RU2382048C1 - Medicinal agent based on modified alpha interferon with prolonged therapeutic action - Google Patents
Medicinal agent based on modified alpha interferon with prolonged therapeutic action Download PDFInfo
- Publication number
- RU2382048C1 RU2382048C1 RU2008151372/15A RU2008151372A RU2382048C1 RU 2382048 C1 RU2382048 C1 RU 2382048C1 RU 2008151372/15 A RU2008151372/15 A RU 2008151372/15A RU 2008151372 A RU2008151372 A RU 2008151372A RU 2382048 C1 RU2382048 C1 RU 2382048C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon
- polyethylene glycol
- alpha interferon
- peg
- interferon alpha
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности и касается новых средств с активностью интерферона альфа.The invention relates to the field of medicine and the pharmaceutical industry and relates to new agents with interferon alpha activity.
Интерферон альфа широко известен как иммуномодулятор, противовирусное и противоопухолевое средство. Интерферон альфа ингибирует репликацию внутриклеточных паразитов, например вирусов и хламидий. Обладает антипролиферативным действием, тормозит деления клеток, в особенности опухолевых. Оказывает угнетающее влияние на синтез некоторых онкогенов, позволяет остановить неопластическую трансформацию клеток и ингибировать опухолевый рост. Интерферон стимулирует процесс презентации антигена иммунокомпетентным клеткам, обладает способностью стимулировать фагоцитарную активность макрофагов, а также цитотоксическую активность Т-клеток и "натуральных киллеров", участвующих в противовирусном иммунитете. Благодаря иммуномодулирующей активности происходит активизация иммунитета и последующая нормализация иммунного статуса организма.Interferon alfa is widely known as an immunomodulator, antiviral and antitumor agent. Interferon alpha inhibits the replication of intracellular parasites, such as viruses and chlamydia. It has an antiproliferative effect, inhibits cell division, especially tumor. It has a depressing effect on the synthesis of some oncogenes, allows you to stop the neoplastic transformation of cells and inhibit tumor growth. Interferon stimulates the process of antigen presentation to immunocompetent cells, and has the ability to stimulate the phagocytic activity of macrophages, as well as the cytotoxic activity of T cells and "natural killers" involved in antiviral immunity. Thanks to immunomodulatory activity, activation of the immune system and subsequent normalization of the immune status of the body occur.
Препарат может применяться при инфекционных заболеваниях, таких как гепатит В, B+D, С, папилломатоз, кондиломы, энцефалит и менингоэнцефалит, конъюнктивит, кератоконъюнктивит, цитомегаловирусная инфекция, герпес, хламидиоз, уреаплазмоз и др. Онкологических заболеваниях: при волосатоклеточном лейкозе, хроническом миелолейкозе, неходжкинской лимфоме, меланоме, множественной миеломе, саркоме Капоши на фоне СПИД, прогрессирующем раке почки.The drug can be used for infectious diseases, such as hepatitis B, B + D, C, papillomatosis, condylomas, encephalitis and meningoencephalitis, conjunctivitis, keratoconjunctivitis, cytomegalovirus infection, herpes, chlamydia, ureaplasmosis and other cancerous diseases: , non-Hodgkin’s lymphoma, melanoma, multiple myeloma, Kaposi’s sarcoma with AIDS, progressive kidney cancer.
Однако биологическая активность интерферона, так же как и многих других белков, ограничена их коротким периодом полураспада в плазме крови.However, the biological activity of interferon, as well as many other proteins, is limited by their short half-life in blood plasma.
Модификация интерферона путем конъюгации белка с полиэтиленгликолем (ПЭГилирование) позволяет существенно увеличить время его персистенции в плазме крови, повысить его стабильность и устойчивость к протеолизу, снизить его иммуногенность и в сумме значительно усилить терапевтический эффект препарата.Modification of interferon by conjugation of a protein with polyethylene glycol (PEGylation) can significantly increase the time of its persistence in blood plasma, increase its stability and resistance to proteolysis, reduce its immunogenicity and, in total, significantly enhance the therapeutic effect of the drug.
К числу препаратов ПЭГилированных белков, получивших в настоящее время наибольшее признание, относятся производные интерферона альфа. «Пэгинтрон» (PEGINTRON™ - peginterferon alfa-2b производства Schering-Plough Corporation) представляет собой монозамещенный интерферон-
Не менее важным фактором, влияющим на успешность получения эффективных и биосовместимых ПЭГ-производных, является выбор методов активации полимера. Для этих целей были использованы ацетальдегидные, пропиональдегидные, сукцинимидилкарбонатные, сукцинимидилсукцинатные, триазиновые, N-гидроксисукцинимидные, мезилатные, трезилатные и другие активные группы. Способы активации, направленные на модификацию иных, нежели аминогруппы, в данном случае нами не рассматриваются, т.к. более удобных для модификации свободных сульфгидрильных групп интерферон-альфа не содержат. Несмотря на некоторые преимущества, например, альдегидных групп в некоторой избирательности в отношении альфа аминогрупп, множественная модификация, а также некоторые побочные реакции не позволяют считать их идеальным выбором. Нестабильность сукцинимидилсукцинатных и сукцинимидилкарбонатных производных, а также способность последних образовывать лабильные связи с остатками гистидина существенно ограничивают перспективы их использования.An equally important factor affecting the success of obtaining effective and biocompatible PEG derivatives is the choice of polymer activation methods. For these purposes, acetaldehyde, propionaldehyde, succinimidyl carbonate, succinimidyl succinate, triazine, N-hydroxysuccinimide, mesylate, tresylate and other active groups were used. Activation methods aimed at modifying other than amino groups are not considered in this case, because more convenient for modification of free sulfhydryl groups do not contain interferon-alpha. Despite some advantages, for example, of aldehyde groups in some selectivity for alpha amino groups, multiple modification, as well as some adverse reactions do not allow us to consider them an ideal choice. The instability of succinimidyl succinate and succinimidyl carbonate derivatives, as well as the ability of the latter to form labile bonds with histidine residues significantly limit the prospects for their use.
