RU2392282C1 - METHOD FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT INTERFERON β-1b - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: proposed method of purification of human recombinant interferon beta-1b (rIFN beta-1b) provides for optimisation of processes of purification of inclusion bodies, their dissolution and refolding of target protein Purification of human rIFN beta-1b is conducted with zwittehent 3-14 as a main detergent for purification and dissolving of inclusion body of Ecoli with the following refolding of rIFN beta-1b. After that prechromatographic processing of a sample is conducted and after that chromatographic processing of Ceramic S and of Source S30 and oxidation using a mixture of cysteamine/cystamine are performed. Then gel-filtration on Superdex 75 Prep grade, chromatographic processing on Source Q30, gel-filtration on Sephacril S200HR are made and finally the effectiveness of purification of the target protein by high performance liquid chromatography is monitored.

EFFECT: raise of the target protein yields and obtaining human rIFN beta-1b which meets the requirements of normative documents with high levels of specific antiviral activity.

5 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения рекомбинантного интерферона бета-1b человека, в частности к способу его очистки.The invention relates to biotechnology, and in particular to a technology for producing recombinant human interferon beta-1b, in particular, to a method for its purification.

Интерфероны (ИФН) - гетерогенные гликопротеины иммунной системы, обладающие противовирусными, противоопухолевыми и иммуномодулирующими эффектами и различающиеся между собой как источником клеточной продукции, так и проявлениями функциональной активности. ИФН бета с самых первых шагов внедрения его рекомбинантных препаратов был предназначен, главным образом, для противоопухолевой терапии [С. Angelucci et al. Recombinant human IFN-beta affects androgen receptor level, neuroendocrine differentiation, cell adhesion, and motility in prostate cancer cells. J. Interferon Cytokine Res., 2007, 27(8): 643-52; S. Kohashi et al. Interferon-beta inhibits liver metastases from murine colon 26 carcinoma and its highly metastatic variant. Surg. Today, 2007, 37(6): 474-481]. Помимо этого, препараты ИФН бета востребованы для лечения вирусных инфекций, в частности гепатита С, везикулярного стоматита и других [I.M. Pedersen et al. Interferon modulation of cellular microRNAs as an antiviral mechanism. Nature, 2007, 449 (7164): 919-22; J. Feher, G. Lengyel. Interferon in the treatment of viral hepatitis. The interferon was discovered 50 years ago. Orv. Hetil., 2007, 148(33): 1539-43; M.D. Trottier, D.S. Lyles, C.S. Reiss. Peripheral, but not central nervous system, type I interferon expression in mice in response to intranasal vesicular stomatitis virus infection. J. Neurovirol., 2007, 13(5): 433-445]. В последние годы основным направлением применения рИФН бета-1b стали неврологические заболевания, в первую очередь рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания нервной системы, болезнь Бехтерева [М. Kremenchutzky, S. Morrow, С. Rush. The safety and efficacy of IFN-beta products for the treatment of multiple sclerosis. Expert Opin. Drug Saf., 2007, 6(3): 279-88; S. Pay et al. Dendritic cell subsets and type I interferon system in Behçet's disease: does functional abnormality in plasmacytoid dendritic cells contribute to Th1 polarization? Clin. Exp. Rheumatol., 2007, 25 (4 Suppl 45): S34-40]. Отмечена клиническая эффективность рИФН бета-1b при терапии стероидоустойчивого язвенного колита, гломерулонефрита, хронического панкреатита [S.C. Satchell et al. Interferon-beta Reduces Proteinuria in Experimental Glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol., 2007, 18(11): 2875-84; R. Talukdar, R.K. Tandon. Pancreatic stellate cells: New target in the treatment of chronic pancreatitis. J. Gastroenterol. Hepatol., 2007].Interferons (IFN) are heterogeneous immune system glycoproteins with antiviral, antitumor and immunomodulating effects and differing both in the source of cell production and in the manifestations of functional activity. IFN beta from the very first steps of introducing its recombinant drugs was intended mainly for antitumor therapy [S. Angelucci et al. Recombinant human IFN-beta affects androgen receptor level, neuroendocrine differentiation, cell adhesion, and motility in prostate cancer cells. J. Interferon Cytokine Res., 2007, 27 (8): 643-52; S. Kohashi et al. Interferon-beta inhibits liver metastases from murine colon 26 carcinoma and its highly metastatic variant. Surg. Today, 2007, 37 (6): 474-481]. In addition, IFN beta drugs are in demand for the treatment of viral infections, in particular hepatitis C, vesicular stomatitis and others [I.M. Pedersen et al. Interferon modulation of cellular microRNAs as an antiviral mechanism. Nature, 2007, 449 (7164): 919-22; J. Feher, G. Lengyel. Interferon in the treatment of viral hepatitis. The interferon was discovered 50 years ago. Orv. Hetil., 2007, 148 (33): 1539-43; M.D. Trottier, D.S. Lyles, C.S. Reiss Peripheral, but not central nervous system, type I interferon expression in mice in response to intranasal vesicular stomatitis virus infection. J. Neurovirol., 2007, 13 (5): 433-445]. In recent years, the main area of application of rIFN beta-1b has become neurological diseases, primarily multiple sclerosis and other demyelinating diseases of the nervous system, ankylosing spondylitis [M. Kremenchutzky, S. Morrow, S. Rush. The safety and efficacy of IFN-beta products for the treatment of multiple sclerosis. Expert Opin. Drug Saf., 2007, 6 (3): 279-88; S. Pay et al. Dendritic cell subsets and type I interferon system in Behçet's disease: does functional abnormality in plasmacytoid dendritic cells contribute to Th1 polarization? Clin. Exp. Rheumatol., 2007, 25 (4 Suppl 45): S34-40]. The clinical efficacy of rIFN beta-1b in the treatment of steroid-resistant ulcerative colitis, glomerulonephritis, chronic pancreatitis [S.C. Satchell et al. Interferon-beta Reduces Proteinuria in Experimental Glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol., 2007, 18 (11): 2875-84; R. Talukdar, R.K. Tandon. Pancreatic stellate cells: New target in the treatment of chronic pancreatitis. J. Gastroenterol. Hepatol., 2007].

