained by methods known in the art, for example, as described by Eppstein et al. in US patent No. 4522811, issued June 11, 1985. Thus, for example, liposome compositions can be obtained by dissolving the corresponding lipid (s) (such as stearoylphosphotidylethanolamine, stearoylphosphatidylcholine, arachodoylphosphatidylcholine and cholesterol) in an inorganic solvent, followed by dissolving, followed by dissolving, then a thin film of dry lipid remains on the surface of the vessel. An aqueous solution of the active compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof is then introduced into this vessel. After that, the contents of the vessel are shaken manually to separate the lipid material from the side walls of the vessel and to disperse the lipid aggregates, resulting in a liposome suspension.

Вышеупомянутые микрочастицы и способы получения таких микрочастиц описаны здесь в качестве примеров и не должны рассматриваться как ограничение объема микрочастиц, используемых в настоящем изобретении. Для специалистов в данной области очевидно, что в настоящем изобретении может быть использован набор микрочастиц, полученных различными способами.The above microparticles and methods for producing such microparticles are described here as examples and should not be construed as limiting the volume of microparticles used in the present invention. For specialists in this field it is obvious that in the present invention can be used a set of microparticles obtained in various ways.

Структурные формы, обсуждаемые выше в связи с водорастворимыми полимерами, имеющими как линейную, так и разветвленную цепь, в общих чертах, могут быть применимы также и к полимерам, которые не растворяются в воде. Так, например, разветвленные остовы, состоящие из цистеина, серина, двух лизинов и трех лизинов, могут быть функционализированы двумя не растворимыми в воде полимерными молекулами. Методы, используемые для продуцирования таких полимеров, по существу, аналогичны методам, используемым для получения водорастворимых полимеров.The structural forms discussed above in connection with water-soluble polymers having both linear and branched chains, in general terms, can also be applied to polymers that are not soluble in water. For example, branched cores consisting of cysteine, serine, two lysines and three lysines can be functionalized by two water-insoluble polymer molecules. The methods used to produce such polymers are essentially similar to the methods used to produce water-soluble polymers.

Время полужизни терапевтических гликопептидов in vivo может быть также увеличено с использованием ПЭГ-молекул, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Так, например, химическая модификация белков с помощью ПЭГ (ПЭГилирование) приводит к увеличению размера молекул и к снижению доступности их поверхности и функциональных групп, где каждое из этих свойств зависит от размера ПЭГ, присоединенного к белку. Это способствует увеличению времени полужизни этих белков в плазме и устойчивости к протеолизу, а также снижению уровней иммуногенности и поглощения печенью (Chaffee et al., J. Clin. Invest. 89:1643-1651 (1992); Pyatak et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29:113-127 (1980)). Сообщалось, что ПЭГилирование интерлейкина-2 повышает его противоопухолевую эффективность in vivo (Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:1487-1491 (1987)), а ПЭГилирование фрагмента F(ab')₂, происходящего от моноклонального антитела А7, способствует улучшению его локализации в опухоли (Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 28:1387-1394 (1990)). Таким образом, в другом предпочтительном варианте изобретения время полужизни in vivo пептида, дериватизированного молекулой ПЭГ способом согласно изобретению, увеличивается по сравнению с временем полужизни in vivo недериватизированного пептида.The in-vivo half-life of therapeutic glycopeptides can also be extended using PEG molecules such as polyethylene glycol (PEG). For example, chemical modification of proteins using PEG (PEGylation) leads to an increase in the size of molecules and to a decrease in the availability of their surface and functional groups, where each of these properties depends on the size of the PEG attached to the protein. This contributes to an increase in plasma half-life and resistance to proteolysis, as well as lower levels of immunogenicity and absorption by the liver (Chaffee et al., J. Clin. Invest. 89: 1643-1651 (1992); Pyatak et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29: 113-127 (1980)). PEGylation of interleukin-2 has been reported to increase its antitumor efficacy in vivo (Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1487-1491 (1987)), and PEGylation of the F (ab ') ₂ fragment occurring from monoclonal antibody A7, improves its localization in the tumor (Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 1387-1394 (1990)). Thus, in another preferred embodiment of the invention, the in-vivo half-life of the peptide derivatized by the PEG molecule according to the invention is increased compared to the in-vivo half-life of the non-derivatized peptide.

Увеличение времени полужизни пептида in vivo лучше всего выражать как интервал процента увеличения его количества. Нижний конец указанного интервала процента увеличения составляет примерно 40%, примерно 60%, примерно 80%, примерно 100%, примерно 150% или примерно 200%. Верхний конец такого интервала составляет примерно 60%, примерно 80%, примерно 100%, примерно 150% или более чем примерно 250%.An in vivo increase in half-life of a peptide is best expressed as the interval of the percentage increase in its amount. The lower end of the indicated range of percent increase is about 40%, about 60%, about 80%, about 100%, about 150%, or about 200%. The upper end of such an interval is about 60%, about 80%, about 100%, about 150%, or more than about 250%.

В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к ПЭГилированному FSH (фиг.1, фиг.2 и фиг.5).In a representative embodiment, the present invention relates to PEGylated FSH (FIG. 1, FIG. 2 and FIG. 5).

СпособыWays

Помимо обсуждаемых выше конъюгатов, настоящее изобретение относится к способам получения этих и других конъюгатов. Так, например, в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ковалентного конъюгата, состоящего из выбранного фрагмента и пептида G-CSF. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам доставки конъюгатов согласно изобретению в конкретную ткань или область организма.In addition to the conjugates discussed above, the present invention relates to methods for producing these and other conjugates. So, for example, in another aspect, the present invention relates to a method for producing a covalent conjugate consisting of a selected fragment and a G-CSF peptide. In addition, the present invention relates to methods for delivering the conjugates of the invention to a specific tissue or region of an organism.

В репрезентативных вариантах изобретения указанный конъюгат образован молекулой ПЭГ (или ферментативно переносимой гликозильной частью, содержащей молекулу ПЭГ) и гликозилированным или негликозилированным пептидом. ПЭГ конъюгирован с пептидом G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы, которая располагается между ними, и ковалентно связан с пептидом G-CSF и с группой ПЭГ или с конструкцией “ПЭГ-негликозильный линкер” (таким линкером является, например, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил). Данный способ включает контактирование пептида G-CSF со смесью, содержащей модифицированный сахар и гликозилтрансферазу, для которой субстратом является указанный модифицированный сахар. Указанную реакцию проводят в условиях, достаточных для образования ковалентной связи между модифицированным сахаром и пептидом G-CSF. Сахарную часть модифицированного сахара предпочтительно выбирают из сахарсодержащих нуклеотидов, активированных сахаров и сахаров, которые не являются компонентами нуклеотидов и не являются активированными.In representative embodiments of the invention, said conjugate is formed by a PEG molecule (or an enzymatically transferred glycosyl moiety containing a PEG molecule) and a glycosylated or non-glycosylated peptide. PEG is conjugated to the G-CSF peptide via an intact glycosyl linker group located between them and covalently linked to the G-CSF peptide and the PEG group or to the “PEG-non-glycosyl linker” construction (such a linker is, for example, substituted or unsubstituted alkyl , substituted or unsubstituted heteroalkyl). This method involves contacting the G-CSF peptide with a mixture containing a modified sugar and a glycosyl transferase, for which the substrate is said modified sugar. The specified reaction is carried out under conditions sufficient to form a covalent bond between the modified sugar and the peptide G-CSF. The sugar portion of the modified sugar is preferably selected from sugar-containing nucleotides, activated sugars and sugars, which are not components of the nucleotides and are not activated.

Пептид-акцептор (гликозилированный или негликозилированный) обычно синтезируется de novo или рекомбинантно экспрессируется в прокариотических клетках (например, в бактериальных клетках, таких как E.coli) или в эукариотических клетках, таких как клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых, грибов или растений. Пептидом G-CSF может быть либо полноразмерный белок, либо его фрагмент. Кроме того, пептидом G-CSF может быть пептид дикого типа или мутированный пептид. В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF включает мутацию, которая добавляет один или несколько сайтов N- или О-связанного гликозилирования в пептидную последовательность.The acceptor peptide (glycosylated or non-glycosylated) is typically synthesized de novo or recombinantly expressed in prokaryotic cells (e.g., bacterial cells such as E. coli ) or in eukaryotic cells such as mammalian, yeast, insect, fungus or plant cells. The G-CSF peptide can be either a full-sized protein, or a fragment thereof. In addition, the G-CSF peptide may be a wild-type peptide or a mutated peptide. In a representative embodiment of the invention, the G-CSF peptide includes a mutation that adds one or more N- or O-linked glycosylation sites to the peptide sequence.

В репрезентативном варианте изобретения фактор IX подвергают О-гликозилированию и функционализации водорастворимым полимером в соответствии с методом, описанным ниже. Пептид продуцируют либо с использованием доступного сайта гликозилирования аминокислот, либо, если он является гликозилированным, то гликозильную часть “обрезают” для обеспечения доступности аминокислоты. Так, например, серин или треонин подвергают α-1-N-ацетиламино-галактозилированию (GalNAc), а NAc-галактозилированный пептид подвергают сиалилированию путем взаимодействия с кластером “сиаловая кислота - модифицирующая группа” с использованием ST6GalNAcT1. Альтернативно, NAc-галактозилированный пептид подвергают галактозилированию с использованием части “остов - 1-GalT-1” и полученный продукт подвергают сиалилированию путем взаимодействия с кластером “сиаловая кислота - модифицирующая группа” с использованием ST3GalT1. Репрезентативный конъюгат, полученный этим способом, имеет следующие связи: Thr-α-1-GalNAc-β-1,3-Gal-α2,3-Sia*, где Sia* означает кластер “сиаловая кислота - модифицирующая группа”.In a representative embodiment of the invention, factor IX is subjected to O-glycosylation and functionalization with a water-soluble polymer in accordance with the method described below. The peptide is produced either using the available amino acid glycosylation site, or if it is glycosylated, the glycosyl moiety is “cut off” to ensure amino acid availability. For example, serine or threonine is subjected to α-1-N-acetylamino-galactosylation (GalNAc), and the NAc-galactosylated peptide is sialylated by interaction with the sialic acid-modifying group cluster using ST6GalNAcT1. Alternatively, the NAc-galactosylated peptide is galactosylated using the core-1-GalT-1 moiety and the resulting product is sialylated by reacting with the sialic acid-modifying group cluster using ST3GalT1. The representative conjugate obtained by this method has the following bonds: Thr-α-1-GalNAc-β-1,3-Gal-α2,3-Sia *, where Sia * means the cluster “sialic acid - modifying group”.

В способах согласно изобретению, например, описанных выше и осуществляемых с использованием множества ферментов и сахарных доноров, отдельные стадии гликозилирования могут быть проведены отдельно или в комбинации с реакций “в одном сосуде”. Так, например, в реакции с участием трех ферментов, описанных выше, GalNAc-трансфераза, GalТ и SiaT и их доноры могут быть объединены в одном сосуде. Альтернативно, реакция GalNac может быть проведена отдельно с последующим добавлением GalТ и SiaT и соответствующих сахарных доноров в одну стадию. Другой способ проведения реакции включает последовательное добавление фермента и соответствующего донора и осуществление реакции в одном сосуде. Для получения соединений согласно изобретению могут быть использованы комбинации каждого из вышеописанных способов.In the methods of the invention, for example, those described above and carried out using a variety of enzymes and sugar donors, the individual glycosylation steps can be carried out separately or in combination with “in one vessel” reactions. For example, in a reaction involving the three enzymes described above, GalNAc transferase, GalT and SiaT and their donors can be combined in one vessel. Alternatively, the GalNac reaction can be carried out separately, followed by the addition of GalT and SiaT and the corresponding sugar donors in one step. Another way of carrying out the reaction involves the sequential addition of the enzyme and the corresponding donor and the implementation of the reaction in one vessel. Combinations of each of the above methods may be used to prepare the compounds of the invention.

В конъюгатах согласно изобретению, а в частности гликопэгилированных N-связанных гликанов, кластер “Sia-модифицирующая группа” может быть присоединен к Gal в положении α-2,6- или α-2,3-связи.In the conjugates according to the invention, and in particular glycopagilated N-linked glycans, the cluster “Sia-modifying group” can be attached to Gal at the position of the α-2,6 - or α-2,3-bonds.

Способ согласно изобретению также включает модификацию неполностью гликозилированных пептидов, продуцируемых рекомбинантными методами. В способе согласно изобретению, проводимом с использованием модифицированного сахара, пептид G-CSF может быть затем одновременно гликозилирован и дериватизирован, например, молекулой ПЭГ, терапевтическим агентом или т.п. Сахарной частью модифицированного сахара может быть остаток, который должен быть соответствующим образом конъюгирован с акцептором в полностью гликозилированном пептиде, или другая сахарная часть с нужными свойствами.The method according to the invention also includes the modification of incompletely glycosylated peptides produced by recombinant methods. In the method according to the invention carried out using modified sugar, the G-CSF peptide can then be simultaneously glycosylated and derivatized, for example, with a PEG molecule, a therapeutic agent or the like. The sugar portion of the modified sugar may be a residue that must be suitably conjugated to an acceptor in a fully glycosylated peptide, or another sugar portion with the desired properties.

Пептиды G-CSF, модифицированные методами согласно изобретению, могут быть синтетическими пептидами или пептидами дикого типа, продуцированными известными методами, такими как сайт-направленный мутагенез. Гликозилирование пептидов обычно бывает либо N-связанным, либо О-связанным. Примером N-связывания является присоединение модифицированного сахара к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности “аспарагин-Х-серин” и “аспарагин-Х-треонин”, где Х представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности, распознаваемые ферментом для присоединения углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде приводит к образованию потенциального сайта гликозилирования. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного сахара (например, N-ацетилгалактозамина, галактозы, маннозы, GlсNAc, глюкозы, фукозы или ксилозы) к боковой гидроксицепи гидроксиаминокислоты, предпочтительно серина или треонина, хотя может быть также использован и 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.G-CSF peptides modified by the methods of the invention may be synthetic peptides or wild-type peptides produced by known methods, such as site-directed mutagenesis. Glycosylation of peptides is usually either N-linked or O-linked. An example of N-binding is the attachment of a modified sugar to the side chain of an aspartic moiety. The tripeptide sequences “asparagine-X-serine” and “asparagine-X-threonine”, where X is any amino acid except proline, are sequences recognized by the enzyme to attach the carbohydrate moiety to the asparagine side chain. Thus, the presence of any of these tripeptide sequences in the polypeptide leads to the formation of a potential glycosylation site. O-linked glycosylation means the addition of a single sugar (e.g., N-acetylgalactosamine, galactose, mannose, GlcNAc, glucose, fucose or xylose) to a side hydroxy chain of a hydroxy amino acid, preferably serine or threonine, although 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine can also be used .

Так, например, в одном из вариантов изобретения G-CSF экспрессируют в системе млекопитающих и модифицируют путем обработки сиалидазой для удаления концевых остатков сиаловой кислоты с последующим ПЭГилированием с использованием SТ3Gal3 и донорной ПЭГ-сиаловой кислоты.For example, in one embodiment of the invention, G-CSF is expressed in a mammalian system and modified by treatment with sialidase to remove terminal sialic acid residues, followed by PEGylation using ST3Gal3 and donor PEG-sialic acid.

В другом репрезентативном варианте изобретения G-CSF, экспрессируемый в клетках млекопитающих, сначала обрабатывают сиалидазой для удаления концевых остатков сиаловой кислоты, а затем подвергают ПЭГилированию с использованием SТ3Gal3 и донорной ПЭГ-сиаловой кислоты и сиалилированию с использованием SТ3Gal3 и донорной сиаловой кислоты.In another representative embodiment of the invention, G-CSF expressed in mammalian cells is first treated with sialidase to remove the terminal sialic acid residues, and then pegylated using ST3Gal3 and donor PEG-sialic acid and sialylated using ST3Gal3 and donor sialic acid.

G-CSF, экспрессируемый в системе млекопитающих, может быть также обработан сиалидазой и галактозидазой для удаления остатков сиаловой кислоты и галактозы, а затем подвергают галактозилированию с использованием галактозы-донора и галактозилтрансферазы, после чего его подвергают ПЭГилированию с использованием SТ3Gal3 и донорной ПЭГ-сиаловой кислоты.G-CSF expressed in the mammalian system can also be treated with sialidase and galactosidase to remove sialic acid and galactose residues, and then galactosylated using a galactose donor and galactosyl transferase, and then pegylated using ST3Gal3 sialic acid PEG .

В еще одном репрезентативном варианте изобретения G-CSF сначала не подвергают обработке сиалидазой, а подвергают глигопэгилированию путем проведения реакции переноса сиаловой кислоты с использованием кластера “модифицирующая группа-сиаловая кислота” и фермента, такого как SТ3Gal3.In yet another representative embodiment of the invention, G-CSF is not first subjected to sialidase treatment, but is subjected to glygopegylation by carrying out a sialic acid transfer reaction using a sialic acid modifying group cluster and an enzyme such as ST3Gal3.

В другом репрезентативном варианте изобретения G-CSF экспрессируют в клетках насекомых и модифицируют в соответствии со следующей процедурой: N-ацетилглюкозамин сначала присоединяют к G-CSF с использованием соответствующего донорного N-ацетиглюкозамина и одного или нескольких из GnТ-I, II, IV и V, а затем подвергают ПЭГилированию с использованием донорной ПЭГ-галактозы и галактозилтрансферазы.In another representative embodiment of the invention, G-CSF is expressed in insect cells and modified according to the following procedure: N-acetylglucosamine is first attached to G-CSF using the appropriate donor N-acetyglucosamine and one or more of GnT-I, II, IV and V and then pegylated using donor PEG galactose and galactosyl transferase.

G-CSF, продуцированный в дрожжах, может быть также гликопэгилирован. Так, например, G-CSF сначала обрабатывают эндогликаназой для удаления гликозильных групп, подвергают галактозилированию с использованием галактозы-донора и галактозилтрансферазы, а затем ПЭГилируют с использованием SТ3Gal3 и донорной ПЭГ-сиаловой кислоты.G-CSF produced in yeast can also be glycopEGylated. For example, G-CSF is first treated with endoglycanase to remove glycosyl groups, galactosylated using a galactose donor and galactosyl transferase, and then PEGylated using ST3Gal3 and donor PEG sialic acid.

Присоединение сайтов гликозилирования к пептиду или к другой структуре обычно осуществляют путем введения модификации в аминокислотную последовательность так, чтобы эта последовательность содержала один или несколько сайтов гликозилирования. Такое присоединение может быть также осуществлено путем включения в последовательность пептида G-CSF одной или нескольких молекул, презентирующих группу -ОН, а предпочтительно, сериновых или треониновых остатков (для сайтов О-связанного гликозилирования). Такое присоединение может быть осуществлено путем введения мутации или путем проведения полного химического синтеза пептида G-CSF. Аминокислотную последовательность пептида G-CSF предпочтительно модифицируют путем внесения изменений на уровне ДНК, а в частности путем мутации ДНК, кодирующей этот пептид, в предварительно выбранных нуклеотидах для создания кодонов, которые будут транслироваться в нужные аминокислоты. Мутацию(и) ДНК осуществляют, предпочтительно, методами, известными специалистам.Attachment of glycosylation sites to a peptide or other structure is usually accomplished by introducing a modification into the amino acid sequence so that this sequence contains one or more glycosylation sites. Such attachment can also be accomplished by including in the sequence of the G-CSF peptide one or more molecules representing the —OH group, and preferably serine or threonine residues (for O-linked glycosylation sites). Such attachment can be accomplished by introducing a mutation or by conducting a complete chemical synthesis of the G-CSF peptide. The amino acid sequence of the G-CSF peptide is preferably modified by making changes at the DNA level, and in particular by mutating the DNA encoding the peptide in pre-selected nucleotides to create codons that will be translated into the desired amino acids. DNA mutation (s) are preferably carried out by methods known in the art.

В репрезентативном варианте изобретения сайт гликозилирования присоединяют путем “перетасовки” полинуклеотидов. Полинуклеотиды, кодирующие пептид-кандидат, могут быть модулированы в соответствии с протоколами “перетасовки” ДНК. Перетасовка ДНК представляет собой процесс рекурсивной рекомбинации и мутации, осуществляемой посредством рандомизированной фрагментации пула родственных генов с последующей сборкой фрагментов способом, подобным полимеразной цепной реакции. См., например, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994) и патенты США № 5605793, 5837458, 5830721 и 5811238.In a representative embodiment of the invention, the glycosylation site is attached by “shuffling” the polynucleotides. Polynucleotides encoding a candidate peptide can be modulated according to DNA shuffling protocols. DNA shuffling is a process of recursive recombination and mutation through randomized fragmentation of a pool of related genes, followed by assembly of fragments in a manner similar to polymerase chain reaction. See, for example, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370: 389-391 (1994) and US Patent Nos. 5605793, 5837458, 5830721 and 5811238.

Настоящее изобретение также относится к способу присоединения (или удаления) одного или нескольких выбранных гликозильных остатков к пептиду с последующим конъюгированием модифицированного сахара, по меньшей мере, с одним из выбранных гликозильных остатков данного пептида. Этот вариант настоящего изобретения может быть использован, например, в том случае, если необходимо конъюгировать модифицированный сахар с выбранным гликозильным остатком, который либо не присутствует в пептиде, либо присутствует в недостаточном количестве. Так, например, перед присоединением модифицированного сахара к пептиду выбранный гликозильный остаток конъюгируют с пептидом G-CSF путем ферментативного или химического присоединения. В другом варианте изобретения перед конъюгированием модифицированного сахара характер гликозилирования гликопептида изменяют путем удаления углеводного остатка из гликопептида. См., например, WO 98/31826.The present invention also relates to a method for attaching (or removing) one or more selected glycosyl residues to a peptide, followed by conjugation of the modified sugar with at least one of the selected glycosyl residues of the peptide. This embodiment of the present invention can be used, for example, if it is necessary to conjugate a modified sugar with a selected glycosyl residue that is either not present in the peptide or is not present in sufficient quantity. So, for example, before the modified sugar is attached to the peptide, the selected glycosyl residue is conjugated to the G-CSF peptide by enzymatic or chemical coupling. In another embodiment of the invention, before the conjugation of the modified sugar, the nature of the glycosylation of the glycopeptide is changed by removing the carbohydrate residue from the glycopeptide. See, for example, WO 98/31826.

Добавление или удаление любых углеводных молекул, присутствующих на гликопептиде, осуществляют либо химическим, либо ферментативным способом. Химическое дегликозилирование осуществляют, предпочтительно, путем обработки полипептидного варианта соединением трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентным соединением. Такая обработка приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, за исключением связывающего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), но при этом сам пептид остается интактным. Химическое дегликозилирование описано у Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) и у Edge et al., Anal. Biochem. 118:131(1998). Ферментативное отщепление углеводных молекул на полипептидных вариантах может быть осуществлено с использованием различных эндо- и экзогликозидаз, как описано в работе Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987).The addition or removal of any carbohydrate molecules present on the glycopeptide is carried out either chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation is preferably carried out by treating the polypeptide variant with a trifluoromethanesulfonic acid compound or an equivalent compound. This treatment results in cleavage of most or all of the sugars, with the exception of binding sugar (N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine), but the peptide itself remains intact. Chemical deglycosylation is described by Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) and Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1998). Enzymatic cleavage of carbohydrate molecules in polypeptide variants can be carried out using various endo- and exoglycosidases, as described by Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).

Химическое присоединение гликозильных остатков осуществляют любым известным методом. Ферментативное присоединение сахарных молекул, предпочтительно, осуществляют описанными здесь способами, модифицированными путем замены модифицированных сахаров, используемых в настоящем изобретении, природными гликозильными звеньями. Другие методы присоединения сахарных групп описаны в патентах США № 5876980, 6030815, 5728554 и 5922577.The chemical addition of glycosyl residues is carried out by any known method. Enzymatic addition of sugar molecules is preferably carried out by the methods described here, modified by replacing the modified sugars used in the present invention with natural glycosyl units. Other sugar linking methods are described in US Pat. Nos. 5,867,980, 6,030,815, 5,728,554 and 5,922,577.

Репрезентативными положениями присоединения для выбранных гликозильных остатков являются, но не ограничиваются ими, (а) консенсусные сайты для N- и О-гликозилирования; (b) концевые гликозильные группы, которые являются акцепторами для гликозилтрансферазы; (с) аргинин, аспарагин и гистидин; (d) свободные карбоксильные группы; (е) свободные сульфгидрильные группы, такие как группы цистеина; (f) свободные гидроксильные группы, такие как группы серина, треонина или гидроксипролина; (g) ароматические остатки, такие как фенилаланин, тирозин или триптофан; или (h) амидная группа глутамина. Репрезентативные способы, используемые в настоящем изобретении, описаны в заявке WO 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и у Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., p.259-306 (1981).Representative attachment positions for selected glycosyl residues include, but are not limited to, (a) consensus sites for N- and O-glycosylation; (b) terminal glycosyl groups which are acceptors for glycosyl transferase; (c) arginine, asparagine and histidine; (d) free carboxyl groups; (e) free sulfhydryl groups, such as cysteine groups; (f) free hydroxyl groups, such as serine, threonine or hydroxyproline groups; (g) aromatic residues such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan; or (h) an amide group of glutamine. Representative methods used in the present invention are described in WO 87/05330, published September 11, 1987, and Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., P. 259-306 (1981).

СпособыWays

Помимо обсуждаемых выше конъюгатов настоящее изобретение относится к способам получения этих и других конъюгатов. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам предупреждения, лечения или ослабления патологического состояния путем введения конъюгата согласно изобретению пациенту, подверженному риску развития такого заболевания, или пациенту, уже страдающему указанным заболеванием.In addition to the conjugates discussed above, the present invention relates to methods for producing these and other conjugates. In addition, the present invention relates to methods for preventing, treating or alleviating a pathological condition by administering the conjugate of the invention to a patient at risk of developing such a disease, or to a patient already suffering from said disease.

Так, например, настоящее изобретение относится к способу получения ковалентного конъюгата, состоящего из выбранной молекулы и пептида G-CSF.So, for example, the present invention relates to a method for producing a covalent conjugate consisting of a selected molecule and a G-CSF peptide.

В репрезентативных вариантах изобретения указанный конъюгат образован водорастворимым полимером, терапевтической молекулой, молекулой для направленной доставки или биомолекулой и гликозилированным или негликозилированным пептидом G-CSF. Полимер, терапевтическая молекула или биомолекула конъюгированы с пептидом G-CSF посредством гликозильной линкерной группы, которая располагается между ними, и ковалентно связаны с указанным пептидом и с модифицирующей группой (например, с водорастворимым полимером). Данный способ включает контактирование пептида G-CSF со смесью, содержащей модифицированный сахар и фермент, например гликозилтрансферазу, опосредующую конъюгирование модифицированного сахара с субстратом (например, пептидом, агликоном, гликолипидом). Такую реакцию проводят в условиях, подходящих для образования ковалентной связи между модифицированным сахаром и пептидом G-CSF.In representative embodiments of the invention, said conjugate is constituted by a water-soluble polymer, a therapeutic molecule, a targeted delivery molecule, or a biomolecule and a glycosylated or non-glycosylated G-CSF peptide. The polymer, therapeutic molecule or biomolecule is conjugated to the G-CSF peptide via a glycosyl linker group located between them and covalently linked to the peptide and to a modifying group (e.g., a water-soluble polymer). This method involves contacting the G-CSF peptide with a mixture containing a modified sugar and an enzyme, for example a glycosyltransferase, mediating conjugation of the modified sugar with a substrate (for example, a peptide, aglycon, glycolipid). Such a reaction is carried out under conditions suitable for the formation of a covalent bond between the modified sugar and the G-CSF peptide.