Прототипом для настоящего изобретения является патент RU 2298560 С2, в котором описывается получение конъюгатов интерферона альфа с двухцепочечными разветвленными молекулами полиэтиленгликоля с молекулярными массами цепей от 7500 до 35000 Да, активированных молекулой триазина.The prototype for the present invention is patent RU 2298560 C2, which describes the preparation of conjugates of interferon alpha with double-stranded branched polyethylene glycol molecules with molecular weights of chains from 7500 to 35000 Da activated by a triazine molecule.
Основным и существенным недостатком такой молекулы является ее способность к модификации помимо аминогрупп имидазольного кольца гистидина. Такая реакция является обратимой, что приводит к высвобождению активированных молекул ПЭГа, способных вступать в реакцию с другими биомолекулами и клеточными структурами организма.The main and significant drawback of such a molecule is its ability to modify, in addition to the amino groups of the imidazole histidine ring. Such a reaction is reversible, which leads to the release of activated PEG molecules capable of reacting with other biomolecules and cellular structures of the body.
Задачей изобретения являлось получение конъюгата, представляющего собой модифицированный полиэтиленгликолем интерферон альфа, имеющий сравнимые с интерфероном фармакологические свойства, но имеющий отличия как по структуре, так и по технологии получения и не имеющий указанных недостатков.The objective of the invention was to obtain a conjugate, which is a modified polyethylene glycol interferon alpha, having pharmacological properties comparable to interferon, but having differences both in structure and production technology and without these drawbacks.
Задача решается новым лекарственным средством, представляющим собой конъюгат с активностью интерферона альфа, соединенного с молекулой разветвленного полиэтиленгликоля общей формулы:The problem is solved by a new drug, which is a conjugate with the activity of interferon alpha, combined with a branched polyethylene glycol molecule of the general formula:
где: INF - полипептид интерферона альфа;where: INF - interferon alpha polypeptide;
R - радикалы 2-аминоэтанола -HN-CH2-CH2-O-,R is the radicals of 2-aminoethanol -HN-CH 2 -CH 2 -O-,
3-аминопропанола -HN-CH2-CH2-CH2-O-, гомосерина -HN-CH(COOH)-CH2-CH2-O-;3-aminopropanol -HN-CH 2 -CH 2 -CH 2 -O-, homoserine -HN-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 -O-;
n и n1 - одинаковые или различные =50-170,n and n 1 are the same or different = 50-170,
в котором с аминогруппами полипептида интерферона альфа ковалентно связаны остатки разветвленного полиэтиленгликоля (ПЭГа) с молекулярной массой 5000-15000 Да.in which the residues of branched polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 5000-15000 Da are covalently linked to the amino groups of the interferon alpha polypeptide.
Под - INF (-интерферон) понимают природный или рекомбинантный полипептид, обладающий активностью интерферона альфа, предпочтительно человеческий, получаемый из любого обычного источника, такого как ткани, путем химического синтеза протеина из культуры клеток с использованием нативных и рекомбинантных клеток. Способы получения интерферона альфа из природных или рекомбинантных источников хорошо известны (Pestka, Sci. Am., 249, 36 (1983); Европейский патент 43980).By - INF (interferon) is meant a natural or recombinant polypeptide having interferon alpha activity, preferably human, obtained from any conventional source, such as tissue, by chemically synthesizing a protein from a cell culture using native and recombinant cells. Methods for producing interferon alfa from natural or recombinant sources are well known (Pestka, Sci. Am., 249, 36 (1983); European Patent 43980).
Остатки полиэтиленгликоля образуют ковалентные связи с аминогруппами интерферона. В частности, с рекомбинантным интерфероном альфа-2-иммуномодуляторным белком, состоящим из полипептидной цепи, включающей 165 аминокислот с двумя дисульфидными связями, образованными 4 цистеиновыми остатками. В его состав входят 10-11 остатков лизина, несущих доступные для модификации эпсилонаминогруппы, 1 свободная концевая альфа-аминогруппа, а также 3 остатка гистидина, имидазольное кольцо которого также доступно для модификации.Residues of polyethylene glycol form covalent bonds with the amino groups of interferon. In particular, with recombinant interferon alpha-2-immunomodulating protein, consisting of a polypeptide chain comprising 165 amino acids with two disulfide bonds formed by 4 cysteine residues. It consists of 10-11 lysine residues bearing the epsilonamino group available for modification, 1 free terminal alpha-amino group, and 3 histidine residues, the imidazole ring of which is also available for modification.
Для осуществления настоящего изобретения была выбрана наиболее эффективная структура разветвленной молекулы ПЭГа со средним значением молекулярной массы 5000-15000 Да, имеющая активную трезилатную группу, способную подобно гидроксисукцинимидным группам модифицировать в мягких условиях исключительно аминогруппы белка.For the implementation of the present invention, the most effective structure of a branched PEG molecule with an average molecular weight of 5000-15000 Da, having an active tresylate group capable of modifying exclusively the amino groups of a protein under mild conditions, was chosen.
Результирующая структура активированного ПЭГа выглядит следующим образом:The resulting structure of activated PEG is as follows:
где значения R, n и n1 - как указано выше.where the values of R, n and n 1 are as described above.
Известную сложность при модификации белков полиэтиленгликолями представляет свойство последних «высаливать» (осаждать из раствора) белковые молекулы при концентрациях ПЭГа выше 5%, которые недостаточны для полной модификации белка, что приводит к низким выходам целевого продукта. При получении прототипа данное обстоятельство обходилось с помощью многократного добавления активированного ПЭГа к раствору белка по мере убывания его концентрации вследствие вступления в реакцию.A known difficulty in the modification of proteins by polyethylene glycols is the property of the latter to “salt out” (precipitate from solution) protein molecules at PEG concentrations above 5%, which are insufficient for complete protein modification, which leads to low yields of the target product. Upon receipt of the prototype, this circumstance was circumvented by the repeated addition of activated PEG to the protein solution as its concentration decreased due to the reaction.
