RU2391353C2 - Polypeptide with growth hormone receptor agonist properties, nucleic acid coding said polypeptide, expression vector thereof and cell producing said polypeptide - Google Patents
Polypeptide with growth hormone receptor agonist properties, nucleic acid coding said polypeptide, expression vector thereof and cell producing said polypeptide Download PDFInfo
- Publication number
- RU2391353C2 RU2391353C2 RU2007106043/13A RU2007106043A RU2391353C2 RU 2391353 C2 RU2391353 C2 RU 2391353C2 RU 2007106043/13 A RU2007106043/13 A RU 2007106043/13A RU 2007106043 A RU2007106043 A RU 2007106043A RU 2391353 C2 RU2391353 C2 RU 2391353C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- growth hormone
- linker
- domains
- tandem
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Данное изобретение относится к полипептидам, содержащим по меньшей мере два домена, способных связываться с рецептором цитокина, где данные домены соединены пептидной линкерной молекулой.This invention relates to polypeptides containing at least two domains capable of binding to a cytokine receptor, where these domains are connected by a peptide linker molecule.
Группа факторов роста, именуемых цитокинами, участвует в целом ряде различных клеточных функций. Эти функции включают, в качестве примера, но не как ограничение, модуляцию иммунной системы, регуляцию энергетического метаболизма и контроль роста и развития. Цитокины опосредуют свои эффекты посредством рецепторов, экспрессируемых на клеточной поверхности клеток-мишеней. Рецепторы цитокинов можно разделить на три отдельные подгруппы. Рецепторы типа 1 (семейство гормона роста (GH)) характеризуются четырьмя консервативными остатками цистеина в аминоконцевой части их внеклеточного домена и присутствием консервативного мотива Trp-Sex-Xaa-Trp-Ser в С-концевой части. Повторяющийся Cys мотив также присутствует у типа 2 (семейство интерферона) и типа 3 (семейство фактора некроза опухолей).A group of growth factors called cytokines is involved in a number of different cellular functions. These functions include, by way of example, but not limitation, modulation of the immune system, regulation of energy metabolism, and control of growth and development. Cytokines mediate their effects through receptors expressed on the cell surface of target cells. Cytokine receptors can be divided into three separate subgroups.
Известно, что многие домены цитокинов взаимодействуют со своим распознающим рецептором через специфические сайты. Некоторые рецепторы цитокинов имеют как сайты связывания домена с высоким сродством, так и сайты связывания с низким сродством.It is known that many cytokine domains interact with their recognition receptor through specific sites. Some cytokine receptors have both high affinity domain binding sites and low affinity binding sites.
Например, известно, что одна молекула GH связывается с двумя молекулами рецептора (GHR) (Cunningham et al., 1991; de Vos et al., 1992; Sundstrom et al., 1996; Clackson et al., 1998). Это осуществляется через два уникальных рецептор-связывающих сайта на GH и общий карман связывания на внеклеточном домене двух рецепторов. Сайт 1 на молекуле GH имеет более высокое сродство, чем сайт 2, и полагают, что димеризация рецептора происходит последовательно, причем один рецептор связывается с сайтом 1 на GH, с последующим рекрутированием второго рецептора к сайту 2. Внеклеточный домен GHR существует в виде двух связанных доменов, причем каждый из них состоит приблизительно из 100 аминокислот. Именно конформационное изменение в этих двух доменах происходит при связывании гормона с образованием тримерного комплекса GHR-GH-GHR. После интернализации комплекса GHR-GH-GHR следует стадия рециклинга, посредством чего молекула рецептора регенерируется для дальнейшего использования в клетке.For example, it is known that one GH molecule binds to two receptor molecules (GHR) (Cunningham et al., 1991; de Vos et al., 1992; Sundstrom et al., 1996; Clackson et al., 1998). This is accomplished through two unique GH receptor-binding sites and a common binding pocket on the extracellular domain of the two receptors.
Цитокины и другие домены часто образуют комплексы рецептор-домен при связывании. Рецепторы, участвующие в образовании комплексов, могут быть гомогенными или гетерогенными. Например, эритропоэтин и GH образуют тримерный комплекс рецептор-гормон-рецептор. Интерлейкин-4 образует тримерный комплекс рецептор-гормон-другой рецептор. Фактор некроза опухолей индуцирует сигнал через образование гомотипных тримеров клеточных трансмембранных рецепторов фактора некроза опухолей, TNF-1/p55 или TNF-2/p75. Другие цитокины, например лептин и GCSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), образуют тетрамерные комплексы рецептор-гормон-гормон-рецептор, а некоторые цитокины (например, интерлейкин 6) возможно образуют гексамерные комплексы, состоящие из двух растворимых рецепторных молекул, двух трансмембранных рецепторных молекул и двух молекул цитокина. В каждом случае существуют первичный сайт связывания с высоким сродством, который локализует цитокин в комплексе с рецептором, и дополнительные сайты, которые играют вторичную роль в изменении конформации или рекрутинге других молекул, инициируя, посредством этого, передачу сигнала.Cytokines and other domains often form receptor-domain complexes upon binding. The receptors involved in the formation of complexes can be homogeneous or heterogeneous. For example, erythropoietin and GH form a receptor-hormone-receptor trimeric complex. Interleukin-4 forms a trimeric complex receptor-hormone-another receptor. Tumor necrosis factor induces a signal through the formation of homotypic trimers of cell transmembrane receptors of tumor necrosis factor TNF-1 / p55 or TNF-2 / p75. Other cytokines, such as leptin and GCSF (granulocyte colony stimulating factor), form tetrameric receptor-hormone-hormone-receptor complexes, and some cytokines (e.g. interleukin 6) possibly form hexamer complexes consisting of two soluble receptor molecules, two transmembrane receptor molecules and two cytokine molecules. In each case, there is a primary binding site with high affinity, which localizes the cytokine in complex with the receptor, and additional sites that play a secondary role in changing the conformation or recruitment of other molecules, thereby initiating signal transmission.
Надсемейство цитокинов TNF (tumour necrosis factor, фактор некроза опухолей) активирует пути передачи сигнала для выживания клеток, их гибели и дифференциации, которые регулируют развитие, организацию и гомеостаз лимфоидной ткани, ткани молочной железы, нервной и эктодермальной ткани. Для TNF продемонстрирована его роль в защите хозяина, которая включает, например, дифференциацию клеток селезенки, полный lgG ответ и переключение изотипа, активацию макрофагов, генерацию оксида азота и радикалов активных форм кислорода. Однако при его сверхэкспрессии TNF также участвует в патогенезе. Доказательство такого участия обнаружили в следующих патологиях: бактериальный сепсис; реакция трансплантат против хозяина; церебральная малярия; ревматоидный артрит; гнездная алопеция / общее облысение; астма; рак; болезнь Крона; диабет; ожирение; псориаз и псориатический артрит; саркоидоз; склеродермия и токсический шок. Эти патологии считают установленными и/или потенциальными патологиями для применений анти-TNF агентов.The superfamily of TNF cytokines (tumor necrosis factor, tumor necrosis factor) activates signal transmission pathways for cell survival, death and differentiation, which regulate the development, organization and homeostasis of lymphoid tissue, breast tissue, nervous and ectodermal tissue. For TNF, its role in host defense has been demonstrated, which includes, for example, differentiation of spleen cells, full IgG response and isotype switching, macrophage activation, generation of nitric oxide and radicals of reactive oxygen species. However, with its overexpression, TNF is also involved in pathogenesis. Evidence of this involvement was found in the following pathologies: bacterial sepsis; graft versus host reaction; cerebral malaria; rheumatoid arthritis; alopecia areata / general alopecia; asthma; cancer; Crohn's disease; diabetes; obesity; psoriasis and psoriatic arthritis; sarcoidosis; scleroderma and toxic shock. These pathologies are considered established and / or potential pathologies for the use of anti-TNF agents.
Сверхэкспрессия цитокинов является причиной целого ряда заболеваний человека, например акромегалии, гигантизма, дефицита GH, синдрома Тернера, почечной недостаточности, остеопороза, остеоартрита, сахарного диабета, рака, ожирения, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, гипертензии, анемии, аутоиммунных и инфекционных заболеваний, воспалительных расстройств, включая ревматоидный артрит.Overexpression of cytokines is the cause of a number of human diseases, such as acromegaly, gigantism, GH deficiency, Turner syndrome, renal failure, osteoporosis, osteoarthritis, diabetes mellitus, cancer, obesity, insulin resistance, hyperlipidemia, hypertension, anemia, autoimmune inflammatory and infectious diseases disorders including rheumatoid arthritis.
Подходом для ингибирования действия цитокинов, например GH, пролактина или TNF, является введение антагонистов.An approach for inhibiting the action of cytokines, for example GH, prolactin or TNF, is the administration of antagonists.
Одним примером антагониста GH является пегвисомант, который представляет собой модифицированную молекулу GH, покрытую полиэтиленгликолем (PEG). Пегвисомант имеет несколько полезных эффектов, включая, например, пониженную скорость клубочковой фильтрации, обусловленную повышенной эффективной молекулярной массой, что обеспечивает снижение дозы, требующейся для получения желательного эффекта [смотри Abuchowski et al J Biol Chem., 252, 3578-3581, (1977)]. Однако следствием пэгилирования является снижение сродства молекулы модифицированного GH к GHR.One example of a GH antagonist is the pegvisomant, which is a modified GH molecule coated with polyethylene glycol (PEG). Pegvisomant has several beneficial effects, including, for example, a reduced glomerular filtration rate due to an increased effective molecular weight, which reduces the dose required to obtain the desired effect [see Abuchowski et al J Biol Chem., 252, 3578-3581, (1977) ]. However, pegylation results in a decrease in the affinity of the modified GH molecule for GHR.
Пример антагониста пролактина раскрыт в WO 03/057729 (которая включена в данное описание изобретения во всей ее полноте посредством ссылки и, более конкретно, последовательности белка и нуклеотидные последовательности, кодирующие указанный антагонист пролактина). Антагонист пролактина содержит модификацию аминокислотной последовательности пролактина человека, которая представляет собой замену остатка глицина в положении 129 остатком аргинина. Модифицированный белок пролактин действует как ингибитор активации рецептора пролактина.An example of a prolactin antagonist is disclosed in WO 03/057729 (which is incorporated herein in its entirety by reference and, more specifically, protein sequences and nucleotide sequences encoding said prolactin antagonist). The prolactin antagonist contains a modification of the amino acid sequence of human prolactin, which is a replacement of the glycine residue at position 129 by the arginine residue. The modified prolactin protein acts as an inhibitor of prolactin receptor activation.
Разработали целый ряд терапевтических стратегий для ингибирования TNF на основе возможности: 1) ингибировать синтез TNF (например, используя ингибиторные цитокины, IL-10; талидомид, кортикостероиды, циклоспорин А; антисмысловые олигонуклеотиды); 2) ингибировать процессинг TNF (например, ингибиторы металлопротеаз (ТАСЕ, TNF-α конвертирующий фермент)); 3) нейтрализовать TNF (например, используя растворимые рецепторы TNF или антитела к TNF).A number of therapeutic strategies have been developed for TNF inhibition based on the ability to: 1) inhibit TNF synthesis (for example, using inhibitory cytokines, IL-10; thalidomide, corticosteroids, cyclosporin A; antisense oligonucleotides); 2) inhibit TNF processing (for example, metalloprotease inhibitors (TACE, TNF-α converting enzyme)); 3) neutralize TNF (for example, using soluble TNF receptors or antibodies to TNF).
Авторы данного изобретения описывают полипептиды, содержащие многочисленные лиганд-связывающие домены цитокиновых рецепторов и их применение в модуляции опосредованной рецептором активации цитокинов.The authors of this invention describe polypeptides containing numerous ligand-binding domains of cytokine receptors and their use in modulating receptor-mediated activation of cytokines.
Согласно одному аспекту данного изобретения предложен полипептид, содержащий по меньшей мере два цитокиновых связывающих домена, способный связываться с цитокиновым рецептором, где данные домены соединены пептидной линкерной молекулой, которая содержит негибкий спиральный участок.According to one aspect of the present invention, there is provided a polypeptide comprising at least two cytokine binding domains capable of binding to a cytokine receptor, wherein these domains are linked by a peptide linker molecule that contains an inflexible helical region.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид действует как антагонист указанного(ых) цитокинового(ых) рецептора(ов). В качестве альтернативы, указанный полипептид действует как агонист.In a preferred embodiment of the invention, said polypeptide acts as an antagonist of said cytokine receptor (s). Alternatively, said polypeptide acts as an agonist.
Предпочтительно полипептид содержит домены, расположенные в тандемном порядке. В предпочтительных воплощениях изобретения данный полипептид содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 доменов в тандемном порядке.Preferably, the polypeptide comprises domains arranged in tandem order. In preferred embodiments of the invention, the polypeptide comprises 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 domains in tandem order.
В еще одном другом предпочтительном воплощении изобретения данный полипептид содержит более 10 доменов в тандемном порядке.In yet another preferred embodiment of the invention, the polypeptide contains more than 10 domains in tandem order.
Предпочтительно негибкий спиральный участок содержит по меньшей мере одну копию мотива А(ЕАААК)хА или ее функциональный вариант. Предпочтительно пептидная линкерная молекула содержит две копии мотива ЕАААК, причем длину молекулы данного пептидного линкера можно увеличить путем пошагового добавления по меньшей мере одной аминокислоты.Preferably, the inflexible spiral portion contains at least one copy of motive A (EAAAC) x A or a functional variant thereof. Preferably, the peptide linker molecule contains two copies of the EAAAK motif, wherein the length of the molecule of the peptide linker can be increased by the stepwise addition of at least one amino acid.