Акцепторный пептид G-CSF обычно синтезируется de novo или рекомбинантно экспрессируется в прокариотических клетках (например, в бактериальных клетках, таких как E.coli) или в эукариотических клетках, таких как клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых, грибов или растений. Пептидом G-CSF может быть либо полноразмерный белок или его фрагмент. Кроме того, пептидом G-CSF может быть пептид дикого типа или мутированный пептид. В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF включает мутацию, которая добавляет один или несколько сайтов N- или О-связанного гликозилирования в пептидную последовательность.The G-CSF acceptor peptide is typically synthesized de novo or recombinantly expressed in prokaryotic cells (e.g., bacterial cells such as E. coli ) or in eukaryotic cells such as mammalian, yeast, insect, fungus or plant cells. The G-CSF peptide can be either a full-sized protein or its fragment. In addition, the G-CSF peptide may be a wild-type peptide or a mutated peptide. In a representative embodiment of the invention, the G-CSF peptide includes a mutation that adds one or more N- or O-linked glycosylation sites to the peptide sequence.

Способ согласно изобретению также предусматривает модификацию неполностью гликозилированных пептидов G-CSF, которые продуцируют рекомбинантными методами. Многие рекомбинантно продуцированные гликопротеины являются неполностью гликозилированными и имеют доступные углеводные остатки, которые могут обладать нежелательными свойствами, например иммуногенностью, то есть могут распознаваться РЭС. В способе согласно изобретению, в котором используется модифицированный сахар, данный пептид может быть затем одновременно гликозилирован и дериватизирован, например, водорастворимым полимером, терапевтическим агентом или т.п. Сахарной частью модифицированного сахара может быть остаток, который должен быть соответствующим образом конъюгирован с акцептором в полностью гликозилированном пептиде, или другая сахарная часть с нужными свойствами.The method according to the invention also provides for the modification of incompletely glycosylated G-CSF peptides that are produced by recombinant methods. Many recombinantly produced glycoproteins are incompletely glycosylated and have available carbohydrate residues that may have undesirable properties, for example immunogenicity, that is, RES can be recognized. In the method according to the invention, which uses modified sugar, this peptide can then be simultaneously glycosylated and derivatized, for example, with a water-soluble polymer, a therapeutic agent or the like. The sugar portion of the modified sugar may be a residue that must be suitably conjugated to an acceptor in a fully glycosylated peptide, or another sugar portion with the desired properties.

Репрезентативные способы получения модифицирующих пептидов, используемые в настоящем изобретении, описаны в заявках WO 04/099231, WO 03/031464 и в цитируемых там работах.Representative methods for the preparation of modifying peptides used in the present invention are described in WO 04/099231, WO 03/031464 and the works cited therein.

В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к способу получения ПЭГилированного G-CSF, содержащего молекулу:In a representative embodiment, the present invention relates to a method for producing a pegylated G-CSF containing the molecule:

где D представляет собой -ОН и R¹-L-HN. Символ G означает R¹-L- или -С(О)(С₁-С₆)алкил. R¹ представляет собой группу, содержащую линейный или разветвленный полиэтиленгликолевый остаток. Символ L означает линкер, выбранный из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. В общих чертах, если D представляет собой ОН, то G представляет собой R¹-L, и, если G представляет собой -С(О)(С₁-С₆)алкил, то D представляет собой R¹-L-NH-. Способ согласно изобретению включает: (а) контактирование пептида G-CSF, являющегося субстратом, с донорной ПЭГ-сиаловой кислотой и ферментом, который способен переносить молекулу ПЭГ-сиаловой кислоты от донора на пептид-субстрат G-CSF.where D is —OH and R ¹ —L-HN. The symbol G means R ¹ -L- or -C (O) (C ₁ -C ₆ ) alkyl. R ¹ represents a group containing a linear or branched polyethylene glycol residue. The symbol L means a linker selected from a bond, substituted or unsubstituted alkyl and substituted or unsubstituted heteroalkyl. In general terms, if D is OH, then G is R ¹ -L, and if G is —C (O) (C ₁ -C ₆ ) alkyl, then D is R ¹ -L-NH- . The method according to the invention includes: (a) contacting a G-CSF peptide, which is a substrate, with a donor PEG-sialic acid and an enzyme that is capable of transferring a PEG-sialic acid molecule from a donor to a G-CSF peptide-substrate.

Репрезентативным донорной ПЭГ-сиаловой кислотой является сахар нуклеотида, имеющий формулу:A representative PEG-sialic acid donor is a nucleotide sugar having the formula:

и фермент, который переносит ПЭГ-сиаловую кислоту на аминокислоту или гликозильный остаток пептида G-CSF в условиях, благоприятствующих такому переносу.and an enzyme that transfers PEG-sialic acid to an amino acid or glycosyl residue of the G-CSF peptide under conditions conducive to such a transfer.

В одном из вариантов изобретения пептид-субстрат G-CSF экспрессируется в клетке-хозяине перед образованием конъюгата согласно изобретению. Репрезентативной клеткой-хозяином является клетка млекопитающего. В других вариантах изобретения клеткой-хозяином является клетка насекомого, растения, бактерии или грибка.In one embodiment of the invention, the G-CSF peptide substrate is expressed in the host cell before the conjugate of the invention is formed. A representative host cell is a mammalian cell. In other embodiments, the host cell is an insect, plant, bacterial or fungal cell.

Описанный здесь способ может быть применен к каждому из конъюгатов G-CSF, описанных в предыдущих разделах.The method described here can be applied to each of the G-CSF conjugates described in the previous sections.

Пептиды G-CSF, модифицированные методами согласно изобретению, могут быть синтетическими пептидами или пептидами дикого типа, продуцированными известными методами, такими как сайт-направленный мутагенез. Гликозилирование пептидов обычно бывает либо N-связанным, либо О-связанным. Примером N-связывания является присоединение модифицированного сахара к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности “аспарагин-Х-серин” и “аспарагин-Х-треонин”, где Х означает любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности, распознаваемые ферментом, опосредующим присоединение углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде приводит к образованию потенциального сайта гликозилирования. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного сахара (например, N-ацетилгалактозамина, галактозы, маннозы, GlсNAc, глюкозы, фукозы или ксилозы) к боковой гидроксицепи гидроксиаминокислоты, предпочтительно серина или треонина, хотя могут быть также использованы и редкие или неприродные аминокислоты, например 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.G-CSF peptides modified by the methods of the invention may be synthetic peptides or wild-type peptides produced by known methods, such as site-directed mutagenesis. Glycosylation of peptides is usually either N-linked or O-linked. An example of N-binding is the attachment of a modified sugar to the side chain of an aspartic moiety. The tripeptide sequences “asparagine-X-serine” and “asparagine-X-threonine”, where X is any amino acid except proline, are sequences recognized by an enzyme that mediates the attachment of the carbohydrate moiety to the asparagine side chain. Thus, the presence of any of these tripeptide sequences in the polypeptide leads to the formation of a potential glycosylation site. O-linked glycosylation means the addition of a single sugar (e.g., N-acetylgalactosamine, galactose, mannose, GlcNAc, glucose, fucose or xylose) to a hydroxy amino acid side hydroxy chain, preferably serine or threonine, although rare or unnatural amino acids may also be used, e.g. 5 β-hydroxyproline or 5-hydroxylisine.

Присоединение сайтов гликозилирования к пептиду или к другой структуре обычно осуществляют путем введения модификации в аминокислотную последовательность так, чтобы эта последовательность содержала один или несколько сайтов гликозилирования. Такое присоединение может быть также осуществлено путем включения в последовательность пептида G-CSF одной или нескольких молекул, презентирующих группу -ОН, а предпочтительно сериновых или треониновых остатков (для сайтов О-связанного гликозилирования). Это присоединение может быть осуществлено путем внесения мутации или путем проведения полного химического синтеза пептида. Аминокислотную последовательность данного пептида предпочтительно модифицируют путем внесения изменений на уровне ДНК, а в частности путем введения мутации в ДНК, кодирующую этот пептид, в предварительно выбранные нуклеотиды, так, чтобы происходило генерирование кодонов, которые будут транслироваться в нужные аминокислоты. ДНК-мутацию(и) осуществляют, предпочтительно, методами, известными специалистам.Attachment of glycosylation sites to a peptide or other structure is usually accomplished by introducing a modification into the amino acid sequence so that this sequence contains one or more glycosylation sites. Such attachment can also be accomplished by including in the sequence of the G-CSF peptide one or more molecules representing the —OH group, and preferably serine or threonine residues (for O-linked glycosylation sites). This addition can be accomplished by introducing a mutation or by conducting a complete chemical synthesis of the peptide. The amino acid sequence of this peptide is preferably modified by making changes at the DNA level, and in particular by introducing a mutation in the DNA encoding the peptide into pre-selected nucleotides so that codons are generated that will translate into the desired amino acids. DNA mutation (s) are preferably carried out by methods known in the art.

В репрезентативном варианте изобретения сайт гликозилирования присоединяют путем “перетасовки” полинуклеотидов. Полинуклеотиды, кодирующие пептид-кандидат, могут быть модулированы в соответствии с протоколами “перетасовки” ДНК. Перетасовка ДНК представляет собой процесс рекурсивной рекомбинации и мутации, осуществляемой посредством рандомизированной фрагментации пула родственных генов с последующей сборкой фрагментов способом, подобным полимеразной цепной реакции. См., например, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994) и патенты США № 5605793, 5837458, 5830721 и 5811238.In a representative embodiment of the invention, the glycosylation site is attached by “shuffling” the polynucleotides. Polynucleotides encoding a candidate peptide can be modulated according to DNA shuffling protocols. DNA shuffling is a process of recursive recombination and mutation through randomized fragmentation of a pool of related genes, followed by assembly of fragments in a manner similar to polymerase chain reaction. See, for example, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370: 389-391 (1994) and US Patent Nos. 5605793, 5837458, 5830721 and 5811238.

Репрезентативные способы присоединения или удаления сайтов гликозилирования и добавления или удаления гликозильных структур или подструктур подробно описаны в заявках WO 04/099231, WO 03/031464, в родственных заявках США и в заявках РСТ.Representative methods for attaching or removing glycosylation sites and adding or removing glycosyl structures or substructures are described in detail in WO 04/099231, WO 03/031464, in US related applications and in PCT applications.

Настоящее изобретение также относится к способу присоединения (или удаления) одного или нескольких выбранных гликозильных остатков к пептиду G-CSF с последующим конъюгированием модифицированного сахара, по меньшей мере, с одним из выбранных гликозильных остатков данного пептида. Такие способы могут быть использованы, например, в том случае, если необходимо конъюгировать модифицированный сахар с выбранным гликозильным остатком, который либо не присутствует в пептиде, либо присутствует в недостаточном количестве. Так, например, перед присоединением модифицированного сахара к пептиду выбранный гликозильный остаток конъюгируют с пептидом G-CSF путем ферментативного или химического присоединения. В другом варианте изобретения перед конъюгированием модифицированного сахара характер гликозилирования гликопептида изменяют путем удаления углеводного остатка из гликопептида. См., например, WO 98/31826.The present invention also relates to a method for attaching (or removing) one or more selected glycosyl residues to a G-CSF peptide, followed by conjugation of the modified sugar with at least one of the selected glycosyl residues of the peptide. Such methods can be used, for example, if it is necessary to conjugate a modified sugar with a selected glycosyl residue, which is either not present in the peptide or is not present in sufficient quantity. So, for example, before the modified sugar is attached to the peptide, the selected glycosyl residue is conjugated to the G-CSF peptide by enzymatic or chemical coupling. In another embodiment of the invention, before the conjugation of the modified sugar, the nature of the glycosylation of the glycopeptide is changed by removing the carbohydrate residue from the glycopeptide. See, for example, WO 98/31826.

Репрезентативными положениями присоединения для выбранных гликозильных остатков являются, но не ограничиваются ими, (а) консенсусные сайты для N-связанного гликозилирования и сайты для О-связанного гликозилирования; (b) концевые гликозильные группы, которые являются акцепторами для гликозилтрансферазы; (с) аргинин, аспарагин и гистидин; (d) свободные карбоксильные группы; (е) свободные сульфгидрильные группы, такие как группы цистеина; (f) свободные гидроксильные группы, такие как группы серина, треонина или гидроксипролина; (g) ароматические остатки, такие как фенилаланин, тирозин или триптофан; или (h) амидная группа глутамина. Репрезентативные способы, используемые в настоящем изобретении, описаны в WO 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и у Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., p.259-306 (1981).Representative attachment positions for selected glycosyl residues include, but are not limited to, (a) consensus sites for N-linked glycosylation and sites for O-linked glycosylation; (b) terminal glycosyl groups which are acceptors for glycosyl transferase; (c) arginine, asparagine and histidine; (d) free carboxyl groups; (e) free sulfhydryl groups, such as cysteine groups; (f) free hydroxyl groups, such as serine, threonine or hydroxyproline groups; (g) aromatic residues such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan; or (h) an amide group of glutamine. Representative methods used in the present invention are described in WO 87/05330, published September 11, 1987, and Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., P. 259-306 (1981).

ПЭГ-модифицированные сахара конъюгируют с гликозилированным или негликозилированным пептидом с использованием соответствующего фермента, опосредующего такое конъюгирование. При этом, предпочтительно, чтобы концентрации модифицированного донорного сахара, фермента и акцепторного пептида выбирали так, чтобы реакция гликозилирования проходила до тех пор, пока не будет достигнута нужная степень модификации акцептора. Хотя представленное ниже обсуждение и относится к сиалилтрансферазе, однако, по существу, оно может также относиться и к другим гликозилтрансферазным реакциям.PEG-modified sugars are conjugated to a glycosylated or non-glycosylated peptide using the appropriate enzyme mediating such conjugation. In this case, it is preferable that the concentration of the modified donor sugar, enzyme and acceptor peptide is chosen so that the glycosylation reaction proceeds until the desired degree of modification of the acceptor is achieved. Although the discussion below applies to sialyl transferase, however, essentially, it can also apply to other glycosyl transferase reactions.

Некоторые методы с использованием гликозилтрансфераз для синтеза нужных олигонуклеотидных структур являются хорошо известными и, по существу, могут применяться в настоящем изобретении. Такие методы описаны, например, в WO 96/32491, Ito et al., Pure Appl. Chem. 65:753 (1993), в патентах США № 5352670, 5374541, 5545553 и в совместных патентах США № 6399336 и 6440703, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.Some methods using glycosyltransferases to synthesize the desired oligonucleotide structures are well known and, in essence, can be used in the present invention. Such methods are described, for example, in WO 96/32491, Ito et al., Pure Appl. Chem. 65: 753 (1993), in US patent No. 5352670, 5374541, 5545553 and in joint US patent No. 6399336 and 6440703, which are incorporated into this description by reference.

Настоящее изобретение осуществляют с использованием одной гликозилтрансферазы или комбинации гликозилтрансфераз. Так, например, может быть использована комбинация сиалилтрансферазы и галактозилтрансферазы. В этих вариантах с использованием более чем одного фермента указанные ферменты и субстраты предпочтительно объединяют с получением исходной реакционной смеси либо указанные ферменты и реагенты для второй ферментативной реакции добавляют в реакционную среду сразу после того, как первая ферментативная реакция полностью завершится или почти завершится. При последовательном проведении двух ферментативных реакций в одном сосуде можно улучшить общий выход по сравнению с выходом, достигаемым при проведении процедур, в которых выделяют промежуточные молекулы. Кроме того, это упрощает удаление и устранение избыточных растворителей и побочных продуктов.The present invention is carried out using a single glycosyl transferase or a combination of glycosyl transferases. For example, a combination of sialyl transferase and galactosyl transferase can be used. In these embodiments, using more than one enzyme, these enzymes and substrates are preferably combined to form the starting reaction mixture, or these enzymes and reagents for the second enzymatic reaction are added to the reaction medium immediately after the first enzymatic reaction is complete or nearly complete. By sequentially carrying out two enzymatic reactions in one vessel, the overall yield can be improved in comparison with the yield achieved during procedures in which intermediate molecules are isolated. In addition, it simplifies the removal and elimination of excess solvents and by-products.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения первым и вторым ферментом является гликозилтрансфераза. В другом предпочтительном варианте изобретения одним из таких ферментов является эндогликозидаза. В другом предпочтительном варианте изобретения для сборки модифицированного гликопротеина согласно изобретению используются более чем два фермента. Эти ферменты используют для модификации сахаридной структуры на пептиде G-CSF в любом положении до или после присоединения модифицированного сахара к данному пептиду.In a preferred embodiment, the first and second enzyme is glycosyl transferase. In another preferred embodiment of the invention, one of these enzymes is endoglycosidase. In another preferred embodiment of the invention, more than two enzymes are used to assemble the modified glycoprotein according to the invention. These enzymes are used to modify the saccharide structure on the G-CSF peptide at any position before or after the addition of the modified sugar to the peptide.

В другом варианте изобретения указанный способ включает использование одной или нескольких экзо- или эндогликозидаз. Гликозидаза обычно представляет собой мутант, который сконструирован так, что в нем гликозильные связи образуются, а не разрушаются. Мутантная гликаназа обычно включает замену кислотного аминокислотного остатка активного центра на другой аминокислотный остаток. Например, если эндогликоназой является эндо-Н, то замененными остатками активного центра обычно являются Asp в положении 130, Glu в положении 132 или их комбинации. Такие аминокислоты обычно заменены серином, аланином, аспарагином или глутамином.In another embodiment of the invention, said method comprises the use of one or more exo- or endoglycosidases. Glycosidase is usually a mutant that is designed so that glycosyl bonds are formed in it, but not destroyed. Mutant glycanase typically involves replacing an acidic amino acid residue of an active site with another amino acid residue. For example, if the endoglyconase is endo-H, then the substituted residues of the active center are usually Asp at position 130, Glu at position 132, or a combination thereof. Such amino acids are usually replaced by serine, alanine, asparagine, or glutamine.

Мутантный фермент катализирует реакцию, обычно, в стадии синтеза, которая аналогична обратной реакции стадии гидролиза эндогликоназой. В этих вариантах изобретения гликозильная донорная молекула (например, нужная олиго- или моносахаридная структура) содержит удаляемую группу, и эта реакция протекает с присоединением донорной молекулы к остатку GlсNAc на белке. Так, например, удаляемой группой может быть галоген, такой как фторид. В других вариантах изобретения удаляемой группой является Asn или молекула Asn-пептид. В других вариантах изобретения остаток GlсNAc на гликозильной донорной молекуле является модифицированным. Так, например, остаток GlсNAc может содержать 1,2-оксахолиновую группу.A mutant enzyme catalyzes a reaction, usually in a synthesis step, which is similar to the reverse reaction of the endoglyconase hydrolysis step. In these embodiments of the invention, the glycosyl donor molecule (for example, the desired oligo- or monosaccharide structure) contains a leaving group, and this reaction proceeds with the addition of the donor molecule to the GlcNAc residue on the protein. So, for example, the leaving group may be a halogen, such as fluoride. In other embodiments, the deleted group is an Asn or an Asn peptide molecule. In other embodiments, the GlcNAc residue on the glycosyl donor molecule is modified. So, for example, the GlcNAc residue may contain a 1,2-oxacholine group.

В предпочтительном варианте изобретения каждый из ферментов, используемых для получения конъюгата согласно изобретению, присутствует в каталитическом количестве. Каталитическое количество конкретного фермента варьируется в зависимости от концентрации субстрата фермента, а также от реакционных условий, таких как температура, время проведения реакции и значение рН. Методы определения каталитического количества данного фермента для предварительно выбранных концентраций субстрата и реакционных условий хорошо известны специалистам.In a preferred embodiment of the invention, each of the enzymes used to prepare the conjugate of the invention is present in a catalytic amount. The catalytic amount of a particular enzyme varies depending on the concentration of the enzyme substrate, as well as the reaction conditions, such as temperature, reaction time and pH. Methods for determining the catalytic amount of a given enzyme for preselected substrate concentrations and reaction conditions are well known in the art.

Температура, при которой осуществляется вышеуказанная реакция, может варьироваться в пределах от температуры, чуть превышающей точку замерзания, до температуры денатурации большинства чувствительных ферментов. Предпочтительная температура варьируется примерно от 0°С до 55°С, а более предпочтительно, примерно от 20°С до 37°С. В другом репрезентативном варианте изобретения один или несколько стадий способа согласно изобретению проводят при повышенной температуре с использованием термофильного фермента.The temperature at which the above reaction is carried out can vary from a temperature slightly above the freezing point to the denaturation temperature of most sensitive enzymes. The preferred temperature ranges from about 0 ° C to 55 ° C, and more preferably from about 20 ° C to 37 ° C. In another representative embodiment of the invention, one or more steps of the method according to the invention is carried out at elevated temperature using a thermophilic enzyme.

Реакционную смесь поддерживают в течение периода времени, достаточного для гликозилирования акцептора, в результате чего образуется нужный конъюгат. В большинстве случаев некоторые из этих конъюгатов могут быть детектированы через несколько часов; причем выделяемые количества обычно получают через 24 часа или менее. Для специалистов в данной области очевидно, что скорость реакции зависит от ряда различных факторов (например, от концентрации фермента, концентрации донора, концентрации акцептора, температуры, объема растворителя), которые могут быть оптимизированы для выбранной системы.The reaction mixture is maintained for a period of time sufficient to glycosylate the acceptor, resulting in the formation of the desired conjugate. In most cases, some of these conjugates can be detected after several hours; moreover, the allocated amount is usually obtained after 24 hours or less. For specialists in this field it is obvious that the reaction rate depends on a number of different factors (for example, the concentration of the enzyme, the concentration of the donor, the concentration of the acceptor, temperature, volume of solvent) that can be optimized for the selected system.

Настоящее изобретение также относится к крупномасштабному продуцированию модифицированных пептидов. Используемое здесь понятие “крупномасштабный” относится к получению, по крайней мере, одного грамма конечного очищенного конъюгата.The present invention also relates to the large-scale production of modified peptides. The term “large-scale” as used herein refers to the preparation of at least one gram of the final purified conjugate.

Как обсуждается ниже, настоящее изобретение проиллюстрировано на примере конъюгирования модифицированных молекул сиаловой кислоты с гликозилированным пептидом. Репрезентативная модифицированная сиаловая кислота помечена ПЭГ. Нижеследующее обсуждение, касающееся использования ПЭГ-модифицированной сиаловой кислоты и гликозилированных пептидов, приводится лишь для иллюстрации, и при этом не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается конъюгированием этих двух компонентов. Специалистам в данной области понятно, что такое обсуждение, по существу, касается и присоединения модифицированных гликозильных групп, не являющихся сиаловой кислотой. Кроме того, такое обсуждение в равной степени касается и модификации гликозильного звена агентами, не являющимися ПЭГ, например, включающими другие молекулы ПЭГ, терапевтические молекулы и биомолекулы.As discussed below, the present invention is illustrated by conjugating modified sialic acid molecules with a glycosylated peptide. A representative modified sialic acid is labeled with PEG. The following discussion regarding the use of PEG-modified sialic acid and glycosylated peptides is for illustration only and is not intended to limit the present invention to conjugation of these two components. Those of skill in the art will understand that such a discussion essentially applies to the addition of modified non-sialic acid glycosyl groups. In addition, such a discussion equally applies to the modification of the glycosyl unit by non-PEG agents, for example, including other PEG molecules, therapeutic molecules and biomolecules.

Для селективного введения ПЭГилированных или ППГилированных углеводов в пептид или гликопептид может быть использован ферментативный метод. Такой метод предусматривает использование модифицированных сахаров, содержащих ПЭГ, ППГ или маскированную реакционноспособную функциональную группу и их комбинации с соответствующей гликозилтрансферазой или гликосинтазой. Путем выбора гликозилтрансферазы, которая образует нужную углеводную связь, и использования модифицированного сахара в качестве донорного субстрата, ПЭГ или ППГ могут быть введены непосредственно в пептидный остов G-CSF, в присутствующие сахарные остатки гликопептида или в сахарные остатки, которые были присоединены к пептиду.An enzymatic method can be used to selectively introduce PEGylated or PPGylated carbohydrates into a peptide or glycopeptide. Such a method involves the use of modified sugars containing PEG, PPG or a masked reactive functional group and their combination with the corresponding glycosyltransferase or glycosynthase. By selecting a glycosyltransferase that forms the desired carbohydrate bond and using modified sugar as a donor substrate, PEG or PPG can be introduced directly into the G-CSF peptide backbone, into the present sugar residues of the glycopeptide, or into sugar residues that have been attached to the peptide.

На пептиде G-CSF, модифицируемом способами согласно изобретению, присутствует акцептор для сиалилтрансферазы либо в виде природной структуры, либо в виде структуры, полученной рекомбинантными, ферментативными или химическими методами. Подходящими акцепторами являются, например, галактозильные акцепторы, такие как Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1,3GalNAc, лакто-N-тетраоза, Galβ1,3GlсNAc, Galβ1,3Ara, Galβ1,6GlсNAc, Galβ1,4Glс (лактоза), и другие акцепторы, известные специалистам в данной области (см., например, Paulson et al., J. Biol. Chem. 253:5617-5624 (1978)).On the G-CSF peptide modified by the methods of the invention, an acceptor for sialyl transferase is present either as a natural structure or as a structure obtained by recombinant, enzymatic or chemical methods. Suitable acceptors are, for example, galactosyl acceptors such as Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1,3GalNAc, lacto-N-tetraose, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,3Ara, Galβ1,6GlcNAc, Galβ1,4Glc and other lactose acceptors known to those skilled in the art (see, for example, Paulson et al., J. Biol. Chem. 253: 5617-5624 (1978)).

В одном из вариантов изобретения акцептор для сиалилтрансферазы присутствует на гликопептиде, модифицированном после in vivo синтеза гликопептида. Такие гликопептиды могут быть сиалилированы с применением заявленных способов без предварительной модификации характера гликозилирования гликопептида. Альтернативно, способы согласно изобретению могут применяться для сиалилирования пептида, который не включает подходящий акцептор, при этом сначала пептид G-CSF модифицируют известными методами, так чтобы он включал акцептор. В репрезентативном варианте изобретения остаток GalNAc присоединяется под действием GalNAc-трансферазы.In one embodiment, the sialyl transferase acceptor is present on a glycopeptide modified after in vivo synthesis of the glycopeptide. Such glycopeptides can be sialylated using the claimed methods without first modifying the glycosylation nature of the glycopeptide. Alternatively, the methods of the invention can be used to sialylate a peptide that does not include a suitable acceptor, wherein the G-CSF peptide is first modified by known methods to include an acceptor. In a representative embodiment of the invention, the GalNAc residue is coupled by GalNAc transferase.

