RU2381033C2 - Prion-specific peptide reagents - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to peptide reagents which react with prion proteins, polynucleotides coding these peptide reagents, to the methods for preparing antibodies with using such peptide reagents and polynucleotides, and to the antibodies received with using these methods. There is declared recovered peptide reagent which mainly reacts with pathogenic forms of conformational disease protein in comparison with nonpathogenic forms of conformational disease protein where said peptide reagent is prepared of peptide protein fragment where said peptide reagent is prepared of peptide chosen from the group that includes peptides with SEQ ID NO: 12-132.

EFFECT: invention provides detection of pathogenic prions in a sample and can be used as components of a therapeutic or preventive composition and for formation of prion-specific antibodies.

52 cl, 3 ex, 4 tbl, 5 dwg

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ FIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к пептидным реагентам, которые взаимодействуют с прионными белками, к полинуклеотидам, кодирующим эти пептидные реагенты, к способам получения антител с использованием таких пептидных реагентов и полинуклеотидов, и к антителам, полученным с использованием этих способов. Изобретение также относится к способам применения этих пептидных реагентов для обнаружения патогенных прионов в образце и к способам применения этих пептидных реагентов в качестве компонентов терапевтической или профилактической композиции. The invention relates to peptide reagents that interact with prion proteins, to polynucleotides encoding these peptide reagents, to methods for producing antibodies using such peptide reagents and polynucleotides, and to antibodies obtained using these methods. The invention also relates to methods of using these peptide reagents to detect pathogenic prions in a sample and to methods of using these peptide reagents as components of a therapeutic or prophylactic composition.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Заболевания, связанные с конформацией белка, охватывают различные неродственные заболевания, включая инфекционные губчатые энцефалопатии, происходящие вследствие аномального конформационного изменения белка (белка конформационного заболевания), которое, в свою очередь, приводит к самопроизвольной ассоциации аномальных форм белка, с последующим замещением и повреждением ткани. Такие заболевания также имеют замечательное сходство в клинических проявлениях, обычно быстрое прогрессирование от диагностики до смерти после различной длительности инкубационного периода.Diseases associated with protein conformation encompass various unrelated diseases, including infectious spongiform encephalopathies, resulting from abnormal conformational changes in the protein (protein conformational disease), which, in turn, leads to spontaneous association of abnormal forms of the protein, with subsequent replacement and damage to the tissue. Such diseases also have remarkable similarities in clinical manifestations, usually rapid progression from diagnosis to death after varying lengths of the incubation period.

Одна из групп конформационных заболеваний называется «прионные заболевания» или «инфекционные губчатые энцефалопатии (TSE)». У людей такие заболевания включают болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), синдром Герштманна-Штрауслера-Шейнкера (GSS), фатальную семейную бессонницу и куру (см., например, Harrison's Principles of Internal Medicine, Isselbacher et al., eds., McGraw-Hill, Inc. New York, (1994); Medori et al. (1992) N.Engl. J. Med. 326: 444-9). У животных TSE включают скрэпи овец, губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE), инфекционную энцефалопатию норок и болезнь хронической усталости рожденного в неволе гибрида оленя и лося (Gajdusek, (1990) Subacute Spongiform Encephalopathies: Transmissible Cerebral Amyloidoses Caused by Unconventional Viruses. Pp. 2289-2324 In: Virology, Fields, ed. New York: Raven Press, Ltd.). Инфекционные губчатые энцефалопатии характеризуются следующими отличительными признаками: наличием аномальной (богатой бета-структурой, устойчивой к протеиназе K) конформации прионного белка, которая переносит заболевание при экспериментальной инокуляции лабораторным животным, включая приматов, грызунов и трансгенных мышей.One group of conformational diseases is called "prion diseases" or "infectious spongiform encephalopathies (TSE)." In humans, such diseases include Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome (GSS), fatal familial insomnia, and chickens (see, for example, Harrison's Principles of Internal Medicine, Isselbacher et al., Eds., McGraw- Hill, Inc. New York, (1994); Medori et al. (1992) N. Engl. J. Med. 326: 444-9). In animals, TSEs include sheep scrapie, bovine spongiform encephalopathy (BSE), mink infectious encephalopathy, and deer and elk hybrid chronic fatigue disease (Gajdusek, (1990) Subacute Spongiform Encephalopathies Cerebral Amyloidoses Parent. 2289-2324 In: Virology, Fields, ed. New York: Raven Press, Ltd.). Infectious spongiform encephalopathies are characterized by the following distinguishing features: the presence of an abnormal (rich beta structure resistant to proteinase K) conformation of prion protein, which transfers the disease during experimental inoculation to laboratory animals, including primates, rodents and transgenic mice.

Недавнее быстрое распространение губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота и его корреляция с повышенной частотой губчатых энцефалопатий у людей привело к значимому повышению интереса к обнаружению инфекционных губчатых энцефалопатий у неотносящихся к человеку млекопитающих. Трагические последствия случайной передачи этих заболеваний (см., например, Gajdusek, Infectious Amyloids, и Prusiner, Prions In Fields Virology. Fields, et al., eds. Lippincott-Ravin, Pub. Philadelphia (1996); Brown et al. (1992) Lancet, 340: 24-27), трудности в дезинфекции (Asher et al. (1986) pages 59-71 In: Laboratory Safety: Principles and Practices, Miller ed. Am. Soc.Micro.), и недавний интерес к губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (British Med. J. (1995) 311: 1415-1421) поддерживают срочную потребность в диагностическом тесте, который мог бы идентифицировать людей и животных с инфекционными губчатыми энцефалопатиями, и в способах лечения инфицированных индивидуумов.The recent rapid spread of bovine spongiform encephalopathy and its correlation with an increased incidence of spongiform encephalopathy in humans has led to a significant increase in interest in detecting infectious spongiform encephalopathies in non-human mammals. The tragic consequences of the accidental transmission of these diseases (see, for example, Gajdusek, Infectious Amyloids, and Prusiner, Prions In Fields Virology. Fields, et al., Eds. Lippincott-Ravin, Pub. Philadelphia (1996); Brown et al. (1992 ) Lancet, 340: 24-27), difficulties in disinfection (Asher et al. (1986) pages 59-71 In: Laboratory Safety: Principles and Practices, Miller ed. Am. Soc. Micro.), And recent interest in spongy cattle encephalopathies (British Med. J. (1995) 311: 1415-1421) support the urgent need for a diagnostic test that can identify people and animals with infectious spongiform encephalopathies and methods of treating infected individuals uumov.

Прионы представляют собой инфекционный патоген, который вызывает губчатые энцефалопатии (прионные заболевания). Прионы значимо отличаются от бактерий, вирусов и вироидов. Основной гипотезой является то, что в отличие от других инфекционных патогенов инфекция вызвана аномальной конформацией прионного белка, которая действует как шаблон и преобразует нормальные конформации приона в аномальные конформации. Прионный белок впервые был охарактеризован в начале 1980-х. (См., например, Bolton, McKinley et al. (1982) Science 218: 1309-1311; Prusiner, Bolton et al. (1982) Biochemistry 21: 6942-6950; McKinley, Bolton et al. (1983) Cell 35: 57-62). Гены, кодирующие полный прионный белок, были затем клонированы, секвенированы и экспрессированы в трансгенных животных. См., например, Basler, Oesch et al. (1986) Cell 46: 417-428. Prions are an infectious pathogen that causes spongiform encephalopathies (prion diseases). Prions are significantly different from bacteria, viruses and viroids. The main hypothesis is that, unlike other infectious pathogens, the infection is caused by an abnormal conformation of prion protein, which acts as a template and converts normal prion conformations to abnormal conformations. Prion protein was first characterized in the early 1980s. (See, for example, Bolton, McKinley et al. (1982) Science 218: 1309-1311; Prusiner, Bolton et al. (1982) Biochemistry 21: 6942-6950; McKinley, Bolton et al. (1983) Cell 35: 57-62). Genes encoding the complete prion protein were then cloned, sequenced and expressed in transgenic animals. See, for example, Basler, Oesch et al. (1986) Cell 46: 417-428.

Ключевой характеристикой прионных заболеваний является образование белка аномальной формы (PrP^Sc), также называемого белком скрэпи, из нормальной (клеточной или непатогенной) формы прионного белка (PrP^C). См., например, Zhang et al. (1997) Biochem. 36 (12): 3543-3553; Cohen & Prusiner (1998) Ann Rev. Biochem. 67: 793-819; Pan et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 10962-10966; Safar et al. (1993) J Biol Chem 268: 20276-20284. Оптическая спектроскопия и кристаллографические исследования выявили, что связанные с заболеванием формы прионов существенно обогащены бета-структурой по сравнению с преимущественно обладающими альфа-спиральным скручиванием, не связанными с заболеванием формами. См., например, Wille et al. (2001) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99: 3563-3568; Peretz et al. (1997) J. Mol. Biol. 273: 614-622; Cohen & Prusiner, Chapter 5: Structural Studies of Prion Proteins in PRION BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp: 191-228). За структурными изменениями, оказывается, следуют изменения биохимических свойств: PrP^C растворим в неденатурирующих детергентах, PrP^Sc нерастворим; PrP^C легко расщепляется протеазами, тогда как PrP^Sc частично устойчив, что приводит к образованию укороченного по N-концу фрагмента, известного как «PrPres» (Baldwin et al. (1995); Cohen & Prusiner (1995)),"PrP 27-30" (27-30 kDa) или «PK-устойчивая» (устойчивая к протеиназе K) форма. Кроме того, PrP^Sc может преобразовывать PrP^C в патогенную конформацию. См., например, Kaneko et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92: 11160-11164; Caughey (2003) Br Med Bull. 66: 109-20.A key characteristic of prion diseases is the formation of an abnormal protein (PrP ^Sc ), also called scrapie protein, from the normal (cellular or non-pathogenic) form of prion protein (PrP ^C ). See, for example, Zhang et al. (1997) Biochem. 36 (12): 3543-3553; Cohen & Prusiner (1998) Ann Rev. Biochem. 67: 793-819; Pan et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 10962-10966; Safar et al. (1993) J Biol Chem 268: 20276-20284. Optical spectroscopy and crystallographic studies have revealed that disease-related forms of prions are substantially enriched in beta structure compared with predominantly alpha-helical twisting, non-disease-related forms. See, for example, Wille et al. (2001) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99: 3563-3568; Peretz et al. (1997) J. Mol. Biol. 273: 614-622; Cohen & Prusiner, Chapter 5: Structural Studies of Prion Proteins in PRION BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp: 191-228). Structural changes, it turns out, are followed by changes in biochemical properties: PrP ^{C is} soluble in non-denaturing detergents, PrP ^{Sc is} insoluble; PrP ^{C is} readily cleaved by proteases, while PrP ^{Sc is} partially stable, resulting in the formation of a N-terminus-truncated fragment known as “PrPres” (Baldwin et al. (1995); Cohen & Prusiner (1995)), “PrP 27- 30 "(27-30 kDa) or" PK-resistant "(proteinase K resistant) form. In addition, PrP ^Sc can convert PrP ^C to a pathogenic conformation. See, for example, Kaneko et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92: 11160-11164; Caughey (2003) Br Med Bull. 66: 109-20.

Обнаружение патогенных изоформ белков конформационных заболеваний в живых индивидуумах и образцах, полученных из живых индивидуумов, оказалось сложным. Таким образом, окончательный диагноз и паллиативные способы лечения данных инфекционных и содержащих амилоид состояний до гибели индивидуума остаются, по существу, нерешенной задачей. Гистопатологическая оценка биопсий мозга рискованна для индивидуума, и повреждения и отложения амилоида могут быть потеряны в зависимости от того, откуда взят биопсийный образец. Однако еще имеется риск, связанный с биопсиями, для животных, пациентов и медицинского персонала. Далее результаты тестов головного мозга животных обычно не успевают получить до того, как животное пойдет в пищу. Кроме того, антитела, полученные против прионных пептидов, распознают как денатурированный PrP^Sc, так и PrP^C, но не способны избирательно распознавать инфекционный (неденатурированный) PrPres. (См., например, Matsunaga et al. (2001) PROTEINS: Structure, Function and Genetics 44: 110-118). The detection of pathogenic isoforms of conformational disease proteins in living individuals and samples obtained from living individuals has proven difficult. Thus, the final diagnosis and palliative methods of treating these infectious and amyloid-containing conditions before the death of the individual remain essentially an unsolved problem. A histopathological evaluation of brain biopsies is risky for the individual, and damage and deposition of amyloid may be lost depending on where the biopsy sample is taken from. However, there is still a risk associated with biopsies for animals, patients, and medical personnel. Further, the results of animal brain tests usually do not have time to get before the animal goes to food. In addition, antibodies obtained against prion peptides recognize both denatured PrP ^Sc and PrP ^C , but are not able to selectively recognize infectious (undenatured) PrPres. (See, for example, Matsunaga et al. (2001) PROTEINS: Structure, Function and Genetics 44: 110-118).

Таким образом, сохраняется потребность в композиции и способах обнаружения патогенных прионных белков в различных образцах, например в образцах, полученных от живых индивидуумов, в продуктах крови, в сельскохозяйственных животных и в других источниках питания человека и животных. Кроме того, остается необходимость в способах и композициях для диагностики и лечения, связанных с прионами заболеваний.Thus, there remains a need for compositions and methods for detecting pathogenic prion proteins in various samples, for example, samples obtained from living individuals, blood products, farm animals and other human and animal nutrition sources. In addition, there remains a need for methods and compositions for the diagnosis and treatment of prion diseases.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение частично относится к пептидным реагентам, которые взаимодейествуют с прионными белками. Более конкретно, описанные здесь пептидные реагенты взаимодействуют преимущественно с патогенными изоформами прионных белков. Эти пептидные реагенты могут использоваться в различных применениях, включая средства для обнаружения патогенных прионов или для обнаружения патогенных прионов в образце, в качестве компонентов терапевтической или профилактической композиции и/или для образования специфичных в отношении прионов антител. The present invention partially relates to peptide reagents that interact with prion proteins. More specifically, the peptide reagents described herein interact primarily with pathogenic isoforms of prion proteins. These peptide reagents can be used in various applications, including means for detecting pathogenic prions or for detecting pathogenic prions in a sample, as components of a therapeutic or prophylactic composition and / or for the formation of prion specific antibodies.

Например, пептидные реагенты, которые взаимодействуют предпочтительно с PrP^Sc по сравнению с PrP^C, могут использоваться для прямого обнаружения патогенных форм в образцах, полученных из живых индивидуумов, например, для диагностики заболевания или для скрининга образцов донорской крови или скрининга донорских органов для трансплантации. For example, peptide reagents that interact preferably with PrP ^Sc compared to PrP ^C can be used to directly detect pathogenic forms in samples obtained from living individuals, for example, to diagnose a disease or to screen donor blood samples or screening donor organs for transplantation.

В более широком аспекте изобретение относится к пептидному реагенту, который преимущественно взаимодействует с патогенными формами белка конформационного заболевания. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь пептидные реагенты взаимодействуют предпочтительно с патогенными формами прионного белка по сравнению с непатогенными формами прионного белка. Описанные здесь пептидные реагенты могут быть полностью или частично синтетическими, например, могут включать в себя одну или несколько следующих групп: циклизованные остатки или пептиды, мультимеры пептидов, метки, и/или другие химические радикалы. Примеры подходящих пептидных реагентов включают в себя те, что получают из пептидов SEQ ID NO: 12-132, например, пептидов, таких как те, что обозначены на SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, или 84, и их аналогов и производных. Описанные здесь пептидные реагенты могут взаимодействовать с любыми белками конформационных заболеваний, например, прионные белки (например, патогенный белок PrP^Sc, и непатогенную форму PrP^C). В некоторых вариантах осуществления пептидные реагенты взаимодействуют предпочтительно с PrP^Sc по сравнению с PrP^C. Пептидные реагенты, в основном, являются специфичными в отношении PrP^Sc более из одного вида, но могут быть специфичны в отношении PrP^Sc из одного вида.In a broader aspect, the invention relates to a peptide reagent that primarily interacts with pathogenic forms of a conformational disease protein. In some embodiments, the peptide reagents described herein interact preferably with pathogenic forms of prion protein compared to non-pathogenic forms of prion protein. The peptide reagents described herein may be fully or partially synthetic, for example, may include one or more of the following groups: cyclized residues or peptides, multimers of peptides, labels, and / or other chemical radicals. Examples of suitable peptide reagents include those obtained from peptides of SEQ ID NO: 12-132, for example, peptides, such as those indicated on SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, or 84, and their analogs and derivatives. The peptide reagents described herein can interact with any conformational disease proteins, for example, prion proteins (for example, the pathogenic PrP ^Sc protein, and the non-pathogenic form of PrP ^C ). In some embodiments, the implementation of the peptide reagents preferably interact with PrP ^Sc compared to PrP ^C. Peptide reagents are generally specific for PrP ^Sc from more than one species, but may be specific for PrP ^Sc from one species.

В другом варианте осуществления пептидные реагенты, полученные из пептидов, показанных в любой из описанных здесь последовательностей. В некоторых вариантах осуществления использованы пептидные реагенты, полученные из областей прионного белка, например из тех областей, которые соответствуют остаткам 23-43 или 85-156 (например, 23-30, 86-111, 89-112, 97-107, 113-135, и 136-156, пронумерованными согласно последовательности мышиного приона, показанной в SEQ ID NO: 2). Для удобства номера аминокислотных остатков, приведенные выше, соответствуют последовательности мышиного прионного белка SEQ ID NO: 2; обычный специалист в данной области может легко идентифицировать соответствующие области в прионных белках других видов, основываясь на последовательностях, известных в данной области и на предоставленных здесь сведениях. Типовые пептидные реагенты включают в себя те, что получают из пептидов, имеющих SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, или 127; или из пептидов, имеющих SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 129, 130, 131, 132 или 128; или из пептидов, имеющих SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82 или 84.In another embodiment, peptide reagents derived from peptides shown in any of the sequences described herein. In some embodiments, peptide reagents derived from prion protein regions are used, for example, from those regions that correspond to residues 23-43 or 85-156 (e.g., 23-30, 86-111, 89-112, 97-107, 113- 135, and 136-156, numbered according to the sequence of the mouse prion shown in SEQ ID NO: 2). For convenience, the numbers of amino acid residues given above correspond to the sequence of the mouse prion protein of SEQ ID NO: 2; one of ordinary skill in the art can easily identify the corresponding regions in prion proteins of other species based on sequences known in the art and the information provided herein. Typical peptide reagents include those derived from peptides having SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, or 127; or from peptides having SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 129, 130, 131, 132 or 128; or from peptides having SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82 or 84.

В другом аспекте изобретение относится к комплексу, содержащему один или несколько пептидных реагентов, описанных здесь, и прионный белок. In another aspect, the invention relates to a complex comprising one or more of the peptide reagents described herein and a prion protein.

В другом аспекте - способ получения антител, которые распознают прионные белки, причем данный способ включает в себя стадию введения любого из пептидных реагентов, описанных здесь (или полинуклеотидов, кодирующих пептидные реагенты) индивидууму (например, животному). В некоторых вариантах осуществления способ далее включает в себя стадию выделения антител из животного. Связанный аспект изобретения относится к антителам, полученным данным способом. Предпочтительные антитела специфичны в отношении патогенных форм.In another aspect, a method for producing antibodies that recognize prion proteins, the method comprising the step of administering any of the peptide reagents described herein (or polynucleotides encoding the peptide reagents) to an individual (eg, an animal). In some embodiments, the method further includes the step of isolating antibodies from the animal. A related aspect of the invention relates to antibodies produced by this method. Preferred antibodies are specific for pathogenic forms.

Еще в одном аспекте изобретение относится к комплексу, содержащему любое из описанных здесь антител и прионный белок. В некоторых вариантах осуществления прионный белок представляет собой непатогенную изоформу, в то время как в других вариантах осуществления она представляет собой патогенную изоформу. In another aspect, the invention relates to a complex comprising any of the antibodies described herein and a prion protein. In some embodiments, the prion protein is a non-pathogenic isoform, while in other embodiments, it is a pathogenic isoform.

Любой из описанных здесь пептидных реагентов и/или антител может кодироваться, полностью или частично, одним или несколькими полинуклеотидами, которые также образуют часть настоящего изобретения.Any of the peptide reagents and / or antibodies described herein may be encoded, in whole or in part, by one or more polynucleotides, which also form part of the present invention.

Еще в одном аспекте предоставляются способы для обнаружения прионных белков. Способы обнаружения могут использоваться, среди прочих, в связи со способами диагностики связанного с прионами заболевания (например, у людей или у индивидуумов-животных, не относящихся к людям), при обеспечении поставки крови, продуктов крови, или поставки пищевых продуктов, по существу, лишенных PrP^Sc, при анализе образцов органов или тканей для трансплантации, при мониторинге отсутствия контаминации хирургических инструментов и оборудования, а также любой другой ситуации, в которой важно знание наличия или отсутствия патогенного приона.In yet another aspect, methods are provided for detecting prion proteins. Detection methods can be used, among others, in connection with methods for diagnosing prion-related diseases (for example, in humans or in non-human animal individuals), while providing a supply of blood, blood products, or food supplies, essentially lacking PrP ^Sc, in the analysis for transplantation, while monitoring the lack of contamination of surgical instruments and equipment samples of organs or tissues, as well as any other situation in which knowledge is important to the presence or absence of the pathogenic prion .

Способы обнаружения основываются на преимущественном взаимодействии пептидных реагентов по изобретению с патогенной изоформой приона. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ обнаружения патогенного приона в биологическом образце.Detection methods are based on the predominant interaction of the peptide reagents of the invention with the pathogenic prion isoform. In some embodiments, a method for detecting a pathogenic prion in a biological sample is provided.

В одном из вариантов осуществления способ включает в себя контакт образца, подозреваемого в наличии в нем патогенного приона, с одним или несколькими описанными здесь пептидными реагентами, в условиях, которые обеспечивают взаимодействие пептидного(-ых) реагента(-ов) и патогенного приона, если он присутствует; и обнаружение наличия или отсутствия патогенного приона в образце за счет его связывания с пептидным(-и) реагентом(-ами). Взаимодействие пептидного(-ых) реагента(-ов) и патогенного приона может осуществляться в растворе, или один или несколько реагентов могут предоставляться в твердой фазе или на ней. Могут проводиться анализы сэндвич-типа, в которых пептидные реагенты по изобретению могут использоваться в качестве реагентов для захвата, реагентов для обнаружения или обоих. Другие связывающие прион реагенты (например, антитела и другие связывающие молекулы, которые связываются с денатурированным прионным белком), могут применяться в данном аспекте в комбинации с пептидными реагентами по изобретению.In one embodiment, the method comprises contacting a sample suspected of having a pathogenic prion therein with one or more of the peptide reagents described herein under conditions that allow the peptide reagent (s) to interact with the pathogenic prion if he is present; and detecting the presence or absence of a pathogenic prion in the sample due to its binding to the peptide reagent (s). The interaction of the peptide (s) reagent (s) and the pathogenic prion can be carried out in solution, or one or more reagents can be provided in or on the solid phase. Sandwich type assays may be performed in which the peptide reagents of the invention can be used as capture reagents, detection reagents, or both. Other prion binding reagents (e.g., antibodies and other binding molecules that bind to the denatured prion protein) can be used in this aspect in combination with the peptide reagents of the invention.

В одном из аспектов данного изобретения один или несколько пептидных реагентов по настоящему изобретению получаются на твердой основе и контактируют с образцом, в котором предполагается наличие патогенного приона, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенного приона, если он присутствует, с пептидным реагентом. Несвязанные материалы образца, включая любой непатогенный прион, могут удаляться, и патогенный прион может обнаруживаться, оставаясь связанным с пептидным реагентом, или после диссоциации от пептидного реагента. Патогенный прион может обнаруживаться с использованием меченого и способного к визуализации пептидного реагента (того же пептида, который использовали для «захвата» патогенного приона или второго пептидного реагента по изобретению) или меченого и способного к визуализации антитела против приона или другого связывающего прион реагента. Это антитело или связывающий прион реагент не обязательно специфичен к патогенной форме приона.In one aspect of the present invention, one or more of the peptide reagents of the present invention are prepared on a solid basis and contacted with a sample in which a pathogenic prion is suspected under conditions that allow the pathogenic prion to bind, if present, to the peptide reagent. Unbound sample materials, including any non-pathogenic prion, can be removed and the pathogenic prion can be detected while remaining bound to the peptide reagent, or after dissociation from the peptide reagent. A pathogenic prion can be detected using a labeled and imaging peptide reagent (the same peptide that was used to “capture” the pathogenic prion or second peptide reagent of the invention) or a labeled and imaging antibody against prion or another prion binding reagent. This antibody or prion binding reagent is not necessarily specific for the pathogenic form of prion.

В другом аспекте данного варианта осуществления связывающий прион реагент предоставляется на твердой основе и контактирует с образцом, в котором предполагается наличие патогенного приона, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенного приона, если он присутствует, со связывающим прион реагентом. Несвязанные материалы образца могут удаляться, и патогенный прион может обнаруживаться, оставаясь связанным с пептидным реагентом, или после диссоциации от пептидного реагента. Патогенный прион может выявляться с использованием одного или нескольких меченых и способных к визуализации пептидных реагентов по изобретению.In another aspect of this embodiment, the prion binding reagent is provided on a solid basis and is contacted with a sample in which a pathogenic prion is suspected under conditions that allow the pathogenic prion to bind, if present, to the prion binding reagent. Unbound sample materials can be removed and the pathogenic prion can be detected while remaining bound to the peptide reagent, or after dissociation from the peptide reagent. A pathogenic prion can be detected using one or more labeled and visualizable peptide reagents of the invention.

В другом аспекте данного изобретения патогенный прион в образце может неспецифично связываться с твердой основой (например, с планшетом ELISA) и выявляться путем связывания одного или нескольких меченых и способных к визуализации пептидных реагентов по изобретению, которые взаимодействуют предпочтительно с патогенной изоформой приона. In another aspect of the invention, a pathogenic prion in a sample can bind non-specifically to a solid support (e.g., an ELISA plate) and be detected by binding to one or more labeled and visualizable peptide reagents of the invention that interact preferably with a pathogenic prion isoform.

В дополнительном варианте осуществления способ предусматривает контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с одним или несколькими пептидными реагентами, выбранными из группы, включающей пептиды, с последовательностями SEQ ID NO: 12-132, и их аналогами и производными, в условиях, которые обеспечивают связывание пептидного(-ых) реагента(-ов) с патогенным прионом, если он присутствует; и обнаружение наличия или отсутствия патогенного приона в образце путем его связывания с пептидным(-и) реагентом(-ами). В предпочтительных вариантах осуществления образец контактирует с одним или несколькими пептидными реагентами, выбранными из группы, включающей пептиды, с последовательностями SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82 или 84, и из аналогов и производных. In a further embodiment, the method comprises contacting a sample in which the presence of a pathogenic prion is expected with one or more peptide reagents selected from the group comprising peptides, with sequences of SEQ ID NOS: 12-132, and their analogs and derivatives, under conditions which provide binding of the peptide (s) reagent (s) to the pathogenic prion, if present; and detecting the presence or absence of a pathogenic prion in the sample by binding it to the peptide reagent (s). In preferred embodiments, the sample is contacted with one or more peptide reagents selected from the group consisting of peptides with sequences of SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82 or 84, and from analogues and derivatives.

В других вариантах осуществления предоставляется способ обнаружения патогенного приона в образце, причем данный способ предусматривает: получение твердой основы, содержащей первый пептид, где первый пептид включает в себя один или несколько пептидных реагентов, описанных здесь, которые предпочтительно взаимодействуют с PrP; контактирование твердой основы с образцом в условиях, которые позволяют патогенным прионам, присутствующим в образце, связываться с первым пептидом; контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации вторым пептидом, где второй пептид включает в себя один или несколько пептидных реагентов, описанных здесь, которые взаимодействуют преимущественно с белками PrP^Sc, в условиях, которые позволяют второму пептиду связываться с патогенными прионами, связанными с первым пептидом; и обнаружение комплексов, образованных между первым пептидом, патогенным прионом из образца и вторым пептидом, с обнаружением таким образом наличия в образце патогенного приона.In other embodiments, a method is provided for detecting a pathogenic prion in a sample, the method comprising: preparing a solid base comprising a first peptide, wherein the first peptide includes one or more of the peptide reagents described herein that preferably interact with PrP; contacting the solid base with the sample under conditions that allow pathogenic prions present in the sample to bind to the first peptide; contacting the solid support with a labeled and capable of visualizing a second peptide, where the second peptide includes one or more of the peptide reagents described herein, which interact mainly with PrP ^Sc proteins, under conditions that allow the second peptide to bind to pathogenic prions associated with the first peptide; and detecting complexes formed between the first peptide, the pathogenic prion from the sample and the second peptide, thereby detecting the presence of a pathogenic prion in the sample.

В других вариантах осуществления предоставляется способ обнаружения патогенного приона в образце, предусматривающий: получение твердой основы, содержащей связывающий прион реагент, где связывающий прион реагент связывается с прионными белками; контактирование твердой основы с образцом в условиях, которые позволяют прионным белкам, если они присутствуют в образце, связываться со связывающим прион реагентом; контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации пептидным реагентом по изобретению, где пептидный реагент преимущественно взаимодействует с патогенным прионным белком; и обнаружение комплексов, образованных между связывающим прион реагентом, патогенным прионом из образца и пептидным реагентом. In other embodiments, a method is provided for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising: obtaining a solid base comprising a prion binding reagent, wherein the prion binding reagent binds to prion proteins; contacting the solid base with the sample under conditions that allow prion proteins, if present in the sample, to bind to the prion binding reagent; contacting the solid base with a labeled and capable of visualizing peptide reagent according to the invention, where the peptide reagent mainly interacts with a pathogenic prion protein; and detecting complexes formed between the prion binding reagent, the pathogenic prion from the sample, and the peptide reagent.

В другом варианте осуществления предоставляется способ обнаружения патогенного приона в образце, причем данный способ включает в себя стадии получения твердой основы, содержащей описанный здесь первый пептидный реагент, где указанный первый пептидный реагент преимущественно взаимодействует с патогенными формами; контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации первым лигандом (например, плазминогеном, рецептором ламинина и гепаран-сульфатом), в условиях, которые обеспечивают образование комплекса меченый и способный к визуализации пептидный реагент-лиганд, где сродство связывания первого пептидного реагента в отношении меченого и способного к визуализации первого лиганда слабее, чем сродство связывания первого пептидного реагента в отношении патогенного приона; контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенных прионов с твердой основой в условиях, которые позволяют патогенному приону, если он присутствует в образце, связываться с первым пептидом и замещать первый лиганд; и обнаружение патогенного приона в образце путем снижения количества меченого и способного к визуализации лиганда на твердой основе.In another embodiment, a method for detecting a pathogenic prion in a sample is provided, the method comprising the steps of: preparing a solid base comprising a first peptide reagent described herein, wherein said first peptide reagent primarily interacts with pathogenic forms; contacting the solid base with a labeled and visualizable first ligand (e.g., plasminogen, laminin receptor, and heparan sulfate), under conditions which allow the formation of a complex labeled and visualizable peptide reagent ligand, where the binding affinity of the first peptide reagent for labeled and capable of visualizing the first ligand is weaker than the binding affinity of the first peptide reagent for a pathogenic prion; contacting the sample, in which the presence of pathogenic prions with a solid base is assumed under conditions that allow the pathogenic prion, if present in the sample, to bind to the first peptide and replace the first ligand; and detecting pathogenic prion in the sample by reducing the amount of labeled and visualizable ligand on a solid basis.

Любые из указанных выше способов обнаружения патогенных прионов могут использоваться в способе диагностики связанных с прионами заболеваний.Any of the above methods for detecting pathogenic prions can be used in a method for diagnosing prion-related diseases.

Настоящее изобретение также относится к способу выделения патогенного приона, предусматривающему: получение твердой основы, содержащей один или несколько пептидных реагентов по изобретению, контактирование твердой основы с образцом, о котором известно, или в котором предполагается наличие патогенного приона, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенного приона, если он присутствует, с пептидным реагентом; и удаление любых несвязавшихся материалов образца. Дополнительные варианты осуществления далее включают в себя стадию диссоциации связанного патогенного приона и пептидного реагента и, необязательно, получения диссоциированного патогенного приона.The present invention also relates to a method for isolating a pathogenic prion, comprising: obtaining a solid base containing one or more peptide reagents of the invention, contacting the solid base with a sample of which it is known, or in which the presence of a pathogenic prion is expected, under conditions that ensure the binding of the pathogenic prion, if present, with a peptide reagent; and removal of any unbound sample materials. Additional embodiments further include the step of dissociating the associated pathogenic prion and peptide reagent and, optionally, producing a dissociated pathogenic prion.

Настоящее изобретение также относится к способу удаления патогенных прионов из образца, предусматривающему: получение твердой основы, содержащей один или несколько пептидных реагентов по изобретению, контактирование твердой основы с образцом, о котором известно или в котором предполагается наличие патогенных прионов, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенных прионов, если они присутствует, с пептидным реагентом; и получение несвязавшихся материалов образца. The present invention also relates to a method for removing pathogenic prions from a sample, comprising: obtaining a solid base containing one or more peptide reagents of the invention, contacting the solid base with a sample of which pathogenic prions are known or suspected to exist under conditions that allow binding pathogenic prions, if present, with a peptide reagent; and obtaining unbound sample materials.

Во всех следующих вариантах осуществления, получения твердой основы, содержащей один или несколько реагентов по изобретению, рассматриваются альтернативные варианты осуществления, когда пептидный реагент контактирует с образцом перед тем, как пептидный реагент присоединяют к твердой основе. В данных вариантах осуществления пептидный реагент включает в себя одного из представителей связывающейся пары, и твердая основа включает в себя второго представителя связывающейся пары. Например, пептидный реагент по изобретению может содержать биотин или модифицироваться так, что он содержит биотин. Биотинилированный пептидный реагент контактирует с образцом, в котором предполагается наличие патогенного приона, в условиях, обеспечивающих связывание пептидного реагента с патогенным прионом. Твердая основа, содержащая авидин или стрептавидин, затем контактирует с биотинилированным пептидным реагентом. Здесь описаны другие подходящие связывающие пары.In all of the following embodiments, to obtain a solid base containing one or more reagents of the invention, alternative embodiments are contemplated when the peptide reagent is contacted with the sample before the peptide reagent is attached to the solid base. In these embodiments, the peptide reagent includes one of the members of the binding pair, and the solid base includes the second representative of the binding pair. For example, the peptide reagent of the invention may contain biotin or be modified to contain biotin. The biotinylated peptide reagent is contacted with a sample in which the presence of a pathogenic prion is assumed under conditions ensuring the binding of the peptide reagent to the pathogenic prion. A solid base containing avidin or streptavidin is then contacted with a biotinylated peptide reagent. Other suitable binding pairs are described herein.

В любом из описанных здесь способов с использованием твердой подложки она может представлять собой, например, нитроцеллюлозу, полистирол, полипропилен, латекс, поливинилфторид, диазотированную бумагу, нейлоновые мембраны, активированные гранулы, и/или отвечающие на магнитное поле гранулы, поливинилхлорид; полипропилен, полистирольный латекс, поликарбонат, нейлон, декстран, хитин, песок, силикагель, пемзу, агарозу, целлюлозу, стекло, металл, полиакриламид, силикон, резину, полисахариды; диазотированную бумагу; активированные гранулы, отвечающие на магнитное поле гранулы, и любые материалы, обычно используемые для твердофазного синтеза, аффинного разделения, реакций гибридизации, иммунных анализов и других таких применений. Основа может представлять собой дисперсные частицы или находиться в виде непрерывной поверхности, и включает в себя мембраны, сита, планшеты, шарики, слайды, диски, капилляры, полые волокна, иглы, пины, чипы, твердые волокна, гели (например, силикагели) и гранулы (например, гранулы пористого стекла, силикагели, полистирольные гранулы, необязательно перекрестно связанные с дивинилбензолом, гранулы с привитыми сополимерами, полиакриламидные гранулы, латексные гранулы, гранулы диметилакриламида, необязательно перекрестно связанные с N-N'-бис-акрилилэтилендиамином, магнитные гранулы с оксидом железа, и стеклянные частицы, покрытые гидрофобным полимером.In any of the methods described herein using a solid support, it can be, for example, nitrocellulose, polystyrene, polypropylene, latex, polyvinyl fluoride, diazotized paper, nylon membranes, activated granules, and / or granules that respond to the magnetic field, polyvinyl chloride; polypropylene, polystyrene latex, polycarbonate, nylon, dextran, chitin, sand, silica gel, pumice, agarose, cellulose, glass, metal, polyacrylamide, silicone, rubber, polysaccharides; diazotized paper; activated granules responding to the magnetic field of granules, and any materials commonly used for solid phase synthesis, affinity separation, hybridization reactions, immune assays and other such applications. The base may be dispersed particles or in the form of a continuous surface, and includes membranes, screens, tablets, balls, slides, disks, capillaries, hollow fibers, needles, pins, chips, solid fibers, gels (e.g., silica gels) and granules (e.g., porous glass granules, silica gels, polystyrene granules optionally cross-linked with divinylbenzene, grafted copolymer granules, polyacrylamide granules, latex granules, dimethyl acrylamide granules, optionally cross-linked with N-N'-bis-a rililetilendiaminom, magnetic beads with iron oxide, and glass particles coated with hydrophobic polymer.