«Функциональный вариант» представляет собой линкерную молекулу, которая может отличаться в аминокислотной последовательности одной или более чем одной заменой, вставкой, делецией, но которая по существу сохраняет спиральную или неспиральную конформацию. Среди предпочтительных вариантов находятся варианты, которые отличаются от эталонной аминокислотной последовательности консервативными аминокислотными заменами. Такие замены представляют собой замены, при которых данная аминокислота заменяется другой аминокислотой со схожими характеристиками. Следующий неограничивающий список аминокислот рассматривают как консервативные замены (сходные): а) аланин, серин и треонин; б) глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота; в) аспарагин и глутамин; г) аргинин, лизин и гистидин; д) изолейцин, лейцин, метионин и валин и е) фенилаланин, тирозин и триптофан. Наиболее предпочтительными являются аминокислотные замены, которые по существу сохраняют гибкий или жесткий спиральный линкерный участок.A “functional variant” is a linker molecule that can differ in amino acid sequence by one or more than one substitution, insertion, deletion, but which essentially retains a helical or non-helical conformation. Among the preferred options are those that differ from the reference amino acid sequence by conservative amino acid substitutions. Such substitutions are substitutions in which a given amino acid is replaced by another amino acid with similar characteristics. The following non-limiting list of amino acids is considered as conservative substitutions (similar): a) alanine, serine and threonine; b) glutamic acid and aspartic acid; c) asparagine and glutamine; g) arginine, lysine and histidine; e) isoleucine, leucine, methionine and valine; and e) phenylalanine, tyrosine and tryptophan. Most preferred are amino acid substitutions that substantially retain a flexible or rigid helical linker region.
В другом предпочтительном воплощении данного изобретения линкерная молекула содержит по меньшей мере один гибкий неспиральный участок.In another preferred embodiment of the invention, the linker molecule comprises at least one flexible non-helical region.
В то время как наличие негибкого спирального участка поддерживает пространственное разделение доменов, как описано выше, наличие гибкого неспирального участка позволяет доменам ориентироваться в связывающие сайты цитокинового(ых) рецептора(ов).While the presence of an inflexible helical region supports the spatial separation of domains, as described above, the presence of a flexible non-helical region allows the domains to orient themselves into the binding sites of the cytokine receptor (s).
В одном воплощении данного изобретения гибкий неспиральный участок расположен на аминотерминальном конце молекулы пептидной линкерной молекулы или около него, тем самым делая возможной ориентацию связывающего домена, находящегося на аминотерминальном конце пептидной линкерной молекулы, по отношению к его распознающему рецептору.In one embodiment of the invention, a flexible non-helical region is located at or near the amino terminal end of the molecule of the peptide linker molecule, thereby making it possible to orient the binding domain located at the amino terminal end of the peptide linker molecule with respect to its recognition receptor.
В другом воплощении данного изобретения гибкий неспиральный участок расположен на карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы или около него, тем самым делая возможной ориентацию связывающего домена, находящегося на карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы, по отношению к его распознающему рецептору.In another embodiment of the invention, a flexible non-helical region is located at or near the carboxyterminal end of the peptide linker molecule, thereby making it possible to orient the binding domain located at the carboxyterminal end of the peptide linker molecule with respect to its recognition receptor.
В еще одном другом воплощении данного изобретения гибкий неспиральный участок расположен на амино- и карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы или около них, тем самым делая возможной ориентацию связывающих доменов, расположенных, соответственно, на амино- и карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы, по отношению к их распознающим рецепторам.In yet another embodiment of the invention, the flexible non-helical region is located at or near the amino and carboxyterminal end of the peptide linker molecule, thereby making it possible to orient the binding domains located respectively at the amino and carboxyterminal end of the peptide linker molecule with respect to their recognizing receptors.
Предпочтительно гибкий неспиральный участок расположен рядом с по меньшей мере одним связывающим доменом. Еще более предпочтительно гибкий неспиральный участок образует соединение между связывающим доменом и негибким спиральным участком.Preferably, the flexible non-helical region is adjacent to at least one binding domain. Even more preferably, the flexible, non-helical region forms a bond between the binding domain and the inflexible helical region.
Еще более предпочтительно негибкий спиральный участок содержит по меньшей мере одну копию мотива А(ЕАААК)хА. Длина негибкого неспирального участка может быть увеличена путем увеличения числа повторов этого мотива А(ЕАААК)хА.Even more preferably, the non-flexible spiral portion contains at least one copy of motif A (EAAAC) x A. The length of the non-flexible non-spiral portion can be increased by increasing the number of repeats of this motif A (EAAAK) x A.
В предпочтительном воплощении данного изобретения «х» в мотиве А(ЕАААК)хА составляет менее 10 копий. Еще более предпочтительно «х» составляет менее 5 копий. Еще более предпочтительно «х» выбран из 1, 2, 3, 4 или 5 копий.In a preferred embodiment of the invention, the “x” in motif A (EAAAK) x A is less than 10 copies. Even more preferably, “x” is less than 5 copies. Even more preferably, “x” is selected from 1, 2, 3, 4 or 5 copies.
В предпочтительном воплощении данного изобретения не существует гибких соединений между жесткими альфа-спиральными линкерами и связывающими доменами, но указанные связывающие домены непосредственно связаны негибким альфа-спиральным линкером.In a preferred embodiment of the present invention, there are no flexible compounds between rigid alpha-helical linkers and binding domains, but said binding domains are directly linked by an inflexible alpha-helical linker.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные связывающие домены соединены соединительной молекулой, состоящей из негибкой альфа-спирали.In a preferred embodiment of the invention, said binding domains are joined by a connecting molecule consisting of an inflexible alpha helix.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная спиральная линкерная молекула соединяет карбоксильный конец одного связывающего домена с аминоконцом второго связывающего домена.In a preferred embodiment of the invention, said helical linker molecule connects the carboxyl end of one binding domain to the amino terminus of the second binding domain.
В этом воплощении данного изобретения спиральный линкер является непрерывным между С-концевой спиралью молекулы первого цитокина и N-концевой спиралью молекулы второго цитокина, жестко связывая, таким образом, два цитокиновых связывающих домена в по существу фиксированной ориентации. Например, это может включать делецию короткого N-концевого и пост-спирального С-концевого участка из домена первого цитокина и короткого предспирального N-концевого участка из второго цитокина (например, остатков 182-190 из первого цитокина и остатков 1-5 из второго цитокина, так как они представляют собой короткие участки случайной кольцевой конформации после С-концевой спирали (например, спираль 4 на Фиг.1Б) в первом цитокине и перед N-концом (спираль 1' на Фиг.1Б) второго цитокина.In this embodiment of the invention, the helical linker is continuous between the C-terminal helix of the first cytokine molecule and the N-terminal helix of the second cytokine molecule, thus rigidly linking the two cytokine binding domains in a substantially fixed orientation. For example, this may include a deletion of a short N-terminal and post-helical C-terminal region from the domain of the first cytokine and a short precoiled N-terminal region from the second cytokine (for example, residues 182-190 from the first cytokine and residues 1-5 from the second cytokine since they are short sections of random ring conformation after the C-terminal helix (for example,
В различных конструктах эту фиксированную ориентацию (как трансляционную, так и ротационную) можно изменить либо путем вставки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислот, либо путем делеции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, чтобы получить молекулы с новыми свойствами, например с антагонистическими свойствами. Добавление дополнительной аминокислоты даст дополнительное относительное перемещение двух доменов приблизительно на 1,5 Å и относительное вращение двух доменов вокруг оси спирали примерно на +100°. Типично линкеры могут начинаться с двух единиц ЕАААК и будут удлиняться путем добавления последовательностей А, АА, ААА, АААА, ЕАААА и ЕАААК.In various constructs, this fixed orientation (both translational and rotational) can be changed either by inserting 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 additional amino acids, or by deletion of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids to obtain molecules with new properties, for example, with antagonistic properties. Adding an additional amino acid will give an additional relative displacement of the two domains by approximately 1.5 Å and a relative rotation of the two domains around the axis of the helix by approximately + 100 °. Typically, linkers can start with two units of EAAAK and will be extended by adding the sequences A, AA, AAA, AAAA, EAAAA and EAAAK.
В другом предпочтительном воплощении данного изобретения связывающие домены полипептида являются одинаковыми или сходными друг с другом.In another preferred embodiment of the invention, the binding domains of the polypeptide are the same or similar to each other.
Кроме того, в других воплощениях данного изобретения полипептид содержит связывающие домены цитокинов, выбранных из группы, состоящей из гормона роста, лептина, эритропоэтина, пролактина, интерлейкинов (IL) IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, р35 субъединицы IL-12, IL-13, IL-15; гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF); гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF); кардиотрофина (СТ-1); фактора, ингибирубщего миграцию лейкоцитов (LIF); онкостатина М (OSM); интерферона, IFNα и IFNγ; фактора некроза опухолей (TNF)α, TNFβ и лиганда RANK.In addition, in other embodiments of the invention, the polypeptide comprises binding domains of cytokines selected from the group consisting of growth hormone, leptin, erythropoietin, prolactin, interleukins (IL) IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL -6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, p35 subunits of IL-12, IL-13, IL-15; granulocyte colony stimulating factor (G-CSF); granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF); ciliary neurotrophic factor (CNTF); cardiotrophin (CT-1); leukocyte migration inhibitory factor (LIF); oncostatin M (OSM); interferon, IFNα and IFNγ; tumor necrosis factor (TNF) α, TNFβ and RANK ligand.
В другом предпочтительном воплощении данного изобретения по меньшей мере один домен содержит связывающий домен гормона роста.In another preferred embodiment of the present invention, at least one domain comprises a growth hormone binding domain.
В другом предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит по меньшей мере два связывающих домена гормона роста или варианта гормона роста.In another preferred embodiment of the invention, said polypeptide comprises at least two binding domains of growth hormone or growth hormone variant.
Модифицированные варианты GH раскрыты в US 5849535, который включен в данное описание изобретения посредством ссылки. Модификации GH находятся как в связывающем сайте 1, так и в сайте 2. Модификации в сайте 1 продуцируют молекулу GH, которая имеет более высокое сродство к GHR по сравнению с GH дикого типа. Эти модифицированные молекулы GH действуют как агонисты. Также существует раскрытие модификаций сайта 2, которые приводят к созданию антагонистов GH. Дополнительные примеры модификаций GH для сайта 1, которые изменяют сродство связывания GH, раскрыты в US 5854026; US 6004931; US 6022711; US 6057292 и US 6136563, каждый из которых включен в данное описание изобретения посредством ссылки. Также описаны модификации сайта 2, в частности аминокислотного остатка G120 в GH, которые при модификации в любой из аргинина, лизина, триптофана, тирозина, фенилаланина или глутаминовой кислоты создают молекулу GH со свойствами антагониста.Modified GH variants are disclosed in US 5,849,535, which is incorporated herein by reference. GH modifications are found at both binding
В находящейся на одновременном рассмотрении заявке на патент WO 03/070765 авторов данного изобретения, которая включена в данное описание изобретения посредством ссылки, авторы изобретения описывают продукт слияния варианта GH с антагонистической активностью по отношению к активации рецептора GH. Данный вариант GH слит через гибкий линкер с внеклеточным доменом рецептора гормона роста. Этот химерный полипептид демонстрирует замедленный клиренс и антагонистическую активность. Предложение аналогичного химерного полипептида, но с негибким или частично гибким линкером также находится в пределах объема изобретения, раскрытого здесь.In a pending patent application WO 03/070765 of the inventors of the present invention, which is incorporated herein by reference, the inventors describe a fusion product of the GH variant with antagonistic activity with respect to activation of the GH receptor. This GH variant is fused via a flexible linker with an extracellular domain of growth hormone receptor. This chimeric polypeptide exhibits delayed clearance and antagonistic activity. A proposal for a similar chimeric polypeptide, but with an inflexible or partially flexible linker, is also within the scope of the invention disclosed herein.
В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит по меньшей мере два связывающих домена пролактина или варианта пролактина.In an alternative preferred embodiment of the invention, said polypeptide comprises at least two prolactin binding domains or a prolactin variant.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид варианта пролактина содержит аминокислотную последовательность, которая модифицирована в положении 129 пролактина человека.In a preferred embodiment of the invention, said prolactin variant polypeptide comprises an amino acid sequence that is modified at position 129 of human prolactin.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная модификация представляет собой аминокислотную замену. Предпочтительно указанная замена представляет собой замену остатка аминокислоты глицина остатком аминокислоты аргинина. Предпочтительно указанная модификация дополнительно содержит делецию по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13 или 14 аминоконцевых аминокислотных остатков.In a preferred embodiment of the invention, said modification is an amino acid substitution. Preferably, said substitution is the replacement of a glycine amino acid residue with an arginine amino acid residue. Preferably, said modification further comprises a deletion of at least 9, 10, 11, 12, 13 or 14 amino-terminal amino acid residues.
В альтернативном воплощении данного изобретения связывающие домены полипептида отличаются друг от друга.In an alternative embodiment of the invention, the binding domains of the polypeptide are different from each other.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит первый связывающий домен, который представляет собой связывающий домен гормона роста, и второй связывающий домен, который представляет собой связывающий домен пролактина.In a preferred embodiment of the invention, said polypeptide comprises a first binding domain, which is a growth hormone binding domain, and a second binding domain, which is a prolactin binding domain.
Предпочтительно указанный полипептид состоит из связывающего домена гормона роста и связывающего домена пролактина.Preferably, said polypeptide consists of a growth hormone binding domain and a prolactin binding domain.
В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит первый связывающий домен, который представляет собой модифицированный связывающий домен гормона роста, и второй связывающий домен, который представляет собой модифицированный связывающий домен пролактина.In an alternative preferred embodiment of the invention, said polypeptide comprises a first binding domain, which is a modified growth hormone binding domain, and a second binding domain, which is a modified prolactin binding domain.
