RU2392318C1 - Method of stable cell cultures manufacture - Google Patents
Method of stable cell cultures manufacture Download PDFInfo
- Publication number
- RU2392318C1 RU2392318C1 RU2008145261/13A RU2008145261A RU2392318C1 RU 2392318 C1 RU2392318 C1 RU 2392318C1 RU 2008145261/13 A RU2008145261/13 A RU 2008145261/13A RU 2008145261 A RU2008145261 A RU 2008145261A RU 2392318 C1 RU2392318 C1 RU 2392318C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- cells
- trypsin
- tissue
- cell
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биотехнологии и вирусологии для получения штаммов диплоидных клеток из первично-трипсинизированных клеточных культур, в том числе для заместительной терапии.The invention relates to biology and medicine and can be used in biotechnology and virology to obtain diploid cell strains from primary trypsinized cell cultures, including replacement therapy.
Известно, что первично-трипсинизированные клеточные культуры являются простым и доступным субстратом для выделения и накопления вирусов человека и животных. В частности, культуры фибробластов эмбриона свиней (ПЭС) используют при работе с арбовирусами и энтеровирусами, фибробласты куриных эмбрионов (ФЭК) используют при работе с арбовирусами, а эпителиоподобные клетки почек эмбриона телят (ПЭТ) - с вирусами респираторной группы.Primary trypsinized cell cultures are known to be a simple and affordable substrate for the isolation and accumulation of human and animal viruses. In particular, pig embryo fibroblast cultures (PES) are used when working with arboviruses and enteroviruses, chicken embryo fibroblasts (PEC) are used when working with arboviruses, and epithelial-like cells of calf embryo kidneys (PET) are used with respiratory viruses.
Известен способ получения клеточных культур из фетального материала. При этом используют ткани животных первой половины срока беременности. Их отмывают, измельчают, далее дезагрегируют в растворе, содержащем раствор коллагеназы II типа и трипсина в течение 40-90 минут, полученную суспензию диссоциированных клеток культивируют до достижения конфлюэнтного монослоя, затем осуществляют пассирование. Дезагрегацию монослоя проводят раствором трипсина. Суспензию клеток засевают с плотностью не менее 1×10 кл/мл на ростовую среду ДМЕМ/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит) и 5 нг/мл фактора роста эпидермиса. Процесс культивирования ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% CO2. Среду в процессе культивирования неоднократно меняют, а культивирование ведут, избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы. В качестве фетального материала могут быть использованы ткани печени, тимуса, костного мозга, подкожной жировой ткани [Патент РФ №2268062, МПК А61К 35/54; А61З 9/00, 2006 г.].A known method of obtaining cell cultures from fetal material. At the same time, animal tissues of the first half of pregnancy are used. They are washed, ground, then disaggregated in a solution containing a solution of type II collagenase and trypsin for 40-90 minutes, the resulting suspension of dissociated cells is cultured until a confluent monolayer is reached, then passaged. Monolayer disaggregation is carried out with trypsin solution. A cell suspension is seeded with a density of at least 1 × 10 cells / ml on DMEM / F12 growth medium, 20% fetal calf serum, 1% ITS (insulin, transferrin, selenite) and 5 ng / ml epidermal growth factor. The cultivation process is carried out 18-25 days at 37 ° C in an atmosphere of 9-10% CO 2 . The environment during the cultivation process is repeatedly changed, and cultivation is carried out, avoiding the accumulation of mature stromal cells in the culture. As fetal material can be used tissue of the liver, thymus, bone marrow, subcutaneous adipose tissue [RF Patent No. 2268062, IPC A61K 35/54; A61Z 9/00, 2006].
Известный метод не обеспечивает возможность стабилизации штаммов диплоидных клеток.The known method does not provide the ability to stabilize strains of diploid cells.
Широко известен метод получения первичных клеточных линий из тканей кожи или эмбрионального материала, полученного при хирургических абортах, путем измельчения исходных тканей в присутствии 0,04%-ного раствора трипсина с последующей инкубацией при эпизодическом пипетировании образующейся суспензии клеток, последнюю центрифигируют, осадок ресуспендируют в 1-2 мл среды А (среда 199 с антибиотиками, сыворотка крови группы АВ и куриный эмбриональный экстракт) и помещают во флаконы Карреля, которые инкубируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа [Дж.Хаймен, А.Полдинг. Культивирование фибробластов человека для исследования хромосом. В кн.: Новые методы культуры животных тканей / Под ред. Дж.Уосли. М.: Мир, 1976, с.208].The method of obtaining primary cell lines from skin tissues or embryonic material obtained during surgical abortion is widely known by grinding the starting tissues in the presence of a 0.04% trypsin solution followed by incubation during episodic pipetting of the resulting cell suspension, the latter is centrifiged, the pellet is resuspended in 1 -2 ml of medium A (medium 199 with antibiotics, blood serum of group AB and chicken embryonic extract) and placed in Carrel vials, which are incubated at 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide [J. Hymen, A.Polding. Cultivation of human fibroblasts for the study of chromosomes. In: New Methods of Culture of Animal Tissues / Ed. J. Washley. M .: Mir, 1976, p.208].