Кроме того, в любом из описанных здесь способов образец может представлять собой биологический образец, то есть образец, полученный или происходящий из живого или когда-либо жившего организма, например органы, цельная кровь, фракции крови, компоненты крови, плазма, тромбоциты, сыворотка, цереброспинальная жидкость (ЦСЖ), ткань головного мозга, ткань нервной системы, мышечная ткань, костный мозг, моча, слезы, не относящаяся к нервной системе ткань, органы и/или биопсии или некропсии. В предпочтительном осуществлении биологический образец включал в себя кровь, фракции крови или компоненты крови. Образец может представлять собой небиологический образец. In addition, in any of the methods described herein, the sample may be a biological sample, that is, a sample obtained or derived from a living or ever living organism, for example organs, whole blood, blood fractions, blood components, plasma, platelets, serum, cerebrospinal fluid (CSF), brain tissue, tissue of the nervous system, muscle tissue, bone marrow, urine, tears, non-nervous system tissue, organs and / or biopsies or necropsy. In a preferred embodiment, the biological sample includes blood, blood fractions, or blood components. The sample may be a non-biological sample.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики связанного с прионом заболевания у индивидуума путем обнаружения наличия или отсутствия приона в биологическом образце от данного индивидуума любыми описанными здесь способами обнаружения.In yet another aspect, the present invention relates to a method for diagnosing a prion-related disease in an individual by detecting the presence or absence of a prion in a biological sample from that individual by any detection methods described herein.

В другом аспекте изобретение относится к способам получения источника крови, который, по существу, лишен патогенных прионов, причем данный способ предусматривает стадии скрининга аликвот крови (например, цельной крови, плазмы, тромбоцитов и сыворотки) из собранных образцов крови любым из описанных здесь способов; элиминации любого образца, в котором обнаружен патогенный прион; и комбинации образцов, в которых не обнаружены патогенные прионы, для обеспечения источника крови, по существу, лишенного патогенных прионов.In another aspect, the invention relates to methods for producing a blood source that is substantially free of pathogenic prions, the method comprising the steps of screening aliquots of blood (eg, whole blood, plasma, platelets and serum) from collected blood samples by any of the methods described herein; elimination of any sample in which a pathogenic prion is found; and combinations of samples in which pathogenic prions are not found to provide a blood source substantially devoid of pathogenic prions.

Еще в одном аспекте изобретение относится к способам получения продуктов питания, в частности мясных продуктов (например, говядины, баранины, или свинины, используемых для потребления людьми или животными), который, по существу, лишен патогенных прионов, причем данный способ включает в себя стадии скрининга любым из описанных здесь способов образцов, взятых от живых или мертвых организмов, которые будут служить продуктами питания, или образцов, взятых из пищи, предназначенной для продуктов питания; идентификации образцов, в которых обнаружен патогенный прион; и удаления из продуктов питания любого живого или мертвого организма, предназначенного для получения продуктов питания, в образцах которых обнаружены патогенные прионы; с обеспечением таким образом продукта питания, по существу, лишенного патогенных прионов.In another aspect, the invention relates to methods for producing food products, in particular meat products (for example, beef, lamb, or pork used for human or animal consumption), which is essentially devoid of pathogenic prions, the method comprising the steps of screening, by any of the methods described herein, samples taken from living or dead organisms that will serve as food, or samples taken from food intended for food; identification of samples in which a pathogenic prion is found; and removal from food products of any living or dead organism intended for obtaining food products in the samples of which pathogenic prions were found; thus providing a food product substantially devoid of pathogenic prions.

В другом аспекте изобретение относится к твердой основе, включающей в себя один или несколько описанных здесь пептидных реагентов. Твердая основа может, среди прочих, использоваться в способах по изобретению для обнаружения патогенного прионного белка в образце, для выделения прионного белка из образца, и для элиминации из образца патогенных прионных белков. Твердая основа может соответствовать описанной выше. In another aspect, the invention relates to a solid base comprising one or more of the peptide reagents described herein. The solid base can, among others, be used in the methods of the invention for detecting pathogenic prion protein in a sample, for isolating prion protein from a sample, and for eliminating pathogenic prion proteins from a sample. A solid base may be as described above.

В другом аспекте изобретение относится к различным наборам для обнаружения патогенного приона в образце, для выделения патогенного приона из образца, для элиминации из образца патогенного приона, причем набор включает в себя: один или несколько описанных здесь пептидных реагентов; и/или любую из твердых основ, включающих в себя один или несколько описанных здесь пептидных реагентов и другие необходимые реагенты, и, необязательно, положительные и отрицательные контроли. Пептидный(-е) реагент(-ы) могут быть мечеными и способными к визуализации. In another aspect, the invention relates to various kits for detecting a pathogenic prion in a sample, for isolating a pathogenic prion from a sample, for eliminating a pathogenic prion from a sample, the kit comprising: one or more of the peptide reagents described herein; and / or any of a solid base including one or more of the peptide reagents described herein and other necessary reagents, and, optionally, positive and negative controls. The peptide (s) reagent (s) may be labeled and capable of visualization.

В других аспектах здесь предоставлены композиции, включающие в себя один или несколько описанных здесь пептидных реагентов, полинуклеотидов и/или антител. In other aspects, compositions are provided herein including one or more of the peptide reagents, polynucleotides and / or antibodies described herein.

В дальнейшем аспекте предоставлены способы лечения или профилактики прионного заболевания, например способы, включающие в себя введение животному (например, не относящееся к человеку или относящееся к человеку млекопитающее) одного или нескольких описанных здесь композиций. В других вариантах осуществления способы предусматривают введение первой композиции, содержащей любую описанную здесь композицию в качестве стадии первичной стимуляции, и введение второй композиции, содержащей любые из описанных здесь композиций, в качестве вторичной стимуляции, например, в количестве, достаточном для индукции у индивидуума иммунного ответа. Композиция(-и) может(-гут) вводиться внутримышечно, через слизистые, интраназально, подкожно, внутрикожно, чрезкожно, интравагинально, интраректально, перорально и/или внутривенно.In a further aspect, methods of treating or preventing prion disease are provided, for example, methods comprising administering to an animal (e.g., a non-human or a human mammal) one or more of the compositions described herein. In other embodiments, the methods comprise administering a first composition comprising any composition described herein as a primary stimulation step, and administering a second composition containing any of the compositions described herein as secondary stimulation, for example, in an amount sufficient to induce an immune response in an individual . The composition (s) may be administered intramuscularly, through the mucous membranes, intranasally, subcutaneously, intradermally, percutaneously, intravaginally, intrarectally, orally and / or intravenously.

Эти и другие варианты осуществления изобретения легко реализуются специалистами в данной области в свете приведенного здесь описания.These and other embodiments of the invention are readily practiced by those skilled in the art in light of the description herein.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

На фиг.1 изображена аминокислотная последовательность человеческих (SEQ ID NO: 1) и мышиных (SEQ ID NO: 2) прионных белков.Figure 1 shows the amino acid sequence of human (SEQ ID NO: 1) and murine (SEQ ID NO: 2) prion proteins.

На фиг.2 изображено выравнивание прионных белков из людей (SEQ ID NO: 3), сирийского хомячка (хомячка) (SEQ ID NO: 4), крупного рогатого скота (SEQ ID NO: 5), овцы (SEQ ID NO: 6), мыши (SEQ ID NO: 7), лося (SEQ ID NO: 8), лани (SEQ ID NO: 9), гибридного оленя (SEQ ID NO: 10) и белохвостого оленя (SEQ ID NO: 11). Лось, лань, гибридный олень отличаются один от другого только на два остатка S/N128 и Q/E226 (показаны жирным шрифтом).Figure 2 shows the alignment of prion proteins from humans (SEQ ID NO: 3), Syrian hamster (hamster) (SEQ ID NO: 4), cattle (SEQ ID NO: 5), sheep (SEQ ID NO: 6) , mice (SEQ ID NO: 7), moose (SEQ ID NO: 8), fallow deer (SEQ ID NO: 9), hybrid deer (SEQ ID NO: 10) and white-tailed deer (SEQ ID NO: 11). Elk, fallow deer, hybrid deer differ from each other by only two residues S / N128 and Q / E226 (shown in bold).

На фиг.3, панелях A-F, показаны типовые пептоидные замены, которые могут быть сделаны для получения любого из описанных здесь пептидных реагентов. Пептоиды показаны кружками на каждой панели и показаны в типовом пептидном реагенте, описанном здесь (SEQ ID NO: 14, QWNKPSKPKTNG), в котором пролиновый остаток (остаток 8 в SEQ ID NO: 14) замещен N-замещенным глициновым (пептоидным) остатком. На панели A показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(S)-(1-фенилэтил)глицином; на панели B показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(4-гидроксифенил)глицином; на панели C показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(циклопропилметил)глицином; на панели D показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(изопропил)глицином; на панели Е показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-(3,5-диметоксибензил)глицином; и на панели F показан пептидный реагент, в котором пролиновый остаток замещен пептоидным остатком: N-бутилглицином. Figure 3, panels A-F, shows typical peptoid substitutions that can be made to produce any of the peptide reagents described herein. Peptoids are shown by circles on each panel and shown in the exemplary peptide reagent described here (SEQ ID NO: 14, QWNKPSKPKTNG) in which the proline residue (residue 8 in SEQ ID NO: 14) is replaced by an N-substituted glycine (peptoid) residue. Panel A shows a peptide reagent in which the proline residue is replaced by a peptoid residue: N- (S) - (1-phenylethyl) glycine; panel B shows a peptide reagent in which the proline residue is replaced by a peptoid residue: N- (4-hydroxyphenyl) glycine; panel C shows a peptide reagent in which the proline residue is replaced by a peptoid residue: N- (cyclopropylmethyl) glycine; panel D shows a peptide reagent in which the proline residue is replaced by a peptoid residue: N- (isopropyl) glycine; panel E shows a peptide reagent in which the proline residue is replaced by a peptoid residue: N- (3,5-dimethoxybenzyl) glycine; and panel F shows a peptide reagent in which the proline residue is replaced by a peptoid residue: N-butyl glycine.

На фиг.4 показаны результаты экспериментов по вестерн-блоттингу, описанных в примере 2. На дорожках 1 и 2 показано наличие прионных белков в гомогенатах головного мозга нормальных мышей (дорожка 1, помечена «С») и в денатурированных гомогенатах инфицированных мышей (дорожка 2, помечена «Sc»). Дорожки 3, 4 и 5 показывают специфичное связывание описанного здесь пептидного реагента (SEQ ID NO: 68) с патогенными формами приона в присутствии человеческой плазмы. В частности, дорожка 3 представляет собой контроль человеческой плазмы, и дорожка 4 представляет собой образец гомогената головного мозга нормальной мыши. На дорожке 5 показано сильное связывание пептидного реагента PrP^Sc в образцах гомогената инфицированной мыши.Figure 4 shows the results of the Western blotting experiments described in Example 2. Lines 1 and 2 show the presence of prion proteins in the brain homogenates of normal mice (lane 1, marked "C") and in the denatured homogenates of infected mice (lane 2 marked “Sc”). Lanes 3, 4 and 5 show the specific binding of the peptide reagent described here (SEQ ID NO: 68) to pathogenic forms of prion in the presence of human plasma. In particular, lane 3 is a control of human plasma, and lane 4 is a sample of the brain homogenate of a normal mouse. Lane 5 shows strong binding of the PrP ^Sc peptide reagent in infected mouse homogenate samples.

На фиг.5 показаны структуры типовых связанных с ПЭГ пептидных реагентов, как описано выше. 5 shows the structures of typical PEG-linked peptide reagents as described above.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION

Изобретение относится к удивительному и неожиданному открытию, что относительно малые пептиды (менее 50-100 аминокислот в длину, предпочтительно, менее чем примерно 50 аминокислот в длину и даже более предпочтительно, менее чем примерно 30 аминокислот в длину) могут использоваться для дискриминации между непатогенными и патогенными прионными белками. Таким образом, настоящее описание относится к неожиданному открытию, что данные пептиды и их производные (вместе называемые «пептидными реагентами») могут связываться с патогенными и непатогенными белковыми формами с разной специфичностью и/или сродством и, в соответствии с этим, могут использоваться в реагентах для диагностики/обнаружения или в качестве них, или в качестве компонентов терапевтических композиций. До настоящего описания полагали, что только более крупные молекулы (например, антитела, PrP^C, α-форма rPrP и плазминоген) могут использоваться для различения патогенной и непатогенной форм. Как таковые, ранее описанные антигенные пептиды использовали для получения антител, которые оценивали на предмет их способности различать патогенную и непатогенную формы. Однако вследствие относительно неиммуногенной природы прионных белков оказалось сложной задачей генерировать антитела, специфичные в отношении патогенных форм. См., например, R.A.Williamson et al. "Antibodies as Tools to Probe Prion Protein Biology" in PRION BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp: 717-741. The invention relates to the surprising and unexpected discovery that relatively small peptides (less than 50-100 amino acids in length, preferably less than about 50 amino acids in length and even more preferably less than about 30 amino acids in length) can be used to discriminate between non-pathogenic and pathogenic prion proteins. Thus, the present description refers to the unexpected discovery that these peptides and their derivatives (collectively called "peptide reagents") can bind to pathogenic and non-pathogenic protein forms with different specificities and / or affinities and, accordingly, can be used in reagents for diagnosis / detection, or as them, or as components of therapeutic compositions. Prior to the present description, it was believed that only larger molecules (eg, antibodies, PrP ^C , α-form rPrP and plasminogen) can be used to distinguish between pathogenic and non-pathogenic forms. As such, the previously described antigenic peptides were used to produce antibodies that were evaluated for their ability to distinguish between pathogenic and non-pathogenic forms. However, due to the relatively non-immunogenic nature of prion proteins, it has proved difficult to generate antibodies specific for pathogenic forms. See, for example, RAWilliamson et al. "Antibodies as Tools to Probe Prion Protein Biology" in PRION BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp: 717-741.

Открытие того, что некоторые пептиды, описанные здесь, взаимодействуют предпочтительно с патогенными (PrP^Sc) прионными белками, обеспечивает разработку новых реагентов для диагностики, анализов для обнаружения и терапевтических средств, среди прочих. Таким образом, изобретение относится к пептидным реагентам и, кроме того, относится к анализам для обнаружения и диагностическим анализам, использующим данные пептидные реагенты, к способам очистки и выделения, использующим данные пептидные реагенты, и к терапевтическим композициям, содержащим данные пептидные реагенты. Также предоставлены полинуклеотиды, кодирующие данные пептидные реагенты, и антитела, генерированные с использованием данных пептидных реагентов. Пептидные реагенты, полинуклеотиды и/или антитела, описанные здесь, используются в композициях и способах обнаружения патогенного приона, например, в биологическом образце. Кроме того, изобретение далее относится к способам применения таких пептидных реагентов, антител и/или полинуклеотидов в качестве компонента в терапевтической или профилактической композиции.The discovery that some of the peptides described herein preferably interact with pathogenic (PrP ^Sc ) prion proteins provides the development of new reagents for diagnosis, detection assays and therapeutic agents, among others. Thus, the invention relates to peptide reagents and, in addition, relates to assays for detection and diagnostic analyzes using these peptide reagents, to purification and isolation methods using these peptide reagents, and to therapeutic compositions containing these peptide reagents. Polynucleotides encoding these peptide reagents and antibodies generated using these peptide reagents are also provided. The peptide reagents, polynucleotides and / or antibodies described herein are used in compositions and methods for detecting a pathogenic prion, for example, in a biological sample. In addition, the invention further relates to methods of using such peptide reagents, antibodies and / or polynucleotides as a component in a therapeutic or prophylactic composition.

Пептидные реагенты (и полинуклеотиды, кодирующие данные пептидные реагенты), применяемые по изобретению, включают в себя пептид, который взаимодействует преимущественно с патогенными изоформами, по сравнению с непатогенными изоформами. Например, в некоторых вариантах осуществления описанные здесь пептидные реагенты специфично связываются с патогенными белковыми формами конформационных заболеваний и не связываются (или связываются в меньшей степени) с непатогенными формами. Пептидные реагенты, описанные здесь (и кодирующие их полинуклеотиды) могут использоваться, например, для получения антител. Данные антитела могут распознавать патогенные формы, непатогенные формы, или оба варианта. Данные молекулы могут использоваться, отдельно или в различных комбинациях, в диагностических анализах и/или в профилактических и терапевтических композициях.Peptide reagents (and polynucleotides encoding these peptide reagents) used according to the invention include a peptide that interacts predominantly with pathogenic isoforms compared to non-pathogenic isoforms. For example, in some embodiments, the peptide reagents described herein specifically bind to pathogenic protein forms of conformational diseases and do not bind (or bind to a lesser extent) to non-pathogenic forms. The peptide reagents described herein (and the polynucleotides encoding them) can be used, for example, to produce antibodies. These antibodies can recognize pathogenic forms, non-pathogenic forms, or both. These molecules can be used, alone or in various combinations, in diagnostic assays and / or in prophylactic and therapeutic compositions.

В практике настоящего изобретения, кроме указанных иначе случаев, будут использованы общепринятые способы химии, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, в пределах знания специалиста в данной области. Такие способы полностью объясняются в литературе. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); и Handbook of Experimental Immunology, Vols.I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K. S. ed., CRC Press, 1997); Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed. (Ausubel et al. eds., 1999, John Wiley & Sons); Molecular Biology Techniques : An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag); Peters and Dalrymple, Fields Virology (2ded), Fields et al. (eds.), B. N. Raven Press, New York, NY. In the practice of the present invention, except as otherwise indicated, conventional methods of chemistry, biochemistry, molecular biology, immunology and pharmacology will be used, within the knowledge of a person skilled in the art. Such methods are fully explained in the literature. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K. S. ed., CRC Press, 1997); Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed. (Ausubel et al. Eds., 1999, John Wiley &Sons); Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., Eds., 1998, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag); Peters and Dalrymple, Fields Virology (2ded), Fields et al. (eds.), B. N. Raven Press, New York, NY.

Понятно, что пептидные реагенты, антитела и способы по данному изобретению не ограничены конкретными препаратами или параметрами способа, поскольку таковые, конечно, могут изменяться. Также следует понимать, что применяемая здесь терминология предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления изобретения, но не для ограничения. It is understood that the peptide reagents, antibodies, and methods of this invention are not limited to the particular preparations or process parameters, since these, of course, may vary. It should also be understood that the terminology used here is intended only for the purpose of describing specific embodiments of the invention, and not for limitation.

Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки включены сюда полностью в качестве ссылки.All publications, patents, and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entireties.

I. ОпределенияI. Definitions

Для облегчения понимания изобретения избранные термины, применяемые в заявке, будут обсуждаться ниже.To facilitate understanding of the invention, selected terms used in the application will be discussed below.

Термины «прион», «прионный белок», «белок PrP» и «PrP» используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на патогенную форму белка (различно обозначаемую как скрэпи-белок, патогенная форма белка, патогенный прион и PrP^Sc) и непатогенную форму (различно обозначаемую как клеточная форма белка, клеточная изоформа, непатогенная изоформа, непатогенный прионный белок, и PrP^с), а также денатурированная форма и различные рекомбинантные формы прионного белка, которые могут не иметь патогенную конформацию или нормальную клеточную конформацию.The terms “prion”, “prion protein”, “PrP protein” and “PrP” are used interchangeably herein to refer to the pathogenic form of the protein (variously referred to as scrapie protein, pathogenic form of the protein, pathogenic prion and PrP ^Sc ) and the non-pathogenic form (various denoted as a cellular form of a protein, a cellular isoform, a non-pathogenic isoform, a non-pathogenic prion protein, and PrP ^c ), as well as a denatured form and various recombinant forms of a prion protein that may not have a pathogenic conformation or normal cellular conformation.

Патогенная форма белка ассоциирована с состоянием заболевания (губчатые энцефалопатии) у людей и животных; непатогенная форма обычно присутствует в животных клетках и может в подходящих условиях преобразовываться в патогенную конформацию PrP^Sc. Прионы продуцируются в природе в различных видах млекопитающих, включая человека, овец, крупный рогатый скот, и мышей. Репрезентативная аминокислотная последовательность человеческого прионного белка приведена в SEQ ID NO: 1. Репрезентативная аминокислотная последовательность мышиного прионного белка SEQ ID NO: 2. Другие репрезентативные последовательности показаны на фиг.2. The pathogenic form of the protein is associated with the state of the disease (spongiform encephalopathy) in humans and animals; the non-pathogenic form is usually present in animal cells and can, under suitable conditions, be converted to the pathogenic conformation of PrP ^Sc . Prions are naturally produced in various species of mammals, including humans, sheep, cattle, and mice. A representative amino acid sequence of a human prion protein is given in SEQ ID NO: 1. A representative amino acid sequence of a mouse prion protein of SEQ ID NO: 2. Other representative sequences are shown in FIG.

Используемый здесь термин «патогенный» означает, что данный белок действительно вызывает заболевание, или он может просто означать, что белок ассоциирован с заболеванием, и поэтому присутствует при наличии заболевания. Таким образом, патогенный белок при использовании термина в связи с данным описанием не обязательно представляет собой белок, который является конкретным каузативным агентом заболевания. Патогенные формы могут быть инфекционными, или не инфекционными. Термин «патогенная форма приона» применяется более специфично со ссылкой на конформацию и/или богатую бета-листами конформацию прионных белков млекопитающих, птиц или рекомбинантных прионных белков. В общем, богатая бета-листами конформация устойчива к действию протеиназы K. Термины «непатогенный» и «клеточный» при использовании в отношении к формам белка конформационного заболевания используются взаимозаменяемо для обозначения на нормальную изоформу белка, присутствие которого не ассоциировано с заболеванием.As used herein, the term “pathogenic” means that the protein is indeed causing the disease, or it can simply mean that the protein is associated with the disease and therefore is present in the presence of the disease. Thus, when using the term in connection with this description, a pathogenic protein is not necessarily a protein that is a specific causative agent of the disease. Pathogenic forms may be infectious or non-infectious. The term “pathogenic prion form” is used more specifically with reference to the conformation and / or beta-sheet-rich conformation of prion proteins of mammals, birds, or recombinant prion proteins. In general, beta-rich conformation is resistant to the action of proteinase K. The terms “non-pathogenic” and “cellular” when used in relation to forms of protein conformational disease are used interchangeably to refer to a normal protein isoform, the presence of which is not associated with the disease.

Более того, используемый здесь термин «прионный белок» или «белок конформационного заболевания» не ограничивается полипептидом, имеющим точную последовательность, соответствующие описанным здесь. Хорошо понятно, что данные термины охватывают белки конформационного заболевания из любого из идентифицированных или неидентифицированных видов или заболеваний (например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, и т.д.). Обычный специалист в данной области в свете учения настоящего описания и данной области знания может определить области, соответствующие последовательностям, показанным на фигурах в любых других прионных белках, с использованием, например, программ сравнения последовательностей (например, BLAST и других описанных здесь) или идентификации и выравнивания структурных характеристик или мотивов.Moreover, the term “prion protein” or “conformational disease protein” as used herein is not limited to a polypeptide having an exact sequence as described herein. It is well understood that these terms encompass proteins of conformational disease from any of the identified or unidentified species or diseases (e.g., Alzheimer's disease, Parkinson's disease, etc.). An ordinary person skilled in the art, in light of the teachings of the present description and this field of knowledge, can determine the regions corresponding to the sequences shown in the figures in any other prion proteins using, for example, sequence comparison programs (e.g. BLAST and others described here) or identification and alignment of structural characteristics or motives.

Термин «ген PrP» используется здесь для описания любого генетического материала, который экспрессирует прионные белки, включающие в себя известные полиморфизмы и патогенные мутации.The term "PrP gene" is used here to describe any genetic material that expresses prion proteins, including known polymorphisms and pathogenic mutations.

Термин «ген PrP» относится, в общем, к любому гену любого вида, который кодирует любой вид белка PrP. Некоторые широко известные последовательности PrP описаны в Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097-9101 (1992), и в патентах США 5565186; 5763740; 5792901; и W097/04814, включенными сюда в качестве ссылки для раскрытия и описания таких последовательностей. Ген PrP может происходить из любого животного, включая животных-«хозяев» и «экспериментальных» животных, описанных здесь, и включать в себя их любые полиморфизмы и мутации, причем понятно, что данные термины включают в себя другие такие гены PrP, которые еще не открыты. Данный белок, экспрессируемый таким геном, может принимать форму PrP^C (не относящуюся к болезни) или PrP^Sc (относящуюся к болезни).The term "PrP gene" refers, in general, to any gene of any kind that encodes any kind of PrP protein. Some well-known PrP sequences are described in Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097-9101 (1992), and in US patents 5565186; 5,763,740; 5,792,901; and W097 / 04814, incorporated herein by reference for the disclosure and description of such sequences. The PrP gene can be derived from any animal, including the host and experimental animals described herein, and include any polymorphisms and mutations thereof, it being understood that these terms include other such PrP genes that are not yet open. This protein expressed by such a gene can take the form of PrP ^C (not related to the disease) or PrP ^Sc (related to the disease).

Используемый здесь термин «связанное с прионом заболевание» относится к заболеванию, вызванному целиком или частично патогенным прионным белком (PrP^Sc). Связанные с прионами заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров скрэпи, губчатые энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE), коровье бешенство, кошачья губчатая энцефалопатия, куру, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), новый вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (nvCJD), болезнь хронической усталости (CWD), болезнь Герштманн-Штрасслера-Шейнкера (GSS) и фатальную семейную бессонницу (FFI).As used herein, the term "prion-related disease" refers to a disease caused by a whole or partially pathogenic prion protein (PrP ^Sc ). Prion-related diseases include, but are not limited to, scrapie, bovine spongiform encephalopathy (BSE), rabies, feline spongiform encephalopathy, chicken, Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), a new variant of Creutzfeldt-Jakob disease chronic fatigue (CWD), Gerstmann-Strassler-Scheinker disease (GSS) and fatal familial insomnia (FFI).

Используемый здесь термин «пептидные реагенты» обычно относится к любому соединению, включающему в себя встречающиеся в природе или синтетические полимеры аминокислот или подобных аминокислотам молекул, включая в качестве неограничивающих примеров соединения, содержащие только амино- и/или иминомолекулы. Пептидные реагенты по настоящему изобретению взаимодействуют преимущественно с патогенным прионным белком и они обычно получены из фрагментов прионного белка. Термин «пептид» будет использоваться взаимозаменяемо с терминами «олигопептид» или «полипептид», и применением данных терминов не конкретизируется размер молекулы. В состав определения входят, например, пептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты, пептиоиды, и т.д.), пептиды с замещенными связями, а также с другими модификациями, известными в данной области, встречающимися в природе и неприродными (например, синтетическими). Таким образом, синтетические пептиды, димеры, мультимеры (например, тандемные повторы, формы пептидов-множественных антигенов (MAP), линейно связанные пептиды), циклизованные, разветвленные молекулы и тому подобное, включены в данное определение. Термины также включают в себя молекулы, содержащие один или несколько N-замещенных остатков глицина («пептоидов») и других синтетических аминокислот или пептидов. (См., например, патент США № 5831005; 5877278; и 5977301; Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7(7): 463-473; и Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (20): 9367-9371, для описания пептоидов). Неограничивающие длины пептидов, подходящих для применения по настоящему изобретению, включают в себя пептиды от 3 до 5 остатков в длину, от 6 до 10 остатков в длину (или соответствующие любому целому числу между ними), от 11 до 20 остатков в длину (или соответствующие любому целому числу между ними), от 21 до 75 остатков в длину (или соответствующие любому целому числу между ними), от 75 до 100 остатков в длину (или соответствующие любому целому числу между ними), или полипептиды более 100 остатков в длину. Обычно пептиды, которые могут использоваться по данному изобретению, могут иметь максимальную длину, подходящую для предназначенного применения. Предпочтительно, пептид составляет от 3 до 100 остатков в длину. В общем, специалист в данной области может легко выбрать максимальную длину в свете приведенного здесь учения. Далее, описанные здесь пептидные реагенты, например синтетические пептиды, могут включать в себя дополнительные молекулы, такие как метки, линкеры или другие химические радикалы (например, биотин, специфичные в отношении амилоида красители, такие как Конго красный или тиофлавин). Такие радикалы могут далее усиливать взаимодействия пептидов с прионными белками и/или дальнейшую детекцию прионных белков. As used herein, the term “peptide reagents” generally refers to any compound that includes naturally occurring or synthetic polymers of amino acids or amino acid-like molecules, including, but not limited to, compounds containing only amino and / or iminomolecules. The peptide reagents of the present invention interact predominantly with pathogenic prion protein and they are usually derived from fragments of prion protein. The term “peptide” will be used interchangeably with the terms “oligopeptide” or “polypeptide”, and the use of these terms does not specify the size of the molecule. The definition includes, for example, peptides containing one or more amino acid analogs (including, for example, unnatural amino acids, peptoids, etc.), peptides with substituted bonds, as well as other modifications known in the art that are found in nature and unnatural (for example, synthetic). Thus, synthetic peptides, dimers, multimers (e.g., tandem repeats, multiple antigen (MAP) peptides, linearly linked peptides), cyclized, branched molecules, and the like are included in this definition. The terms also include molecules containing one or more N-substituted glycine residues (“peptoids”) and other synthetic amino acids or peptides. (See, for example, US Patent No. 5831005; 5877278; and 5977301; Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7 (7): 463-473; and Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 (20): 9367-9371, to describe peptoids). Non-limiting lengths of peptides suitable for use in the present invention include peptides from 3 to 5 residues in length, from 6 to 10 residues in length (or corresponding to any integer between them), from 11 to 20 residues in length (or corresponding any integer between them), from 21 to 75 residues in length (or corresponding to any integer between them), from 75 to 100 residues in length (or corresponding to any integer between them), or polypeptides of more than 100 residues in length. Typically, peptides that can be used according to this invention can have a maximum length suitable for the intended use. Preferably, the peptide is 3 to 100 residues in length. In general, one of ordinary skill in the art can easily select the maximum length in light of the teachings presented here. Further, peptide reagents described herein, for example synthetic peptides, may include additional molecules, such as tags, linkers, or other chemical radicals (e.g., biotin, amyloid-specific dyes, such as Congo red or thioflavin). Such radicals can further enhance the interaction of peptides with prion proteins and / or further detection of prion proteins.

Пептидные реагенты также включают в себя производные аминокислотных последовательностей по изобретению, имеющие одну или несколько замен, дополнений и/или делеций, включающие одну или несколько не встречающихся в природе аминокислот. Предпочтительно, производные характеризуются, по меньшей мере, 50%-ной идентичностью в отношении любой последовательности дикого типа или последовательности сравнения, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 70%-ной идентичностью, более предпочтительно, по меньшей мере, идентичностью последовательности, примерно равной 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, в отношении любой описанной здесь последовательности дикого типа или последовательности сравнения. Идентичность по последовательности (или в процентах) может определяться, как описано ниже. Такие производные могут включать в себя постэкспрессионные модификации полипептида, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, и тому подобное.Peptide reagents also include derivatives of the amino acid sequences of the invention having one or more substitutions, additions and / or deletions, including one or more non-naturally occurring amino acids. Preferably, the derivatives are characterized by at least 50% identity with respect to any wild-type sequence or comparison sequence, preferably at least about 70% identity, more preferably at least a sequence identity of about 75 %, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%, with respect to any wild-type sequence described herein or comparison sequences. Sequence identity (or percentage) may be determined as described below. Such derivatives may include post-expression modifications of the polypeptide, for example glycosylation, acetylation, phosphorylation, and the like.

Пептидные производные также могут включать в себя модификации нативной последовательности, например делеции, добавления и замены (в общем консервативные по природе), при том что полипептид сохраняет требуемую активность. Данные модификации могут быть преднамеренными, например созданными путем сайтспецифического мутагенеза, или могут быть случайными, например произошедшими за счет мутаций хозяев, которые продуцируют данные белки, или за счет ошибок амплификации ПЦР.Peptide derivatives may also include modifications to the native sequence, such as deletions, additions and substitutions (generally conservative in nature), while the polypeptide retains the desired activity. These modifications may be intentional, for example, created by site-specific mutagenesis, or may be random, for example, due to mutations of the hosts that produce these proteins, or due to PCR amplification errors.

Более того, могут быть сделаны модификации, которые имеют один или несколько следующих эффектов: снижение токсичности; повышение сродства и/или специфичности прионных белков; облегчение процессинга в клетках (например, секреции, презентации антигена, и т.д.); и облегчение презентации B-клеткам и/или Т-клеткам. Описанные здесь полипептиды могут быть получены рекомбинантно, синтетически, могут быть очищены из природных источников или из культуры ткани. Moreover, modifications can be made that have one or more of the following effects: reduced toxicity; increased affinity and / or specificity of prion proteins; facilitating cell processing (e.g., secretion, antigen presentation, etc.); and facilitating presentation to B cells and / or T cells. The polypeptides described herein can be obtained recombinantly, synthetically, can be purified from natural sources or from tissue culture.

Используемый здесь термин «фрагмент» относится к пептиду, состоящему только из части интактного полноразмерного белка и структуры, которая находится в природе. Например, фрагмент может включать в себя С-концевую делецию и/или N-концевую делецию белка. Обычно фрагмент сохраняет одну, некоторые или все функции полноразмерного белка, из которого он получен. Обычно фрагмент включает в себя, по меньшей мере, 5 следующих друг за другом аминокислотных остатков нативного белка; предпочтительно, по меньшей мере, 8 следующих друг за другом аминокислотных остатков; более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, или 30 следующих друг за другом аминокислотных остатков нативного белка.As used herein, the term “fragment” refers to a peptide consisting only of a portion of an intact full-sized protein and a structure that is found in nature. For example, a fragment may include a C-terminal deletion and / or N-terminal deletion of the protein. Typically, a fragment retains one, some, or all of the functions of the full-sized protein from which it is derived. Typically, the fragment includes at least 5 consecutive amino acid residues of the native protein; preferably at least 8 consecutive amino acid residues; more preferably at least about 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 successive amino acid residues of the native protein.

Термин «полинуклеотид», известный в данной области, в общем относится к молекуле нуклеиновой кислоты. «Полинуклеотид» может включать в себя двух- и одноцепочечные последовательности и относится к приведенным в качестве неограничивающих примеров прокариотическим последовательностям, эукариотическим мРНК, кДНК из вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномных РНК- и ДНК-последовательностей из вирусов (например, РНК- и ДНК-вирусов и ретровирусов), прокариотической ДНК или эукариотической ДНК (например, относящейся к млекопитающим), и, особенно, к синтетическим последовательностям ДНК. Данный термин также охватывает последовательности, которые включают в себя любой из известных аналогов ДНК и РНК, и включает в себя такие модификации, как делеции, добавления и замены (обычно консервативные по природе) в отношение нативной последовательности.The term "polynucleotide", as known in the art, generally refers to a nucleic acid molecule. A “polynucleotide” can include double and single chain sequences and refers to non-limiting examples of prokaryotic sequences, eukaryotic mRNAs, cDNAs from viral, prokaryotic or eukaryotic mRNAs, genomic RNA and DNA sequences from viruses (eg, RNA and DNA viruses and retroviruses), prokaryotic DNA or eukaryotic DNA (e.g., mammalian), and especially synthetic DNA sequences. The term also encompasses sequences that include any of the known DNA and RNA analogs, and includes modifications such as deletions, additions, and substitutions (usually conservative in nature) to the native sequence.

Данные модификации могут быть преднамеренными, например, созданными путем сайтспецифического мутагенеза, или могут быть случайными, например, произошедшими за счет мутаций хозяев, содержащих полинуклеотиды, содержащие прионы. Модификации полинуклеотидов могут иметь любое количество эффектов, включая, например, облегчение экспрессии полипептидного продуктуа в клетке хозяина.These modifications may be intentional, for example, created by site-specific mutagenesis, or may be accidental, for example, due to mutations of hosts containing polynucleotides containing prions. Modifications to polynucleotides can have any number of effects, including, for example, facilitating the expression of a polypeptide product in a host cell.

Полинуклеотид может кодировать биологически активный (например, иммуногенный или терапевтический) белок или полипептид. В зависимости от природы полипептида, кодируемого полинуклеотидом, полинуклеотид может включать в себя минимум 10 нуклеотидов, например, в случае, когда полинуклеотид кодирует антиген или эпитоп. Обычно полинуклеотид кодирует пептиды, по меньшей мере, составляющие 18,19, 20,21, 22,23, 24,25, 30 или большее количество аминокислот. A polynucleotide may encode a biologically active (eg, immunogenic or therapeutic) protein or polypeptide. Depending on the nature of the polypeptide encoded by the polynucleotide, the polynucleotide may include at least 10 nucleotides, for example, in the case where the polynucleotide encodes an antigen or epitope. Typically, a polynucleotide encodes peptides of at least 18.19, 20.21, 22.23, 24.25, 30 or more amino acids.