Предпочтительно указанный полипептид состоит из модифицированного связывающего домена гормона роста и модифицированного связывающего домена пролактина.Preferably, said polypeptide consists of a modified growth hormone binding domain and a modified prolactin binding domain.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный модифицированный связывающий домен гормона роста содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты глицина 120. Предпочтительно указанная модификация представляет собой замену глицина 120 аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аргинина, лизина, триптофана, тирозина, фенилаланина или глутаминовой кислоты.In a preferred embodiment of the invention, said modified growth hormone binding domain comprises an amino acid substitution at the amino acid position of glycine 120. Preferably, said modification is a replacement of glycine 120 with an amino acid selected from the group consisting of arginine, lysine, tryptophan, tyrosine, phenylalanine or glutamic acid.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная модификация представляет собой замену глицина 120 остатком аминокислоты аргинин.In a preferred embodiment of the invention, said modification is the replacement of glycine 120 with an amino acid residue arginine.
В дополнительном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный модифицированный связывающий домен пролактина содержит модификацию глицина 129. Предпочтительно указанная модификация представляет собой замену глицина 129 остатком аминокислоты аргинина. Предпочтительно указанная модификация дополнительно содержит делецию по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13 или 14 аминоконцевых аминокислотных остатков.In a further preferred embodiment of the invention, said modified prolactin binding domain comprises a modification of glycine 129. Preferably, said modification is a replacement of glycine 129 with an arginine amino acid residue. Preferably, said modification further comprises a deletion of at least 9, 10, 11, 12, 13 or 14 amino-terminal amino acid residues.
В дополнительном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид дополнительно содержит лиганд-связывающий домен рецептора цитокина. Предпочтительно указанный рецептор представляет собой рецептор гормона роста. В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный рецептор представляет собой рецептор пролактина.In a further preferred embodiment of the invention, said polypeptide further comprises a ligand-binding domain of a cytokine receptor. Preferably, said receptor is a growth hormone receptor. In an alternative preferred embodiment of the invention, said receptor is a prolactin receptor.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный лиганд-связывающий домен может быть соединен с указанным связывающим доменом цитокина линкером, содержащим негибкий спиральный участок или состоящим из него.In a preferred embodiment of the invention, said ligand binding domain may be coupled to said cytokine binding domain with a linker containing or consisting of an inflexible helical region.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид согласно данному изобретению.According to another aspect of the invention, there is provided a nucleic acid molecule that encodes a polypeptide of the invention.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор, адаптированный для экспрессии указанного полипептида.In a preferred embodiment of the invention, said nucleic acid molecule is a vector adapted for expression of said polypeptide.
Типично данная адаптация включает обеспечение последовательностей контроля транскрипции (промоторных последовательностей), которые опосредуют экспрессию, специфичную для клеток/тканей. Эти промоторные последовательности могут быть специфичными для клеток/тканей, индуцируемыми или конститутивными.Typically, this adaptation involves providing transcriptional control sequences (promoter sequences) that mediate cell / tissue specific expression. These promoter sequences may be cell / tissue specific, inducible or constitutive.
Промотор является признанным в данной области термином и, ради ясности, включает следующие особенности, которые приведены только в качестве примера. Энхансерные элементы представляют собой цис-действующие последовательности нуклеиновых кислот, часто находящиеся 5' по отношению к сайту инициации транскрипции гена (энхансеры также могут быть обнаружены 3' по отношению к последовательности гена или даже могут быть локализованы в интронных последовательностях и, следовательно, являются независимыми от положения). Функция энхансеров заключается в увеличении скорости транскрипции гена, с которым связан энхансер. Активность энхансера является чувствительной к транс-действующим факторам транскрипции (полипептидам), которые, как было показано, специфически связываются с энхансерными элементами. Связывание/активность транскрипционных факторов (пожалуйста, смотрите Eukaryotic Transcription Factors, by David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego) являются чувствительными к целому ряду стимулов среды, которые включают, например, промежуточные метаболиты (например, глюкоза), эффекторы окружающей среды (например, тепло).A promoter is a recognized term in the art and, for the sake of clarity, includes the following features, which are given by way of example only. Enhancer elements are cis-acting nucleic acid sequences, often located 5 'relative to the gene transcription initiation site (enhancers can also be detected 3' relative to the gene sequence or even can be localized in intron sequences and, therefore, are independent of provisions). The function of enhancers is to increase the rate of transcription of a gene to which an enhancer is linked. Enhancer activity is sensitive to trans-acting transcription factors (polypeptides), which have been shown to specifically bind to enhancer elements. The binding / activity of transcription factors (please see Eukaryotic Transcription Factors, by David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego) are sensitive to a variety of environmental stimuli, which include, for example, intermediate metabolites (e.g. glucose), environmental effectors ( e.g. warm).
Промоторные элементы также включают так называемые ТАТА-бокс и последовательности выбора инициации РНК-полимеразы (RIS), функция которых заключается в выборе сайта инициации транскрипции. Эти последовательности также связывают полипептиды, функция которых, среди прочего, состоит в облегчении выбора инициации транскрипции РНК-полимеразой.Promoter elements also include the so-called TATA box and RNA polymerase initiation (RIS) selection sequences, the function of which is to select a transcription initiation site. These sequences also bind polypeptides whose function, inter alia, is to facilitate the selection of transcription initiation by RNA polymerase.
Адаптации также включают обеспечение селектируемых маркеров и последовательностей автономной репликации, которые облегчают поддержание вектора в эукариотической или прокариотической клетке. Векторы, которые поддерживаются автономно, именуются эписомальными векторами.Adaptations also include the provision of selectable markers and autonomous replication sequences that facilitate the maintenance of the vector in a eukaryotic or prokaryotic cell. Autonomous supported vectors are called episomal vectors.
Адаптации, которые облегчают экспрессию генов, кодируемых вектором, включают обеспечение последовательностей терминации транскрипции/полиаденилирования, что также включает обеспечение внутренних сайтов связывания рибосом (IRES), функция которых состоит в максимизации экспрессии генов, кодируемых вектором, организованных в бицистронные или мультицистронные кассеты экспрессии.Adaptations that facilitate the expression of genes encoded by the vector include the provision of transcription / polyadenylation termination sequences, which also includes the provision of internal ribosome binding sites (IRES), the function of which is to maximize the expression of the genes encoded by the vector organized in bicistronic or multicistronic expression cassettes.
Эти адаптации являются хорошо известными в данной области. Существует значительное количество опубликованной литературы относительно конструкции векторов экспрессии и технологии рекомбинантных ДНК в целом. Пожалуйста, смотрите Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY и ссылки в данной публикации; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).These adaptations are well known in the art. There is a significant amount of published literature regarding the construction of expression vectors and recombinant DNA technology in general. Please see Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and the links in this publication; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: FM M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Для специалиста в данной области будет очевидным, что векторы согласно данному изобретению могут являться векторами генной терапии. Векторы для генной терапии обычно основаны на вирусах. Целый ряд вирусов обычно используют в качестве векторов для доставки экзогенных генов. Обычно используемые векторы включают рекомбинантно модифицированные ДНК и РНК вирусы с оболочкой или без оболочки, предпочтительно выбранные из baculoviridiae (бакуловирусы), parvoviridiae (парвовирусы), picornoviridiae (пикорновирусы), herpesviridiae (герпесвирусы), poxviridiae (поксвирусы), adenoviridiae (аденовирусы) или picornaviridiae (пикорнавирусы). Также можно использовать химерные векторы, которые эксплуатируют полезные элементы каждого свойства родительского вектора (смотрите, например, Feng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870). Такие вирусные векторы могут быть векторами дикого типа или могут быть модифицированы методами рекомбинантных ДНК так, чтобы быть дефицитными по репликации, условно реплицирующимися или компетентным по репликации.It will be apparent to those skilled in the art that the vectors of this invention may be gene therapy vectors. Vectors for gene therapy are usually virus-based. A variety of viruses are commonly used as vectors for the delivery of exogenous genes. Commonly used vectors include recombinantly modified DNA and RNA viruses with or without a shell, preferably selected from baculoviridiae (baculoviruses), parvoviridiae (parvoviruses), picornoviridiae (picornoviruses), herpesviridiae (herpes viruses, poxviridirusesiaera), poxviridirusesiaera (poxviridirusesiae), and (picornaviruses). You can also use chimeric vectors that exploit the beneficial elements of each property of the parent vector (see, for example, Feng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 866-870). Such viral vectors may be wild-type vectors or may be modified by recombinant DNA methods to be deficient in replication, conditionally replicating, or competent for replication.
Предпочтительные векторы происходят из аденовирусных, связанных с аденовирусными, и ретровирусных геномов. В наиболее предпочтительном осуществлении данного изобретения векторы происходят из генома аденовируса человека. Особенно предпочтительные векторы происходят из серотипов 2 или 5 аденовируса человека. Способность к репликации таких векторов можно ослабить (до точки, рассматриваемой как «дефицитная по репликации») путем модификаций или делеций в кодирующих областях Е1а и/или Е1b. Предпочтительными являются другие модификации вирусного генома для достижения конкретных особенностей экспрессии или обеспечения повторного введения, или меньшей иммунной реакции.Preferred vectors come from adenovirus, adenovirus, and retroviral genomes. In a most preferred embodiment of the invention, the vectors originate from the human adenovirus genome. Particularly preferred vectors come from
В качестве альтернативы, вирусные векторы могут быть условно реплицирующимися или компетентными по репликации. Условно реплицирующиеся вирусные векторы используют для достижения избирательной экспрессии в конкретных типах клеток, при избежании нежелательной инфекции широкого спектра. Примеры условно реплицирующихся векторов описаны в Pennisi, E. (1996) Science 274:342-343; Russell, and S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30А(8):1165-1171. Дополнительные примеры избирательно реплицирующихся векторов включают те векторы, где ген, существенный для репликации вируса, находится под контролем промотора, который является активным только в конкретном типе клеток или при конкретном состоянии клеток так, что в отсутствие экспрессии такого гена данный вирус не будет реплицироваться. Примеры таких векторов описаны в Henderson et al., патент Соединенных Штатов №5698443, выданный 16 декабря 1997, и Henderson et al., патент Соединенных Штатов №5871726, выданный 16 февраля 1999, все идеи которых включены в данное описание изобретения посредством ссылки.Alternatively, viral vectors may be conditionally replicating or replication competent. Conditionally replicating viral vectors are used to achieve selective expression in specific cell types, while avoiding an undesirable wide-spectrum infection. Examples of conditionally replicating vectors are described in Pennisi, E. (1996) Science 274: 342-343; Russell, and S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A (8): 1165-1171. Additional examples of selectively replicating vectors include those vectors where the gene essential for virus replication is under the control of a promoter that is active only in a particular type of cell or in a particular state of cells such that in the absence of expression of such a gene, the virus will not replicate. Examples of such vectors are described in Henderson et al., United States Patent No. 5,698,443, issued December 16, 1997, and Henderson et al., United States Patent No. 5871726, issued on February 16, 1999, all of which are incorporated herein by reference.
Дополнительно, вирусный геном можно модифицировать путем включения индуцируемых промоторов, которые обеспечивают репликацию или экспрессию только при определенных условиях. Примеры индуцируемых промоторов известны в научной литературе (смотрите, например, Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, et al. (1997) J. Virol 71(9):7128-7131; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; and Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46); 29364-29371.Additionally, the viral genome can be modified by the inclusion of inducible promoters that provide replication or expression only under certain conditions. Examples of inducible promoters are known in the scientific literature (see, for example, Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426-430; Iida, et al. (1996) J. Virol. 70 (9): 6054 -6059; Hwang, et al. (1997) J. Virol 71 (9): 7128-7131; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17 (9): 5097-5105; and Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem 272 (46); 29364-29371.
Векторы также могут быть невирусными и доступными из целого ряда коммерческих источников, легко доступных специалисту в данной области. Например, данные векторы могут представлять собой плазмиды, которые могут быть эписомальными или интегрирующими.Vectors may also be non-viral and available from a variety of commercial sources readily available to one skilled in the art. For example, these vectors may be plasmids, which may be episomal or integrating.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложена клетка, трансформированная или трансфицированная нуклеиновой кислотой или вектором согласно данному изобретению.According to another aspect of the present invention, there is provided a cell transformed or transfected with a nucleic acid or a vector according to this invention.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная клетка представляет собой эукариотическую клетку.In a preferred embodiment of the invention, said cell is a eukaryotic cell.
Предпочтительно указанная эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клетки грибов, например Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp; миксомицетов (например Dictyostelium spp); клетки насекомых (например Spodoptera frugiperda); растительной клетки или клетки млекопитающего (например клетка СНО (яичник китайского хомячка)).Preferably, said eukaryotic cell is selected from the group consisting of fungal cells, for example Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp; myxomycetes (e.g. Dictyostelium spp); insect cells (e.g. Spodoptera frugiperda); a plant or mammalian cell (e.g., CHO cell (Chinese hamster ovary)).
В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанная клетка представляет собой прокариотическую клетку.In an alternative preferred embodiment of the invention, said cell is a prokaryotic cell.
В другом аспекте данного изобретения предложен способ получения полипептида согласно данному изобретению, включающий стадии:In another aspect of the present invention, a method for producing a polypeptide according to this invention, comprising the steps of:
1) выращивания клетки согласно данному изобретению в условиях, приводящих к продуцированию полипептида согласно изобретению, и1) growing a cell according to this invention under conditions leading to the production of a polypeptide according to the invention, and
2) выделения полипептида из клетки или из ее ростовой среды. В предпочтительном способе по данному изобретению указанный полипептид снабжен аффинной меткой.2) isolation of the polypeptide from the cell or from its growth medium. In a preferred method of the invention, said polypeptide is affinity tagged.