В данной работе задача повышения молярного соотношения модифицирующего агента к белку решается путем использования твердофазного носителя, адсорбирующего белок перед модификацией. В качестве такого носителя была выбрана ионообменная смола. Для модификаций белка, требующих слабощелочных значений рН 7-10, использовали анионообменные смолы, в частности Q-Sepharose Fast Flow, упакованную в хроматографическую колонку. После нанесения раствора белка и его адсорбции ионообменной смолой к сорбенту с помощью перистальтического насоса добавляли раствор ПЭГа при различных значениях рН и в объеме, равном объему хроматографической колонки. После определенного времени инкубации реакционной смеси через колонку прокачивали следующую аналогичную порцию свежего раствора ПЭГа. Количество циклов добавления реагента определялось по необходимой степени модификации интерферона.In this work, the task of increasing the molar ratio of modifying agent to protein is solved by using a solid-phase carrier adsorbing the protein before modification. An ion exchange resin was chosen as such a carrier. For protein modifications requiring slightly alkaline pH values of 7-10, anion exchange resins, in particular Q-Sepharose Fast Flow, packed in a chromatographic column, were used. After the protein solution was applied and adsorbed by the ion exchange resin, a PEG solution was added to the sorbent using a peristaltic pump at various pH values and in a volume equal to the volume of the chromatographic column. After a certain time of incubation of the reaction mixture, the next similar portion of fresh PEG solution was pumped through the column. The number of cycles of reagent addition was determined by the necessary degree of modification of interferon.
Анализ результатов экспериментов показал, что использование твердофазного процесса модификации приводит не только к повышению степени модификации белка, но и существенно повышает ее избирательность. Выход моно- и дипэгилированного продукта значительно повышается, а доля примесей более высокой степени модификации уменьшается. К такому же результату, в смысле уменьшения гетерогенности модифицированного интерферона, приводит использование в реакции модификации более низких значений рН, близких к нейтральным.An analysis of the experimental results showed that the use of the solid-phase modification process leads not only to an increase in the degree of protein modification, but also significantly increases its selectivity. The yield of mono- and di-pegylated product is significantly increased, and the proportion of impurities of a higher degree of modification is reduced. The same result, in the sense of reducing the heterogeneity of modified interferon, is caused by the use of lower pH values close to neutral in the modification reaction.
По окончании процесса модификации избыток ПЭГа удаляют промывкой сорбента нужным буферным раствором. Элюция модифицированного продукта производится линейным градиентом нейтральной соли, в частности хлористого натрия. При этом достигается фракционирование различной степени модифицированных молекул белка.At the end of the modification process, the excess PEG is removed by washing the sorbent with the desired buffer solution. The modified product is eluted by a linear gradient of a neutral salt, in particular sodium chloride. In this case, fractionation of varying degrees of modified protein molecules is achieved.
Эффективность модификации белка различными производными двуцепочечного ПЭГа существенно возрастает в ряду 2-аминоэтанол-<3-аминопропанол-<гомосерин-трезильных производных. Равные выходы монозамещенных производных (свыше 40%) достигались при 100, 40, и 20-кратных весовых избытках ПЭГа соответственно. Более высокая активность аминопропанольного и гомосеринового производных позволяет проводить эффективную модификацию белка также и в растворе без использования твердофазного носителя. Кроме того, наличие отрицательно заряженной карбоксильной группы в гомосериновом производном помимо обеспечения экспонированности активной трезилатной группы в водную фазу и повышения тропности к аминогруппам белка привносит определенные сложности для проведения реакции на анионообменной твердой фазе, благодаря ионному взаимодействию с ней и появившимися конкурентным отношениям с белковой молекулой за связывание с сорбентом.The efficiency of protein modification with various derivatives of double-stranded PEG increases significantly in the series 2-aminoethanol- <3-aminopropanol- <homoserine-trezyl derivatives. Equal yields of monosubstituted derivatives (over 40%) were achieved at 100, 40, and 20-fold weight excesses of PEG, respectively. The higher activity of the aminopropanol and homoserine derivatives allows the effective modification of the protein also in solution without the use of a solid phase carrier. In addition, the presence of a negatively charged carboxyl group in the homoserine derivative, in addition to ensuring the exposure of the active tresylate group to the aqueous phase and increasing tropism to the amino groups of the protein, introduces certain difficulties for the reaction on the anion-exchange solid phase due to the ionic interaction with it and the emerging competitive relations with the protein molecule beyond binding to the sorbent.
Хотя анионообменный сорбент обеспечивает отделение белков от избытка реагента и частичное разделение продуктов модификации, более эффективное фракционирование различной степени модифицированных производных и немодифицированного белка обеспечивает катионообменная хроматография, например, на SP- или CM-Sepharose FF. Использование линейного, ступенчатого или более сложной формы градиентов нейтральной соли, например хлористого натрия, или слабокислых буферных растворов, например ацетата аммония или натрия, позволяет достичь высокой степени чистоты ПЭГилированных препаратов интерферона. Для достижения гомогенности препарата, а также в качестве конечной стадии приготовления фармакопейной субстанции препарата катионообменная хроматография может быть дополнена гель-фильтрационной, например, на колонке Superdex 75.Although anion-exchange sorbent provides separation of proteins from excess reagent and partial separation of modification products, cation-exchange chromatography, for example, on SP- or CM-Sepharose FF provides a more efficient fractionation of various degrees of modified derivatives and unmodified protein. The use of a linear, stepwise or more complex form of gradients of a neutral salt, for example sodium chloride, or weakly acidic buffer solutions, for example ammonium acetate or sodium, allows to achieve a high degree of purity of PEGylated interferon preparations. To achieve homogeneity of the drug, as well as as the final stage of preparation of the pharmacopeia substance of the drug, cation exchange chromatography can be supplemented by gel filtration, for example, on a Superdex 75 column.