«Кодирующая полинуклеотидная последовательность» или последовательность, которая «кодирует» выбранный полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo при помещении под контроль подходящих регуляторных последовательностей (или «контрольных элементов»). Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5'-(N-)конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-(С-)конце. Последовательность терминации транскрипции может быть локализована в 3'-направлении от кодирующей последовательности. Типичные «элементы контроля» включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, регуляторы транскрипции, такие как промоторы, элементы-энхансеры транскрипции, сигналы терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования; и регуляторы трансляции, например последовательности для оптимизации инициации трансляции, например последовательности Шайна-Дальгарно (участок связывания рибосомы), последовательности Козака (т.е., последовательности оптимизации трансляции, расположенные, например, в 5'-направлении от кодирующей последовательности), лидерные последовательности (гетерологичные или нативные), кодон инициации трансляции (например, ATG), и последовательности терминации трансляции. Промоторы могут включать в себя индуцируемые промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируется аналитом, кофактором, регуляторным белком, и т.д.), репрессируемые промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, подавляется аналитом, кофактором, регуляторным белком, и т.д.) и конститутивные промоторы.A "coding polynucleotide sequence" or a sequence that "encodes" a selected polypeptide is a nucleic acid molecule that is transcribed (in the case of DNA) and translated (in the case of mRNA) into the polypeptide in vivo when placed under the control of suitable regulatory sequences (or "control elements "). The boundaries of the coding sequence are determined by the start codon at the 5 '- (N-) end and the translation stop codon at the 3' - (C-) end. The transcription termination sequence can be localized in the 3'-direction from the coding sequence. Typical “control elements” include, but are not limited to, transcriptional regulators, such as promoters, transcription enhancer elements, transcriptional termination signals, and polyadenylation sequences; and translation controls, e.g., sequences for optimizing translation initiation, e.g., Shine-Dalgarno sequences (ribosome binding site), Kozak sequences (i.e., translation optimization sequences located, for example, in the 5'-direction from the coding sequence), leader sequences (heterologous or native), translation initiation codon (e.g., ATG), and translation termination sequences. Promoters may include inducible promoters (where expression of a polynucleotide sequence operably linked to the promoter is induced by an analyte, cofactor, regulatory protein, etc.), repressed promoters (where expression of a polynucleotide sequence operably linked to the promoter is inhibited by analyte, cofactor , regulatory protein, etc.) and constitutive promoters.

«Функционально связанный» означает перестройку элементов, при которой компоненты, описанные таким образом, конфигурируются так, что они выполняют их обычную функцию. Таким образом, данный промотор функционально связаный с кодирующей последовательностью способен осуществлять экспрессию кодирующей последовательности в присутствии надлежащего фермента. Промотору не нужно непосредственно прилегать к кодирующей последовательности, если он функционирует для управления ее экспрессии. Таким образом, например, промежуточные нетранслируемые, но транскрибируемые последовательности могут присутствовать между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью, и промоторная последовательность, тем не менее, будет считаться «функционально связанной» с кодирующей последовательностью.“Functionally connected” means a rebuilding of elements in which the components described in this way are configured to perform their normal function. Thus, a given promoter operably linked to a coding sequence is capable of expressing a coding sequence in the presence of an appropriate enzyme. The promoter does not need to be directly adjacent to the coding sequence if it functions to control its expression. Thus, for example, intermediate untranslated but transcribed sequences may be present between the promoter sequence and the coding sequence, and the promoter sequence, however, will be considered "functionally linked" to the coding sequence.

Используемый здесь для описания молекулы нуклеиновой кислоты термин «рекомбинантная» молекула нуклеиновой кислоты означает полинуклеотид геномного, кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, который в силу его происхождения или манипуляции: (1) не ассоциирован частично или полностью с полинуклеотидом, с которым он ассоциирован в природе; и/или (2) связан с полинуклеотидом, отличным от того, с которым он связан в природе. Используемый здесь в отношении белка или полипептида термин «рекомбинантный» означает полипептид, продуцируемый путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Термины «рекомбинантные клетки хозяина», «клетки хозяина», «клетки», «клеточные линии», «клеточные культуры» и другие такие термины, обозначающие прокариотические микроорганизмы или эукариотические клеточные линии, культивируемые в одноклеточном виде, используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, которые могут использоваться или ранее использовались в качестве реципиентов для рекомбинантных векторов или другой ДНК для переноса, и включают в себя потомство исходной клетки, которая была трансфицирована. Понятно, что потомство одной родительской клетки может не быть обязательно полностью идентично по морфологии или по геномной или общей ДНК, комплементарной исходной родительской ДНК, вследствие случайной или преднамеренной мутации. Потомство родительской клетки, которое достаточно сходно с родительской клеткой, характеризующееся соответствующими свойствами, такими как присутствие нуклеотидной последовательности, кодирующей требуемый пептид, включается в потомство, предполагаемое данным определением, и охватывается указанными выше терминами.As used herein to describe a nucleic acid molecule, the term “recombinant” nucleic acid molecule means a polynucleotide of genomic, cDNA, semisynthetic or synthetic origin, which due to its origin or manipulation: (1) is not partially or fully associated with the polynucleotide with which it is naturally associated ; and / or (2) is associated with a polynucleotide other than that with which it is associated in nature. As used herein with reference to a protein or polypeptide, the term “recombinant” means a polypeptide produced by expression of a recombinant polynucleotide. The terms “recombinant host cells”, “host cells”, “cells”, “cell lines”, “cell cultures” and other such terms denoting prokaryotic microorganisms or eukaryotic cell lines cultured in a single cell form are used interchangeably and refer to cells, which can be used or have been previously used as recipients for recombinant vectors or other DNA for transfer, and include the progeny of the original cell that has been transfected. It is understood that the offspring of one parent cell may not necessarily be completely identical in morphology or in genomic or total DNA, complementary to the original parental DNA, due to an accidental or intentional mutation. The progeny of the parent cell, which is fairly similar to the parent cell, characterized by appropriate properties, such as the presence of a nucleotide sequence encoding the desired peptide, is included in the progeny envisioned by this definition and is encompassed by the above terms.

Под «изолированным», при указании на полинуклеотид или полипептид, подразумевается, что отмеченная молекула является отдельной и дискретной от целого организма, в котором данная молекула находится в природе или когда полинуклиатид или полиамид не находится в природе, является достаточно свободной от других биологических макромолекул, так что полинуклеотид или полипептид может использоваться для предназначенной ему цели.By "isolated", when referring to a polynucleotide or polypeptide, it is meant that the marked molecule is separate and discrete from the whole organism in which the molecule is in nature or when the polynuclide or polyamide is not in nature, is sufficiently free from other biological macromolecules, so that the polynucleotide or polypeptide can be used for its intended purpose.

Термин «антитело», известный в данной области, включает в себя один или несколько биологических радикалов, которые химическими и физическими средствами могут связываться или ассоциироваться с эпитопом интересующего полипептида. Например, антитела по изобретению могут преимущественно взаимодействовать (например, специфично связываться) с патогенными конформациями приона. Термин «антитело» включает в себя антитела, полученные из поликлональных и моноклональных препаратов, а также следующее: гибридные (химерные) молекулы (см., например, Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299; и патент США № 4816567); F(ab')₂- и F(ab)-фрагменты; Fv-молекулы (нековалентные гетеродимеры, см., например, Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69: 2659-2662; и Ehrlich et al. (1980) Brochent 19: 4091-4096); одноцепочечные Fv-молекулы (sFv) (см., например, Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5897-5883); димерные и тримерные конструкции антитела; минитела (см., например, Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B: 120-126); гуманизированные молекулы антитела (см., например, Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534-1536; и публикацию патента Великобритании № GB 2276169, опубликованную 21 сентября 1994 г.); и любые функциональные фрагменты, полученные из таких молекул, где такие фрагменты сохраняют свойства иммунологического связывания родительской молекулы антитела. Термин «антитело» далее включает в себя антитела, полученные необщепринятыми способами, такими как фаговый дисплей.The term "antibody", as known in the art, includes one or more biological radicals that, by chemical and physical means, can bind or associate with an epitope of the polypeptide of interest. For example, antibodies of the invention can preferentially interact (e.g., specifically bind) with pathogenic prion conformations. The term "antibody" includes antibodies derived from polyclonal and monoclonal preparations, as well as the following: hybrid (chimeric) molecules (see, for example, Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299; and US patent No. 4816567 ); F (ab ') ₂ and F (ab) fragments; Fv molecules (non-covalent heterodimers, see, for example, Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69: 2659-2662; and Ehrlich et al. (1980) Brochent 19: 4091-4096); single chain Fv molecules (sFv) (see, for example, Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5897-5883); dimeric and trimeric antibody constructs; minitel (see, for example, Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B: 120-126); humanized antibody molecules (see, for example, Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534-1536; and UK Patent Publication No. GB 2276169, published September 21, 1994 .); and any functional fragments derived from such molecules, where such fragments retain the immunological binding properties of the parent antibody molecule. The term "antibody" further includes antibodies obtained by non-conventional methods, such as phage display.

Используемый здесь термин «моноклональное антитело» относится к композиции антител, содержащей гомогенную популяцию антител. Данный термин не ограничен в плане вида или источника антитела, и он не подразумевает ограничения способа, которым оно получено. Таким образом, термин охватывает антитела, полученные из мышиных гибридом, а также человеческие моноклональные антитела, полученные с использованием человеческих, а не мышиных антител. См., например, Cote, et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,1985, p 77. As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody composition comprising a homogeneous population of antibodies. This term is not limited in terms of the type or source of the antibody, and it does not imply a limitation on the way it is obtained. Thus, the term encompasses antibodies derived from murine hybridomas, as well as human monoclonal antibodies obtained using human rather than murine antibodies. See, for example, Cote, et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, p 77.

Если требуются поликлональные антитела, выбранное млекопитающее (например, мышь, кролик, коза, лошадь, и т.д.), в общем, иммунизируют иммуногенной композицией (например, описанным здесь пептидным реагентом). Сыворотку из иммунизированного животного собирают и обрабатывают по известным процедурам. Если сыворотка, содержащая поликлональные антитела к выбранному пептидному антигену, содержит антитела к другим антигенам, поликлональные антитела могут очищаться иммуноаффинной хроматографией. Способы продукции и обработки поликлональных антисывороток известны в данной области, см., например, Mayer and Walker, eds. (1987) IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).If polyclonal antibodies are required, the selected mammal (e.g., mouse, rabbit, goat, horse, etc.) is generally immunized with an immunogenic composition (e.g., the peptide reagent described herein). The serum from the immunized animal is collected and processed according to known procedures. If the serum containing the polyclonal antibodies to the selected peptide antigen contains antibodies to other antigens, the polyclonal antibodies can be purified by immunoaffinity chromatography. Methods for the production and processing of polyclonal antisera are known in the art, see, for example, Mayer and Walker, eds. (1987) IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).

Специалист в данной области может легко продуцировать моноклональные антитела, направленные против описанных здесь пептидных реагентов. Общая методология для получения моноклональных антител гибридомами хорошо известна. Иммортализованные антителопродуцирующие клеточные линии могут создаваться путем слияния клеток, и также другими способами, такими как прямая трансформация B-лимфоцитов онкогенной ДНК или трансфекция вирусом Эпштейна-Барр. См., например, M. Schreier et al. (1980) HYBRIDOMA TECHNIQUES; Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS; Kennett et al. (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES; см. также патенты США № 4341761; 4399121; 4427783; 4444887; 4466917; 4472500; 4491632; и 4493890. One of skill in the art can readily produce monoclonal antibodies directed against the peptide reagents described herein. The general methodology for producing monoclonal antibodies by hybridomas is well known. Immortalized antibody-producing cell lines can be created by cell fusion, and also in other ways, such as direct transformation of oncogenic DNA B-lymphocytes or transfection with Epstein-Barr virus. See, for example, M. Schreier et al. (1980) HYBRIDOMA TECHNIQUES; Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS; Kennett et al. (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES; see also US patents No. 4341761; 4,399,121; 4,427,783; 4,448,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; and 4493890.

Используемый здесь термин «однодоменное антитело» (dAb) представляет собой антитело, состоящее из V_H-домена, которое специфично связывается с обозначенным антителом. dAb не содержит V_L-домен, но может содержать другие антигенсвязывающие домены, которые, как известно, существуют в антителах, например каппа- и лямбда-домены. Способы получения dAb известны в данной области. См., например, Ward et al, Nature 341: 544 (1989). As used herein, the term “single domain antibody” (dAb) is an antibody consisting of a V _H domain that specifically binds to a designated antibody. dAb does not contain a V _L domain, but may contain other antigen binding domains that are known to exist in antibodies, for example, the kappa and lambda domains. Methods for producing dAb are known in the art. See, for example, Ward et al, Nature 341: 544 (1989).

Антитела могут также состоять из V_H- и V_L-доменов, а также другие антигенсвязывающие домены. Примеры данных типов антител и способы их получения известны в данной области (см., например, патент США 4816467, который включен сюда в качестве ссылки) и включают в себя следующее. Например, термин «антитела позвоночных» относится к антителам, которые являются тетрамерами или их агрегатами, включающим в себя легкие и тяжелые цепи, которые обычно агрегируют в «Y»-конфигурацию и которые могут иметь ковалентные связи между цепями, но могут и не иметь их. В антителах позвоночных аминокислотные последовательности цепей гомологичны тем последовательностям, которые обнаружены в антителах, продуцируемых в позвоночных, in situ или in vitro (например, в гибридомах). Антитела позвоночных включают в себя, например, очищенные поликлональные антитела и моноклональные антитела, способы получения которых описаны ниже.Antibodies can also consist of V _H and V _L domains, as well as other antigen binding domains. Examples of these types of antibodies and methods for their preparation are known in the art (see, for example, US Pat. No. 4,816,467, which is incorporated herein by reference) and includes the following. For example, the term “vertebrate antibodies” refers to antibodies that are tetramers or their aggregates, including light and heavy chains, which typically aggregate in the “Y” configuration and which may or may not have covalent bonds between the chains . In vertebrate antibodies, the amino acid sequences of the chains are homologous to those found in antibodies produced in vertebrates, in situ or in vitro (for example, in hybridomas). Vertebrate antibodies include, for example, purified polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, the methods for which are described below.

«Гибридные антитела» представляют собой антитела, где цепи отдельно друг от друга гомологичны в отношении цепей антител млекопитающих и представляют собой новые их соединения, так что два других антигена могут преципитировать с образованием тетрамера или агрегируют. В гибридных антителах одна пара тяжелых и легких цепей гомологичны тем, которые находятся в антителе, полученном против первого антигена, тогда как вторая пара цепей гомологична тем, которые находятся в антителе, полученном против второго антитела. Результатом этого является свойство «бивалентности», т.е., способность связывать два антигена одновременно. Такие гибриды могут также образовываться с использованием химерных цепей, как указано выше.“Hybrid antibodies” are antibodies where the chains are separately homologous to the chains of mammalian antibodies and are new compounds thereof, so that the other two antigens can precipitate to form a tetramer or aggregate. In hybrid antibodies, one pair of heavy and light chains are homologous to those in the antibody obtained against the first antigen, while the second pair of chains is homologous to those in the antibody obtained against the second antibody. The result of this is the “bivalence” property, that is, the ability to bind two antigens simultaneously. Such hybrids can also be formed using chimeric chains, as described above.

Термин «химерные антитела» относится к антителам, в которых тяжелые и/или легкие цепи являются белками слияния. Обычно одна часть аминокислотных последовательностей цепи гомологична соответствующим последовательностям в антителе, происходящем из конкретного вида или конкретного класса, в то время как оставшийся сегмент цепи гомологичен последовательностям, происходящим их другого вида и/или класса. Обычно вариабельная область обеих легких и тяжелых цепей имитирует вариабельные области или антитела, происходящие из одного вида позвоночных, тогда как константные части гомологичны последовательностям, происходящих из другого вида позвоночных. Однако определение не ограничивается данным конкретным примером. Также включено любое антитело, в котором тяжелая или легкая цепь или обе составлены из комбинаций последовательностей, имитирующих последовательности антител из различных источников, причем данные источники происхождения являются различными классами или различными видами, и точка слияния находится на границе вариабельной и константной области или в другом положении. Таким образом, возможно продуцировать антитела, в которых ни константная, ни вариабельная область не имитирует какой-либо известной последовательности антитела. Затем становится возможным, например, конструировать антитела, вариабельная область которых имеет высокоспецифичное сродство в отношении конкретного антигена, или константная область которых может проявлять повышенное связывание комплемента, или реализовывать другие улучшения свойств, проявляемых конкретной константной областью.The term "chimeric antibodies" refers to antibodies in which the heavy and / or light chains are fusion proteins. Typically, one portion of the amino acid sequences of a chain is homologous to the corresponding sequences in an antibody originating from a particular species or class, while the remaining segment of the chain is homologous to sequences originating from another species and / or class. Typically, the variable region of both light and heavy chains mimics variable regions or antibodies originating from one vertebrate species, while the constant parts are homologous to sequences originating from another vertebrate species. However, the definition is not limited to this specific example. Also included is any antibody in which the heavy or light chain, or both, are composed of combinations of sequences that mimic the sequences of antibodies from different sources, these sources of origin being different classes or different types, and the fusion point is at the border of the variable and constant region or in a different position . Thus, it is possible to produce antibodies in which neither the constant nor the variable region mimics any known sequence of antibodies. Then it becomes possible, for example, to design antibodies whose variable region has a highly specific affinity for a particular antigen, or whose constant region may exhibit increased complement binding, or to realize other improvements in the properties exhibited by a particular constant region.

Другим примером являются «измененные антитела», относящиеся к антителам, в которых встречающаяся в природе аминокислотная последовательность антитела позвоночных была изменена. С использованием способа рекомбинантной ДНК антитела могут быть реконструированы с получением требуемых характеристик. Возможных вариаций много, и они изменяются от замены одной или нескольких аминокислот до полной реконструкции области, например константной области. Изменения в константной области, в общем, для придания требуемых характеристик клеточных процессов, например изменений фиксации комплемента, взаимодействий с мембранами, и других эффекторных функций. Изменения вариабельной области могут быть сделаны для изменения антигенсвязывающих характеристик. Антитело может также конструироваться для обеспечения специфичной доставки молекулы или вещества к специфичной клетке или участку ткани. Требуемые изменения могут быть сделаны известными способами молекулярной биологии, например рекомбинантными способами, сайтспецифическим мутагенезом, и т.д.Another example is “altered antibodies” referring to antibodies in which the naturally occurring amino acid sequence of vertebrate antibodies has been altered. Using the recombinant DNA method, antibodies can be reconstructed to obtain the desired characteristics. There are many possible variations, and they vary from the replacement of one or more amino acids to the complete reconstruction of a region, for example, a constant region. Changes in the constant region, in general, to impart the required characteristics of cellular processes, for example, changes in fixation of complement, interactions with membranes, and other effector functions. Variable region changes can be made to alter antigen binding characteristics. An antibody can also be designed to provide specific delivery of a molecule or substance to a specific cell or tissue site. The required changes can be made by known methods of molecular biology, for example, recombinant methods, site-specific mutagenesis, etc.

Еще одним примером являются «унивалентные антитела», которые представляют собой агрегаты, составленные из димера тяжелая цепь/легкая цепь, связанного с Fc- (т.е., стволовой) областью второй тяжелой цепи. Данный тип антител избегает антигенной модуляции. См., например, Glennie et al. Nature 295: 712 (1982). Также в определение антител входят «Fab»-фрагменты антител. «Fab»-область относится к тем частям тяжелой и легкой цепей, которые приблизительно эквивалентны или аналогичны последовательностям, которые составляют часть, относящуюся к ветвям тяжелой и легкой цепей, и которые, как показано, характеризуются иммунологическим связыванием со специфичным антигеном, но не имеют эффекторной Fc-части. «Fab» включает в себя агрегаты одной тяжелой и одной легкой цепей (обычно известные как Fab'), а также тетрамеры, состоящие из 2 H- и 2 L-цепей (обозначаемые как F(ab)₂), которые способны избирательно взаимодействовать с обозначенным антигеном или семейством антигенов. Антитела Fab могут подразделяться на подмножества, аналогичные описанным выше, т.е., «Fab позвоночных», «гибридный Fab», «химерный Fab», и «измененный Fab». Способы продукции Fab-фрагментов антител известны в данной области и включают в себя, например, протеолиз и синтез рекомбинантными способами. Another example is “univalent antibodies”, which are aggregates made up of a heavy chain / light chain dimer bound to the Fc- (ie, stem) region of the second heavy chain. This type of antibody avoids antigenic modulation. See, for example, Glennie et al. Nature 295: 712 (1982). The definition of antibodies also includes “Fab” antibody fragments. "Fab" region refers to those parts of the heavy and light chains that are approximately equivalent or similar to the sequences that make up the part relating to the branches of the heavy and light chains, and which, as shown, are characterized by immunological binding to a specific antigen, but do not have effector Fc parts. "Fab" includes aggregates of one heavy and one light chain (commonly known as Fab '), as well as tetramers consisting of 2 H and 2 L chains (denoted by F (ab) ₂ ) that are capable of selectively interacting with designated antigen or antigen family. Fab antibodies can be subdivided into subsets similar to those described above, ie, “Vertebrate Fab”, “Hybrid Fab”, “Chimeric Fab”, and “Modified Fab”. Methods for producing Fab fragments of antibodies are known in the art and include, for example, proteolysis and synthesis by recombinant methods.

Термин «комплекс антиген-антитело» относится к комплексу, образованному антителом, которое специфично связывается с эпитопом на антигене. The term "antigen-antibody complex" refers to a complex formed by an antibody that specifically binds to an epitope on an antigen.

Говорят что пептид (или пептидный реагент) «взаимодействует» с другим пептидом или белком, если он связывается специфично, неспецифично или в некоторой комбинации специфичного или неспецифичного связывания. Говорят что пептид (или пептидный реагент) «взаимодействует предпочтительно» с патогенным прионным белком, если он связывается с большим сродством и/или с большей специфичностью с патогенной формой, по сравнению с непатогенными изоформами. Пептидный реагент, который взаимодействует преимущественно с патогенным прионным белком, также обозначается здесь как патогенный специфичный в отношении приона пептидный реагент. Следует понимать, что преимущественное взаимодействие не обязательно требует взаимодействия между специфичными аминокислотными остатками и/или мотивами каждого пептида. Например, в некоторых вариантах осуществления описанные здесь пептидные реагенты взаимодействуют преимущественно с патогенными изоформами, но, тем не менее, могут быть способными связывать непатогенные изоформы на слабом, но выявляемом уровне (например, 10%-ное или менее выраженное связывание по сравнению с интересующим полипептидом). Обычно слабое связывание или фоновое связывание легко отличимо от преимущественного связывания с интересующим соединением или полипептидом, например, за счет применения подходящих контролей. В общем, пептиды по изобретению связывают патогенные прионы в присутствии 10⁶-кратного избытка непатогенных форм. A peptide (or peptide reagent) is said to “interact” with another peptide or protein if it binds specifically, non-specifically, or in some combination of specific or non-specific binding. It is said that a peptide (or peptide reagent) "preferably interacts" with a pathogenic prion protein if it binds with greater affinity and / or with greater specificity to the pathogenic form, as compared to non-pathogenic isoforms. A peptide reagent that interacts predominantly with a pathogenic prion protein is also referred to herein as a pathogenic prion specific peptide reagent. It should be understood that the predominant interaction does not necessarily require interaction between specific amino acid residues and / or motifs of each peptide. For example, in some embodiments, the peptide reagents described herein interact predominantly with pathogenic isoforms, but may nevertheless be able to bind non-pathogenic isoforms at a weak but detectable level (for example, 10% or less pronounced binding compared to the polypeptide of interest ) Generally, weak binding or background binding is readily distinguishable from preferential binding to the compound or polypeptide of interest, for example, by the use of suitable controls. In general, the peptides of the invention bind pathogenic prions in the presence of a 10 ^6- fold excess of non-pathogenic forms.

Термин «сродство» относится к силе связывания и может выражаться количественно в виде константы диссоциации (K_d). Предпочтительно, пептид (или пептидный реагент), который взаимодействует преимущественно с патогенной изоформой, предпочтительно, взаимодействует с патогенной изоформой, по меньшей мере, с двукратно более высоким сродством, более предпочтительно, по меньшей мере, с 10-кратно более высоким сродством, и даже более предпочтительно, по меньшей мере, с 100-кратно более высоким сродством, чем он взаимодействует с непатогенной изоформой. Сродство связывания (т.е., K_d) может определяться стандартными способами. The term "affinity" refers to the strength of binding and can be expressed quantitatively in the form of a dissociation constant (K _d ). Preferably, a peptide (or peptide reagent) that interacts predominantly with the pathogenic isoform, preferably interacts with the pathogenic isoform, at least twice as much affinity, more preferably at least 10 times more affinity, and even more preferably with at least 100-fold higher affinity than it interacts with a non-pathogenic isoform. The binding affinity (i.e., K _d ) can be determined by standard methods.

Способы определения «сходства» или «процентной идентичности» аминокислотной последовательности хорошо известны в данной области. В общем, «сходство» означает сравнение аминокислот одного или нескольких полипептидов в соответствующем месте, где аминокислоты идентичны или обладают сходными химическими и/или физическими свойствами, такими как заряд или гидрофобность. Между сравниваемыми полипептидными последовательностями может, таким образом, определяться так называемая «процентная идентичность». Способы определения идентичности последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотной последовательности хорошо известны в данной области и включают в себя определение нуклеотидной последовательности мРНК для данного гена (обычно через кДНК-интермедиат) и определение кодируемой ей аминокислотной последовательности, и ее сравнение со второй аминокислотной последовательностью. В общем, «идентичность» относится к точному соответствию нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, соответственно.Methods for determining "similarity" or "percent identity" of an amino acid sequence are well known in the art. In general, “similarity” means a comparison of the amino acids of one or more polypeptides in an appropriate place where the amino acids are identical or have similar chemical and / or physical properties, such as charge or hydrophobicity. Between the compared polypeptide sequences, a so-called “percent identity” can thus be determined. Methods for determining the identity of a nucleic acid sequence and an amino acid sequence are well known in the art and include determining the mRNA nucleotide sequence for a given gene (usually via an cDNA intermediate) and determining the amino acid sequence encoded by it and comparing it with the second amino acid sequence. In general, “identity” refers to the exact correspondence of a nucleotide to a nucleotide or amino acid to an amino acid of two polynucleotide or polypeptide sequences, respectively.

Два или большее количество аминокислотных или пoлинуклеотидных последовательностей могут сравниваться путем определения их «процентной идентичности». Процентная идентичность может определяться прямым сравнением информации о последовательности двух молекул (последовательностью сравнения и последовательностью с неизвестной % идентичностью в отношении последовательности сравнения) путем выравнивания последовательностей, подсчета точного количества совпадений между двумя выровненными последовательностями, разделения этого количества на длину последовательности сравнения, и умножения результата на 100. Легко доступные компьютерные программы могут использоваться для упрощения анализа, например, ALIGN, Dayhoff, M. O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3: 353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, которая адаптирует алгоритм местной гомологии по Smith and Waterman, Advances in Appl. Math. 2: 482-489, 1981, для пептидного анализа. Программы для определения идентичности нуклеотидной последовательности доступны в Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (доступны от Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин), например программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также основываются на алгоритме Smith and Waterman. Данные программы могут легко использоваться с программами по умолчанию, рекомендуемыми производителем и описанными в Wisconsin Sequence Analysis Package, указанном выше. Например, процентная идентичность конкретной нуклеотидной последовательности в отношении последовательности сравнения может определяться с использованием алгоритма гомологии Smith and Waterman с таблицей коэффициентов по умолчанию и штрафом за вставку, равным шести нуклеотидным положениям.Two or more amino acid or polynucleotide sequences can be compared by determining their “percent identity”. Percent identity can be determined by directly comparing the sequence information of two molecules (the comparison sequence and the sequence with unknown% identity with respect to the comparison sequence) by aligning the sequences, calculating the exact number of matches between the two aligned sequences, dividing that number by the length of the comparison sequence, and multiplying the result by 100. Easily accessible computer programs can be used to simplify ana Lisa, e.g., ALIGN, Dayhoff, M. O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, which adapts the local homology algorithm according to Smith and Waterman, Advances in Appl. Math. 2: 482-489, 1981, for peptide analysis. Nucleotide sequence identification programs are available in the Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (available from Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), such as BESTFIT, FASTA, and GAP, which are also based on the Smith and Waterman algorithm. These programs can be easily used with the default programs recommended by the manufacturer and described in the Wisconsin Sequence Analysis Package above. For example, the percent identity of a particular nucleotide sequence with respect to a comparison sequence can be determined using the Smith and Waterman homology algorithm with a default coefficient table and insertion penalty of six nucleotide positions.

Другой способ определения процентной идентичности в контексте настоящего изобретения представляет собой применение пакета программ MPSRCH^TM, правами на который обладает University of Edinburgh, и который разработан John F. Collins и Shane S. Sturrok и доступен из многих источников, например из Интернета. Из данного набора пакетов может использоваться алгоритм Smith-Waterman, где используются параметры по умолчанию для таблицы коэффициентов (например, штраф за открытие вставки 12, штраф за продление вставки один, и вставка, равная шести). Из генерированных данных значение «Match» отражает «идентичность последовательности». Другие подходящие программы для расчета процентной идентичности или сходства между последовательностями, в общем, известны в данной области, например, другая программа выравнивания представляет собой BLAST, используемый с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP могут использоваться с использованием параметров по умолчанию: генетический код = стандарт; фильтр = отсутствует; цепи = обе; уровень отсечения = 60; ожидание = 10; матрица = BLOSUM62; описания = 50 последовательностей; сортировка по = HIGH SCORE; базы данных = невырожденные, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Легко доступны подробности по данным программам. Another way of determining percent identity in the context of the present invention is to use the MPSRCH ^™ software package, which is owned by the University of Edinburgh, and which was developed by John F. Collins and Shane S. Sturrok and is available from many sources, for example from the Internet. From this set of packages, the Smith-Waterman algorithm can be used, where the default parameters for the coefficient table are used (for example, the penalty for opening insert 12, the penalty for extending the insert is one, and the insert is six). From the generated data, the “Match” value reflects “sequence identity”. Other suitable programs for calculating percent identity or similarity between sequences are generally known in the art, for example, another alignment program is BLAST used with default parameters. For example, BLASTN and BLASTP can be used using the default parameters: genetic code = standard; filter = none; chains = both; clipping level = 60; expectation = 10; matrix = BLOSUM62; descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; databases = non-degenerate, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Details on these programs are readily available.

Используемый здесь термин «иммуногенная композиция» относится к любым композициям (например, композициям пептидов, антител и/или полинуклеотидов), где введение данной композиции индивидууму приводит к развитию у индивидуума гуморального и/или клеточного иммунного ответа. Иммуногенная композиция может вводиться непосредственно индивидууму-реципиенту, например, путем инъекции, ингаляции, пероральным, интраназальным или любым другим парентеральным путем введения или путем введения через слизистые (например, интраректально или интравагинально).As used herein, the term “immunogenic composition” refers to any composition (eg, compositions of peptides, antibodies and / or polynucleotides), where administration of the composition to an individual leads to the development of an individual's humoral and / or cellular immune response. The immunogenic composition may be administered directly to the recipient individual, for example, by injection, inhalation, by oral, intranasal or any other parenteral route of administration, or by administration through the mucous membranes (for example, intrectally or intravaginally).

Под «эпитопом» подразумевается участок на антигене, на которые отвечают специфичные В-клетки и/или Т-клетки, и это дает возможность молекуле, содержащей такой эпитоп, вызывать иммунологическую реакцию или взаимодействовать с антителами, присутствующими в биологическом образце. Данный термин также используется взаимозаменяемо с «антигенной детерминанто» или «участком антигенной детерминанты». Эпитоп может включать в себя 3 или большее количество аминокислот в пространственной конформации, уникальной для эпитопа. В общем, эпитоп состоит, по меньшей мере, из 5 таких аминокислот и, чаще всего, состоит, по меньшей мере, 8-10 таких аминокислот. Способы определения пространственной конформации аминокислот известны в данной области и включают в себя, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитные резонанс. Более того, идентификации эпитопов в данном белке легко выполняется с использованием способов, хорошо известных в данной области, например, с применением исследований гидрофобности и путем сайт-специфической серологии. См., также, Geysen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1984) 81: 3998-4002 (общий способ быстрого синтеза пептидов для определения локализации иммуногенных эпитопов к полученному антигену); патент США № 4708871 (процедуры идентификации и химического синтеза эпитопов антигенов); и Geysen et al., Molecular Immunology (1986) 23: 709-715 (способ идентификации пептидов с высоким сродством в отношении данного антитела). Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп, могут идентифицироваться в простом иммунном анализе, показывающем способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.By “epitope” is meant a region on an antigen to which specific B cells and / or T cells respond, and this enables a molecule containing such an epitope to elicit an immunological response or to interact with antibodies present in a biological sample. The term is also used interchangeably with “antigenic determinant” or “site of antigenic determinant”. An epitope may include 3 or more amino acids in a spatial conformation unique to the epitope. In general, an epitope consists of at least 5 such amino acids and most often consists of at least 8-10 such amino acids. Methods for determining the spatial conformation of amino acids are known in the art and include, for example, X-ray crystallography and 2-dimensional nuclear magnetic resonance. Moreover, the identification of epitopes in a given protein is easily accomplished using methods well known in the art, for example, using hydrophobicity studies and site-specific serology. See also Geysen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1984) 81: 3998-4002 (general method for the rapid synthesis of peptides to determine the localization of immunogenic epitopes to the resulting antigen); US patent No. 4708871 (identification and chemical synthesis of epitopes of antigens); and Geysen et al., Molecular Immunology (1986) 23: 709-715 (a method for identifying peptides with high affinity for a given antibody). Antibodies that recognize the same epitope can be identified in a simple immunoassay showing the ability of one antibody to block the binding of another antibody to the target antigen.

Используемый здесь термин «иммунологический ответ» или «иммунный ответ» представляет собой развитие у индивидуума гуморального и/или клеточного иммунного ответа на пептид, описанный выше, где данный полипептид присутствует в вакцинной композиции. Данные антитела также могут нейтрализовать инфекционность и/или опосредовать действие системы антитело-комплемент или антителозависимую клеточную цитотоксичность для предоставления защиты иммунизированного хозяина. Иммунологическая реактивность может определяться в стандартных иммунных анализах, таких как конкурентный анализ, хорошо известный в данной области.As used herein, the term “immunological response” or “immune response” is the development of an individual's humoral and / or cellular immune response to the peptide described above, where the polypeptide is present in the vaccine composition. These antibodies can also neutralize infectivity and / or mediate the effect of the antibody complement system or antibody-dependent cellular cytotoxicity to provide protection for the immunized host. Immunological reactivity can be determined in standard immunoassays, such as competitive assays, well known in the art.

«Перенос гена» или «доставка гена» относится к способам или системам надежного встраивания интересующей ДНК в клетку хозяина. Такие способы могут приводить к временной экспрессии неинтегрированной перенесенной ДНК, экстрахромосомной репликации и экспрессии перенесенных репликонов (например, эписом), или интеграции перенесенного генетического материала в геномную ДНК клеток хозяина. Экспрессирующие векторы для доставки генов включают в себя в качестве неограничивающих примеров векторов, происходящих из альфавирусов, поксвирусов, и вирусов коровьей оспы. При использовании для иммунизации такие экспрессирующие векторы для генной доставки могут называться вакцинами или вакцинными векторами. "Gene transfer" or "gene delivery" refers to methods or systems for the reliable incorporation of DNA of interest into a host cell. Such methods may result in the transient expression of non-integrated transferred DNA, extrachromosomal replication and expression of transferred replicons (eg, episomus), or the integration of transferred genetic material into the genomic DNA of the host cells. Expression vectors for gene delivery include, but are not limited to vectors derived from alphaviruses, poxviruses, and vaccinia viruses. When used for immunization, such expression vectors for gene delivery may be referred to as vaccines or vaccine vectors.

Термин «образец» включает в себя биологические и небиологические образцы. Биологические образцы представляют собой те, которые получены или происходят из живых или живущих когда-либо организмов. Небиологические образцы не происходят из живых или живущих когда-либо организмов. Биологические образцы включают в себя в качестве неограничивающих примеров образцы, происходящие из животных (живых или мертвых), например из органов (например, головного мозга, печени, почки, и т.д.), цельной крови, фракций крови, плазмы, цереброспинальной жидкости (CSF), мочи, слез, ткани, органов, биопсий. Примеры небиологических образцов включают в себя фармацевтические средства, продукты питания, косметику и тому подобное.The term “sample” includes biological and non-biological samples. Biological samples are those that are derived or come from living or ever living organisms. Non-biological samples do not come from living or ever living organisms. Biological samples include, but are not limited to, samples derived from animals (living or dead), such as organs (e.g., brain, liver, kidney, etc.), whole blood, blood fractions, plasma, cerebrospinal fluid (CSF), urine, tears, tissue, organs, biopsies. Examples of non-biological samples include pharmaceuticals, food products, cosmetics, and the like.