Среди препаратов ИФН бета наибольшее признание на мировом фармацевтическом рынке заслужили рекомбинантный ИФН бета-1b, или Бетаферон (Schering AG, Germany), и в меньшей степени ИФН бета-1а, в частности Авонекс (Gedeon Richter, Hungary). Помимо особенностей фармакологического действия каждого из этих препаратов, имеющих свою фармакодинамику и свои показания для назначения пациентам, следует отметить, что у препарата ИФН бета-1b есть определенные преимущества, которые определили на него больший спрос. При оценке этих преимуществ исследователи отмечают, в частности, его неспособность, в отличие от ИФН бета-1а, к индукции нейтрализующих антител [Р. Barbero et al. Every-other-day interferon beta-1b versus once-weekly interferon beta-1a for multiple sclerosis (INCOMIN Trial) II: analysis of MRI responses to treatment and correlation with Nab. Mult. Scler., 2006, 12(1): 72-76], меньшую выраженность болевых ощущений и местной реакции на инъекционное введение ИФН бета-1b [К. Baum et al. Comparison of injection site pain and injection site reactions in relapsing-remitting multiple sclerosis patients treated with interferon beta-1a or 1b. Mult. Scler., 2007, 13(9): 1153-1160], а также различия в технологии получения этих препаратов: рекомбинантный ИФН бета-1а получают на клетках яичника китайских хомячков, то есть в эукариотической системе, а рекомбинантный ИФН бета-1b можно получать и в прокариотической системе с использованием штамма-продуцента E.coli [F.P. McCormick et al. Human interferon-.beta. (IFN-.beta.) produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells. United States Patent 5,795,779 August 18, 1998; A. Whitty et al. Interferon-beta fusion proteins and uses. United States Patent 6,800,735, October 5, 2004].Among IFN beta drugs, recombinant IFN beta-1b, or Betaferon (Schering AG, Germany), and to a lesser extent IFN beta-1a, in particular Avonex (Gedeon Richter, Hungary), have earned the most recognition in the global pharmaceutical market. In addition to the peculiarities of the pharmacological action of each of these drugs, which have their own pharmacodynamics and indications for prescribing to patients, it should be noted that the IFN beta-1b preparation has certain advantages that determined a greater demand for it. In assessing these benefits, researchers note, in particular, his inability, in contrast to IFN beta-1a, to induce neutralizing antibodies [R. Barbero et al. Every-other-day interferon beta-1b versus once-weekly interferon beta-1a for multiple sclerosis (INCOMIN Trial) II: analysis of MRI responses to treatment and correlation with Nab. Mult. Scler., 2006, 12 (1): 72-76], less severe pain and a local reaction to the injection of IFN beta-1b [K. Baum et al. Comparison of injection site pain and injection site reactions in relapsing-remitting multiple sclerosis patients treated with interferon beta-1a or 1b. Mult. Scler., 2007, 13 (9): 1153-1160], as well as differences in the technology for producing these preparations: recombinant IFN beta-1a is obtained on Chinese hamster ovary cells, that is, in the eukaryotic system, and recombinant IFN beta-1b can be obtained and in the prokaryotic system using the producer strain E. coli [FP McCormick et al. Human interferon-.beta. (IFN-.beta.) Produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells. United States Patent 5,795,779 August 18, 1998; A. Whitty et al. Interferon-beta fusion proteins and uses. United States Patent 6,800,735, October 5, 2004].

Технологии получения и очистки рИФНβ-1b посвящено много патентных исследований, в их числе: US Patent 5,795,779, August 18, 1998 (McCormick et al. Human interferon-.beta. (IFN-.beta.) produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells); US Patent 6,323,006, November 27, 2001 (Peregrino Ferreira et al. Recombinant human beta-CIS interferon); US Patent 4,894,330, January 16, 1990 (Hershenson et al. Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC); US Patent 5,004,605, April 2, 1991 (Hershenson et al. Low pH pharmaceutical compositions of recombinant .beta.-interferon); US Patent 6,923,956, August 2, 2005 (Tschope et al. Liquid interferon-.beta. formulations); RU 2006 123 539 А (Парк Дзи-Соок и др. Способ очистки интерферона бета).A lot of patent research has been devoted to the production and purification technology of rIFNβ-1b, including: US Patent 5,795,779, August 18, 1998 (McCormick et al. Human interferon-.beta. (IFN-.beta.) Produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells); US Patent 6,323,006, November 27, 2001 (Peregrino Ferreira et al. Recombinant human beta-CIS interferon); US Patent 4,894,330, January 16, 1990 (Hershenson et al. Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC); US Patent 5,004,605, April 2, 1991 (Hershenson et al. Low pH pharmaceutical compositions of recombinant .beta.-interferon); US Patent 6,923,956, August 2, 2005 (Tschope et al. Liquid interferon-.beta. Formulations); RU 2006 123 539 A (Park Dzi-Sook and others. The method of purification of interferon beta).