Аффинные метки являются известными в данной области и включают белок, связывающий мальтозу, глутатион-S-трансферазу, белок, связывающий кальмодулин, и полученные при помощи генной инженерии полигистидиновые участки в белках, которые затем очищают путем аффинной очистки на матрицах, содержащих никель. Во многих случаях имеющиеся в продаже векторы и/или наборы можно использовать для слияния интересующего белка с подходящей аффинной меткой, с последующей его трансфекцией в клетку-хозяина для экспрессии и последующей экстракции и очистки на аффинной матрице.Affinity tags are known in the art and include maltose binding protein, glutathione S-transferase, calmodulin binding protein, and genetically engineered polyhistidine regions in proteins, which are then purified by affinity purification on nickel-containing matrices. In many cases, commercially available vectors and / or kits can be used to fuse a protein of interest with a suitable affinity tag, followed by transfection into a host cell for expression and subsequent extraction and purification on an affinity matrix.
В находящейся на одновременном рассмотрении заявке WO 03/034275 авторов данного изобретения, содержание которой включено в описание данного изобретения посредством ссылки, авторы изобретения описывают новую аффинную метку для полипептидов, которая использует домен, включающий сигнальную последовательность, которая направляет добавление гликозилфосфатидилинозитола к полипептиду. Полипептиды, которые включают гликозилфосфатидилинозитольную метку, предпочтительно встраиваются в липидные мембраны и могут обладать антагонистическим действием на активацию рецепторов цитокинов. Следовательно, изобретение, раскрытое здесь, охватывает полипептиды с присоединенной молекулой гликозилфосфатидилинозитола.In a pending application WO 03/034275 of the authors of the present invention, the contents of which are incorporated into the description of the present invention by reference, the inventors describe a new affinity tag for polypeptides that uses a domain including a signal sequence that directs the addition of glycosylphosphatidylinositol to the polypeptide. Polypeptides that include a glycosylphosphatidylinositol label are preferably incorporated into lipid membranes and may have antagonistic effects on the activation of cytokine receptors. Therefore, the invention disclosed herein encompasses polypeptides with an attached glycosylphosphatidylinositol molecule.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложен полипептид, содержащий первый цитокиновый связывающий домен, соединенный со вторым цитокиновым связывающим доменом, где указанный полипептид дополнительно содержит внеклеточный домен цитокинового рецептора.According to another aspect of the present invention, there is provided a polypeptide comprising a first cytokine binding domain linked to a second cytokine binding domain, wherein said polypeptide further comprises an extracellular domain of the cytokine receptor.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные первый и второй связывающие домены соединены гибкой линкерной молекулой.In a preferred embodiment of the invention, said first and second binding domains are connected by a flexible linker molecule.
В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанные первый и второй домены связывания соединены пептидной линкерной молекулой, которая содержит негибкий спиральный участок.In an alternative preferred embodiment of the invention, said first and second binding domains are linked by a peptide linker molecule that contains an inflexible helical region.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные первый и второй связывающие домены соединены пептидной линкерной молекулой, содержащей негибкий спиральный участок и гибкий неспиральный участок.In a preferred embodiment of the invention, said first and second binding domains are linked by a peptide linker molecule comprising an inflexible helical region and a flexible non-helical region.
Пептидные линкеры, которые содержат негибкие спиральные участки и комбинации негибких спиральных участков и гибких неспиральных участков, были описаны выше и являются применимыми к этому воплощению данного изобретения, как и определенные ранее цитокины и цитокиновые рецепторы.Peptide linkers that contain inflexible helical regions and combinations of inflexible spiral regions and flexible non-helical regions have been described above and are applicable to this embodiment of the present invention, as are the previously defined cytokines and cytokine receptors.
В предпочтительном воплощении данного изобретения внеклеточный домен цитокинового рецептора соединен с первым или вторым цитокиновым связывающим доменом посредством линкерной молекулы. Предпочтительно указанная линкерная молекула содержит негибкий спиральный участок.In a preferred embodiment of the invention, the extracellular domain of the cytokine receptor is connected to the first or second cytokine binding domain via a linker molecule. Preferably, said linker molecule comprises an inflexible helical region.
В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанная линкерная молекула является гибкой.In an alternative preferred embodiment of the invention, said linker molecule is flexible.
Предпочтительно указанная линкерная молекула содержит негибкий спиральный участок и гибкий неспиральный участок.Preferably, said linker molecule comprises an inflexible helical region and a flexible non-helical region.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный связывающий цитокиновый домен представляет собой гормон роста или вариант гормона роста, и указанный внеклеточный домен является внеклеточным доменом гормона роста. Предпочтительно указанные домены являются человеческими.In a preferred embodiment of the invention, said cytokine binding domain is a growth hormone or a variant of growth hormone, and said extracellular domain is an extracellular domain of growth hormone. Preferably, said domains are human.
Полипептид по данному изобретению может демонстрировать двойную функциональность. Во-первых, первый и второй домены, содержащие цитокины или их части, которые предпочтительно соединены пептидной линкерной молекулой, содержащей негибкий спиральный участок, способны связываться с рецепторами цитокинов поверхности клетки и стерически затруднять ассоциацию этих рецепторов в рецепторные комплексы, предотвращая, таким образом, последующую клеточную передачу сигнала. Во-вторых, предоставление третьего домена, содержащего рецепторы цитокинов или их части, обеспечивает способность функционирования в качестве растворимого рецептора, связывая, таким образом, любой цитокин перед его связыванием с рецептором поверхности клетки. Этот третий домен предпочтительно соединен с первым или со вторым доменом пептидной линкерной молекулой, содержащей негибкий спиральный участок. В альтернативном воплощении данного изобретения третий домен предпочтительно соединен с первым или вторым доменом пептидной линкерной молекулой, содержащей гибкий неспиральный участок.The polypeptide of this invention may exhibit dual functionality. Firstly, the first and second domains containing cytokines or parts thereof, which are preferably connected by a peptide linker molecule containing an inflexible helical region, are able to bind to cytokine receptors on the cell surface and sterically hinder the association of these receptors into receptor complexes, thus preventing the subsequent cell signal transmission. Secondly, the provision of a third domain containing cytokine receptors or parts thereof provides the ability to function as a soluble receptor, thereby binding any cytokine before binding to a cell surface receptor. This third domain is preferably connected to the first or second domain of a peptide linker molecule containing an inflexible helical region. In an alternative embodiment of the invention, the third domain is preferably connected to the first or second domain of a peptide linker molecule containing a flexible non-helical region.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные пептидные линкерные молекулы дополнительно содержат аминокислотную последовательность, которая является чувствительной к протеолитическому расщеплению.In a preferred embodiment of the invention, said peptide linker molecules further comprise an amino acid sequence that is sensitive to proteolytic cleavage.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложено применение молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты согласно изобретению в качестве фармацевтического средства.According to another aspect of the present invention, there is provided the use of a polypeptide or nucleic acid molecule of the invention as a pharmaceutical agent.
Предпочтительно предложена фармацевтическая композиция, содержащая молекулу полипептида или нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению. Предпочтительно указанная фармацевтическая композиция содержит носитель, эксципиент и/или разбавитель.Preferably, a pharmaceutical composition is provided comprising a polypeptide or nucleic acid molecule of the invention. Preferably, said pharmaceutical composition comprises a carrier, an excipient and / or a diluent.
При введении терапевтические композиции по настоящему изобретению вводят в фармацевтически приемлемых препаратах. Термин «фармацевтически приемлемый» означает нетоксичное вещество, которое не оказывает вредного воздействия на эффективность биологической активности активных ингредиентов. Такие препараты традиционно могут содержать соли, буферные вещества, совместимые носители, консерванты и возможно другие терапевтические агенты.When administered, the therapeutic compositions of the present invention are administered in pharmaceutically acceptable formulations. The term "pharmaceutically acceptable" means a non-toxic substance that does not adversely affect the effectiveness of the biological activity of the active ingredients. Such preparations may traditionally contain salts, buffering agents, compatible carriers, preservatives, and possibly other therapeutic agents.
При использовании в медицине соли должны быть фармацевтически приемлемыми, однако фармацевтически неприемлемые соли можно с удобством использовать для получения фармацевтически приемлемых солей, и они не исключены из объема данного изобретения. Такие фармакологические и фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные из следующих кислот: соляной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, лимонной, муравьиной, малоновой, янтарной и тому подобных, но не ограничиваются ими. Также фармацевтически приемлемые соли можно получить в виде солей щелочных и щелочноземельных металлов, как, например, соли натрия, калия или кальция.When used in medicine, salts must be pharmaceutically acceptable, however pharmaceutically unacceptable salts can conveniently be used to prepare pharmaceutically acceptable salts, and are not excluded from the scope of this invention. Such pharmacological and pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts of hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, nitric, phosphoric, maleic, acetic, salicylic, citric, formic, malonic, succinic, and the like. Also pharmaceutically acceptable salts can be obtained in the form of alkali and alkaline earth metal salts, such as, for example, sodium, potassium or calcium salts.
Данные фармацевтические композиции могут содержать подходящие буферные агенты, включающие уксусную кислоту в соли; лимонную кислоту в соли; борную кислоту в соли и фосфорную кислоту в соли.These pharmaceutical compositions may contain suitable buffering agents comprising acetic acid in salt; citric acid in salt; boric acid in salt and phosphoric acid in salt.
Данные композиции можно объединять, если это желательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Термин «фармацевтически приемлемый носитель», в том виде, как он здесь используется, означает один или более чем один совместимый твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или инкапсулирующее вещество, которые подходят для введения человеку. Термин «носитель» означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединен активный ингредиент для облегчения применения. Компоненты фармацевтических композиций также способны совместно смешиваться с молекулами по настоящему изобретению и друг с другом таким образом, что отсутствует взаимодействие, которое существенно ухудшило бы желательную фармацевтическую эффективность.These compositions may be combined, if desired, with a pharmaceutically acceptable carrier. The term “pharmaceutically acceptable carrier,” as used herein, means one or more compatible solid or liquid excipients, diluents, or encapsulating substances that are suitable for administration to humans. The term “carrier” means an organic or inorganic ingredient, natural or synthetic, with which the active ingredient is combined to facilitate use. The components of the pharmaceutical compositions are also capable of being mixed together with the molecules of the present invention and with each other so that there is no interaction that would significantly impair the desired pharmaceutical efficacy.
Фармацевтические композиции с удобством могут быть представлены в стандартной лекарственной форме и могут быть получены любым способом, хорошо известным в области фармации. Все способы включают стадию приведения активного агента в ассоциацию с носителем, который составляет один или более чем один вспомогательный ингредиент. В общем, данные композиции получают путем приведения активного соединения в однородную и тесную ассоциацию с жидким носителем, тонкоизмельченным твердым носителем или ими обоими и затем, если это необходимо, путем формовки данного продукта.Pharmaceutical compositions may conveniently be presented in unit dosage form and may be prepared by any method well known in the art of pharmacy. All methods include the step of bringing the active agent into association with a carrier, which is one or more auxiliary ingredients. In general, these compositions are prepared by bringing the active compound into uniform and tight association with a liquid carrier, a finely divided solid carrier, or both, and then, if necessary, molding the product.
Данные фармацевтические композиции также возможно могут содержать подходящие консерванты, такие как бензалкония хлорид; хлорбутанол; парабены и тимеросал.These pharmaceutical compositions may also possibly contain suitable preservatives, such as benzalkonium chloride; chlorobutanol; parabens and thimerosal.
Фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить любым традиционным путем, включая инъекцию, или путем постепенной инфузии на протяжении определенного промежутка времени. Введение может быть, например, пероральным, внутривенным, интраперитонеальным, внутримышечным, внутриполостным, подкожным или чрескожным.The pharmaceutical compositions of this invention can be administered by any conventional route, including injection, or by gradual infusion over a period of time. Administration may be, for example, oral, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intracavitary, subcutaneous or transdermal.
Композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, таблетки, лепешки, причем каждая из них содержит заданное количество активного соединения. Другие композиции включают суспензии в водных жидкостях или в неводных жидкостях, такие как сироп, эликсир или эмульсия.Compositions suitable for oral administration may be presented as discrete units such as capsules, tablets, lozenges, each containing a predetermined amount of the active compound. Other compositions include suspensions in aqueous liquids or in non-aqueous liquids, such as syrup, elixir or emulsion.
Композиции по данному изобретению вводят в эффективных количествах. «Эффективное количество» представляет собой такое количество композиции, которое само по себе или совместно с дополнительными дозами дает желательную реакцию. В случае лечения конкретного заболевания, такого как рак, желательной реакцией является подавление развития заболевания. Это может включать только временное замедление развития заболевания, хотя, более предпочтительно, это включает перманентную остановку развития заболевания. Это можно отслеживать традиционными способами.The compositions of this invention are administered in effective amounts. An “effective amount” is such an amount of a composition that, alone or in combination with additional doses, gives the desired reaction. In the case of treating a specific disease, such as cancer, the desired response is to suppress the development of the disease. This may include only a temporary delay in the development of the disease, although, more preferably, this includes the permanent cessation of the development of the disease. This can be tracked in traditional ways.
Такие количества будут, конечно, зависеть от конкретного состояния, которое лечат, от тяжести состояния, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физическое состояние, размер и массу, продолжительность лечения, от природы сопутствующей терапии (если таковая имеет место), конкретного пути введения и от подобных факторов, находящихся в пределах знаний и компетенции практикующего врача. Эти факторы хорошо известны обычным специалистам в данной области и могут быть изучены при помощи не более чем обычного экспериментирования. Обычно является предпочтительным, чтобы была использована максимальная доза отдельных компонентов или их комбинаций, то есть наивысшая безопасная доза, согласно правильному медицинскому решению. Обычным специалистам в данной области, однако, будет понятно, что пациент может настаивать на меньшей дозе или переносимой дозе по медицинским причинам, физиологическим причинам и, фактически, по любым другим причинам.Such amounts will, of course, depend on the particular condition being treated, on the severity of the condition, individual parameters of the patient, including age, physical condition, size and weight, duration of treatment, the nature of concomitant therapy (if any), the particular route of administration and from similar factors within the knowledge and competence of a practitioner. These factors are well known to those of ordinary skill in the art and can be studied using nothing more than routine experimentation. It is usually preferred that the maximum dose of the individual components or combinations thereof be used, that is, the highest safe dose, according to the correct medical decision. Ordinary specialists in this field, however, it will be clear that the patient may insist on a lower dose or tolerated dose for medical reasons, physiological reasons and, in fact, for any other reasons.