Конъюгаты согласно изобретению могут быть использованы для лечения в виде фармацевтических композиций для парэнтерального введения, таких как растворы для инъекций, суппозитории, приготовленных известными в химико-фармацевтической области способами. В качестве приемлемых вспомогательных носителей могут быть указаны: вода для инъекций, буферные растворы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, хлориды натрия, калия, лимонная кислота, ПАВ, сахара, сахарные спирты, такие как трегалоза, маннитол, сорбитол и др.The conjugates according to the invention can be used for treatment in the form of pharmaceutical compositions for parenteral administration, such as injectable solutions, suppositories, prepared by methods known in the chemical pharmaceutical field. Suitable excipients may include: water for injection, buffers, for example, acetate, phosphate, citrate, sodium chloride, potassium chloride, citric acid, surfactants, sugars, sugar alcohols such as trehalose, mannitol, sorbitol, etc.
Пример 1. Синтез разветвленных полиэтиленгликолей.Example 1. Synthesis of branched polyethylene glycols.
Синтез линейных полиэтиленгликолей заданной молекулярной массы с концевыми функциональными группами осуществляют методом анионной полимеризации окиси этилена (см. пример 1 патента РФ 2298560).The synthesis of linear polyethylene glycols of a given molecular weight with terminal functional groups is carried out by the method of anionic polymerization of ethylene oxide (see example 1 of RF patent 2298560).
Синтез разветвленного полиэтиленгликоль-аминопропанол-трезила с молекулярной массой 10000 Да общей формулы:Synthesis of branched polyethylene glycol-aminopropanol-tresil with a molecular weight of 10,000 Da of the general formula:
проводят в три стадии.carried out in three stages.
Стадия синтеза №1. Синтез разветвленного полиэтиленгликоль-триазин-монохлорида общей формулы:Stage synthesis No. 1. Synthesis of branched polyethylene glycol triazine monochloride of the general formula:
В трехгорлую колбу объемом 200 мл вносят 15,0 г (0,003 г·моль) ПЭГ-5000 с одной гидроксильной группой на конце цепи, 52 мл безводного 1,2-дихлорэтана и при перемешивании получают 25% раствор олигомера. При 20°С в колбу при перемешивании вносят 0,44 мл (0,003 2 г-моль) триэтиламина; после 10 минут взаимодействия ПЭГ с катализатором реакции в колбу вносят 0,28 г (0,0015 г·моль) цианурхлорида. Реакционную массу нагревают до температуры кипения 1,2-дихлорэтана (84°С) и ведут реакцию в течение 2 часов. Далее реакционную массу охлаждают до комнатной температуры и выливают при слабом перемешивании в 150 мл серного эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, помещают в стакан, заливают 150 мл свежего серного эфира, перемешивают суспензию 20 минут и заново отфильтровывают промытый олигомер. Полученный порошок (12,7 г) сушат 1 сутки на воздухе, растворяют в 30 мл 1,2-дихлоэтана и высаждают продукт в 150 мл серного эфира. Осадок отфильтровывают, промывают (как указано выше) в 150 мл серного эфира, сушат 1 сутки на воздухе, а затем 2 суток в вакуумном шкафу при 20°С. Выход продукта после переосаждения составляет 6,9 г (46% от теоретического выхода).15.0 g (0.003 g mol) of PEG-5000 with one hydroxyl group at the end of the chain, 52 ml of anhydrous 1,2-dichloroethane are added to a 200 ml three-necked flask and, with stirring, a 25% oligomer solution is obtained. At 20 ° C, 0.44 ml (0.003 2 g-mol) of triethylamine are added to the flask with stirring; after 10 minutes of PEG reaction with the reaction catalyst, 0.28 g (0.0015 g mol) of cyanuric chloride are added to the flask. The reaction mass is heated to the boiling point of 1,2-dichloroethane (84 ° C) and the reaction is carried out for 2 hours. Next, the reaction mass is cooled to room temperature and poured with gentle stirring in 150 ml of sulfuric ether. The precipitate formed is filtered off, placed in a beaker, 150 ml of fresh sulfuric ether are poured, the suspension is stirred for 20 minutes and the washed oligomer is filtered off again. The resulting powder (12.7 g) was dried for 1 day in air, dissolved in 30 ml of 1,2-dichloethane and the product precipitated in 150 ml of sulfuric ether. The precipitate is filtered off, washed (as indicated above) in 150 ml of sulfuric ether, dried for 1 day in air, and then 2 days in a vacuum oven at 20 ° C. The product yield after reprecipitation is 6.9 g (46% of theoretical yield).
Стадия синтеза №2. Синтез разветвленного полиэтиленгликоль-триазин-аминопропанола общей формулы:Stage synthesis No. 2. Synthesis of branched polyethylene glycol-triazine-aminopropanol of the general formula:
В трехгорлую колбу объемом 200 мл вносят 0,320 г карбоната натрия, 60 мл дистиллированной воды, 18,0 г (0,0018 г·моль) разветвленного полиэтиленгликоль-триазин-монохлорида, включают ток аргона, магнитную мешалку и обогрев; при температуре силиконовой бани 50-60°С и перемешивании получают опалесцирующий раствор без осадка. Подключают вакуум от водоструйного насоса (7-10 мм рт.ст) и медленно повышают температуру бани до 105-110°С. Реакционная масса закипает и одновременно с протеканием реакции идет отгонка воды, температура паров воды в верхней части насадки составляет 55-60°С. Реакцию при указанных температуре и вакууме ведут 4 часа и полностью отгоняют воду. Получают расплав продукта реакции при температуре бани 110°С. Вакуум стравливают аргоном и охлаждают колбу с продуктом реакции до комнатной температуры в токе инертного газа.0.320 g of sodium carbonate, 60 ml of distilled water, 18.0 g (0.0018 g · mol) of branched polyethylene glycol-triazine monochloride are introduced into a 200 ml three-necked flask, include argon flow, magnetic stirrer and heating; at a temperature of a silicone bath of 50-60 ° C and stirring, an opalescent solution is obtained without sediment. Connect the vacuum from the water-jet pump (7-10 mm Hg) and slowly increase the temperature of the bath to 105-110 ° C. The reaction mass boils and at the same time as the reaction proceeds, water is distilled off, the temperature of the water vapor in the upper part of the nozzle is 55-60 ° C. The reaction at the indicated temperature and vacuum is carried out for 4 hours and the water is completely distilled off. Get the melt of the reaction product at a bath temperature of 110 ° C. The vacuum is poured with argon and the flask with the reaction product is cooled to room temperature in an inert gas stream.