В репрезентативном варианте изобретения сборку галактозильного акцептора осуществляют путем присоединения галактозного остатка к соответствующему рецептору, связанному с пептидом G-CSF, например GlсNAc. Этот метод включает инкубирование модифицируемого пептида G-CSF с реакционной смесью, содержащей подходящее количество галактозилтрансферазы (например, galβ1,3 или galβ1,4) и подходящего галактозильного донора (например, УДФ-галактозы). Реакционную смесь оставляют для прохождения реакции, в основном, вплоть до ее завершения или, альтернативно, эту реакцию завершают добавлением предварительно выбранного количества галактозного остатка. Специалистам в данной области очевидно, что существуют и другие методы сборки выбранного сахаридного акцептора.In a representative embodiment of the invention, the assembly of the galactosyl acceptor is carried out by attaching the galactose residue to the corresponding receptor associated with the G-CSF peptide, for example, GlcNAc. This method involves incubating a modified G-CSF peptide with a reaction mixture containing a suitable amount of galactosyl transferase (e.g., galβ1,3 or galβ1,4) and a suitable galactosyl donor (e.g., UDP galactose). The reaction mixture is left to undergo the reaction, mainly until it is complete or, alternatively, this reaction is completed by adding a pre-selected amount of galactose residue. It will be apparent to those skilled in the art that there are other methods for assembling the selected saccharide acceptor.

В еще одном варианте изобретения связанные с гликопептидом олигосахариды сначала “отрезают” либо полностью, либо частично, обнажая, тем самым акцептор для сиалилтрансферазы или часть, к которой могут быть присоединены один или несколько соответствующих остатков, в результате чего получают подходящий акцептор. Для проведения реакций присоединения и отщепления могут быть использованы такие ферменты, как гликозилтрансферазы и эндогликозидазы (см., например, патент США № 5716812).In yet another embodiment of the invention, the oligosaccharides associated with the glycopeptide are first “cut off” either completely or partially, thereby exposing the sialyl transferase acceptor or a part to which one or more corresponding residues can be attached, resulting in a suitable acceptor. Enzymes such as glycosyltransferases and endoglycosidases (see, for example, US Pat. No. 5,716,812) can be used to carry out addition and cleavage reactions.

Как обсуждается ниже, способ согласно изобретению проиллюстрирован на примере использования модифицированных сахаров, содержащих присоединенную к ним молекулу ПЭГ. Это обсуждение приводится для лучшей иллюстрации настоящего изобретения. Специалистам в данной области понятно, что такое обсуждение в равной степени относится к тем вариантам изобретения, в которых модифицированный сахар содержит терапевтическую молекулу, биомолекулу или т.п.As discussed below, the method according to the invention is illustrated by the use of modified sugars containing an attached PEG molecule. This discussion is provided to better illustrate the present invention. Those skilled in the art will understand that such a discussion equally applies to those embodiments of the invention in which the modified sugar contains a therapeutic molecule, biomolecule, or the like.

В репрезентативном варианте изобретения, в котором углеводный остаток “отрезают” перед присоединением модифицированного сахара, высокомолекулярную маннозу “урезают” с получением биантенной структуры первой генерации. Модифицированный сахар, несущий молекулу ПЭГ, конъюгируют с одним или несколькими сахарными остатками, обнаженными в результате “урезания”. В одном из примеров ПЭГ-часть добавляют посредством GlсNAc-части, конъюгированной с этой ПЭГ-частью. Модифицированный GlсNAc присоединяют к одной или двум концевым маннозным остаткам биантенной структуры. Альтернативно, немодифицированный GlсNAc может быть присоединен к одному или двум концам разветвленных молекул.In a representative embodiment of the invention, in which the carbohydrate residue is “cut off” before the addition of the modified sugar, the high molecular weight mannose is “cut off” to obtain a first generation bantenic structure. Modified sugar carrying the PEG molecule is conjugated to one or more sugar residues exposed as a result of “trimming”. In one example, the PEG portion is added via the GlcNAc portion conjugated to this PEG portion. Modified GlcNAc is attached to one or two terminal mannose residues of the biennial structure. Alternatively, unmodified GlcNAc may be attached to one or two ends of the branched molecules.

В другом варианте изобретения ПЭГ-часть присоединяют к одному или обоим концевым маннозным остаткам биантенной структуры посредством модифицированного сахара, имеющего галактозный остаток, который конъюгирован с остатком GlсNAc, присоединенным к концевым маннозным остаткам. Альтернативно, немодифицированный Gal может быть присоединен к одному или к обоим концевым остаткам GlсNAc.In another embodiment of the invention, the PEG portion is attached to one or both of the terminal mannose residues of the biennial structure by means of a modified sugar having a galactose residue that is conjugated to the GlcNAc residue attached to the terminal mannose residues. Alternatively, unmodified Gal may be attached to one or both terminal GlcNAc residues.

В другом варианте изобретения ПЭГ-часть присоединяют к остатку Gal с использованием модифицированной сиаловой кислоты.In another embodiment, the PEG moiety is attached to the Gal residue using a modified sialic acid.

В другом варианте изобретения высокомолекулярную структуру маннозы “урезают” до маннозы, от которой ответвляется биантенная структура. В одном из примеров молекулу ПЭГ присоединяют посредством GlcNAc, модифицированного полимером. Альтернативно, немодифицированную GlcNAc присоединяют к маннозе, а затем присоединяют Gal со связанной молекулой ПЭГ. В еще одном варианте изобретения немодифицированные остатки GlcNAc и Gal последовательно присоединяют к маннозе, а затем присоединяют молекулу сиаловой кислоты, модифицированную группой ПЭГ.In another embodiment of the invention, the high molecular weight structure of mannose is “trimmed” to mannose, from which the biannual structure branches. In one example, the PEG molecule is attached via a polymer modified GlcNAc. Alternatively, unmodified GlcNAc is attached to mannose and then Gal is attached to the bound PEG molecule. In yet another embodiment of the invention, unmodified GlcNAc and Gal residues are sequentially attached to mannose, and then the sialic acid molecule modified by the PEG group is attached.

В другом репрезентативном варианте высокомолекулярную структуру маннозы “урезают” до GlcNАc, к которому присоединена первая манноза. GlcNАc конъюгируют с остатком Gal, несущим молекулу ПЭГ. Альтернативно, немодифицированный Gal присоединяют к GlcNАc, а затем присоединяют сиаловую кислоту, модифицированную водорастворимым сахаром. В еще одном примере концевой GlcNАc конъюгируют с Gal, а затем GlcNАc подвергают фукозилированию модифицированной фукозой, несущей группу ПЭГ.In another representative embodiment, the high molecular weight structure of mannose is “trimmed” to GlcNAC, to which the first mannose is attached. GlcNAC is conjugated to a Gal residue bearing a PEG molecule. Alternatively, unmodified Gal is attached to GlcNAC and then sialic acid modified with water-soluble sugar is added. In yet another example, the terminal GlcNAC is conjugated to Gal, and then the GlcNAC is fucosylated with a modified fucose carrying a PEG group.

Высокомолекулярная манноза может быть также урезана до первого GlcNАc, присоединенного к Asn данного пептида. В одном примере GlcNАc остатка GlcNАc-(Fuc)_а конъюгируют с GlcNАc, несущим водорастворимый полимер. В другом примере GlcNАc остатка GlcNАc-(Fuc)_а модифицируют Gal, несущим водорастворимый полимер. В еще одном варианте изобретения GlcNАc модифицируют Gal, с последующим конъюгированием с Gal сиаловой кислоты, модифицированной молекулой ПЭГ.High molecular weight mannose can also be truncated to the first GlcNac attached to the Asn of the peptide. In one example, the GlcNAC residue of GlcNAC- (Fuc) _{a is} conjugated to a GlcNAC carrying a water-soluble polymer. In another example, the GlcNAc residue GlcNAc- (Fuc) _a modified Gal, bearing a water soluble polymer. In yet another embodiment of the invention, GlcNACs modify Gal, followed by conjugation with Gal of a sialic acid modified with a PEG molecule.

Другие репрезентативные варианты описаны в публикациях совместных заявок на патент США: 20040132640; 20040063911; 20040137557; в заявках на патент США: № 10/369079, 20/410913, 10/360770, 10/410945 и РСТ/US02/32263, каждая из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.Other representative options are described in the publication of joint applications for US patent: 20040132640; 20040063911; 20040137557; in US patent applications: No. 10/369079, 20/410913, 10/360770, 10/410945 and PCT / US02 / 32263, each of which is incorporated into this description by reference.

Эти представленные выше примеры приводятся лишь в целях иллюстрации эффективности описанных здесь способов. В соответствии с описанными здесь способами можно “урезать” и наращивать углеводные остатки с получением, по существу, любой нужной структуры. Модифицированный сахар может быть присоединен по концам описанной выше углеводной молекулы, либо он может занимать промежуточное положение между пептидным остовом и концом углевода.These examples presented above are provided only to illustrate the effectiveness of the methods described herein. In accordance with the methods described herein, it is possible to “trim” and build up carbohydrate residues to produce essentially any desired structure. Modified sugar can be attached at the ends of the carbohydrate molecule described above, or it can occupy an intermediate position between the peptide backbone and the end of the carbohydrate.

В репрезентативном варианте изобретения присутствующую сиаловую кислоту отщепляют от гликопептида G-CSF с использованием сиалидазы, демаскируя, тем самым, все или большинство нижерасположенных галактозильных остатков. Альтернативно, пептид или гликопептид метят галактозными остатками или олигосахаридным остатком, который является концевым в галактозном звене. Для присоединения модифицированной сиаловой кислоты после демаскировки или присоединения галактозных остатков используют соответствующую сиалилтрансферазу. Этот способ проиллюстрирован на схеме I.In a representative embodiment of the invention, sialic acid present is cleaved from the G-CSF glycopeptide using sialidase, thereby unmasking all or most of the downstream galactosyl residues. Alternatively, the peptide or glycopeptide is labeled with galactose residues or an oligosaccharide residue that is terminal in the galactose unit. To attach the modified sialic acid after unmasking or attach the galactose residues, the corresponding sialyl transferase is used. This method is illustrated in scheme I.

В еще одном способе, систематизированном на схеме 2, маскированная реакционноспособная функциональная группа присутствует на сиаловой кислоте. Предпочтительно, чтобы эта маскированная реакционноспособная группа не подвергалась воздействию условий, используемых для присоединения модифицированной сиаловой кислоты к G-CSF. После ковалентного присоединения модифицированной сиаловой кислоты к пептиду G-CSF маскировку удаляют и пептид G-CSF конъюгируют с таким агентом, как ПЭГ. Этот агент специфически конъюгируют с пептидом посредством его реакции с немаскированной реакционноспособной группой на модифицированном сахарном остатке.In yet another method, systematized in Scheme 2, a masked reactive functional group is present on sialic acid. Preferably, this masked reactive group is not exposed to the conditions used to attach the modified sialic acid to G-CSF. After covalent attachment of the modified sialic acid to the G-CSF peptide, the masking is removed and the G-CSF peptide is conjugated to an agent such as PEG. This agent is specifically conjugated to the peptide by its reaction with an unmasked reactive group on a modified sugar residue.

Любой описанный здесь модифицированный сахар может быть использован вместе с его соответствующей гликозилтрансферазой, в зависимости от концевых сахаров олигосахаридных боковых цепей гликопептида (таблица 1). Как обсуждалось выше, концевой сахар данного гликопептида, необходимый для введения ПЭГилированной структуры, может быть введен в процессе природной экспрессии, либо он может быть продуцирован после экспрессии под действием соответствующей гликозидазы, гликозилтрансферазы или смеси гликозидазы и гликозилтрансферазы.Any modified sugar described herein can be used in conjunction with its corresponding glycosyltransferase, depending on the terminal sugars of the oligosaccharide glycopeptide side chains (Table 1). As discussed above, the terminal sugar of a given glycopeptide necessary for introducing a PEGylated structure can be introduced during natural expression, or it can be produced after expression by the appropriate glycosidase, glycosyl transferase or a mixture of glycosidase and glycosyl transferase.

В другом репрезентативном варианте изобретения конъюгат УДФ-галактоза-ПЭГ подвергают взаимодействию с β1,4-галактозилтрансферазой коровьего молока, что позволяет переносить модифицированную галактозу на соответствующую концевую N-ацетилглюкозаминовую структуру. Концевые остатки GlcNАc на гликопептиде могут быть продуцированы в процессе экспрессии, которая может осуществляться в таких экспрессионных системах, как клетки млекопитающих, насекомых, растений или грибов, но, если это необходимо, они могут быть также продуцированы путем обработки гликопептида сиалидазой, и/или гликозидазой, и/или гликозилтрансферазой.In another representative embodiment of the invention, the UDF-galactose-PEG conjugate is reacted with β1,4-galactosyltransferase of cow's milk, which allows the modified galactose to be transferred to the corresponding terminal N-acetylglucosamine structure. The terminal GlcNAC residues on the glycopeptide can be produced during the expression process, which can be carried out in expression systems such as mammalian, insect, plant or fungal cells, but, if necessary, they can also be produced by treating the glycopeptide with sialidase and / or glycosidase , and / or glycosyltransferase.

В другом варианте изобретения GlcNАc-трансфераза, такая как GNТ1-5, используется для переноса ПЭГилированного GlcN на концевой маннозный остаток гликопептида. В еще одном репрезентативном варианте изобретения N- и/или О-связанные гликановые структуры ферментативно удаляют из гликопептида, в результате чего становятся доступными аминокислотный или концевой гликозильный остаток, которые затем конъюгируют с модифицированным сахаром. Так, например, в целях обеспечения доступа к концевому GlcNАc в виде GlcNАс-Asn на гликопептиде используют эндогликаназу для удаления N-связанных структур гликопептида. Для введения функциональной ПЭГ-галактозы в доступный GlcNАc используют УДФ-Gal-ПЭГ и соответствующую галактозилтрансферазу.In another embodiment of the invention, GlcNAC transferase, such as GNT1-5, is used to transfer the PEGylated GlcN to the terminal mannose residue of the glycopeptide. In yet another representative embodiment of the invention, N- and / or O-linked glycan structures are enzymatically removed from the glycopeptide, whereby an amino acid or terminal glycosyl residue is available, which are then conjugated to the modified sugar. So, for example, in order to provide access to the terminal GlcNAC as GlcNAC-Asn on the glycopeptide, endoglycanase is used to remove the N-linked structures of the glycopeptide. To introduce functional PEG galactose into available GlcNAC, UDP-Gal PEG and the corresponding galactosyl transferase are used.

В альтернативном варианте изобретения модифицированный сахар присоединяют непосредственно к пептидному остову G-CSF с использованием гликозилтрансферазы, которая, как известно, переносит сахарные остатки на пептидный остов. Такой репрезентативный вариант представлен на схеме 3. Примерами гликозилтрансфераз, используемых для осуществления настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, GalNac-трансферазы (GalNac Т1-14), GlcNАc-трансферазы, фукозилтрансферазы, глюкозилтрансферазы, ксилозилтрансферазы, маннозилтрансферазы и т.п. Применение этого способа позволяет непосредственно присоединять модифицированные сахара к пептидам, в которых отсутствуют любые углеводы, или, альтернативно, к присутствующим гликопептидам. В обоих случаях присоединение модифицированного сахара происходит в специфических положениях на пептидном остове, как было определено по специфичности гликозилтрансферазы к субстрату, но не произвольно, как это происходит в процессе модификации пептидного остова белка химическими методами. В белки или гликопептиды, в которых отсутствует пептидная последовательность, являющаяся субстратом для гликозилтрансферазы, может быть введен ряд агентов путем конструирования соответствующей аминокислотной последовательности в полипептидной цепи.In an alternative embodiment of the invention, the modified sugar is attached directly to the peptide backbone of G-CSF using a glycosyltransferase, which is known to transfer sugar residues to the peptide backbone. Such a representative embodiment is shown in Scheme 3. Examples of glycosyltransferases used to carry out the present invention include, but are not limited to, GalNac transferase (GalNac T1-14), GlcNAC transferase, fucosyl transferase, glucosyl transferase, xylosyl transferase, mannosyl transferase and the like. The use of this method allows the direct attachment of modified sugars to peptides that lack any carbohydrates, or, alternatively, to the glycopeptides present. In both cases, the addition of the modified sugar occurs in specific positions on the peptide backbone, as determined by the specificity of the glycosyltransferase to the substrate, but not arbitrarily, as is the case with the modification of the peptide backbone of the protein by chemical methods. In proteins or glycopeptides that lack a peptide sequence that is a substrate for glycosyl transferase, a number of agents can be introduced by constructing the corresponding amino acid sequence in the polypeptide chain.

В каждом из описанных выше репрезентативных вариантах изобретения после конъюгирования модифицированного сахара с пептидом могут быть проведены одна или несколько дополнительных стадий химической или ферментативной модификации. В репрезентативном варианте изобретения фермент (например, фукозилтрансферазу) используют для присоединения гликозильного звена (например, фукозы) к концевому модифицированному сахару, присоединенному к пептиду G-CSF. В другом примере ферментативную реакцию используют для “кэпирования” сайтов, с которыми модифицированный сахар не может конъюгироваться. Альтернативно, химическую реакцию проводят для изменения структуры конъюгированного модифицированного сахара. Так, например, конъюгированный модифицированный сахар подвергают взаимодействию с агентами, которые стабилизируют или дестабилизируют его связь с пептидным компонентом, к которому присоединен модифицированный сахар. В другом примере, после конъюгирования компонента модифицированного сахара с пептидом, защиту у этого компонента снимают. Специалистам в данной области известно, что существует ряд ферментативных и химических процедур, которые могут применяться в способах согласно изобретению на стадии, проводимой после конъюгирования модифицированного сахара с пептидом G-CSF. Последующее усовершенствование конъюгата “модифицированный сахар - пептид” входит в объем настоящего изобретения.In each of the representative embodiments described above, after conjugation of the modified sugar with a peptide, one or more additional steps of a chemical or enzymatic modification may be carried out. In a representative embodiment of the invention, an enzyme (e.g., fucosyl transferase) is used to attach a glycosyl unit (e.g., fucose) to the terminal modified sugar attached to the G-CSF peptide. In another example, an enzymatic reaction is used to “cap” sites with which modified sugar cannot conjugate. Alternatively, a chemical reaction is carried out to alter the structure of the conjugated modified sugar. For example, conjugated modified sugar is reacted with agents that stabilize or destabilize its bond with the peptide component to which the modified sugar is attached. In another example, after conjugation of the modified sugar component with the peptide, the protection of this component is removed. Specialists in this field know that there are a number of enzymatic and chemical procedures that can be applied in the methods according to the invention at the stage carried out after conjugation of the modified sugar with the peptide G-CSF. Subsequent refinement of the “modified sugar-peptide” conjugate is within the scope of the present invention.

ФерментыEnzymes

Помимо ферментов, обсуждаемых выше в связи с получением ацилсвязанного конъюгата, характер гликозилирования конъюгата и исходных субстратов (например, пептидов, липидов) может быть улучшен, скорректирован или как-либо иначе модифицирован методами с использованием других ферментов. Методы ремоделирования пептидов и липидов с использованием ферментов, переносящих донорный сахар на акцептор, очень подробно обсуждается в заявке DeFrees, WO 03/031464 А2, опубликованной 17 апреля 2003. Краткое описание выбранных ферментов, используемых в способе согласно изобретению, приводится ниже.In addition to the enzymes discussed above in connection with the preparation of an acyl-linked conjugate, the glycosylation of the conjugate and the starting substrates (e.g. peptides, lipids) can be improved, adjusted or otherwise modified by methods using other enzymes. Methods for remodeling peptides and lipids using enzymes transferring donor sugar to an acceptor are discussed in great detail in DeFrees, WO 03/031464 A2, published April 17, 2003. A brief description of the selected enzymes used in the method according to the invention is given below.

ГликозилтрансферазыGlycosyl transferase

Гликозилтрансферазы катализируют постадийное присоединение активированных сахаров (донорных NDP- или NМР-сахаров) к белку, гликопептиду, липиду или к гликолипиду, или к невосстанавливающему концу растущего олигосахарида. N-связанные гликопептиды синтезируют посредством трансферазы и связанного с липидом донорного олигосахарида Dol-PP-NAG₂Glc₃Man₉ путем переноса блоком с последующим “подравниванием” остова. В этом случае природа “остовного” сахарида будет несколько отличаться от природы присоединенных впоследствии групп. Специалистам известно очень большое число гликозилтрансфераз.Glycosyl transferases catalyze the stepwise addition of activated sugars (donor NDP or NMR sugars) to a protein, glycopeptide, lipid or glycolipid, or to the non-reducing end of the growing oligosaccharide. N-linked glycopeptides are synthesized by transferase and a lipid-bound donor oligosaccharide Dol-PP-NAG ₂ Glc ₃ Man ₉ by block transfer followed by “trimming” the backbone. In this case, the nature of the “core” saccharide will slightly differ from the nature of the subsequently attached groups. Specialists know a very large number of glycosyltransferases.

Гликозилтрансферазой, используемой в настоящем изобретении, может быть любая гликозилтрансфераза при условии, что она способна утилизовать модифицированный сахар в качестве донорного сахара. Примерами таких ферментов являются гликозилтрансфераза пути Лелуара, такая как галактозилтрансфераза, N-ацетилглюкозаминилтрансфераза, N-ацетилгалактозаминилтрансфераза, фукозилтрансфераза, сиалилтрансфераза, маннозилтрансфераза, ксилозилтрансфераза, глюкурононилтрансфераза и т.п.The glycosyl transferase used in the present invention may be any glycosyl transferase provided that it is capable of utilizing the modified sugar as a donor sugar. Examples of such enzymes are the Leloir pathway glycosyltransferase, such as galactosyltransferase, N-acetylglucosaminyltransferase, N-acetylgalactosaminyltransferase, fucosyltransferase, sialyltransferase, xylosyltransferaserancosylanthonosylose, xylose

Для ферментативного синтеза сахаридов, который включает гликозилтрансферазные реакции, гликозилтрансфераза может быть клонирована или выделена из любого источника. Многие клонированные гликозилтрансферазы, а также кодирующие их полинуклеотидные последовательности являются известными. См., например, “The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases” (http://www.vei.co.uk/TGN/gt.guide.htm). Аминокислотные последовательности гликозилтрансферазы и нуклеотидные последовательности, кодирующие гликозилтрансферазы, из которых могут происходить данные аминокислотные последовательности, также имеются в различных доступных базах данных, включая Genbank, Swiss-Prot, EMBL и др.For enzymatic synthesis of saccharides, which includes glycosyltransferase reactions, glycosyltransferase can be cloned or isolated from any source. Many cloned glycosyltransferases, as well as the polynucleotide sequences encoding them, are known. See, for example, “The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases” (http://www.vei.co.uk/TGN/gt.guide.htm) . Amino acid glycosyl transferase sequences and nucleotide sequences encoding glycosyl transferases from which these amino acid sequences can be derived are also available in various available databases, including Genbank, Swiss-Prot, EMBL, and others.

Гликозилтрансферазами, которые могут быть использованы в способах согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, галактозилтрансферазы, фукозилтрансферазы, глюкозилтрансферазы, N-ацетилгалактозаминилтрансферазы, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, глюкуронилтрансферазы, сиалилтрансферазы, маннозилтрансферазы, (глюкуроновая кислота)трансферазы, (галактуроновая кислота)трансферазы и олигосахарилтрансферазы. Подходящими гликозилтрансферазами являются гликозилтрансферазы, полученные из эукариотов, а также из прокариотов.Glycosyl transferases that can be used in the methods of the invention include, but are not limited to, galactosyl transferases, fucosyl transferases, glucosyl transferases, N-acetylgalactosaminyl transferases, N-acetylglucosaminyl transferase, glucuronyl transferase, glucuronyl transferase, glucuronyl transferase, oligosaccharyl transferase. Suitable glycosyl transferases are glycosyl transferases derived from eukaryotes as well as from prokaryotes.

ДНК, кодирующая гликозилтрансферазы, может быть получена путем химического синтеза, путем скрининга обратных транскриптов мРНК из соответствующих клеток или культур клеточных линий, путем скрининга геномных библиотек из соответствующих клеток или путем проведения комбинированных процедур. Скрининг мРНК или геномной ДНК может быть осуществлен с использованием олигонуклеотидных зондов, генерированных из генной последовательности гликозилтрансфераз. Зонды могут быть помечены детектируемой группой, такой как флуоресцентная группа, радиоактивный атом или хемилюминесцентная группа в соответствии с известными процедурами, и использованы в стандартных анализах методом гибридизации. Альтернативно, генные последовательности гликозилтрансфераз могут быть получены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных ПЦР-праймеров, продуцированных из генной последовательности гликозилтрансфераз. См. патент США № 4683195, Mullis et al. и патент США № 4683202, Mullis.DNA encoding glycosyl transferases can be obtained by chemical synthesis, by screening mRNA reverse transcripts from the corresponding cells or cell line cultures, by screening genomic libraries from the corresponding cells, or by performing combined procedures. Screening for mRNA or genomic DNA can be carried out using oligonucleotide probes generated from the glycosyltransferase gene sequence. Probes can be labeled with a detectable group, such as a fluorescent group, a radioactive atom or a chemiluminescent group in accordance with known procedures, and used in standard assays by hybridization. Alternatively, glycosyltransferase gene sequences can be obtained by polymerase chain reaction (PCR) using oligonucleotide PCR primers produced from the glycosyltransferase gene sequence. See US patent No. 4683195, Mullis et al. and US patent No. 4683202, Mullis.

Гликозилтрансфераза может быть синтезирована в клетках хозяина, транформированных векторами, содержащими ДНК, кодирующую фермент гликозилтрансферазу. Векторы используются для амплификации ДНК, кодирующей фермент гликозилтрансферазу, и/или для экспрессии ДНК, кодирующей фермент гликозилтрансферазу. Экспрессионным вектором является реплицируемая ДНК-конструкция, в которой ДНК-последовательность, кодирующая фермент гликозилтрансферазу, функционально присоединена к подходящим регуляторным последовательностям, способным осуществлять экспрессию фермента гликозилтрансферазы в подходящем хозяине. Необходимость в присутствии таких регуляторных последовательностей варьируется в зависимости от выбранного хозяина и от выбранного метода трансформации. В общих чертах регуляторные последовательности включают транскрипционный промотор; необязательную операторную последовательность для регуляции транскрипции; последовательность, кодирующую подходящие мРНК-сайты связывания с рибосомой; и последовательности, регулирующие терминацию транскрипции и трансляции. Векторам для амплификации не требуется домен регуляции экспрессии. Все, что требуется для данного вектора, это - способность реплицироваться в хозяине, обычно сообщаемая ориджином репликации, и присутствие селективного гена для облегчения идентификации трансформантов.Glycosyl transferase can be synthesized in host cells transformed with vectors containing DNA encoding the glycosyl transferase enzyme. Vectors are used to amplify a DNA encoding a glycosyl transferase enzyme and / or to express a DNA encoding a glycosyl transferase enzyme. An expression vector is a replicable DNA construct in which a DNA sequence encoding a glycosyl transferase enzyme is operably linked to suitable regulatory sequences capable of expressing a glycosyl transferase enzyme in a suitable host. The need for the presence of such regulatory sequences varies depending on the selected host and the chosen transformation method. In general terms, regulatory sequences include a transcriptional promoter; optional operator sequence for transcriptional regulation; a sequence encoding suitable ribosome mRNA binding sites; and sequences that regulate the termination of transcription and translation. Vectors do not require an expression regulation domain for amplification. All that is required for this vector is the ability to replicate in the host, usually communicated by the origin of replication, and the presence of a selective gene to facilitate identification of transformants.