Известный метод не позволяет стабильно получать стандартные клеточные культуры и, как следствие, обеспечить возможность стабилизации штаммов.The known method does not allow to stably obtain standard cell cultures and, as a result, provide the ability to stabilize strains.
Наиболее близким к предлагаемому, является способ выделения и стабилизации диплоидных клеток из однородной ткани 12-14-недельного эмбриона человека. Перед приготовлением определяют пол донора по набору хромосом, ткань измельчают и промывают 0,25-0,30%-ным раствором трипсина при температуре 18-22°С в течение 20-30 минут, проводя многократную экстракцию клеток путем обработки ткани новой порцией трипсина при температуре 37°С в соотношении 1/10 к массе ткани при перемешивании до полного истощения ткани, собранные порции экстрагированных клеток нейтрализуют в питательной среде Игла и центрифугируют, полученный осадок ресуспендируют и культивируют в ростовой среде на основе среды Игла с 10% телячьей сывороткой и антибиотиками, полученную суспензию высевают в матрасы и инкубируют при 37°С со сменой среды на 3-4 сутки, съем клеток для пассирования осуществляют на 5-7 сутки после образования их монослоя путем обработки 0,25%-ным раствором трипсина при температуре 18-22°С в течение 1-2 минут с последующим пипетированием, нейтрализацией трипсина и центрифугированием и последующим пассированием. Готовые клеточные линии подвергают криоконсервации в среде Игла с добавлением 10% сыворотки телят и 10% глицерина при концентрации клеток 1,5-2,0 млн кл./мл [Выделение, культивирование и контроль штаммов диплоидных клеток. Методические указания. Министерство здравоохранения СССР, М., 1979 г., с.2-4].Closest to the proposed, is a method of isolation and stabilization of diploid cells from a homogeneous tissue of a 12-14-week-old human embryo. Before preparation, the donor gender is determined by the set of chromosomes, the tissue is ground and washed with a 0.25-0.30% trypsin solution at a temperature of 18-22 ° C for 20-30 minutes, conducting multiple cell extraction by treating the tissue with a new portion of trypsin at at a temperature of 37 ° C in a ratio of 1/10 to the mass of the tissue with stirring until the tissue is completely depleted, the collected portions of the extracted cells are neutralized in the Needle medium and centrifuged, the resulting pellet is resuspended and cultured in a growth medium based on the Needle medium with 10% calf serum and antibiotics, the resulting suspension is sown in mattresses and incubated at 37 ° C with a change of medium for 3-4 days, cells are removed for passaging 5-7 days after the formation of their monolayer by treatment with 0.25% trypsin solution at a temperature of 18-22 ° C for 1-2 minutes, followed by pipetting, neutralization of trypsin and centrifugation and subsequent passivation. The finished cell lines are cryopreserved in the Eagle medium with the addition of 10% calf serum and 10% glycerol at a cell concentration of 1.5-2.0 million cells / ml [Isolation, cultivation and control of diploid cell strains. Methodical instructions. The Ministry of Health of the USSR, M., 1979, S. 2-4].
Известная методика позволяет получать перевиваемые клеточные линии, тогда как постоянно получать стабильные штаммы диплоидных клеток по описанной методике весьма затруднительно. Это связано с тем, что однородные клетки со стабильными свойствами в процессе выделения и культивирования подвергаются такому воздействию трипсина, которое приводит к частичному разрушению клетки, и, как следствие, отсутствуют успешные результаты в получении стабильных штаммов диплоидных клеток.The known method allows to obtain transplantable cell lines, while it is very difficult to obtain stable diploid cell strains by the described method. This is due to the fact that homogeneous cells with stable properties are exposed to trypsin in the process of isolation and cultivation, which leads to partial destruction of the cell, and, as a result, there are no successful results in obtaining stable strains of diploid cells.
Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности и качества процесса получения стабильных штаммов диплоидных клеток.The objective of the present invention is to increase the efficiency and quality of the process of obtaining stable strains of diploid cells.
Поставленная задача решается тем, что предлагаемый способ получения стабильного клеточного штамма включает использование предварительно измельченной эмбриональной ткани, промытой ферментным раствором, с последующей трипсинизацией ткани путем многократной обработки раствором трипсина при перемешивании, сливы отделившихся клеток обрабатывают питательной средой и центрифугируют, образовавшийся осадок ресуспендируют и культивируют в монослое в ростовой среде на основе среды Игла, инкубируют с последующим пассированием в течение не менее пяти раз, целевой продукт обрабатывают ферментным раствором с целью съема с поверхности матраса, полученную взвесь центрифугируют и осадок подвергают криогенной консервации, отличающийся тем, что промывку эмбриональной ткани ферментным раствором ведут при температуре 25-37°С, а трипсинизацию ведут не менее трех, но не более пяти раз путем обработки кусочков ткани раствором трипсина с протеолитической активностью в пределах 65-80 Ед.The problem is solved in that the proposed method for obtaining a stable cell strain involves the use of pre-ground embryonic tissue washed with an enzyme solution, followed by trypsinization of the tissue by repeated treatment with trypsin solution with stirring, the drained cells are treated with nutrient medium and centrifuged, the precipitate formed is resuspended and cultured in a monolayer in a growth medium based on Eagle’s medium, incubated, followed by passage for not less than five times, the target product is treated with an enzyme solution in order to remove it from the surface of the mattress, the suspension obtained is centrifuged and the precipitate is subjected to cryogenic preservation, characterized in that the embryonic tissue is washed with an enzyme solution at a temperature of 25-37 ° C, and trypsinization is performed at least three, but no more than five times by treating tissue pieces with trypsin solution with proteolytic activity in the range of 65-80 units.
Промывка эмбриональной ткани ферментным раствором при температуре 25-37°С позволяет повысить качество эксплантации клеток. В процессе получения штамма используют 0,25%-ный раствор трипсина, удовлетворяющий требованиям ФС 42-3321-96, с протеолитической активностью в пределах 65-80 Ед. (по степени расщепления казеина).Washing the embryonic tissue with an enzyme solution at a temperature of 25-37 ° C improves the quality of cell explantation. In the process of obtaining the strain using a 0.25% trypsin solution that meets the requirements of FS 42-3321-96, with proteolytic activity in the range of 65-80 Units. (according to the degree of cleavage of casein).
Использование раствора трипсина с указанной активностью, по меньшей мере, трехкратно позволяет провести процесс трипсинизации при температуре трипсина, близкой к 37°С. Такой режим позволяет обеспечить высокую степень извлечения клеток без разрушения их оболочек, что, в конечном счете, способствует повышению выхода жизнеспособных клеток и числа положительных первичных отвивок клеток для получения штамма. Максимальный количественный эффект достигается при длительности каждого цикла трипсинизации, равной 30 минутам.The use of a trypsin solution with the indicated activity, at least three times, allows the trypsinization process to be carried out at a trypsin temperature close to 37 ° C. This mode allows for a high degree of cell extraction without destroying their membranes, which ultimately helps to increase the yield of viable cells and the number of positive primary cell distillations to obtain a strain. The maximum quantitative effect is achieved with a duration of each trypsinization cycle of 30 minutes.
Промывка ферментным раствором эмбриональной ткани при повышенной температуре и проведение стадии трипсинизации при заявляемых режимах обеспечивают возможность получения установившегося штамма уже с 5-ого пассажа.Washing with an enzymatic solution of embryonic tissue at an elevated temperature and carrying out a trypsinization step under the claimed regimes provide the possibility of obtaining a steady strain already from the 5th passage.
В качестве эмбриональной ткани используют ткани млекопитающих животных, преимущественно ткани эмбрионов свиньи. Для проведения заявленного способа наиболее предпочтительными являются эмбриональные ткани первой половины срока беременности. Клетки, полученные из эмбриональной ткани такого раннего возраста, менее дифференцированы, что положительно влияет на качество и количество конечного продукта. В качестве источника эмбриональной ткани могут быть использованы эмбрионы второй половины срока беременности (10-12 недель), однако в этом случае качество клеток ухудшается, а время эффективного культивирования существенно уменьшается.As the embryonic tissue using tissue of mammalian animals, mainly tissue of pig embryos. For carrying out the claimed method, the most preferred are embryonic tissues of the first half of the gestation period. Cells obtained from embryonic tissue of such an early age are less differentiated, which positively affects the quality and quantity of the final product. As a source of embryonic tissue, embryos of the second half of pregnancy (10-12 weeks) can be used, however, in this case, the quality of the cells deteriorates, and the time of effective cultivation is significantly reduced.