Известен способ получения рекомбинантного интерферона бета-1b (рИФН бета-1b) человека в нерастворимой форме - в виде тел включения (пат. РФ № 2261913, МПК C12N 15/22, опубл. 2005)A known method of producing recombinant interferon beta-1b (rIFN beta-1b) of a person in insoluble form - in the form of inclusion bodies (US Pat. RF No. 2261913, IPC C12N 15/22, publ. 2005)

По сравнению с растворимой формой экспрессия белка в виде тел включения имеет ряд преимуществ - нерастворимые агрегаты белка не проявляют токсического действия, практически не атакуются протеазами, с высоким выходом выделяются центрифугированием. В то же время существуют проблемы низкого выхода активного корректно сложенного белка после проведения рефолдинга в процессе очистки рИФН бета-1b, что определяется пространственной структурой последнего [М. Karpusas et al. The crystal structure of human interferon b at 2.2-Å resolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. Vol.94. P.1 1813-11818].Compared to the soluble form, the expression of protein in the form of inclusion bodies has several advantages - insoluble protein aggregates do not exhibit toxic effects, are practically not attacked by proteases, and are released by centrifugation in high yield. At the same time, there are problems of a low yield of active correctly folded protein after refolding in the process of purification of rIFN beta-1b, which is determined by the spatial structure of the latter [M. Karpusas et al. The crystal structure of human interferon b at 2.2-Å resolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1997. Vol. 94. P.1 1813-11818].

Известен способ очистки рИФН бета-1b и использованием детергента додецилсульфат натрия при его получении в нерастворимой форме (Патент США 4,530,787, 1985).A known method of purification of rIFN beta-1b and the use of detergent sodium dodecyl sulfate when it is received in insoluble form (US Patent 4,530,787, 1985).

Однако при относительно низкой токсичности этого препарата использование додецилсульфата натрия в технологическом процессе сопряжено с целым рядом препятствий: это соединение вызывает значительную денатурацию целевого белка, его не удается удалить из раствора, что в свою очередь делает невозможной последующую ионообменную хроматографию, необходимую для дальнейшего процесса очистки рИФН бета-1b.However, with the relatively low toxicity of this drug, the use of sodium dodecyl sulfate in the technological process is fraught with a number of obstacles: this compound causes significant denaturation of the target protein, it cannot be removed from the solution, which in turn makes subsequent ion exchange chromatography necessary for the further purification of rIFN impossible beta 1b.

Известен способ очистки рИФН бета-1b, позволяющий избежать указанных недостатков применением в качестве детергента цвиттергента 3-14, который не обладает денатурирующими свойствами, не образует ионных связей, является рН-независимым, может быть удален из раствора, делает возможной ионообменную хроматографию [Russell-Harde D., Knauf M., Croze E. The use of Zwittergent 3-14 in the purification of recombinant human interferon-beta Serl7 (Betaseron). // J. Interferon Cytokine Res. - 1995. - Vol.15(1). - P.31-37].A known method of purification of rIFN beta-1b, which allows to avoid these drawbacks by using zwittergent 3-14 as a detergent, which does not have denaturing properties, does not form ionic bonds, is pH-independent, can be removed from solution, makes ion-exchange chromatography possible [Russell- Harde D., Knauf M., Croze E. The use of Zwittergent 3-14 in the purification of recombinant human interferon-beta Serl7 (Betaseron). // J. Interferon Cytokine Res. - 1995 .-- Vol. 15 (1). - P.31-37].

Известен наиболее близкий к заявленному способ очистки рИФН бета-1b из растворимого состояния с использованием аффинной хроматографии, катионно-обменной хроматографии и диафильтрации (Заявка РФ № 2006123543. «Способ очистки интерферона бета».Known closest to the claimed method for the purification of rIFN beta-1b from a soluble state using affinity chromatography, cation exchange chromatography and diafiltration (RF Application No. 2006123543. "Method for the purification of interferon beta."

Однако в этом способе не учитывается возможность получения названного препарата из тел включения E.coli и не охарактеризованы связанные с этим особенности его очистки.However, this method does not take into account the possibility of obtaining the named preparation from E.coli inclusion bodies and does not characterize the related features of its purification.

Изобретение решает задачу оптимизации условий очистки рИФН бета-1b на этапах отмывки и растворения тел включения E.coli, продуцирующей рекомбинантный интерферон бета-1b человека, в ходе технологического процесса рефолдинга целевого белка, а также при окислении последнего.The invention solves the problem of optimizing the purification conditions of rIFN beta-1b at the stages of washing and dissolving E.coli inclusion bodies, which produces recombinant human interferon beta-1b, during the process of refolding the target protein, as well as during the oxidation of the latter.

Заявляемый способ очистки рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli предусматривает следующие основные стадии: (1) отмывка тел включения; (2) растворение тел включения; (3) рефолдинг целевого белка; (4) прехроматографическая подготовка образца; (5) хроматография на Ceramic S; (6) хроматография на Source S30; (7) окисление; (8) гель-фильтрация на Superdex 75 Prep grade; (9) хроматография на Source Q30; (10) гель-фильтрация на Sephacril S200HR; (11) контроль эффективности очистки целевого белка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с последующим стандартным определением его противовирусной активности.The inventive method of purification of recombinant interferon beta-1b from inclusion bodies of E. coli comprises the following main steps: (1) washing the inclusion bodies; (2) dissolution of inclusion bodies; (3) refolding the target protein; (4) prechromatographic sample preparation; (5) chromatography on Ceramic S; (6) chromatography on Source S30; (7) oxidation; (8) gel filtration on Superdex 75 Prep grade; (9) chromatography on Source Q30; (10) gel filtration on Sephacril S200HR; (11) monitoring the efficiency of purification of the target protein by high performance liquid chromatography (HPLC) followed by a standard definition of its antiviral activity.