В репрезентативном варианте изобретения используется прокариотический фермент. Гликозилтрансферазами являются ферменты, участвующие в синтезе липоолигосахаридов (ЛОС), которые продуцируются многими грамотрицательными бактериями (Preston et al., Critical Reviews in Microbiology 23(3):139-180 (1996)). Такими ферментами являются, но не ограничиваются ими, белки оперонов rfa таких видов, как E.coli и Salmonella typhimurium, которые включают β1,6-галактозилтрансферазу и β1,3-галактозилтрансферазу (см., например, EMBL Accesion № M80599 и М86935 (E.coli), EMBL Accesion № S56361 (S. typhimurium)), глюкозилтрансферазу (Swiss-Prot Accesion № Р25470 (E.coli)), β1,2-глюкозилтрансферазу (rfaJ) (Swiss-Prot Accesion № P27129 (E.coli) и Swiss-Prot Accesion № Р19817 (S. typhimurium)) и β1,2-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (rfaK)(EMBL Accesion № U00039 (E.coli)). Другими гликозилтрансферазами с известными аминокислотными последовательностями являются ферменты, которые кодируются оперонами, такими как rfaВ и которые были охарактеризованы в микроорганизмах, таких как Klebsiella pneumoniae, E.coli, Salmonella typhimurium, Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica, Mycobacterium leprosum, и опероном rhl Pseudomonas aeruginosa.In a representative embodiment of the invention, a prokaryotic enzyme is used. Glycosyl transferases are enzymes involved in the synthesis of lipo-oligosaccharides (VOCs), which are produced by many gram-negative bacteria (Preston et al., Critical Reviews in Microbiology 23 (3): 139-180 (1996)). Such enzymes include, but are not limited to, rfa operon proteins of species such as E. coli and Salmonella typhimurium , which include β1,6-galactosyltransferase and β1,3-galactosyltransferase (see, for example, EMBL Accesion No. M80599 and M86935 ( E .coli ), EMBL Accesion No. S56361 ( S. typhimurium )), glucosyl transferase (Swiss-Prot Accesion No. P25470 ( E.coli )), β1,2-glucosyl transferase ( rfaJ) (Swiss-Prot Accesion No. P27129 ( E. coli ) and Swiss-Prot Accesion No. P19817 ( S. typhimurium)) and β1,2-N-acetylglucosaminyltransferase ( rfa K) (EMBL Accesion No. U00039 ( E. coli )). In other glycosyltransferases with known amino acid sequences are enzymes that are encoded by operons such as rfa B, and which have been characterized in organisms such as Klebsiella pneumoniae, E.coli, Salmonella typhimurium, Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica, Mycobacterium leprosum, and the rhl Pseudomonas aeruginosa operon .

Ферментами, подходящими для использования в настоящем изобретении, также являются гликозилтрансферазы, которые участвуют в образовании структур, содержащих лакто-N-неотетраозу, D-галактозил-β-1,4-N-ацетил-D-глюкозаминил-β-1,3-D-галактозил-β-1,4-D-глюкозу и трисахаридную последовательность группы крови P^k, D-галактозил-α-1,4-D-галактозил-β-1,4-D-глюкозу, которые были идентифицированы в ЛОС патогенов Neisseria gonorrhoeae и N. meningitidis слизистой (Scholten et al., J. Med. Microbiol. 41:236-243 (1994)). Гены N. meningitidis и N. gonorrhoeae, которые кодируют гликозилтрансферазы, участвующие в биосинтезе этих структур, были идентифицированы в иммунотипах L3 и L1 N. meningitidis (Jennings et al., Mol. Microbiol. 18:729-740 (1995)) и в мутанте F62 N. gonorrhoeae (Gotshlich, J. Exp. Med. 180:2181-2190 (1994)). В N. meningitidis локус, состоящий из трех генов, lgtA, lgtB и lgE, кодирует гликозилтрансферазы, необходимые для присоединения последних трех сахаров в лакто-N-неотетраозной цепи (Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271:19166-73 (1996)). Недавно была продемонстрирована ферментативная активность генных продуктов lgtB и lgtA, которая является первым прямым свидетельством их предполагаемой гликозилтрансферазной функции (Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271(45):28271-276 (1996)). В N. gonorrhoeae имеются два дополнительных гена: lgtD, который присоединяет β-D-GalNAc в 3 положении концевой галактозы лакто-N-неотетраозной структуры, и lgtС, который присоединяет концевую α-D-Gal к лактозному элементу усеченного ЛОС, образуя, тем самым, антигенную структуру группы крови Р^k (Gotshlich (1994), см. выше). В N. meningitidis, отдельный иммунотип L1 также экспрессирует антиген группы крови Р^k, и было показано, что он несет ген lgtС (Jennings et al. (1995), см. выше). Гликозилтрансферазы Neisseria и ассоциированные с ними гены также описаны в патенте США № 5545553 (Gotschlich). Были также охарактеризованы гены α1,2-фукозилтрансферазы и α1,3-фукозилтрансферазы Helicobacter pylori (Martin et al., J. Biol. Chem. 272:21349-21356 (1997)). В настоящем изобретении могут быть также использованы гликозилтрансферазы Campylobacter jejuni (см., например, http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf_42.html).Enzymes suitable for use in the present invention are also glycosyl transferases, which are involved in the formation of structures containing lacto-N-neotetraose, D-galactosyl-β-1,4-N-acetyl-D-glucosaminyl-β-1,3- D-galactosyl-β-1,4-D-glucose and Trisaccharide blood group sequence P ^k , D-galactosyl-α-1,4-D-galactosyl-β-1,4-D-glucose, which were identified in VOCs pathogens Neisseria gonorrhoeae and N. meningitidis mucosa (Scholten et al., J. Med. Microbiol. 41: 236-243 (1994)). The genes of N. meningitidis and N. gonorrhoeae that encode glycosyltransferases involved in the biosynthesis of these structures have been identified in N. meningitidis immunotypes L3 and L1 (Jennings et al., Mol. Microbiol. 18: 729-740 (1995)) and in mutant F62 N. gonorrhoeae (Gotshlich, J. Exp. Med. 180: 2181-2190 (1994)). In N. meningitidis , a three-gene locus, lgtA , lgtB and lgE , encodes the glycosyltransferases necessary for the addition of the last three sugars in the lacto-N-neotetraose chain (Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271: 19166-73 (1996)). The enzymatic activity of the lgtB and lgtA gene products has recently been demonstrated, which is the first direct evidence of their putative glycosyltransferase function (Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271 (45): 28271-276 (1996)). There are two additional genes in N. gonorrhoeae : lgtD , which attaches β-D-GalNAc at the 3 position of the terminal galactose of the lacto-N-neotetraose structure, and lgtС , which attaches the terminal α-D-Gal to the lactose element of the truncated VOC, thus forming the antigenic structure of the blood group P ^k (Gotshlich (1994), see above). In N. meningitidis , the individual L1 immunotype also expresses the blood group antigen P ^k , and it has been shown to carry the lgtC gene (Jennings et al. (1995), supra). Neisseria glycosyl transferases and their associated genes are also described in US Pat. No. 5,545,553 (Gotschlich). The genes of α1,2-fucosyltransferase and α1,3-fucosyltransferase of Helicobacter pylori (Martin et al., J. Biol. Chem. 272: 21349-21356 (1997)) were also characterized. Campylobacter jejuni glycosyltransferases may also be used in the present invention (see, for example, http://afmb.cnrs-mrs.fr/ ~ pedro / CAZY / gtf_42.html).

ФукозилтрансферазыFucosyl transferase

В некоторых вариантах изобретения гликозилтрансферазой, используемой в способе согласно изобретению, является фукозилтрансфераза. Фукозилтрансферазы известны специалистам. Репрезентативными фукозилтрансферазами являются ферменты, которые переносят L-фукозу из ГДФ-фукозы в гидроксиположение акцепторного сахара. В настоящем изобретении также используются фукозилтрансферазы, переносящие ненуклеотидные сахара на акцептор.In some embodiments, the glycosyl transferase used in the method of the invention is a fucosyl transferase. Fucosyl transferases are known in the art. Representative fucosyl transferases are enzymes that transfer L-fucose from HDF-fucose to the hydroxy position of acceptor sugar. Fucosyl transferases that transfer non-nucleotide sugars to an acceptor are also used in the present invention.

В некоторых вариантах изобретения акцепторный сахар представляет собой, например, GlcNАc в Galβ(1→3,4)GlcNАcβ-группе в гликозиде олигосахарида. Фукозилтрансферазами, подходящими для этой реакции, являются Galβ(1→3,4)GlcNАcβ1-α(1→3,4)фукозилтрансфераза (FТIII ЕС № 2.4.1.65), которая была впервые выделена из человеческого молока и охарактеризована (см. Palcic et al., Carbohydrate Res. 190:1-11 (1989); Prieels et al., J. Biol. Chem. 256:10456-10463 (1981) & Nunez et al., Can. J. Chem. 59:2086-2095 (1981)), и Galβ(1→4)GlcNАcβ-α-фукозилтрансферазы (FТIV, FTV, FTVI), которые были обнаружены в человеческой сыворотке. Была также охарактеризована FТVII (ЕС № 2.4.1.65), сиалил-α(2→3)Galβ(1→3)GlcNАcβ-фукозилтрансфераза. Кроме того, была охарактеризована рекомбинантная форма Galβ(1→3,4)GlcNAcβ-α(1→3,4)-фукозилтрансферазы (см. Dumas et al., Bioorg. Med. Letters 1:425-428 (1991) & Kukowska-Latallo et al., Genes and Development 4:1288-1303 (1990)). Другими примерами фукозилтрансфераз являются, например, α1,2-фукозилтрансфераза (ЕС № 2.4.1.69). Ферментативное фукозилирование может быть осуществлено методами, описанными в работе Mollicone et al., Eur. J. Biochem. 191:169-176 (1990) или в патенте США № 5374655. Клетки, которые используются для продуцирования фукозилтрансферазы, также включают систему ферментативного синтеза ГДФ-фукозы.In some embodiments, the acceptor sugar is, for example, a GlcNAC in a Galβ (1 → 3,4) GlcNACcβ group in an oligosaccharide glycoside. Fucosyl transferases suitable for this reaction are Galβ (1 → 3,4) GlcNACβ1-α (1 → 3,4) fucosyl transferase (FTIII EC No. 2.4.1.65), which was first isolated from human milk and characterized (see Palcic et al., Carbohydrate Res. 190: 1-11 (1989); Prieels et al., J. Biol. Chem. 256: 10456-10463 (1981) & Nunez et al., Can. J. Chem. 59: 2086- 2095 (1981)), and Galβ (1 → 4) GlcNACβ-fucosyltransferases (FTIV, FTV, FTVI), which were found in human serum. FTVII (EC No. 2.4.1.65), sialyl-α (2 → 3) Galβ (1 → 3) GlcNAcβ-fucosyltransferase was also characterized. In addition, a recombinant form of Galβ (1 → 3,4) GlcNAcβ-α (1 → 3,4) -fucosyl transferase was characterized (see Dumas et al., Bioorg. Med. Letters 1: 425-428 (1991) & Kukowska -Latallo et al., Genes and Development 4: 1288-1303 (1990)). Other examples of fucosyltransferases are, for example, α1,2-fucosyltransferase (EC No. 2.4.1.69). Enzymatic fucosylation can be carried out by the methods described in Mollicone et al., Eur. J. Biochem. 191: 169-176 (1990) or US Pat. No. 5,374,655. Cells that are used to produce fucosyl transferase also include an enzymatic system for synthesizing HDF-fucose.

ГалактозилтрансферазыGalactosyl transferase

В другой группе вариантов изобретения указанной гликозилтрансферазой является галактозилтрансфераза. Примерами галактозилтрансфераз являются α(1,3)-галактозилтрансферазы (ЕС № 2.4.1.151, см., например, Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921 (1993) и Yamamoto et al. Nature 345:229-233 (1990)), коровья галактозилтрансфераза (GenBank j04989, Joziasse et al. J. Biol. Chem. 264:14290-14297 (1989)), мышиная галактозилтрансфераза (GenBank m26925; Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8227-8231 (1995)) и свиная галактозилтрансфераза (GenBank L36152; Strahan et al., Immunogenetics 41:101-105 (1995)). Другой подходящей α1,3-галактозилтрансферазой является галактозилтрансфераза, которая участвует в синтезе антигенов человеческой группы крови В (ЕС 2.4.1.37, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265:1146-1151 (1990)). Еще одним примером галактозилтрансферазы является Gal-T1 остова.In another group of embodiments of the invention, said glycosyl transferase is galactosyl transferase. Examples of galactosyl transferases are α (1,3) -galactosyl transferases (EC No. 2.4.1.151; see, for example, Dabkowski et al., Transplant Proc. 25: 2921 (1993) and Yamamoto et al. Nature 345: 229-233 (1990) )), bovine galactosyltransferase (GenBank j04989, Joziasse et al. J. Biol. Chem. 264: 14290-14297 (1989)), mouse galactosyltransferase (GenBank m26925; Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 8227-8231 (1995)) and porcine galactosyltransferase (GenBank L36152; Strahan et al., Immunogenetics 41: 101-105 (1995)). Another suitable α1,3-galactosyltransferase is galactosyltransferase, which is involved in the synthesis of human blood type B antigens (EC 2.4.1.37, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265: 1146-1151 (1990)). Another example of galactosyl transferase is the Gal-T1 backbone.

В способах согласно изобретению могут быть также использованы β(1,4)-галактозилтрансферазы, которыми являются, например, ЕС 2.4.1.90 (LacNAc-синтетаза) и ЕС 2.4.1.22 (лактозо-синтетаза), коровья (D'Agostaro et al., Eur. J. Biochem. 183:211-217 (1989)), человеческая (Mastri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157:657-663 (1998)) и мышиная галактозилтрансферазы (Nakazawa et al., J. Biochem. 104:165-168 (1988)), а также ЕС 2.4.1.38 и церамид-галактозилтрансфераза (ЕС 2.4.1.45, Stahl et al., J. Neurosci. Res. 38:234-242 (1994)). Другими подходящими галактозилтрансферазами являются, например, α1,2-галактозилтрансферазы (выделенные, например, из Schizosaccharomyces pombe, Chapell et al., Mol. Biol. Cell. 5:519-528 (1994)).Β (1,4) -galactosyltransferases, which are, for example, EC 2.4.1.90 (LacNAc synthetase) and EC 2.4.1.22 (lactose synthetase), bovine (D'Agostaro et al., Can also be used in the methods of the invention. , Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989)), human (Mastri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157: 657-663 (1998)) and murine galactosyl transferase (Nakazawa et al., J. Biochem. 104: 165-168 (1988)), as well as EC 2.4.1.38 and ceramide-galactosyl transferase (EC 2.4.1.45, Stahl et al., J. Neurosci. Res. 38: 234-242 (1994)) . Other suitable galactosyl transferases are, for example, α1,2-galactosyl transferases (isolated, for example, from Schizosaccharomyces pombe, Chapell et al., Mol. Biol. Cell. 5: 519-528 (1994)).

СиалилтрансферазыSialyltransferases

Сиалилтрансферазы представляют собой гликозилтрансферазы другого типа, которые могут быть использованы в рекомбинантных клетках и в реакционных смесях согласно изобретению. Клетки, продуцирующие рекомбинантные сиалилтрансферазы, также продуцируют ЦМФ-сиаловую кислоту, которая является донорной сиаловой кислотой для сиалилтрансфераз. Примерами сиалилтрансфераз, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются ST3GalIII (например, крысиные или мышиные ST3GalIII), ST3GalIV, ST3GalI, ST3GalII, ST6GalI, ST3GalV, ST6GalII, ST6GalNAcI, ST6GalNAcII и ST6GalNAcIII (номенклатура, используемая для обозначения сиалилтрансфераз, имеется у Tsuji et al., Glycobiology 6:v-xiv (1996)). Репрезентативная α(2,3)сиалилтрансфераза, называемая α(2,3)сиалилтрансферазой (ЕС 2.4.99.6), переносит сиаловую кислоту на невосстанавливающий концевой Gal дисахарида или гликозида Galβ1→3Glc. См. Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256:3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257:13845 (1985) и Wen et al., J. Biol. Chem. 267:21011 (1992). Другая репрезентативная α2,3-сиалилтрансфераза (ЕС 2.4.99.4) также переносит сиаловую кислоту на невосстанавливающий концевой Gal дисахарида или гликозида, см. Rearick et al., J. Biol. Chem. 254:4444 (1979) и Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267:21004 (1992). Еще одним репрезентативным ферментом является Gal-β-1,4-GlcNAc-α-2,6-сиалилтрансфераза (см. Kurosawa et al., Eur. J. Biochem. 219:375-381 (1994)).Sialyl transferases are another type of glycosyl transferases that can be used in recombinant cells and in the reaction mixtures according to the invention. Recombinant sialyl transferase producing cells also produce CMP-sialic acid, which is a sialic acid donor for sialyl transferases. Examples of sialyltransferases that can be used in the present invention are ST3GalIII (e.g. rat or mouse ST3GalIII), ST3GalIV, ST3GalI, ST3GalII, ST6GalI, ST3GalV, ST6GalII, ST6GalNAcI, ST6GalNAcI et al., Glycobiology 6: v-xiv (1996)). A representative α (2,3) sialyl transferase, called α (2,3) sialyl transferase (EC 2.4.99.6), transfers sialic acid to the non-reducing terminal Gal of a disaccharide or glycoside Galβ1 → 3Glc. See Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256: 3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1985) and Wen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992). Another representative α2,3-sialyltransferase (EC 2.4.99.4) also transfers sialic acid to the non-reducing terminal Gal of a disaccharide or glycoside, see Rearick et al., J. Biol. Chem. 254: 4444 (1979) and Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267: 21004 (1992). Another representative enzyme is Gal-β-1,4-GlcNAc-α-2,6-sialyltransferase (see Kurosawa et al., Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994)).

Для гликозилирования углеводов гликопептидов предпочтительно, чтобы сиалилтрансфераза обладала способностью переносить сиаловую кислоту на последовательность Galβ1,4GlcNAc-, то есть на наиболее распространенную последовательность, являющуюся предпоследней последовательностью перед концевой сиаловой кислотой на полностью сиалилированных углеводных структурах (см. таблицу 2).For glycosylation of carbohydrate glycopeptides, it is preferable that sialyl transferase has the ability to transfer sialic acid to the Galβ1,4GlcNAc- sequence, i.e. to the most common sequence, which is the penultimate sequence before the terminal sialic acid on fully sialylated carbohydrate structures (see table 2).

Таблица 2table 2
Сиалилтрансферазы, которые используют последовательность Galβ1,4GlcNAc в качестве субстрата-акцептораSialyl transferases that use the Galβ1,4GlcNAc sequence as an acceptor substrate СиалилтрансферазаSialyltransferase ИсточникSource Образуемая последовательностьFormed sequence сс.ss SТ6Gal IST6Gal I МлекопитающееMammal NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNАcNeuAcα2.6Galβ1.4GlcNAC 1one SТ3Gal IIIST3Gal III МлекопитающееMammal NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNАc- NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNАcNeuAcα2.3Galβ1.4GlcNAC-NeuAcα2.3Galβ1.3GlcNac 1one SТ3Gal IVST3Gal IV МлекопитающееMammal NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNАc- NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNАcNeuAcα2.3Galβ1.4GlcNAC-NeuAcα2.3Galβ1.3GlcNac 1one SТ6Gal IIST6Gal II МлекопитающееMammal NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNАcNeuAcα2.6Galβ1.4GlcNAC 1one SТ6Gal IIST6Gal II ФотобактерияPhotobacteria NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNАcNeuAcα2.6Galβ1.4GlcNAC 22 SТ3Gal VST3Gal V N. meningitidisN. meningitidis
N. gonorrhoeaeN. gonorrhoeae NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNАcNeuAcα2.3Galβ1.4GlcNAC 33

1) Goochee et al., Bio/Technology 9:1347-1355 (1991).1) Goochee et al., Bio / Technology 9: 1347-1355 (1991).

2) Yamamoto et al., J. Biochem. 120:104-110 (1996).2) Yamamoto et al., J. Biochem. 120: 104-110 (1996).

3) Gilbert et al., J. Biol. Chem. 271:28271-28276 (1996).3) Gilbert et al., J. Biol. Chem. 271: 28271-28276 (1996).

Примером сиалилтрансферазы, которая используется в заявленных способах, является SТ3GalIII, которая также называется α(2,3)сиалилтрансферазой (ЕС 2.4.99.6). Этот фермент катализирует перенос сиаловой кислоты на Gal гликозида Galβ1,3GlcNAc или Galβ1,4GlcNAc (см., например, Wen et al., J. Biol. Chem. 267:21011 (1992); Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256:3159 (1991)) и является ответственным за сиалилирование связанных с аспарагином олигосахаридов в гликопептидах. Данная сиаловая кислота связывается с Gal, в результате чего между двумя сахаридами образуется α-связь. Связывание (присоединение) сахаридов происходит между 2 положением NeuAc и 3 положением Gal. Этот конкретный фермент может быть выделен из печени крыс (Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257:13845 (1982)); причем кДНК (Sasaki et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994), J. Biol. Chem. 269:1394-1401) и геномная ДНК-последовательности человеческого фермента (Kitagawa et al. (1996), J. Biol. Chem. 271:931-938) являются известными, что облегчает продуцирование этого фермента посредством рекомбинантной экспрессии. В предпочтительном варианте изобретения заявленные способы сиалилирования предусматривают использование крысиного SТ3GalIII.An example of a sialyl transferase that is used in the claimed methods is ST3GalIII, also called α (2,3) sialyl transferase (EC 2.4.99.6). This enzyme catalyzes the transfer of sialic acid to the Gal glycoside Galβ1,3GlcNAc or Galβ1,4GlcNAc Gal (see, e.g., Wen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992); Van den Eijnden et al., J. Biol Chem. 256: 3159 (1991)) and is responsible for the sialylation of asparagine-linked oligosaccharides in glycopeptides. This sialic acid binds to Gal, resulting in an α-bond between the two saccharides. Saccharide binding occurs between the 2 position of NeuAc and the 3 position of Gal. This particular enzyme can be isolated from rat liver (Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982)); moreover, cDNA (Sasaki et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994), J. Biol. Chem. 269: 1394-1401) and the genomic DNA sequence of the human enzyme ( Kitagawa et al. (1996), J. Biol. Chem. 271: 931-938) are known to facilitate the production of this enzyme by recombinant expression. In a preferred embodiment of the invention, the claimed sialylation methods involve the use of rat ST3GalIII.

Другими репрезентативными сиалилтрансферазами, используемыми в настоящем изобретении, являются сиалилтрансферазы, выделенные из Campylobacter jejuni, включая CST-1 и CST-II, и сиалилтрансферазы, образующие α(2,3)-связи. См., например, WO 99/49051.Other representative sialyltransferases used in the present invention are sialyltransferases isolated from Campylobacter jejuni, including CST-1 and CST-II, and sialyltransferases forming α (2,3) bonds. See, for example, WO 99/49051.

Для проведения недорогостоящих и эффективных крупномасштабных процедур сиалилирования гликопептидов, имеющих важное коммерческое значение, могут быть также использованы и другие сиалилтрансферазы, не перечисленные в таблице 2. Самым простым тестом для определения эффективности этих других ферментов является проведение реакции различных количеств каждого из этих ферментов (1-100 мЕд/мг белка) с асиало-α₁-АГФ (при 1-10 мг/мл) для сравнения способности представляющей интерес сиалилтрансферазы сиалилировать гликопептиды со способностью к такому сиалилированию коровьей ST6GalI, ST3GalIII или обеих сиалилтрансфераз. Альтернативно, для такой оценки вместо асиало-α₁-АГФ могут быть использованы и другие гликопептиды или N-связанные олигосахариды, ферментативно высвобождаемые из пептидного остова. Сиалилтрансферазы, обладающие способностью более эффективно сиалилировать N-связанные олигосахариды гликопептидов, чем ST6GalI, могут быть использованы для проведения крупномасштабных процедур сиалилирования пептидов.Other sialyltransferases not listed in Table 2 can also be used to carry out inexpensive and effective large-scale procedures for sialylation of glycopeptides that are of commercial importance. The simplest test to determine the effectiveness of these other enzymes is to react different amounts of each of these enzymes (1- 100 mU / mg protein) with asialo-α ₁ -AGF (at 1-10 mg / ml) to compare the ability of the sialyltransferase of interest sialylated glycopeptides with the ability to t who sialylation cow ST6GalI, ST3GalIII or both sialyltransferases. Alternatively, other glycopeptides or N-linked oligosaccharides enzymatically released from the peptide backbone can be used instead of asialo-α ₁ -AGF for such an assessment. Sialyltransferases, which are capable of more efficiently sialylating N-linked glycopeptide oligosaccharides than ST6GalI, can be used for large-scale peptide sialylation procedures.

Эти и другие сиалилтрансферазы представлены на фиг.11, где приводится таблица сиалилтрансфераз, которые используются для переноса на акцептор модифицированных молекул сиаловой кислоты, описанных в настоящей заявке, и немодифицированной сиаловой кислоты.These and other sialyl transferases are presented in FIG. 11, which provides a table of sialyl transferases that are used to transfer the modified sialic acid molecules described herein and unmodified sialic acid to the acceptor.

GalNac-трансферазыGalNac transferase

N-ацетилгалактозаминилтрансферазы используются для осуществления настоящего изобретения, а в частности для связывания молекулы GalNac с аминокислотой сайта О-связанного гликозилирования пептида. Подходящими N-ацетилгалактозаминилтрансферазами являются, но не ограничиваются ими, α(1,3)N-ацетилгалактозаминилтрансферазы, β(1,4)N-ацетилгалактозаминилтрансферазы (Nagata et al., J. Biol. Chem. 267:12082-12089 (1992) и Smith et al., J. Biol. Chem. 269:15162 (1994)) и полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансфераза (Homa et al., J. Biol. Chem. 268:12609 (1993)).N-acetylgalactosaminyl transferases are used to carry out the present invention, and in particular, to bind the GalNac molecule to the amino acid of the O-linked glycosylation site of the peptide. Suitable N-acetylgalactosaminyl transferases include, but are not limited to, α (1,3) N-acetylgalactosaminyl transferases, β (1,4) N-acetylgalactosaminyl transferases (Nagata et al., J. Biol. Chem. 267: 12082-12089 (1992) and Smith et al., J. Biol. Chem. 269: 15162 (1994)) and the N-acetylgalactosaminyl transferase polypeptide (Homa et al., J. Biol. Chem. 268: 12609 (1993)).