Для первичной промывки эмбриональной ткани используют раствор Хенкса или раствор трипсина или химопсина. В качестве питательной ростовой среды используют среду, состоящую, предпочтительно, из равных количеств сред Игла MEM и 0,5% раствора гидролизата лактальбумина (ГЛА) с 10% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (ЭСКРС). Для приготовления ростовой среды может быть использована смесь среды Игла MEM и среды 199. Использование указанных сред обеспечивает сохранение жизнеспособности клеточных культур и выход максимального числа положительных первичных отвивок клеток для получения штамма.For the initial washing of the embryonic tissue, Hanks solution or trypsin or chymopsin solution is used. As a growth medium, a medium is used, consisting preferably of equal amounts of Eagle MEM media and 0.5% lactalbumin hydrolyzate (GLA) solution with 10% cattle fetal serum (ESCRS). To prepare the growth medium, a mixture of MEM Eagle medium and medium 199 can be used. The use of these media ensures the preservation of cell culture viability and the yield of the maximum number of positive primary cell strains for obtaining the strain.
Дополнительный результат, связанный с оптимизацией режимов получения клеточного штамма, обеспечивается также тем, что съем клеток для пассирования производят на 5-6 сутки смесью растворов 0,25% трипсина и 0,02% Версена в соотношении 1:1 при температуре не более 37°С при экспозиции 0,5-1 минуты с последующим добавлением среды Игла или ГЛА и центрифугируют при 1000-1200 об/мин в течение 10-15 минут. Указанный режим съема клеток способствует гомогенизации монослоя при культивировании и обеспечивает ровный рост клеток, что, в конечном счете, позволяет увеличить количество и качество снимаемой клеточной суспензии и последующее качественное осаждение клеточной массы.An additional result associated with the optimization of cell strain production modes is also ensured by the fact that cells are removed for passaging on days 5-6 by a mixture of 0.25% trypsin and 0.02% Versen solutions in a 1: 1 ratio at a temperature of no more than 37 ° C at an exposure of 0.5-1 minutes, followed by the addition of Medium Eagle or GLA and centrifuged at 1000-1200 rpm for 10-15 minutes. The specified mode of cell removal contributes to the homogenization of the monolayer during cultivation and ensures smooth cell growth, which, ultimately, allows to increase the quantity and quality of the removed cell suspension and subsequent qualitative deposition of the cell mass.
Заявляемый способ реализуют следующим образом.The inventive method is implemented as follows.
Однородные ткани исходного образца берут от млекопитающего животного - донора, преимущественно 4-6-недельные эмбрионы свиньи. В момент сбора ткань трехкратно промывают стерильным раствором Хенкса или 0,25%-ным раствором трипсина или 0,02%-ным раствором химопсина с гентамицином при температуре 25-37°С, собирают в стерильную колбу, отмывают до возможно полного обескровливания и измельчают скальпелем на кусочки величиной 2-3 мм3. Отмытые кусочки ткани помещают в стерильную колбу с магнитиком для проведения процесса трипсинизации на магнитной мешалке. В колбу с кусочками ткани добавляют 0,25% раствор трипсина с протеолитической активностью в пределах 65-80 Ед., подогретый до температуры 32-37°С в таком количестве, чтобы осевшая ткань была покрыта слоем жидкости на 1,5-2,0 см (предпочтительно 1/20 к массе ткани) и устанавливают на предварительно подогретую до 35-37°С магнитную мешалку. Перемешивание ведут в течение 3-10 минут, не допуская вспенивания. Цикл трипсинизации повторяют не менее 3-х раз. Для ослабления переваривающей активности трипсина в сливаемые порции взвеси клеток до 1/2 объема добавляют 0,5% раствор гидролизата лактальбумина (ГЛА). После каждого цикла трипсинизации взвесь клеток помещают в предварительно охлажденные до температуры не более +6°С стерильные центрифужные стаканы и заливают средой Игла или смесью питательных сред Игла и 0,5% ГЛА. Центрифугирование отобранной взвеси клеток проводят при 1200-1500 об/мин в течение 10 минут в охлаждаемой центрифуге при температуре +4-+6°С. Полученный осадок ресуспендируют в 0,5% растворе ГЛА и клеточную взвесь тщательно пипетируют. Отбирают пробу и проводят контрольный подсчет клеток в камере Горяева. Пипетированную клеточную взвесь готовят в концентрации 300 тыс. кл. /мл в среде Игла MEM с добавлением 10% ЭСКРС и разливают в