Отличительными особенностями заявляемого способа являются:Distinctive features of the proposed method are:

- в ходе отмывки тел включения навеску размороженных тел включения ресуспендировали в 10 мл 2% водного раствора цвиттергента 3-14;- during washing of inclusion bodies, a portion of thawed inclusion bodies was resuspended in 10 ml of a 2% aqueous solution of zwittergent 3-14;

- раствор для рефолдинга целевого белка содержит 20 мМ Трис-HCl, pH 9.0, 0,2% полиэтиленгликоль (PEG) 3550, 300 мМ NaCl, 2 мМ восстановленного глутатиона (GSH), 1 мМ окисленного глутатиона (GSSG), 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,05% цвиттергента 3-14;- the solution for refolding the target protein contains 20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.2% polyethylene glycol (PEG) 3550, 300 mM NaCl, 2 mM reduced glutathione (GSH), 1 mM oxidized glutathione (GSSG), 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.05% of zwittergent 3-14;

- в ходе предхроматографической подготовки образца используют буфер Б следующего состава: 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонил-флуорида (PMSF);- during prechromatographic preparation of the sample, buffer B of the following composition is used: 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% zwittergent 3-14, 0.5 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF);

- в процессе хроматографии используют буферы: (1) 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; (2) 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ NaCl, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; (3) 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1 М NaCl, 0,05% Цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF;- buffers are used in the chromatography process: (1) 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% zwittergent 3-14, 0.5 mM PMSF; (2) 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.05% zwittergent 3-14, 0.5 mM PMSF; (3) 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 0.05% Zwittergent 3-14, 0.5 mM PMSF;

- для окисления целевого белка используют смесь цистеамин/цистамин в концентрации 1 мМ/0,1 мМ.- for the oxidation of the target protein using a mixture of cysteamine / cystamine at a concentration of 1 mm / 0.1 mm.

Контроль выхода и активности рекомбинантного интерферона бета-1b после очистки показал соответствие следующим критериям: выход 10%, мультимеры по гель-фильтрации <5%, родственные белки по обращенно-фазовой хроматографии <5%, родственные белки по электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) <5%, белки штамма-продуцента по иммуноферментному анализу (ИФА) <5 нг/мг, эндотоксины по LAL-тесту (тесту с применением "Limulus Amebocite Lisate" - лизата клеток краба-мечехвоста) <5 ЭЕ/мг (эквивалентных единиц на 1 миллиграмм), удельная активность интерферона бета-1b 32 млн МЕ/мг (Международных Единиц на 1 миллиграмм).Control of the yield and activity of recombinant interferon beta-1b after purification showed compliance with the following criteria: yield 10%, multimers by gel filtration <5%, related proteins by reverse phase chromatography <5%, related proteins by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of dodecyl sulfate sodium (SDS-PAGE) <5%, proteins of the producer strain by enzyme immunoassay (ELISA) <5 ng / mg, endotoxins by the LAL test (test using the Limulus Amebocite Lisate - crab-horseshoe crab cell lysate) <5 EE / mg (equivalent units per 1 milligram), specific Activity I interferon beta-1b 32 million IU / mg (International Units per 1 mg).

Изобретение иллюстрируют примеры.The invention is illustrated by examples.

Пример 1. Оптимизация рефолдинга и окисления рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli с использованием цвиттергента 3-14Example 1. Optimization of refolding and oxidation of recombinant interferon beta-1b from E.coli inclusion bodies using zwittergent 3-14

Целесообразность использования цвиттергента 3-14 в процессе растворения и рефолдинга рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli потребовала оптимизации условий их выполнения. С этой целью были составлены полуэмпирические формулы, и на их основе осуществлен подбор оптимального соотношения ингредиентов в процессе рефолдинга целевого белка и его окисления из предполагаемого интервала значений, как это представлено в таблицах 1-2 и формулах 1-2.The feasibility of using zwittergent 3-14 in the process of dissolution and refolding of recombinant interferon beta-1b from E.coli inclusion bodies required optimization of their conditions. For this purpose, semi-empirical formulas were compiled, and based on them, the optimal ratio of ingredients was selected in the process of refolding the target protein and its oxidation from the expected range of values, as shown in tables 1-2 and formulas 1-2.

Таблица 1Table 1 Определение общего соотношения параметров ингредиентов в процессе рефолдинга рИФН бета-1bDetermination of the general ratio of parameters of ingredients in the process of refolding rIFN beta-1b ПеременнаяVariable ОписаниеDescription Верхнее значениеUpper value Нижнее значениеLower value AA pHpH 7,57.5 9,09.0 BB Полиэтиленгликоль 3550Polyethylene glycol 3550 0%0% 0,1%0.1% CC МочевинаUrea 0 M0 M   DD NaClNaCl 50 мМ50 mm 300 мМ300 mm ЕE Цистеамин/цистаминCysteamine / cystamine 1 мМ/0,3 мМ1 mm / 0.3 mm 1 мМ/0,1 мМ1 mm / 0.1 mm FF Цвиттергент 3-14Zwittergent 3-14   25%25% GG ТемператураTemperature 10°C10 ° C  

Формула 1. Общее соотношение параметров ингредиентов с обозначением их взаимозависимости:Formula 1. The general ratio of the parameters of the ingredients with the designation of their interdependence:

Таблица 2table 2 Определение соотношения параметров ингредиентов в процессе окисления ИФН бета-1bDetermination of the ratio of parameters of ingredients in the oxidation process of IFN beta-1b ПеременнаяVariable ОписаниеDescription Верхнее значениеUpper value Нижнее значениеLower value AA pHpH 7,57.5 9,09.0 BB Полиэтиленгликоль 3550Polyethylene glycol 3550 0%0% 0,1%0.1% DD NaClNaCl 50 Мм50 mm 300 Мм300 mm EE Цистеамин/цистаминCysteamine / cystamine 1 Мм/0,3 Мм1 mm / 0.3 mm 1 Мм/0,1 Мм1 mm / 0.1 mm

Формула 2. Соотношение изолированной группы параметров с обозначением их взаимозависимости:Formula 2. The ratio of an isolated group of parameters with a designation of their interdependence:

В конечном итоге были установлены следующие финальные параметры выполнения рефолдинга и окисления ИФН бета-1b:Ultimately, the following final parameters were established for performing the refolding and oxidation of IFN beta-1b:

- Цвиттергент 3-14: 0,05%;- Zwittergent 3-14: 0.05%;

- Трис-HCl, 10 мМ: рН 7,5;- Tris-HCl, 10 mM: pH 7.5;

- Температура: +10°С;- Temperature: + 10 ° C;

- Nacl: 50 мМ;- Nacl: 50 mM;

- ЭДТА-Na: 1 мМ;- EDTA-Na: 1 mm;

- Цистеамин/цистамин: 1 мМ/0,1 мМ.- Cysteamine / cystamine: 1 mM / 0.1 mM.