Получение белков, таких как фермент GalNAc Т_I-ХХ, из клонированных генов путем генной инженерии хорошо известно специалистам. См., например, патент США № 4761371. Один из методов включает сбор достаточного числа образцов, а затем определение аминокислотной последовательности фермента путем N-концевого секвенирования. Такая информация может быть затем использована для выделения кДНК-клона, кодирующего полноразмерную (мембраносвязанную) трансферазу, которая после ее экспрессии в клеточной линии насекомых Sf9 позволяет синтезировать полностью активный фермент. Специфичность этого фермента к акцептору затем определяют с помощью полуколичественного анализа аминокислот, окружающих известные сайты гликозилирования в 16 различных белках, после чего проводят исследования in vitro гликозилирования синтетических пептидов. В этой работе было продемонстрировано, что некоторые аминокислотные остатки присутствуют в гликозилированных пептидных сегментах в избыточном количестве и что остатки в специфических положениях, окружающих гликозилированный сериновый и треониновый остатки, могут оказывать более заметное влияние на эффективность акцептора, чем другие аминокислотные остатки.The preparation of proteins, such as the GalNAc T _I-XX enzyme, from cloned genes by genetic engineering is well known in the art. See, for example, US Patent No. 4,761,371. One method involves collecting a sufficient number of samples and then determining the amino acid sequence of the enzyme by N-terminal sequencing. Such information can then be used to isolate a cDNA clone encoding a full-sized (membrane-bound) transferase, which, after its expression in the insect cell line Sf9, allows the synthesis of a fully active enzyme. The specificity of this enzyme for the acceptor is then determined using a semi-quantitative analysis of the amino acids surrounding the known glycosylation sites in 16 different proteins, after which in vitro glycosylation studies of synthetic peptides are carried out. In this work, it was demonstrated that some amino acid residues are present in excess in glycosylated peptide segments and that residues at specific positions surrounding glycosylated serine and threonine residues can have a more noticeable effect on acceptor efficiency than other amino acid residues.

Связанные с клетками гликозилтрансферазыGlycosyltransferase-Related Cells

В другом варианте изобретения ферментами, используемыми в способе согласно изобретению, являются связанные с клетками гликозилтрансферазы. Хотя известно много растворимых гликозилтрансфераз (см., например, патент США № 5032519), однако эти гликозилтрансферазы, при их связывании с клетками, в основном, присутствуют в мембраносвязанной форме. Многие из исследованных таким образом мембраносвязанных ферментов, в основном, считаются внутренними белками, то есть они не высвобождаются из мембран при обработке ультразвуком, и для их солюбилизации требуются детергенты. Поверхностные гликозилтрансферазы были идентифицированы на поверхностях клеток позвоночных и беспозвоночных, и было также установлено, что эти поверхностные трансферазы сохраняют каталитическую активность в физиологических условиях. Однако более известной функцией таких гликозилтрансфераз клеточной поверхности является внутриклеточное распознавание (Roth, Molecular Approaches to Supracellular Phenomena, 1990).In another embodiment of the invention, the enzymes used in the method of the invention are glycosyl transferase bound to cells. Although many soluble glycosyltransferases are known (see, for example, US Pat. No. 5,032,519), these glycosyltransferases, when they bind to cells, are mainly present in membrane bound form. Many of the membrane-bound enzymes studied in this way are mainly considered to be internal proteins, that is, they are not released from the membranes by sonication, and detergents are required to solubilize them. Surface glycosyl transferases were identified on the surfaces of vertebrate and invertebrate cells, and it was also found that these surface transferases retain catalytic activity under physiological conditions. However, the better known function of such cell surface glycosyltransferases is intracellular recognition (Roth, Molecular Approaches to Supracellular Phenomena, 1990).

Были разработаны способы модификации гликозилтрансфераз, экспрессируемых клетками. Так, например, в работе Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:8227-8231 (1989) описан генетический метод выделения клонированных кДНК-последовательностей, которые определяют уровень экспрессии олигосахаридных структур клеточной поверхности и их когнатных гликозилтрансфераз. кДНК-библиотека, генерированная из мРНК, выделенной из мышиной клеточной линии, которая, как известно, экспрессирует УДФ-галактозу: β-D-галактозил-1,4-N-ацетил-D-глюкозаминид-α-1,3-галактозилтрансферазу, была трансфицирована в клетки СОS-1. Затем трансфицированные клетки культивировали и анализировали на α-1,3-галактозилтрансферазную активность.Methods have been developed for modifying glycosyltransferases expressed by cells. For example, in Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 8227-8231 (1989) describes a genetic method for isolating cloned cDNA sequences that determine the expression level of oligosaccharide cell surface structures and their cognate glycosyltransferases. cDNA library generated from mRNA isolated from a murine cell line that is known to express UDF galactose: β-D-galactosyl-1,4-N-acetyl-D-glucosaminide-α-1,3-galactosyltransferase, was transfected into COS-1 cells. Then, the transfected cells were cultured and analyzed for α-1,3-galactosyl transferase activity.

В работе Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:2713-2717 (1992) описан метод заякоривания β-лактамазы на внешней поверхности Esсherichia coli. Был продуцирован трехкомпонентный гибрид, состоящий из (i) сигнальной последовательности внешнего мембранного белка, (ii) трансмембранной части внешнего мембранного белка и (iii) полноразмерной зрелой β-лактамазной последовательности и образующий активную молекулу β-лактамазы, связанную с клеточной поверхностью. Однако метод Франциско ограничивается только прокариотическими клеточными системами, и, как известно авторам, для правильного функционирования этой лактамазы необходим полный трехкомпонентный гибрид.In the work of Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 89: 2713-2717 (1992) describes a method for anchoring β-lactamase on the outer surface of Esherichia coli . A three-component hybrid was produced consisting of (i) the signal sequence of the outer membrane protein, (ii) the transmembrane portion of the outer membrane protein and (iii) the full-sized mature β-lactamase sequence and forming the active β-lactamase molecule bound to the cell surface. However, the Francisco method is limited only to prokaryotic cell systems, and, as the authors know, for the proper functioning of this lactamase, a complete three-component hybrid is required.

СульфотрансферазыSulfotransferase

Настоящее изобретение также относится к способам получения пептидов, которые содержат сульфатированные молекулы, включая, например, сульфатированные полисахариды, такие как гепарин, сульфат гепарана, карагенан и родственные соединения. Подходящими сульфотрансферазами являются, например, хондротин-6-сульфотрансфераза (куриная кДНК, описанная Fukuta et al., J. Biol. Chem. 270:18575-18580 (1995); GenBank, рег.№ D49915), гликозаминогликан-N-ацетилглюкозамин-N-деацетилаза/N-сульфотрансфераза 1 (Dixon et al., Genomics 26:239-241 (1995); UL18918) и гликозаминогликан-N-ацетилглюкозамин-N-деацетилаза/N-сульфотрансфераза 2 (мышиная кДНК, описанная Orellana et al., J. Biol. Chem. 269:2270-2276 (1994) и Eriksson et al., J. Biol. Chem. 269:10438-10443 (1994); и человеческая кДНК, имеющаяся в Genbank Accession No. U2304).The present invention also relates to methods for producing peptides that contain sulfated molecules, including, for example, sulfated polysaccharides, such as heparin, heparan sulfate, carrageenan and related compounds. Suitable sulfotransferases are, for example, chondrotin-6-sulfotransferase (chicken cDNA described by Fukuta et al., J. Biol. Chem. 270: 18575-18580 (1995); GenBank, reg. No. D49915), glycosaminoglycan-N-acetylglucosamine- N-deacetylase / N-sulfotransferase 1 (Dixon et al., Genomics 26: 239-241 (1995); UL18918) and glycosaminoglycan-N-acetylglucosamine-N-deacetylase / N-sulfotransferase 2 (mouse cDNA described by Orellana et al. , J. Biol. Chem. 269: 2270-2276 (1994) and Eriksson et al., J. Biol. Chem. 269: 10438-10443 (1994); and human cDNA available from Genbank Accession No. U2304).

ГликозидазыGlycosidase

Настоящее изобретение также относится к использованию гликозидаз дикого типа и мутантных гликозидаз. Было продемонстрировано, что мутантные β-галактозидазы катализируют образование дисахаридов посредством связывания α-гликозилфторида с галактозильной акцепторной молекулой (Withers, патент США № 6284494, выданный 4 сентября 2001). Другими гликозидазами, используемыми в настоящем изобретении, являются, например, β-глюкозидазы, β-галактозидазы, β-маннозидазы, β-ацетилглюкозаминидазы, β-N-ацетилгалактозаминидазы, β-ксилозидазы, β-фукозидазы, целлюлазы, ксиланазы, галактаназы, маннаназы, гемицеллюлазы, амилазы, глюкоамилазы, α-глюкозидазы, α-галактозидазы, α-маннозидазы, α-N-ацетилглюкозаминидазы, α-N-ацетилгалактозаминидазы, α-ксилозидазы, α-фукозидазы и нейраминидазы/сиалидазы.The present invention also relates to the use of wild-type glycosidases and mutant glycosidases. Mutant β-galactosidases have been shown to catalyze the formation of disaccharides by binding of α-glycosyl fluoride to a galactosyl acceptor molecule (Withers, US Patent No. 6,284,494, issued September 4, 2001). Other glycosidases used in the present invention are, for example, β-glucosidase, β-galactosidase, β-mannosidase, β-acetylglucosaminidase, β-N-acetylgalactosaminidase, β-xylosidase, β-fucosidase, cellulase, xylanase, galactanase, galactanase hemicellulase, amylase, glucoamylase, α-glucosidase, α-galactosidase, α-mannosidase, α-N-acetylglucosaminidase, α-N-acetylgalactosaminidase, α-xylosidase, α-fucosidase and neuraminidase / sialidase.

Иммобилизованные ферментыImmobilized enzymes

Настоящее изобретение также относится к использованию ферментов, иммобилизованных на твердом и/или растворимом носителе. В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к гликозилтрансферазе, которая конъюгирована с ПЭГ посредством интактного гликозильного линкера способами согласно изобретению. Конъюгат “ПЭГ-линкер-фермент” присоединяют, но необязательно, к твердому носителю. Использование ферментов на твердых носителях в способах согласно изобретению упрощает обработку реакционной смеси и очистку реакционного продукта, а также облегчает восстановление фермента. В способах согласно изобретению используют гликозилтрансферазный конъюгат. Специалистам известны и другие комбинации ферментов и носителей.The present invention also relates to the use of enzymes immobilized on a solid and / or soluble carrier. In a representative embodiment, the present invention relates to a glycosyl transferase that is conjugated to PEG via an intact glycosyl linker by the methods of the invention. The PEG-linker-enzyme conjugate is attached, but not necessarily, to a solid support. The use of enzymes on solid supports in the methods according to the invention simplifies the processing of the reaction mixture and purification of the reaction product, and also facilitates the restoration of the enzyme. The methods of the invention utilize a glycosyl transferase conjugate. Other combinations of enzymes and carriers are known to those skilled in the art.

Гибридные белкиHybrid proteins

В других репрезентативных вариантах в способах согласно изобретению используются гибридные белки, обладающие более чем одной ферментативной активностью, участвующей в синтезе нужного гликопептидного конъюгата. Гибридные полипептиды могут состоять, например, из каталитически активного домена гликозилтрансферазы, который присоединен к каталитически активному домену вспомогательного фермента. Каталитический домен вспомогательного фермента может, например, катализировать стадию образования сахара нуклеотида, который является донором для гликозилтрансферазы, или катализировать реакцию, участвующую в гликозилтрансферазном цикле. Так, например, полинуклеотид, кодирующий гликозилтрансферазу, может быть присоединен, с сохранением рамки считывания, к полинуклеотиду, кодирующему фермент, участвующий в синтезе сахара нуклеотида. Затем полученный гибридный белок может катализировать не только синтез сахара нуклеотида, но также и переносить сахарную группу на акцепторную молекулу. Гибридный белок может состоять из двух или нескольких ферментов, участвующих в данном цикле и связанных с одной экспрессируемой нуклеотидной последовательностью. В других вариантах изобретения этот гибридный белок включает каталитические активные домены двух или более гликозилтрансфераз. См., например, патент 5641668. Модифицированные гликопептиды согласно изобретению могут быть легко сконструированы и изготовлены с использованием различных подходящих гибридных белков (см., например, патентную заявку РСТ/СА98/01180, опубликованную 24 июня 1999 под номером WO 99/31224).In other representative embodiments, the methods of the invention utilize fusion proteins having more than one enzymatic activity involved in the synthesis of a desired glycopeptide conjugate. Hybrid polypeptides may consist, for example, of a catalytically active domain of a glycosyl transferase that is attached to a catalytically active domain of an auxiliary enzyme. The catalytic domain of the auxiliary enzyme can, for example, catalyze the stage of sugar nucleotide formation, which is a donor for glycosyltransferase, or catalyze the reaction involved in the glycosyltransferase cycle. So, for example, a polynucleotide encoding a glycosyl transferase can be attached, with the preservation of the reading frame, to a polynucleotide encoding an enzyme involved in the synthesis of nucleotide sugar. Then, the resulting hybrid protein can catalyze not only the synthesis of sugar nucleotide, but also transfer the sugar group to the acceptor molecule. A hybrid protein may consist of two or more enzymes involved in a given cycle and linked to a single expressed nucleotide sequence. In other embodiments, the fusion protein comprises catalytic active domains of two or more glycosyl transferases. See, for example, patent 5641668. The modified glycopeptides according to the invention can be easily designed and manufactured using various suitable fusion proteins (see, for example, patent application PCT / CA98 / 01180, published June 24, 1999 under the number WO 99/31224).

Получение модифицированных сахаровObtaining modified sugars

В общих чертах сахарная часть или кластер “сахарная часть - линкер” и группа ПЭГ или группы кластера “ПЭГ-линкер” связаны друг с другом посредством реакционноспособных групп, которые, в процессе реакции присоединения, обычно превращаются в новую органическую функциональную группу или в нереакционноспособную группу. Реакционноспособная(ые) функциональная(ые) группа(ы) сахара локализована(ы) в любом положении сахарной части. Обычно, для осуществления настоящего изобретения используются реакционноспособные группы и класс реакций, которые хорошо известны специалистам в области химии биоконъюгатов. Наиболее предпочтительными в настоящее время классами реакций с реакционноспособными сахарными группами являются реакции, которые протекают в относительно мягких условиях. Такими реакциями являются, но не ограничиваются ими, нуклеофильные замещения (например, реакции аминов и спиртов с ацилгалогенидами, активными сложными эфирами), электрофильные замещения (например, реакции с енаминами) и реакции присоединения с образованием углерод-углеродных и углерод-гетероатомных кратных связей (например, реакция Михаэля, реакция присоединения Дильса-Альдера). Эти и другие подходящие реакции обсуждаются, например, в публикациях March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 и у Feeney et al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol.198, American Chemical Society, Washington, DC, 1982.In general terms, the sugar moiety or the sugar moiety-linker cluster and the PEG group or the PEG-linker cluster groups are linked to each other via reactive groups, which, during the addition reaction, usually turn into a new organic functional group or a non-reactive group . Reactive functional functional group (s) of sugar is localized (s) in any position of sugar part. Typically, the implementation of the present invention uses reactive groups and a class of reactions that are well known to specialists in the field of chemistry of bioconjugates. The currently most preferred classes of reactions with reactive sugar groups are reactions that proceed under relatively mild conditions. Such reactions include, but are not limited to, nucleophilic substitutions (e.g., reactions of amines and alcohols with acyl halides, active esters), electrophilic substitutions (e.g., reactions with enamines) and addition reactions to form carbon-carbon and carbon-heteroatom multiple bonds ( e.g. Michael reaction, Diels-Alder addition reaction). These and other suitable reactions are discussed, for example, in March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 and Feeney et al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol .98, American Chemical Society, Washington, DC, 1982.

Используемыми реакционноспособными функциональными группами, ответвляющимися от сахарного ядра, или модифицирующими группами являются, но не ограничиваются ими:Used reactive functional groups branching from the sugar core, or modifying groups are, but are not limited to:

(а) карбоксильные группы и их различные производные, включая, но не ограничиваясь ими, N-гидроксисукцинимидоэфиры, эфиры N-гидроксибензотриазола, галогенангидриды кислоты, ацилимидазолы кислот, сложные тиоэфиры, п-нитрофениловые эфиры, алкиловые, алкениловые, алкиниловые и ароматические сложные эфиры;(a) carboxyl groups and various derivatives thereof, including, but not limited to, N-hydroxysuccinimido esters, N-hydroxybenzotriazole esters, acid halides, acyl imidazoles, thio esters, p-nitrophenyl esters, alkyl, alkenyl, alkynyl;

(b) гидроксильные группы, которые могут превращаться, например, в сложные эфиры, в простые эфиры, в альдегиды и т.п.;(b) hydroxyl groups which can be converted, for example, to esters, ethers, aldehydes and the like;

(с) галогеналкильные группы, где галогенид может быть затем замещен нуклеофильной группой, такой как, например, амин, анион карбоксилата, анион тиола, карбанион или ион алкоксида, с ковалентным присоединением новой группы к функциональной группе, которой является атом галогена;(c) haloalkyl groups, where the halide can then be substituted with a nucleophilic group, such as, for example, an amine, carboxylate anion, thiol anion, carbanion or alkoxide ion, with the covalent addition of a new group to a functional group, which is a halogen atom;

(d) диенофильные группы, которые могут участвовать в реакциях Дильса-Альдера, такие как, например, малеимидогруппы;(d) dienophilic groups that may be involved in Diels-Alder reactions, such as, for example, maleimido groups;

(е) альдегидные или кетоновые группы, которые могут затем подвергаться дериватизации посредством образования карбонильных производных, таких как, например, имины, гидразоны, полукарбазоны или оксимы, или посредством таких механизмов, как реакция присоединения Гриньяра или реакция присоединения алкиллития;(e) aldehyde or ketone groups, which can then be derivatized by the formation of carbonyl derivatives, such as, for example, imines, hydrazone, half-carbazones or oximes, or by mechanisms such as the Grignard addition reaction or the alkyl lithium addition reaction;

(f) сульфонилгалогенидные группы для последующей реакции с аминами, например, с образованием сульфонамидов;(f) sulfonyl halide groups for subsequent reaction with amines, for example, to form sulfonamides;

(g) тиоловые группы, которые могут, например, превращаться в дисульфиды или реагировать с ацилгалогенидами;(g) thiol groups which may, for example, convert to disulfides or react with acyl halides;

(h) аминогруппы или сульфгидрильные группы, которые могут быть, например, ацилированными, алкилированными или окисленными;(h) amino groups or sulfhydryl groups, which may be, for example, acylated, alkylated or oxidized;

(i) алкены, которые могут подвергаться, например, реакции циклоприсоединения, ацилирования, реакции присоединения Михаэля и т.п.;(i) alkenes which may undergo, for example, a cycloaddition reaction, acylation, Michael addition reaction, and the like;

(j) эпоксиды, которые могут реагировать, например, с аминами и гидроксильными соединениями.(j) epoxides that can react, for example, with amines and hydroxyl compounds.

Реакционноспособные функциональные группы могут быть выбраны так, чтобы они не участвовали в реакциях или не препятствовали реакциям, которые необходимы для сборки реакционноспособного сахарного ядра или модифицирующей группы. Альтернативно, реакционноспособная функциональная группа может быть защищена от участия в реакции благодаря присутствию защитной группы. Специалистам в данной области хорошо известен способ защиты конкретной функциональной группы, который позволяет предотвращать ее участие в выбранной серии реакций, проводимых в определенных условиях. Примеры подходящих защитных групп можно найти, например, в руководстве Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.Reactive functional groups can be selected so that they do not participate in the reactions or do not interfere with the reactions that are necessary for the assembly of the reactive sugar core or modifying group. Alternatively, the reactive functional group may be protected from participation in the reaction due to the presence of a protective group. Specialists in this field are well aware of the way to protect a specific functional group, which helps to prevent its participation in the selected series of reactions carried out under certain conditions. Examples of suitable protecting groups can be found, for example, in Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

Ниже обсуждается ряд конкретных примеров модифицированных сахаров, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. В репрезентативных вариантах изобретения производное сиалиловой кислоты используется в качестве сахарного ядра, к которому присоединена модифицирующая группа. Обсуждение производных сиаловой кислоты приводится лишь для иллюстрации и не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения. Специалистам в данной области понятно, что различные другие сахарные группы могут быть активированы и дериватизированы методами, аналогичными методам с использованием сиаловой кислоты, описанным в качестве примера. Так, например, существует множество методов, подходящих для модификации галактозы, глюкозы, N-ацетилгалактозамина и фукозы, не говоря уже о других сахарных субстратах, и такая модификация может быть легко осуществлена известными методами. См., например, Elhalabi et al., Curr. Med. Chem. 6:93 (1999) и Schafer et al., J. Org. Chem. 65:24 (2000).A number of specific examples of modified sugars that can be used to carry out the present invention are discussed below. In representative embodiments of the invention, the sialyl acid derivative is used as the sugar core to which a modifying group is attached. The discussion of sialic acid derivatives is for illustration only and should not be construed as limiting the scope of the invention. Those skilled in the art will recognize that various other sugar groups can be activated and derivatized by methods analogous to the methods using sialic acid described as an example. So, for example, there are many methods suitable for modifying galactose, glucose, N-acetylgalactosamine and fucose, not to mention other sugar substrates, and such a modification can be easily carried out by known methods. See, for example, Elhalabi et al., Curr. Med. Chem. 6:93 (1999) and Schafer et al., J. Org. Chem. 65:24 (2000).

В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF, модифицированный способом согласно изобретению, представляет собой гликопептид, который продуцируется в клетках млекопитающих (например, в клетках СНО) или в трансгенном животном, а поэтому он содержит цепи N- и/или О-связанного олигосахарида, являющиеся неполностью сиалилированными. Олигосахаридные цепи гликопетида, не содержащие сиаловой кислоты, но содержащие концевой галактозный остаток, могут быть ПЭГилированы, ППГилированы или как-либо иначе модифицированы модифицированной сиаловой кислотой.In a representative embodiment of the invention, the G-CSF peptide modified by the method of the invention is a glycopeptide that is produced in mammalian cells (e.g. CHO cells) or in a transgenic animal, and therefore contains chains of an N- and / or O-linked oligosaccharide, being incompletely sialylated. Oligosaccharide glycopetide chains that do not contain sialic acid but contain a terminal galactose residue can be PEGylated, PPGylated or otherwise modified with modified sialic acid.

Как показано на схеме 4, аминогликозид 1 обрабатывают активным сложным эфиром защищенного производного аминокислоты (например, глицина), в результате чего аминовый остаток сахара превращается в соответствующий защищенный амидный продукт присоединения аминокислоты. Этот продукт присоединения обрабатывают альдолазой и получают α-гидроксикарбоксилат 2. Соединение 2 превращают в соответствующее производное ЦМФ под действием ЦМФ-СК-синтетазы с последующим каталитическим гидрированием производного ЦМФ и с получением соединения 3. Амин, введенный в результате образования продукта присоединения глицина, используют в качестве сайта присоединения ПЭГ посредством взаимодействия соединения 3 с активированным производным ПЭГ или ППГ (например, ПЭГ-С(О)NНS, ПЭГ-ОС(О)О-п-нитрофенилом), в результате чего получают такие соединения, как 4 или 5, соответственно.As shown in Scheme 4, aminoglycoside 1 is treated with an active ester of a protected amino acid derivative (e.g. glycine), whereby the amine sugar residue is converted to the corresponding protected amide amino acid addition product. This addition product is treated with aldolase and α-hydroxycarboxylate 2 is obtained. Compound 2 is converted to the corresponding CMF derivative by the action of CMP-SK synthetase, followed by catalytic hydrogenation of the CMF derivative and to obtain compound 3. The amine introduced as a result of the formation of the glycine addition product is used in as the PEG attachment site by reacting compound 3 with an activated PEG or PPG derivative (e.g., PEG-C (O) NHS, PEG-OS (O) O-p-nitrophenyl), whereby compounds such as 4 or 5, respectively.

В таблице 3 представлены репрезентативные примеры монофосфатов сахаров, дериватизированных молекулой ПЭГ. Некоторые из этих соединений таблицы 3 получают методом, проиллюстрированным на схеме 4. Другие производные получают хорошо известными методами. См., например, Keppler et al., Glycobiology 11:11R (2001) и Charter et al., Glycobiology 10:1049 (2000). Другие реагирующие с амином аналоги ПЭГ и ППГ являются коммерчески доступными, либо они могут быть получены методами, легко осуществляемыми специалистами в данной области.Table 3 presents representative examples of sugar monophosphates derivatized with a PEG molecule. Some of these compounds of Table 3 are prepared by the method illustrated in Scheme 4. Other derivatives are prepared by well-known methods. See, for example, Keppler et al., Glycobiology 11: 11R (2001) and Charter et al., Glycobiology 10: 1049 (2000). Other amine-reactive analogs of PEG and PPG are commercially available, or they can be prepared by methods easily carried out by those skilled in the art.

Модифицированные фосфаты сахаров, используемые для осуществления настоящего изобретения, могут быть замещены в других положениях, а также в положениях, указанных выше. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными замещениями сиаловой кислоты являются замещения, проиллюстрированные в нижеследующей формуле:The modified sugar phosphates used to carry out the present invention may be substituted in other positions, as well as in the positions indicated above. In accordance with the present invention, preferred substitutions for sialic acid are those substituted in the following formula:

где Х представляет собой линкерную группу, предпочтительно, выбранную из -О-, -N(Н)-, -S, СН₂- и N(R)₂, где каждый из R представляет собой член, независимо выбранный из R¹-R⁵. Каждый из символов Y, Z, А и В означает группу, выбранную из групп, указанных выше для Х. Каждый из Х, Y, Z, А и В является независимо выбранным, а поэтому эти группы могут быть одинаковыми или различными. Символы R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ означают Н, фрагмент ПЭГ, терапевтический фрагмент, биомолекулу или другой фрагмент. Альтернативно, эти символы означают линкер, связанный с фрагментом ПЭГ, терапевтическим фрагментом, биомолекулой или другим фрагментом.where X represents a linker group, preferably selected from —O—, —N (H) -, —S, CH ₂ - and N (R) ₂ , where each of R is a member independently selected from R ¹ —R ⁵ . Each of the characters Y, Z, A, and B means a group selected from the groups indicated above for X. Each of X, Y, Z, A, and B is independently selected, and therefore these groups may be the same or different. The symbols R ¹ , R ² , R ³ , R ^4, and R ⁵ mean H, a PEG fragment, a therapeutic fragment, a biomolecule, or another fragment. Alternatively, these symbols mean a linker linked to a PEG fragment, therapeutic fragment, biomolecule or other fragment.