стерильные одноразовые пластиковые матрасы. Инкубирование ведут в термостате при 37°С. Через 1 сутки проводят смену ростовой среды для удаления детрита. Монослой клеток формируется на 5-е сутки. Пересев проводят по стандартной методике в соотношении 1:2. На втором и третьем пассажах клетки пересевают на 5 сутки независимо от плотности монослоя. С 4-го пассажа формируется плотный монослой с ориентированными зонами роста униморфных фибробластоподобных клеток с четкими границами. Съем клеток при пассировании ведут 0,25% раствором трипсина или 0,02% раствором версена или их смесью при соотношении 1:1 при температуре около 37°С в течение 0,5-1,0 минуты с добавлением среды Игла MEM или ГЛА с последующим центрифугированием при 1000-1200 об/мин в течение 10-15 минут.The homogeneous tissues of the initial sample were taken from a mammalian animal - a donor, mainly 4-6-week-old pig embryos. At the time of collection, the tissue is washed three times with sterile Hanks solution or 0.25% trypsin solution or 0.02% chymopsin solution with gentamicin at a temperature of 25-37 ° C, collected in a sterile flask, washed until bleeding is complete and crushed with a scalpel into pieces of 2-3 mm 3 . The washed tissue pieces are placed in a sterile flask with a magnet for the trypsinization process on a magnetic stirrer. A 0.25% trypsin solution with proteolytic activity in the range of 65-80 Units, heated to a temperature of 32-37 ° C in such an amount that the settled tissue was covered with a layer of liquid by 1.5-2.0, is added to the flask with tissue pieces. cm (preferably 1/20 to the mass of fabric) and set on a pre-heated to 35-37 ° C magnetic stirrer. Stirring is carried out for 3-10 minutes, avoiding foaming. The trypsinization cycle is repeated at least 3 times. To weaken the digesting activity of trypsin, a 0.5% solution of lactalbumin hydrolyzate (GLA) is added to the drained portions of the cell suspension to 1/2 volume. After each trypsinization cycle, the cell suspension is placed in sterile centrifuge glasses pre-cooled to a temperature of no more than + 6 ° C and filled with Eagle's medium or with a mixture of Eagle's medium and 0.5% GLA. Centrifugation of the selected suspension of cells is carried out at 1200-1500 rpm for 10 minutes in a cooled centrifuge at a temperature of + 4- + 6 ° C. The resulting pellet was resuspended in a 0.5% GLA solution and the cell suspension was thoroughly pipetted. A sample is taken and a control count of cells is carried out in the Goryaev chamber. A pipetted cell suspension is prepared at a concentration of 300 thousand cells. / ml in a medium MEM Needle with the addition of 10% ESCRS and poured into sterile disposable plastic mattresses. Incubation is carried out in a thermostat at 37 ° C. After 1 day, the growth medium is changed to remove detritus. A monolayer of cells forms on the 5th day. Reseeding is carried out according to standard methods in a ratio of 1: 2. In the second and third passages, the cells are subcultured on day 5 regardless of the density of the monolayer. From the 4th passage, a dense monolayer is formed with oriented growth zones of unimorphic fibroblast-like cells with clear boundaries. Cells during passaging are harvested with 0.25% trypsin solution or 0.02% versene solution or their mixture at a ratio of 1: 1 at a temperature of about 37 ° C for 0.5-1.0 minutes with the addition of MEM needle or GLA with subsequent centrifugation at 1000-1200 rpm for 10-15 minutes.
Проведенный количественный кариологический анализ полученной культуры клеток показал, что относительное число клеток с хромосомным набором, соответствующим набору хромосом животного-донора, составляет 95-97%. Таким образом, становление культуры происходит в процессе 1-5 пассажей, накопление полученных диплоидных штаммов клеток ведут с 6 по 20 пассажи. Рост установившейся культуры диплоидных штаммов клеток надлежащего качества происходит не менее чем до 45 пассажа.A quantitative karyological analysis of the obtained cell culture showed that the relative number of cells with a chromosome set corresponding to the set of chromosomes of an animal donor is 95-97%. Thus, the formation of culture occurs in the process of 1-5 passages, the accumulation of the obtained diploid cell strains is from 6 to 20 passages. The growth of an established culture of diploid strains of cells of good quality occurs at least up to passage 45.