Соблюдение этих условий позволяло добиваться 70% выхода целевого белка после осуществления рефолдинга и 10% выхода после полного цикла очистки.Compliance with these conditions allowed us to achieve 70% yield of the target protein after refolding and 10% yield after a full purification cycle.

Пример 2. Очистка рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coliExample 2. Purification of recombinant interferon beta-1b from inclusion bodies of E. coli

Отмывка, растворение и рефолдинг тел включения. В процессе растворения и рефолдинга тел включения использовался буфер А следующего состава: 7 М гуанидин хлорид, 20 мМ дитиотреитол (DTT), 0,5 мМ PMSF.Washing, dissolving and refolding inclusion bodies. In the process of dissolution and refolding of inclusion bodies, buffer A of the following composition was used: 7 M guanidine chloride, 20 mM dithiothreitol (DTT), 0.5 mM PMSF.

Навеску размороженных тел включения (500 мг) ресуспендировали в 10 мл 2% водного раствора цвиттергента 3-14, суспензию перемешивали в течение 10-15 мин при комнатной температуре и центрифугировали при ускорении 500g и температуре 4°С 15 минут. Супернатант удаляли и повторяли процедуру центрифугирования. Выход по белку на этой стадии ~50-60%.A portion of thawed inclusion bodies (500 mg) was resuspended in 10 ml of a 2% aqueous solution of zwittergent 3-14, the suspension was stirred for 10-15 minutes at room temperature and centrifuged at 500g at a temperature of 4 ° C for 15 minutes. The supernatant was removed and the centrifugation procedure was repeated. The protein yield at this stage is ~ 50-60%.

250 мг отмытых телец включения ресуспендировали в 2,5 мл буфера А, суспензию инкубировали 2 часа при 60°С. Нерастворившийся материал удаляли центрифугированием с ускорением 12000g при температуре 4°С 10 мин.250 mg of washed inclusion bodies were resuspended in 2.5 ml of buffer A, the suspension was incubated for 2 hours at 60 ° C. Insoluble material was removed by centrifugation with an acceleration of 12000g at a temperature of 4 ° C for 10 min.

Готовили раствор для рефолдинга (указаны конечные концентрации компонентов, конечный объем 50 мл) - 20 мМ Трис-HCl, pH 9.0, 0,2% PEG 3550, 300 мМ NaCl, 2 мМ восстановленного глутатиона (GSH), 1 мМ окисленного глутатиона (GSSG), 2 мМ ЭДТА, 0,05% цвиттергент 3-14 - и добавляли в него растворенные в буфере А тела включения. Полученный раствор перемешивали и инкубировали при 10°С в течение ночи.A refolding solution was prepared (final component concentrations, final volume 50 ml indicated) - 20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.2% PEG 3550, 300 mM NaCl, 2 mM reduced glutathione (GSH), 1 mM oxidized glutathione (GSSG ), 2 mM EDTA, 0.05% zwittergent 3-14 - and inclusion bodies dissolved in buffer A were added to it. The resulting solution was stirred and incubated at 10 ° C. overnight.

Предхроматографическая подготовка образца. Использовался буфер Б следующего состава: 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF.Prechromatographic sample preparation. Buffer B of the following composition was used: 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% zwittergent 3-14, 0.5 mM PMSF.

Полученный в растворе образец разбавляли буфером Б в 6 раз, выпавший осадок удаляли центрифугированием (14000g, 20 мин, 4°С). В супернатанте доводили pH и проводимость до соответствующих значений буфера Б, после чего его концентрировали до исходного объема на ультрафильтрационной ячейке Amicon (мембрана РМ-10) и затем центрифугировали (14000g, 10 мин, 4°С).The sample obtained in solution was diluted 6 times with buffer B, the precipitate was removed by centrifugation (14000g, 20 min, 4 ° C). In the supernatant, the pH and conductivity were adjusted to the corresponding values of buffer B, after which it was concentrated to the initial volume on an Amicon ultrafiltration cell (PM-10 membrane) and then centrifuged (14000g, 10 min, 4 ° С).

Хроматографическая очистка рИФН бета-1b, его окисление и гелъ-филътрация. Для стабильности процесса очистки на данном этапе использовались буферы: Б - 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; В - 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; Г - 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 М NaCl, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF.Chromatographic purification of rIFN beta-1b, its oxidation and gel filtration. For the stability of the cleaning process at this stage, the following buffers were used: B - 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% zwittergent 3-14, 0.5 mM PMSF; B - 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05% zwittergent 3-14, 0.5 mM PMSF; G - 25 mm Tris-HCl, pH 7.5, 1 M NaCl, 0.05% zwittergent 3-14, 0.5 mm PMSF.

Подготовленный образец растворенных тел включения вводили (3 мл/мин) на колонку HyperD Ceramic S (Ciphergen, 10/100 мм, максимальное давление 30 атм), уравновешенную 10 объемами буфера Б. Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Проскок в объеме нанесенного образца (50 мл) собирали и связавшиеся примесные вещества удаляли промывкой 3 объемами буфера Г. Колонку регенерировали 1 объемом 100 мМ NaOH и уравновешивали стартовым буфером (Б).The prepared sample of dissolved inclusion bodies was injected (3 ml / min) onto a HyperD Ceramic S column (Ciphergen, 10/100 mm, maximum pressure 30 atm), balanced with 10 volumes of buffer B. The optical density of the eluate was controlled spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm. The breakthrough in the volume of the applied sample (50 ml) was collected and the bound impurities were removed by washing with 3 volumes of buffer G. The column was regenerated with 1 volume of 100 mM NaOH and balanced with start buffer (B).