Репрезентативными фрагментами, связанными с описанными здесь конъюгатами, являются, но не ограничиваются ими, производные ПЭГ (например, ацил-ПЭГ, ацил-алкил-ПЭГ, алкил-ацил-ПЭГ, карбамоил-ПЭГ, арил-ПЭГ), производные ППГ (например, ацил-ППГ, ацил-алкил-ППГ, алкил-ацил-ППГ, карбамоил-ППГ, арил-ППГ), терапевтические фрагменты, диагностические фрагменты, маннозо-6-фосфат, гепарин, гепаран, SLе_х, манноза, маннозо-6-фосфат, сиалил-Lewis-Х, FGF, VFGF, белки, хондротин, кератан, дерматан, альбумин, интегрины, антенные олигосахариды, пептиды и т.п. Методы конъюгирования различных модифицирующих групп с сахаридной группой легко доступны для специалистов в данной области (Poly(Ethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; Poly(Ethylene Glycol) Chemical and Biological Applications, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series № 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 & Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol.469, American Chemical Society, Washington, DC. 1991).Representative fragments associated with the conjugates described herein include, but are not limited to, PEG derivatives (e.g., acyl-PEG, acyl-alkyl-PEG, alkyl-acyl-PEG, carbamoyl-PEG, aryl-PEG), derivatives of PPG (e.g. , acyl-BCP, acyl-alkyl-BCP, alkyl-acyl-BCP, carbamoyl-BCP, aryl-BCP), therapeutic fragments, diagnostic fragments, mannose-6-phosphate, heparin, heparan, SL _x , mannose, mannose-6 -phosphate, sialyl-Lewis-X, FGF, VFGF, proteins, chondrotin, keratan, dermatan, albumin, integrins, antenna oligosaccharides, peptides, etc. Methods for conjugating various modifying groups with a saccharide group are readily available to those skilled in the art (Poly (Ethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; Poly (Ethylene Glycol) Chemical and Biological Applications, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 & Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, DC. 1991).

Линкерные группы (перекрестносшивающие группы)Linker groups (cross-linking groups)

Получение модифицированного сахара, используемого в способах согласно изобретению, включает присоединение фрагмента ПЭГ к сахарному остатку, а предпочтительно, образование стабильного продукта присоединения, который является субстратом для гликозилтрансферазы. Так, например, для получения конъюгата ПЭГ и сахара часто предпочтительно использовать линкер, например линкер, образующийся в результате реакции ПЭГ и сахарной группы с перекрестносшивающим агентом. Репрезентативными бифункциональными соединениями, которые могут быть использованы для присоединения модифицирующих групп к углеводным фрагментам, являются, но не ограничиваются ими, бифункциональные полиэтиленгликоли, полиамиды, простые полиэфиры, сложные полиэфиры и т.п. Общие методы присоединения углеводов к другим молекулам известны из литературы. См., например, Lee et al., Biochemistry 28:1856 (1989); Bhatia et al., Anal. Biochem. 178:408 (1989); Janda et al., J. Am. Chem. Soc. 112:8886 (1990) и Bednarski et al., WO 92/18135. Ниже обсуждаются реакционноспособные группы, обработанные так, чтобы это благоприятно влияло на рост сахарной цепи модифицированного сахара. Это обсуждение приводится лишь в целях иллюстрации. Специалистам в данной области понятно, что обсуждение, касающееся реакционноспособных групп, также относится и к модифицирующим группам.Obtaining a modified sugar used in the methods according to the invention includes the addition of a PEG fragment to a sugar residue, and preferably the formation of a stable addition product, which is a substrate for glycosyl transferase. So, for example, to obtain a PEG conjugate and sugar it is often preferable to use a linker, for example a linker resulting from the reaction of PEG and a sugar group with a cross-linking agent. Representative bifunctional compounds that can be used to attach modifying groups to carbohydrate moieties include, but are not limited to, bifunctional polyethylene glycols, polyamides, polyethers, polyesters, and the like. General methods for attaching carbohydrates to other molecules are known in the literature. See, for example, Lee et al., Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia et al., Anal. Biochem. 178: 408 (1989); Janda et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 8886 (1990) and Bednarski et al., WO 92/18135. The following discusses reactive groups, processed so that it favorably affects the growth of the sugar chain of modified sugar. This discussion is for illustrative purposes only. Those skilled in the art will understand that the discussion regarding reactive groups also applies to modifying groups.

Для модификации компонентов модифицированного сахара с внутримолекулярными химическими поперечными связями используются различные реагенты (описание перекрестносшивающих реагентов и процедур сшивания можно найти в работах Wold F., Meth Enzymol. 25:623-651, 1972; Weetall H.H., & Cooney D.A., In: Enzymes as Drugs (Holcenberg & Roberts, eds), p.395-442, Wiley, New York, 1981; Ji T.H., Meth. Enzymol. 91:580-609, 1983; Mattson et al., Mol. Biol. Rep. 17:167-183, 1993, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Предпочтительные перекрестносшивающие реагенты происходят от различных реагентов нулевого порядка, гомобифункциональных и гетеробифункциональных перекрестносшивающих реагентов. Перекрестносшивающими реагентами нулевого порядка являются реагенты для прямого конъюгированния двух внутренних химических групп без введения внешних реагентов. К этой категории относятся агенты, катализирующие образование дисульфидной связи. Другими примерами являются реагенты, индуцирующие реакцию конденсации карбоксильной и первичной аминогруппы с образованием амидной связи, и такими реагентами являются карбодиимиды, этилхлорформиат, реагент Вудварда К (2-этил-5-фенилизоксазолий-3'-сульфонат) и карбонилдиимидазол. Помимо этих химических реагентов в качестве перекрестносшивающего реагента нулевого порядка может быть использован фермент трансглутаминаза (глутамил-пептид-γ-глутамилтрансфераза; ЕС 2.3.2.13). Этот фермент катализирует реакции переноса ацила на карбоксамидные группы связанных с белком глутаминильных остатков, обычно, с использованием первичной аминогруппы в качестве субстрата. Предпочтительные гомо- и гетеробифункциональные реагенты содержат два идентичных или два отличающихся сайта соответственно, которые могут реагировать с аминогруппой, с сульфгидрильной группой, с гуанидиногруппой, с индоловой группой или с неспецифической группой.Various reagents are used to modify the components of the modified sugar with intramolecular chemical cross-links (a description of cross-linking reagents and crosslinking procedures can be found in Wold F., Meth Enzymol. 25: 623-651, 1972; Weetall HH, & Cooney DA, In: Enzymes as Drugs (Holcenberg & Roberts, eds), p. 395-442, Wiley, New York, 1981; Ji TH, Meth. Enzymol. 91: 580-609, 1983; Mattson et al., Mol. Biol. Rep. 17: 167-183, 1993, which are incorporated into this description by reference). Preferred cross-linking reagents come from a variety of zero order reagents, homobifunctional and heterobifunctional cross-linking reagents. Zero-order crosslinking reagents are reagents for direct conjugation of two internal chemical groups without the introduction of external reagents. This category includes agents that catalyze the formation of a disulfide bond. Other examples are reagents inducing a condensation reaction of a carboxyl and primary amino group to form an amide bond, and such reagents are carbodiimides, ethyl chloroformate, Woodward K reagent (2-ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonate) and carbonyldiimidazole. In addition to these chemicals, the transglutaminase enzyme (glutamyl peptide-γ-glutamyl transferase; EC 2.3.2.13) can be used as a cross-linking reagent of zero order. This enzyme catalyzes the reaction of acyl transfer to the carboxamide groups of protein-bound glutaminyl residues, usually using a primary amino group as a substrate. Preferred homo- and heterobifunctional reagents contain two identical or two different sites, respectively, which can react with an amino group, with a sulfhydryl group, with a guanidino group, with an indole group or with a non-specific group.

Очистка конъюгатов G-CSFG-CSF conjugate purification

Рефолдинг нерастворимого G-CSFRefolding Insoluble G-CSF

Многие рекомбинантные белки, экспрессируемые в бактериях, экспрессируются в виде нерастворимых агрегатов в бактериальных тельцах включения. Тельца включения представляют собой отложения белка, обнаруживаемые в цитоплазматическом и в периплазматическом пространстве бактериальной клетки (см., например, Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). Рекомбинантные белки G-CSF экспрессируются в бактериальных тельцах включения, и в настоящей заявке описаны способы осуществления рефолдинга этих белков в целях продуцирования активных белков G-CSF.Many recombinant proteins expressed in bacteria are expressed as insoluble aggregates in bacterial inclusion bodies. Inclusion bodies are deposits of protein found in the cytoplasmic and periplasmic space of a bacterial cell (see, for example, Clark, Cur. Op. Biotech. 12: 202-207 (2001)). Recombinant G-CSF proteins are expressed in bacterial inclusion bodies, and methods for refolding these proteins to produce active G-CSF proteins are described herein.

А. Условия для рефолдинга активного G-CSFA. Conditions for refolding active G-CSF

Для продуцирования активных белков G-CSF из бактериальных клеток белки G-CSF подвергают экспрессии в бактериальных тельцах включения, после чего бактерии собирают, подвергают дизрупции, а тельца включения выделяют и промывают. В одном из вариантов изобретения осуществляют три промывки: первую промывку проводят в буфере при рН 6,0-9,0, содержащем одновалентную соль, например хлорид натрия, неионогенный детергент, например тритон Х-100, ионогенный детергент, например дезоксихолат натрия, и EDTA; вторую промывку проводят в буфере, не содержащем детергента; а третью промывку проводят в H₂O. Затем белки в тельцах включения солюбилизируют. Солюбилизация может быть проведена с использованием денатурирующих агентов, хлорида гуанидиния или мочевины, при крайних значениях рН; либо детергентов или любых их комбинаций. В одном из вариантов изобретения для солюбилизации G-CSF используют 5-6М гуанидин-HCl или мочевину. В другом варианте изобретения добавляют ДТТ.To produce active G-CSF proteins from bacterial cells, G-CSF proteins are expressed in bacterial inclusion bodies, after which the bacteria are harvested, disrupted, and the inclusion bodies are isolated and washed. In one embodiment of the invention, three washes are carried out: the first washer is carried out in a buffer at pH 6.0-9.0 containing a monovalent salt, for example sodium chloride, a nonionic detergent, for example Triton X-100, an ionic detergent, for example sodium deoxycholate, and EDTA ; the second washing is carried out in a buffer containing no detergent; and the third wash is carried out in H ₂ O. Then, the proteins in the inclusion bodies are solubilized. Solubilization can be carried out using denaturing agents, guanidinium chloride or urea, at extreme pH values; or detergents or any combination thereof. In one embodiment of the invention, 5-6M guanidine-HCl or urea is used to solubilize G-CSF. In another embodiment of the invention, DTT is added.

После солюбилизации денатурирующие агенты удаляют из смеси белка G-CSF. Удаление денатурирующего агента может быть проведено различными методами, включая разведение в буфере для рефолдинга или методами буферного обмена. Методы буферного обмена включают диализ, диафильтрацию, гель-фильтрацию и иммобилизацию белка на твердом носителе (см., например, Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). Для удаления денатурирующих агентов может быть применена комбинация любого из вышеописанных методов.After solubilization, the denaturing agents are removed from the G-CSF protein mixture. The denaturing agent can be removed by various methods, including dilution in refolding buffer or buffer exchange methods. Buffer exchange methods include dialysis, diafiltration, gel filtration, and protein immobilization on a solid support (see, for example, Clark, Cur. Op. Biotech. 12: 202-207 (2001)). A combination of any of the methods described above may be used to remove denaturing agents.

Образование дисульфидной связи в белках G-CSF стимулируют добавлением буфера для рефолдинга, содержащего окислительно-восстановительную пару. Окислительно-восстановительными парами являются восстановленный и окисленный глутатион ((-JSF-I/GSSG), цистеин/цистин, цистеамин/цистамин, DTT/GSSG и DTE/GSSG (см., например, Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). В одном из вариантов изобретения окислительно-восстановительной парой является GSH/GSSG в отношении 10:1.The formation of a disulfide bond in G-CSF proteins is stimulated by the addition of a redox buffer containing redox pair. Redox pairs are reduced and oxidized glutathione ((-JSF-I / GSSG), cysteine / cystine, cysteamine / cystamine, DTT / GSSG and DTE / GSSG (see, for example, Clark, Cur. Op. Biotech. 12: 202-207 (2001)). In one embodiment of the invention, the redox pair is GSH / GSSG in a ratio of 10: 1.

Рефолдинг может быть осуществлен в буфере с рН в пределах, например, от 6,0 до 10,0. Буферы для рефолдинга могут включать и другие добавки для усиления рефолдинга, например L-аргинин (0,4-1М); ПЭГ; денатурирующие агенты в низких концентрациях, такие как мочевина (1-2М) и хлорид гуанидиния (0,5-1,5 М), и детергенты (например, Chaps, ДСН, СТАВ, лаурилмальтозид, Твин-80 и тритон Х-100).Refolding can be carried out in a buffer with a pH in the range of, for example, from 6.0 to 10.0. Refolding buffers may include other additives to enhance refolding, for example L-arginine (0.4-1M); PEG; denaturing agents in low concentrations, such as urea (1-2M) and guanidinium chloride (0.5-1.5 M), and detergents (e.g. Chaps, SDS, CTAB, laurylmaltoside, Tween-80 and Triton X-100) .

После рефолдинга белок G-CSF может быть диализован для удаления окислительно-восстановительной пары или других нежелательных буферных компонентов. В одном из вариантов изобретения диализ проводят с использованием буфера, включающего ацетат натрия, глицерин и неионогенный детергент, например твин-80. После диализа белок G-CSF может быть дополнительно очищен и/или подвергнут концентрированию с помощью ионообменной хроматографии. В одном из вариантов изобретения используют катионообменную смолу SР-сефарозу.After refolding, the G-CSF protein can be dialyzed to remove the redox pair or other undesirable buffer components. In one embodiment of the invention, dialysis is carried out using a buffer comprising sodium acetate, glycerin and a nonionic detergent, for example tween-80. After dialysis, the G-CSF protein can be further purified and / or concentrated by ion exchange chromatography. In one embodiment of the invention, a cation exchange resin SP-Sepharose is used.

Специалистам в данной области известно, что “правильный” рефолдинг белка происходит в том случае, если такой подвергаемый рефолдингу белок обладает детектируемой биологической активностью. Биологическая активность белка G-CSF может быть измерена различными методами. Так, например, биологически активные белки G-CSF являются субстратами для О-связанного гликозилирования, описанного в заявке на патент США 60/535284, поданной 8 января 2004; заявке 60/544411, поданной 12 февраля 2004, и в заявке, имеющей регистрационный номер, присвоенный патентным поверенным, 019957-018820US и поданной 20 февраля 2004, каждая из которых во всей своей полноте и для всех целей осуществления изобретения вводится в настоящее описание посредством ссылки. Активность белка G-CSF может быть измерена с помощью анализов на пролиферацию клеток или анализов лейкоцитарной формулы для крыс (такие анализы также описаны в заявке на патент США 60/535284, поданной 8 января 2004; в заявке 60/544411, поданной 12 февраля 2004, и в заявке, имеющей регистрационный номер, присвоенный патентным поверенным, 019957-018820US, поданной 20 февраля 2004, каждая из которых во всей своей полноте и для всех целей осуществления изобретения вводится в настоящее описание посредством ссылки. Анализы на пролиферацию и анализы лейкоцитарной формулы могут быть проведены до или после О-связанного гликозилирования подвергнутых рефолдингу белков G-CSF.Specialists in this field know that the “correct” protein refolding occurs if such a protein subjected to refolding has a detectable biological activity. The biological activity of the G-CSF protein can be measured by various methods. So, for example, biologically active G-CSF proteins are substrates for O-linked glycosylation described in US patent application 60/535284, filed January 8, 2004; application 60/544411, filed February 12, 2004, and in the application having a registration number assigned by a patent attorney 019957-018820US and filed February 20, 2004, each of which in its entirety and for all purposes of the invention is incorporated into this description by reference . The activity of the G-CSF protein can be measured using cell proliferation assays or rat leukocyte assays (such assays are also described in U.S. Patent Application 60/535284, filed January 8, 2004; in application 60/544411, filed February 12, 2004, and in the application having the registration number assigned by the patent attorney, 019957-018820US, filed February 20, 2004, each of which in its entirety and for all purposes of the invention is incorporated into the present description by reference. Leukocyte proliferation assays and assays Gut be performed before or after O-linked glycosylation of proteins refolded G-CSF.

Другие способы выделения конъюгатов согласно изобретениюOther methods for isolating conjugates according to the invention

Альтернативно, продукты, полученные вышеуказанными способами, могут быть использованы без очистки. Однако обычно предпочтительно, чтобы данный продукт был выделен. Для этого могут быть применены стандартные хорошо известные методы выделения гликозилированных сахаридов, такие как тонкослойная и толстослойная хроматография, колоночная хроматография, ионообменная хроматография или мембранная фильтрация. При этом, для выделения, предпочтительно, проводить мембранную фильтрацию, а более предпочтительно использовать обратную осмотическую мембрану или один или несколько методов колоночной хроматографии, как обсуждалось ранее и в цитируемой здесь литературе. Так, например, для удаления белков, таких как гликозилтрансферазы, может быть использована мембранная фильтрация, где мембраны имеют молекулярную массу с отсечкой примерно от 3000 до 10000. Затем для удаления солей и/или для очистки сахаридных продуктов могут быть использованы нанофильтрация или обратный осмос (см., например, WO98/15581). Нанофильтровальные мембраны представляют собой класс обратноосмотических мембран, которые пропускают одновалентные соли, но удерживают поливалентные соли и незаряженные растворенные вещества, имеющие молекулярную массу более чем примерно 100-2000 Дальтон, в зависимости от используемой мембраны. Таким образом, в типичных применениях, сахариды, полученные способами согласно изобретению, будут удерживаться в мембране, а контаминирующие соли будут проходить через мембрану.Alternatively, the products obtained by the above methods can be used without purification. However, it is usually preferred that the product be isolated. To do this, standard well-known methods for the isolation of glycosylated saccharides, such as thin layer and thick layer chromatography, column chromatography, ion exchange chromatography or membrane filtration, can be applied. Moreover, it is preferable to carry out membrane filtration for isolation, and it is more preferable to use a reverse osmotic membrane or one or more column chromatography methods, as discussed earlier and in the literature cited here. So, for example, to remove proteins, such as glycosyltransferases, membrane filtration can be used, where the membranes have a molecular weight with a cutoff of about 3,000 to 10,000. Then nanofiltration or reverse osmosis can be used to remove salts and / or to purify saccharide products ( see, for example, WO98 / 15581). Nanofiltration membranes are a class of reverse osmosis membranes that pass monovalent salts but retain polyvalent salts and uncharged solutes having a molecular weight of more than about 100-2000 Daltons, depending on the membrane used. Thus, in typical applications, saccharides obtained by the methods of the invention will be retained in the membrane and contaminating salts will pass through the membrane.

Если модифицированный гликопротеин продуцируется внутри клетки, как в первой стадии, то дебрис крупных частиц, либо клеток-хозяев, либо лизированных фрагментов, удаляют, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации, и этот белок, но необязательно, может быть концентрирован с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрации белков с последующим отделением полипептидных вариантов от других примесей в одной или нескольких стадиях, выбранных из стадий проведения иммуноаффинной хроматографии, фракционирования на ионообменной колонке (например, на диэтиламиноэтиле (DEAE) или на матрицах, содержащих карбоксиметильные или сульфопропильные группы), хроматографии на Blue-сефарозе, СМ-Blue-сефарозе, хроматографии на MONO-Q, MONO-S, хроматографии на лектине чечевицы-сефарозе, хроматографии на WGA-сефарозе, хроматографии на Con A-сефарозе, хроматографии на эфире-Toyopearl, на бутил-Toyopearl, фенил-Toyopearl или на белок А-сефарозе, хроматографии в ДСН-ПААГ, хроматографии на двуокиси кремния, хроматофокусирования, обращенно-фазовой ВЭЖХ (например, на силикагеле, к которому присоединены алифатические группы), гель-фильтрации, например на Сефадексе и молекулярных ситах, или эксклюзионной хроматографии, хроматографии на колонках, селективно связанных с полипептидом, и преципитации этанолом или сульфатом аммония.If the modified glycoprotein is produced inside the cell, as in the first stage, then the debris of large particles, either host cells or lysed fragments, is removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration, and this protein, but not necessarily, can be concentrated using a commercially available filter for protein concentration, followed by separation of the polypeptide variants from other impurities in one or more stages selected from the stages of immunoaffinity chromatography, fractionation on on-exchange column (for example, on diethylaminoethyl (DEAE) or on matrices containing carboxymethyl or sulfopropyl groups), chromatography on Blue-Sepharose, CM-Blue-Sepharose, chromatography on MONO-Q, MONO-S, chromatography on lentil-sepharose lectin, chromatography on WGA-sepharose, chromatography on Con A-sepharose, chromatography on Toyopearl ether, butyl Toyopearl, phenyl Toyopearl or protein A-Sepharose, chromatography on SDS-PAGE, chromatography on silica, chromatography, reverse phase HPLC (e.g., silica gel attached to aliphatic groups), gel filtration, for example on Sephadex and molecular sieves, or size exclusion chromatography, column chromatography selectively coupled to a polypeptide, and precipitation with ethanol or ammonium sulfate.

Модифицированные гликопептиды, продуцированные в культуре, обычно сначала выделяют путем экстракции из клеток, ферментов и т.п., а затем проводят одну или несколько стадий концентрирования, высаливания, водной ионообменной хроматографии или эксклюзионной хроматографии. Кроме того, модифицированный гликопротеин может быть очищен аффинной хроматографией. И, наконец, для проведения конечных стадий очистки может быть применена ВЭЖХ.Modified glycopeptides produced in culture are usually first isolated by extraction from cells, enzymes and the like, and then one or more stages of concentration, salting out, aqueous ion exchange chromatography or size exclusion chromatography are performed. In addition, the modified glycoprotein can be purified by affinity chromatography. Finally, HPLC can be used to carry out the final purification steps.

В любые из предыдущих стадий может быть включен ингибитор протеазы, например метилсульфонилфторид (PMSF) для ингибирования протеолиза, а для предотвращения попадания случайных примесей могут быть включены антибиотики.A protease inhibitor, for example methylsulfonyl fluoride (PMSF) may be included in any of the previous steps to inhibit proteolysis, and antibiotics may be included to prevent the ingress of accidental impurities.

В другом варианте изобретения супернатанты из систем, которые продуцируют модифицированный гликопептид согласно изобретению, сначала концентрируют с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрации белков, например устройства для ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. После проведения стадии концентрирования концентрат может быть нанесен на подходящую матрицу для очистки. Так, например, подходящая аффинная матрица может содержать лиганд для пептида, лектин или молекулу антитела, связанные с подходящим носителем. Альтернативно, может быть использована анионообменная смола, например матрица или субстрат, имеющие боковые группы DЕАЕ. Подходящими матрицами являются акриламид, агароза, декстран, целлюлоза и вещества других типов, обычно применяемые для очистки белка. Альтернативно, может быть проведена стадия катионообменной хроматографии. Подходящими катионообменниками являются различные нерастворимые матрицы, содержащие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. Особенно предпочтительными являются сульфопропильные группы.In another embodiment, supernatants from systems that produce the modified glycopeptide of the invention are first concentrated using a commercially available protein concentration filter, such as an Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration device. After the concentration step, the concentrate can be applied to a suitable matrix for purification. Thus, for example, a suitable affinity matrix may comprise a ligand for the peptide, a lectin, or an antibody molecule bound to a suitable carrier. Alternatively, an anion exchange resin, for example a matrix or substrate, having DEAE side groups can be used. Suitable matrices are acrylamide, agarose, dextran, cellulose and other types of substances commonly used for protein purification. Alternatively, a cation exchange chromatography step may be performed. Suitable cation exchangers are various insoluble matrices containing sulfopropyl or carboxymethyl groups. Particularly preferred are sulfopropyl groups.

И, наконец, для дополнительной очистки композиции полипептидного варианта могут быть проведены одна или несколько ОФ-ВЭЖХ-стадий, в которых используются гидрофобные ОФ-ВЭЖХ-среды, например силикагель, имеющий боковые метильные или другие алифатические группы. Для получения гомогенного модифицированного гликопротеина могут быть также проведены некоторые или все вышеупомянутые стадии очистки в различных комбинациях.Finally, for further purification of the composition of the polypeptide variant, one or more RP-HPLC steps can be carried out using hydrophobic RP-HPLC media, for example, silica gel having methyl lateral or other aliphatic groups. To obtain a homogeneous modified glycoprotein, some or all of the aforementioned purification steps can also be carried out in various combinations.

Модифицированный гликопептид согласно изобретению, полученный в результате проведения крупномасштабной ферментации, может быть очищен методами, аналогичными методам, описанным Urdal et al., J. Chromatog. 296:171 (1984). В этой работе описаны две последовательные ОФ-ВЭЖХ-стадии очистки рекомбинантного человеческого IL-2 на препаративной ВЭЖХ-колонке. Альтернативно, для очистки модифицированного гликопротеина могут быть применены такие методы, как аффинная хроматография.The modified glycopeptide according to the invention obtained by large-scale fermentation can be purified by methods similar to those described by Urdal et al., J. Chromatog. 296: 171 (1984). This work describes two sequential RP-HPLC purification steps of recombinant human IL-2 on a preparative HPLC column. Alternatively, methods such as affinity chromatography can be used to purify the modified glycoprotein.

Фармацевтические композицииPharmaceutical Compositions

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции. Эта фармацевтическая композиция включает фармацевтически приемлемый разбавитель и ковалентный конъюгат, содержащий неприродную молекулу ПЭГ, терапевтическую молекулу или биомолекулу и гликозилированный или негликозилированный пептид. Указанный полимер, терапевтическую молекулу или биомолекулу конъюгируют с пептидом G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы, расположенной между ними и ковалентно связанной с пептидом G-CSF и полимером, терапевтической молекулой или биомолекулой.In another aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition. This pharmaceutical composition includes a pharmaceutically acceptable diluent and a covalent conjugate containing a non-natural PEG molecule, a therapeutic molecule or biomolecule, and a glycosylated or non-glycosylated peptide. The specified polymer, therapeutic molecule or biomolecule is conjugated to the G-CSF peptide through an intact glycosyl linker group located between them and covalently linked to the G-CSF peptide and the polymer, therapeutic molecule or biomolecule.

Фармацевтические композиции согласно изобретению являются подходящими для их использования в различных системах доставки лекарственных средств. Композиции, подходящие для использования в настоящем изобретении, можно найти в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, Maсе Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed (1985). Краткий обзор методов доставки лекарственных средств можно найти у Langer, Science 249:1527-1533 (1990).The pharmaceutical compositions of the invention are suitable for use in various drug delivery systems. Compositions suitable for use in the present invention can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences , Mac Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed (1985). A brief overview of drug delivery methods can be found in Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).