Криоконсервацию установившейся клеточной культуры проводят по стандартной методике в среде роста с добавлением 10% глицерина в программном замораживателе по стандартному режиму с последующим помещением в низкотемпературный холодильник (не менее -86°С) или в жидкий азот (-196°С). Контрольное восстановление полученных клеток показало, что жизнеспособность восстановленной культуры составляет 85-95%.Cryopreservation of the established cell culture is carried out according to the standard method in a growth medium with the addition of 10% glycerol in a program freezer according to the standard regime, followed by placement in a low-temperature refrigerator (at least -86 ° C) or in liquid nitrogen (-196 ° C). The control recovery of the obtained cells showed that the viability of the restored culture is 85-95%.
Пробы культуры, не подвергшиеся криоконсервации, продолжают пассировать до начала проявления в монослое признаков неспецифической дегенерации или заметных изменений морфологических показателей.Culture samples that have not undergone cryopreservation continue to be passaged until signs of nonspecific degeneration or noticeable changes in morphological parameters appear in the monolayer.
Контроль клеточного штамма на бактериологическую и вирусологическую стерильность осуществляют по утвержденным методикам МУК 1/4.2.588-96 методом прямого посева; методом окраски ДНК флуорохромами по РД 42-28-10-89 или методом электронной микроскопии в соответствии с МУ МЗ СССР, М., 1979; реакцией гемадсорбции с эритроцитами морской свинки по МУК 1/4.2.588-96. Подготовку препаратов для определения кариологических параметров культуры проводят согласно требованиям РД 42-28-10-89, контроль кариологических параметров ведут по известным методикам (см., например, «Выделение, культивирование и контроль штаммов диплоидных клеток». Методические указания. Министерство здравоохранения СССР, М., 1979 г., с.16-22).The control of the cell strain for bacteriological and virological sterility is carried out according to the approved methods of MUK 1 / 4.2.588-96 by direct seeding; by DNA staining with fluorochromes according to RD 42-28-10-89 or by electron microscopy in accordance with the Ministry of Health of the USSR, M., 1979; the reaction of hemi-adsorption with guinea pig erythrocytes according to MUK 1 / 4.2.588-96. Preparation of preparations for determining the karyological parameters of the culture is carried out in accordance with the requirements of RD 42-28-10-89, control of karyological parameters is carried out by known methods (see, for example, “Isolation, cultivation and control of diploid cell strains.” Guidelines. USSR Ministry of Health, M., 1979, p.16-22).
При получении клеток фибробластов свиньи (ПЭС)/ легкого эмбрионов свиньи (ЛЭС) вышеописанным способом средний выход клеток с 1 г ткани составляет 30-40 миллионов клеток.Upon receipt of pig fibroblast cells (PES) / lung pig embryos (LES) as described above, the average cell yield per gram of tissue is 30-40 million cells.
Ниже приведены примеры конкретного выполнения заявленного способа. Полученные данные представлены в таблицах.The following are examples of specific performance of the claimed method. The data obtained are presented in tables.
Для определения влияния протеолитической активности (сроков использования) раствора трипсина на выход клеток с 1 г. эмбриональной ткани (при проведении трипсинизации в течение 3-х циклов в течение 30 минут), а также режимов трипсинизации при минимальном значении активности раствора трипсина были проведены опыты с использованием тканей 4-6-недельных эмбрионов, полученных от здоровых особей свиней. Активность трипсина определена по степени расщепления казеина по ФС 42-3321-96. Подсчет клеток проведен в камере Горяева по утвержденной методике. Данные приведены в таблицах №1-3To determine the effect of the proteolytic activity (terms of use) of a trypsin solution on the yield of cells from 1 g of embryonic tissue (during trypsinization for 3 cycles within 30 minutes), as well as trypsinization regimes with a minimum value of trypsin solution activity, experiments were carried out with using tissues of 4-6-week-old embryos obtained from healthy pigs. Trypsin activity was determined by the degree of casein cleavage according to FS 42-3321-96. Cell counting was carried out in the Goryaev chamber according to the approved methodology. The data are shown in tables No. 1-3
При хранении трипсина его биологическая активность снижается. Оптимальная активность трипсина - 4-7 недель после приготовления, что соответствует протеолитической активности 65-80 Ед. При использовании трипсина с большей активностью увеличивается вероятность разрушения клеточных структур в процессе трипсинизации. При использовании раствора трипсина с активностью меньше заявляемой выход клеток с единицы веса ткани не позволяет обеспечить полноту извлечения жизнеспособных клеток, т.е. процесс менее эффективен. Использование трипсина с активностью в пределах 65-80 Ед. позволяет получить оптимальный результат по качеству клеток и их выходу с 1 г ткани.During storage of trypsin, its biological activity is reduced. The optimal trypsin activity is 4-7 weeks after preparation, which corresponds to a proteolytic activity of 65-80 units. When using trypsin with greater activity, the probability of destruction of cell structures during trypsinization increases. When using a trypsin solution with activity less than the declared yield of cells from a unit weight of tissue does not allow for the completeness of extraction of viable cells, i.e. the process is less efficient. The use of trypsin with activity in the range of 65-80 units. allows you to get the best result on the quality of cells and their output from 1 g of tissue.