Порцию образца (10 мл) наносили на колонку Source S30 (10/100 мм, максимальное давление 30 атм, 2,5 мл/мин), уравновешенную 10 объемами буфера Б, собирая проскок. Колонку промывали 2-5 объемами буфера Б и элюировали связавшийся материал градиентом концентрации NaCl (0-500 мМ, 5 объемов колонки, 3 мл/мин). Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Собирали фракцию, выходящую в 150-200 мМ NaCl. Перед нанесением следующей порции образца колонку регенерировали 1 объемом 100 мМ NaOH и уравновешивали стартовым буфером (Б). Процедуру повторяли для объединенного проскока с колонки Source S30.A portion of the sample (10 ml) was applied to a Source S30 column (10/100 mm, maximum pressure 30 atm, 2.5 ml / min) balanced with 10 volumes of buffer B, collecting a breakthrough. The column was washed with 2-5 volumes of buffer B and bound material was eluted with a NaCl concentration gradient (0-500 mM, 5 column volumes, 3 ml / min). The optical density of the eluate was controlled spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm. The fraction leaving 150-200 mM NaCl was collected. Before applying the next portion of the sample, the column was regenerated with 1 volume of 100 mM NaOH and balanced with start buffer (B). The procedure was repeated for the combined slip from the Source S30 column.

Собранные фракции рИФН бета-1b объединяли и в полученный раствор добавляли цистеамин/цистамин до концентрации 1 мМ/0,1 мМ. Образец инкубировали в течение ночи при 4°С, центрифугировали (12000g, 4°С, 10 мин) и супернатант концентрировали до 1,5 мл на ультрафильтрационной ячейке Amicon (мембрана РМ-10).The collected rIFN beta-1b fractions were combined and cysteamine / cystamine was added to the resulting solution to a concentration of 1 mM / 0.1 mM. The sample was incubated overnight at 4 ° C, centrifuged (12000g, 4 ° C, 10 min) and the supernatant was concentrated to 1.5 ml on an Amicon ultrafiltration cell (PM-10 membrane).

Образец окисленного рИФН бета-1b (1,5 мл) вводили на колонку Superdex 75 Prep grade (16/500 мм, 13000 т.т./м, максимальное давление 5 атм), уравновешенную буфером В Разделение вели в буфере В, на скорости 30 см/ч. Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм (нанометров). Собирали основную фракцию (время удерживания 39,25 мин).A sample of oxidized rIFN beta-1b (1.5 ml) was injected onto a Superdex 75 Prep grade column (16/500 mm, 13000 tp / m, maximum pressure 5 atm) balanced by buffer B. Separation was carried out in buffer B, at a speed 30 cm / h The optical density of the eluate was controlled spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm (nanometers). The main fraction was collected (retention time 39.25 min).

Образец рИФН бета-1b наносили на колонку Source Q30 (10/100 мм, максимальное давление 30 атм (атмосфер), 2,5 мл/мин), уравновешенную 10 объемами буфера В, собирая проскок. Колонку промывали 2-5 объемами буфера В и элюировали связавшийся материал градиентом концентрации NaCl (50-1000 мМ, 10 объемов колонки, 4 мл/мин). Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Собирали фракцию, выходящую в 200-300 мМ NaCl. Колонку регенерировали промывкой 1 объемом 100 мМ HCl. Собранную фракцию концентрировали до 1 мл на ультрафильтрационной ячейке Amicon (мембрана РМ-10).A rIFN beta-1b sample was applied to a Source Q30 column (10/100 mm, maximum pressure 30 atm (atmospheres), 2.5 ml / min), balanced with 10 volumes of buffer B, collecting a breakthrough. The column was washed with 2-5 volumes of buffer B and bound material was eluted with a NaCl concentration gradient (50-1000 mM, 10 column volumes, 4 ml / min). The optical density of the eluate was controlled spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm. The fraction leaving 200-300 mM NaCl was collected. The column was regenerated by washing 1 with a volume of 100 mM HCl. The collected fraction was concentrated to 1 ml on an Amicon ultrafiltration cell (PM-10 membrane).

Образец рИФНβ-1b (1 мл) вводили на колонку Sephacryl S200HR (16/600 мм, >5000 т.т./м, максимальное давление 1,5 атм), уравновешенную буфером В. Разделение вели в буфере В на скорости 15 см/ч. Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Собирали основную фракцию (время удерживания 95,3 мин).A sample of rIFNβ-1b (1 ml) was injected onto a Sephacryl S200HR column (16/600 mm,> 5000 tp / m, maximum pressure 1.5 atm) balanced with buffer B. Separation was carried out in buffer B at a speed of 15 cm / hours The optical density of the eluate was controlled spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm. The main fraction was collected (retention time 95.3 min).

Пример 3. Контроль эффективности способа очистки рекомбинантного интерферона β-1b из тел включения E.coliExample 3. Monitoring the effectiveness of the method of purification of recombinant interferon β-1b from inclusion bodies of E. coli

Эффективность предложенного способа очистки рИФНβ-1b контролировалась в процессе получения 11 партий опытных образцов препарата с последующим определением их противовирусной активности. Протоколы получения даух опытных партий представлены в таблицах 3 и 4.The effectiveness of the proposed method for purification of rIFNβ-1b was monitored in the process of obtaining 11 batches of experimental samples of the drug with subsequent determination of their antiviral activity. The protocols for obtaining duh of experimental batches are presented in tables 3 and 4.

При получении опытной партии S4/2401 количество тел включения E.coli до отмывки составляло 500 мг, после отмывки - 230 мг. Конечное содержание рИФН бета-1b составляло 1,88 мг (10%).Upon receipt of the experimental batch S4 / 2401, the number of E.coli inclusion bodies before washing was 500 mg, after washing, 230 mg. The final rIFN beta-1b content was 1.88 mg (10%).