В другом аспекте данного изобретения предложено применение молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из акромегалии; гигантизма; дефицита GH; синдрома Тернера; почечной недостаточности; остеопороза; остеоартрита; сахарного диабета; рака (например, рака простаты, рака шейки матки, рака молочной железы, меланомы, гепатомы, рака почек, глиомы, рака мочевого пузыря, рака легкого, неврального рака, рака яичника, рака яичка, рака поджелудочной железы, рака желудочно-кишечного тракта, лимфомы); ожирения; резистентности к инсулину; гиперлипидемии; гипертензии; анемии; аутоиммунных и инфекционных заболеваний; воспалительных расстройств, включая ревматоидный артрит.In another aspect of the invention, there is provided the use of a polypeptide or nucleic acid molecule of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease selected from the group consisting of acromegaly; gigantism; GH deficiency; Turner syndrome; renal failure; osteoporosis; osteoarthritis; diabetes mellitus; cancer (e.g., prostate cancer, cervical cancer, breast cancer, melanoma, hepatoma, kidney cancer, glioma, bladder cancer, lung cancer, neural cancer, ovarian cancer, testicular cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, lymphomas); obesity insulin resistance; hyperlipidemia; hypertension anemia autoimmune and infectious diseases; inflammatory disorders, including rheumatoid arthritis.
Согласно данному изобретению также предложен способ лечения человеческого или животного субъекта, включающий введение эффективного количества полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, фармацевтической композиции или лекарственного средства данному субъекту.The present invention also provides a method of treating a human or animal subject, comprising administering an effective amount of a polypeptide, nucleic acid molecule, pharmaceutical composition or drug to the subject.
Во всем описании и формуле изобретения слова "включают" и "содержат" и вариации данных слов, например "содержащий" и "содержит", означают «включающий, но не ограничивающийся», и они не предназначены для того, чтобы исключить (и не исключают) другие группировки, добавки, компоненты, целые числа или стадии.Throughout the specification and claims, the words “include” and “comprise” and variations of these words, for example, “comprising” and “contains”, mean “including, but not limited to,” and are not intended to exclude (and do not exclude) ) other groups, additives, components, integers or stages.
Во всем описании и формуле изобретения единственное число охватывает множественное, если контекст не требует иного. Конкретно, когда используется единственное число, данное описание следует понимать как рассматривающее множественность, а также единичность, если контекст не требует иного.Throughout the specification and claims, the singular encompasses the plural unless the context requires otherwise. Specifically, when a singular is used, this description should be understood as considering plurality, as well as singularity, unless the context requires otherwise.
Свойства, целые числа, характеристики, соединения, химические группировки или группы, описанные в связи с конкретным аспектом, воплощением или примером данного изобретения, следует понимать, как применимые к любому другому аспекту, воплощению или примеру, описанному здесь, если это не является несовместимым с данным описанием изобретения.The properties, integers, characteristics, compounds, chemical groups or groups described in connection with a particular aspect, embodiment or example of the present invention should be understood as applicable to any other aspect, embodiment or example described here, if it is not incompatible with this description of the invention.
Воплощения данного изобретения теперь будут описаны только в качестве примера и со ссылкой на следующие фигуры.Embodiments of the present invention will now be described by way of example only and with reference to the following figures.
Фиг.1А. Цитокиновые домены (овалы) соединены альфа спиралью (заштрихованный прямоугольник). Гибкие линкеры (изогнутые стрелки) соединяют первый цитокиновый домен со спиралью и спираль - со вторым цитокиновым доменом; Фиг.1Б. Цитокиновые домены соединены альфа спиралью. Гибкие линкеры соединяют первый цитокиновый домен со спиральным линкером и спиральный линкер - со вторым цитокиновым доменом.Figa. The cytokine domains (ovals) are connected by an alpha helix (a shaded rectangle). Flexible linkers (curved arrows) connect the first cytokine domain to the helix and the helix to the second cytokine domain; Figb. Cytokine domains are linked by an alpha helix. Flexible linkers connect the first cytokine domain to a helical linker and the helical linker to a second cytokine domain.
Фиг.2. Спиральный линкер не имеет гибких соединителей - вместо этого он продолжает С-концевую спираль (4) цитокина 1 и соединяет ее с N-концевой спиралью (1') цитокина 2 с образованием жесткого тандема, соединенного одиночной длинной спиралью: 4 - линкерная спираль 1'. Относительная ориентация двух цитокиновых доменов, следовательно, является фиксированной. Однако путем создания различных конструктов при помощи присоединения или удаления аминокислот из линкера можно генерировать серии жестких тандемов, в которых данные домены являются по-разному ориентированными.Figure 2. The spiral linker does not have flexible connectors - instead, it extends the C-terminal helix (4) of
Фиг.3 иллюстрирует карту и последовательность нуклеотидов/аминокислот для конструкта χ1C1b.Figure 3 illustrates the map and nucleotide / amino acid sequence for the χ1C1b construct.
Фиг.4 иллюстрирует обзор конструкций линкеров и праймеров, используемых для генерации тандемов со спиральными линкерами с гибкими концами.Figure 4 illustrates an overview of the designs of linkers and primers used to generate tandems with spiral ends with flexible ends.
Фиг.5 иллюстрирует А) конструкцию пограничных участков между доменами GH и линкером, чтобы позволить лигирование дуплексов праймеров с получением непрерывающихся спиральных линкеров между доменами; Б) праймеры, используемые для модификации χ1C1b с получением χ1С5.Figure 5 illustrates A) the design of the border regions between the GH domains and the linker to allow ligation of primer duplexes to produce continuous helical linkers between the domains; B) the primers used to modify χ1C1b to obtain χ1C5.
Фиг.6 иллюстрирует карту конструкта χ1С5 и последовательность линкерного участка.6 illustrates a map of the χ1C5 construct and the sequence of the linker region.
Фиг.7 иллюстрирует обзор конструкции линкера и праймеров, используемых для генерации тандемов с жесткими спиральными линкерами.7 illustrates an overview of the design of the linker and primers used to generate tandems with rigid spiral linkers.
Фиг.8 иллюстрирует схематическую диаграмму, показывающую стратегию конструирования χ1L1.Fig. 8 is a schematic diagram showing a construction strategy of χ1L1.
Фиг.9 иллюстрирует нуклеотидную последовательность χ1L1. Домены GH показаны серым цветом, домен GHR выделен жирным шрифтом и линкеры подчеркнуты.Fig.9 illustrates the nucleotide sequence of χ1L1. GH domains are shown in gray, the GHR domain is in bold, and linkers are underlined.
Фиг.10 иллюстрирует аминокислотную последовательность χ1L1. Домены GH показаны серым цветом, домен GHR выделен жирным шрифтом, и линкеры подчеркнуты.Figure 10 illustrates the amino acid sequence of χ1L1. GH domains are shown in gray, the GHR domain is in bold, and linkers are underlined.
Фиг.11 иллюстрирует схематическую диаграмму, показывающую стратегию клонирования для конструирования χ1L1.11 is a schematic diagram showing a cloning strategy for constructing χ1L1.
Фиг.12 иллюстрирует экспрессию χ1L1.12 illustrates the expression of χ1L1.
Фиг.13 иллюстрирует предварительную очистку χ1L1-His. χ1L1-His очищали, используя Со2+-колонку.Fig. 13 illustrates a precleaning of χ1L1-His. χ1L1-His was purified using a Co 2+ column.
Фиг.14 иллюстрирует, что χ1L1 демонстрирует агонистическую активность.Fig. 14 illustrates that χ1L1 shows agonistic activity.
Фиг.15 обобщает использованную номенклатуру по отношению к жестким и полужестким конструктам GH.Fig. 15 summarizes the nomenclature used with respect to rigid and semi-rigid GH constructs.
Фиг.16: а) представляет собой нуклеиновокислотную последовательность тандема GH, содержащего полужесткую линкерную последовательность; б) представляет собой аминокислотную последовательность тандема GH, содержащего полужесткую линкерную последовательность; в) иллюстрирует примеры полужестких линкеров, используемых в конструировании тандемов GH; г) иллюстрирует бактериальную экспрессию тандемов GH, содержащих полужесткие линкеры; и д) иллюстрирует биоактивность тандемов GH, содержащих полужесткие линкеры.Fig: a) represents the nucleic acid sequence of the tandem GH containing a semi-rigid linker sequence; b) represents the amino acid sequence of the tandem GH containing a semi-rigid linker sequence; c) illustrates examples of semi-rigid linkers used in the construction of GH tandems; g) illustrates the bacterial expression of GH tandems containing semi-rigid linkers; and e) illustrates the bioactivity of GH tandems containing semi-rigid linkers.
Фиг.17: а) представляет собой нуклеиновокислотную последовательность тандема GH, содержащую жесткую линкерную последовательность; б) представляет собой аминокислотную последовательность тандема GH, содержащую жесткую линкерную последовательность; в) иллюстрирует примеры жестких линкеров, используемых в конструировании тандемов GH; г) иллюстрирует бактериальную экспрессию тандемов GH, содержащих жесткие линкеры; и д) иллюстрирует биоактивность тандемов GH, содержащих жесткие линкеры.Fig: a) represents the nucleic acid sequence of the tandem GH containing a rigid linker sequence; b) represents the amino acid sequence of the tandem GH containing a rigid linker sequence; c) illustrates examples of rigid linkers used in the construction of GH tandems; g) illustrates the bacterial expression of GH tandems containing rigid linkers; and e) illustrates the bioactivity of GH tandems containing rigid linkers.
Фиг.18А иллюстрирует очистку T1cEAK2+3his и анализ путем окрашивания кумасси и вестерн-блоттинга; Фиг.18Б и 18В иллюстрируют биоактивность T1cEAK2+3his; Фиг.18Г иллюстрирует очистку T1cEAK2+4his и анализ путем окрашивания кумасси и вестерн-блоттинга; и Фиг.18Д и 18Е иллюстрируют биоактивность T1cEAK2+4his.Fig. 18A illustrates T1cEAK2 + 3his purification and analysis by Coomassie staining and Western blotting; Figv and 18B illustrate the bioactivity of T1cEAK2 + 3his; Fig. 18G illustrates T1cEAK2 + 4his purification and analysis by Coomassie staining and Western blotting; and FIGS. 18E and 18E illustrate the bioactivity of T1cEAK2 + 4his.
Фиг.19 иллюстрирует ELISA для определения тандемов гормона роста.Fig. 19 illustrates an ELISA for determining growth hormone tandems.
Фиг.20 представляет собой схематическую иллюстрацию тандемов гормона роста, связанных гибким, полужестким и жестким линкерами.20 is a schematic illustration of tandems of growth hormone linked by flexible, semi-rigid, and rigid linkers.
Фиг.21 иллюстрирует примеры возможных комбинаций пролактина (PRL), гормона роста (GH) и их антагонистических мутантов.21 illustrates examples of possible combinations of prolactin (PRL), growth hormone (GH) and their antagonistic mutants.
Фиг.22 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности пролактина и одной из его антагонистических форм, мутанта G129R (подчеркнуто) с удаленными аминокислотами 1-14.FIG. 22 illustrates the nucleotide and amino acid sequences of prolactin and one of its antagonistic forms, mutant G129R (underlined) with amino acids 1-14 removed.
Фиг.23 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности гормона роста и его антагонистической формы, мутанта G120R (подчеркнуто).23 illustrates the nucleotide and amino acid sequences of growth hormone and its antagonistic form, mutant G120R (underlined).
Фиг.24 представляет собой схематическую иллюстрацию тандема пролактина.24 is a schematic illustration of a tandem of prolactin.
Фиг.25. (А) Схема конструктов жесткого тандема GH с сайтами рестрикции, полученными при помощи генной инженерии, Notl и Nrul, что делает возможным соединение линкера непосредственно с концевыми спиралями соседних доменов и также облегчает изменение линкера. (Б) Схема жесткого конструкта PRL-линкер-СН с сайтами рестрикции, полученными при помощи генной инженерии, Notl и Nrul, которые имеют ту же самую функцию, что и в (А), сайт Notl находится в линкерных участках и, таким образом, просто может быть добавлен к усеченному гену RRL в домене А. (В) Схематическая диаграмма жесткого тандема PRL, уникальный сайт рестрикции нужно создать путем генной инженерии, используя вырожденный аминокислотный код, на границе между линкером и PRL в домене Б, чтобы сделать возможным легкий синтез и модификацию данного тандемного гена.Fig.25. (A) Scheme of constructs of the rigid tandem GH with restriction sites obtained by genetic engineering, Notl and Nrul, which makes it possible to connect the linker directly to the end helices of adjacent domains and also facilitates the change of the linker. (B) Scheme of the rigid construct of the PRL-linker-CH with restriction sites obtained by genetic engineering, Notl and Nrul, which have the same function as in (A), the Notl site is located in the linker sites and, thus, it can simply be added to the truncated RRL gene in domain A. (C) Schematic diagram of the hard PRL tandem, a unique restriction site needs to be created by genetic engineering using a degenerate amino acid code, at the border between the linker and PRL in domain B, to allow easy synthesis and modification of this tandem gene but.