Фармацевтические композиции могут быть приготовлены для любого подходящего способа введения, включая, например, местное, пероральное, интраназальное, внутривенное, внутричерепное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Носитель для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, предпочтительно, содержит воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения может быть использован любой из вышеуказанных носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрийсодержащий сахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. В качестве носителей для фармацевтических композиций согласно изобретению могут быть также использованы биологически разлагаемые микросферы (например, полилактат-полигликолят). Подходящие биологически разлагаемые микросферы описаны, например, в патентах США № 4897268 и 5075109.Pharmaceutical compositions can be prepared for any suitable route of administration, including, for example, topical, oral, intranasal, intravenous, intracranial, intraperitoneal, subcutaneous or intramuscular administration. A carrier for parenteral administration, such as subcutaneous injection, preferably contains water, saline, alcohol, fat, wax or a buffer. For oral administration, any of the above carriers or a solid carrier, such as mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talc, cellulose, glucose, sucrose and magnesium carbonate can be used. Biodegradable microspheres (e.g., polylactate-polyglycolate) can also be used as carriers for the pharmaceutical compositions of the invention. Suitable biodegradable microspheres are described, for example, in US Pat. Nos. 4,897,268 and 5,075,109.

Обычно, фармацевтические композиции вводят парентерально, например внутривенно. Таким образом, настоящее изобретение относится к композициям для парентерального введения, содержащим соединение, растворенное или суспендированное в приемлемом носителе, предпочтительно, в водном носителе, например в воде, в забуференной воде, в физиологическом растворе, PBS и т.п. Такие композиции могут содержать фармацевтически приемлемые добавки, необходимые для коррекции физиологических условий, такие как рН-корректирующие агенты и забуферивающие агенты, а также агенты, придающие тоничность, смачивающие агенты, детергенты и т.п.Typically, pharmaceutical compositions are administered parenterally, for example intravenously. Thus, the present invention relates to compositions for parenteral administration containing a compound dissolved or suspended in an acceptable carrier, preferably in an aqueous carrier, for example in water, in buffered water, in physiological saline, PBS and the like. Such compositions may contain pharmaceutically acceptable additives necessary for the correction of physiological conditions, such as pH-correcting agents and buffering agents, as well as tonicity agents, wetting agents, detergents, and the like.

Эти композиции могут быть стерилизованы стандартными методами, либо они могут быть подвергнуты стерильной фильтрации. Полученные водные растворы могут быть упакованы для непосредственного использования в том виде, в каком они были получены, или лиофилизованы; причем лиофилизованный препарат, перед его введением, может быть разведен стерильным водным носителем. рН данного препарата обычно составляет от 3 до 11, более предпочтительно, от 5 до 9, а наиболее предпочтительно, от 7 до 8.These compositions may be sterilized by standard methods, or they may be subjected to sterile filtration. The resulting aqueous solutions can be packaged for direct use in the form in which they were obtained, or lyophilized; moreover, the lyophilized preparation, before its administration, can be diluted with a sterile aqueous carrier. The pH of this preparation is usually from 3 to 11, more preferably from 5 to 9, and most preferably from 7 to 8.

В некоторых вариантах изобретения гликопептиды согласно изобретению могут быть введены в липосомы, полученные из стандартных образующих везикулы липидов. Для получения липосом существует ряд методов, описанных, например, в работе Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), в патентах США № 4235871, 4501728 и 4837028. Доставка липосом с использованием различных нацеливающих агентов (например, сиалилгалактозидов согласно изобретению) хорошо известна специалистам (см., например, патенты США № 4957773 и 4604044).In some embodiments of the invention, the glycopeptides of the invention can be introduced into liposomes derived from standard lipid-forming vesicles. To obtain liposomes, there are a number of methods described, for example, in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), US Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728 and 4,837,028. Liposome delivery using various targeting agents (eg, sialylgalactosides according to the invention) is well known to those skilled in the art (see, for example, US Pat. Nos. 4,957,773 and 4,604,044).

Могут быть использованы стандартные методы присоединения нацеливающих агентов к липосомам. Эти методы обычно включают введение в липосомы липидных компонентов, таких как фосфатидилэтаноламин, которые могут быть активированы для присоединения нацеливающих агентов или дериватизированных липофильных соединений, таких как дериватизированные липидом гликопептиды согласно изобретению.Standard methods for attaching targeting agents to liposomes can be used. These methods typically include introducing lipid components into the liposomes, such as phosphatidylethanolamine, which can be activated to attach targeting agents or derivatized lipophilic compounds, such as the lipid derivatized glycopeptides of the invention.

Механизмы доставки обычно требуют, чтобы агенты для направленной доставки находились на поверхности липосомы в таком положении, в котором такие молекулы будут доступны для взаимодействия с мишенью, например с рецептором клеточной поверхности. Углеводы согласно изобретению могут быть присоединены к липидной молекуле перед образованием липосом методами, известными специалистам (например, путем алкилирования или ацилирования гидроксильной группы, присутствующей на углеводе, длинноцепочечным алкилгалогенидом или жирной кислотой соответственно). Альтернативно, липосома может быть получена таким образом, чтобы в мембрану, во время ее формирования, сначала была введена связывающая часть. Такая связывающая часть должна иметь липофильную часть, которая прочно погружена в мембрану и заякорена на ней. Эта связывающая часть должна иметь реакционноспособную часть, которая является химически доступной на водной поверхности липосомы. Эту реакционноспособную часть выбирают так, чтобы, по своей химической структуре, она могла образовывать стабильную химическую связь с нацеливающим агентом или с углеводом, добавляемыми позже. В некоторых случаях нацеливающий агент можно присоединять непосредственно к соединяющей молекуле, но в большинстве случаев более предпочтительно использовать третью молекулу, действующую как химический мостик, который позволяет присоединять связывающую молекулу, находящуюся на мембране, к нацеливающему агенту или к углеводу, который выступает за пределы поверхности везикулы в окружающее пространство.Delivery mechanisms usually require that the agents for targeted delivery are on the surface of the liposome in a position in which such molecules will be available for interaction with the target, for example with a cell surface receptor. The carbohydrates according to the invention can be attached to the lipid molecule before liposome formation by methods known in the art (for example, by alkylating or acylating a hydroxyl group present on a carbohydrate with a long chain alkyl halide or fatty acid, respectively). Alternatively, the liposome can be prepared in such a way that a binding moiety is first introduced into the membrane during its formation. Such a binding part should have a lipophilic part, which is firmly immersed in and anchored on the membrane. This binding part must have a reactive part, which is chemically available on the water surface of the liposome. This reactive moiety is selected so that, in its chemical structure, it can form a stable chemical bond with the targeting agent or with the carbohydrate added later. In some cases, the targeting agent can be attached directly to the connecting molecule, but in most cases it is more preferable to use a third molecule acting as a chemical bridge, which allows you to attach the binding molecule located on the membrane to the targeting agent or to a carbohydrate that extends beyond the surface of the vesicle into the surrounding space.

Соединения, полученные способами согласно изобретению, могут быть также использованы в качестве диагностических реагентов. Так, например, меченые соединения могут быть использованы для определения локализации областей воспаления или опухолевых метастазов у пациента с подозрением на воспаление. Для такого применения соединения могут быть помечены ¹²⁵I, ¹⁴С или тритием.Compounds prepared by the methods of the invention can also be used as diagnostic reagents. For example, labeled compounds can be used to determine the localization of areas of inflammation or tumor metastases in a patient with suspected inflammation. For such use, the compounds may be labeled ¹²⁵ I, ¹⁴ C, or tritium.

Активный ингредиент, используемый в фармацевтических композициях согласно изобретению, представляет собой гликопэгилированный G-CSF или его производные, обладающие биологическими свойствами фолликулостимулирующего гормона, стимулирующими, например, овуляцию. Композицию G-CSF согласно изобретению, предпочтительно, вводят парентерально (например, i.v., i.m., s.c. или i.p.). Очевидно, что эффективные дозы могут значительно варьироваться в зависимости от состояния, подвергаемого лечению, и от способа введения, однако предполагается, что эти дозы будут составлять в пределах примерно от 0,1 (~7 ед.) до 100 (~7000 ед.) мкг активного вещества/кг массы тела. Для лечения анемии предпочтительные дозы составляют примерно от 50 до 300 единиц/кг и вводятся три раза в неделю. Поскольку настоящее изобретение относится к G-CSF с увеличенным временем пребывания in vivo, то, при введении композиции согласно изобретению, указанные дозы могут быть, но необязательно, снижены.The active ingredient used in the pharmaceutical compositions according to the invention is glycopegylated G-CSF or its derivatives having biological properties of follicle-stimulating hormone, stimulating, for example, ovulation. The G-CSF composition of the invention is preferably administered parenterally (e.g., iv, im, sc or ip). Obviously, effective doses can vary significantly depending on the condition being treated and on the route of administration, however, it is assumed that these doses will be in the range of about 0.1 ( ~ 7 units) to 100 ( ~ 7000 units) μg of active substance / kg body weight. For the treatment of anemia, preferred doses are from about 50 to 300 units / kg and are administered three times a week. Since the present invention relates to G-CSF with increased in vivo residence time, when the composition of the invention is administered, these doses may, but not necessarily, be reduced.

Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации конъюгатов и способов их получения согласно изобретению, однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничение заявленного изобретения.The following examples are provided to illustrate the conjugates and methods for their preparation according to the invention, however, these examples should not be construed as limiting the claimed invention.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1Example 1

Гликопэгилирование G-CSF, продуцированного в клетках СНОGlycopegylation of G-CSF produced in CHO cells

а. Получение асиало-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF)but. Preparation of Asial Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)

G-CSF, продуцированный в клетках СНО, растворяли при плотности 2,5 мг/мл в 50 мМ трис-HCl, рН 7,4, 0,15 М NаСl, 5 мМ СаCl₂ и концентрировали до 500 мкл на фильтрующей центрифуге Centricon Plus 20. Полученный раствор инкубировали с 300 мЕд/мл нейраминидазы II (Vibrio choleraе) в течение 16 часов при 32°С. Для мониторинга данной реакции небольшую аликвоту реакционной смеси разводили соответствующим буфером и проводили изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в геле. Затем реакционную смесь добавляли к предварительно промытому конъюгату “N-(п-аминофенил)оксаминовая кислота-агароза” (800 мкл/мл объема реакционной смеси) и промытые сферы слегка перемешивали вращением в течение 24 часов при 4°С. Смесь центрифугировали при 10000 об/мин и супернатант собирали. Сферы 3 раза промывали буфером Трис-EDTA, один раз - 0,4 мл буфера Трис-EDTA и один раз 0,2 мл буфера Трис-EDTA и все супернатанты объединяли. Супернатант диализовали при 4°С против 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1М NаСl, 0,05% NаN₃, а затем еще два раза против 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1М NаСl, 0,05% NаN₃. После этого диализованный раствор концентрировали на фильтрующей центрифуге Centricon Plus 20 и хранили при -20°С. ИЭФ в геле проводили в условиях, соответствующих процедурам и реагентам от Invitrogen. Образцы нативного и десиалилированного G-CSF диализовали против воды и анализировали с помощью MALDI-TOF-МS.G-CSF produced in CHO cells was dissolved at a density of 2.5 mg / ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl ₂ and concentrated to 500 μl in a Centricon Plus filter centrifuge 20. The resulting solution was incubated with 300 mU / ml neuraminidase II ( Vibrio cholerae ) for 16 hours at 32 ° C. To monitor this reaction, a small aliquot of the reaction mixture was diluted with the appropriate buffer and isoelectric focusing (IEF) in the gel was performed. Then the reaction mixture was added to the pre-washed conjugate “N- (p-aminophenyl) oxamic acid agarose” (800 μl / ml volume of the reaction mixture) and the washed spheres were slightly stirred by rotation for 24 hours at 4 ° C. The mixture was centrifuged at 10,000 rpm and the supernatant was collected. The spheres were washed 3 times with Tris-EDTA buffer, once with 0.4 ml of Tris-EDTA buffer and once with 0.2 ml of Tris-EDTA buffer and all supernatants were combined. The supernatant was dialyzed at 4 ° C against 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1M NaCl, 0.05% NaN ₃ , and then two more times against 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1M NaCl, 0, 05% NaN ₃ . After that, the dialyzed solution was concentrated on a Centricon Plus 20 filter centrifuge and stored at -20 ° C. IEF in the gel was carried out under conditions consistent with the procedures and reagents from Invitrogen. Samples of native and desialylated G-CSF were dialyzed against water and analyzed using MALDI-TOF-MS.

b. Получение G-CSF-(альфа2,3)-сиалил-ПЭГb. Obtaining G-CSF- (alpha2,3) -sialyl-PEG

Десиалилированный G-CSF растворяли при плотности 2,5 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl, 0,15 М NаСl, 0,05% NаN₃, рН 7,2. Полученный раствор инкубировали с 1 мМ ЦМФ-сиаловая кислота-ПЭГ и 0,1 мЕд/мл SТ3Gal1 при 32°С в течение 2 дней. Для мониторинга включения сиаловой кислоты-ПЭГ к небольшой аликвоте реакционной смеси ЦМФ-СК-ПЭГ добавляли флуоресцентный лиганд и метку, включенную в пептид, отделяли от свободной метки с помощью гель-фильтрации на аналитической колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1). Включение флуоресцентной метки в пептид количественно оценивали с помощью подключенного флуоресцентного детектора. Через 2 дня реакционную смесь очищали на препаративной колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1) и фракции собирали исходя из УФ-поглощения. Продукт реакции анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и ИЭФ-анализ проводили с применением процедур и реагентов от Invitrogen. Образцы нативного и ПЭГилированного G-CSF диализовали против воды и анализировали с помощью MALDI-TOF-МS.Desialylated G-CSF was dissolved at a density of 2.5 mg / ml in 50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN ₃ , pH 7.2. The resulting solution was incubated with 1 mM CMP-sialic acid-PEG and 0.1 mU / ml ST3Gal1 at 32 ° C for 2 days. To monitor the incorporation of sialic acid-PEG, a fluorescent ligand was added to a small aliquot of the reaction mixture of CMP-SK-PEG and the tag included in the peptide was separated from the free tag by gel filtration on a Toso Haas G3000SW analytical column using PBS buffer (pH 7, one). The incorporation of the fluorescent label into the peptide was quantified using a connected fluorescent detector. After 2 days, the reaction mixture was purified on a Toso Haas G3000SW preparative column using PBS buffer (pH 7.1) and the fractions were collected based on UV absorption. The reaction product was analyzed by SDS-PAGE and IEF analysis was performed using procedures and reagents from Invitrogen. Samples of native and PEGylated G-CSF were dialyzed against water and analyzed using MALDI-TOF-MS.

с. Получение G-CSF-(альфа2,8)-сиалил-ПЭГfrom. Obtaining G-CSF- (alpha2,8) -sialyl-PEG

G-CSF, продуцированный в клетках СНО и содержащий альфа2,3-сиалилированный О-связанный гликан, растворяли при плотности 2,5 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl, 0,15 М NаСl, 0,05% NаN₃, рН 7,2. Полученный раствор инкубировали с 1 мМ конъюгата ЦМФ-сиаловая кислота-ПЭГ и 0,1 Ед/мл СSТ-II при 32°С в течение 2 дней. Для мониторинга включения сиаловой кислоты-ПЭГ к небольшой аликвоте реакционной смеси ЦМФ-СК-ПЭГ добавляли флуоресцентный лиганд и метку, включенную в пептид, отделяли от свободной метки с помощью гель-фильтрации на аналитической колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1). Включение флуоресцентной метки в пептид количественно оценивали с помощью подключенного флуоресцентного детектора. Через 2 дня реакционную смесь очищали на препаративной колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1) и фракции собирали исходя из УФ-поглощения. Продукт реакции анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и ИЭФ-анализ проводили с применением процедур и реагентов от Invitrogen. Образцы нативного и ПЭГилированного G-CSF диализовали против воды и анализировали с помощью MALDI-TOF-МS.G-CSF produced in CHO cells and containing alpha 2,3-sialylated O-linked glycan was dissolved at a density of 2.5 mg / ml in 50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN ₃ , pH 7.2. The resulting solution was incubated with 1 mm CMP-sialic acid-PEG conjugate and 0.1 U / ml CST-II at 32 ° C for 2 days. To monitor the incorporation of sialic acid-PEG, a fluorescent ligand was added to a small aliquot of the reaction mixture of CMP-SK-PEG and the tag included in the peptide was separated from the free tag by gel filtration on a Toso Haas G3000SW analytical column using PBS buffer (pH 7, one). The incorporation of the fluorescent label into the peptide was quantified using a connected fluorescent detector. After 2 days, the reaction mixture was purified on a Toso Haas G3000SW preparative column using PBS buffer (pH 7.1) and the fractions were collected based on UV absorption. The reaction product was analyzed by SDS-PAGE and IEF analysis was performed using procedures and reagents from Invitrogen. Samples of native and PEGylated G-CSF were dialyzed against water and analyzed using MALDI-TOF-MS.

d. Получение G-CSF-(альфа2,6)-сиалил-ПЭГd. Obtaining G-CSF- (alpha2,6) -sialyl-PEG

G-CSF, содержащий только О-связанный GalNAc, растворяли при плотности 2,5 мг/мл в 50 мМ трис-HCl, 0,15 М NаСl, 0,05% NаN₃, рН 7,2. Полученный раствор инкубировали с 1 мМ конъюгата ЦМФ-сиаловая кислота-ПЭГ и 0,1 Ед/мл SТ6GalNAc I или II при 32°С в течение 2 дней. Для мониторинга включения сиаловой кислоты-ПЭГ к небольшой аликвоте реакционной смеси ЦМФ-СК-ПЭГ добавляли флуоресцентный лиганд и метку, включенную в пептид, отделяли от свободной метки с помощью гель-фильтрации на аналитической колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1). Включение флуоресцентной метки в пептид количественно оценивали с помощью подключенного флуоресцентного детектора. Через 2 дня реакционную смесь очищали на препаративной колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1) и фракции собирали исходя из УФ-поглощения. Продукт реакции анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и ИЭФ-анализ проводили с применением процедур и реагентов от Invitrogen. Образцы нативного и ПЭГилированного G-CSF диализовали против воды и анализировали с помощью MALDI-TOF-МS.G-CSF containing only O-linked GalNAc was dissolved at a density of 2.5 mg / ml in 50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% NaN ₃ , pH 7.2. The resulting solution was incubated with 1 mm CMP-sialic acid-PEG conjugate and 0.1 U / ml ST6GalNAc I or II at 32 ° C for 2 days. To monitor the incorporation of sialic acid-PEG, a fluorescent ligand was added to a small aliquot of the reaction mixture of CMP-SK-PEG and the tag included in the peptide was separated from the free tag by gel filtration on a Toso Haas G3000SW analytical column using PBS buffer (pH 7, one). The incorporation of the fluorescent label into the peptide was quantified using a connected fluorescent detector. After 2 days, the reaction mixture was purified on a Toso Haas G3000SW preparative column using PBS buffer (pH 7.1) and the fractions were collected based on UV absorption. The reaction product was analyzed by SDS-PAGE and IEF analysis was performed using procedures and reagents from Invitrogen. Samples of native and PEGylated G-CSF were dialyzed against water and analyzed using MALDI-TOF-MS.

G-CSF, продуцированный в клетках СНО, обрабатывали сиалидазой бактерии рода Arthrobacter, после чего очищали эксклюзионной хроматографией на Superdex 75 и обрабатывали SТ3Gal1 или SТ3Gal2, а затем конъюгатом ЦМФ-СК-ПЭГ, 20 кДа. Полученную молекулу очищали ионообменной хроматографией и гель-фильтрацией, и анализ, проведенный с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, указывал на завершение ПЭГилирования. Это является первым свидетельством гликопэгилирования О-связанного гликана.G-CSF produced in CHO cells was treated with Arthrobacter sialidase bacteria, then purified by size exclusion chromatography on Superdex 75 and treated with ST3Gal1 or ST3Gal2 and then with 20 kDa CMF-SK-PEG conjugate. The resulting molecule was purified by ion exchange chromatography and gel filtration, and an analysis performed by SDS-PAGE electrophoresis indicated the completion of PEGylation. This is the first evidence of glycopegulation of O-linked glycan.

Пример 2Example 2

Экспрессия, рефолдинг и очистка рекомбинантного G-CSFExpression, refolding and purification of recombinant G-CSF

- Клетки собирают путем центрифугирования, и супернатант отбрасывают. Результаты культивирования на различных средах представлены на фиг.9.- Cells are harvested by centrifugation and the supernatant discarded. The results of cultivation in various environments are presented in Fig.9.

- Клеточный осадок ресуспендируют в 10 мл/г буфера для лизиса, содержащего 10 мМ Трис рН 7,4, 75 мМ NаСl, 5 мМ EDTA.- The cell pellet is resuspended in 10 ml / g lysis buffer containing 10 mM Tris pH 7.4, 75 mM NaCl, 5 mM EDTA.

- Клетки подвергают микрофлюидизации (с использованием также пресса Френча).- Cells are subjected to microfluidization (using also the French press).

- Клетки центрифугируют в течение 30 минут, при 4°С и при 5000 об/мин, и супернатант отбрасывают.- The cells are centrifuged for 30 minutes at 4 ° C and at 5000 rpm, and the supernatant is discarded.

- Осадок ресуспендируют в буфере для лизиса и центрифугируют, как описано выше.- The pellet was resuspended in lysis buffer and centrifuged as described above.

- IB промывают в 25 мМ Трис, рН 8, 100 мМ NаСl, 1% ТХ-100, 1% NаDОС, 5 мМ EDTA. Осадки ресуспендируют путем пипетитирования и встряхивания. Затем его центрифугируют 15 минут при 4°С и при 5000 об/мин. Эту стадию повторяют еще один раз (всего две промывки).- IB is washed in 25 mm Tris, pH 8, 100 mm NaCl, 1% TX-100, 1% NaDOS, 5 mm EDTA. Precipitation resuspended by pipetting and shaking. Then it is centrifuged for 15 minutes at 4 ° C and at 5000 rpm. This step is repeated one more time (only two washes).

- Осадки два раза промывают в 25 мМ трис, рН 8, 100 мМ NаСl, 5 мМ EDTA для удаления детергентов и центрифугируют, как описано выше.- Precipitation is washed twice with 25 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA to remove detergents and centrifuged as described above.

- Осадки ресуспендируют в dH₂O для разделения на аликвоты и центрифугируют, как описано выше. Осадки замораживают при -20°С.- Precipitation was resuspended in dH ₂ O to aliquot and centrifuged as described above. Precipitation is frozen at -20 ° C.

- IB ресуспендируют при 20 мг/мл в 6М гуанидин-HCl, 5 мМ EDTA, 100 мМ NаСl, 100 мМ Трис, рН 8, 10 мМ ДТТ, с использованием пипеттора с последующим перемешиванием в течение 2-4 часов при комнатной температуре.- IBs are resuspended at 20 mg / ml in 6M guanidine-HCl, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 100 mM Tris, pH 8, 10 mM DTT, using a pipettor, followed by stirring for 2-4 hours at room temperature.

- Солюбилизированный IB центрифугируют в течение 1 мин при комнатной температуре при 14000 об/мин. Супернатант сохраняют.- The solubilized IB is centrifuged for 1 min at room temperature at 14,000 rpm. Supernatant retained.

- Супернатант разводят 1:20 буфером для рефолдинга, содержащим 50 мМ MES, рН 6, 240 мМ NаСl, 10 мМ.- The supernatant was diluted 1:20 with a refolding buffer containing 50 mM MES, pH 6, 240 mM NaCl, 10 mM.

- Затем добавляют буфер, содержащий КСl, 0,3 мМ лаурилмальтозид, 0,055% ПЭГ3350, 1 мМ GSН, 0,1М GSSG, 0,5М аргинин, и проводят рефолдинг на ротационном шейкере в течение ночи при 4°С.- Then, a buffer containing KCl, 0.3 mM lauryl maltoside, 0.055% PEG3350, 1 mM GSH, 0.1 M GSSG, 0.5 M arginine is added and refolding is carried out on a rotary shaker overnight at 4 ° C.

- Смесь для рефолдинга переносят на змеевик Pierce с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 7 кДа для диализа. Диализ проводят в буфере, содержащем 20 мМ NаОАс, рН 4, 50 мМ NаСl, 0,005% Твин-80, 0,1 мМ EDTA. Диализ проводят всего 3 раза против, по меньшей мере, 200-кратного избытка, при 4°С.- The refolding mixture is transferred to a Pierce coil with a molecular weight cut-off (MWCO) of 7 kDa for dialysis. Dialysis is carried out in a buffer containing 20 mm NaOAc, pH 4, 50 mm NaCl, 0.005% Tween-80, 0.1 mm EDTA. Dialysis is carried out only 3 times against at least a 200-fold excess at 4 ° C.

- После диализа материал пропускают через 0,45 мкМ-фильтр.- After dialysis, the material is passed through a 0.45 μm filter.

- Колонку с SР-сефарозой уравновешивают буфером для диализа и наносят образец. Колонку промывают буфером для диализа и элюируют буфером для диализа, содержащим солевой градиент до 1М NаСl. Белок обычно элюируют при 300-400 мМ NаСl.- The column with SP-Sepharose is balanced with dialysis buffer and a sample is applied. The column is washed with dialysis buffer and eluted with dialysis buffer containing a salt gradient of up to 1 M NaCl. Protein is usually eluted at 300-400 mM NaCl.

- Материал анализируют с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (см., например, фиг.10).- The material is analyzed by electrophoresis in SDS-PAGE (see, for example, figure 10).

Пример 3Example 3

Метод с использованием двух ферментов в двух сосудахMethod using two enzymes in two vessels

В нижеследующем примере проиллюстрировано получение G-CSF-GalNAc-SA-PEG в двух последовательных стадиях, где каждый промежуточный продукт очищали перед его использованием в следующей стадии.The following example illustrates the preparation of G-CSF-GalNAc-SA-PEG in two sequential steps, where each intermediate was purified before use in the next step.

а. Получение G-CSF-GalNAc (рН 6,2) из G-CSF и UDP-GalNAc с использованием GalNAc-Т2 but. Obtaining G-CSF-GalNAc (pH 6.2) from G-CSF and UDP-GalNAc using GalNAc-T2

G-CSF (960 мкг) в 3,2 мл буфера для упаковки концентрировали путем ультрафильтрации с использованием УФ-фильтра (MWCO 5K), а затем разводили 1 мл 25 мМ буфера МЕS (рН 6,2, 0,005% NаN₃). Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг, 9,24 мМ), GalNAc-Т2 (40 мкл, 0,04 ед.) и 100 мМ MnCl₂ (40 мкл, 4 мМ) и полученный раствор инкубировали при комнатной температуре.G-CSF (960 μg) in 3.2 ml of packaging buffer was concentrated by ultrafiltration using a UV filter (MWCO 5K), and then 1 ml of 25 mM MES buffer was diluted (pH 6.2, 0.005% NaN ₃ ). Then, UDP-GalNAc (6 mg, 9.24 mmol), GalNAc-T2 (40 μl, 0.04 units) and 100 mm MnCl ₂ (40 μl, 4 mmol) were added and the resulting solution was incubated at room temperature.