Термины «метка» и «выявляемая метка» относятся к молекуле, способной выявляться, включая в качестве неограничивающих примеров радиоактивные изотопы, флуорофоры, люминофоры, хемилюминофоры, ферменты, субстраты ферментов, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, хромофоры, красители, ионы металлов, золи металлов, лиганды (например, биотин или гаптены) и тому подобное. Термин «флуорофор» относится к веществу или к его части, которое способно излучать флуоресценцию в выявляемом интервале. Конкретные примеры меток, которые могут использоваться по изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров флуоресценин, родамин, дансил, умбеллиферон, Техасский красный, люминол, сложные эфиры акрадимума, NADPH, бета-галактозидазу, пероксидазу хрена, глюкозооксидазу, целочную фосфатазу и уреазу. Метка также может представлять собой эпитопную метку (например, метку His-His), антитело или амплифицируемый или выявляемый иначе олигонуклеотид.The terms “label” and “detectable label” refer to a molecule capable of being detected, including, but not limited to, radioactive isotopes, fluorophores, phosphors, chemiluminophores, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, chromophores, dyes, metal ions, sols ligands (e.g., biotin or haptens) and the like. The term “fluorophore” refers to a substance or part of it that is capable of emitting fluorescence in a detectable range. Specific examples of labels that can be used according to the invention include, but are not limited to, fluorescenins, rhodamine, dansil, umbelliferone, Texas red, luminol, acradimum esters, NADPH, beta-galactosidase, horseradish peroxidase, glucose oxidase, whole phosphatase and urease. The label may also be an epitope label (e.g., His-His label), an antibody, or an oligonucleotide amplified or otherwise detected.

II. Общий обзорII. general review

Здесь описаны композиции, включающие в себя пептидный реагент (и/или полинуклеотиды, кодирующие эти пептидные реагенты), в которых пептидный реагент способен отличать патогенные и непатогенные изоформы прионных белков, например, за счет преимущественного взаимодействия с одной формой и отсутствия взаимодействия с другой. Также предоставлены антитела, генерируемые с использованием данных пептидных реагентов, а также композиции и способы получения и применения данных пептидных реагентов и/или антител (например, выделения и/или обнаружения патогенного прионного белка). Compositions are described herein including a peptide reagent (and / or polynucleotides encoding these peptide reagents) in which the peptide reagent is able to distinguish between pathogenic and non-pathogenic isoforms of prion proteins, for example, due to the predominant interaction with one form and the absence of interaction with another. Also provided are antibodies generated using these peptide reagents, as well as compositions and methods for preparing and using these peptide reagents and / or antibodies (e.g., isolating and / or detecting pathogenic prion protein).

Изобретение частично относится к открытию авторов изобретения, состоящему в том, что относительно малые фрагменты прионного белка могут преимущественно связываться с патогенной формой приона. Для проявления преимущественного взаимодействия с патогенной изоформой приона данные фрагменты не обязательно должны быть частями более крупной белковой структуры или другого типа каркасной молекулы. Хотя это и не связано с какой-либо конкретной теорией, оказывается, что пептидные фрагменты спонтанно принимают конформацию, которая обеспечивает связывание патогенной изоформы приона, но не непатогенной изоформы приона, возможно, путем имитации конформации, которая присутствует в непатогенной изоформе. Данный общий принцип, указывающий на то, что некоторые фрагменты белка конформационного заболевания взаимодействуют преимущественно с патогенной формой данного белка конформационного заболевания, продемонстрированный здесь для прионов, может легко применяться в отношении других белков конформационного заболевания для продукции пептидных реагентов, которые взаимодействуют преимущественно с патогенными формами. Обычному специалисту в данной области понятно, что данные фрагменты предоставляют исходную точку (в плане размера или характеристик последовательности, например), что в данных фрагментах могут быть сделаны модификации для продукции пептидных реагентов с более необходимыми свойствами (например, с более высоким сродством, большей стабильностью, большей растворимостью, меньшей чувствительностью к протеазам, большей специфичностью, большей простотой в плане синтеза, и т.д.). The invention partially relates to the discovery of the inventors, consisting in the fact that relatively small fragments of prion protein can mainly bind to the pathogenic form of prion. In order to exhibit a preferential interaction with the pathogenic prion isoform, these fragments do not have to be parts of a larger protein structure or other type of frame molecule. Although not related to any particular theory, it appears that the peptide fragments spontaneously adopt a conformation that provides for the binding of the pathogenic prion isoform, but not the non-pathogenic prion isoform, possibly by simulating the conformation that is present in the non-pathogenic isoform. This general principle, indicating that some fragments of a conformational disease protein interact predominantly with the pathogenic form of this conformational disease protein, demonstrated here for prions, can easily be applied to other conformational disease proteins to produce peptide reagents that interact mainly with pathogenic forms. It will be understood by a person of ordinary skill in the art that these fragments provide a starting point (in terms of size or sequence characteristics, for example), that modifications can be made in these fragments to produce peptide reagents with more desirable properties (for example, with higher affinity, greater stability , greater solubility, less sensitivity to proteases, more specificity, more simplicity in terms of synthesis, etc.).

В общем описанные здесь пептидные реагенты способны преимущественно взаимодействовать с патогенными формами прионных белков. Таким образом, данные пептидные реагенты обеспечивают более простое обнаружение патогенных форм белков и, следовательно, диагностику связанных с прионами заболеваний практически в любом образце, биологическом или небиологическом, включающем живой или мертвый головной мозг, спинной мозг, или другую ткань нервной системы, а также кровь. In general, the peptide reagents described herein are capable of preferentially interacting with pathogenic forms of prion proteins. Thus, these peptide reagents provide a simpler detection of pathogenic forms of proteins and, therefore, the diagnosis of prion-related diseases in almost any sample, biological or non-biological, including a living or dead brain, spinal cord, or other tissue of the nervous system, as well as blood .

Кроме того, описанные здесь пептидные реагенты могут использоваться для получения антител, которые могут использоваться в диагностических или терапевтических композициях или способах. В частности, когда пептидный реагент и/или антитело взаимодействует преимущественно с патогенным белком, оно может использоваться преимущественно для обнаружения патогенных изоформ, например, за счет упорядочения, агрегации или иной индукции относящихся к заболеванию форм белков в состоянии, которое затем может выявляться. Описанные здесь пептидные реагенты могут использоваться в различных диагностических анализах, включая обнаружение патогенных форм в содержащих кровь образцах. Антитела и/или пептидные реагенты (или один или несколько из их составляющих частей) могут метиться или маркироваться для облегчения обнаружения и/или усиления взаимодействия с прионными белками.In addition, the peptide reagents described herein can be used to produce antibodies that can be used in diagnostic or therapeutic compositions or methods. In particular, when the peptide reagent and / or antibody interacts predominantly with a pathogenic protein, it can be used primarily to detect pathogenic isoforms, for example, by ordering, aggregating, or otherwise inducing disease-related forms of proteins in a state that can then be detected. The peptide reagents described herein can be used in various diagnostic assays, including the detection of pathogenic forms in blood-containing samples. Antibodies and / or peptide reagents (or one or more of their constituent parts) can be labeled or labeled to facilitate detection and / or enhance interaction with prion proteins.

Кроме того, любая система для амплификации сигнала может использоваться для дальнейшего облегчения обнаружения, включая в качестве неограничивающих примеров применение разветвленной ДНК для амплификации сигнала (см., например, патенты США 5681697; 5424413; 5451503; 54547025; и 6235483); применение способов амплификации мишени, таких как ПЦР, амплификация по вращающемуся кругу, Third Wave's invader (Arruda et al. 2002 Expert. Rev. Mol. Diagn. 2: 487; патенты США № 6090606, 5843669, 5985557, 6090543, 5846717), NASBA, TMA, и т.д. (патент США 6511809; EP0544212A1); и/или способы иммуно-ПЦР (см., например, патенты США № 5665539; Международные публикации WO 98/23962; WO 00/75663; и WO 01/31056). In addition, any signal amplification system can be used to further facilitate detection, including, but not limited to, the use of branched DNA to amplify a signal (see, for example, US Pat. Nos. 5,681,697; 5,424,413; 5,451,503; 5,445,725; and 6,235,483); the use of target amplification methods, such as PCR, rotating circle amplification, Third Wave's invader (Arruda et al. 2002 Expert. Rev. Mol. Diagn. 2: 487; US Pat. Nos. 6,090,606, 5,843,669, 5,958,557, 6,090,543, 5,846,717), NASBA , TMA, etc. (US Patent 6,511,809; EP0544212A1); and / or immuno-PCR methods (see, for example, US Pat. Nos. 5,665,539; International Publications WO 98/23962; WO 00/75663; and WO 01/31056).

Более того, могут использоваться описанные здесь пептидные реагенты и антитела, отдельно или в комбинации для лечения или профилактики заболевания.Moreover, the peptide reagents and antibodies described herein can be used, alone or in combination, to treat or prevent a disease.

III. A. Пептидные реагентыIII. A. Peptide Reagents

Здесь описаны пептиды, которые взаимодействуют с патогенными формами белка конформационного заболевания. Примерами белков конформационных заболеваний служат здесь прионные белки. Peptides that interact with pathogenic forms of conformational disease protein are described herein. Examples of conformational disease proteins are prion proteins.

Далее следует неограничивающий список заболеваний с ассоциированными белками, которые принимают две или большее количество различных конформаций.The following is a non-limiting list of diseases with associated proteins that take two or more different conformations.

ЗаболеваниеDisease Белок(-ки) конформационного заболеванияProtein (s) conformational disease Прионные заболевания (например, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, скрэпи, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота)Prion diseases (e.g. Creutzfeldt-Jakob disease, scrapie, bovine spongiform encephalopathy) PrP^Sc PrP ^Sc Болезнь АльцгеймераAlzheimer's disease APP, А*-пептид, *1-антихимотрипсин, tan, не относящийся к А* компонентAPP, A * peptide, * 1-antichymotrypsin, tan, non-A * component ALSALS SOD и нейрофиламентSOD and neurofilament Болезнь ПикаPeak Disease Тельца ПикаTaurus Peak Болезнь ПаркинсонаParkinson's disease Тельца ЛевиTaurus Levy Диабет I типаType I diabetes АмилинAmilin Множественная миелома - дискразия плазматических клетокMultiple myeloma - plasma cell dysrasia IgG, L-цепьIgG L chain Семейная амилоидозная полинейропатияFamilial amyloidosis polyneuropathy ТранстиретинTransthyretin Медуллярная карцинома щитовидной железыThyroid medullary carcinoma ПрокальцитонинProcalcitonin Хроническая почечная недостаточностьChronic renal failure бета-2-микроглобинbeta-2-microglobin Застойная сердечная недостаточностьCongestive Heart Failure атриальный натрийуретический факторatrial natriuretic factor Сенильный сердечный и системный амилоидозSenile cardiac and systemic amyloidosis ТранстиретинTransthyretin Хроническое воспалениеChronic inflammation Сывороточный амилоид АSerum Amyloid A АтеросклерозAtherosclerosis Апо-А1Apo-A1 Семейный амилоидозFamilial amyloidosis ГельзолинGelsolin

Далее, каждый из перечисленных выше белков конформационных заболеваний включают в себя некоторое количество вариантов или мутаций, происходящих в различных штаммах, которые относятся к настоящему изобретению. Функциональный анализ различных областей и последовательностей мышиного прионного белка даны ниже. См. также Priola (2001) Adv. Protein Chem. 57: 1-27. Области и остатки, соответствующие установленным ниже для мыши (Mo), хомяка (Ha), человека (Hu), птицы (A) и овцы (Sh), могут легко определяться для других видов стандартными процедурами и по приведенному здесь учению. Further, each of the conformational disease proteins listed above includes a number of variants or mutations occurring in different strains that relate to the present invention. Functional analysis of various regions and sequences of mouse prion protein are given below. See also Priola (2001) Adv. Protein Chem. 57: 1-27. Regions and residues corresponding to those set forth below for mouse (Mo), hamster (Ha), human (Hu), bird (A) and sheep (Sh) can be easily determined for other species by standard procedures and the teachings given here.

Аминокислота(-ы)Amino Acid (s) ФункцияFunction Mo1-28Mo1-28 Домен транслокации (отщепляемый)Translocation Domain (Split-Off) 22 22 Предполагаемый участок расщепленияEstimated cleavage site 23-2823-28 Основная область, потенциально взаимодействующая с участком связывания белка Х, поскольку ее делеция отменяет эффект ассоциированных с белком Х мутаций на С-конце прионных белковThe main region potentially interacting with the protein X binding site, since its deletion cancels the effect of protein X-associated mutations at the C-terminus of prion proteins 23-8823-88 Область окта-повтора (вставка 1-9 или делеция 2 усиливают заболевание). Координация меди гистидинами в каждом из повторов The octa repeat region (box 1-9 or deletion 2 exacerbates the disease). Copper coordination of histidines in each of the repeats 34-5234-52 Часть окта-повтора, которая, как показано, образует полипролиновую спираль и также образует гидроксипролин The portion of the octa repeat, which, as shown, forms a polyproline spiral and also forms hydroxyproline 86-9186-91 Участки расщепления PrP^Sc при расщеплении протеиназой КPrP ^Sc cleavage sites for proteinase K cleavage Hu82-146Hu82-146 7 кДа фрагмент, обнаруженный в поврежденном головном мозге пациентов с GSS; синтетический пептид, соответствующей данной области, образует ионные каналы7 kDa fragment found in the damaged brain of patients with GSS; the synthetic peptide corresponding to this region forms ion channels HuP102Hup102 Мутация P102L, ассоциированная с GSS, оказывается, не вызывает спонтанного преобразования прионного белка в устойчивую к протеазам конформацию. Пролин консервативен во всех оцениваемых видах.The P102L mutation associated with GSS does not appear to cause spontaneous conversion of the prion protein to a protease-resistant conformation. Proline is conservative in all evaluated species. HuP105Hup105 Мутация P105L, ассоциированная с GSS, оказывается, не вызывает спонтанного преобразования прионного белка в устойчивую к протеазам конформацию. Пролин консервативен во всех оцениваемых видах.The P105L mutation associated with GSS does not appear to cause spontaneous conversion of the prion protein to a protease-resistant conformation. Proline is conservative in all evaluated species. Hu102-105Hu102-105 PXXP-мотив; возможно, полипролиновая спираль II типаPXXP motive; possibly a type II polyproline spiral Mo_106Mo_106 Ассоциирован с устойчивостью к заболеваниюAssociated with disease resistance Hu106-126Hu106-126 Мутантные формы синтетических пептидов, как считается, образуют модулирующие медь ионные каналы, G114 и G119, как показано, снижают фибриллогенное поведение пептида, когда мутируют с получением А.Mutant forms of synthetic peptides are believed to form copper modulating ion channels, G114 and G119, as shown, reduce the fibrillogenic behavior of the peptide when mutated to A. Mo_111Mo_111 Ассоциирован с устойчивостью к заболеваниюAssociated with disease resistance Sh104-113Sh104-113 Пептид, совместно кристаллизованный с D13 FabPeptide co-crystallized with D13 Fab Ha109-112Ha109-112 Петля, специфично распознаваемая пептидом D13, что показано кристаллической структурой (М109 и М112 встроены в связывающие карманы внутри Fab). A loop specifically recognized by the D13 peptide as indicated by the crystal structure (M109 and M112 are embedded in the binding pockets inside the Fab). Hu113-120Hu113-120 Палиндромная последовательность, полностью консервативнаяPalindromic sequence, completely conservative А117VA117V Патогенная мутация в палиндроме; повышает амилоидогенные свойства пептидов, содержащих данную областьPathogenic mutation in the palindrome; increases amyloidogenic properties of peptides containing this region Ha129-131Ha129-131 Бета-лист в PrP^C Beta List in PrP ^C На129/Go132At129 / Go132 Полиморфизм, ассоциированный с чувствительностью/устойчивостью к прионному заболеваниюPolymorphism associated with sensitivity / resistance to prion disease На136 At 136 Аланиновый полиморфизм, ассоциированный с повышением окаймленных ямок у овец Alanine polymorphism associated with increased skirted fossa in sheep Мо138/Go142Mo138 / Go142 Полиморфизм, ассоциированный с чувствительностью/устойчивостью к прионному заболеваниюPolymorphism associated with sensitivity / resistance to prion disease Mo141-176Mo141-176 Область, делеция которой (вместе с 23-88) из мышиного миниприона PrP106 не имела эффекта; это указывает на незначительную функцию данной областиA region whose deletion (together with 23-88) from the mouse miniprion PrP106 had no effect; this indicates an insignificant function of this area Ha144-154Ha144-154 Спираль АSpiral a Ha155Ha155 Полиморфизм, ассоциированный с чувствительностью/устойчивостью против прионного заболеванияPolymorphism associated with sensitivity / resistance to prion disease Ha160-163Ha160-163 Лист 2Sheet 2 MoV165MoV165 Видовой барьер. Когда у трансгенных по человеческому гену мышей данные остатки мутируют обратно в мышиную последовательность, наблюдается намного более короткий инкубационный периодSpecies barrier. When these residues mutate back into the mouse sequence in transgenic mice on the human gene, a much shorter incubation period is observed MoQ167MoQ167 Видовой барьер. Когда у трансгенных по человеческому гену мышей данные остатки мутируют обратно в мышиную последовательность, наблюдается намного более короткий инкубационный периодSpecies barrier. When these residues mutate back into the mouse sequence in transgenic mice on the human gene, a much shorter incubation period is observed MoQ168MoQ168 Предполагаемый участок связывания белка Х; при мутации он защищает от прионного заболеванияEstimated protein X binding site; when mutating, it protects against prion disease Sh171Sh171 Полиморфизм, ассоциированный с чувствительностью/устойчивостью против прионного заболеванияPolymorphism associated with sensitivity / resistance to prion disease MoQ172Moq172 Предполагаемый участок связывания белка Х; при мутации он защищает от прионного заболеванияEstimated protein X binding site; when mutating, it protects against prion disease 176176 Связанный дисульфидной связью цистеинDisulfide-linked cysteine Ha173-194Ha173-194 Спираль ВSpiral B 178178 Ассоциированная с заболеванием мутацияDisease Associated Mutation 180180 Ассоциированная с заболеванием мутация, участок гликозилированияDisease-associated mutation, glycosylation site 196196 Участок гликозилированияGlycosylation site 198198 Ассоциированная с заболеванием мутацияDisease Associated Mutation Hu200-228Hu200-228 Спираль СSpiral C HuE200Hue200 Мутация на К ассоциирована с семейным CJD у ливийских евреев (полиморфизм М129 в комбинации также повышает шансы на заболеваемость)Mutation on K is associated with familial CJD in Libyan Jews (M129 polymorphism in combination also increases the chances of incidence) 208208 Ассоциированная с заболеванием мутацияDisease Associated Mutation 210210 Ассоциированная с заболеванием мутацияDisease Associated Mutation MoT215MoT215 Предполагаемый участок связывания белка Х; при мутации он защищает от прионного заболевания Estimated protein X binding site; when mutating, it protects against prion disease 217217 Ассоциированная с заболеванием мутацияDisease Associated Mutation MoQ219Moq219 Предполагаемый участок связывания белка Х; при мутации он защищает от прионного заболеванияEstimated protein X binding site; when mutating, it protects against prion disease 232232 Ассоциированная с заболеванием мутацияDisease Associated Mutation 232232 GPI-якорьGPI Anchor ~233~ 233 Предполагаемый участок расщепления GPI-якоряEstimated GPI Anchor Cleavage Site 233-254233-254 Часть, удаляемая из зрелого белкаPart removed from Mature Protein

Следует также заметить, что прионные белки (и другие белки конформационного заболевания) имеют две разные 3-мерные конформации при одинаковой аминокислотной последовательности. Одна из конформаций ассоциирована с характеристиками заболевания и в общем нерастворима, в то время как другая конформация не ассоциирована с характеристиками заболевания и растворима. См., например, Wille, et al., "Structural Studies of the Scrapie Prion Protein by Electron Crystallography", Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 99 (6): 3563-3568 (2002). Хотя настоящее изобретение и проиллюстрированно примером прионных белков, оно не ограничено перечисленными заболеваниями, белками и штаммами. It should also be noted that prion proteins (and other proteins of conformational disease) have two different 3-dimensional conformations with the same amino acid sequence. One conformation is associated with disease characteristics and is generally insoluble, while the other conformation is not associated with disease characteristics and is soluble. See, for example, Wille, et al., "Structural Studies of the Scrapie Prion Protein by Electron Crystallography", Proc.Natl. Acad. Sci. USA 99 (6): 3563-3568 (2002). Although the present invention is illustrated by the example of prion proteins, it is not limited to the listed diseases, proteins and strains.

Таким образом, в некоторых аспектах описанные здесь пептидные реагенты включают в себя аминокислотную последовательность происходящую из встречающегося в природе белка, например белка конформационного заболевания (например, прионного белка) или белка, который содержит мотивы или последовательности, которые проявляют гомологию в отношении прионных белков. В частности, пептидные реагенты по изобретению обычно происходят из встречающегося в природе прионного белка. Пептидные реагенты предпочтительно получают из аминокислотных последовательностей из некоторых областей прионных белков. Примерами данных предпочтительных областей в плане мышиной прионной последовательности (SEQ ID NO: 2) являются аминокислотные остатки 23-43 и 85-156, и входящие в их состав области. Изобретение не ограничено пептидными реагентами, полученными из мышиных последовательностей, но относится к пептидным реагентам, полученным сходным образом, как описано, из прионных последовательностей любых видов, включая человека, крупный рогатый скот, овец, оленей, лосей и хомяка. Когда описанные здесь пептидные реагенты получены из прионных белков, они могут включать в себя полипролиновый спиральный мотив II типа. Данный мотив обычно содержит общую последовательность PxxP (например, остатки 102-105 of SEQ ID NO: 1), хотя другие последовательности, в частности аланиновые тетрапептиды, также, как предполагается, образуют полипролиновые спирали II типа (см., например, Nguyen et al. Chem Biol. 2000 7: 463; Nguyen et al. Science 1998 282: 2088; Schweitzer-Stenner et al. J. Am. Chem Soc. 2004 126: 2768). В последовательности PxxP «x» может представлять собой любую аминокислоту и «P» представляет собой пролин во встречающейся в природе последовательности, но может находиться во встречающейся в природе последовательности, но может меняться на заместитель пролина в пептидных реагентах по изобретению. Такие заместители пролина включают в себя N-замещенные глицины, обычно называемые пептоидами. Таким образом, в пептидных реагентах по изобретению, которые включают в себя полипролиновую спираль типа II, основанные на последовательности PxxP, «P» представляет собой пролин или N-замещенные глициновые остатки, и «x» представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты. Здесь описаны особенно предпочтительные N-замещенные глицины.Thus, in some aspects, the peptide reagents described herein include an amino acid sequence derived from a naturally occurring protein, such as a conformational disease protein (such as a prion protein) or a protein that contains motifs or sequences that exhibit homology to prion proteins. In particular, the peptide reagents of the invention typically come from a naturally occurring prion protein. Peptide reagents are preferably derived from amino acid sequences from certain regions of prion proteins. Examples of these preferred regions in terms of the mouse prion sequence (SEQ ID NO: 2) are amino acid residues 23-43 and 85-156, and their constituent regions. The invention is not limited to peptide reagents derived from murine sequences, but relates to peptide reagents obtained in a similar manner, as described, from prion sequences of any species, including humans, cattle, sheep, deer, moose and hamster. When the peptide reagents described herein are derived from prion proteins, they may include a type II polyproline helical motif. This motif usually contains the general PxxP sequence (for example, residues 102-105 of SEQ ID NO: 1), although other sequences, in particular alanine tetrapeptides, are also supposed to form type II polyproline helices (see, for example, Nguyen et al Chem Biol. 2000 7: 463; Nguyen et al. Science 1998 282: 2088; Schweitzer-Stenner et al. J. Am. Chem Soc. 2004 126: 2768). In the PxxP sequence, “x” can be any amino acid and “P” is proline in a naturally occurring sequence, but can be in a naturally occurring sequence, but can be replaced by a proline substituent in the peptide reagents of the invention. Such proline substituents include N-substituted glycines, commonly called peptoids. Thus, in the peptide reagents of the invention, which include a type II polyproline helix based on the PxxP sequence, “P” is proline or N-substituted glycine residues, and “x” is an amino acid or amino acid analogue. Particularly preferred N-substituted glycines are described herein.

Кроме того, известна полинуклеотидная и аминокислотная последовательность прионных белков, продуцируемых многими различными видами, включая человека, мышь, овец и крупный рогатый скот. Варианты данных последовательностей также существуют в каждом виде. Таким образом, пептидные реагенты, используемые по изобретению, могут включать в себя фрагменты или производные аминокислотных последовательностей любых видов или вариантов. Например, в некоторых вариантах осуществления описанные здесь пептидные реагенты происходят из любых последовательностей, приведенных на фиг.2 (SEQ ID NO: 3-11). Последовательности пептидных реагентов, которые специфично описаны здесь, в общем, основаны на мышиной прионной последовательности, однако специалист в данной области может легко заместить ее соответствующими последовательностями из другого вида, если они подходят. Например, если требуются человеческие диагностические или терапевтические средства, может быть легко сделана замена мышиных последовательностей на соответствующие человеческие последовательности. В конкретном примере, в пептидных реагентах, происходящих из области примерно от остатка 85 до остатка 112 (например, SEQ ID NO: 35, 36, 37, 40), лейцин в положении, соответствующем остатку 109, может замещаться метионином, валин в положении соответствующем остатку 112, может замещаться метионином, и аспарагин в положении, соответствующем остатку 97, может замещаться серином. Сходным образом, если требуется средство для диагностики крупного рогатого скота, могут проводиться подходящие замены в описанных пептидных последовательностях, чтобы они отражали последовательность приона крупного рогатого скота. Таким образом, продолжая с указанным выше примером для пептидных реагентов, происходящих из области примерно от остатка 85 до остатка 112, лейцин в положении, соответствующем остатку 109, может замещаться метионином, и аспарагин в положении соответствующем остатку 97, может замещаться глицином. Также могут использоваться производные прионных белков, включая аминокислотные замены, делеции, добавления и другие мутации данных последовательностей. Предпочтительно, любые аминокислотные замены, добавления и делеции, по сравнению с последовательностью прионного белка, не влияют на способность пептидного реагента взаимодействовать с патогенной формой.In addition, the polynucleotide and amino acid sequence of prion proteins produced by many different species is known, including humans, mice, sheep and cattle. Variants of these sequences also exist in each form. Thus, the peptide reagents used according to the invention may include fragments or derivatives of amino acid sequences of any kinds or variants. For example, in some embodiments, the peptide reagents described herein are derived from any of the sequences shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 3-11). Peptide reagent sequences that are specifically described herein are generally based on a murine prion sequence, however, one of skill in the art can easily replace it with corresponding sequences from another species, if appropriate. For example, if human diagnostic or therapeutic agents are required, the replacement of murine sequences with appropriate human sequences can be easily done. In a specific example, in peptide reagents originating from a region from about residue 85 to residue 112 (e.g., SEQ ID NO: 35, 36, 37, 40), the leucine at the position corresponding to residue 109 can be replaced with methionine, valine at the position corresponding residue 112 may be substituted with methionine, and asparagine at the position corresponding to residue 97 may be substituted with serine. Similarly, if a cattle diagnostic agent is required, suitable substitutions in the described peptide sequences may be made to reflect the sequence of the cattle prion. Thus, continuing with the above example for peptide reagents originating from a region of about residue 85 to residue 112, the leucine at the position corresponding to residue 109 can be replaced with methionine, and asparagine at the position corresponding to residue 97 can be replaced with glycine. Derivatives of prion proteins may also be used, including amino acid substitutions, deletions, additions, and other mutations of these sequences. Preferably, any amino acid substitutions, additions and deletions, compared with the prion protein sequence, do not affect the ability of the peptide reagent to interact with the pathogenic form.

Следует понимать, что вне зависимости от того, какой источник использован для описанных здесь пептидных реагентов, данные пептидные реагенты не обязательно проявят идентичность последовательности в отношении известных прионных белков. Таким образом, описанные здесь пептидные реагенты могут включать в себя одну или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций в отношении встречающегося в природе прионного белка или описанных здесь последовательностей до тех пор, пока они сохраняют способность преимущественно взаимодействовать с патогенными формами белков конформационных заболеваний. В некоторых вариантах осуществления предпочтительны консервативные аминокислотные замены. Консервативными аминокислотными заменами являются те, которые имеют место в пределах семейства аминокислот, которые относятся к их боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты в основном подразделяются на три семейства: (1) кислые = аспартат, глутамат; (2) основные = лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные = глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют совместно как ароматические аминокислоты. Например, можно резонно предположить, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонин на серин, или сходная консервативная замена аминокислоты структурно связанной аминокислотой не будет иметь большого влияния на биологическую активность.It should be understood that no matter what source is used for the peptide reagents described herein, these peptide reagents do not necessarily show sequence identity with respect to known prion proteins. Thus, the peptide reagents described herein may include one or more amino acid substitutions, additions, or deletions for the naturally occurring prion protein or sequences described herein as long as they retain the ability to primarily interact with pathogenic forms of conformational disease proteins. In some embodiments, conservative amino acid substitutions are preferred. Conservative amino acid substitutions are those that occur within the family of amino acids that belong to their side chains. Genetically encoded amino acids are mainly divided into three families: (1) acidic = aspartate, glutamate; (2) basic = lysine, arginine, histidine; (3) non-polar = alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; and (4) uncharged polar = glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine. Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are sometimes classified together as aromatic amino acids. For example, it can reasonably be assumed that a separate replacement of leucine with isoleucine or valine, aspartate with glutamate, threonine with serine, or a similar conservative replacement of an amino acid with a structurally linked amino acid will not have a large effect on biological activity.

Также понятно, что любая комбинация природных аминокислот и неприродных аналогов аминокислот может использоваться для получения описанных здесь пептидных реагентов. Обычно рассматриваемые аналоги аминокислот, не кодируемые генами, включают в себя в качестве неограничивающих примеров орнитин (Orn); аминоизомасляную кислоту (Aib); бензотиофенилаланин (BtPhe); альбиццин (Abz); трет-бутилглицин (Tle); фенилглицин (PhG); циклогексилаланин (Cha); норлейцин (Nle); 2-нафтилаланин (2-Nal); 1-нафтилаланин (1-Nal); 2-тиенилаланин (2-Thi); 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту (Tic); N-метилизолейцин (N-MeIle); гомоаргинин (Har); Nα-метиларгинин (N-MeArg); фосфотирозин (pTyr или pY); пипеколиновую кислоту (Pip); 4-хлорфенилаланин (4-ClPhe); 4-фторфенилаланин (4-FPhe); 1- аминоциклопропанкарбоновую кислоту (1-NCPC); и саркозин (Sar). Любая из используемых в пептидных реагентах по настоящему изобретению аминокислот может быть D- или, чаще, L-изомером.It is also understood that any combination of natural amino acids and non-natural analogs of amino acids can be used to produce the peptide reagents described herein. Commonly considered non-gene encoded amino acid analogues include, but are not limited to, Ornithine (Orn); aminoisobutyric acid (Aib); benzothiophenylalanine (BtPhe); Albizzin (Abz); tert-butyl glycine (Tle); phenylglycine (PhG); cyclohexylalanine (Cha); norleucine (Nle); 2-naphthylalanine (2-Nal); 1-naphthylalanine (1-Nal); 2-thienylalanine (2-Thi); 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid (Tic); N-methylisoleucine (N-MeIle); homoarginine (Har); Nα-methylarginine (N-MeArg); phosphotyrosine (pTyr or pY); pipecolic acid (Pip); 4-chlorophenylalanine (4-ClPhe); 4-fluorophenylalanine (4-FPhe); 1-aminocyclopropanecarboxylic acid (1-NCPC); and sarcosine (Sar). Any of the amino acids used in the peptide reagents of the present invention may be the D - or, more often, L-isomer.

Другие не встречающиеся в природе аналоги аминокислот, которые могут использоваться для образования описанных здесь пептидных реагентов, включают в себя пептоиды и/или соединения-пептидомиметики, например, основанные на сульфоновой или бороновой кислоте аналоги аминокислот, которые представляют собой биологически функциональные эквиваленты, также могут использоваться в соединениях по настоящему изобретению и включают в себя соединения, имеющие одну или несколько амидных связей, необязательно замещенных изостерой. В контексте настоящего изобретения, например, --CONH-- может замещаться --CH₂NH--, --NHCO--, --SO₂NH--, --CH₂O--, --CH₂CH₂--, --CH₂S--, --CH₂SO--, --CH--CH-- (цис или транс), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂-- и 1,5-дизамещенным тетразолом, так что радикалы, связанные данными изостерами, будут поддерживаться в сходных ориентациях с радикалами, связанными --CONH--. Один или несколько остатков в описанных здесь пептидных реагентах могут включать в себя пептоиды.Other non-naturally occurring amino acid analogs that can be used to form the peptide reagents described herein include peptoids and / or peptidomimetic compounds, for example, sulfonic or boronic acid based amino acid analogues that are biologically functional equivalents, can also be used in the compounds of the present invention and include compounds having one or more amide bonds, optionally substituted with an isoster. In the context of the present invention, for example, --CONH-- may be substituted with --CH ₂ NH--, --NHCO--, --SO ₂ NH--, --CH ₂ O--, --CH ₂ CH ₂ -, --CH ₂ S--, --CH ₂ SO--, --CH - CH-- (cis or trans), --COCH ₂ -, --CH (OH) CH ₂ - and 1,5-disubstituted tetrazole, so that the radicals bound by these isosteres will be supported in similar orientations with the radicals bound by --CONH--. One or more residues in the peptide reagents described herein may include peptoids.

Таким образом, пептидные реагенты также могут включать в себя один или несколько N-замещенных глициновых остатков (пептиды, имеющие один или несколько N-замещенных глициновых остатков, могут обозначаться как «пептоиды»). Например, в некоторых вариантах осуществления один или несколько остатков пролина любого из описанных здесь пептидных реагентов замещены N-замещенными глициновыми остатками. Конкретные N-замещенные глицины, которые подходят в данном отношении, включают в себя в качестве неограничивающих примеров N-(S)-(1-фенилэтил)глицин; N-(4-гидроксифенил)глицин; N-(циклопропилметил)глицин; N-(изопропил)глицин; N-(3,5-диметоксибензил)глицин; и N-бутилглицин (например, фиг.3). Другие N-замещенные глицины могут также подходить для замещения одного или нескольких аминокислотных остатков в последовательностях описанных здесь пептидных реагентов. Для общего обзора данных и других аналогов аминокислот и пептидомиметиков см. Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7 (7): 463-473; Spatola, A.F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983). См. также Spatola, A. F., Peptide Backbone Modifications (general review), Vega Data, Vol.1, Issue 3, (March 1983); Morley, Trends Pharm Sci (общий обзор), pp. 463-468 (1980); Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res, 14: 177-185 (1979) (--CH₂NH--, CH₂CH₂--); Spatola etal., Life Sci, 38: 1243-1249 (1986) (--CH₂--S); Hann J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982) (--CH--CH--, цис и транс); Almquist et al., J Med Chem, 23:1392-1398 (1980) (--COCH₂--); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett, 23: 2533 (1982) (--COCH₂--); Szelke et al., European Appln. EP 45665 CA: 97: 39405 (1982) (--CH(OH)CH₂--); Holladay et al., Tetrahedron Lett, 24:4401-4404(1983) (--C(OH)CH₂--); и Hruby, Life Sci, 31: 189-199 (1982) (--CH₂--S--); каждая из данных публикаций включена сюда в качестве ссылки. C-концевая карбоновая кислота может замещаться бороновой кислотой --B(OH)₂ или бороновым эфиром --B(OR)₂ или другим таким производным бороновой кислоты, как описано в патенте США № 5288707, включенном сюда в качестве ссылки. Thus, peptide reagents may also include one or more N-substituted glycine residues (peptides having one or more N-substituted glycine residues may be referred to as “peptoids”). For example, in some embodiments, one or more proline residues of any of the peptide reagents described herein are substituted with N-substituted glycine residues. Particular N-substituted glycines that are suitable in this regard include, but are not limited to, N- (S) - (1-phenylethyl) glycine; N- (4-hydroxyphenyl) glycine; N- (cyclopropylmethyl) glycine; N- (isopropyl) glycine; N- (3,5-dimethoxybenzyl) glycine; and N-butyl glycine (e.g., FIG. 3). Other N-substituted glycines may also be suitable for substitution of one or more amino acid residues in the sequences of the peptide reagents described herein. For a general overview of data and other amino acid analogs and peptidomimetics, see Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7 (7): 463-473; Spatola, AF, in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983). See also Spatola, AF, Peptide Backbone Modifications (general review), Vega Data, Vol. 1, Issue 3, (March 1983); Morley, Trends Pharm Sci (overview), pp. 463-468 (1980); Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res, 14: 177-185 (1979) (--CH ₂ NH--, CH ₂ CH ₂ -); Spatola et al., Life Sci 38: 1243-1249 (1986) (--CH ₂ --S); Hann J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982) (--CH - CH--, cis and trans); Almquist et al., J Med Chem, 23: 1392-1398 (1980) (--COCH ₂ -); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett, 23: 2533 (1982) (--COCH ₂ -); Szelke et al., European Appln. EP 45665 CA: 97: 39405 (1982) (--CH (OH) CH ₂ -); Holladay et al., Tetrahedron Lett, 24: 4401-4404 (1983) (--C (OH) CH ₂ -); and Hruby, Life Sci, 31: 189-199 (1982) (--CH ₂ --S--); each of these publications is incorporated herein by reference. The C-terminal carboxylic acid may be substituted with boronic acid -B (OH) ₂ or boronic ester -B (OR) ₂ or another such boronic acid derivative as described in US Pat. No. 5,288,707, incorporated herein by reference.