Проведение процесса при температуре трипсина выше 37°С приводит к разрушению клеточных элементов, проведение процесса при температуре ниже 30°С не обеспечивает оптимального результата.Carrying out the process at a trypsin temperature above 37 ° C leads to the destruction of cellular elements, the process at a temperature below 30 ° C does not provide the optimal result.
Как видно из представленных данных, проведение не менее 3-х циклов трипсинизации длительностью по 30 минут каждый обеспечивает максимальный количественный результат процесса трипсинизации. Увеличение длительности каждого цикла свыше 30 минут приводит к разрушению клеточных элементов.As can be seen from the data presented, at least 3 trypsinization cycles lasting 30 minutes each provide the maximum quantitative result of the trypsinization process. An increase in the duration of each cycle over 30 minutes leads to the destruction of cellular elements.
Как видно из представленных данных, выращивание клеток с использованием различных сред роста влияет на активность пролиферации, а следовательно, на качество и однородность выращенной клеточной культуры. Выращивание клеток на смеси, состоящей из равных количеств среды Игла и 0,5% раствора ГЛА с 10% ЭСКРС, обеспечивает формирование сплошного монослоя фибробластоподобных клеток на 3-4 сутки роста. Границы клеток хорошо выражены. Цитоплазма светлая, равномерно окрашенная. Количество аномальных интерфаз не более 25,2‰. Число патологий митоза составило до 1% от числа делящихся клеток, число генераций не менее 40-45.As can be seen from the data presented, cell growth using different growth media affects the proliferation activity, and therefore, the quality and uniformity of the grown cell culture. Growing cells in a mixture consisting of equal amounts of Eagle’s medium and a 0.5% GLA solution with 10% ESCRS provides the formation of a continuous monolayer of fibroblast-like cells for 3-4 days of growth. Cell boundaries are well defined. The cytoplasm is light, evenly colored. The number of abnormal interphases is not more than 25.2 ‰. The number of mitosis pathologies amounted to 1% of the number of dividing cells, the number of generations was not less than 40-45.
Использование заявляемого способа позволяет получить стабильные результаты по получению однородных штаммов диплоидных клеток. Промывание ткани ферментным раствором при повышенной температуре и проведение трипсинизации по стадиям при заявляемых режимах снижает риск разрушения клетки и обеспечивает возможность становления штамма уже с 5-го пассажа. Достигаемый результат обеспечивается тем, что на стадии подготовки клеточной ткани заявленные температурные режимы позволяют примерно на 30% повысить долю жизнеспособных клеток, а на стадии трипсинизации заявленные режимы обеспечивают увеличение числа положительных первичных отвивок на 30-40%. Повышение выхода жизнеспособных клеток связано, на наш взгляд, с тем, что при оптимальной температуре сокращается время контакта эмбриональной ткани с ферментным раствором, а использование трипсина заявленной активности позволяет снизить риск разрушения клетки.Using the proposed method allows to obtain stable results for obtaining homogeneous strains of diploid cells. Washing the tissue with an enzyme solution at an elevated temperature and performing trypsinization in stages at the claimed modes reduces the risk of cell destruction and provides the possibility of the formation of a strain from passage 5. The achieved result is ensured by the fact that at the stage of preparation of the cell tissue the declared temperature regimes allow increasing the proportion of viable cells by approximately 30%, and at the trypsinization stage the declared regimes provide an increase in the number of positive primary whistles by 30-40%. The increase in the yield of viable cells is associated, in our opinion, with the fact that at the optimum temperature the time of contact between the embryonic tissue and the enzyme solution is reduced, and the use of trypsin of the declared activity reduces the risk of cell destruction.