Стадия синтеза №3. Синтез разветвленного полиэтиленгликоль-аминопропанол-трезила со средней молекулярной массой 10000 Да общей формулы:Stage synthesis No. 3. Synthesis of branched polyethylene glycol-aminopropanol-tresyl with an average molecular weight of 10,000 Da of the general formula:
При комнатной температуре в колбу с продуктом стадии №2 вносят 35 мл очищенного 1,2-дихлорэтана, растворяют вещество при перемешивании с помощью магнитной мешалки и получают мутный от кристалликов солей (карбонат натрия, хлористый натрий) раствор. Соли отфильтровывают с помощью фильтра Шотта пористостью 4 мкм, фильтр промывают 35 мл 1,2-дихлорэтана. Полученный светлый раствор переливают в новую трехгорлую колбу для синтеза, охлаждают до комнатной температуры и вносят 0,33 мл (0,0024 г·моль) триэтиламина. Через 10 минут реакции с помощью микрошприца в колбу добавляют 0,30 мл (0,0027 г·моль) 2,2,2-трифторэтансульфонилхлорида и ведут реакцию 2 часа. Затем реакционный раствор выливают при слабом перемешивании в 150 мл серного эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, помещают в стакан, заливают 150 мл серного эфира, перемешивают суспензию 20 минут и заново отфильтровывают промытый олигомер. Далее порошок (14,5 г) сушат 1 сутки на воздухе, растворяют в 30 мл 1,2-дихлорэтана и высаждают продукт в 150 мл серного эфира. Осадок отфильтровывают, промывают (как указано выше) в два приема 250 мл серного эфира, сушат 1 сутки на воздухе, а затем 2 суток в вакуумном шкафу при 20°С. Выход продукта после переосаждения составляет 8,2 г (45% от теоретического выхода).At room temperature, 35 ml of purified 1,2-dichloroethane are added to the flask with the product of stage No. 2, the substance is dissolved with stirring using a magnetic stirrer, and a solution turbid from salt crystals (sodium carbonate, sodium chloride) is obtained. The salts are filtered off using a Schott filter with a porosity of 4 μm, the filter is washed with 35 ml of 1,2-dichloroethane. The resulting light solution was poured into a new three-necked flask for synthesis, cooled to room temperature and 0.33 ml (0.0024 g · mol) of triethylamine was added. After 10 minutes of the reaction, 0.30 ml (0.0027 g mol) of 2,2,2-trifluoroethanesulfonyl chloride are added to the flask using a microsyringe and the reaction is carried out for 2 hours. Then the reaction solution was poured with gentle stirring in 150 ml of sulfuric ether. The precipitate formed is filtered off, placed in a beaker, 150 ml of sulfuric ether are poured, the suspension is stirred for 20 minutes and the washed oligomer is filtered off again. Next, the powder (14.5 g) is dried for 1 day in air, dissolved in 30 ml of 1,2-dichloroethane and the product is precipitated in 150 ml of sulfuric ether. The precipitate is filtered off, washed (as described above) in two doses of 250 ml of sulfuric ether, dried for 1 day in air, and then 2 days in a vacuum oven at 20 ° C. The yield after reprecipitation is 8.2 g (45% of theoretical yield).
Аналогичным способом были получены продукты с n, n1=50 и n, n1=170.In a similar way, products with n, n 1 = 50 and n, n 1 = 170 were obtained.
Строение синтезированных продуктов подтверждено данными ЯМР-спектроскопии и гельпроникающей хроматографии.The structure of the synthesized products was confirmed by NMR spectroscopy and gel permeation chromatography.
На ЯМР спектрах соотношение интегральных интенсивностей сигналов протонов от протонов -O-СН3 групп и -СН2-СF3 групп, равное 2,5, близко к расчетному соотношению этих протонов 6:2=3.In the NMR spectra, the ratio of the integrated intensities of the proton signals from the protons of the —O — CH 3 groups and —CH 2 —CF 3 groups, equal to 2.5, is close to the calculated ratio of these protons 6: 2 = 3.
Определение молекулярной массы и молекулярно-массового распределения синтезированных продуктов проводили с помощью хроматографа фирмы «Уотерс» со стирогелевыми колонками пористостью 20, 50 и 100 нм. Исследования проводили при 30°С с использованием в качестве элюента тетрагидрофурана. Результаты гельпроникающей хроматографии для исходного ПЭГ-5000 и синтезированных активированных олигомеров приведены в таблице.The molecular weight and molecular weight distribution of the synthesized products were determined using a Waters chromatograph with styrene gel columns with porosities of 20, 50, and 100 nm. Studies were carried out at 30 ° C using tetrahydrofuran as eluent. The results of gel permeation chromatography for the original PEG-5000 and synthesized activated oligomers are shown in the table.
Как видно из таблицы, величины средневесовых (Mw) и среднечисловых (Mn) молекулярных масс разветвленных активированных производных полиэтиленгликолей (пп.2-4) близки к теоретической величине 10000 Да. Кроме того, величины молекулярно-массового распределения (Mw/Mn) для разветвленных продуктов реакции невелики и сравнимы с распределением макромолекул в исходном ПЭГ-5000.As can be seen from the table, the values of weight average (M w ) and number average (M n ) molecular weights of branched activated derivatives of polyethylene glycols (claims 2-4) are close to a theoretical value of 10,000 Da. In addition, the molecular weight distribution (M w / M n ) for the branched reaction products is small and comparable with the distribution of macromolecules in the original PEG-5000.
Пример 2. Твердофазнын синтез ПЭГ-ИФН.Example 2. Solid-phase synthesis of PEG-IFN.
Субстанция интерферона разводилась деионизованной водой, рН доводился до 7.5 и сорбировались на твердой фазе в объеме из расчета 1.5 мг интерферона на 1 мл Q-Sepharose Fast Flow, предварительно уравновешенных 20 мМ натрий-фосфатным буфером рН 7.5.The interferon substance was diluted with deionized water, the pH was adjusted to 7.5 and adsorbed on the solid phase in a volume of 1.5 mg of interferon per 1 ml of Q-Sepharose Fast Flow, previously balanced with 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.5.