Описанные здесь пептидные реагенты могут включать в себя мономеры, мультимеры, циклизованные молекулы, разветвленные молекулы, линкеры и тому подобное. Также рассматриваются мультимеры (т.е., димеры, триммеры и тому подобное) любой из описанных здесь последовательностей или их биологически функциональных эквивалентов. Мультимер может быть гомомультимером, т.е., составленным из идентичных мономеров, например, каждый мономер представляет собой одну и ту же аминокислотную последовательность. Альтернативно, мультимер может представлять собой гетеромультимер, под чем подразумевается то, что не все мономеры, образующие мультимер идентичны.The peptide reagents described herein may include monomers, multimers, cyclized molecules, branched molecules, linkers, and the like. Also considered are multimers (i.e., dimers, trimmers, and the like) of any of the sequences described herein or their biologically functional equivalents. A multimer may be a homomultimer, i.e., composed of identical monomers, for example, each monomer represents the same amino acid sequence. Alternatively, the multimer may be a heteromultimer, which means that not all monomers forming the multimer are identical.

Мультимеры могут образовываться путем непосредственного присоединения мономеров друг к другу или путем присоединения к субстрату, включая, например, пептиды-множественные антигены (MAP) (например, симметричные MAP), пептиды, присоединенные к полимерным каркасам, например к каркасу ПЭГ, и/или пептиды, соединенные тандемами со спейсерными единицами или без них.Multimers can be formed by directly attaching monomers to each other or by attaching to a substrate, including, for example, multiple antigen peptides (MAPs) (e.g., symmetric MAPs), peptides attached to polymer scaffolds, e.g., PEG scaffolds, and / or peptides connected by tandems with or without spacer units.

Альтернативно, связывающие группы могут быть добавлены к мономерным последовательностям для соединения мономеров вместе и образования мультимера. Неограничивающие примеры мультимеров с использованием связывающих групп включают в себя тандемные повторы с использованием глициновых линкеров; MAP, соединенные посредством линкера с субстратом и/или линейно связанные пептиды, присоединенные линкерами к субстрату. Связывающие группы могут включать в себя применение бифункциональных спейсерных единиц (гомобифункциональных или гетеробифункциональных), известных специалисту в данной области. В качестве неограничивающих примеров многие способы включения таких спейсерных единиц в связывающие пептиды вместе с применением таких реагентов, как сукцинимидил-4-(п-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират и подобных им описаны в Pierce Immunotechnology Handbook (Pierce Chemical Co., Rockville, Ill.) и также доступны от Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.) и Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.) и описаны в "Comprehensive Organic Transformations", VCK-Verlagsgesellschaft, Weinheim/Germany (1989). Одним из примеров связывающей группы, которая может использоваться для связывания вместе мономерных последовательностей, является --Y1--F--Y2, где Y1 и Y2 идентичны или отличны и представляют собой алкиленовые группы 0-20, предпочтительно, 0-8, более предпочтительно, 0-3 атомов углерода, и F представляет собой одну или несколько функциональных групп, таких как --O--, --S--, --S--S--, --C(O) --O--, --NR--, --C(O)--NR--, --NR--C(O)--O--, --NR--C(O)--NR--, --NR--C(S)--NR--, --NR--C(S)--O--. Y1 и Y2 могут необязательно замещаться на гидрокси, алкокси, гидроксиалкил, алкоксиалкил, амино, карбоксил, карбоксиалкил и тому подобное. Следует понимать, что любой подходящий атом мономера может присоединяться к связывающей группе.Alternatively, linking groups can be added to the monomer sequences to bond the monomers together and form a multimer. Non-limiting examples of multimers using linking groups include tandem repeats using glycine linkers; MAPs linked via a linker to a substrate and / or linearly linked peptides linked by linkers to the substrate. Linking groups may include the use of bifunctional spacer units (homobifunctional or heterobifunctional) known to one skilled in the art. By way of non-limiting examples, many methods for incorporating such spacer units into binding peptides using reagents such as succinimidyl 4- ( p- maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), succinimidyl-4- ( p- maleimidophenyl) butyrate and the like they are described in the Pierce Immunotechnology Handbook (Pierce Chemical Co., Rockville, Ill.) and are also available from Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.) and Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.) And are described in Comprehensive Organic Transformations, VCK-Verlagsgesellschaft, Weinheim / Germany (1989). One example of a linking group that can be used to bind together monomeric sequences is - Y1 - F - Y2, where Y1 and Y2 are identical or different and are alkylene groups 0-20, preferably 0-8, more preferably , 0-3 carbon atoms, and F represents one or more functional groups, such as --O--, --S--, --S - S--, --C (O) --O- -, --NR--, --C (O) - NR--, --NR - C (O) - O--, --NR - C (O) - NR--, --NR - C (S) - NR--, --NR - C (S) - O--. Y1 and Y2 may optionally be substituted with hydroxy, alkoxy, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, amino, carboxyl, carboxyalkyl and the like. It should be understood that any suitable atom of the monomer may attach to a linking group.

Кроме того, пептидные реагенты по изобретению могут быть линейными, разветвленными или циклизованными. Мономерные единицы могут быть циклизованы или могут быть связаны вместе для обеспечения мультимеров в линейном или разветвленном виде, в виде кольца (например, макроцикл), в виде звезды (дендримеры) или в форме шара (например, фуллерены). Специалисты в данной области легко распознают различные полимеры, которые могут образовываться из описанных здесь мономерных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления мультимер представляет собой циклический димер. С использованием той же терминологии, что указана выше, димер может представлять собой гомодимер или гетеродимер.In addition, the peptide reagents of the invention may be linear, branched or cyclized. Monomer units can be cyclized or can be linked together to provide multimers in a linear or branched form, in the form of a ring (for example, a macrocycle), in the form of a star (dendrimers) or in the form of a ball (for example, fullerenes). Those skilled in the art will readily recognize the various polymers that can be formed from the monomer sequences described herein. In some embodiments, the multimer is a cyclic dimer. Using the same terminology as indicated above, the dimer can be a homodimer or heterodimer.

Циклические формы, мономеры это или мультимеры, могут быть получены посредством любой из описанных здесь связей, например, в качестве неограничивающих примеров: (1) путем циклизации N-концевого амина с C-концевой карбоновой кислотой посредством прямого образования амидной связи между азотом и С-концевым карбонилом, или посредством промежуточной спейсерной группы, например, путем конденсации с эпсилон-амино-карбоновой кислотой; (2) путем циклизации посредством образования связи между боковыми цепями двух остатков, например, путем образования амидной связи между аспартатной или глутаматной боковой цепью и боковой цепью лизина, или путем образования дисульфидной связи между двумя боковыми цепями цистеина, или между пеницилламином и боковой цепью цистеина, или между двумя боковыми цепями пеницилламина; (3) путем циклизации за счет образования амидной связи между боковой цепью (например, аспартата или лизина) и N-концевым амином или С-концевым карбоксилом, соответственно; и/или (4) путем связывания двух боковых цепей посредством промежуточной короткой углеводородной спейсерной группы.Cyclic forms, monomers or multimers, can be obtained by any of the bonds described here, for example, as non-limiting examples: (1) by cyclization of the N-terminal amine with the C-terminal carboxylic acid by direct formation of an amide bond between nitrogen and C- terminal carbonyl, or via an intermediate spacer group, for example, by condensation with epsilon amino carboxylic acid; (2) by cyclization through the formation of a bond between the side chains of two residues, for example, by the formation of an amide bond between the aspartate or glutamate side chain and the side chain of lysine, or by the formation of a disulfide bond between two side chains of cysteine, or between penicillamine and the cysteine side chain, or between two side chains of penicillamine; (3) by cyclization due to the formation of an amide bond between the side chain (for example, aspartate or lysine) and the N-terminal amine or C-terminal carboxyl, respectively; and / or (4) by linking two side chains via an intermediate short hydrocarbon spacer group.

Предпочтительно описанные здесь пептидные реагенты не являются патогенными и/или инфекционными. Preferably, the peptide reagents described herein are not pathogenic and / or infectious.

Пептидные реагенты по изобретению могут находиться в пределах от 3 примерно до 100 остатков в длину (или любой длины между данными значениями) или даже длиннее, предпочтительно, примерно от 4 до 75 остатков (или любой длины между данными значениями), предпочтительно примерно от 5 до 63 остатков (или любой длины между данными значениями), и даже более предпочтительно примерно от 8 до 30 остатков (или любой длины между данными значениями), и, наиболее предпочтительно, пептидный реагент составляет 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 остатков.The peptide reagents of the invention can range from 3 to about 100 residues in length (or any length between these values) or even longer, preferably from about 4 to 75 residues (or any length between these values), preferably from about 5 to 63 residues (or any length between these values), and even more preferably from about 8 to 30 residues (or any length between these values), and most preferably, the peptide reagent is 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 remainder ov.

Неограничивающие примеры пептидных реагентов, которые могут использоваться в описанных здесь композициях и способах, происходят из последовательностей, показанных в таблице 1 и в таблице 4. Пептидные реагенты в таблицах представлены общепринятыми однобуквенными аминокислотными кодами и обозначены с N-конца слева и с C-конца справа. Аминокислоты в квадратных скобках указывают на альтернативные остатки, которые могут использоваться в данном положении в различных пептидных реагентах. Круглые скобки указывают на остаток(-ки), который(-ые) могут присутствовать или отсутствовать в пептидном реагенте. Любой пролиновый остаток может замещаться N-замещенными глициновыми остатками с образованием пептоидов. Любые из последовательностей в таблицах могут необязательно включать в себя линкеры Gly (G_n, где n = 1, 2, 3, или 4) с N- и/или C-конца.Non-limiting examples of peptide reagents that can be used in the compositions and methods described herein are derived from the sequences shown in Table 1 and Table 4. The peptide reagents in the tables are represented by conventional single-letter amino acid codes and are designated from the N-terminus on the left and the C-terminus on the right . Amino acids in square brackets indicate alternative residues that can be used at a given position in various peptide reagents. Parentheses indicate the residue (s) that (s) may be present or absent in the peptide reagent. Any proline residue may be substituted with N-substituted glycine residues to form peptoids. Any of the sequences in the tables may optionally include Gly linkers (G _n , where n = 1, 2, 3, or 4) from the N- and / or C-terminus.

Таблица 1Table 1

В одном из аспектов пептидный реагент по изобретению включает в себя каждый из описанных здесь пептидов и их производных (как описано здесь). Таким образом, изобретение включает в себя пептидный реагент, полученный из пептида с SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, или 132. In one aspect, the peptide reagent of the invention includes each of the peptides and their derivatives described herein (as described herein). Thus, the invention includes a peptide reagent derived from a peptide with SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, or 132.

Изобретение предпочтительно включает в себя пептидный реагент, полученный из пептида с SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 72, 74, 76, 77, 78, 81, 82, 84, 89, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, или 132. The invention preferably includes a peptide reagent derived from a peptide with SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 72, 74, 76, 77, 78, 81, 82, 84, 89, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, or 132.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пептидные реагенты специфично связываются с патогенными прионами, например пептидные реагенты, полученные из пептидов SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, или 84, и их аналоги (например, с заменой одного или нескольких пролинов N-замещенным глицином) и производные. In some preferred embodiments, the peptide reagents specifically bind to pathogenic prions, for example, peptide reagents derived from peptides SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, or 84, and their analogs (for example, by replacing one or more proline with N-substituted glycine) and derivatives.

Как описано выше, описанные здесь пептидные реагенты могут включать в себя одну или несколько замен, добавлений и/или мутаций. Например, один или несколько остатков в пептидных реагентах может замещаться другими остатками, например, аланиновыми остатками, или аналогом аминокислоты или N-замещенным глициновым остатком для получения пептоида (см., например, Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7 (7): 463-473).As described above, the peptide reagents described herein may include one or more substitutions, additions and / or mutations. For example, one or more residues in the peptide reagents may be substituted with other residues, for example, alanine residues, or an amino acid analog or an N-substituted glycine residue to produce a peptoid (see, for example, Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7 (7 ): 463-473).

Более того, описанные здесь пептидные реагенты могут также включать в себя дополнительные пептидные или непептидные компоненты. Неограничивающие примеры дополнительных пептидных компонентов включают в себя спейсерные остатки, например, два или большее число глициновых остатков (природных или дериватизированных) или линкеров аминогексановой кислоты на одном или обоих концах, или остатки, которые могут способствовать солюбилизации пептидных реагентов, например кислых остатков, таких как аспарагиновая кислота (Asp или D), как показано, например, в SEQ ID NO: 83, 86. В некоторых вариантах осуществления, например, пептидные реагенты синтезируются в виде пептидов-множественных антигенов (MAP). Обычно множественные копии пептидных реагентов (например, 2-10 копий) синтезируются непосредственно на MAP-носителе, таком как разветвленный лизин или другой несущее ядро MAP. См., например, Wu et al. (2001) J Am Chem Soc. 2001123 (28): 6778-84; Spetzler et al. (1995) Int J Pept Proten Res. 45(1): 78-85. Moreover, the peptide reagents described herein may also include additional peptide or non-peptide components. Non-limiting examples of additional peptide components include spacer residues, for example, two or more glycine residues (naturally occurring or derivatized) or aminohexanoic acid linkers at one or both ends, or residues that can help solubilize peptide reagents, such as acidic residues, such as aspartic acid (Asp or D), as shown, for example, in SEQ ID NO: 83, 86. In some embodiments, for example, peptide reagents are synthesized as multiple peptides x antigens (MAP). Typically, multiple copies of peptide reagents (e.g., 2-10 copies) are synthesized directly on a MAP carrier, such as branched lysine or another MAP carrier core. See, for example, Wu et al. (2001) J Am Chem Soc. 2001123 (28): 6778-84; Spetzler et al. (1995) Int J Pept Proten Res. 45 (1): 78-85.

Неограничивающие примеры непептидных компонентов (например, химических радикалов), которые могут быть включены в описанные здесь пептидные реагенты, включают в себя одну или несколько выявляемых меток (например, биотин, His-метки, олигонуклеотиды), красители, представители связывающихся пар, и тому подобное, как на конце, так и внутри пептидного реагента. Непептидные компоненты могут также присоединяться (например, посредством ковалентного присоединения одной или нескольких меток), непосредственно или через спейсер (например, амидную группу), в положение(-я) соединения, которое(-ые), как предсказано количественными данными по исследованию структуры-активности и/или молекулярным моделированием, не препятствуют активности. Пептидные реагенты, описанные здесь, могут также включать в себя специфичные в отношении приона химические радикалы, такие как специфичные в отношении амилоида красители (например, Конго красный или тиофлавин). Дериватизация соединений (например, мечение, циклизация, присоединение химических радикалов, и т.д.) не должна существенно препятствовать (и может даже усиливать) свойства связывания, биологической функции и/или фармакологической активности пептидного реагента.Non-limiting examples of non-peptide components (e.g., chemical radicals) that can be included in the peptide reagents described herein include one or more detectable tags (e.g., Biotin, His-tags, oligonucleotides), dyes, representatives of binding pairs, and the like. , both at the end and inside the peptide reagent. Non-peptide components can also attach (for example, by covalently attaching one or more labels), directly or through a spacer (for example, an amide group), to the position (s) of the compound, which (s), as predicted by quantitative data on the study of the structure activity and / or molecular modeling, do not interfere with activity. The peptide reagents described herein may also include prion-specific chemical radicals, such as amyloid-specific dyes (e.g., Congo red or thioflavin). Derivatization of compounds (e.g., labeling, cyclization, addition of chemical radicals, etc.) should not significantly impede (and may even enhance) the binding properties, biological function and / or pharmacological activity of the peptide reagent.

Пептидные реагенты по изобретению обычно имеют, по меньшей мере, примерно 50% идентичности по последовательности в отношении фрагментов прионного белка или приведенных здесь пептидных последовательностей. Предпочтительно, пептидные реагенты имеют, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, или 100% идентичность по последовательности в отношении фрагментов прионного белка или приведенных здесь пептидных последовательностей.The peptide reagents of the invention typically have at least about 50% sequence identity with respect to prion protein fragments or the peptide sequences provided herein. Preferably, the peptide reagents have at least 70% sequence identity, more preferably at least 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100 % sequence identity with respect to prion protein fragments or the peptide sequences shown here.

Описанные здесь пептидные реагенты взаимодействуют преимущественно с патогенными формами и, соответственно, могут использоваться в разнообразных применениях по выделению, очистке, обнаружению, диагностике и лечению. Например, в вариантах осуществления, в которых пептидный реагент взаимодействует преимущественно с патогенными формами, сами пептидные реагенты могут использоваться для обнаружения в образце, таком как кровь, ткань нервной системы (головной мозг, спинной мозг, ЦСЖ, и т.д.) или образец другой ткани или органа. Пептидные реагенты также могут использоваться для диагностики присутствия заболевания, ассоциированного с патогенными формами, обнаружения патогенных форм и для деконтаминации образцов посредством удаления патогенных форм.The peptide reagents described herein interact primarily with pathogenic forms and, accordingly, can be used in a variety of applications for the isolation, purification, detection, diagnosis and treatment. For example, in embodiments in which the peptide reagent interacts predominantly with pathogenic forms, the peptide reagents themselves can be used to detect in a sample, such as blood, tissue of the nervous system (brain, spinal cord, CSF, etc.) or a sample another tissue or organ. Peptide reagents can also be used to diagnose the presence of a disease associated with pathogenic forms, detect pathogenic forms, and to decontaminate samples by removing pathogenic forms.

Взаимодействие пептидных реагентов с прионными белками может тестироваться с использованием любых известных анализов связывания, например стандартных иммунных анализов, таких как ELISA, вестерн-блот и тому подобное. The interaction of peptide reagents with prion proteins can be tested using any known binding assays, for example, standard immunoassays, such as ELISA, Western blot and the like.

Одним из удобных способов тестирования специфичности пептидных реагентов по настоящему изобретения является выбор образца, содержащего как патогенные, так и непатогенные прионы. Такие обычные образцы содержат ткань головного или спинного мозга из больных животных. Описанные здесь пептидные реагенты, которые специфично связываются с патогенными формами, присоединяются к твердой основе (способами, хорошо известными в данной области и далее описанными ниже) и используются для отделения («осаждения») патогенного приона от других компонентов образца и получения количественного значения, непосредственно относящегося к числу взаимодействий связывания пептид-прион на твердой основе. Вариации и другие анализы, известные в данной области, могут также использоваться для демонстрации специфичности пептидных реагентов по изобретению. См., например, примеры.One convenient way to test the specificity of the peptide reagents of the present invention is to select a sample containing both pathogenic and non-pathogenic prions. Such conventional samples contain brain or spinal cord tissue from diseased animals. The peptide reagents described herein, which specifically bind to pathogenic forms, attach to a solid support (methods well known in the art and described below below) and are used to separate ("precipitate") the pathogenic prion from other components of the sample and obtain a quantitative value directly solid-peptide-related peptide-prion binding interactions. Variations and other assays known in the art can also be used to demonstrate the specificity of the peptide reagents of the invention. See, for example, examples.

Хотя при использовании описанных здесь пептидных реагентов это не обязательно, в данных анализах может использоваться тот факт, что прионы, имеющие патогенную конформацию, в основном, устойчивы к протеазам, таким как протеиназа К. Те же протеазы могут разрушать прионы в непатогенной конформации. Поэтому при использовании протеазы образец может разделяться на два равных объема. Протеаза может добавляться ко второму образцу, и может проводиться тот же тест. Поскольку протеаза во втором образце разрушает любые непатогенные прионы, любые взаимодействия по связыванию пептид-прион во втором образце могут быть отнесены к патогенным прионам.Although this is not necessary when using the peptide reagents described here, these analyzes can use the fact that prions having a pathogenic conformation are mainly resistant to proteases, such as proteinase K. The same proteases can destroy prions in a non-pathogenic conformation. Therefore, when using a protease, the sample can be divided into two equal volumes. Protease can be added to the second sample, and the same test can be performed. Since the protease in the second sample destroys any non-pathogenic prions, any peptide-prion binding interactions in the second sample can be attributed to pathogenic prions.

Таким образом, неограничивающие примеры способов оценки специфичности связывания и/или сродства описанных здесь пептидных реагентов включают в себя стандартные процедуры вестерн- и фар-вестерн-блоттинга; меченые пептиды; ELISA-подобные анализы; и/или основанные на клетках анализы. В вестерн-блотах, например, используются меченое первичное антитело, которое выявляет денатурированный прионный белок в геле SDS-PAGE образцов, полученных при описанном здесь анализе «осаждения», который подвергают электроблоттингу на нитроцеллюлозу или PVDF. Описаны антитела, которые распознают денатурированный прионный белок (среди прочих, описаны в Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72: 9413; патенте США № 6765088; патенте США № 6537548), и некоторые из них коммерчески доступны. Описаны другие связывающие прион молекулы, например гибридные полипептиды с привитыми мотивами (см., WО03/085086), некоторые катионные или анионные полимеры (см., WО03/073106), некоторые пептиды, которые представляют собой «катализаторы размножения» (см., WО02/0974444) и плазминоген. Затем выявляется первичное антитело (и/или амплифицируется) посредством зонда для метки (например, конъюгированная со стрептавидином щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, реагент ECL, и/или амплифицируемые олигонуклеотиды). Связывание также может оцениваться с использованием реагентов для обнаружения, таких как пептидов с меткой сродства (например, биотином), которые мечены и амплифицированы посредством зонда для данной метки сродства (например, конъюгированной со стрептавидином щелочной фосфатазы, пероксидазы хрена, реагента ECL, или амплифицируемых олигонуклеотидов). Кроме того, могут использоваться процедуры, выполняемые в планшетах для микротитрования, сходные с сэндвич-методом ELISA, например, специфичный в отношении приона пептидный реагент, описанный здесь, используют для иммобилизации прионного(-ых) белка(-ов) на твердой основе (например, на лунке планшета для микротитрования, на грануле, и т.д.), и дополнительный реагент для выявления может включать в себя в качестве неограничивающих примеров другой специфичный в отношении прионов пептидный реагент с метками сродства и/или обнаружения, такими как конъюгированная щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, реагент ECL, или амплифицируемые олигонуклеотиды. Анализы, основанные на клетках, также могут использоваться, например, когда прионный белок выявляется непосредственно на индивидуальных клетках (например, с использованием флуоресцентно меченного, специфичного в отношении приона пептидного реагента, что обеспечивает основанную на флуоресценции сортировку, подсчет клеток, или обнаружение специфично меченых клеток).Thus, non-limiting examples of methods for assessing the binding specificity and / or affinity of the peptide reagents described herein include standard Western and Far Western Blotting procedures; labeled peptides; ELISA-like assays; and / or cell based assays. Western blots, for example, use a labeled primary antibody that detects denatured prion protein in the SDS-PAGE gel of the samples obtained from the “deposition” assay described here, which is subjected to electroblotting for nitrocellulose or PVDF. Antibodies that recognize a denatured prion protein are described (among others, described in Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72: 9413; US patent No. 6765088; US patent No. 6537548), and some of them are commercially available. Other prion binding molecules are described, for example hybrid polypeptides with grafted motifs (see WO03 / 085086), some cationic or anionic polymers (see WO03 / 073106), some peptides that are “propagation catalysts” (see, WO02 / 0974444) and plasminogen. The primary antibody is then detected (and / or amplified) by means of a label probe (e.g., streptavidin-conjugated alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, ECL reagent, and / or amplifiable oligonucleotides). Binding may also be evaluated using detection reagents, such as affinity tag peptides (e.g., biotin) that are labeled and amplified by a probe for that affinity tag (e.g., streptavidin-conjugated alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, ECL reagent, or amplifiable oligonucleotides ) In addition, procedures performed on microtiter plates similar to the ELISA sandwich method can be used, for example, the prion-specific peptide reagent described here is used to immobilize the prion (s) on a solid basis (e.g. , on a microtiter plate well, on a pellet, etc.), and an additional detection reagent may include, but are not limited to, another prion specific peptide reagent with affinity and / or detection marks, such as nyugirovannaya alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, the ECL reagent, or amplifiable oligonucleotides. Cell-based assays can also be used, for example, when prion protein is detected directly on individual cells (for example, using a fluorescently labeled, prion-specific peptide reagent, which provides fluorescence-based sorting, cell counting, or detection of specifically labeled cells )

III. B. Продукция пептидных реагентовIII. B. Production of peptide reagents

Пептидные реагенты по настоящему изобретению могут продуцироваться любыми путями, которые известны в данной области.The peptide reagents of the present invention can be produced by any means known in the art.

В одном из вариантов осуществления пептидный реагент представляет собой, полностью или частично, генетически кодируемый пептид, причем данный пептид может генерироваться с использованием рекомбинантных способов, хорошо известных в данной области. Специалист в данной области может легко определить нуклеотидные последовательности, которые кодируют требуемый пептид с использованием стандартной методологии и приведенного здесь учения. После выделения рекомбинантный пептид необязательно может модифицироваться так, что они включают в себя не кодируемые генетически компоненты (например, выявляемые метки, представители связывающихся пар, и т.д.), как описано здесь и хорошо известно в данной области, для продукции пептидных реагентов.In one embodiment, the peptide reagent is a fully or partially genetically encoded peptide, which peptide can be generated using recombinant methods well known in the art. One of skill in the art can easily determine the nucleotide sequences that encode the desired peptide using a standard methodology and the teachings given here. After isolation, the recombinant peptide may optionally be modified so that they include non-genetically encoded components (e.g., detectable tags, representatives of binding pairs, etc.), as described herein and is well known in the art, for the production of peptide reagents.

Олигонуклеотидные зонды могут быть сконструированы на основе известных последовательностей и использованы для зондирования геномных или кДНК-библиотек. Последовательности могут быть далее выделены с использованием стандартных способов и, например, ферментов рестрикции, используемых для укорочения гена с получением требуемых частей полноразмерной последовательности. Сходным образом, интересующие последовательности могут выделяться непосредственно из содержащих их клеток и тканей, с использованием известных способов, таких как экстракция фенолом, с последовательностью манипулируют далее с получением требуемых укороченных частей. См., например, Sambrook et al., supra, для описания способов, используемых для получения и выделения ДНК.Oligonucleotide probes can be constructed based on known sequences and used to probe genomic or cDNA libraries. The sequences can be further isolated using standard methods and, for example, restriction enzymes used to shorten the gene to obtain the desired parts of a full-sized sequence. Similarly, sequences of interest can be isolated directly from cells and tissues containing them, using known methods, such as phenol extraction, to further manipulate the sequence to obtain the desired truncated parts. See, for example, Sambrook et al., Supra, for a description of the methods used to prepare and isolate DNA.

Последовательности, кодирующие пептид, также могут продуцироваться синтетически, например, на основе известных последовательностей. Нуклеотидная последовательность может конструироваться с подходящими кодонами для конкретной требуемой аминокислотной последовательности. Полная последовательность, в общем, соединяется из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными способами, и объединяется из полной кодирующей последовательности. См., например, Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311; Stemmer et al. (1995) Gene 164: 49-53. Peptide coding sequences can also be synthetically produced, for example, based on known sequences. The nucleotide sequence can be constructed with suitable codons for the specific desired amino acid sequence. The complete sequence, in General, is combined from the overlapping oligonucleotides obtained by standard methods, and combined from the complete coding sequence. See, for example, Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311; Stemmer et al. (1995) Gene 164: 49-53.

Рекомбинантные способы легко используются для клонирования последовательностей, кодирующих полипептиды, применимые в заявленных пептидных реагентах, которые затем могут подвергаться мутагенезу in vitro путем замены подходящей(-их) пары(-р) оснований с получением в результате кодона для требуемой аминокислоты. Такое изменение может включать в себя, как минимум, одну пару оснований, что приводит к изменению одной аминокислоты, или может охватывать изменения в нескольких пар оснований. Альтернативно, мутации могут осуществляться с использованием несоответствующего праймера, который гибридизуется с исходной нуклеотидной последовательностью (в общем, кДНК, соответствующей последовательности РНК), при температуре ниже температуры плавления несовпадающего дуплекса. Праймер может быть получен специфичным за счет поддержания длины праймера и сочетания оснований в пределах относительно узких пределов и поддержания мутантного основания, локализованного по центру. См., например, Innis et al, (1990) PCR Applications: Protocols for Functional Genomics; Zoller and Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. Продление праймера осуществляется с использованием ДНК-полимеразы, продукт клонируют и отбирают клоны, содержащие мутированную ДНК, происходящие за счет сегрегации цепи продления праймера. Отбор может выполняться с использованием мутантного праймера в качестве зонда для гибридизации. Способ также может использоваться для получения множественных точечных мутаций. См., например, Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA (1982) 79: 6409. Recombinant methods are readily used to clone sequences encoding the polypeptides useful in the claimed peptide reagents, which can then undergo in vitro mutagenesis by replacing the appropriate base pair (s) with the resultant codon for the desired amino acid. Such a change may include at least one base pair, which leads to a change in one amino acid, or may include changes in several base pairs. Alternatively, mutations can be carried out using an inappropriate primer that hybridizes to the original nucleotide sequence (in general, cDNA corresponding to the RNA sequence) at a temperature below the melting point of the mismatched duplex. The primer can be obtained specific by maintaining the length of the primer and combining the bases within relatively narrow limits and maintaining the mutant base localized in the center. See, for example, Innis et al, (1990) PCR Applications: Protocols for Functional Genomics; Zoller and Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. The extension of the primer is carried out using DNA polymerase, the product is cloned and selected are clones containing mutated DNA resulting from the segregation of the extension chain of the primer. Selection can be performed using a mutant primer as a probe for hybridization. The method can also be used to obtain multiple point mutations. See, for example, Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA (1982) 79: 6409.

После выделения и/или синтеза кодирующих последовательностей они могут быть клонированы в любой подходящий вектор или репликон для экспрессии. (См., также, примеры). Как понятно из приведенных здесь сведений, разнообразные векторы, кодирующие модифицированные полипептиды, могут генерироваться путем создания экспрессирующих конструкций, которые функционально связывают в различных сочетаниях полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, содержащие делеции или мутации. After isolation and / or synthesis of coding sequences, they can be cloned into any suitable vector or replicon for expression. (See also examples). As is clear from the information presented here, a variety of vectors encoding modified polypeptides can be generated by creating expression constructs that functionally bind polynucleotides encoding polypeptides containing deletions or mutations in various combinations.

Многочисленные клонирующие векторы известны специалистам в данной области, и селекция подходящего клонирующего вектора является предметом выбора. Примеры рекомбинантных ДНК-векторов для клонирования и клеток хозяина, которые могут трансформироваться ими, включают в себя бактериофаг λ (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (грамотрицательные бактерии), pGV1106 (грамотрицательные бактерии), pLAFRl (грамотрицательные бактерии), pME290 (не относящиеся к E. coli грамотрицательные бактерии), pHV14 (E. coli и Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptonzyces), YIp5 (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces) и вирус папилломы крупного рогатого скота (клетки млекопитающих). См., в общем, DNA Cloning: Vols. I & II, supra; Sambrook et al., supra; B. Perbal, supra. Numerous cloning vectors are known to those skilled in the art, and selection of a suitable cloning vector is a matter of choice. Examples of recombinant DNA vectors for cloning and host cells that can be transformed with them include bacteriophage λ (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (gram-negative bacteria), pGV1106 (gram-negative bacteria), pLAFRl (gram-negative bacteria), pME290 (non-E. coli gram-negative bacteria), pHV14 (E. coli and Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptonzyces), YIp5 (Sacchomy) , YCpl9 (Saccharomyces) and cattle papilloma virus (mammalian cells). See, in general, DNA Cloning: Vols. I & II supra; Sambrook et al., Supra; B. Perbal, supra.

Экспрессирующие системы клеток насекомых, такие как бакуловирусные системы, могут также использоваться и известны специалистам в данной области и описаны, например, в Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Материалы и методы по экспрессирующим системам бакуловирус/клетки насекомых коммерчески доступны, среди прочих, от Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния (набор «MaxBac»).Insect cell expression systems, such as baculovirus systems, can also be used and are known to those skilled in the art and are described, for example, in Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materials and methods for baculovirus / insect cell expression systems are commercially available, among others, from Invitrogen, San Diego, California (MaxBac kit).

Растительные экспрессирующие системы могут также использоваться для продукции описанных здесь пептидных реагентов. В общем, в таких системах применяются основанные на вирусе векторы для трансфекции растительных клеток гетерологичными генами. Для описания таких систем см., например, Porta et al., Mol. Biotech. (1996) 5: 209-221; и Hackland et al., Arch. Virol. (1994) 139: 1-22.Plant expression systems can also be used to produce the peptide reagents described herein. In general, such systems employ virus-based vectors to transfect plant cells with heterologous genes. For a description of such systems, see, for example, Porta et al., Mol. Biotech (1996) 5: 209-221; and Hackland et al., Arch. Virol. (1994) 139: 1-22.

Вирусные системы, такие как основанная на вирусе коровьей оспы система инфекции/трансфекции, описанная в Tomei et al., J. Virol. (1993) 67: 4017-4026 и Selby et al., J. Gen. Virol. (1993) 74: 1103-1113, также найдут применение по настоящему изобретению. В данной системе клетки вначале трансфицируют in vitro рекомбинантных вирусом коровьей оспы, который кодирует РНК-полимеразу бактериофага T7. Данная полимераза характеризуется исключительной специфичностью, при которой она транскрибирует только те матрицы, которые несут промотор T7. После инфицирования клетки трансфицируют интересующей ДНК, управляемой промотором T7. Полимераза, экспрессируемая в цитоплазме с рекомбинантного вируса коровьей оспы, транскрибирует трансфицированную ДНК в РНК, которая затем транслируется в белок посредством механизма трансляции хозяина. Способ предоставляет временную продукцию высокого уровня в цитоплазме больших количеств РНК и продукта(-ов) ее трансляции.Viral systems, such as the vaccinia virus-based vaccination / transfection system described in Tomei et al., J. Virol. (1993) 67: 4017-4026 and Selby et al., J. Gen. Virol. (1993) 74: 1103-1113 will also find use in the present invention. In this system, cells are first transfected in vitro with recombinant vaccinia virus, which encodes bacteriophage T7 RNA polymerase. This polymerase is characterized by exceptional specificity, in which it transcribes only those matrices that carry the T7 promoter. After infection, cells are transfected with the T7 promoter driven DNA of interest. The polymerase expressed in the cytoplasm of recombinant vaccinia virus transcribes the transfected DNA into RNA, which is then translated into the protein via the host translation mechanism. The method provides temporary high-level production in the cytoplasm of large quantities of RNA and its translation product (s).

Ген может помещаться под контроль промотора, участка, связывающего рибосому (для бактериальной экспрессии) и, необязательно, оператора (вместе указываемых здесь как элементы «контроля»), так что последовательность ДНК, кодирующая требуемый полипептид, транскрибируется в РНК в клетке хозяина, трансформированного вектором, содержащим данную конструкцию экспрессии. Кодирующая последовательность может содержать сигнальный пептид или лидерную последовательность, или может не содержать их. По настоящему изобретению могут использоваться как встречающиеся в природе сигнальные пептиды, так и гетерологичные последовательности. Лидерные последовательности могут удаляться хозяином при посттрансляционном процессинге. См., например, патенты США № 4431739; 4425437; 4338397. Такие последовательности включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, лидер TPA, а также сигнальную последовательность меллитина медоносной пчелы.The gene can be placed under the control of the promoter, the ribosome binding site (for bacterial expression) and, optionally, the operator (collectively referred to as control elements), so that the DNA sequence encoding the desired polypeptide is transcribed into RNA in the host cell transformed with the vector containing this expression construct. The coding sequence may or may not contain a signal peptide or leader. Both naturally occurring signal peptides and heterologous sequences can be used in the present invention. Leader sequences can be deleted by the host in post-translational processing. See, for example, US Pat. Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397. Such sequences include, but are not limited to, the TPA leader, as well as the mellitin signal sequence of the honey bee.