Через 24 часа MALDI-анализ указывал на завершение реакции. Реакционную смесь подвергали прямой ВЭЖХ-очистке с использованием SЕС (Superdex 75 и Superdex 200) и буфера для элюирования, содержащего PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 4,9, и 0,005% Твин 80). Собранный пик G-CSF-GalNAc концентрировали с использованием фильтра Centricon с MWCO 5 кДа до концентрации 150 мкл и объем доводили до 1 мл с использованием PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 4,9, и 0,005% Твин 80). Конечная концентрация белка составляла 1 мг/мл (А₂₈₀), выход 100%. Образец хранили при 4°С.After 24 hours, MALDI analysis indicated the completion of the reaction. The reaction mixture was subjected to direct HPLC purification using SEC (Superdex 75 and Superdex 200) and an elution buffer containing PBS (phosphate buffered saline, pH 4.9, and 0.005% Tween 80). The collected G-CSF-GalNAc peak was concentrated using a Centricon filter with 5 kDa MWCO to a concentration of 150 μl and the volume was adjusted to 1 ml using PBS (phosphate buffered saline, pH 4.9, and 0.005% Tween 80). The final protein concentration was 1 mg / ml (A ₂₈₀ ), yield 100%. The sample was stored at 4 ° C.

b. Получение G-CSF-GalNAc-СК-ПЭГ с использованием очищенных G-CSF-GalNAc, ЦМФ-СК-ПЭГ (20 КДа) и мышиного SТ6GalNAc-Т1 (рН 6,2)b. Obtaining G-CSF-GalNAc-SK-PEG using purified G-CSF-GalNAc, CMP-SK-PEG (20 KDa) and mouse ST6GalNAc-T1 (pH 6.2)

В растворе G-CSF-GalNAc, содержащем 1 мг белка, буфер заменяли 25 мМ буфером МЕS (рН 6,2, 0,005% NаN₃) и добавляли ЦМФ-СК-ПЭГ (20 КДа)(5 мг, 0,25 мкмоль). После растворения добавляли MnCl₂ (100 мкл, 100 мМ раствор) и SТ3GalNAc-1 (100 мкл, мышиный фермент) и реакционную смесь медленно перемешивали при 32°С в течение трех дней. Затем реакционную смесь концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K) и проводили одну замену буфера на 25 мМ NаОАс (рН 4,9), после чего концентрировали до объема всего 1 мл. Затем продукт очищали с использованием SР-сефарозы (А: 25 мМ NаОАс+0,005% Твин-80, рН 4,5; В: 25 мМ NаОАс+0,005% Твин-80, рН 4,5+2М NаСl) при времени удерживания 13-18 минут и SЕС (Superdex 75; PBS-рН 7,2, 0,005% твин-80) при времени удерживания 8,6 минут (Superdex 75; скорость потока 1 мл/мин). Нужные фракции собирали, концентрировали до 0,5 мл и хранили при 4°С.In a G-CSF-GalNAc solution containing 1 mg protein, the buffer was replaced with 25 mM MES buffer (pH 6.2, 0.005% NaN ₃ ) and CMF-SK-PEG (20 KDa) (5 mg, 0.25 μmol) was added. . After dissolution, MnCl ₂ (100 μl, 100 mM solution) and ST3GalNAc-1 (100 μl, mouse enzyme) were added and the reaction mixture was slowly stirred at 32 ° C for three days. Then the reaction mixture was concentrated by ultrafiltration (MWCO 5K), and one buffer change was performed with 25 mM NaOAc (pH 4.9), after which it was concentrated to a volume of only 1 ml. The product was then purified using SP-Sepharose (A: 25 mM NaOAc + 0.005% Tween-80, pH 4.5; B: 25 mM NaOAc + 0.005% Tween-80, pH 4.5 + 2M NaCl) with a retention time of 13 -18 minutes and SEC (Superdex 75; PBS-pH 7.2, 0.005% Tween-80) with a retention time of 8.6 minutes (Superdex 75; flow rate 1 ml / min). The desired fractions were collected, concentrated to 0.5 ml and stored at 4 ° C.

Пример 4Example 4

Метод получения G-CSF-GalNAc-СК-ПЭГ в одном сосуде с одновременным добавлением ферментовThe method of obtaining G-CSF-GalNAc-SK-PEG in a single vessel with the simultaneous addition of enzymes

В нижеследующем примере проиллюстрировано получение G-CSF-GalNAc-СК-ПЭГ в одном сосуде с одновременным добавлением ферментов.The following example illustrates the preparation of G-CSF-GalNAc-SC-PEG in a single vessel with the addition of enzymes.

1. Реакция в одном сосуде с использованием мышиного SТ6GalNAc-1 (рН 6,0)1. The reaction in one vessel using mouse ST6GalNAc-1 (pH 6.0)

G-CSF (960 мкг белка, растворенного в 3,2 мл буфера для приготовления продукта) концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K) до 0,5 мл, а затем разводили 25 мМ буфера МЕS (рН 6,0, 0,005% NаN₃) до объема всего примерно 1 мл или до концентрации белка 1 мг/мл. Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг, 9,21 мкмоль), GalNAc-Т2 (80 мкл, 80 мЕд), ЦМФ-СК-ПЭГ (20 кДа)(6 мг, 0,3 мкмоль), после чего добавляли мышиный фермент SТ6GalNAc-1 (120 мкл) и 100 мМ MnCl₂ (50 мкл). Полученный раствор перемешивали при 32°С в течение 48 часов и очищали в стандартных условиях хроматографии на SР-сефарозе. Было получено всего 0,5 мг белка (А₂₈₀), или общий выход составлял примерно 50%. Структуру продукта подтверждали с помощью анализа MALDI и электрофореза в ДСН-ПААГ.G-CSF (960 μg of protein dissolved in 3.2 ml of product preparation buffer) was concentrated by ultrafiltration (MWCO 5K) to 0.5 ml, and then diluted with 25 mM MES buffer (pH 6.0, 0.005% NaN ₃ ) to a volume of only about 1 ml or to a protein concentration of 1 mg / ml. Then, UDP-GalNAc (6 mg, 9.21 μmol), GalNAc-T2 (80 μl, 80 mU), CMP-SK-PEG (20 kDa) (6 mg, 0.3 μmol) were added, and then the mouse enzyme was added ST6GalNAc-1 (120 μl) and 100 mM MnCl ₂ (50 μl). The resulting solution was stirred at 32 ° C for 48 hours and purified under standard chromatography conditions on SP-Sepharose. Only 0.5 mg of protein (A ₂₈₀ ) was obtained, or the total yield was approximately 50%. The structure of the product was confirmed by analysis of MALDI and SDS-PAGE.

2. Реакция в одном сосуде с использованием куриного SТ6GalNAc-1 (рН 6,0)2. The reaction in one vessel using chicken ST6GalNAc-1 (pH 6.0)

14,4 мг G-CSF концентрировали до конечного объема 3 мл, а затем буфер заменяли 25 мМ буфером МЕS (рН 6,0, 0,05% NаN₃, 0,004% Твин-80) и объем доводили до 13 мл. Затем добавляли UDP-GalNAc (90 мг, 150 мкмоль), GalNAc-Т2 (0,59 ед.), ЦМФ-СК-ПЭГ (20 кДа)(90 мг), куриный SТ6GalNAc-1 (0,44 ед) и 100 мМ MnCl₂ (600 мкл). Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 60 часов. Затем реакционную смесь концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K) и центрифугировали. Остаток (примерно 2 мл) растворяли в 25 мМ буфера NаОАс (рН 4,5) и снова концентрировали до конечного объема всего 5 мл. Этот образец очищали с использованием SР-сефарозы в течение примерно 10-23 минут, SЕС (Superdex 75; 17 минут, скорость потока 0,5 мл/мин) и снова SЕС (Superdex 200; 23 минуты, скорость потока 0,5 мл/мин), в результате чего получали 3,6 мг (общий выход 25%) G-CSF-GalNAc-СК-ПЭГ (20 кДа)(А₂₈₀ и ВСА-метод).14.4 mg of G-CSF was concentrated to a final volume of 3 ml, and then the buffer was replaced with 25 mM MES buffer (pH 6.0, 0.05% NaN ₃ , 0.004% Tween-80) and the volume was adjusted to 13 ml. Then UDP-GalNAc (90 mg, 150 μmol), GalNAc-T2 (0.59 units), CMP-SK-PEG (20 kDa) (90 mg), chicken ST6GalNAc-1 (0.44 units) and 100 were added. mM MnCl ₂ (600 μl). The resulting mixture was kept at room temperature for 60 hours. Then the reaction mixture was concentrated by ultrafiltration (MWCO 5K) and centrifuged. The residue (approximately 2 ml) was dissolved in 25 mM NaOAc buffer (pH 4.5) and again concentrated to a final volume of only 5 ml. This sample was purified using SP-Sepharose for about 10-23 minutes, SEC (Superdex 75; 17 minutes, flow rate 0.5 ml / min) and again SEC (Superdex 200; 23 minutes, flow rate 0.5 ml / min), whereby 3.6 mg (total yield 25%) of G-CSF-GalNAc-SC-PEG (20 kDa) was obtained (A ₂₈₀ and BCA method).

Пример 5Example 5

Метод получения G-CSF-GalNAc-Gal-СК-ПЭГ в одном сосуде с последовательным добавлением ферментовThe method of obtaining G-CSF-GalNAc-Gal-SK-PEG in a single vessel with sequential addition of enzymes

В нижеследующем примере проиллюстрировано получение G-CSF-GalNAc-Gal-СК-ПЭГ в одном сосуде с последовательным добавлением ферментов.The following example illustrates the preparation of G-CSF-GalNAc-Gal-SK-PEG in a single vessel with sequential addition of enzymes.

1. Получение исходя из GalNAc-G-CSF1. Preparation based on GalNAc-G-CSF

а. Получение G-CSF-GalNAc (рН 6,2) из G-CSF и UDP-GalNAc с использованием GalNAc-Т2 but. Obtaining G-CSF-GalNAc (pH 6.2) from G-CSF and UDP-GalNAc using GalNAc-T2

G-CSF (960 мкг) в 3,2 мл буфера для упаковки концентрировали на фильтре для ультрафильтрации (MWCO 5K), а затем разводили 1 мл 25 мМ буфера МЕS (рН 6,2, 0,005% NаN₃). Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг, 9,24 мМ), GalNAc-Т2 (40 мкл, 0,04 ед) и 100 мМ MnCl₂ (40 мкл, 4 мМ) и полученный раствор инкубировали при комнатной температуре.G-CSF (960 μg) in 3.2 ml of packaging buffer was concentrated on an ultrafiltration filter (MWCO 5K), and then 1 ml of 25 mM MES buffer was diluted (pH 6.2, 0.005% NaN ₃ ). Then, UDP-GalNAc (6 mg, 9.24 mmol), GalNAc-T2 (40 μl, 0.04 u) and 100 mm MnCl ₂ (40 μl, 4 mmol) were added and the resulting solution was incubated at room temperature.

b. Получение G-CSF-GalNAc-Gal-СК-ПЭГ из G-CSF-GalNAc, УДФ-галактозы, СК-ПЭГ (20 КДа) и соответствующих ферментовb. Obtaining G-CSF-GalNAc-Gal-SK-PEG from G-CSF-GalNAc, UDF-galactose, SK-PEG (20 KDa) and the corresponding enzymes

УДФ-галактозу (4 мг, 6,5 мкмоль), конъюгат “остов -1-Gal-Т” (320 мкл, 160 мЕд), ЦМФ-СК-ПЭГ (20 кДа) (8 мг, 0,4 мкмоль), ST3Gal2 (80 мкл, 0,07 мЕд) и 100 мМ MnCl₂ (80 мкл) непосредственно добавляли к неочищенной реакционной смеси G-CSF-GalNAc (1,5 мг) в 1,5 мл 25 мМ буфера MES (pH 6,0) вышеуказанной стадии (а). Полученную смесь инкубировали при 32°С в течение 60 часов. Реакционную смесь центрифугировали и раствор концентрировали с помощью ультрафильтрации (MWCO 5K) до 0,2 мл, а затем снова растворяли в 25 мМ NaOAc (pH 4,5) до конечного объема 1 мл. Продукт очищали на SP-сефарозе (время удерживания 10-15 минут), а затем фракцию пика концентрировали на фильтрующей центрифуге (MWCO 5K) и остаток снова очищали с использованием SEC (Superdex 75, время удерживания 10,2 мин). После концентрирования на фильтрующей центрифуге (MWCO 5K) белок разводили до 1 мл с использованием буфера для получения композиции, содержащей PBS, 2,5% маннита, 0,005% полисорбата, рН 6,5, и получали композицию при концентрации 850 мкг белка на 1 мл продукта (А₂₈₀). Общий выход составлял 55%.UDF-galactose (4 mg, 6.5 μmol), conjugate “backbone -1-Gal-T” (320 μl, 160 mU), CMP-SK-PEG (20 kDa) (8 mg, 0.4 μmol), ST3Gal2 (80 μl, 0.07 mU) and 100 mM MnCl ₂ (80 μl) were directly added to the crude reaction mixture of G-CSF-GalNAc (1.5 mg) in 1.5 ml of 25 mM MES buffer (pH 6.0 ) of the above step (a). The resulting mixture was incubated at 32 ° C for 60 hours. The reaction mixture was centrifuged and the solution was concentrated by ultrafiltration (MWCO 5K) to 0.2 ml, and then redissolved in 25 mM NaOAc (pH 4.5) to a final volume of 1 ml. The product was purified on SP-Sepharose (retention time 10-15 minutes), and then the peak fraction was concentrated on a filter centrifuge (MWCO 5K) and the residue was again purified using SEC (Superdex 75, retention time 10.2 min). After concentrating on a filter centrifuge (MWCO 5K), the protein was diluted to 1 ml using a buffer to obtain a composition containing PBS, 2.5% mannitol, 0.005% polysorbate, pH 6.5, and the composition was obtained at a concentration of 850 μg of protein per 1 ml product (A ₂₈₀ ). The total yield was 55%.

Пример 6Example 6

Метод получения G-CSF-GalNAc-Gal-СК-ПЭГ в одном сосуде с одновременным добавление ферментовThe method of obtaining G-CSF-GalNAc-Gal-SK-PEG in a single vessel with the simultaneous addition of enzymes

а. Получение исходя из G-CSFbut. Getting based on G-CSF

G-CSF (960 мкг, 3,2 мл) концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K), а затем разводили 25 мМ буфера МЕS (рН 6,0, 0,005% NаN₃). Полный объем раствора G-CSF доводили примерно до 1 мг/мл. Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг), GalNAc-Т2 (80 мкл, ~80 мкЕд), UDP-Gal (6 мг), конъюгат “остов 1-GalT” (160 мкл, 80 мкЕд), ЦМФ-СК-ПЭГ(20K) (6 мг), 2,3-(О)-сиалилтрансферазу (160 мкл, 120 мкЕд) и 100 мМ MnCl₂ (40 мкл). Полученную смесь инкубировали при 32°С в течение 48 часов. Очистку проводили, как описано ниже с применением ИЭФ и SEC. Полученную фракцию, содержащую продукт, концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K) и объем доводили примерно до 1 мл добавлением буфера. Концентрация белка, как было определено по А₂₈₀, составляла 0,392 мг/мл, а общий выход из расчета G-CSF составлял 40%.G-CSF (960 μg, 3.2 ml) was concentrated by ultrafiltration (MWCO 5K), and then diluted with 25 mM MES buffer (pH 6.0, 0.005% NaN ₃ ). The total volume of the G-CSF solution was adjusted to approximately 1 mg / ml. Then added UDP-GalNAc (6 mg), GalNAc-T2 (80 μl, ~ 80 μU), UDP-Gal (6 mg), 1-GalT backbone conjugate (160 μl, 80 μU), CMP-SK-PEG (20K) (6 mg), 2,3- (O) -sialyltransferase (160 μl, 120 μU) and 100 mM MnCl ₂ (40 μl). The resulting mixture was incubated at 32 ° C for 48 hours. Purification was performed as described below using IEF and SEC. The resulting product containing fraction was concentrated by ultrafiltration (MWCO 5K) and the volume was adjusted to approximately 1 ml by addition of buffer. The protein concentration, as determined by A ₂₈₀ , was 0.392 mg / ml, and the total yield from the calculation of G-CSF was 40%.

Очевидно, что описанные здесь примеры и варианты приводятся лишь в иллюстративных целях, и исходя из описания настоящего изобретения специалист в данной области может внести различные модификации или изменения, которые не выходят за рамки объема и сущности настоящего изобретения и прилагаемой формулы изобретения. Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте и для всех целей осуществления изобретения вводятся в настоящее описание посредством ссылки.Obviously, the examples and variations described herein are for illustrative purposes only, and based on the description of the present invention, one skilled in the art can make various modifications or changes that do not go beyond the scope and essence of the present invention and the appended claims. All publications, patents and patent applications cited herein, in their entirety and for all purposes of the invention, are hereby incorporated by reference.

Claims (35)

1. Пептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, содержащий фрагмент:

где R¹ представляет собой группу, выбранную из фрагментов, включающих линейный или разветвленный остаток полиэтиленглиголя; и
а равно целому числу от 0 до 20.1. The peptide of a granulocyte colony stimulating factor containing a fragment:

where R ¹ represents a group selected from fragments comprising a linear or branched residue of polyethylene glycol; and
and equals an integer from 0 to 20. 2. Пептид по п.1, где R¹ имеет структуру, которая выбрана из:

;

; и

где е и f независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500, а q равно целому числу от 0 до 20.2. The peptide according to claim 1, where R ¹ has a structure that is selected from:

;

; and

where e and f are independently equal to integers selected from 1-2500, and q is an integer from 0 to 20. 3. Пептид по п.1, где R¹ имеет структуру, которая выбрана из:

;

;

; и

где: е, f и f' равны целым числам, независимо выбранным из 1-2500, а
q и q' означают целые числа, независимо выбранные из 1-20.3. The peptide according to claim 1, where R ¹ has a structure that is selected from:

;

;

; and

where: e, f and f 'are equal to integers independently selected from 1-2500, and
q and q 'are integers independently selected from 1-20. 4. Пептид по п.1, где R¹ имеет структуру, которая выбрана из:

где е, f и f' независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500, а
q, q' и q” равны целым числам, независимо выбранным из 1-20.4. The peptide according to claim 1, where R ¹ has a structure that is selected from:

where e, f and f 'are independently equal to integers selected from 1-2500, and
q, q 'and q ”are integers independently selected from 1-20. 5. Пептид по п.1, где R¹ имеет структуру, которая выбрана из:

; и

где е и f независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500.5. The peptide according to claim 1, where R ¹ has a structure that is selected from:

; and

where e and f are independently equal to integers selected from 1-2500. 6. Пептид G-CSF по п.1, где указанный фрагмент имеет формулу:

6. The peptide G-CSF according to claim 1, where the specified fragment has the formula:

7. Пептид G-CSF по п.1, где указанный фрагмент имеет формулу:

7. The peptide G-CSF according to claim 1, where the specified fragment has the formula:

8. Пептид G-CSF по п.1, где указанный фрагмент имеет формулу:

где AA означает аминокислотный остаток указанного пептида.8. The peptide G-CSF according to claim 1, where the specified fragment has the formula:

where AA means the amino acid residue of the specified peptide. 9. Пептид G-CSF по п.8, где указанный аминокислотный остаток выбран из серина или треонина.9. The G-CSF peptide of claim 8, wherein said amino acid residue is selected from serine or threonine. 10. Пептид G-CSF по п.1, где указанный пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.10. The G-CSF peptide according to claim 1, where the specified peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 11. Пептид G-CSF по п.9, где указанным аминокислотным остатком является треонин в положении 134 SEQ ID NO: 1.11. The G-CSF peptide according to claim 9, wherein said amino acid residue is threonine at position 134 of SEQ ID NO: 1. 12. Пептид G-CSF по п.1, где указанный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-11.12. The G-CSF peptide according to claim 1, where the specified peptide has an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1-11. 13. Пептид G-CSF no п.1, где указанный фрагмент имеет формулу:

где a, b, c, d, i, r, s, t и u равны целым числам, независимо выбранным из 0 и1;
q равно 1;
е, f, g и h независимо равны целым числам, выбранным из 0-6;
j, k, l и m независимо равны целым числам, выбранным из 0-100;
v, w, х и y независимо выбраны из 0 и 1, а, по меньшей мере, один из v, w, х и y равен 1;
АА означает аминокислотный остаток указанного пептида G-CSF;
Sia-(R) имеет формулу:

где R¹ представляет собой группу, содержащую фрагмент, выбранный из линейного или разветвленного остатка полиэтиленгликоля; и а равно целому числу от 0 до 20.13. The peptide G-CSF no.1, where the specified fragment has the formula:

where a, b, c, d, i, r, s, t, and u are integers independently selected from 0 and 1;
q is 1;
e, f, g, and h are independently equal to integers selected from 0-6;
j, k, l and m are independently equal to integers selected from 0-100;
v, w, x, and y are independently selected from 0 and 1, and at least one of v, w, x, and y is 1;
AA means the amino acid residue of the indicated peptide G-CSF;
Sia- (R) has the formula:

where R ¹ represents a group containing a fragment selected from a linear or branched residue of polyethylene glycol; and a is an integer from 0 to 20. 14. Пептид по п.13, где указанный аминокислотный остаток представляет собой аспарагиновый остаток.14. The peptide of claim 13, wherein said amino acid residue is an asparagine residue. 15. Пептид по п.1, где указанный пептид представляет собой биологически активный пептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.15. The peptide according to claim 1, where the specified peptide is a biologically active peptide of granulocyte colony stimulating factor. 16. Способ получения конъюгата пептида G-CSF, содержащего фрагмент:

R¹ представляет собой группу, содержащую фрагмент, выбранный из линейного или разветвленного остатка полиэтиленглиголя; и а равно целому числу от 0 до 20, включающий:
(а) контактирование пептида G-CSF, являющегося субстратом, с донорным фрагментом ПЭГ-сиаловая кислота, имеющим формулу:

и с ферментом, переносящим указанную ПЭГ-сиаловую кислоту на аминокислотный остаток или гликозильный остаток указанного пептида G-CSF в условиях, подходящих для такого переноса.16. A method of obtaining a conjugate of the peptide G-CSF containing a fragment:

R ¹ represents a group containing a moiety selected from a linear or branched residue of polyethylene glycol; and a is an integer from 0 to 20, including:
(a) contacting the peptide G-CSF, which is a substrate, with a donor fragment of PEG-sialic acid having the formula:

and with an enzyme transferring said PEG sialic acid to an amino acid residue or glycosyl residue of said G-CSF peptide under conditions suitable for such a transfer. 17. Способ по п.16, где R¹ имеет структуру, которая выбрана из:

;

; и

где е и f независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500;
q равно целому числу от 0 до 20.17. The method according to clause 16, where R ¹ has a structure that is selected from:

;

; and

where e and f are independently equal to integers selected from 1-2500;
q is an integer from 0 to 20. 18. Способ по п.16, где R¹ имеет структуру, которая выбрана из:

;

;

; и

где е, f и f равны целым числам, независимо выбранным из 1-2500, а q и q' означают целые числа, независимо выбранные из 1-20.18. The method according to clause 16, where R ¹ has a structure that is selected from:

;

;

; and

where e, f and f are equal to integers independently selected from 1-2500, and q and q 'are integers independently selected from 1-20. 19. Способ по п.16, где R¹ имеет структуру, которая выбрана из:

; и

где е, f и f” независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500, а q, q' и q” равны целым числам, независимо выбранным из 1-20.19. The method according to clause 16, where R ¹ has a structure that is selected from:

; and

where e, f and f ”are independently equal to integers selected from 1-2500, and q, q 'and q” are equal to integers independently selected from 1-20. 20. Способ по п.16, где R¹ имеет структуру, которая выбрана из:

; и

где е и f независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500.20. The method according to clause 16, where R ¹ has a structure that is selected from:

; and

where e and f are independently equal to integers selected from 1-2500. 21. Способ по п.16, который, перед проведением стадии (а), включает:
(b) экспрессию указанного пептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, используемого в качестве субстрата, в подходящем хозяине.21. The method according to clause 16, which, before carrying out stage (a), includes:
(b) expressing said peptide of a granulocyte colony stimulating factor used as a substrate in a suitable host. 22. Способ по п.16, где указанный хозяин выбран из клетки насекомого и клетки млекопитающего.22. The method according to clause 16, where the specified host is selected from an insect cell and a mammalian cell. 23. Способ стимуляции продуцирования воспалительных лейкоцитов у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему пептида по п.1.23. A method of stimulating the production of inflammatory leukocytes in a mammal, comprising administering to said mammal a peptide according to claim 1. 24. Фармацевтическая композиция для стимуляции воспалительных клеток лейкоцитов, содержащая пептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора по п.1 в количестве, эффективном для указанной стимуляции, и фармацевтически приемлемый носитель.24. A pharmaceutical composition for stimulating leukocyte inflammatory cells, comprising the granulocyte colony stimulating factor peptide of claim 1 in an amount effective for said stimulation, and a pharmaceutically acceptable carrier. 25. Пептид по п.1, где R¹ представляет собой линейный остаток полиэтиленгликоля.25. The peptide according to claim 1, where R ¹ represents a linear residue of polyethylene glycol. 26. Пептид по п.25, где R¹ представляет собой линейный PEG, имеющий молекулярную массу примерно 20 кДа.26. The peptide of claim 25, wherein R ¹ is a linear PEG having a molecular weight of about 20 kDa. 27. Пептид по п.1, где фрагмент имеет формулу

где n представляет собой целое число от 1 до 2500.27. The peptide according to claim 1, where the fragment has the formula

where n is an integer from 1 to 2500. 28. Композиция по п.24, где указанный пептид присутствует в количестве, эффективном для стимуляции нейтрофилов.28. The composition according to paragraph 24, where the specified peptide is present in an amount effective to stimulate neutrophils. 29. Способ по п.16, где R¹ представляет собой линейный остаток полиэтиленгликоля.29. The method according to clause 16, where R ¹ represents a linear residue of polyethylene glycol. 30. Способ по п.29, где R¹ представляет собой линейный PEG, имеющий молекулярную массу примерно 20 кДа.30. The method according to clause 29, where R ¹ is a linear PEG having a molecular weight of about 20 kDa. 31. G-CSF пептид по п.27, где указанный аминокислотный остаток выбран из серина или треонина.31. The G-CSF peptide of claim 27, wherein said amino acid residue is selected from serine or threonine. 32. Пептид по п.27, где указанный пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-11.32. The peptide of claim 27, wherein said peptide has an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1-11. 33. Пептид по п.32, где указанный пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.33. The peptide of claim 32, wherein said peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 34. Пептид по п.32, где указанным аминокислотным остатком является треонин в положении 134 SEQ ID NO:1.34. The peptide of claim 32, wherein said amino acid residue is threonine at position 134 of SEQ ID NO: 1. 35. Способ по п.16, где указанный фрагмент имеет формулу

где n представляет собой целое число от 1 до 2500; и
донорный фрагмент ПЭГ-сиаловая кислота имеет формулу

35. The method according to clause 16, where the specified fragment has the formula

where n is an integer from 1 to 2500; and
the donor fragment of PEG-sialic acid has the formula

Images