После завершения сорбции сорбент упаковывался в колонку, промывался 20 мМ натрий-фосфатным буфером рН 7.5, затем на колонку наносился раствор активированного трезилхлоридом аминопропанольного производного ПЭГ в том же буфере в 50-кратном избытке по отношению к интерферону. После инкубации в течение 12 часов при +4°С колонка промывалась уравновешивающим буфером для удаления избытка ПЭГа, а белок элюировался буферным раствором, содержащим 250 мМ хлористого натрия. Продукты реакции анализировали электрофорезом.After sorption was completed, the sorbent was packed into a column, washed with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, and then a solution of a activated with a tresyl chloride aminopropanol derivative of PEG in the same buffer in a 50-fold excess relative to interferon was applied. After incubation for 12 hours at + 4 ° C, the column was washed with equilibration buffer to remove excess PEG, and the protein was eluted with a buffer solution containing 250 mM sodium chloride. The reaction products were analyzed by electrophoresis.
Пример 3. ПЭГилирование интерферона альфа 2б в растворе.Example 3. PEGylation of interferon alpha 2b in solution.
Субстанцию интерферона доводили до рН раствора 7.5. К раствору интерферона добавляли раствор активированного трезилхлоридом гомосеринового производного ПЭГ в 20 мМ натрий-фосфатном буфером, рН 7.5, затем инкубировали 12 часов при комнатной температуре на ротационном миксере. Продукты реакции анализировали электрофорезом.The interferon substance was adjusted to a pH of 7.5. To a solution of interferon was added a solution of the activated tresyl chloride homoserine derivative of PEG in 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, then incubated for 12 hours at room temperature on a rotary mixer. The reaction products were analyzed by electrophoresis.
Пример 4. Хроматографическое фракционирование ПЭГ-ИФН.Example 4. Chromatographic fractionation of PEG-IFN.
Растворы модифицированного интерферона разводили в три раза деионизованной водой для понижения ионной силы и доводили рН до 4.5. Раствор наносили на колонку CM-Sepharose Fast Flow (или SP-XL-Sepharose, Pharmacia) с соотношением диаметр/высота=1:8, уравновешенную 40 мМ буферным раствором ацетата аммония рН 4.5, содержащим 0.02% твина 20. Для элюции белка использовали градиент концентрации хлористого натрия в диапазоне 0-350 мМ. Отбирали фракции, соответствующие пикам белка. Фракции подвергали анализу электрофорезом в полиакриламидном геле.Modified interferon solutions were diluted three times with deionized water to lower ionic strength and the pH was adjusted to 4.5. The solution was applied to a CM-Sepharose Fast Flow column (or SP-XL-Sepharose, Pharmacia) with a diameter / height ratio of 1: 8 balanced with 40 mM ammonium acetate buffer pH 4.5 containing 0.02% tween 20. A gradient was used for protein elution concentration of sodium chloride in the range of 0-350 mm. The fractions corresponding to the peaks of the protein were selected. Fractions were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis.
Пример 5. Токсичность полученных ПЭГ-производных.Example 5. The toxicity of the obtained PEG derivatives.
Эксперименты по изучению токсичности выполнялись на белых нелинейных мышах. Испытание проводили на здоровых животных обоего пола. За 2 часа до проведения испытаний мышей лишали корма и воды. Животных взвешивали и отбирали особей с массой тела 20±1 г. Количество мышей, которые будут использованы для испытания на токсичность одного образца, определяется из расчета 5 мышей на каждый путь введения препарата. Для испытания токсичности производных интерферона альфа были выбраны внутривенный и внутрибрюшинный способы введения каждого образца. Раствор препарата, подлежащего испытанию, подогревали в термостате до 37°С в течение 3-5 мин и вводили со скоростью 0,1 мл/с. Тестовые дозы для каждого образца составляли - 1 млн ME производных интерферона альфа в 0,5 мл раствора натрия хлорида 0,9% для инъекций на мышь.Toxicity experiments were performed on white non-linear mice. The test was performed on healthy animals of both sexes. Mice were deprived of food and water 2 hours before the test. Animals were weighed and animals with a body weight of 20 ± 1 g were selected. The number of mice that will be used for toxicity testing of one sample is determined based on 5 mice for each route of drug administration. To test the toxicity of interferon alfa derivatives, the intravenous and intraperitoneal routes of administration of each sample were selected. The solution of the drug to be tested was heated in a thermostat to 37 ° C for 3-5 minutes and was administered at a rate of 0.1 ml / s. Test doses for each sample were 1 million ME derivatives of interferon alfa in 0.5 ml of 0.9% sodium chloride solution for injection per mouse.
Сразу после введения раствора препарата отмечают возможные признаки интоксикации и проводят непрерывный мониторинг в течение 30 минут. Последующее наблюдение за состоянием животных ведут в течение 48 часов. Препарат считают выдержавшим испытание на токсичность, если в течение предусмотренного срока наблюдения не погибнет ни одна из подопытных мышей.Immediately after administration of the drug solution, possible signs of intoxication are noted and continuous monitoring is carried out for 30 minutes. Subsequent monitoring of the condition of the animals is carried out within 48 hours. The drug is considered to have passed the toxicity test if not one of the experimental mice dies within the prescribed observation period.
При использовании указанных доз производных интерферона альфа летальных эффектов не наблюдалось.When using these doses of derivatives of interferon alfa lethal effects were not observed.
Пример 6. Противовирусная активность ПЭГ-ИФН in vitro.Example 6. Antiviral activity of PEG-IFN in vitro.