Могут также потребоваться другие регуляторные последовательности, которые обеспечат регуляцию экспрессии последовательностей белка в отношении роста клетки хозяина. Такие регуляторные последовательности известны специалистам в данной области, и примеры их включают в себя те последовательности, которые вызывают выключение или включение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, включая присутствие регуляторного соединения. Другие типы регуляторных элементов также могут присутствовать в векторе, например энхансерные последовательности.Other regulatory sequences may also be required that will regulate the expression of protein sequences in relation to host cell growth. Such regulatory sequences are known to those skilled in the art, and examples thereof include those that cause the expression of a gene to be turned off or on in response to a chemical or physical stimulus, including the presence of a regulatory compound. Other types of regulatory elements may also be present in the vector, for example enhancer sequences.

Последовательности контроля и другие регуляторные последовательности могут лигироваться с кодирующей последовательностью перед встраиванием в вектор. Альтернативно, кодирующая последовательность может клонироваться непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит последовательности контроля и подходящий участок рестрикции.Control sequences and other regulatory sequences may be ligated to the coding sequence before being inserted into the vector. Alternatively, the coding sequence may be cloned directly into an expression vector that already contains control sequences and a suitable restriction site.

В некоторых случаях может быть необходимо модифицировать кодирующую последовательность, так что она может быть присоединена к последовательностям контроля в подходящей ориентации; т.е., для поддержания подходящей рамки считывания. Мутанты или аналоги могут быть получены путем делеции части последовательности, кодирующей белок, путем вставки последовательности и/или путем замены одного или нескольких нуклеотидов в последовательности. Способы модификации нуклеотидных последовательностей, таких как сайтспецифический мутагенез, хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Vols. I and II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. In some cases, it may be necessary to modify the coding sequence so that it can be attached to the control sequences in a suitable orientation; i.e., to maintain a suitable reading frame. Mutants or analogs can be obtained by deletion of a portion of a protein coding sequence, by insertion of a sequence, and / or by substitution of one or more nucleotides in the sequence. Methods for modifying nucleotide sequences, such as site-specific mutagenesis, are well known to those skilled in the art. See, for example, Sambrook et al., Supra; DNA Cloning, Vols. I and II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Затем экспрессирующий вектор используют для трансформации подходящей клетки хозяина. Некоторые клеточные линии млекопитающих известны в данной области и включают в себя иммортализованные клеточные линии, доступные из American Type Culture Collection (ATCC), например, в качестве неограничивающих примеров, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки почки джунгарского хомячка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки человеческой гепатоцеллюлярной карциномы (например, Hep G2), клетки Vero293, а также другие клетки. Сходным образом, бактериальные хозяева, такие как E. coli, Bacillus subtilis и Streptococcus spp., найдут применение в конструкциях по настоящему изобретению. Дрожжевые хозяева, которые могут использоваться по настоящему изобретению, включают в себя, среди прочих, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и Yarrowia lipolytica. Клетки насекомых для применения с бакуловирусными экспрессирующими векторами включают в себя, среди прочих, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni. The expression vector is then used to transform a suitable host cell. Some mammalian cell lines are known in the art and include immortalized cell lines available from the American Type Culture Collection (ATCC), for example, by way of non-limiting examples, Chinese hamster ovary cells (CHO), HeLa cells, Jungarian hamster kidney cells (BHK ), monkey kidney cells (COS), human hepatocellular carcinoma cells (e.g., Hep G2), Vero293 cells, and other cells. Similarly, bacterial hosts such as E. coli, Bacillus subtilis and Streptococcus spp. Will find use in the constructs of the present invention. The yeast hosts that can be used in the present invention include, but are not limited to, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyrow pomia liporomromomaromisompory. Insect cells for use with baculovirus expression vectors include, but are not limited to, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda and Trichoplusia ni.

В зависимости от выбранных экспрессирующей системы и хозяина, белки по настоящему изобретению продуцируют путем выращивания клеток хозяина, трансформированных экспрессирующими векторами, описанными выше, в условиях, в которых экспрессируется интересующий белок. Выбор подходящих условий роста находится в пределах знаний специалиста в данной области.Depending on the expression system and host selected, the proteins of the present invention are produced by growing host cells transformed with the expression vectors described above under the conditions in which the protein of interest is expressed. The selection of suitable growth conditions is within the knowledge of a person skilled in the art.

В одном из осуществлений трансформированные клетки секретируют продукт-полипептид в окружающую среду. Некоторые регуляторные последовательности могут включать в состав вектора для усиления секреции белкового продукта, например, используют лидерную последовательность тканевого плазминогена (TPA), последовательности сигнальных пептидов интерферонов (γ или α) или другие последовательности сигнальных пептидов известных секреторных белков. Секретируемый полипептидный продукт может затем выделяться различными описанными здесь способами, например, с использованием стандартных способов очистки, таких как, например, гидроксиапатитные смолы, колоночная хроматография, ионообменная хроматография, гель-фильтрация, электрофорез, ВЭЖХ, способы иммуноадсорбции, аффинная хроматография, иммунопреципитация, и тому подобное.In one embodiment, the transformed cells secrete the product polypeptide into the environment. Some regulatory sequences may be included in a vector to enhance secretion of a protein product, for example, using tissue plasminogen leader sequence (TPA), interferon signal peptide sequences (γ or α), or other signal peptide sequences of known secretory proteins. The secreted polypeptide product can then be isolated by the various methods described herein, for example, using standard purification methods, such as, for example, hydroxyapatite resins, column chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, electrophoresis, HPLC, immunoadsorption methods, affinity chromatography, immunoprecipitation, and things like that.

Альтернативно, трансформированные клетки разрушают с использованием химических, физических или механических средств, которые лизируют клетки, при этом сохраняя рекомбинантные полипептиды, по существу, интактными. Внутриклеточные белки также могут быть получены путем удаления компонентов из клеточной клетки или мембраны, например, с использованием детергентов или органических растворителей, так что происходит вымывание полипептида. Такие способы известны специалистам в данной области и описаны, например, в Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E. L. V. Harris and S. Angal, Eds., 1990). Alternatively, transformed cells are destroyed using chemical, physical, or mechanical means that lyse the cells, while keeping the recombinant polypeptides essentially intact. Intracellular proteins can also be obtained by removing components from a cell cell or membrane, for example, using detergents or organic solvents, so that the polypeptide is washed out. Such methods are known to those skilled in the art and are described, for example, in Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E. L. V. Harris and S. Angal, Eds., 1990).

Например, способы разрушения клеток для применения по настоящему изобретению включают в качестве неограничивающих примеров: обработка звуком или ультразвуком; встряхивание; жидкая или твердая экструзия; обработка нагреванием; замораживание-оттаивание; сушка; взрывная декомпрессия; осмотический шок; обработка литическими ферментами, включая протеазы, такие как трипсин, нейраминидаза и лизоцим; щелочная обработка; и применение детергентов и растворителей, таких как желчные кислоты, натрия Triton, NP40 и CHAPS. Конкретный способ, используемый для разрушения клеток, главным образом является предметом выбора и зависит от клеточного типа, в котором экспрессируется полипептид, условий культивирования и используемых условий предобработки.For example, cell disruption methods for use in the present invention include, but are not limited to: sonication or ultrasound; shaking liquid or solid extrusion; heat treatment; freeze-thaw; drying; explosive decompression; osmotic shock; treatment with lytic enzymes, including proteases, such as trypsin, neuraminidase and lysozyme; alkaline treatment; and the use of detergents and solvents such as bile acids, Triton sodium, NP40 and CHAPS. The particular method used to disrupt the cells is mainly a matter of choice and depends on the cell type in which the polypeptide is expressed, culture conditions and pre-treatment conditions used.

После разрушения клеток удаляют клеточный дебрис, в основном, центрифугированием, и далее очищают продуцированные внутриклеточно полипептиды с использованием стандартных способов очистки, включающих в себя в качестве неограничивающих примеров колоночную хроматографию, ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез, ВЭЖХ, способы иммуноадсорбции, аффинную хроматографию, иммунопреципитации, и тому подобное.After the destruction of the cells, the cell debris is removed, mainly by centrifugation, and then the intracellularly produced polypeptides are purified using standard purification methods, including, but not limited to, column chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, electrophoresis, HPLC, immunoadsorption methods, affinity chromatography , immunoprecipitation, and the like.

Например, один из способов получения внутриклеточных полипептидов по настоящему изобретению включает в себя аффинную очистку, такую как иммунноаффинную хроматографию с использованием антител (например, ранее образованные антитела), или аффинную хроматографию на лектине. Особенно предпочтительными лектиновыми смолами являются те, что распознают маннозные радикалы, такие как, в качестве неограничивающих примеров смолы, полученные из агглютинина Galarathus nivalis (GNA), агглютинина Lens culinaris (LCA или лектин чечевицы), агглютинина Pisum sativum (PSA или лектин гороха), агглютинина Narcissus pseudonarcissus (NPA) и агглютинина Allium ursinum (AUA). Выбор подходящей аффинной смолы находится в пределах знаний специалиста в данной области. После аффинной очистки полипептиды могут далее очищаться с использованием общепринятых способов, хорошо известных в данной области, например любыми способами, описанными выше.For example, one of the methods for producing intracellular polypeptides of the present invention involves affinity purification, such as immunoaffinity chromatography using antibodies (e.g., pre-formed antibodies), or lectin affinity chromatography. Particularly preferred lectin resins are those which recognize mannose radicals, such as, but not limited to, resins derived from agglutinin Galarathus nivalis (GNA), agglutinin Lens culinaris (LCA or lentil lectin), agglutinin Pisum sativum (PSA or pea lectin) agglutinin Narcissus pseudonarcissus (NPA) and agglutinin Allium ursinum (AUA). The selection of a suitable affinity resin is within the knowledge of one skilled in the art. After affinity purification, the polypeptides can be further purified using conventional methods well known in the art, for example, by any of the methods described above.

Пептидные реагенты могут общепринятым способом химически синтезироваться, например, любым из нескольких способов, которые известны специалистам в области пептидной химии. В общем, данные способы используют последовательное добавление одной или нескольких аминокислот к растущей пептидной цепи. Обычно амино- и карбоксильную группу первой аминокислоты защищают подходящей защитной группой. Защитная или дериватизированная аминокислота затем может присоединяться к инертной твердой основе или использоваться в растворе путем добавления следующей аминокислоты к последовательности, имеющем подходящим образом защищенную комплементарную группу (амино- или карбоксильную), в условиях, которые обеспечивают образование амидной связи. Защитную группу затем удаляют с вновь образованного аминокислотного остатка, и затем добавляют следующую аминокислоту (должным образом защищенную), и так далее. После связывания требуемых аминокислот с образованием надлежащей последовательности, все оставшиеся защитные группы (и любые твердые основы при использовании способа твердофазного синтеза) удаляют последовательно или одновременно для получения конечного полипептида. Простой модификацией данной общей процедуры возможно добавить более одной аминокислоты в один момент к растущей цепи, например, путем связывания (в условиях, которые не обуславливают рацемизацию хиральных центров) защищенного трипептида с защищенным надлежащим образом дипептидом с образованием после депротекции пептапептида. См., например, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984) и G. Barany and R. B.Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, vol. 2, (Academic Press, New York, 1980), pp. 3-254, для способов твердофазного пептидного синтеза; и M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Berlin 1984) and E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis. Synthesis. Biology, Vol.1, для классического синтеза в растворе. Данные способы обычно применяются для относительно малых полипептидов, т.е., до 50-100 аминокислот в длину, но также применяются к более протяженным полипептидам.Peptide reagents can be chemically synthesized in a conventional manner, for example, by any of several methods that are known to those skilled in the art of peptide chemistry. In general, these methods utilize the sequential addition of one or more amino acids to the growing peptide chain. Typically, the amino and carboxyl group of the first amino acid is protected with a suitable protecting group. The protective or derivatized amino acid can then be attached to an inert solid base or used in solution by adding the following amino acid to a sequence having a suitably protected complementary group (amino or carboxylic) under conditions that allow for the formation of an amide bond. The protecting group is then removed from the newly formed amino acid residue, and then the next amino acid (properly protected) is added, and so on. After binding of the required amino acids to form the proper sequence, all remaining protective groups (and any solid bases using the solid-phase synthesis method) are removed sequentially or simultaneously to obtain the final polypeptide. By a simple modification of this general procedure, it is possible to add more than one amino acid at a time to the growing chain, for example, by linking (under conditions that do not cause racemization of the chiral centers) the protected tripeptide to a properly protected dipeptide to form a peptide after deprotection. See, e.g., JM Stewart and JD Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984) and G. Barany and RB Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, vol. 2, (Academic Press, New York, 1980), pp. 3-254, for methods of solid-phase peptide synthesis; and M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Berlin 1984) and E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis. Synthesis Biology, Vol. 1, for classical synthesis in solution. These methods are usually applied to relatively small polypeptides, i.e., up to 50-100 amino acids in length, but also apply to longer polypeptides.

Обычные защитные группы включают в себя трет-бутоксикарбонил (Boc), 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc), бензилоксикарбонил (Cbz); п-толуолсульфонил (Tx); 2,4-динитрофенил; бензил (Bzl); бифенилизопропилоксикарбонилоксикарбонил, трет-амилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, о-бромбензилоксикарбонил, циклогексил, изопропил, ацетил, о-нитрофенилсульфонил и тому подобное. Typical protecting groups include tert-butoxycarbonyl (Boc), 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), benzyloxycarbonyl (Cbz); p-toluenesulfonyl (Tx); 2,4-dinitrophenyl; benzyl (Bzl); biphenylisopropyloxycarbonyloxycarbonyl, tert-amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, o-bromobenzyloxycarbonyl, cyclohexyl, isopropyl, acetyl, o-nitrophenylsulfonyl and the like.

Обычные твердые основы являются перекрестно связанными полимерными основами. Они могут включать в себя перекрестно связанные полимеры на основе стирола, например сополимеры дивинилбензола-гидроксиметилстирола, сополимеры дивинилбензола-хлорметилстирола и сополимеры дивинилбензола-бензгидриламинополистирола.Conventional solid bases are cross-linked polymer bases. These may include cross-linked styrene-based polymers, for example divinylbenzene-hydroxymethylstyrene copolymers, divinylbenzene-chloromethylstyrene copolymers and divinylbenzene-benzhydrylaminopolystyrene copolymers.

Синтез пептоида, содержащего полимеры, может проводиться, например, по патенту США № 5877278; 6033631; Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367.The synthesis of a peptoid containing polymers can be carried out, for example, according to US patent No. 5877278; 6,033,631; Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367.

Пептидный реагент по настоящему изобретению также может быть получен химически другими способами, такими как способ одновременного множественного пептидного синтеза. См., например, Houghten Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 5131-5135; патент США № 4631211. The peptide reagent of the present invention can also be obtained chemically by other methods, such as a simultaneous multiple peptide synthesis method. See, for example, Houghten Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 5131-5135; U.S. Patent No. 4,631,211.

IV. АнтителаIV. Antibodies

Кроме того, описанные здесь пептидные реагенты, применяемые по изобретению, могут использоваться для получения антител. В некоторых вариантах осуществления антитела, полученные против данных пептидных реагентов, специфичны в отношении патогенных прионов. В других вариантах осуществления антитела связываются с патогенной и непатогенной формами. В дальнейших вариантах осуществления антитела специфичны в отношении непатогенных изоформ. Необязательно, описанные здесь антитела ингибируют преобразование непатогенной формы в патогенную конформацию. Обычно антитела по изобретению получают путем введения описанного здесь пептидного реагента (или полинуклеотида, кодирующего такой пептидный реагент) животному. Способы также могут включать в себя выделение из животного антител.In addition, the peptide reagents described herein used according to the invention can be used to produce antibodies. In some embodiments, antibodies produced against these peptide reagents are specific for pathogenic prions. In other embodiments, the antibodies bind to pathogenic and non-pathogenic forms. In further embodiments, the antibodies are specific for non-pathogenic isoforms. Optionally, the antibodies described herein inhibit the conversion of a non-pathogenic form to a pathogenic conformation. Typically, antibodies of the invention are prepared by administering a peptide reagent described herein (or a polynucleotide encoding such a peptide reagent) to an animal. The methods may also include the isolation of animal antibodies.

Антитела по изобретению могут быть препаратами поликлональных или моноклональных антител, моноспецифическими антисыворотками, человеческими антителами, или могут представлять собой гибридные или химерные антитела, такие как гуманизированные антитела, измененные антитела, (Fab')₂-фрагменты, F(ab)-фрагменты, Fv-фрагменты, однодоменные антитела, димерные или тримерные фрагменты или конструкции антител, минитела, или их функциональные фрагменты, которые связываются с интересующим антигеном.Antibodies of the invention may be polyclonal or monoclonal antibody preparations, monospecific antisera, human antibodies, or may be hybrid or chimeric antibodies, such as humanized antibodies, altered antibodies, (Fab ') ₂ fragments, F (ab) fragments, Fv - fragments, single-domain antibodies, dimeric or trimeric fragments or constructs of antibodies, minitel, or their functional fragments that bind to the antigen of interest.

Антитела продуцируют с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области и описанных например, в патенте США № 4011308; 4722890; 4016043; 3876504; 3770380; и 4372745. Например, поликлональные антитела получают путем иммунизации подходящего животного, такого как мышь, крыса, кролик, овца, или коза, интересующим антигеном (например, описанным здесь пептидным реагентом). Для усиления иммуногенности антиген может быть связан с носителем перед иммунизацией. Таким носители хорошо известны обычным специалистам в данной области. Иммунизацию в общем проводят путем смешивания или эмульгирования антигена в солевом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, и путем парентеральной инъекции эмульсии (в общем, подкожно или внутримышечно). Животное, в общем, повторно стимулируют через 2-6 недели одной или несколькими инъекциями антигена в солевом растворе, предпочтительно, с использованием неполного адъюванта Фрейнда. Антитела также могут генерироваться путем иммунизации in vitro с использованием способов, известных в данной области. Затем от иммунизированного животного получают поликлональную антисыворотку.Antibodies are produced using methods well known to those skilled in the art and described, for example, in US Pat. No. 4,011,308; 4,722,890; 4016043; 3,876,504; 3,770,380; and 4372745. For example, polyclonal antibodies are obtained by immunizing a suitable animal, such as a mouse, rat, rabbit, sheep, or goat, with an antigen of interest (for example, the peptide reagent described herein). To enhance immunogenicity, an antigen may be coupled to a carrier prior to immunization. Such carriers are well known to those of ordinary skill in the art. Immunization is generally carried out by mixing or emulsifying the antigen in saline, preferably in an adjuvant, such as Freund's complete adjuvant, and by parenteral injection of the emulsion (generally, subcutaneously or intramuscularly). The animal, in General, re-stimulated after 2-6 weeks with one or more injections of antigen in saline, preferably using incomplete Freund's adjuvant. Antibodies can also be generated by in vitro immunization using methods known in the art. Then, a polyclonal antiserum is obtained from the immunized animal.

Моноклональные антитела в общем получают с использованием способа Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497 или по его модификации. Обычно мышь или крысу иммунизируют, как описано выше. Однако вместо забора у животного крови для выделения сыворотки у него удаляют селезенку (и необязательно несколько больших лимфоузлов) и разделяют на отдельные клетки. Если требуется, клетки селезенки могут подвергаться скринингу (после удаления неспецифично прилипающих клеток) путем нанесения клеточной суспензии на планшет или лунку, покрытую антигеном. B-клетки, экспрессирующие мембраносвязанный иммуноглобулин, специфичный для антигена, будут связываться с планшетом и не будут смываться с оставшейся суспензией. Полученные в результате В-клетки или все диссоциированные клетки селезенки затем индуцируют для слияния с миеломными клетками с образованием гибридом и культивируют в селективной среде (например, среда гипоксантин, аминоптерин, тимидин, «HAT»). Полученные в результате гибридомы высевают путем лимитирующих разведений и анализируют на продукцию антител, которые специфично связываются с иммунизирующим антигеном (и которые не связываются с неродственными антигенами). Выбранные секретирующие моноклональное антитело гибридомы затем культивируют in vitro (например, в бутылках для культуры ткани или реактор с полыми волокнами), или in vivo (например, в асцитах у мышей). Monoclonal antibodies are generally prepared using the method of Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497 or a modification thereof. Typically, a mouse or rat is immunized as described above. However, instead of collecting blood from an animal, a spleen (and optionally several large lymph nodes) is removed and separated into separate cells. If required, spleen cells can be screened (after removal of non-adherent cells) by applying a cell suspension to a plate or well coated with antigen. B cells expressing a membrane-bound antigen-specific immunoglobulin will bind to the plate and will not wash off with the remaining suspension. The resulting B cells or all dissociated spleen cells are then induced to fuse with myeloma cells to form hybridomas and cultured in selective medium (eg, hypoxanthine, aminopterin, thymidine, “HAT” medium). The resulting hybridomas are seeded by limiting dilutions and analyzed for the production of antibodies that specifically bind to the immunizing antigen (and which do not bind to unrelated antigens). Selected monoclonal antibody-secreting hybridomas are then cultured in vitro (e.g., in tissue culture bottles or a hollow fiber reactor), or in vivo (e.g., in ascites in mice).

Гуманизированные и химерные антитела также могут использоваться по изобретению. Молекулы гибридного (химерного) антитела в общем обсуждаются в Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299 и патенте США № 4816567. Humanized antibody molecules are generally discussed in Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534-1536; и публикации патента Великобритании № GB 2276169, опубликованные 21 сентября 1994 г.). Один из подходов для конструирования гуманизированного антитела использует клонирование рекомбинантной ДНК, содержащей промотор, лидер и последовательности вариабельной области из гена мышиного антитела и экзоны константной области из гена человеческого антитела с образованием мышино-человеческого антитела, гуманизированного антитела. См., в общем, Kuby, "Immunology, 3rd Edition", W. H. Freeman and Company, New York (1998) на странице 136.Humanized and chimeric antibodies can also be used according to the invention. Hybrid (chimeric) antibody molecules are generally discussed in Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299 and US patent No. 4816567. Humanized antibody molecules are generally discussed in Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534-1536; and British Patent Publication No. GB 2276169, published September 21, 1994). One approach for constructing a humanized antibody involves cloning a recombinant DNA containing a promoter, leader, and variable region sequences from a mouse antibody gene and constant region exons from a human antibody gene to form a mouse-human antibody, a humanized antibody. See, in general, Kuby, "Immunology, 3rd Edition", W. H. Freeman and Company, New York (1998) on page 136.

Антитела, как моноклональные, так и поликлональные, которые направлены против описанных здесь пептидных реагентов, особенно применимы в диагностических и терапевтических применениях, например, те антитела, которые являются нейтрализующими, могут использоваться в пассивной иммунотерапии. Моноклональные антитела, в частности, могут использоваться для получения антиидиотипических антител.Antibodies, both monoclonal and polyclonal, which are directed against the peptide reagents described herein, are particularly useful in diagnostic and therapeutic applications, for example, those antibodies that are neutralizing can be used in passive immunotherapy. Monoclonal antibodies, in particular, can be used to obtain anti-idiotypic antibodies.

Антиидиотипические антитела представляют собой иммуноглобулины, которые несут «внутреннее изображение» антигена агента, против которого требуется защита. Способы получения антиидиотипических антител известны в данной области. См., например, Grzych (1985), Nature 316: 74; MacNamara et al. (1984), Science 226: 1325, Uytdehaag et al (1985), J. Immunol. 134: 1225. Данные антиидиотипические антитела могут использоваться для лечения и/или диагностики конформационных заболеваний.Anti-idiotypic antibodies are immunoglobulins that carry an “internal image” of the antigen of the agent against which protection is required. Methods for producing anti-idiotypic antibodies are known in the art. See, for example, Grzych (1985), Nature 316: 74; MacNamara et al. (1984), Science 226: 1325, Uytdehaag et al (1985), J. Immunol. 134: 1225. These anti-idiotypic antibodies can be used to treat and / or diagnose conformational diseases.

Фрагменты антитела также входят в объем изобретения. В данной области известно некоторое количество фрагментов антитела, которые содержат антигенсвязывающие участки, способные проявлять свойства иммунологического связывания интактной молекулы антитела. Например, функциональные фрагменты антитела могут продуцироваться путем отщепления константной области, не отвечающей за связывание антигена, от молекулы антитела, например, с использованием пепсина, с продукцией F(ab')₂-фрагментов. Данные фрагменты содержат два антигенсвязывающих участка, но не содержат часть константной области из каждой тяжелой цепи. Сходным образом, если требуется, могут продуцироваться Fab-фрагменты, содержащие единичный участок связывания антитела, например, путем расщепления поликлональных или моноклональных антител папаином. Функциональные фрагменты, включающие только вариабельные области тяжелых и легких цепей, также могут продуцироваться с использованием стандартных способов, таких как рекомбинантная продукция или преимущественное протеолитическое расщепление иммуноглобулиновых молекул. Данные фрагменты известны как F_ν. См., например, Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci USA 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15: 2706-2710; и Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096. Antibody fragments are also included in the scope of the invention. A number of antibody fragments are known in the art that contain antigen binding sites capable of exhibiting immunological binding properties of an intact antibody molecule. For example, functional antibody fragments can be produced by cleaving a constant region that is not responsible for antigen binding from an antibody molecule, for example, using pepsin, with the production of F (ab ') ₂ fragments. These fragments contain two antigen-binding sites, but do not contain part of the constant region from each heavy chain. Similarly, if desired, Fab fragments containing a single antibody binding site can be produced, for example, by cleaving polyclonal or monoclonal antibodies with papain. Functional fragments, including only the variable regions of the heavy and light chains, can also be produced using standard methods, such as recombinant production or predominant proteolytic cleavage of immunoglobulin molecules. These fragments are known as F _ν . See, for example, Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci USA 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15: 2706-2710; and Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096.

Одноцепочечный Fv-полипептид («sFv» или «scFv») представляет собой ковалентно связанный гетеродимер V_H-V_L, который экспрессируется с гена слияния, включающего V_H- и V_L-кодирующие гены, соединенные кодирующим пептид линкером. Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Описано несколько способов для распознавания и разработки химических структур (линкеров) для преобразования агрегированных в природе, но разделенных химически легких и тяжелых полипептидных цепей из V-области антитела в молекулу sFv, которая будет сворачиваться в трехмерную структуру, по существу, сходную со структурой антигенсвязывающего участка. См., например, патент США № 5091513; 5132405; и 4946778. Молекулы sFv могут продуцироваться с использованием способов, описанных в данной области. См., например, Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci USA 85: 5879-5338; патент США № 5091513; 5132405 и 4946778. Критерии конструирования включают определение подходящей длины для охвата расстояния C-конца одной цепи и N-конца другой, где линкер в общем, образуется из малых гидрофобных аминокислотных остатков, которые не сворачиваются или не образуют вторичной структуры. Такие способы описаны в данной области. См., например, патент США № 5091513; 5132405 и 4946778. Подходящие линкеры, в общем, включают в себя полипептидные цепи из перемежающихся наборов глициновых и сериновых остатков и могут включать в себя остатки глутаминовой кислоты и лизина, встроенные для повышения растворимости.A single chain Fv polypeptide (“sFv” or “scFv”) is a covalently linked V _H -V _L heterodimer that is expressed from a fusion gene including V _H and V _L coding genes linked by a peptide-linking linker. Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Several methods have been described for the recognition and development of chemical structures (linkers) for converting naturally aggregated but separated chemically light and heavy polypeptide chains from the V region of an antibody into an sFv molecule that will fold into a three-dimensional structure essentially similar to the structure of the antigen binding site . See, for example, US patent No. 5091513; 5,132,405; and 4946778. sFv molecules can be produced using methods described in this field. See, for example, Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci USA 85: 5879-5338; US patent No. 5091513; 5132405 and 4946778. Design criteria include determining the appropriate length to encompass the C-terminus of one chain and the N-terminus of the other, where the linker is generally formed from small hydrophobic amino acid residues that do not fold or form a secondary structure. Such methods are described in the art. See, for example, US patent No. 5091513; 5132405 and 4946778. Suitable linkers generally include polypeptide chains from interleaved sets of glycine and serine residues and may include glutamic acid and lysine residues incorporated to increase solubility.

«Мини-антитела» или «минитела» также найдут применение по настоящему изобретению. Минитела представляют собой полипептидные цепи sFv, которые содержат на их C-конце домены олигомеризации, отделенные от sFv шарнирной областью. Pack et al., (1992) Biochem 31: 1579-1584. Домен олигомеризации включает в себя аутоассоциирующиеся α-спирали, например лейциновые застежки, которые могут далее стабилизироваться дополнительными дисульфидными связями. Домен олигомеризации сконструирован так, что он совместим с векторным фолдингом сквозь мембрану процессом, который, как полагают, облегчает фолдинг полипептида in vivo в функциональный связывающий белок. В общем, минитела продуцируются с использованием рекомбинантных способов, хорошо известных в данной области. См., например, Pack et al., (1992) Biochem 31: 1579-1584; Cumber et al. (1992) J. Immunology 149B: 120-126."Mini antibodies" or "minitel" will also find use in the present invention. Minobodies are sFv polypeptide chains that contain oligomerization domains at their C-terminus that are separated from the sFv by a hinge region. Pack et al., (1992) Biochem 31: 1579-1584. The oligomerization domain includes autoassociated α-helices, for example leucine fasteners, which can be further stabilized by additional disulfide bonds. The oligomerization domain is designed to be compatible with vector folding through the membrane by a process that is believed to facilitate folding of the polypeptide in vivo into a functional binding protein. In general, minitel is produced using recombinant methods well known in the art. See, for example, Pack et al., (1992) Biochem 31: 1579-1584; Cumber et al. (1992) J. Immunology 149B: 120-126.

Для получения и идентификации антител могут также использоваться необщепринятые способы. Например, библиотека фагового дисплея может подлежать скринингу на антитела, которые больше связываются с патогенными формами, чем с непатогенными формами, или наоборот. См., в общем, Siegel, "Recombinant Monoclonal Antibody Technology", Transfus. Clin. Biol. (2002) 9(1): 15-22; Sidhu, "Phage Display in Pharmaceutical Biotechnology", Curr.Opin.Biotechnol. (2000) 11(6): 610-616; Sharon, et al.,"Recombinant Polyclonal Antibody Libraries", Comb. Chem. High Throughput Screen (2000) 3(3): 185-196; и Schmitz et al., "Phage Display: A Molecular Tool for the Generation of Antibodies-Review", Placenta, (2000) 21 Suppl A:S 106-12. Unconventional methods can also be used to obtain and identify antibodies. For example, a phage display library may be screened for antibodies that are more associated with pathogenic forms than non-pathogenic forms, or vice versa. See, in general, Siegel, "Recombinant Monoclonal Antibody Technology", Transfus. Clin. Biol. (2002) 9 (1): 15-22; Sidhu, "Phage Display in Pharmaceutical Biotechnology", Curr.Opin. Biotechnol. (2000) 11 (6): 610-616; Sharon, et al., "Recombinant Polyclonal Antibody Libraries", Comb. Chem. High Throughput Screen (2000) 3 (3): 185-196; and Schmitz et al., "Phage Display: A Molecular Tool for the Generation of Antibodies-Review", Placenta, (2000) 21 Suppl A: S 106-12.

Как отмечено выше, антитела могут также генерироваться путем введения животному полинуклеотидной последовательности, кодирующей описанный здесь пептидный реагент. Когда пептид экспрессируется in vivo, антитела генерируются in vivo. Способы доставки полинуклеотидов обсуждаются ниже. As noted above, antibodies can also be generated by introducing an animal polynucleotide sequence encoding the peptide reagent described herein. When a peptide is expressed in vivo, antibodies are generated in vivo. Polynucleotide delivery methods are discussed below.

Специфичность антител по изобретению может тестироваться, как описано выше для пептидных реагентов. Как упоминалось выше, прионы, имеющие патогенную конформацию, в общем, устойчивы к некоторым протеазам, таким как протеиназа K. Те же протеазы способны разрушать прионы в непатогенной конформации. Одним из способов тестирования специфичности антител по настоящему изобретению является отбор биологического образца, содержащего патогенные и непатогенные прионы. Образец может разделяться на равные объемы. Антитела по изобретению могут добавляться адсорбированными на твердую основу (как далее описано ниже) и использоваться для получения количественного значения, непосредственно связанного с числом взаимодействий антитело-прион на твердой основе. Протеаза может добавляться ко второму образцу, и может проводиться тот же тест. Поскольку протеаза во втором образце разрушает любые непатогенные прионы, любые взаимодействия по связыванию пептид-прион во втором образце могут быть отнесены к патогенным прионам. Вариации и другие анализы, известные в данной области, также могут использоваться для демонстрации специфичности антител по изобретению.The specificity of the antibodies of the invention can be tested as described above for peptide reagents. As mentioned above, prions having a pathogenic conformation are generally resistant to certain proteases, such as proteinase K. The same proteases are capable of destroying prions in a non-pathogenic conformation. One of the methods for testing the specificity of antibodies of the present invention is the selection of a biological sample containing pathogenic and non-pathogenic prions. The sample can be divided into equal volumes. Antibodies of the invention can be added adsorbed onto a solid support (as described below below) and used to obtain a quantitative value directly related to the number of antibody-prion interactions on a solid support. Protease can be added to the second sample, and the same test can be performed. Since the protease in the second sample destroys any non-pathogenic prions, any peptide-prion binding interactions in the second sample can be attributed to pathogenic prions. Variations and other assays known in the art can also be used to demonstrate the specificity of the antibodies of the invention.

V. АнализыV. Assays

Пептидные реагенты по изобретению могут использоваться в различных анализах для скрининга образцов (например, биологических образцов, таких как кровь, головной мозг, спинной мозг, ЦСЖ или образцы органов), например, для обнаружения наличия или отсутствия в данных образцах патогенных форм белков конформационного заболевания. В отличие от многих современных реагентов для диагностики прионов описанные здесь пептидные реагенты обеспечат обнаружение по существу любого типа биологического или небиологического образца, включая образец крови, продукты крови или образцы биопсии.The peptide reagents of the invention can be used in various assays to screen samples (e.g., biological samples such as blood, brain, spinal cord, CSF or organ samples), for example, to detect the presence or absence of pathogenic forms of conformational disease proteins in these samples. Unlike many modern prion diagnostic reagents, the peptide reagents described herein will detect essentially any type of biological or non-biological sample, including a blood sample, blood products, or biopsy samples.

Изобретение, таким образом, относится к способу обнаружения патогенного приона в образце, предусматривающем: контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с пептидным реагентом по изобретению, в условиях, которые обеспечивают связывание пептидного реагента и патогенного прионного белка, если он присутствует; и обнаружение в образце патогенного приона, если он присутствует, за счет его связывания с пептидным реагентом.The invention thus relates to a method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising: contacting a sample in which a pathogenic prion is expected to be present with a peptide reagent of the invention under conditions that allow the peptide reagent to be bound to the pathogenic prion protein, if present; and detecting a pathogenic prion in the sample, if present, by binding to the peptide reagent.

Для применения по способу изобретения об образце может быть каким-либо образом известно, или в нем может предполагаться наличие патогенного прионного белка. Образец может представлять собой биологический образец (то есть, образец, полученный из живого или когда-либо жившего организма) или небиологический образец. Подходящие биологические образцы включают в себя в качестве неограничивающих примеров органы, цельную кровь, фракции крови, компоненты крови, плазму, тромбоциты, сыворотку, цереброспинальную жидкость (CSF), ткань головного мозга, ткань нервной системы, мышечную ткань, костный мозг, мочу, слезы, не относящуюся к нервной системе ткань, органы и/или биопсии или некропсии. Предпочтительные биологические образцы включают в себя кровь, фракции крови, компоненты крови, плазму, тромбоциты и сыворотку.For use in the method of the invention, the sample may be known in some way, or the presence of pathogenic prion protein may be suspected in it. The sample may be a biological sample (i.e., a sample obtained from a living or ever living organism) or a non-biological sample. Suitable biological samples include, but are not limited to, organs, whole blood, blood fractions, blood components, plasma, platelets, serum, cerebrospinal fluid (CSF), brain tissue, nervous system tissue, muscle tissue, bone marrow, urine, tears non-nervous system tissue, organs and / or biopsies or necropsy. Preferred biological samples include blood, blood fractions, blood components, plasma, platelets and serum.

Образец контактирует с одним или несколькими пептидным реагентами по изобретению в условиях, которые обеспечивают связывание пептидного(-ых) реагента(-ов) с патогенным прионным белком, если он присутствует в образце. В компетенции обычного специалиста в данной области определение конкретных условий, основанных на данном описании. Обычно образец и пептидный(-ые) реагент(-ы) инкубируют вместе в подходящем буфере примерно при нейтральных pH (например, буфер TBS при 7,5) при подходящей температуре (например, около 4ºC), в течение подходящего периода времени (например, примерно от 1 часа до ночи) для обеспечения связывания.The sample is contacted with one or more peptide reagents of the invention under conditions that allow the peptide reagent (s) to bind to the pathogenic prion protein, if present in the sample. The competence of an ordinary specialist in this field the definition of specific conditions based on this description. Typically, the sample and peptide reagent (s) are incubated together in a suitable buffer at approximately neutral pH (e.g., TBS buffer at 7.5) at a suitable temperature (e.g., about 4ºC), for a suitable period of time (e.g. from about 1 hour to night) to ensure binding.