Используемые ростовые среды позволяют создать оптимальные условия сохранения жизнеспособности клеток в процессе культивирования.The growth media used make it possible to create optimal conditions for maintaining cell viability during cultivation.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008145261/13A RU2392318C1 (en) | 2008-11-17 | 2008-11-17 | Method of stable cell cultures manufacture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008145261/13A RU2392318C1 (en) | 2008-11-17 | 2008-11-17 | Method of stable cell cultures manufacture |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2392318C1 true RU2392318C1 (en) | 2010-06-20 |
Family
ID=42682716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008145261/13A RU2392318C1 (en) | 2008-11-17 | 2008-11-17 | Method of stable cell cultures manufacture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2392318C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112920995A (en) * | 2021-03-31 | 2021-06-08 | 赵峻岭 | Mesenchymal stem cell culture serum refueling bag and application thereof |
-
2008
- 2008-11-17 RU RU2008145261/13A patent/RU2392318C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ВЫДЕЛЕНИЕ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И КОНТРОЛЬ ШТАММОВ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК. Методические указания. Министерство здравоохранения СССР. - М., 1979, с.2-4. RU 0002308957 С1 (ООО «МЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ»), 27.10.2007. US 344354 B1 (ST JUDE CHILDRENS RES HOSPITAL), 05.02.2002. CN 101353642 A (SHANGHAI INST OF ACUPUNCTURE A), 28.01.2009. CN 101195815 A (GUANGSHOU MEDICAL COLLEGE), 11.06.2008. SALIM S. EL-AMOURI et al.: «Neprilysin protects neurons against Aβ peptide toxicity». Brain Res. 2007 Jun 4; p.191-200. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112920995A (en) * | 2021-03-31 | 2021-06-08 | 赵峻岭 | Mesenchymal stem cell culture serum refueling bag and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106754674B (en) | The method and its application of amnion mesenchymal stem cell are prepared from Human plactnta amnion | |
| TWI836505B (en) | A method of isolating mesenchymal stem cells from the amniotic membrane of the umbilical cord, a mesenchymal stem cell population isolated from the amniotic membrane of the umbilical cord and a cell culture medium for isolating mesenchymal stem cells from the amniotic membrane of the umbilical cord | |
| KR100908481B1 (en) | Mesenchymal stem cell culture medium and culture method of mesenchymal stem cells using the same | |
| CN108103013B (en) | Enzyme digestion method primary culture and identification method for smooth muscle cells of esophageal-gastric junction | |
| RU2323252C1 (en) | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo | |
| CN104726406B (en) | It is a kind of to induce the method that dental pulp Derived from Mesenchymal Stem Cells is nerve cell | |
| CN101052299A (en) | Undifferentiated stem cell tissue system coming from cornea edge | |
| US20190264179A1 (en) | Serum-free medium inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cell into insulin-secretion-like cell and preparation method and use thereof | |
| CN109749997A (en) | A kind of Limbus corneae stem cell serum-free culture medium and its cultural method | |
| CN104651305A (en) | Method for acquiring bioactive proteins by utilizing umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| CN115418341B (en) | Method for transdifferentiation of fibroblast to hair papilla cell and application thereof | |
| RU2392318C1 (en) | Method of stable cell cultures manufacture | |
| RU2384618C2 (en) | Method for making fibroblast-like cells of umbilical cord of newborn | |
| CN110669792A (en) | Genetically modified mesenchymal stem cell, preparation method, application and cell therapy product | |
| CN112608904B (en) | Method for efficiently and rapidly reprogramming somatic cells into neural stem cells and application thereof | |
| RU2645255C1 (en) | Method for obtaining of biosafe culture of mesenchimal stem cells from human chorionic villae | |
| CN104818243A (en) | Separation method of placenta-derived fetal stem cells | |
| CN113755438B (en) | Mandarin fish spinal cord tissue cell line and construction method and application thereof | |
| CN112569227B (en) | 3D (three-dimensional) transplantation material system with nerve protection function and application thereof | |
| CN1284851C (en) | Somatic cell derived embryonic stem cell and its differentiated cell | |
| CN111662864A (en) | Method for differentiating umbilical cord mesenchymal stem cells into dermal stem cells through in-vitro induction | |
| CN111484971A (en) | Preparation method, kit and application of blood-derived female autologous reproductive stem cells | |
| CN112154203A (en) | Method for efficiently separating and culturing neural stem cells | |
| CN1610738A (en) | Method of inducing differentiation of mesodermal stem cells,ES cells or immortalized cells into nervous system cells | |
| RU2821926C1 (en) | Method for producing and maintaining mesenchymal stem cells from mammalian bone material |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161118 |