Противовирусную активность определяли стандартным методом (Европейская фармакопея 5.3, статья интерферон альфа) в культуре перевиваемых линий клеток MDBK (АТСС №CCL22), свободных от микробиологического загрязнения, чувствительных к интерферону альфа типа, против вируса везикулярного стоматита, штамм «Индиана» (ГКВ ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН №600) в дозе, соответствующей 100 ТИД50 в 0,1 мл. Активность интерферона альфа определяли, сравнивая эффект защиты клеток от цитопатического действия вируса, испытуемого образца и стандарта (WHO International Standard INTERFERON ALPHA).Antiviral activity was determined by the standard method (European Pharmacopoeia 5.3, article interferon alfa) in a culture of transplantable MDBK cell lines (ATCC No. CCL22) free of microbiological contamination, sensitive to interferon alfa type, against vesicular stomatitis virus, Indiana strain (GKV GU Research Institute Virology named after D.I. Ivanovsky RAMS No. 600) in a dose corresponding to 100 TID50 in 0.1 ml. The activity of interferon alpha was determined by comparing the effect of protecting cells from the cytopathic effect of the virus, test sample and standard (WHO International Standard INTERFERON ALPHA).
1. Исходный интерферон альфа фирмы ООО "Фармапарк", Москва, Россия, раствор - 10 мкг/мл.1. The initial interferon alpha company Pharmapark LLC, Moscow, Russia, the solution is 10 μg / ml.
2. Пэгилированный интерферон альфа Pegasys, Хоффманн-Ля Рош, Швейцария, раствор - 50 мкг/мл.2. Pegylated interferon alfa Pegasys, Hoffmann-La Roche, Switzerland, solution - 50 μg / ml.
3. Конъюгат по примеру 2 раствор - 20 мкг/мл.3. The conjugate of example 2 solution is 20 μg / ml.
4. Конъюгат по примеру 3 раствор - 25 мкг/мл.4. The conjugate of example 3 solution is 25 μg / ml.
Биологическое тестирование дало следующие результаты:Biological testing yielded the following results:
Таким образом, все модифицированные препараты сохраняют значительную противовирусную активность интерферона альфа.Thus, all modified drugs retain significant antiviral activity of interferon alpha.
Пример 7. Антипролиферативная активность in vitroExample 7. Antiproliferative activity in vitro
Антипролиферативную активность интерферона оценивали с помощью колориметрического теста с МТТ [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide], как описано в (Takemoto и др., 2004) на линии клеток Daudi, лимфома Буркитта (АТСС №CCL-213). Человеческие клетки линии поддерживали в виде суспензионных культур в среде RPMI 1640, дополненной 10%-ной фетальной бычьей сывороткой и 2 мМ глютамином. Клетки (1,5×104) добавляли в лунки планшетов для микротитрования (Costar, MA) с 100 мкл среды. Различные концентрации интерферона стандарта (WHO International Standard INTERFERON ALPHA) и конъюгата формулы I, полученного в примере 3, добавляли в лунки объемом 100 мкл. Планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 72 часов. Результаты измерений:The antiproliferative activity of interferon was evaluated using a colorimetric test with MTT [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyltetrazolium Bromide], as described in (Takemoto et al., 2004) on a Daudi cell line, lymphoma Burkitt (ATCC No.CCL-213). Human line cells were maintained as suspension cultures in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 2 mM glutamine. Cells (1.5 × 10 4 ) were added to the wells of microtiter plates (Costar, MA) with 100 μl of medium. Different concentrations of the interferon standard (WHO International Standard INTERFERON ALPHA) and the conjugate of the formula I obtained in Example 3 were added to 100 μl wells. The plates were incubated at 37 ° C in 5% CO 2 for 72 hours. Measurement Results:
Таким образом, конъюгат формулы I оказывал выраженное антипролиферативное действие на клетки лимфомы Буркитта в стандартном тесте (Hirai и др., 1987).Thus, the conjugate of formula I exerted a pronounced antiproliferative effect on Burkitt's lymphoma cells in a standard test (Hirai et al., 1987).
Пример 8. Фармакокинетика препаратов.Example 8. Pharmacokinetics of drugs.
Для изучения фармакокинетики средства конъюгат по примеру 2 вводили крысам внутривенно единократно в количестве 1 мкг в объеме по 0,5 мл/крыса.To study the pharmacokinetics of the drug, the conjugate of Example 2 was administered to rats intravenously once in an amount of 1 μg in a volume of 0.5 ml / rat.
В качестве препарата сравнения использовали пэгилированное производное интерферона (Pegasys) в той же дозе.A pegylated interferon derivative (Pegasys) at the same dose was used as a reference preparation.
У каждой крысы через определенные промежутки времени после введения из хвостовой вены брали по 0,5 мл крови. Для этого скальпелем отсекали 1,5-2 мм плоти хвоста. Кровь собирали в пробирки типа Eppendorf. Пробирки помещали в термостат и инкубировали 30 минут при 37°С. Стеклянным капилляром отделяли образовавшийся тромб от стенок пробирки. Пробирки помещали в холодильную камеру и инкубировали 4-6 часов при +4°С. Автоматической пипеткой отсасывали сыворотку и для удаления клеток крови центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. Для стерилизации образцов сыворотки крови супернатанты переносили в системы фильтрации Ultrafree-MC (Amicon) и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 минут. Образцы для тестирования хранили при +4°С.Each rat, at certain intervals after administration, 0.5 ml of blood was taken from the tail vein. To do this, 1.5-2 mm of the tail flesh was cut off with a scalpel. Blood was collected in Eppendorf tubes. The tubes were placed in a thermostat and incubated for 30 minutes at 37 ° C. A thrombus formed from the walls of the tube was separated by a glass capillary. The tubes were placed in a refrigerator and incubated for 4-6 hours at + 4 ° C. Serum was aspirated with an automatic pipette and centrifuged at 5,000 rpm for 5 minutes to remove blood cells. To sterilize blood serum samples, supernatants were transferred to Ultrafree-MC filtration systems (Amicon) and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes. Samples for testing were stored at + 4 ° C.