Наличие патогенного прионного белка в образце выявляется за счет его связывания с пептидным(-и) реагентом(-ами). Обнаружение патогенного прионного белка за счет его связывания с пептидным(-и) реагентом(-ами) по изобретению может выполняться несколькими путями. Например, пептидный(-е) реагент(-ы) по изобретению могут использоваться для специфичного «захвата» патогенного прионного белка путем образования первого комплекса между пептидным(-и) реагентом(-ами) и патогенным прионным белком, причем первый комплекс может быть отделен от несвязанных материалов образца, включающих непатогенный прионный белок, присутствующий в образце. Патогенный прионный белок может затем обнаруживаться путем добавления и связывания одного или нескольких пептидных реагентов по изобретению, причем данные пептидные реагенты мечены со способностью к визуализации (т.е., меченый(-е) пептидный(-е) реагент(-ы)). Патогенный прионный белок может при этом обнаруживаться в первом комплексе, или патогенный прионный белок может диссоциировать с первого комплекса перед добавлением и связыванием с меченым пептидным(ми) реагентом(ами) по изобретению.The presence of pathogenic prion protein in the sample is detected due to its binding to the peptide reagent (s). The detection of pathogenic prion protein by binding to the peptide (s) reagent (s) of the invention can be accomplished in several ways. For example, the peptide (s) reagent (s) of the invention can be used to specifically "capture" pathogenic prion protein by forming a first complex between the peptide (s) reagent (s) and pathogenic prion protein, wherein the first complex can be separated from unbound sample materials, including the non-pathogenic prion protein present in the sample. A pathogenic prion protein can then be detected by the addition and binding of one or more peptide reagents of the invention, wherein these peptide reagents are labeled with visualization ability (i.e., labeled (s) peptide reagent (s)). In this case, a pathogenic prion protein may be detected in the first complex, or a pathogenic prion protein may dissociate from the first complex before addition and binding to the labeled peptide (s) reagent (s) of the invention.

Альтернативно, когда пептидный(-е) реагенты(-ы) по изобретению применяются для захвата патогенного прионного белка, как описано выше, и первый комплекс отделяется от несвязанных материалов образца, меченый и способный к визуализации, связывающий прион реагент может использоваться для обнаружения патогенного прионного белка, при том, что патогенный прионный белок находится в первом комплексе или после диссоциации патогенного прионного белка из первого комплекса. «Связывающий прион реагент» представляет собой реагент, который связывается с прионным белком в любой конформации, обычно связывающий прион реагент связывается с денатурированной формой прионного белка. Такие реагенты описаны и включают в себя, например, антитела против приона (описаны, среди прочих, в Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al.1998 J. Virol. 72: 9413; в патенте США № 6765088; в патенте США № 6537548), гибридные полипептиды с привитыми мотивами (см., WО03/085086), некоторые катионные или анионные полимеры (см., WО03/073106), некоторые пептиды, которые представляют собой «катализаторы размножения» (см., WО02/0974444) и плазминоген. Ясно, что если конкретный используемый связывающий прион реагент связывается с денатурированной формой приона, то «захватываемый» патогенный прионный белок должен быть денатурирован перед обнаружением связывающим прион реагентом.Alternatively, when the peptide (s) reagents (s) of the invention are used to capture pathogenic prion protein, as described above, and the first complex is separated from unbound sample materials, labeled and capable of visualization, prion binding reagent can be used to detect pathogenic prion protein, despite the fact that the pathogenic prion protein is in the first complex or after the dissociation of the pathogenic prion protein from the first complex. A “prion binding reagent” is a reagent that binds to a prion protein in any conformation, typically a prion binding reagent binds to a denatured form of a prion protein. Such reagents are described and include, for example, anti-prion antibodies (described, among others, in Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72: 9413; in US patent No. 6765088; in US patent No. 6537548), hybrid polypeptides with grafted motifs (see, WO03 / 085086), some cationic or anionic polymers (see, WO03 / 073106), some peptides that are “propagation catalysts” (see WO02 / 0974444) and plasminogen. It is clear that if the particular prion binding reagent used binds to the denatured form of the prion, then the “trapped” pathogenic prion protein must be denatured before the prion binding reagent is detected.

В другой альтернативе связывающий прион реагент может использоваться для захвата каких-либо прионов (патогенных или непатогенных), присутствующих в образце, с образованием первого комплекса, и один или несколько меченых и способных к визуализации пептидных реагентов по изобретению может использоваться для обнаружения патогенных прионов в первом комплексе или после диссоциации из первого комплекса.In another alternative, the prion binding reagent can be used to capture any prions (pathogenic or non-pathogenic) present in the sample to form the first complex, and one or more labeled and visualized peptide reagents of the invention can be used to detect pathogenic prions in the first complex or after dissociation from the first complex.

В первой альтернативе образец может захватываться непосредственно (т.е., без какого-либо связывающего прион реагента) на твердой основе, и патогенные прионные белки, если они присутствуют, могут выявляться с использованием одного или нескольких меченых и способных к визуализации реагентов по изобретению.In a first alternative, a sample can be captured directly (i.e., without any prion binding reagent) on a solid basis, and pathogenic prion proteins, if present, can be detected using one or more labeled and visualizable reagents of the invention.

Описанные выше стадии захвата и обнаружения могут проводиться в растворе или могут проводиться в твердой основе или на ней, или с использованием некоторой комбинации раствора и твердой фазы. Некоторые подходящие форматы растворенной фазы включают в себя, например, флуоресцентную корреляционную спектроскопию (см., Giese et al. Arch. Virol. Suppl. 2000 16: 161; Bieschke et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2000 97: 55468) и перенос энергии резонанса флуоресценции. Обычно пептидный(-е) реагент(-ы) по изобретению в данном формате растворенной фазы мечен(-ы) и способный(ые) к визуализации. Предпочтительно, пептидный(-е) реагент(-ы) мечены двумя или большим количеством различимых между собой выявляемых меток. Наличие патогенного прионного белка может обнаруживаться за счет сочетания двух или нескольких выявляемых меток в первом комплексе. Подходящие форматы твердофазных анализов описаны здесь. В основном в твердофазных форматах реагент захвата (который может представлять собой один или несколько пептидных реагентов по изобретению или один или несколько связывающих прион реагентов) присоединяется или адаптируется для присоединения к твердой основе. Реагент захвата может адаптироваться для присоединения к твердой основе любыми средствами, известными в данной области, например, реагент захвата и твердая основа оба могут включать в себя одного из представителей пары связывания, так что, когда реагент захвата контактирует с твердой основой, связующий реагент связывается с твердой основой посредством связывания представителей пары связывания.The capture and detection steps described above can be carried out in solution or can be carried out in or on a solid base, or using some combination of solution and solid phase. Some suitable dissolved phase formats include, for example, fluorescence correlation spectroscopy (see Giese et al. Arch. Virol. Suppl. 2000 16: 161; Bieschke et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2000 97: 55468) and fluorescence resonance energy transfer. Typically, the peptide (s) reagent (s) of the invention in this dissolved phase format are labeled (s) and capable of visualization. Preferably, the peptide (s) reagent (s) are labeled with two or more distinct detectable labels. The presence of pathogenic prion protein can be detected by a combination of two or more detectable labels in the first complex. Suitable solid phase analysis formats are described herein. Basically, in solid phase formats, a capture reagent (which may be one or more peptide reagents of the invention or one or more prion binding reagents) is attached or adapted to attach to a solid base. The capture reagent can be adapted to attach to the solid support by any means known in the art, for example, the capture reagent and the solid support can both include one of a pair of binding pairs, so that when the capture reagent is in contact with the solid support, the binding reagent binds to a solid base by binding members of a binding pair.

Например, реагент захвата может включать в себя биотин, а основа может содержать авидин или стрептавидин. В дополнение к биотин-авидину и биотин-стрептавидину, другие подходящие пары связывания для данного варианта осуществления включают в себя, например, антиген-антитело, гаптен-антитело, миметоп-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A - Fc антитела. Такие пары связывания хорошо известны (см., например, патент США № 6551843 и 6586193), и обычный специалист в данной области будет компетентен в выборе подходящей пары связывания и адаптирует их для применения по настоящему изобретению. Когда реагент захвата адаптируется для присоединения к основе, как описано выше, образец может контактировать с реагентом захвата до и после того, как реагент захвата будет присоединяться к основе.For example, the capture reagent may include biotin, and the base may contain avidin or streptavidin. In addition to biotin-avidin and biotin-streptavidin, other suitable binding pairs for this embodiment include, for example, antigen antibody, hapten antibody, mimetop antibody, hormone receptor, ligand receptor, antagonist agonist, lectin -carbohydrate, protein A - Fc antibodies. Such binding pairs are well known (see, for example, US Pat. Nos. 6,551,843 and 6,586,193), and one of ordinary skill in the art will be competent to select the appropriate binding pair and will adapt them for use in the present invention. When the capture reagent is adapted to attach to the base, as described above, the sample can be contacted with the capture reagent before and after the capture reagent is attached to the base.

Изобретение, таким образом, относится к способу обнаружения патогенного приона в образце, предусматривающем:The invention thus relates to a method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:

(a) контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с первым пептидным реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание первого пептидного реагента с патогенным прионным белком, если он присутствует, с образованием первого комплекса; и (a) contacting a sample in which a pathogenic prion is suspected to be present with the first peptide reagent under conditions that allow the first peptide reagent to bind to the pathogenic prion protein, if present, to form the first complex; and

(b) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце путем его связывания с первым пептидным реагентом. (b) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to the first peptide reagent.

Пептидный реагент соответствует описанному здесь, предпочтительно, пептидный реагент получают из пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 12-132, более предпочтительно, из пептида, имеющего последовательность, соответствующую одной из SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 132; или из пептидов, имеющих SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 или 128; или из пептидов, имеющих SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, или 84. Пептидный реагент может быть биотинилирован. Пептидный реагент может быть присоединен к твердой основе. В некоторых вариантах осуществления пептидный реагент может быть меченым и способным к визуализации.The peptide reagent is as described herein, preferably the peptide reagent is obtained from a peptide having the sequence of SEQ ID NOS: 12-132, more preferably a peptide having a sequence corresponding to one of SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 132; or from peptides having SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 or 128; or from peptides having SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, or 84. The peptide reagent may be biotinylated. The peptide reagent may be attached to a solid base. In some embodiments, the peptide reagent may be labeled and capable of visualization.

Изобретение также относится к способу обнаружения патогенного приона в образце, предусматривающему: The invention also relates to a method for detecting pathogenic prion in a sample, comprising:

(a) контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с первым пептидным реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание первого пептидного реагента с патогенным прионом, если он присутствует, с образованием первого комплекса; (a) contacting a sample in which the presence of a pathogenic prion is expected with the first peptide reagent under conditions that allow the first peptide reagent to bind to the pathogenic prion, if present, to form the first complex;

(b) контактирование указанного первого комплекса со вторым пептидным реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание второго пептидного реагента с патогенным прионом в указанном первом комплексе, где указанный второй пептидный реагент включает в себя выявляемую метку; и (b) contacting said first complex with a second peptide reagent under conditions that allow the second peptide reagent to bind to a pathogenic prion in said first complex, wherein said second peptide reagent includes a detectable label; and

(c) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце путем его связывания с вторым пептидным реагентом. (c) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to a second peptide reagent.

Когда в способе используется первый пептидный реагент и второй пептидный реагент, первый и второй пептидные реагенты могут быть одинаковыми или различными. Под «одинаковыми» подразумевается, что первый и второй пептидные реагенты различаются только включением во второй пептидный реагент выявляемой метки.When the first peptide reagent and the second peptide reagent are used in the method, the first and second peptide reagents may be the same or different. By "identical" is meant that the first and second peptide reagents differ only by the inclusion of a detectable label in the second peptide reagent.

Первый пептидный реагент и второй пептидный реагент может быть получен из пептидных фрагментов из одной области прионного белка или из пептидных фрагментов из различных областей прионного белка. Первый пептидный реагент и второй пептидный реагент могут быть независимо выбраны из пептидных реагентов, полученных из пептидов, характеризующихся SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, или 132. The first peptide reagent and the second peptide reagent can be obtained from peptide fragments from one region of a prion protein or from peptide fragments from different regions of a prion protein. The first peptide reagent and the second peptide reagent can be independently selected from peptide reagents derived from peptides characterized by SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, or 132.

Первый пептидный реагент и второй пептидный реагент могут быть независимо выбраны из пептидных реагентов, полученных из пептидов, характеризующихся SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, и 84. The first peptide reagent and the second peptide reagent can be independently selected from peptide reagents derived from peptides characterized by SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, and 84.

Первый пептидный реагент может быть выбран из пептидного реагента, полученного из пептидов, характеризующихся SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, или 127, и второй пептидный реагент может быть выбран из пептидного реагента, полученного из пептидов, характеризующихся SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, или 132, или наоборот. Первый пептидный реагент может быть выбран из пептидного реагента, полученного из пептидов, характеризующихся SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, или 127, и второй пептидный реагент может быть выбран из пептидного реагента, полученного из пептидов, характеризующихся SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, и 84, или наоборот. Первый пептидный реагент может быть выбран из пептидного реагента, полученного из пептидов, характеризующихся SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, или 132, и второй пептидный реагент может быть выбран из пептидного реагента, полученного из пептидов, характеризующихся SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, и 84, или наоборот.The first peptide reagent may be selected from a peptide reagent derived from peptides characterized by SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124 , 125, 126, or 127, and the second peptide reagent may be selected from a peptide reagent derived from peptides characterized by SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, or 132, or vice versa. The first peptide reagent may be selected from a peptide reagent derived from peptides characterized by SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124 , 125, 126, or 127, and the second peptide reagent may be selected from a peptide reagent derived from peptides characterized by SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, and 84, or vice versa. The first peptide reagent may be selected from a peptide reagent derived from peptides characterized by SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113 , 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, or 132, and the second peptide reagent may be selected from a peptide reagent derived from peptides characterized by SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, and 84, or vice versa.

Первый пептидный реагент может быть биотинилированным или может присоединяться к твердой основе.The first peptide reagent may be biotinylated or may attach to a solid base.

Изобретение также относится к способу обнаружения патогенного приона в образце, предусматривающему:The invention also relates to a method for detecting pathogenic prion in a sample, comprising:

(a) контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с первым пептидным реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание первого пептидного реагента с патогенным прионным белком, если он присутствует, с образованием первого комплекса; (a) contacting a sample in which a pathogenic prion is suspected to be present with the first peptide reagent under conditions that allow the first peptide reagent to bind to the pathogenic prion protein, if present, to form the first complex;

(b) удаление несвязанных материалов образца; (b) removal of unbound sample materials;

(c) диссоциацию указанного патогенного приона с указанного первого комплекса; (c) dissociating said pathogenic prion from said first complex;

(d) контактирование указанного диссоциированного патогенного приона со вторым пептидным реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание второго пептидного реагента с патогенным прионом, где указанный второй пептидный реагент включает в себя выявляемую метку; и (d) contacting said dissociated pathogenic prion with a second peptide reagent under conditions that allow binding of the second peptide reagent to a pathogenic prion, wherein said second peptide reagent includes a detectable label; and

(e) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце за счет его связывания со вторым пептидным реагентом. Первый и второй пептидные реагенты могут быть одинаковыми или различными. (e) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to the second peptide reagent. The first and second peptide reagents may be the same or different.

Изобретение также относится к способу обнаружения патогенного приона в образце, предусматривающему: The invention also relates to a method for detecting pathogenic prion in a sample, comprising:

(a) контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с первым пептидным реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание первого пептидного реагента с патогенным прионным белком, если он присутствует, с образованием первого комплекса; (a) contacting a sample in which a pathogenic prion is suspected to be present with the first peptide reagent under conditions that allow the first peptide reagent to bind to the pathogenic prion protein, if present, to form the first complex;

(b) удаление несвязанных материалов образца; (b) removal of unbound sample materials;

(c) диссоциацию указанного патогенного приона с указанного первого комплекса; (c) dissociating said pathogenic prion from said first complex;

(d) контактирование указанного диссоциированного патогенного приона со связывающим прион реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание связывающего прион реагента с патогенным прионом, где указанный связывающий прион реагент включает в себя выявляемую метку; и (d) contacting said dissociated pathogenic prion with a prion binding reagent under conditions that allow binding of a prion binding reagent to a pathogenic prion, wherein said prion binding reagent includes a detectable label; and

(e) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце за счет его связывания со связывающим прион реагентом. Связывающий прион реагент может представлять собой антитело против приона, гибридный полипептид с привитым мотивом, катионные или анионные полимеры, катализаторы размножения и плазминоген, или любой другой радикал, который, как известно, связывает прионные белки. (e) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to a prion binding reagent. The prion binding reagent can be an anti-prion antibody, a hybrid grafted polypeptide, cationic or anionic polymers, propagation catalysts and plasminogen, or any other radical that is known to bind prion proteins.

Изобретение также относится к способу обнаружения патогенного приона в образце, предусматривающему: The invention also relates to a method for detecting pathogenic prion in a sample, comprising:

(a) контактактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, со связывающим прион реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание связывающего прион реагента с патогенным прионным белком, если он присутствует, с образованием первого комплекса; (a) contacting a sample in which the presence of a pathogenic prion is expected with a prion binding reagent under conditions that allow binding of the prion binding reagent to the pathogenic prion protein, if present, to form the first complex;

(b) удаление несвязанных материалов образца; (b) removal of unbound sample materials;

(с) контактирование указанного первого комплекса с пептидным реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание пептидного реагента с патогенным прионом, где указанный второй пептидный реагент включает в себя выявляемую метку; и (c) contacting said first complex with a peptide reagent under conditions that allow binding of the peptide reagent to a pathogenic prion, wherein said second peptide reagent includes a detectable label; and

(d) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце за счет его связывания с пептидным реагентом.(d) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to a peptide reagent.

Изобретение также относится к способу обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающему: The invention also relates to a method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:

(a) получение твердой основы, содержащей первый пептидный реагент;(a) obtaining a solid base containing the first peptide reagent;

(b) контактирование твердой основы с образцом в условиях, которые обеспечивают связывание патогенных прионов, если они присутствуют в данном образце, с первым пептидным реагентом; (b) contacting the solid base with the sample under conditions that allow the binding of pathogenic prions, if present in the sample, to the first peptide reagent;

(c) контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации вторым пептидным реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание второго пептидного реагента с патогенными прионами, связанными с первым пептидным реагентом; и (c) contacting the solid base with a labeled and visualizable second peptide reagent under conditions that allow the second peptide reagent to bind to pathogenic prions associated with the first peptide reagent; and

(d) выявление комплексов, образованных между первым пептидным реагентом, патогенным прионом из образца и вторым пептидным реагентом, с выявлением за счет этого присутствия патогенного приона в образце.(d) detecting complexes formed between the first peptide reagent, the pathogenic prion from the sample and the second peptide reagent, thereby detecting the presence of the pathogenic prion in the sample.

Альтернативно на твердой основе может предоставляться связывающий прион реагент. Изобретение, таким образом, относится к способу обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающему:Alternatively, a prion binding reagent may be provided on a solid basis. The invention thus relates to a method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:

(a) получение твердой основы, содержащей связывающий прион реагент;(a) obtaining a solid base containing a prion binding reagent;

(b) контактирование твердой основы с образцом в условиях, которые обеспечивают связывание патогенных прионов, если они присутствуют в данном образце, со связывающим прион реагентом; (b) contacting the solid base with a sample under conditions that allow the binding of pathogenic prions, if present in the sample, to a prion binding reagent;

(c) контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации вторым пептидным реагентом; и (c) contacting the solid base with a labeled and visualizable second peptide reagent; and

(d) выявление комплексов, образованных между связывающим прион реагентом, патогенным прионом из биологического образца и вторым пептидным реагентом.(d) detecting complexes formed between a prion binding reagent, a pathogenic prion from a biological sample, and a second peptide reagent.

Анализ может предоставляться в конкурентном формате; таким образом, изобретение относится к способу обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающему:Analysis may be provided in a competitive format; the invention thus relates to a method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:

(a) получение твердой основы, содержащей первый пептидный реагент;(a) obtaining a solid base containing the first peptide reagent;

(b) комбинацию твердой основы с выявляемо меченым первым лигандом, причем сродство связывания первого пептидного реагента с меченым и способным к визуализации первым лигандом слабее, чем сродство связывания первого пептидного реагента с патогенным прионом;(b) a combination of a solid base with a detectably labeled first ligand, wherein the affinity of binding of the first peptide reagent to the labeled and visualizable first ligand is weaker than the affinity of binding of the first peptide reagent to a pathogenic prion;

(c) комбинацию образца с твердой основой в условиях, которые позволяют патогенному приону, когда он присутствует в образце, связываться с первым пептидным реагентом и вытеснять первый лиганд; и (c) combining the sample with a solid base under conditions that allow the pathogenic prion, when present in the sample, to bind to the first peptide reagent and displace the first ligand; and

(d) выявление комплексов, образованных между первым пептидным реагентом и патогенным прионом из образца.(d) detecting complexes formed between the first peptide reagent and the pathogenic prion from the sample.

В основном, описанные здесь пептидные реагенты используют для связывания прионных белков в образце (например, в качестве реагента захвата) и/или для обнаружения прионных белков (например, в качестве реагентов обнаружения). Реагент захвата и реагент обнаружения могут быть различными молекулами или, альтернативно, одна молекула может служить для функций захвата и обнаружения. В некоторых осуществлениях реагент захвата и/или обнаружения представляют собой описанные здесь пептидные реагенты, которые взаимодействуют преимущественно с патогенными прионами (т.е., специфичны в отношении патогенного приона). В других вариантах осуществления реагент захвата специфичен в отношении патогенных прионов, и реагент обнаружения связывается с патогенными и непатогенными прионами, например это антитела, которые связываются с прионными белками. Такие связывающие прион реагенты описаны здесь выше. Альтернативно, в других вариантах осуществления реагент захвата не специфичен в отношении патогенных прионов, и реагент обнаружения специфичен в отношении патогенных прионов.Basically, the peptide reagents described herein are used to bind prion proteins in a sample (e.g., as a capture reagent) and / or to detect prion proteins (e.g., as detection reagents). The capture reagent and the detection reagent may be different molecules or, alternatively, one molecule may serve for capture and detection functions. In some embodiments, the capture and / or detection reagent are peptide reagents described herein that interact predominantly with pathogenic prions (i.e., are specific for a pathogenic prion). In other embodiments, the capture reagent is specific for pathogenic prions, and the detection reagent binds to pathogenic and non-pathogenic prions, for example, antibodies that bind to prion proteins. Such prion binding reagents are described hereinabove. Alternatively, in other embodiments, the capture reagent is not specific for pathogenic prions, and the detection reagent is specific for pathogenic prions.

Для идентификации связывания между описанным здесь пептидным реагентом и прионным белком может использоваться любой подходящий способ обнаружения. Например, описанные здесь анализы могут включать в себя применение меченых пептидных реагентов или антител. Выявляемые метки, подходящие для применения по изобретению, включают в себя любые молекулы, подходящие для обнаружения, включая в качестве неограничивающих примеров радиоактивные изотопы, флуорофоры, хемилюминофоры, хромофоры, флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы, ферменты, субстраты ферментов, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, хромофоры, красители, ионы металлов, золи металлов, лиганды (например, биотин или гаптены) и тому подобное. Дополнительные метки включают в себя в качестве неограничивающих примеров те, что используют флуоресценцию, включая те вещества или их части, которые способны испускать флуоресценцию в выявляемом интервале. Конкретные примеры меток, которые могут использоваться по изобретению, включают в себя в качестве неограничивающих примеров пероксидазу хрена (HRP), флуоресцеин, FITC, родамин, дансил, умбеллиферон, сложный эфир диметилакридиния (DMAE), техасский красный, люминол, NADPH и β-галактозидазу. Кроме того, выявляемая метка может включать в себя олигонуклеотидную метку, причем данная метка может выявляться любым известным способом выявления нуклеиновой кислоты, включая ПЦР, TMA, b-DNA, NASBA, и т.д.Any suitable detection method may be used to identify the binding between the peptide reagent described herein and the prion protein. For example, the assays described herein may include the use of labeled peptide reagents or antibodies. Identifiable labels suitable for use in the invention include any molecules suitable for detection, including but not limited to radioactive isotopes, fluorophores, chemiluminophores, chromophores, fluorescent semiconductor nanocrystals, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, chromo dyes, metal ions, metal sols, ligands (e.g., biotin or haptens) and the like. Additional labels include, but are not limited to, those that use fluorescence, including those substances or parts thereof that are capable of emitting fluorescence in a detectable range. Specific examples of labels that can be used according to the invention include, but are not limited to, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein, FITC, rhodamine, dansil, umbelliferone, dimethyl acridinium ester (DMAE), Texas red, luminol, NADPH and β-galactosidase . In addition, the detectable label may include an oligonucleotide label, and this label can be detected by any known method for detecting nucleic acid, including PCR, TMA, b-DNA, NASBA, etc.

В дополнение к применению меченых реагентов обнаружения (описанных выше) для отделения пептидных реагентов, которые связываются с прионным белком (например, патогенным прионом) используется иммунопреципитация. Предпочтительно, иммунопреципитация облегчается добавлением средства усиления преципитации. Средство усиления преципитации включает в себя радикалы, которые могут усиливать или повышать преципитацию пептидных реагентов, которые связаны с патогенными прионами. Такие средства усиления преципитации включают в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ), белок G, белок A и тому подобное. Там, где в качестве усиливающих преципитацию средств используют белок G или белок A, белок может, необязательно, присоединяться к грануле, предпочтительно, к магнитной грануле. Преципитация может далее усиливаться применением центрифугирования или применением магнитных сил. Применение таких усиливающих преципитацию средств известно в данной области. In addition to the use of labeled detection reagents (described above), immunoprecipitation is used to separate peptide reagents that bind to a prion protein (e.g., a pathogenic prion). Preferably, immunoprecipitation is facilitated by the addition of a precipitation enhancer. The precipitation enhancer includes radicals that can enhance or increase the precipitation of peptide reagents that are associated with pathogenic prions. Such precipitation enhancing agents include polyethylene glycol (PEG), protein G, protein A and the like. Where Protein G or Protein A is used as precipitation enhancing agents, the protein may optionally attach to a granule, preferably a magnetic granule. Precipitation can be further enhanced by the use of centrifugation or the use of magnetic forces. The use of such precipitation enhancing agents is known in the art.

Также известны анализы, которые амплифицируют сигналы от реагента детекции. Их примеры включают в себя анализы, где используется биотин и авидин, и иммунные анализы, связанные с ферментом и опосредованные им, такие как анализы ELISA.Assays that amplify signals from a detection reagent are also known. Examples thereof include assays using biotin and avidin, and immune assays related to and mediated by the enzyme, such as ELISA assays.

Одна или несколько стадий описанного здесь анализа может проводиться в растворе (например, в жидкой среде) или на твердой основе. Твердая основа для целей изобретения может представлять собой любой материал, который является нерастворимым матриксом, и может иметь жесткую или полужесткую поверхность, к которой может привязываться или присоединяться интересующая молекула (например, пептидные реагенты по изобретению, прионные белки, антитела, и т.д.). Типовые твердые основы включают в себя в качестве неограничивающих примеров такие субстраты, как нитроцеллюлоза, поливинилхлорид; полипропилен, полистирол, латекс, поликарбонат, нейлон, декстран, хитин, песок, силикагель, пемзу, агарозу, целлюлозу, стекло, металл, полиакриламид, силикон, резину, полисахариды, поливинилфторид; диазотированную бумагу; активированные гранулы, гранулы, отвечающие на магнитное поле, и любые материалы, обычно используемые в твердофазном синтезе, аффинных разделениях, очистке, реакциях гибридизации, иммунных анализах и других таких применениях. Основа может представлять собой дисперсные частицы или находиться в виде непрерывной поверхности и включает в себя мембраны, сита, планшеты, шарики, слайды, диски, капилляры, полые волокна, иглы, пины, чипы, твердые волокна, гели (например, силикагели) и гранулы (например, гранулы пористого стекла, силикагели, полистирольные гранулы, необязательно перекрестно связанные с дивинилбензолом, гранулы с привитыми сополимерами, полиакриламидные гранулы, латексные гранулы, гранулы диметилакриламида, необязательно перекрестно связанные с N-N'-бис-акрилилэтилендиамином, магнитные гранулы с оксидом железа и стеклянные частицы, покрытые гидрофобным полимером.One or more of the steps of the analysis described herein may be carried out in solution (for example, in a liquid medium) or on a solid basis. The solid base for the purposes of the invention may be any material that is an insoluble matrix, and may have a rigid or semi-rigid surface to which a molecule of interest can bind or attach (for example, the peptide reagents of the invention, prion proteins, antibodies, etc. ) Exemplary solid bases include, but are not limited to, substrates such as nitrocellulose, polyvinyl chloride; polypropylene, polystyrene, latex, polycarbonate, nylon, dextran, chitin, sand, silica gel, pumice, agarose, cellulose, glass, metal, polyacrylamide, silicone, rubber, polysaccharides, polyvinyl fluoride; diazotized paper; activated granules, magnetic field responsive granules, and any materials commonly used in solid phase synthesis, affinity separation, purification, hybridization reactions, immune assays and other such applications. The base may be dispersed particles or in the form of a continuous surface and includes membranes, sieves, tablets, balls, slides, disks, capillaries, hollow fibers, needles, pins, chips, solid fibers, gels (eg, silica gels) and granules (e.g., porous glass beads, silica gels, polystyrene beads, optionally cross-linked with divinylbenzene, grafted copolymer beads, polyacrylamide beads, latex beads, dimethyl acrylamide beads, optionally cross-linked with N-N'-bis-ac rilylethylenediamine, magnetic granules with iron oxide and glass particles coated with a hydrophobic polymer.

Описанные здесь пептидные реагенты могут легко присоединяться к твердой основе с использованием стандартных способов. Иммобилизация на основе может усиливаться исходным присоединением пептидного реагента к белку (например, когда белок имеет улучшенные свойства связывания с твердой фазой). Подходящие белки связывания включают в себя в качестве неограничивающих примеров такие макромолекулы, как сывороточные альбумины, включая бычий сывороточный альбумин (BSA), гемоцианин морского блюдечка, молекулы иммуноглобулина, тиреоглобулин, овальбумин и другие белки, хорошо известные специалистам в данной области. Другие реагенты, которые могут использоваться для связывания молекул с основой, включают в себя полисахариды, полимолочные кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и тому подобное. Такие молекулы и способы связывания данных молекул с белками, хорошо известны обычным специалистам в данной области. См., например, Brinkley, M. A., (1992) Bioconjugate Chem., 3: 2-13; Hashida et al. (1984) J. Appl.Biochem., 6: 56-63; и Anjaneyulu and Staros (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30: 117- 124.The peptide reagents described herein can easily be attached to a solid base using standard methods. Based immobilization can be enhanced by the initial attachment of the peptide reagent to the protein (for example, when the protein has improved solid phase binding properties). Suitable binding proteins include, but are not limited to, macromolecules such as serum albumin, including bovine serum albumin (BSA), saucer hemocyanin, immunoglobulin molecules, thyroglobulin, ovalbumin, and other proteins well known to those skilled in the art. Other reagents that can be used to bind molecules to the base include polysaccharides, polylactic acids, polymeric amino acids, amino acid copolymers and the like. Such molecules and methods for binding these molecules to proteins are well known to those of ordinary skill in the art. See, for example, Brinkley, M. A., (1992) Bioconjugate Chem., 3: 2-13; Hashida et al. (1984) J. Appl. Biochem., 6: 56-63; and Anjaneyulu and Staros (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30: 117--12.

Если требуется, молекулы, подлежащие добавлению к твердой основе, могут легко функционализоваться с образованием стиролов или акрилатных радикалов, что, таким образом, обеспечивает включение молекул в полистирол, полиакрилат или другие полимеры, такие как полиимид, полиакрилат, полиэтилен, поливинил, полидиацетилен, полифенилен-винилен, полипептид, полисахарид, полисульфон, полипиррол, полиимидазол, политиофен, полиэфир, эпоксиды, кварцевое стекло, силикагель, силоксан, полифосфат, гидрогель, агароза, целлюлоза и тому подобное.If required, the molecules to be added to the solid base can easily function to form styrenes or acrylate radicals, which thus enables the inclusion of molecules in polystyrene, polyacrylate or other polymers such as polyimide, polyacrylate, polyethylene, polyvinyl, polydiacetylene, polyphenylene -vinylylene, polypeptide, polysaccharide, polysulfone, polypyrrole, polyimidazole, polythiophene, polyester, epoxides, silica glass, silica gel, siloxane, polyphosphate, hydrogel, agarose, cellulose and the like.

Пептидные реагенты могут присоединяться к твердой основе посредством взаимодействия пары связывающихся молекул. Такие связывающие пары хорошо известны, и их примеры описаны здесь в других местах. Один из представителей пары связывания присоединяется описанными выше способами к твердой основе, и другой представитель пары связывания присоединяют к пептидному реагенту (до, во время или после синтеза). Модифицированный таким образом пептидный реагент может контактировать с образцом, и в растворе может происходить взаимодействие с патогенными прионом, если он есть, после чего твердая основа может контактировать с пептидным реагентом (или комплексом пептид-прион). Предпочтительные пары связывания для данного варианта осуществления включают в себя биотин и авидин, и биотин и стрептавидин.Peptide reagents can be attached to a solid base through the interaction of a pair of binding molecules. Such binding pairs are well known, and examples thereof are described elsewhere herein. One of the representatives of the binding pair is attached to the solid base by the methods described above, and the other representative of the binding pair is attached to the peptide reagent (before, during or after synthesis). The peptide reagent thus modified can contact the sample, and the solution can interact with pathogenic prion, if any, after which the solid base can contact the peptide reagent (or the peptide-prion complex). Preferred binding pairs for this embodiment include biotin and avidin, and biotin and streptavidin.

Подходящие контроли также могут использоваться в анализах по изобретению. Например, в анализах может использоваться отрицательный контроль PrP^C. Положительный контроль PrP^Sc (или PrPres) также может использоваться в анализах. Такие контроли могут необязательно быть меченым.Suitable controls can also be used in the assays of the invention. For example, a negative PrP ^C control may be used in the assays. The positive control PrP ^Sc (or PrPres) can also be used in assays. Such controls may optionally be labeled.

Некоторые вариации и комбинации с использованием пептидных реагентов по изобретению могут применяться в анализах по изобретению. Следующие неограничивающие примеры, описанные для иллюстрации.Some variations and combinations using the peptide reagents of the invention can be used in the assays of the invention. The following non-limiting examples are described for illustration.

В некоторых вариантах осуществления описаны анализы обнаружения патогенных прионов в биологическом образце. В таких способах пептидный реагент по изобретению может использоваться в качестве реагента захвата патогенных прионов в биологическом или небиологическом образце. В таком варианте осуществления твердая основа (например, магнитные гранулы) вначале взаимодействуют с описанным здесь пептидным реагентом, который преимущественно взаимодействует с патогенными прионами, так что пептидный реагент достаточно иммобилизуются на основе. Твердая основа затем контактирует с образцом, в котором предполагается наличие патогенныех прионов, в условиях, которые позволяют пептидному реагенту связываться с патогенными прионами. После удаления несвязанного материала образца связанные патогенные прионы могут диссоциироваться с пептидного реагента и обнаруживаются с использованием любого другого механизма для обнаружения, включая в качестве неограничивающих примеров вестерн-блот и ELISA, например, как описано выше в примерах и цитируемых здесь ссылках. Альтернативно, связанный патогенный прион может обнаруживаться без диссоциации с пептидного реагента.In some embodiments, pathogen prion detection assays in a biological sample are described. In such methods, the peptide reagent of the invention can be used as a capture reagent for pathogenic prions in a biological or non-biological sample. In such an embodiment, the solid base (e.g., magnetic beads) first interacts with the peptide reagent described herein, which primarily interacts with pathogenic prions, so that the peptide reagent is sufficiently immobilized on the basis. The solid support is then contacted with a sample in which the presence of pathogenic prions is suspected under conditions that allow the peptide reagent to bind to pathogenic prions. After removal of unbound sample material, bound pathogenic prions can be dissociated from the peptide reagent and detected using any other detection mechanism, including but not limited to Western blots and ELISAs, for example, as described above in the examples and references cited here. Alternatively, the associated pathogenic prion can be detected without dissociation from the peptide reagent.