Материалы и методыMaterials and methods
Модификацию линкера в тандеме GH инициировали от гена молекулы GH-(G4S)-GH (χ1C1), которую модифицировали для удаления 30 аминокислот, избыточных на N-конце экспрессируемого белка, данный ген также субклонировали в модифицированный вектор рЕТ21(+) с получением рЕТ21:χ1C1b (Фиг.3).Modification of the linker in the GH tandem was initiated from the gene of the GH- (G 4 S) -GH (χ1C1) molecule, which was modified to remove 30 amino acids redundant at the N-terminus of the expressed protein, this gene was also subcloned into the modified pET21 (+) vector to obtain pET21: χ1C1b (Figure 3).
Для конструктов со спиральными линкерами с гибкими концами конструировали линкер путем лигирования друг с другом комплементарных олигонуклеотидов; эти олигонуклеотиды конструировали так, чтобы они кодировали желательный линкер и имели концы, которые лигировались бы в вектор, рЕТ21:χ1C1b, который был расщеплен Notl и EcoRI. Обзор этих линкеров показан на Фиг.4.For constructs with helical linkers with flexible ends, a linker was constructed by ligating complementary oligonucleotides to each other; these oligonucleotides were designed to encode the desired linker and have ends that would be ligated into the vector, pET21: χ1C1b, which was digested by Notl and EcoRI. An overview of these linkers is shown in FIG. 4.
Для жесткого линкера между доменами GH эти домены GH должны были быть модифицированы для удаления их С-конца (GH1) и N-конца (GH2) так, чтобы данные домены заканчивались на конце спиралей. Затем сконструировали сайты рестрикции, применяя технику вырожденных кодонов, что сделало бы возможным введение новых линкеров без какого-либо прерывания спирали, которая формировалась бы между двумя данными доменами (Фиг.5А). Праймеры сконструировали так, чтобы проводить эти модификации доменов GH GH-тандема (Фиг.5Б). Образующийся конструкт называли χ1С5 (Фиг.6). Для генерации линкерного участка, фланкированного сайтами Notl и Nrul, использовали комплементарные олигонуклеотиды, затем лигировали их в рЕТ21:χ1С5, который расщепляли Notl и Nrul. Обзор этих линкеров показан на Фиг.7.For a hard linker between GH domains, these GH domains had to be modified to remove their C-terminus (GH1) and N-terminus (GH2) so that these domains end at the end of the helices. Then restriction sites were constructed using the degenerate codon technique, which would make it possible to introduce new linkers without any interruption of the helix that would form between these two domains (Fig. 5A). The primers were designed to carry out these modifications of the GH domains of the GH tandem (Fig. 5B). The resulting construct was called χ1C5 (Fig.6). To generate the linker region flanked by the Notl and Nrul sites, complementary oligonucleotides were used, then they were ligated into pET21: χ1C5, which Notl and Nrul cleaved. An overview of these linkers is shown in FIG. 7.
Экспрессию конструктов осуществляют путем первоначальной трансформации вектора экспрессии рЕТ в штамм для экспрессии, E. coli BL21(DE3) CodonPlus RIPL. Экспрессию можно проводить при целом ряде различных условий, которые включают различные температуры инкубации (например, комнатную температуру, 37°С), различные среды (например, LB, 2YT, 5YT и прочее), различные точки индукции (т.е. OD600, при которой индуцируют культуру), различные концентрации IPTG (изопропилтио-β-D-галактопиранозид) (или другого индуктора), используемые для индукции культуры, и время, в которое собирают клетки после индукции.The expression of constructs is carried out by initially transforming the pET expression vector into an expression strain, E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIPL. Expression can be carried out under a number of different conditions, which include different incubation temperatures (e.g. room temperature, 37 ° C), different media (e.g. LB, 2YT, 5YT, etc.), different points of induction (i.e. OD 600 , at which culture is induced), various concentrations of IPTG (isopropylthio-β-D-galactopyranoside) (or other inducer) used to induce culture, and the time at which cells are harvested after induction.
К С-концу данного конструкта можно добавить His-метку, которая облегчит его очистку с использованием иммобилизованной аффинной хроматографии с ионами металла (с Ni2+ или Со2+ колонками). Конструкты, которые не имеют His-метки, можно очистить, используя различные способы, такие как ионообменная хроматография, гидрофобные колонки и гель-хроматография. Для получения белка подходящей чистоты может требоваться одна или более чем одна из этих методик очистки.To the C-terminus of this construct, a His tag can be added, which will facilitate its purification using immobilized affinity chromatography with metal ions (with Ni 2+ or Co 2+ columns). Constructs that do not have a His tag can be purified using various methods, such as ion exchange chromatography, hydrophobic columns, and gel chromatography. To obtain a protein of suitable purity, one or more of these purification techniques may be required.
Конструирование χ1С5Construction χ1C5
Модифицированные домены GH генерировали, используя PCR (полимеразная цепная реакция) и релевантные праймеры. GH1 модифицировали, используя DiGHNcoGF и GH[AEA3]NotR, и GH2 модифицировали с Ecol-(Nru)GH-F и GHΔ*-HR. Реакционные среды PCR состояли из: 1 мкл 100 пмоль/мкл прямого праймера, 1 мкл 100 пмоль/мкл обратного праймера, 1 мкл pTrcHisGHstop (разбавленного), 1 мкл 10 мМ dNTPs, 5 мкл 10х буфера для амплификации, 1 мкл 50 мМ MgSO4, 0,5 мкл полимеразы Pfx, 39,5 мкл стерильной воды. PCR проводили на этих реакционных смесях, используя следующий температурный профиль: 95°С в течение 5 мин; 15×(95°С в течение 45 с, 55°С в течение 45 с, 72°С в течение 45 с); 72°С в течение 5 мин. Продукты PCR проверяли, используя агарозный гель, и очищали желательный продукт PCR. Модифицированный GH1 лигировали в рЕТ21:χ1C1b между сайтами Ncol и Notl с получением рЕТ21:χ1С4. Модифицированный GH2 лигировали в рЕТ21:χ1С4 между сайтами EcoRI и HindIII с получением рЕТ21:χ1С5. Обзор этого процесса показан на Фиг.8.Modified GH domains were generated using PCR (polymerase chain reaction) and relevant primers. GH1 was modified using DiGHNcoGF and GH [AEA3] NotR, and GH2 was modified with Ecol- (Nru) GH-F and GHΔ * -HR. PCR reaction media consisted of: 1
Изменение линкеровLinker Change
Фосфорилирование праймеровPhosphorylation of Primers
Когда для генерации линкера требовалось 2 или более чем 2 дуплекса праймеров, праймеры, содержащие внутренний 5'-конец, сначала фосфорилировали. Для каждого подлежащего фосфорилированию праймера готовили следующую реакционную смесь: 2 мкл 100 пмоль/мкл олигонуклеотидов, 2 мкл 10х киназного буфера, 2 мкл 10 мМ АТФ, 13 мкл стерильной воды, 1 мкл Т4 полинуклеотидкиназы (10 ед./мкл). Эти компоненты инкубировали при 37°С в течение 30 мин и затем при 70°С в течение 10 мин. Затем разводили пробы 1:10, используя буфер для отжига (10 мМ TRIS, 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 7,5-8,0), с получением раствора 0,1 пмоль/мкл. Эти компоненты затем могли быть использованы в реакции отжига, описанной ниже.When 2 or more than 2 primer duplexes were required to generate a linker, primers containing an internal 5 ′ end were first phosphorylated. For each primer to be phosphorylated, the following reaction mixture was prepared: 2 μl of 100 pmol / μl of oligonucleotides, 2 μl of 10x kinase buffer, 2 μl of 10 mM ATP, 13 μl of sterile water, 1 μl of T4 polynucleotide kinase (10 units / μl). These components were incubated at 37 ° C for 30 minutes and then at 70 ° C for 10 minutes. Samples 1:10 were then diluted using an annealing buffer (10 mM TRIS, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 7.5-8.0) to give a solution of 0.1 pmol / μl. These components could then be used in the annealing reaction described below.
Отжиг дуплексов праймеровPrimer Duplex Annealing
Праймеры разбавляли до концентрации 0,1 пмоль/мкл, используя буфер для отжига (10 мМ TRIS, 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, рН 7,5-8,0). 10 мкл комплементарных праймеров смешивали в свежей пробирке. Данную пробирку затем инкубировали при 95°С в течение 2 мин и давали температуре упасть до 30°С в течение промежутка времени 40-60 мин. В случаях, когда требовалось более одного дуплекса праймеров, смешивали равные объемы дуплексов праймеров с получением раствора, содержащего все дуплексы праймеров, необходимые для образования желательного линкера. Затем хранили данные растворы на льду.The primers were diluted to a concentration of 0.1 pmol / μl using an annealing buffer (10 mm TRIS, 50 mm NaCl, 1 mm EDTA, pH 7.5-8.0). 10 μl of complementary primers were mixed in a fresh tube. This tube was then incubated at 95 ° C for 2 minutes and the temperature allowed to drop to 30 ° C over a period of 40-60 minutes. In cases where more than one primer duplex was required, equal volumes of primer duplexes were mixed to obtain a solution containing all primer duplexes necessary to form the desired linker. Then these solutions were stored on ice.
Лигирование и трансформацияLigation and Transformation
Примерно 200 нг вектора, расщепленного релевантными рестрикционными ферментами (например рЕТ21:χ1C1b, расщепленный Notl и EcoRI, или рЕТ21:χс1С5, расщепленный Notl и Nrul), инкубировали с 4 мкл праймеров после отжига, 1 мкл лигазного буфера, 2 мкл Т4 ДНК-лигазы и доводили реакционную среду до 10 мкл стерильной водой. Эти компоненты инкубировали в течение ночи в лабораторном стакане со льдом, которому давали растаять за это время. 5 мкл продукта лигазной реакции, образовавшегося за ночь, затем добавляли к 50 мкл химически компетентных клеток E.coli SURE. Инкубировали их на льду в течение 1 часа, затем подвергали действию теплового шока при 42°С в течение 30 с. Добавляли к клеткам 450 мкл среды LB и затем инкубировали пробу в течение 30 мин при 37°С. Затем центрифугировали мини-культуру в течение 5 мин при 4000 об/мин, образующийся осадок ресуспендировали в 50 мкл среды LB и затем переносили на чашки LB, содержащие карбенициллин (100 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл) и глюкозу (0,3% мас./об.). Инкубировали их в течение ночи при 37°С. Образующиеся колонии затем подвергали скринингу для проверки того, было ли изменение линкера успешным.About 200 ng of the vector digested with relevant restriction enzymes (e.g. pET21: χ1C1b, digested Notl and EcoRI, or pET21: χc1C5, digested Notl and Nrul) were incubated with 4 μl of primers after annealing, 1 μl of ligase buffer, 2 μl of T4 DNA and the reaction medium was adjusted to 10 μl with sterile water. These components were incubated overnight in a beaker with ice, which was allowed to melt during this time. 5 μl of the ligase reaction product formed overnight was then added to 50 μl of chemically competent E. coli SURE cells. They were incubated on ice for 1 hour, then subjected to heat shock at 42 ° C for 30 s. 450 μl of LB medium was added to the cells and then the sample was incubated for 30 min at 37 ° C. The mini culture was then centrifuged for 5 min at 4000 rpm, the resulting precipitate was resuspended in 50 μl of LB medium and then transferred to LB plates containing carbenicillin (100 μg / ml), tetracycline (10 μg / ml) and glucose (0 , 3% w / v). Incubated them overnight at 37 ° C. The resulting colonies were then screened to check if the linker change was successful.
Модификации общей стратегииGeneral Strategy Modifications
Генерация конструктов с жесткими линкерами с использованием рестрикционных ферментов Notl и Nrul для расщепления рЕТ21:χ1С5, после трансформации генерировала большое число колоний на чашках с негативным контролем (отсутствует дуплекс праймеров в реакции лигирования), поэтому было сложно осуществить скрининг на позитивные клоны. Очищали их путем дефосфорилирования расщепленного вектора; 15 мкл рЕТ21:χ1С5, расщепленного Notl и Nrul, смешивали с 2 мкл буфера CIAP 10х, 1 мкл CIAP (щелочная фосфатаза кишечника теленка) (10 ед./мкл) и 2 мкл стерильной воды. Эту смесь инкубировали при 37°С в течение 1 часа и затем при 80°С в течение 30 мин. Затем очищали ДНК из раствора, используя набор для очистки (например, Qiagen PCR Purification Kit). Все праймеры, использованные для создания дуплексов праймеров, фосфорилировали, используя способ, описанный выше. Фосфорилированные дуплексы праймеров затем лигировали в дефосфорилированный вектор, как описано выше.Generation of constructs with rigid linkers using Notl and Nrul restriction enzymes to cleave pET21: χ1C5, after transformation generated a large number of colonies on plates with negative control (no duplex primers in the ligation reaction), so it was difficult to screen for positive clones. They were purified by dephosphorylation of the cleaved vector; 15 μl of pET21: χ1C5 digested with Notl and Nrul was mixed with 2 μl of 10x CIAP buffer, 1 μl of CIAP (calf intestinal alkaline phosphatase) (10 units / μl) and 2 μl of sterile water. This mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour and then at 80 ° C for 30 minutes. DNA was then purified from solution using a purification kit (e.g., Qiagen PCR Purification Kit). All primers used to create primer duplexes were phosphorylated using the method described above. The phosphorylated primer duplexes were then ligated into a dephosphorylated vector as described above.
Клонирование и экспрессия χ1L1Cloning and expression of χ1L1
χ1L1 состоит из двух доменов гормона роста GH с последующим одиночным внеклеточным доменом гормона роста, причем каждый из этих доменов в данный момент связан с линкером (Gly4Ser)4 (Фиг.8). Нуклеотидная последовательность χ1L1 показана на Фиг.9, и аминокислотная последовательность приведена на Фиг.10.χ1L1 consists of two domains of growth hormone GH followed by a single extracellular domain of growth hormone, each of these domains is currently associated with a linker (Gly 4 Ser) 4 (Fig. 8). The nucleotide sequence of χ1L1 is shown in Fig. 9, and the amino acid sequence is shown in Fig. 10.