В процессе получения опытной партии S4/1301 количество тел включения E.coli до отмывки составляло 1000 мг, после отмывки - 460 мг. Конечное содержание рИФН бета-1b составляло 3,76 мг (10%).In the process of obtaining the experimental batch S4 / 1301, the number of E.coli inclusion bodies before washing was 1000 mg, after washing, 460 mg. The final rIFN beta-1b content was 3.76 mg (10%).

Оценку биологической (антивирусной) активности 11 образцов рекомбинантного ИНФ бета-1b проводили в диплоидной культуре фибробластов человека М27 (НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН). В качестве тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС) в количестве 100 ЦТД₅₀ (цитотоксическая доза, вызывающая цитотоксический эффект у 50% образцов клеточных культур). За единицу активности ИФН принимали величину, обратную его разведению, при которой наблюдается 50% защита клеток от цитодеструктивного действия, вызванного репликацией тест-вируса. Контролем служил образец препарата «Бетаферон» (Schering AG, USA). Протокол титрования представлен в таблице 5.The biological (antiviral) activity of 11 samples of recombinant INF-beta-1b was evaluated in a diploid culture of M27 human fibroblasts (Research Institute of Poliomyelitis and Virus Encephalitis named after M.P. Chumakov RAMS). Mouse encephalomyocarditis virus (EMC) in the amount of 100 CTD ₅₀ (cytotoxic dose causing a cytotoxic effect in 50% of cell culture samples) was used as a test virus. The unit of IFN activity was taken to be the reciprocal of its dilution, at which a 50% protection of cells from cyto-destructive action caused by replication of the test virus is observed. The control was a sample of Betaferon (Schering AG, USA). The titration protocol is presented in table 5.

Таблица 3Table 3 Протокол получения опытной партии S4/2401 рИФН бета-1bThe protocol for obtaining the experimental batch S4 / 2401 rIFN beta-1b № п/пNo. p / p Объем, млVolume ml Стадия процессаProcess stage Чистота по ВЭЖХ, %HPLC purity,% Кол-во по ВЭЖХ, мгHPLC, mg Выход стадии по ВЭЖХ, %The output of the stage by HPLC,% Общий выход, %Total yield,% LAL, ЕЭ/мгLAL, EE / mg Белки E.coli, нг/мгProteins of E. coli, ng / mg 1one 20twenty Исходные тела включенияSource inclusion bodies -- 18,818.8 -- 100%one hundred% -- -- 22 99 Отмытые тела включенияWashed inclusion bodies -- 11,111.1 59%59% 59%59% -- -- 33 211211 Солюбилизация в цвиттергенте 3-14Solubilization in Zwittergent 3-14 -- 5,65,6 51%51% 30%thirty% -- 2947229472 4four 4040 Хроматография на Source S30Chromatography on Source S30 -- 4,04.0 72%72% 22%22% -- 1705,11705.1 55 4040 ОкислениеOxidation 91%91% 3,93.9 96%96% 21%21% -- 897,63897.63 66 15fifteen Гель-фильтрация на Superdex 75Gel filtration on Superdex 75 95,6%95.6% 2,42,4 62%62% 13%13% -- 1532,61532.6 77 2424 Хроматография на Source Q30Source Q30 Chromatography 95,1%95.1% 2,42,4 97%97% 12%12% -- 1645,61645.6 88 88 Гель-фильтрация на Sephacril S200HRGel filtration on Sephacril S200HR 97,9%97.9% 2,12.1 88%88% 11%eleven% -- 1413,71413.7 99 50fifty Хроматография на Source C4/G25Chromatography on Source C4 / G25 -- 1,881.88 71%71% 10%10% -- -- 1010 Готовая формаFinished form 33 3,43.4

Таблица 4Table 4 Протокол получения опытной партии S4/1301 рИФН бета-1bThe Protocol of obtaining the pilot batch S4 / 1301 rIFN beta-1b № п/пNo. p / p Объем, млVolume ml Стадия процессаProcess stage Чистота по ВЭЖХ, %HPLC purity,% Кол-во по ВЭЖХ, мгHPLC, mg Выход стадии по ВЭЖХ, %The output of the stage by HPLC,% Общий выход, %Total yield,% LAL, ЕЭ/мгLAL, EE / mg Белки E.coli, нг/мгProteins of E. coli, ng / mg 1one 4040 Исходные тела включенияSource inclusion bodies -- 37,637.6 -- 100%one hundred% -- -- 22 18eighteen Отмытые тела включенияWashed inclusion bodies -- 22,222.2 59%59% 59%59% -- -- 33 200200 РефолдингRefolding -- 18,218.2 82%82% 48%48% -- -- 4four 200200 Обессоливание/ концентрированиеDesalination / Concentration -- 16,316.3 90%90% 43%43% -- 2947229472 55 20twenty Хроматография на Source S30Chromatography on Source S30 -- 11,311.3 69%69% 30%thirty% -- 17051705 66 5,55.5 Окисление/концентрированиеOxidation / Concentration 59,859.8 12,012.0 107%107% 32%32% -- 897,6897.6 77 2727 Гель-фильтрация на Superdex 75Gel filtration on Superdex 75 90,790.7 8,48.4 70%70% 22%22% -- 15331533 88 30thirty Хроматография на Source Q30Source Q30 Chromatography 87,987.9 6,76.7 79%79% 18%eighteen% -- 16461646 99 7,57.5 Гель-фильтрация на Sephacril S200HRGel filtration on Sephacril S200HR 97,097.0 4,74.7 71%71% 13%13% -- 14141414 1010 4,54,5 Хроматография на Source C4/G25Chromatography on Source C4 / G25 96,596.5 3,763.76 68%68% 10%10% -- -- 11eleven 55 Готовая формаFinished form 33 3,43.4 Таблица 5Table 5 Результаты титрования образцов рИФHβ-1bTitration Results of rIFHβ-1b Samples Образцы рИФНр-1bRIFNr-1b samples Содержание ИФНIFN Content В объемеIn volume Титр интерферона, Ед/0,2 млInterferon titer, U / 0.2 ml Средняя удельная активностьAverage specific activity №1No. 1 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 6,4×10⁵ 6.4 × 10 ⁵   №2Number 2 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 7,56×10⁵ 7.56 × 10 ⁵   №3Number 3 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 6,4×10⁵ 6.4 × 10 ⁵   №4Number 4 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 7,56×10⁵ 7.56 × 10 ⁵   №5Number 5 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 8,2×10⁵ 8.2 × 10 ⁵   №6Number 6 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 7,56×10⁵ 7.56 × 10 ⁵ 32×10⁶ МЕ/мг32 × 10 ⁶ IU / mg №9Number 9 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 7,56×10⁵ 7.56 × 10 ⁵   №10Number 10 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 7,56×10⁵ 7.56 × 10 ⁵   №11Number 11 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 6,4×10⁵ 6.4 × 10 ⁵   Контроль (Бетаферон)Control (Betaferon) 0,023 мг0.023 mg 0,5 мл0.5 ml 6,4×10⁵ 6.4 × 10 ⁵ 30×10⁶ МЕ/мг30 × 10 ⁶ IU / mg