Измерения проводили с помощью набора для иммуноферментного анализа (Alpha-IFN ELISA kit, Bender Med Systems). Результаты измерения уровня интерферона за период 14 дней показали, что концентрация препарата сравнения через 7 суток составила в сыворотке менее 50% от пиковой, через 14 суток - менее 20%, а концентрация исследуемого средства через 7 суток составила в сыворотке около 60%, а через 14 суток - порядка 30% от пиковой концентрации.Measurements were performed using an enzyme immunoassay kit (Alpha-IFN ELISA kit, Bender Med Systems). The results of measuring the level of interferon for a period of 14 days showed that the concentration of the reference drug in serum after 7 days was less than 50% of the peak, after 14 days - less than 20%, and the concentration of the test drug after 7 days was in serum about 60%, and after 14 days - about 30% of the peak concentration.
Таким образом, новое средство обладает значительным пролонгированным эффектом.Thus, the new tool has a significant prolonged effect.
Пример 9. Фармацевтическая композиция.Example 9. The pharmaceutical composition.
Состав для инъекций:Composition for injection:
Claims (2)
где INF - полипептид интерферона альфа;
R - радикалы 2-аминоэтанола -HN-CH2-CH2-O-, -аминопропанола -HN-CH2-CH2-CH2-O-, гомосерина -HN-CH(COOH)-CH2-CH2-O-;
n и n1 - одинаковые или различные =50-170, в котором с аминогруппами полипептида интерферона альфа ковалентно связаны остатки разветвленного полиэтиленгликоля с молекулярной массой 5000-15000 Да.1. A drug with interferon alpha activity, characterized in that it is a conjugate with a branched polyethylene glycol molecule of the general formula
where INF is the interferon alpha polypeptide;
R are the radicals of 2-aminoethanol -HN-CH 2 -CH 2 -O-, -aminopropanol -HN-CH 2 -CH 2 -CH 2 -O-, homoserine -HN-CH (COOH) -CH 2 -CH 2 - O-;
n and n 1 are the same or different = 50-170, in which the branched polyethylene glycol residues with a molecular weight of 5000-15000 Da are covalently linked to the amino groups of the interferon alpha polypeptide.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008151372/15A RU2382048C1 (en) | 2008-12-25 | 2008-12-25 | Medicinal agent based on modified alpha interferon with prolonged therapeutic action |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008151372/15A RU2382048C1 (en) | 2008-12-25 | 2008-12-25 | Medicinal agent based on modified alpha interferon with prolonged therapeutic action |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2382048C1 true RU2382048C1 (en) | 2010-02-20 |
Family
ID=42127016
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008151372/15A RU2382048C1 (en) | 2008-12-25 | 2008-12-25 | Medicinal agent based on modified alpha interferon with prolonged therapeutic action |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2382048C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115531364A (en) * | 2021-06-30 | 2022-12-30 | 中国科学技术大学 | Microbial metabolite preparation for preventing or treating rotavirus infection and application thereof |
-
2008
- 2008-12-25 RU RU2008151372/15A patent/RU2382048C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115531364A (en) * | 2021-06-30 | 2022-12-30 | 中国科学技术大学 | Microbial metabolite preparation for preventing or treating rotavirus infection and application thereof |
| CN115531364B (en) * | 2021-06-30 | 2024-02-23 | 中国科学技术大学 | Microbial metabolite preparation for preventing or treating rotavirus infection and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5336372B2 (en) | G-CSF site-specific monoconjugate | |
| EP0809996B1 (en) | Interferon conjugates | |
| CN104906594B (en) | The dendrimer-PEG of four side chains for puting together with protein and peptide | |
| US20050176108A1 (en) | Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life | |
| RU2485134C2 (en) | Polyethylene glycol modified interferon alpha 2b, producing and using preparation | |
| HUT75533A (en) | Improved interferon polymer conjugates | |
| RU2447083C1 (en) | NOVEL FUNCTIONALLY ACTIVE, HIGHLY PURE, STABLE CONJUGATE OF INTERFERON α WITH POLYETHYLENE GLYCOL, REPRESENTED BY ONE PEG- NαH-IFN POSITIONAL ISOMER, WITH IMPROVED IMMUNOGENICITY, WITH PROLONGED BIOLOGICAL ACTION, SUITABLE FOR MEDICAL APPLICATION, AND IMMUNOLOGICAL AGENT BASED THEREON | |
| EA003789B1 (en) | Polyol-ifn-beta conjugates | |
| JP2007533665A (en) | New G-CSF conjugate | |
| JP2008543304A (en) | Human granulocyte colony-stimulating factor isoform (Human Granulocyte-Colony Stimulating FactorIsforms) | |
| KR100735784B1 (en) | Mutant of granulocyte-colony stimulating factorG-CSF and chemically conjugated polypeptide thereof | |
| BRPI0722341A2 (en) | G-CSF MODIFIED BY Y-SHAPED POLYETHYLENE GLYCOL, PREPARATION AND USE OF THE SAME | |
| US20060276586A1 (en) | Peg-physiologically active polypeptide homodimer complex having prolonged in vivo half-life and process for the preparation thereof | |
| RU2488598C2 (en) | Double-stranded polyethylene glycol modified growth hormone, preparation method and use thereof | |
| BRPI0622128A2 (en) | polyethylene glycol-g-csf conjugate | |
| KR101483814B1 (en) | Interferon alpha 2a modified by polyethylene glycol, its synthesis process and application | |
| US20210268117A1 (en) | Methods of generating a pegylated il-11 composition | |
| RU2382048C1 (en) | Medicinal agent based on modified alpha interferon with prolonged therapeutic action | |
| Behi et al. | Optimization of PEGylation reaction time and molar ratio of rhG-CSF toward increasing bioactive potency of monoPEGylated protein | |
| CN101163716A (en) | Interleukin-6 polyethylene glycol conjugate and its preparing method and use | |
| CN106749608B (en) | Interferon alpha conjugates | |
| RU2298560C2 (en) | Conjugates of protein and polyethylene glycol derivative, pharmaceutical composition, method for control of viral infection | |
| EA006368B1 (en) | Chemically-modified progenipoietin conjugates | |
| RU2466138C1 (en) | Interferon conjugates and method for production thereof | |
| RU2311930C2 (en) | Pagylated interferon against viral infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131226 |