χ1L1 конструировали путем лигирования гена hGH, фланкированного сайтами Nhel и Xhol, в χс1Е2 (GHRa-GH-GHRb); это давало χ1К1. Домен GHR затем лигировали в χ1К1 между сайтами EcoRI и HindIII с получением χ1L1. Схематическая диаграмма этой процедуры показана на Фиг.11.χ1L1 was constructed by ligation of the hGH gene flanked by the Nhel and Xhol sites in χc1E2 (GHRa-GH-GHRb); this gave χ1K1. The GHR domain was then ligated into χ1K1 between EcoRI and HindIII sites to give χ1L1. A schematic diagram of this procedure is shown in FIG. 11.
Ген χ1L1 проверяли путем секвенирования и показали, что он является правильным. Экспрессию проводили, используя модифицированный вектор рЕТ21(+) в клетках E.coli BL21 (DE3) CodonPlus RIPL. Белок, экспрессируемый в среде LB через 4 часа после индукции 1 мМ IPTG (конечная концентрация) при OD600 0,5-0,6, был частично растворимым, и на вестерн-блоте, проанализированном на наличие GH (Фиг.12), наблюдали полосы с различными М.м. (молекулярные массы).The χ1L1 gene was checked by sequencing and showed that it is correct. Expression was performed using the modified pET21 (+) vector in E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIPL cells. The protein expressed in
Версию χ1L1 с С-концевой His-меткой очищали, используя Со2+ колонку (Фиг.13). В белковом препарате сохранялся целый ряд загрязняющих белков, и на вестерн-блоте все еще наблюдали полосы с различными М.м. Предварительные биоанализы этого белкового препарата показали, что он имел значительную агонистическую активность (Фиг.14).The C-terminal His-tagged χ1L1 version was purified using a Co 2+ column (FIG. 13). A number of contaminating proteins remained in the protein preparation, and bands with different M. m. Were still observed on the Western blot. Preliminary bioassays of this protein preparation showed that it had significant agonistic activity (FIG. 14).
Конструирование тандемов пролактина и тандемов пролактин:гормон ростаConstruction of tandems of prolactin and tandems of prolactin: growth hormone
Конструкты тандемов PRL (пролактин) и GH генерировали, используя стандартные методики PCR с последующим лигированием и трансформацией полученного вектора. Линкер можно изменить путем лигирования и трансформирования олигонуклеотидных пар, подвергнутых отжигу, в полученные векторы. Ниже показаны три примера стратегий конструирования тандема PRL и GH.Tandem constructs PRL (prolactin) and GH were generated using standard PCR techniques followed by ligation and transformation of the resulting vector. The linker can be changed by ligation and transformation of the annealed oligonucleotide pairs into the resulting vectors. Three examples of PRL and GH tandem design strategies are shown below.
Стратегия 1
Генерация PRL-(G4S)4-PRLGeneration PRL- (G 4 S) 4 -PRL
1. PCR PRL между сайтами Ncol и Notl (прямой праймер = atatccatgggcTTGCCCATCTGTCC: обратный праймер = atatatatatatgggcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG).1. PCR PRL between the Ncol and Notl sites (forward primer = ata tccatgg gcTTGCCCATCTGTCC: reverse primer = atatatatatatgg gcggccgc cGCAGTTGTTGTTGTGG).
2. Расщепление продукта PCR рестриктазами Ncol и Notl.2. Cleavage of the PCR product with restriction enzymes Ncol and Notl.
3. Расщепление реципиентного вектора Ncol и Notl→рЕТ21(m)χ1C1b (т.е. GH-(G4S)4-GH).3. Cleavage of the recipient vector Ncol and Notl → pET21 (m) χ1C1b (ie GH- (G 4 S) 4 -GH).
4. Лигирование продукта PCR в вектор с получением pET21(m)PRL-(G4S)4-GH4. Ligation of the PCR product into a vector to obtain pET21 (m) PRL- (G 4 S) 4 -GH
5. PCR PRL между сайтами EcoRI и HindIIII (прямой праймер = atatgaattcTTGCCCATCTGTCC; обратный праймер = atataagcttGCAGTTGTTGTTGTGG).5. PCR PRL between EcoRI and HindIIII sites (forward primer = atat gaattc TTGCCCATCTGTCC; reverse primer = atat aagctt GCAGTTGTTGTTGTGG).
6. Расщепление продукта PCR рестриктазами EcoRI и HindIII.6. Cleavage of the PCR product with restriction enzymes EcoRI and HindIII.
7. Расщепление реципиентного вектора EcoRI и HindIII→pET21(m)PRL-(G4S)4-GH.7. Cleavage of the recipient vector EcoRI and HindIII → pET21 (m) PRL- (G 4 S) 4 -GH.
8. Лигирование продукта PCR в вектор с получением pET21(m)PRL-(G4S)4-PRL.8. Ligation of the PCR product into a vector to give pET21 (m) PRL- (G 4 S) 4 -PRL.
Стратегия 2
Генерация PRL-A(EA3K)2A-GHGeneration PRL-A (EA 3 K) 2 A-GH
1. PCR PRL между сайтами Ncol и Notl (прямой праймер = atatccatgggcTTGCCCATCTGTCC: обратный праймер = atatatatatatgggcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG).1. PCR PRL between Ncol and Notl sites (forward primer = atat ccatgg gcTTGCCCATCTGTCC: reverse primer = atatatatatatgg gcggccgc cGCAGTTGTTGTTGTGG).
2. Расщепление продукта PCR рестриктазами Ncol и Notl.2. Cleavage of the PCR product with restriction enzymes Ncol and Notl.
3. Расщепление реципиентного вектора Ncol и Notl→рЕТ21(m)Т1аЕАК2 (т.е. СН-А(ЕА3К)2А-GH).3. Cleavage of the recipient vector Ncol and Notl → pET21 (m) T1aEAK2 (ie, CH-A (EA 3 K) 2 A-GH).
4. Лигирование продукта PCR в вектор с получением PRL-A(EA3K)2A-GH.4. Ligation of the PCR product into a vector to give PRL-A (EA 3 K) 2 A-GH.
Стратегия 3
Генерация PPL-А(ЕА3К)4А-PRLGeneration of PPL-A (EA 3) 4 A-PRL
1. Отжечь праймеры для генерации линкера А(ЕА3К)4А.1. Anneal the primers to generate linker A (EA 3 K) 4 A.
2. Расщепить реципиентный вектор рестриктазами Notl и EcoRI→pET21(m)PRL-(G4S)4-PRL (из примера 1, приведенного выше).2. Split the recipient vector with Notl restriction enzymes and EcoRI → pET21 (m) PRL- (G 4 S) 4 -PRL (from Example 1 above).
3. Лигировать олигонуклеотидный димер в вектор с получением PRL-А(ЕА3К)4А-PRL.3. Ligate the oligonucleotide dimer into the vector to give PRL-A (EA 3 K) 4 A-PRL.
Приведенная выше стратегия проиллюстрирована на Фиг.24.The above strategy is illustrated in FIG.
ПРИМЕР 1EXAMPLE 1
Полужесткие тандемыSemi-rigid tandems
Клетки E.coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL выращивали в 10 мл среды LB, дополненной карбенициллином, тетрациклином и хлорамфениколом. Данные клетки выращивали на качалке при 37°С. Культуры индуцировали при OD600, равной 0,4-0,7, используя IPTG в конечной концентрации 1 мМ. Данные культуры выращивали в течение дополнительных 4 ч перед сбором. Клетки лизировали, используя комбинацию лизоцима, дезоксихолата натрия и обработки ультразвуком. Растворимую фракцию затем выделяли центрифугированием. Гели PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле), окрашенные кумасси, не показывали явных полос экспрессии тандема.E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL cells were grown in 10 ml of LB medium supplemented with carbenicillin, tetracycline and chloramphenicol. These cells were grown on a shaker at 37 ° C. Cultures were induced at an OD 600 of 0.4-0.7 using IPTG at a final concentration of 1 mM. These cultures were grown for an additional 4 hours before harvesting. Cells were lysed using a combination of lysozyme, sodium deoxycholate and sonication. The soluble fraction was then isolated by centrifugation. PAGE gels (polyacrylamide gel electrophoresis) stained with Coomassie did not show clear tandem expression bands.
Растворимую фракцию определяли посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), и 40 нг/лунку тандема загружали на 12%-ный гель PAGE. Белок переносили на PVDF (поливинилиденфторид) мембрану и подвергали вестерн-блоттингу с использованием кроличьего анти-GH антитела (первичного) и анти-кроличьего-HRP (конъюгированное с пероксидазой хрена) антитела (вторичного); смотрите Фиг.16 г. Биоактивность тандема GH, содержащего полужесткий линкер, показана на Фиг.16д.The soluble fraction was determined by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), and 40 ng / well of tandem was loaded onto a 12% PAGE gel. The protein was transferred onto a PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane and subjected to Western blotting using rabbit anti-GH antibody (primary) and anti-rabbit-HRP (horseradish peroxidase conjugated) antibody (secondary); see FIG. 16. The bioactivity of a tandem GH comprising a semi-rigid linker is shown in FIG.
ПРИМЕР 2EXAMPLE 2
Жесткие тандемыHard tandems
Клетки E.coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL выращивали в 10 мл среды LB, дополненной карбенициллином, тетрациклином и хлорамфениколом. Данные клетки выращивали на качалке при 37°С. Культуры индуцировали при OD600, равной 0,4-0,7, используя IPTG в конечной концентрации 1 мМ. Данные культуры выращивали в течение дополнительных 4 ч перед сбором.E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL cells were grown in 10 ml of LB medium supplemented with carbenicillin, tetracycline and chloramphenicol. These cells were grown on a shaker at 37 ° C. Cultures were induced at an OD 600 of 0.4-0.7 using IPTG at a final concentration of 1 mM. These cultures were grown for an additional 4 hours before harvesting.
Клетки лизировали, используя комбинацию лизоцима, дезоксихолата натрия и обработки ультразвуком. Растворимую фракцию затем выделяли центрифугированием. Гели PAGE, окрашенные кумасси, не показывали явных полос экспрессии тандема.Cells were lysed using a combination of lysozyme, sodium deoxycholate and sonication. The soluble fraction was then isolated by centrifugation. Coomassie stained PAGE gels did not show clear tandem expression bands.
Растворимую фракцию определяли посредством ELISA и 40 нг/лунку тандема загружали на 12%-ный гель PAGE. Белок переносили на PVDF мембрану и подвергали вестерн-блоттингу с использованием кроличьего анти-GH антитела (первичного) и анти-кроличьего-HRP антитела (вторичного); смотрите Фиг.17г. Биоактивность тандема GH, содержащего полужесткий линкер, показана на Фиг.17д.The soluble fraction was determined by ELISA and 40 ng / well of tandem was loaded onto a 12% PAGE gel. The protein was transferred to a PVDF membrane and subjected to Western blotting using rabbit anti-GH antibodies (primary) and anti-rabbit-HRP antibodies (secondary); see Fig.17g. The bioactivity of the tandem GH containing a semi-rigid linker is shown in Fig.17d.
ПРИМЕР 3EXAMPLE 3
Очистка тандемовTandem Cleaning
Конструкты T1cEAK2+3His и T1cEAK2+4His включали в окончательный список для дальнейшего исследования на основании их первоначальных сверхмаксимальных активностей в биоанализе. Экспрессионной плазмидой трансформировали клетки E.coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL и проводили экспрессию в 1 л порционных культур. Очистку проводили на фракции растворимого белка, используя комбинацию Ni-хелатной аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными ионами металлов (IMAC), и ионообменной хроматографии. IMAC представляла собой первую стадию очистки, первоначально элюцию осуществляли, используя градиент рН (от рН 8 до рН 3); однако обнаружили, что большое количество белка терялось в промывках колонки. Поэтому авторы вернулись к использованию элюции имидазолом (от 0 до 0,5 М имидазола) и с модификациями в стратегии очистки авторы добились более чем 70%-ной чистоты. Затем использовали ионообменную колонку (Resourse Q) для дальнейшей очистки белка до более чем 90%-ной чистоты. Это проиллюстрировано на Фиг.18.The constructs T1cEAK2 + 3His and T1cEAK2 + 4His were included in the final list for further study based on their initial supermaximal activities in bioanalysis. The expression plasmid transformed E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL cells and expressed in 1 L portioned cultures. Purification was performed on soluble protein fractions using a combination of Ni-chelate affinity chromatography on a column with immobilized metal ions (IMAC) and ion exchange chromatography. IMAC was the first purification step; initially, elution was performed using a pH gradient (
Количественная оценка на основе результатов ELISA: T1cEAK2+3His (RQ13/4)=215 мкг/мл; T1cEAK2+3His (RQ14/4)=177 мкг/мл.Quantification based on ELISA results: T1cEAK2 + 3His (RQ13 / 4) = 215 μg / ml; T1cEAK2 + 3His (RQ14 / 4) = 177 μg / ml.
Каждый полученный 1 мл, следовательно, давал общий выход 392 мкг. Получение осуществляли из 2 литров культуры→выход на литр=~200 мкг.Each 1 ml obtained, therefore, gave a total yield of 392 μg. Obtaining was carried out from 2 liters of culture → output per liter = ~ 200 μg.
Активность T1cEAK2+3His достигает более многократной индукции, чем rhGH, при более высоких концентрациях белка. Аналогичный результат получается, когда тандем тестируют на молярной основе, смотрите Фиг.18Б и 18В. Аналогичный анализ проводили в отношении T1cEAK2+4His. Очистка и биоактивность проиллюстрированы на Фиг.18Г, 18Д и 18Е.T1cEAK2 + 3His activity achieves more multiple induction than rhGH at higher protein concentrations. A similar result is obtained when the tandem is tested on a molar basis, see Fig. 18B and 18B. A similar analysis was performed for T1cEAK2 + 4His. Purification and bioactivity are illustrated in FIGS. 18G, 18D and 18E.