Как показывают протоколы исследований, предлагаемый оптимизированный способ очистки позволяет получить субстанцию рИФН бета-1b в полной мере отвечающей требованиям нормативных документов, при этом полученный рИФН бета-1b по удельной противовирусной активности не уступает зарубежному аналогу Бетаферону. В целом предлагаемый способ очистки тел включения E.coli позволяет получить субстанцию рИФН бета-1b со следующими показателями:According to the research protocols, the proposed optimized purification method allows to obtain the substance rIFN beta-1b fully meeting the requirements of regulatory documents, while the obtained rIFN beta-1b in terms of specific antiviral activity is not inferior to the foreign counterpart Betaferon. In general, the proposed method for cleaning inclusion bodies of E. coli allows to obtain the substance rIFN beta-1b with the following indicators:

- выход целевого белка: 10%;- yield of the target protein: 10%;

- мультимеры по гель-фильтрации: <5%;- multimers for gel filtration: <5%;

- родственные белки по обращенно-фазовой хроматографии: <5%;- related proteins by reverse phase chromatography: <5%;

- родственные белки по ДСН-ПААГ: <5%;- related proteins for SDS-PAGE: <5%;

- белки штамма-продуцента по ИФА: <5 нг/мг;- proteins of the producer strain by ELISA: <5 ng / mg;

- эндотоксины по ЛАЛ-тесту: <5 ЭЕ/мг;- endotoxins according to the LAL test: <5 EU / mg;

- удельная активность: 32 млн МЕ/мг.- specific activity: 32 million IU / mg.

Claims (1)

Способ очистки рекомбинантного интерферона β-1b из тел включения E.coli, включающий отмывку тел включения в 10 мл 2%-ного водного раствора цвиттергента 3-14 с последующим удалением нерастворившегося материала центрифугированием с использованием промывочного буферного раствора с pH 7,5, растворение тел включения в буфере, содержащем 7 М гуанидинхлорида, 20 мМ дитиотреитола и 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, рефолдинг целевого белка в растворе, содержащем 20 мМ Трис-HCl, pH 9,0, 0,2% полиэтиленгликоля 3550, 300 мМ NaCl, 2 мМ восстановленного глутатиона, 1 мМ окисленного глутатиона, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,05% Цвиттергента 3-14 с последующими прехроматографической подготовкой образца с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,05% Цвиттергент 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, хроматографией на Ceramic S с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, хроматографией на Source S30 с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, окислением смесью цистеамина с цистамином в концентрации 1 мМ/0,1 мМ соответственно, гель-фильтрацией на Superdex 75 Prep grade с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, хроматографией на Source Q30 с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида и гель-фильтрацией на Sephacril S200HR с использованием буфера, содержащего 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50
мМ NaCl, 0,05% Цвиттергента 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонилфлуорида, а контроль эффективности очистки целевого белка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующим стандартным определением его противовирусной активности. The method of purification of recombinant interferon β-1b from E.coli inclusion bodies, including washing the inclusion bodies in 10 ml of a 2% aqueous solution of zwittergent 3-14, followed by removal of insoluble material by centrifugation using a washing buffer solution with pH 7.5, dissolving the bodies inclusion in a buffer containing 7 M guanidinochloride, 20 mm dithiothreitol and 0.5 mm phenylmethanesulfonyl fluoride, refolding the target protein in a solution containing 20 mm Tris-HCl, pH 9.0, 0.2% polyethylene glycol 3550, 300 mm NaCl, 2 mm reduced glutathione, 1 mM oxide glutathione, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid and 0.05% Zwittergent 3-14 followed by prechromatographic preparation of the sample using buffer containing 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% Zwittergent 3-14, 0.5 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, chromatography on Ceramic S using a buffer containing 25 mm Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% Zwittergent 3-14, 0.5 mm phenylmethanesulfonyl fluoride, chromatography on Source S30 using a buffer containing 25 mm Tris- HCl, pH 8.0, 0.05% Zwittergent 3-14, 0.5 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, oxidation with a cysteamine mixture with cystamine at a concentration of 1 mm / 0.1 mm, respectively, gel filtration on Superdex 75 Prep grade using a buffer containing 25 mm Tris-HCl, pH 7.5, 50 mm NaCl, 0.05% Zwittergent 3-14, 0.5 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, chromatography on Source Q30 using a buffer containing 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05% Zwittergent 3-14, 0.5 mM phenylmethanesulfonyl fluoride and gel filtration on Sephacril S200HR using a buffer containing 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50
mM NaCl, 0.05% Zwittergent 3-14, 0.5 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, and control the efficiency of purification of the target protein by high performance liquid chromatography followed by standard determination of its antiviral activity.