Количественная оценка, основанная на результатах ELISA T1cEAK2+4His (RQ13/4), составляет 550 мкг/мл. Каждый полученный 1 мл, следовательно, давал общий выход 550 мкг. Получение осуществляли из 2 литров культуры → выход на литр = ~275 мкг. Активность T1cEAK2+4-His достигает более многократной индукции, чем rhGH, при более высоких концентрациях белка. Аналогичный результат получается, когда тандем тестируют на молярной основе.Quantification based on the results of ELISA T1cEAK2 + 4His (RQ13 / 4) is 550 μg / ml. Each 1 ml obtained, therefore, gave a total yield of 550 μg. Obtaining was carried out from 2 liters of culture → output per liter = ~ 275 μg. The activity of T1cEAK2 + 4-His achieves more repeated induction than rhGH at higher protein concentrations. A similar result is obtained when the tandem is tested on a molar basis.
ПРИМЕР 4EXAMPLE 4
Концентрацию χ1C3 измеряли, используя анализ по Брэдфорду (Bradford's). rhGH (~1 мг/мл) измеряли параллельно для подтверждения достоверности данных, полученных из анализа по Брэдфорду. Затем использовали χ1С3 для прямой замены стандартов GH в биоанализе на GH с получением стандартной кривой тандема. Пробы очищенного и неочищенного тандема и rhGH измеряли относительно стандартной кривой GH и стандартной кривой тандема, затем измеряли концентрацию белка из каждого планшета ELISA. GH ELISA дает приблизительно две третьих фактического значения тандемов при измерении посредством этих ELISA. Это проиллюстрировано на Фиг.19.The concentration of χ1C3 was measured using Bradford's analysis. rhGH (~ 1 mg / ml) was measured in parallel to confirm the reliability of the data obtained from the Bradford analysis. Then χ1C3 was used to directly replace GH standards in bioassay with GH to obtain a standard tandem curve. Samples of purified and untreated tandem and rhGH were measured relative to the standard GH curve and standard tandem curve, then the protein concentration from each ELISA plate was measured. The GH ELISA gives approximately two thirds of the actual tandem value when measured by these ELISA. This is illustrated in FIG. 19.
ПРИМЕР 5EXAMPLE 5
Тандемы пролактин/GHTandem Prolactin / GH
Тандемы пролактина и/или GH с их соответствующей антагонистической мутацией или без нее можно синтезировать, используя PCR для введения подходящих сайтов рестрикции в каждый конец гена, чтобы сделать возможным лигирование в тандемный ген.Tandems of prolactin and / or GH with or without their corresponding antagonistic mutation can be synthesized using PCR to introduce suitable restriction sites at each end of the gene to enable ligation into the tandem gene.
Гибкие тандемыFlexible tandems
Тандемный ген конструируют путем связывания двух белковых доменов гибким линкером на основе последовательности (G4S)n; на каждом конце белковых доменов и линкера есть уникальные сайты рестрикции (Фиг.20).The tandem gene is constructed by linking two protein domains with a flexible linker based on the sequence (G 4 S) n; at each end of the protein domains and linker there are unique restriction sites (Figure 20).
Следовательно, два белковых домена в данном тандеме можно изменять путем лигирования в различных доменах. Например, пролактин (PRL), мутант пролактина G129R с удаленными аминокислотами 1-14 (Δ1-14PRL.G129R), гормон роста (GH) и антагонистический мутант гормона роста G120R (GH.G120R) можно объединять в тандемном гене множеством способов (Фиг.Б). Фиг.22 и 23 показывают нуклеотидные последовательности и последовательности белков для этих доменов.Therefore, two protein domains in this tandem can be changed by ligation in different domains. For example, prolactin (PRL), the prolactin mutant G129R with amino acids 1-14 deleted (Δ1-14PRL.G129R), growth hormone (GH) and the growth hormone antagonist G120R (GH.G120R) can be combined in a tandem gene in many ways (Fig. B) Figures 22 and 23 show the nucleotide and protein sequences for these domains.
Для генерации генов с желательным белковым доменом, фланкированным подходящими сайтами для эндонуклеаз рестрикции, можно использовать стандартный PCR. Расщепление продукта PCR и реципиентного вектора этими эндонуклеазами рестрикции с последующим лигированием и трансформацией генерирует тандем с желательными белковыми доменами. Этот процесс можно проводить на любом белковом домене или на линкере (Фиг.24), которые были бы замещены, используя олигонуклеотидный димер, как уже было описано.To generate genes with the desired protein domain flanked by suitable restriction endonuclease sites, standard PCR can be used. Cleavage of the PCR product and the recipient vector by these restriction endonucleases, followed by ligation and transformation, generates a tandem with the desired protein domains. This process can be carried out on any protein domain or linker (Fig. 24), which would be substituted using an oligonucleotide dimer, as already described.
Полужесткие тандемыSemi-rigid tandems
Тандемный ген конструируют путем связывания двух белковых доменов со спиральным линкером на основе последовательности А(ЕА3К)nA; на каждом конце белковых доменов и линкера есть уникальные сайты рестрикции (Фиг.20).The tandem gene is constructed by linking two protein domains to a helical linker based on the sequence A (EA 3 K) n A; at each end of the protein domains and linker there are unique restriction sites (Figure 20).
Следовательно, два белковых домена в данном тандеме можно изменять путем лигирования в различных доменах. Например, пролактин (PRL), мутант пролактина G129R с удаленными аминокислотами 1-14 (Δ1-14PRL.G129R), гормон роста (GH) и антагонистический мутант гормона роста G120R (GH.G120R) можно объединять в тандемном гене множеством способов (Фиг.21). Фиг.22 и 23 показывают нуклеотидные последовательности и последовательности белков для этих доменов.Therefore, two protein domains in this tandem can be changed by ligation in different domains. For example, prolactin (PRL), the prolactin mutant G129R with amino acids 1-14 deleted (Δ1-14PRL.G129R), growth hormone (GH) and the growth hormone antagonist G120R (GH.G120R) can be combined in a tandem gene in many ways (Fig. 21). Figures 22 and 23 show the nucleotide and protein sequences for these domains.
Для генерации генов с желательным белковым доменом, фланкированным подходящими сайтами эндонуклеаз рестрикции, можно использовать стандартный PCR. Расщепление продукта PCR и реципиентного вектора этими эндонуклеазами рестрикции с последующим лигированием и трансформацией генерирует тандем с желательными белковыми доменами. Этот процесс можно проводить на любом белковом домене или на линкере (Фиг.24), которые были бы замещены, используя олигонуклеотидный димер, как уже было описано.To generate genes with the desired protein domain flanked by suitable restriction endonuclease sites, standard PCR can be used. Cleavage of the PCR product and the recipient vector by these restriction endonucleases, followed by ligation and transformation, generates a tandem with the desired protein domains. This process can be carried out on any protein domain or linker (Fig. 24), which would be substituted using an oligonucleotide dimer, as already described.
Жесткие тандемыHard tandems
Два домена тандема нужно связать непосредственно через С-конец α-спирали домена А и N-концевую α-спираль домена Б. Следовательно, гены для данных белков (Фиг.22 и 23) в домене А и Б нужно урезать так, чтобы спиральный линкер [А(ЕА3К)nA] соединялся непосредственно с этими спиралями.The two tandem domains must be connected directly through the C-end of the α-helix of domain A and the N-terminal α-helix of domain B. Therefore, the genes for these proteins (Figs. 22 and 23) in domain A and B need to be cut so that the spiral linker [A (EA 3 K) n A] connected directly to these spirals.
Следовательно:Hence:
Тандемный ген конструируют путем связывания двух белковых доменов со спиральным линкером на основе последовательности А(ЕА3К)nA; на каждом конце белковых доменов и линкера есть уникальные сайты рестрикции (Фиг.20). Уникальный сайт Notl сконструировали в N-терминальном конце линкерного участка, и уникальный сайт Nrul сконструировали в С-терминальном конце GH (Фиг.5 и 6); это делает возможной модификацию линкерного участка в тандемах GH.The tandem gene is constructed by linking two protein domains to a helical linker based on the sequence A (EA 3 K) n A; at each end of the protein domains and linker there are unique restriction sites (Figure 20). A unique Notl site was constructed at the N-terminal end of the linker region, and a unique Nrul site was constructed at the C-terminal end of GH (Figures 5 and 6); this makes it possible to modify the linker region in GH tandems.
N-концевую последовательность линкера, включающую сайт Notl, можно непосредственно добавить к гену PRL в положении домена А, позволяя сконструировать конструкты на основе матрицы PRL-линкер-GH (Фиг.25). Однако в случаях, когда домен Б представляет собой PRL (Фиг.25), на границе между линкером и доменом Б необходимо ввести уникальный сайт рестрикции.The N-terminal linker sequence including the Notl site can be directly added to the PRL gene at domain A position, allowing constructing constructs based on the PRL-linker-GH matrix (Fig. 25). However, in cases where domain B is PRL (FIG. 25), a unique restriction site must be entered at the boundary between the linker and domain B.
Следовательно, два белковых домена в данном тандеме можно изменять путем лигирования в различных усеченных доменах. Например, пролактин (PRL), мутант пролактина G129R с удаленными аминокислотами 1-14 (Δ1-14PRL.G129R), гормон роста (GH) и антагонистический мутант гормона роста G120R (GH.G120R) можно объединять в тандемном гене множеством способов (Фиг.21). В зависимости от их положения в домене А или в домене Б белковые домены нужно будет урезать, как описано выше.Therefore, two protein domains in this tandem can be changed by ligation in different truncated domains. For example, prolactin (PRL), a prolactin mutant G129R with amino acids 1-14 deleted (Δ1-14PRL.G129R), growth hormone (GH) and the growth hormone antagonist G120R (GH.G120R) can be combined in a tandem gene in many ways (Fig. 21). Depending on their position in domain A or domain B, protein domains will need to be trimmed as described above.
Для генерации генов с желательным белковым доменом, фланкированным подходящими сайтами эндонуклеаз рестрикции, можно использовать стандартный PCR. Расщепление продукта PCR и реципиентного вектора этими эндонуклеазами рестрикции с последующим лигированием и трансформацией будет генерировать тандем с желательными белковыми доменами. Этот процесс можно проводить на любом белковом домене или на линкере, и он является аналогичным методологии, использованной для гибких и полугибких линкеров (Фиг.24).To generate genes with the desired protein domain flanked by suitable restriction endonuclease sites, standard PCR can be used. Cleavage of the PCR product and the recipient vector by these restriction endonucleases, followed by ligation and transformation, will generate a tandem with the desired protein domains. This process can be carried out on any protein domain or on the linker, and it is similar to the methodology used for flexible and semi-flexible linkers (Fig.24).
Claims (10)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US59135804P | 2004-07-26 | 2004-07-26 | |
| US60/591,358 | 2004-07-26 | ||
| GB0416687A GB0416687D0 (en) | 2004-07-27 | 2004-07-27 | Linkers |
| GB0416687.2 | 2004-07-27 | ||
| GB0502839.4 | 2005-02-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007106043A RU2007106043A (en) | 2008-09-10 |
| RU2391353C2 true RU2391353C2 (en) | 2010-06-10 |
Family
ID=39866259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007106043/13A RU2391353C2 (en) | 2004-07-26 | 2005-07-18 | Polypeptide with growth hormone receptor agonist properties, nucleic acid coding said polypeptide, expression vector thereof and cell producing said polypeptide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2391353C2 (en) |
-
2005
- 2005-07-18 RU RU2007106043/13A patent/RU2391353C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ARAI R. ET AL., Protein Engineering, v.14, no.8, 529-532, 2001. BEYERMANN M. ET AL., J. Biol. Chem., 275, no.8, 5702-5709, 2000. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007106043A (en) | 2008-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090221477A1 (en) | Linkers | |
| JP6694409B2 (en) | TNFSF single chain molecule | |
| ES2327409T3 (en) | IMPROVED FC FUSION PROTEINS. | |
| EP1183360B1 (en) | Modified cytokine for its stabilisation | |
| JP2004522424A (en) | Apolipoprotein analog | |
| PL210714B1 (en) | Modified polypeptide | |
| US20070092933A1 (en) | Production of multimeric fusion proteins using a c4bp scaffold | |
| RU2325400C2 (en) | Multimers of receptor-binding ligands | |
| JP6320973B2 (en) | B cell activator antagonist, preparation method and use thereof | |
| RU2391353C2 (en) | Polypeptide with growth hormone receptor agonist properties, nucleic acid coding said polypeptide, expression vector thereof and cell producing said polypeptide | |
| US20220267434A1 (en) | Long-Acting Therapeutic Fusion Proteins | |
| WO2022117044A1 (en) | Glp-1/gcg dual receptor agonist polypeptide and fusion protein thereof | |
| WO2021143733A1 (en) | Fusion protein, preparation method therefor and use thereof | |
| US20070264234A1 (en) | Cytokine Variant Polypeptides | |
| RU2821896C1 (en) | NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FUSED PROTEIN CONSISTING OF FUNCTIONAL FRAGMENT OF HUMAN IL-1RA AND CONSTANT PART OF HEAVY CHAIN OF HUMAN IgG4 | |
| CN101014616A (en) | Linkers | |
| CN113527502B (en) | Nano antibody recombinant protein for treating rheumatoid arthritis | |
| WO2022188883A1 (en) | Fusion protein of tnfr2 and april baff receptor | |
| CA2418913A1 (en) | Peptide mimetics | |
| KR101172045B1 (en) | Apolipoprotein analogues |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110719 |