Альтернативно, пептидный реагент по изобретению может контактировать в образце, в котором предполагается наличие патогенныех прионов до присоединения к твердой основе, с последующим присоединением пептидного реагента к твердой основе (например, пептидный реагент может биотинилироваться, и твердая основа может включать в себя авидин или стрептавидин). После удаления несвязанного материала образца патогенные прионы могут диссоциировать с пептидного реагента и обнаруживаются с использованием любого механизма обнаружения, включая в качестве неограничивающих примеров, вестерн-блот и ELISA, например, как описано выше в примерах и цитируемых здесь ссылках. Альтернативно, связанный патогенный прион не обязательно должен диссоциировать с пептидного реагента перед обнаружением.Alternatively, the peptide reagent of the invention may be contacted in a sample in which pathogenic prions are expected to be attached to the solid base, followed by the attachment of the peptide reagent to the solid base (for example, the peptide reagent may be biotinylated and the solid base may include avidin or streptavidin) . After removal of unbound sample material, pathogenic prions can dissociate from the peptide reagent and are detected using any detection mechanism, including, but not limited to, Western blot and ELISA, for example, as described above in the examples and references cited here. Alternatively, the associated pathogenic prion does not have to dissociate with the peptide reagent before detection.

Обнаружение патогенных прионов в образце может выполняться с использованием описанного здесь пептидного реагента, который преимущественно взаимодействует с патогенными формами. Альтернативно, патогенные прионы могут обнаруживаться неспецифическими реагентами обнаружения (например, пептидами или антителами, которые связываются с PrP в общем смысле). В некоторых вариантах осуществления после диссоциации с твердой основы захваченный патогенный прион денатурируют перед обнаружением, что может способствовать обнаружению, давая возможность применения неспецифичных реагентов обнаружения. Альтернативно, захваченный патогенный прион может денатурировать без диссоциации с пептидного реагента, если, например, пептидный реагент модифицирован так, что он содержит активируемую реакционно-способную группу (например, фотореактивную группу), которая может использоваться для ковалентного связывания пептидного реагента и патогенного приона.Detection of pathogenic prions in a sample can be performed using the peptide reagent described herein, which predominantly interacts with pathogenic forms. Alternatively, pathogenic prions can be detected by non-specific detection reagents (e.g., peptides or antibodies that bind to PrP in a general sense). In some embodiments, after dissociation from a solid base, the trapped pathogenic prion is denatured before detection, which may facilitate detection, allowing the use of non-specific detection reagents. Alternatively, a trapped pathogenic prion can denature without dissociation from the peptide reagent if, for example, the peptide reagent is modified to contain an activated reactive group (e.g., a photoreactive group) that can be used to covalently bind the peptide reagent and the pathogenic prion.

Такие протоколы, как ELISA, описанный в Ryou et al. (2003) Lab Invest. 83 (6): 837-43, могут осуществляться для определения количества патогенного приона, элюированного с твердой основы (см. примеры). В кратком изложении, лунки планшета для микротитрования покрывают захваченным патогенным прионом, который диссоциировал (был элюирован) с твердой основы. Планшет(-ы) могут промывать для удаления несвязанных радикалов и добавляют меченую и способную к визуализации связывающую молекулу, такую как антитело против приона или пептидный реагент по изобретению (тот же, что используют для захвата или другой). Данной связывающей молекуле позволяют взаимодействовать с любым захваченным прионом из образца, планшет промывают, и присутствие меченых антител и/или меченых пептидных реагентов обнаруживают с использованием способов, хорошо известных в данной области. Связанная молекула не обязательно должно быть специфичной в отношении патогенного приона, но может связываться с обеими изоформами или с денатурированным PrP, если реагент захвата специфичен в отношении патогенной формы приона. Protocols such as ELISA described in Ryou et al. (2003) Lab Invest. 83 (6): 837-43, can be carried out to determine the amount of pathogenic prion eluted from a solid base (see examples). Briefly, the wells of a microtiter plate are coated with a trapped pathogenic prion that dissociates (has been eluted) from a solid base. The tablet (s) can be washed to remove unbound radicals and a labeled and visualizable binding molecule, such as the anti-prion antibody or peptide reagent of the invention (the same as that used for capture or the other), is added. This binding molecule is allowed to interact with any trapped prion from the sample, the plate is washed, and the presence of labeled antibodies and / or labeled peptide reagents is detected using methods well known in the art. The bound molecule does not have to be specific for the pathogenic prion, but can bind to both isoforms or to denatured PrP if the capture reagent is specific for the pathogenic form of the prion.

В других типовых анализах реагент захвата и прион не диссоциируют перед обнаружением. Например, твердая основа (например, лунки планшета для микротитрования) связывается с первым с первой специфичной в отношении приона молекулой (пептидный реагент). Затем биологический образец, содержащий патогенные прионы или в котором предполагается наличие их, добавляют к твердой основе. После периода инкубации, достаточного для того, чтобы патогенные прионы связывались с первой молекулой, твердая основа может промываться для удаления несвязанных радикалов, и добавляется меченая и способная к визуализации вторичная связывающаяся молекула, описанная выше, такая как второе антитело против PrP или специфичный в отношении приона пептидный реагент. Альтернативно, молекула, которая связывается с патогенной и непатогенной формами (например, неспецифичный реагент захвата) может присоединяться к твердой основе (например, покрывать лунки планшета для микротитрования), и обнаружение может осуществляться с использованием патогенного специфичного в отношении приона реагента обнаружения (например, описанного здесь пептидного реагента).In other typical assays, the capture reagent and prion do not dissociate before detection. For example, a solid base (e.g., microtiter plate wells) binds to the first with the first prion-specific molecule (peptide reagent). Then a biological sample containing pathogenic prions or in which they are expected to be added is added to the solid base. After an incubation period sufficient for pathogenic prions to bind to the first molecule, the solid base can be washed to remove unbound radicals and a labeled and visualizable secondary binding molecule described above, such as a second anti-PrP antibody or prion specific, is added. peptide reagent. Alternatively, a molecule that binds to pathogenic and non-pathogenic forms (e.g., a nonspecific capture reagent) can attach to a solid base (e.g., cover the wells of a microtiter plate), and detection can be carried out using a pathogenic prion-specific detection reagent (e.g., described here the peptide reagent).

Другим типовым анализом является «сэндвич-анализ с двумя пептидами», который может использоваться для обнаружения прионов (например, патогенных прионов). В данном способе твердая основа взаимодействует, как описано здесь, с одним или несколькими первыми пептидными реагентами по изобретению, промывается для удаления непрореагировавшего первого пептидного реагента и затем подвергается воздействию тестируемого образца (например, биологического образца), в котором предполагается наличие патогенного прионного белка, в условиях, обеспечивающих взаимодействие между первым(-и) пептидным(-и) реагентом(-ами) и любым патогенными прионным белком, присутствующим в образце. Непрореагировавшие компоненты образца удаляют и добавляют один или несколько вторых пептидных реагентов по изобретению в условиях, которые обеспечивают взаимодействие второго(-ых) пептидного(-ых) реагента(-ов) с любым патогенными прионным белком, присутствующим в образце. Взаимодействие между первым пептидом-прионным белком-вторым пептидом может выявляться любыми средствами, известными в данной области. Обычно второй(-ые) пептидный(-ые) реагент(-ы) включает(-ют) в себя выявляемую метку. В данном анализе первый(-ые) пептидный(-ые) реагент(-ы) и/или второй(-ые) пептидный(-ые) реагент(-ы) включает(-ют) взаимодействуют преимущественно с патогенным прионным белком.Another typical assay is a “double peptide sandwich assay,” which can be used to detect prions (such as pathogenic prions). In this method, the solid base is reacted, as described herein, with one or more of the first peptide reagents of the invention, washed to remove the unreacted first peptide reagent, and then exposed to a test sample (e.g., a biological sample) that assumes the presence of a pathogenic prion protein, in conditions ensuring the interaction between the first (s) peptide (s) reagent (s) and any pathogenic prion protein present in the sample. Unreacted sample components are removed and one or more of the second peptide reagents of the invention are added under conditions that allow the second peptide reagent (s) to interact with any pathogenic prion protein present in the sample. The interaction between the first peptide-prion protein and the second peptide can be detected by any means known in the art. Typically, the second peptide (s) reagent (s) include (s) a detectable label. In this analysis, the first peptide (s) reagent (s) and / or the second peptide (s) reagent (s) comprise (s) interact predominantly with a pathogenic prion protein.

В некоторых вариантах осуществления антитела против PrP применяют для обнаружения прионных белков. Антитела, модифицированные антитела и другие реагенты, которые связываются с прионами, особенно с PrP^C или с денатурированным PrP, описаны, и некоторые из них доступны коммерчески (см., например, антитела против прионов, описанные в Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72: 9413; в патенте США № 6765088. Некоторые из них и других доступны коммерчески, среди прочих, от InPro Biotechnology, South San Francisco, Калифорния, Cayman Chemicals, Ann Arbor MI; Prionics AG, Цюрих; также см. WO03/085086 для описания модифицированных антител).In some embodiments, anti-PrP antibodies are used to detect prion proteins. Antibodies, modified antibodies and other reagents that bind to prions, especially PrP ^C or denatured PrP, are described, and some of them are commercially available (see, for example, anti-prion antibodies described in Peretz et al. 1997 J. Mol Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72: 9413; in US patent No. 6765088. Some of them and others are commercially available, among others, from InPro Biotechnology , South San Francisco, CA, Cayman Chemicals, Ann Arbor MI; Prionics AG, Zurich; also see WO03 / 085086 for a description of modified antibodies).

Пептидные реагенты по изобретению могут также использоваться в конкурентных анализах. Средства обнаружения могут использоваться для идентификации того, когда лиганд, слабо связывающийся с PrP^Sc, замещается описанным здесь пептидным реагентом, который специфичен в отношении PrP^Sc. Например, образец, в котором предполагается наличие PrP^Sc, может адсорбироваться на твердой основе. Впоследствии твердую основу комбинируют с меченым и способным к визуализации лигандом, который связывается с PrP^Sc (например, плазминоген, рецептор ламинина и гепарансульфат) в условиях, таких что меченый и способный к визуализации лиганд связывается с PrP^Sc. Выявляются комплексы лиганд-PrP^Sc. Затем добавляют описанный здесь связывающий PrP^Sc пептидный реагент. Сродство связывания меченого и способного к визуализации лиганда слабее, чем сродство связывания пептидного реагента в отношении патогенного приона. В соответствии с этим связывающий PrP^Sc пептидный реагент замещает меченый лиганд, и может обнаруживаться снижение выявляемых количеств меченого лиганда, указывающее на комплексы, образованные между пептидным реагентом и патогенными прионами из биологического образца. The peptide reagents of the invention can also be used in competitive assays. Detection tools can be used to identify when a ligand that weakly binds to PrP ^Sc is replaced by a peptide reagent described herein that is specific for PrP ^Sc . For example, a sample in which the presence of PrP ^{Sc is} assumed can be adsorbed on a solid basis. Subsequently, the solid base is combined with a labeled and visualizable ligand that binds to PrP ^Sc (e.g., plasminogen, laminin receptor and heparan sulfate) under conditions such that the labeled and visualizable ligand binds to PrP ^Sc . Ligand-PrP ^Sc . Complexes are detected. The PrP ^Sc binding peptide reagent described herein is then added. The binding affinity of the labeled and visualizable ligand is weaker than the binding affinity of the peptide reagent for the pathogenic prion. Accordingly, the PrP ^Sc binding peptide reagent replaces the labeled ligand, and a decrease in detectable amounts of the labeled ligand can be detected, indicating complexes formed between the peptide reagent and pathogenic prions from a biological sample.

Описанные выше реагенты для анализа, включая описанные здесь пептидные реагенты, могут предоставляться в наборах с подходящими инструкциями и другими необходимыми реагентами, для проведения анализов обнаружения, как описано выше. Там, где пептидный реагент адсорбируется на твердую основу, набор может дополнительно или альтернативно включать в себя такие пептидные реагенты, адсорбированные на одну или несколько твердых основ. Набор может далее содержать подходящие положительные и отрицательные контроли, описанные выше. Набор также может содержать, в зависимости от используемых конкретных анализов обнаружения, подходящие метки и другие упакованные реагенты и материалы (т.е., буферы промывки и тому подобное).The assay reagents described above, including the peptide reagents described herein, may be provided in kits with suitable instructions and other necessary reagents for conducting detection assays as described above. Where the peptide reagent is adsorbed onto a solid base, the kit may additionally or alternatively include such peptide reagents adsorbed onto one or more solid bases. The kit may further contain suitable positive and negative controls described above. The kit may also contain, depending on the specific detection assays used, suitable labels and other packaged reagents and materials (i.e., wash buffers and the like).

В дальнейших вариантах осуществления изобретение относится к твердым основам, содержащим специфичный в отношении патогенного приона пептидный реагент. Также предоставляются способы продукции данных твердых основ, например, путем In further embodiments, the invention relates to solid bases comprising a pathogenic prion specific peptide reagent. Also provided are methods of producing these solid bases, for example, by

a) получения твердой основы; и a) obtaining a solid base; and

(b) связывания с ней одного или нескольких специфичных в отношении патогенного приона пептидных реагентов.(b) binding to it one or more peptide reagents specific for the pathogenic prion.

Специфичные в отношении приона пептидные реагенты могут далее применяться для выделения патогенных прионных белков с использованием аффинных основ. Пептидные реагенты могут добавляться к твердой основе, например, путем адсорбции, ковалентной связи, и т.д., так что пептидные реагенты сохраняют их селективную в отношении прионов связывающую активность. Необязательно, могут включаться спейсерные группы, например, так что связывающий участок пептидного реагента остается доступным. Затем иммобилизованные молекулы могут затем применяться для связывания патогенного прионного белка из биологического образца, такого как кровь, плазма, головной мозг, спинной мозг, другие ткани. Связанные пептидные реагенты или комплексы снимают с соновы, например, изменением pH, или патогенный прион может диссоциировать с комплекса.Prion-specific peptide reagents can then be used to isolate pathogenic prion proteins using affinity bases. Peptide reagents can be added to the solid base, for example, by adsorption, covalent bonds, etc., so that the peptide reagents retain their prion-selective binding activity. Optionally, spacer groups may be included, for example, so that the binding site of the peptide reagent remains available. The immobilized molecules can then be used to bind a pathogenic prion protein from a biological sample, such as blood, plasma, brain, spinal cord, and other tissues. Bound peptide reagents or complexes are removed from the sonic, for example, by a change in pH, or the pathogenic prion may dissociate from the complex.

Образцы, которые могут тестироваться по изобретению, включают в себя любые образцы, подлежащие анализу с антителами, включая образцы из ткани нервной системы (например, головного мозга, спинного мозга, ЦСЖ, и т.д.), образцы крови и/или другой ткани из живых или мертвых индивидуумов. Как отмечено выше, в предпочтительных вариантах осуществления образцы включают в себя кровь, продукты крови, или образцы ткани, полученные из живого индивидуума. Samples that can be tested according to the invention include any samples to be analyzed with antibodies, including samples from tissue of the nervous system (e.g., brain, spinal cord, CSF, etc.), blood samples and / or other tissue from living or dead individuals. As noted above, in preferred embodiments, the samples include blood, blood products, or tissue samples obtained from a living individual.

VI. Дополнительные примененияVI. Additional applications

A. ОбнаружениеA. Detection

Как описано выше, описанные здесь пептидные реагенты могут использоваться для диагностики у индивидуума прионного заболевания. Кроме того, описанные выше пептидные реагенты могут также применяться для обнаружения контаминации патогенного приона в продуктах крови и/или питания. Таким образом, может быть получен продукт крови, который, по существу, лишен патогенных прионов, путем скрининга аликвот полученных от индивидуумов образцов или объединенных образцов с использованием любого из описанных здесь анализов обнаружения. Образцы или объединенные образцы, которые контаминированы патогенными прионами, могут удаляться до их комбинации. Данным путем может предоставляться продукт крови, по существу лишенный контаминации патогенного приона. Под «по существу свободными патогенными прионами» подразумевается, что присутствие патогенных прионов не выявляется с использованием любого из описанных здесь анализов. Важно, что описанные здесь пептидные реагенты, которые, как уже было показано, обнаруживали патогенные белковые формы в тканях головного мозга, разбавленных в 10⁶ раз нормальной тканью, являются единственным продемонстрированным реагентом, который может обнаруживать патогенные прионы в крови.As described above, the peptide reagents described herein can be used to diagnose a prion disease in an individual. In addition, the peptide reagents described above can also be used to detect contamination of a pathogenic prion in blood and / or food products. Thus, a blood product that is substantially free of pathogenic prions can be obtained by screening aliquots of samples obtained from individuals or pooled samples using any of the detection assays described herein. Samples or pooled samples that are contaminated with pathogenic prions can be removed prior to combination. In this way, a blood product substantially devoid of contamination of the pathogenic prion may be provided. By “substantially free pathogenic prions” is meant that the presence of pathogenic prions is not detected using any of the assays described herein. It is important that the peptide reagents described here, which, as has already been shown, detect pathogenic protein forms in brain tissue diluted 10 ⁶ times with normal tissue, are the only reagent demonstrated that can detect pathogenic prions in the blood.

Изобретение, таким образом, предоставляет способ получения продукта крови, который, по существу, лишен патогенных прионов, где указанный продукт содержит цельную кровь, эритроциты, плазму, тромбоциты или сыворотку, причем указанный способ предусматривает: The invention thus provides a method for producing a blood product that is substantially devoid of pathogenic prions, wherein said product contains whole blood, red blood cells, plasma, platelets or serum, said method comprising:

(a) скрининг аликвот цельной крови, эритроцитов, плазмы, тромбоцитов или сыворотки из собранных образцов крови любыми способами обнаружения, предоставленными здесь для обнаружения патогенных прионов; (a) screening aliquots of whole blood, red blood cells, plasma, platelets or serum from collected blood samples by any detection methods provided herein for the detection of pathogenic prions;

(b) элиминацию образцов, в которых обнаружены патогeнные прионы; и (b) elimination of samples in which pathogenic prions are found; and

(c) комбинацию образцов, в которых не обнаружены патогенные прионы, для предоставления продукта крови, по существу, лишенного патогенных прионов. (c) a combination of samples in which pathogenic prions are not found to provide a blood product substantially devoid of pathogenic prions.

Сходным образом, продукт питания может подвергаться скринингу на присутствие патогенных принов для получения пищи, по существу лишенной патогенных прионов. Таким образом, с использованием любого из описанных здесь способов образцы из живых организмов, предназначенные для потребления в пищу людей и животных, могут подвергаться скринингу на присутствие патогенных прионов. Образцы, взятые из продукта питания, предназначенного для снабжения пищей, также могут подвернаться скринингу. Образцы, в которых обнаруживают патогенные прионы, идентифицируют, и живой организм и пища, предназначенные для снабжения питанием, в образцах, в которых обнаружены патогенные прионы, удаляют из снабжения питанием. Таким путем предоставляются продукты питания, по существу, лишенные патогенных прионов. Similarly, a food product may be screened for the presence of pathogenic prions to obtain food substantially devoid of pathogenic prions. Thus, using any of the methods described herein, samples from living organisms intended for human and animal consumption can be screened for the presence of pathogenic prions. Samples taken from food intended for food can also be screened. Samples in which pathogenic prions are detected are identified, and a living organism and food intended for nutrition are removed from samples in which pathogenic prions are found. In this way, food products substantially devoid of pathogenic prions are provided.

Таким образом, изобретение относится к способу получения продукта питания, по существу, лишенного патогенных прионов, причем указанный способ предусматривает: Thus, the invention relates to a method for producing a food product essentially devoid of pathogenic prions, said method comprising:

(a) скрининг образца, взятого из живых организмов, которые пойдут на продукты питания или образца, взятого из пищи, предназначенного для снабжения питанием, любыми способами обнаружения, предоставленными здесь для обнаруженния патогенных прионов;(a) screening a sample taken from living organisms that will go for food or a sample taken from food intended to supply food, by any detection methods provided here for the detection of pathogenic prions;

(b) элиминацию образцов, в которых обнаружены патогeнные прионы; и (b) elimination of samples in which pathogenic prions are found; and

(c) комбинацию образцов, в которых не обнаружены патогенные прионы, для предоставления продукта питания, по существу, лишенного патогенных прионов. (c) a combination of samples in which pathogenic prions are not found to provide a food product substantially devoid of pathogenic prions.

B. ОчисткаB. Cleaning

Пептиды по изобретению могут также использоваться для удаления патогенных прионов из образца как для цели выделения патогенного приона (например, для концентрирования прионного белка перед обнаружением), так и для цели удаления из образца патогенного приона (например, в качестве средства предоставления образца, по существу, лишенного патогенных прионов). В данных способах пептидные реагенты обычно предоставляются на твердой основе. Твердая основа, содержащая пептидный реагент, контактирует с образцом, содержащим патогенный прион в условиях для связывания приона с пептидным реагентом. Если целью является выделение патогенного приона, несвязавшийся образец удаляют и собирают твердую основу, содержащую прионы; если целью является удаление прионов из образца, собирают несвязавшийся образец.The peptides of the invention can also be used to remove pathogenic prions from a sample, both for the purpose of isolating a pathogenic prion (e.g., to concentrate a prion protein before detection) and for the purpose of removing a pathogenic prion from a sample (e.g., as a means of providing a sample essentially devoid of pathogenic prions). In these methods, peptide reagents are usually provided on a solid basis. The solid base containing the peptide reagent is contacted with a sample containing the pathogenic prion under conditions for binding of the prion to the peptide reagent. If the goal is to isolate a pathogenic prion, an unbound sample is removed and a solid base containing prions is collected; if the goal is to remove prions from the sample, collect an unbound sample.

Таким образом, изобретение относится к способу выделения патогенного прионного белка из образца, предусматривающему: Thus, the invention relates to a method for isolating pathogenic prion protein from a sample, comprising:

(a) получение твердой основы, содержащей пептидный реагент по изобретению; (a) obtaining a solid base containing the peptide reagent of the invention;

(b) контактирование указанного образца с указанной твердой основой в условиях, которые обеспечивают связывание патогенного прионного белка, если он присутствует в указанном образце, с указанным первым пептидным реагентом, с образованием первого комплекса, и (b) contacting said sample with said solid base under conditions that allow the pathogenic prion protein to bind, if present in said sample, to said first peptide reagent to form a first complex, and

(c) удаление несвязанных материалов образца. (c) removal of unbound sample materials.

В дальнейшем варианте осуществления указанный патогенный прионный белок может диссоциироваться с указанного первого комплекса. Эта диссоциация может выполняться способами, которые хорошо известны в области очистки белка.In a further embodiment, said pathogenic prion protein may dissociate from said first complex. This dissociation can be performed by methods that are well known in the field of protein purification.

Изобретение также относится к способу элиминации патогенных прионных белков из образца, предусматривающему:The invention also relates to a method for eliminating pathogenic prion proteins from a sample, comprising:

(a) получение твердой основы, содержащей пептидный реагент по изобретению; (a) obtaining a solid base containing the peptide reagent of the invention;

(b) контактирование указанной твердой основы с образцом, в котором предполагается наличие патогенных прионных белков в условиях, которые обеспечивают связывание патогенных прионных белков, если они присутствуют, с пептидным реагентом; и (b) contacting said solid base with a sample in which the presence of pathogenic prion proteins is expected under conditions that allow the binding of pathogenic prion proteins, if present, to the peptide reagent; and

(c) получение несвязанных материалов образца.(c) obtaining unbound sample materials.

C. КомпозицииC. Compositions

Изобретение далее относится к композициям, содержащим описанные здесь пептидные реагенты и/или антитела (и полинуклеотиды, кодирующие данные пептидные реагенты и/или антитела) и к способам применения данных композиций в терапевтических и профилактических композициях для лечения или профилактики связанных с прионами заболеваний. Более того, антитела, пептидные реагенты (и полинуклеотиды, кодирующие данные антитела и/или пептидные реагенты) могут также применяться в композициях, индивидуально или в комбинации, для профилактических (например, для предоствращения патогенеза) или терапевтических (для лечения заболевания после инфекции) целей.The invention further relates to compositions containing the peptide reagents and / or antibodies described herein (and polynucleotides encoding these peptide reagents and / or antibodies) and to methods for using these compositions in therapeutic and prophylactic compositions for treating or preventing prion-related diseases. Moreover, antibodies, peptide reagents (and polynucleotides encoding these antibodies and / or peptide reagents) can also be used in the compositions, individually or in combination, for prophylactic (for example, to prevent pathogenesis) or therapeutic (for treating a disease after infection) purposes .

Точный механизм, по которому описанные здесь композиции действуют в плане лечения или профилактики заболевания, не критичен. Хотя это и не связано с какой-либо одной теорией, описанные здесь композции могут действовать в плане лечения или профилактики заболеваний по одному или нескольким из следующих механизмов: индукция у индивидуума иммунного ответа, который затем лечит или предотвращает состояние болезни; связывание непатогенных форм, которые могут предотвращать переход в патогенные формы; связывание патогенных формы, которое может предотвращать патогенные последствия; и/или связывание с патогенными формами, которое может препятствовать переходу за счет патогенных форм непатогенных форм в формы, связанные с заболеванием. (См., например, Peretz et al. (2001) Nature 412: 739-743, где анализируется способность некоторых Fab ингибировать размножние прионов).The exact mechanism by which the compositions described herein act in terms of treating or preventing a disease is not critical. Although not related to any one theory, the compositions described herein can act in terms of treating or preventing diseases by one or more of the following mechanisms: induction of an immune response in an individual, which then treats or prevents the condition of the disease; the binding of non-pathogenic forms that can prevent the transition to pathogenic forms; binding of pathogenic forms that can prevent pathogenic effects; and / or binding to pathogenic forms, which may impede the transition due to pathogenic forms of non-pathogenic forms to forms associated with the disease. (See, for example, Peretz et al. (2001) Nature 412: 739-743 for an analysis of the ability of some Fabs to inhibit prion multiplication).

Композиции могут включать в себя смеси одного или нескольких пептидных реагентов, антител и/или полинуклеотидов. Данные молекулы могут быть получены из различных источников, например рекомбинантно продуцированные белки, синтетически продуцированные белки и т.д. Композиции также могут вводиться в связи с другими молекулами, например, антигенами и иммунорегуляторными агентами, такими как иммуноглобулины, цитокины, лимфокины, и хемокины, включая в качестве неограничивающих примеров IL-2, модифицированные IL-2 (cys125-ser125), GM-CSF, IL-12, альфа- или гамма-интерферон, IP-10, MIP1 и RANTES. Композиции могут вводиться в виде полипептидов или, альтернативно, в виде голой нуклеоиновой кислоты (например, ДНК), с использованием вирусных векторов (например, ретровирусных векторов, аденовирусных векторов, аденоассоциированных вирусных векторов, альфавирусных векторов) или невирусных векторов (например, липосом, частиц, покрытых нуклеиновой кислотой или белком).Compositions may include mixtures of one or more peptide reagents, antibodies and / or polynucleotides. These molecules can be obtained from various sources, for example, recombinantly produced proteins, synthetically produced proteins, etc. The compositions may also be administered in association with other molecules, for example, antigens and immunoregulatory agents, such as immunoglobulins, cytokines, lymphokines, and chemokines, including but not limited to IL-2, modified IL-2 (cys125-ser125), GM-CSF , IL-12, alpha or gamma interferon, IP-10, MIP1 and RANTES. Compositions may be administered as polypeptides or, alternatively, as naked nucleic acid (e.g., DNA), using viral vectors (e.g., retroviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, alphavirus vectors) or non-viral vectors (e.g. liposomes, particles coated with nucleic acid or protein).

Композиции могут также включать в себя смесь пептидного реагента и нуклеиновой кислоты, которая, в свою очередь, может быть доставлена с использованием различных способов и/или носителей. Одинаковые или различные композиции могут вводиться более одного раза (например, «первичное» введение с последующей одной или несколькими «стимуляциями») для достижения требуемых эффектов. Одна и та же композиция может вводиться в качестве первичной и в качестве одной или нескольких стимуляций. Альтернативно, различные композиции могут использоваться для первичного эффекта и стимуляции. The composition may also include a mixture of a peptide reagent and nucleic acid, which, in turn, can be delivered using various methods and / or carriers. The same or different compositions may be administered more than once (for example, “primary” administration followed by one or more “stimulations”) to achieve the desired effects. The same composition may be administered as primary and as one or more stimulations. Alternatively, various compositions may be used for primary effect and stimulation.

Композиции по изобретению предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми и фармакологически приемлемыми. В частности, композиции предпочтительно не являются нежелательными в биологическом или другом смысле, т.е., данный материал может вводиться в препарате или композиции без индукции каких-либо нежелательных биологических эффектов или без вредоносного взаимодействия с любыми компонентами композиции, в которой он содержится.The compositions of the invention are preferably pharmaceutically acceptable and pharmacologically acceptable. In particular, the compositions are preferably not undesirable in a biological or other sense, i.e., this material can be introduced into the preparation or composition without inducing any undesirable biological effects or without harmful interaction with any components of the composition in which it is contained.

Описанные здесь композиции могут обычно включать в себя терапевтически эффективное количество молекул (пептидных реагентов) или кодирующих их нуклеотидных последовательностей, антител, направленных на данные молекулы и любых других указанных выше компонентов, если это требуется. Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается количество, которое индуцирует протективный и/или терапевтический ответ в неинфицированном, инфицированном или не испытавшем воздействия индивидууме, которому оно введено. «Терапевтически эффективное количество» попадает в относительно широкий интервал, который определяется рутинными испытаниями. Точное необходимое количество изменяется в зависимости от подлежащего лечению индивидуума; возраста и общего состояния подлежащего лечению индивидуума; способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела; степени требуемой защиты; тяжести подлежащего лечению состояния; конкретно выбранной композиции и способ ее введения, среди прочих факторов.The compositions described herein may typically include a therapeutically effective amount of molecules (peptide reagents) or nucleotide sequences encoding them, antibodies directed to those molecules, and any other components mentioned above, if desired. By “therapeutically effective amount” is meant an amount that induces a protective and / or therapeutic response in an uninfected, infected or untreated individual to whom it is administered. A “therapeutically effective amount” falls within a relatively wide range, which is determined by routine trials. The exact amount needed varies with the individual being treated; age and general condition of the individual to be treated; the ability of an individual's immune system to synthesize antibodies; degree of protection required; the severity of the condition to be treated; specifically selected composition and method of its administration, among other factors.

В некоторых вариантах осуществления пептидные реагенты являются иммуногенными, и способы по изобретению включают в себя введение животному иммуногенной композиции, содержащей описанный здесь пептидный реагент, антитело, специфичное в отношении патогенных прионов и/или полинуклеотиды, кодирующие данные пептидные реагенты или антитела. Иммуногенные композиции, применяемые по изобретению, предпочтительно включают в себя иммунологически эффективное количество данных компонентов. «Иммунологически эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для того, чтобы у животного был вызыван иммунный ответ против прионного белка, предпочтительно, патогенного приона. Иммунный ответ, в общем, приводит к развитию у индивидуума секреторного, клеточного и/или опосредованного антителом иммунного ответа. Обычно такой ответ включает в себя в качестве неограничивающих примеров один или несколько из следующих эффектов: продукцию антител любого из иммунологических классов, таких как иммуноглобулины A, D, E, G или M; пролиферацию B- и T-лимфоцитов; предоставление иммунологическим клеткам сигналов активации, роста и дифференцировки; размножение хелперной T-клетки, супрессорной Т-клетки, и/или цитотоксической Т-клетки. Количество продуцируемых антител изменяется в зависимости от нескольких факторов, включая используемое животное, присутствие адъюванта и т.д.In some embodiments, the peptide reagents are immunogenic, and the methods of the invention comprise administering to the animal an immunogenic composition comprising the peptide reagent described herein, an antibody specific for pathogenic prions and / or polynucleotides encoding these peptide reagents or antibodies. The immunogenic compositions used according to the invention preferably include an immunologically effective amount of these components. An "immunologically effective amount" is an amount sufficient to cause an animal to elicit an immune response against a prion protein, preferably a pathogenic prion. The immune response, in General, leads to the development of an individual's secretory, cellular and / or antibody-mediated immune response. Typically, such a response includes, but is not limited to, one or more of the following effects: production of antibodies of any of the immunological classes, such as A, D, E, G, or M immunoglobulins; proliferation of B- and T-lymphocytes; providing immunological cells with activation, growth, and differentiation signals; propagation of a helper T cell, a suppressor T cell, and / or a cytotoxic T cell. The amount of antibody produced varies depending on several factors, including the animal used, the presence of an adjuvant, etc.

Композиции по изобретению могут далее включать в себя один или несколько адъювантов. Адъюванты, подходящие для применения по изобретению, включают в себя один или несколько из следующих: The compositions of the invention may further include one or more adjuvants. Adjuvants suitable for use according to the invention include one or more of the following:

- термолабильный энтеротоксин E. coli («LT») или его детоксифицированные мутанты, такие как мутанты K63 или R72; - thermolabile enterotoxin E. coli ("LT") or its detoxified mutants, such as K63 or R72 mutants;

- холерный токсин («CT») или его детоксифицированные мутанты; - cholera toxin ("CT") or its detoxified mutants;

- микрочастицы (т.е., частица от «~100 нм до ~150 мкм» в диаметре, более предпочтительно, от ~200 нм до ~30 мкм в диаметре, и, наиболее предпочтительно, от ~500 нм до ~10 мкм в диаметре), образованные из материалов, которые являются биодеградируемыми и нетоксичными (например, поли(α-гидрокси кислота), полигидроксимасляная кислота, полиортоэфир, полиангидрид, поликапронолактон и т.д.);microparticles (i.e., a particle of “~ 100 nm to ~ 150 μm” in diameter, more preferably, from ~ 200 nm to ~ 30 μm in diameter, and most preferably, from ~ 500 nm to ~ 10 μm in diameter) formed from materials that are biodegradable and non-toxic (for example, poly (α-hydroxy acid), polyhydroxybutyric acid, polyorthoester, polyanhydride, polycapronolactone, etc.);

- полиоксиэтиленовый простой эфир или полиоксиэтиленовый сложный эфир (см. заявку на выдачу Международного патента WO 99/52549); - polyoxyethylene ether or polyoxyethylene ester (see application for the grant of International patent WO 99/52549);

- поверхностно-активное вещество из полиоксиэтиленового сорбитанового эфира в комбинации с октоксинолом (см. заявку на выдачу Международного патента WO 01/21207) или поверхностно-активное вещество из полиоксиэтиленового алкильного простого эфира или сложного эфира в комбинации, по меньшей мере, с одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол (см. заявка на выдачу Международного патента WO01/21152); - a surfactant from polyoxyethylene sorbitan ether in combination with octoxynol (see International Patent Application WO 01/21207) or a surfactant from polyoxyethylene alkyl ether or ester in combination with at least one additional non-ionic a surfactant such as octoxynol (see International Patent Application WO01 / 21152);

- хитозан (например, заявка на выдачу Международного патента WO 99/27960);- chitosan (for example, application for the grant of International patent WO 99/27960);

- иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, олигонуклотид CpG) и сапонин (см. заявка на выдачу Международного патента WO00/62800); - an immunostimulatory oligonucleotide (e.g., CpG oligonucleotide) and saponin (see International Patent Application WO00 / 62800);

- иммуностимулирующая двухцепочечная РНК;- immunostimulating double-stranded RNA;

- соединения алюминия (например, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, гидроксифосфат алюминия, оксигидроксид, ортофосфат, сульфат и т.д. (например, см. главы 8 & 9 Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X) (здесь и далее «Vaccine design»), или смеси различных соединений алюминия, с соединениями, принимающими какую-либо подходящую форму (например, гелевую, кристаллическую, аморфную, и т.д.), и с предпочтительной адсорбцией;- aluminum compounds (e.g. aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum hydroxyphosphate, oxyhydroxide, orthophosphate, sulfate, etc. (e.g. see chapters 8 & 9 of Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X) (hereinafter “Vaccine design"), or mixtures of various aluminum compounds, with compounds that take any suitable form (for example, gel, crystalline, amorphous, etc. .), and with preferred adsorption;

- MF59 (5% сквален, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85, составленные в субмикронные частицы с использованием микрофлюидизатора) (см. главу 10 «Vaccine design»; см. также заявку на выдачу Международной заявки WO 90/14837);- MF59 (5% squalene, 0.5% Tween 80 and 0.5% Span 85, compiled into submicron particles using a microfluidizer) (see chapter 10 “Vaccine design”; see also application for issuance of International application WO 90 / 14837);

- липосомы (см. главы 13 и 14 «Vaccine design»);- liposomes (see chapters 13 and 14 of the Vaccine design);

- ISCOM (см. главы 23 «Vaccine design»);- ISCOM (see chapters 23 “Vaccine design”);

- SAF, содержащий 10% сквален, 0,4% Tween 80, 5% блок-сополимер этилена и оксида пропилена L121, и thr-MDP, микроожиженные в субмикронную эмульсию, или смешивают на vortex с образованием эмульсии с большим размером частиц (см. главу 12 «Vaccine design»);- SAF containing 10% squalene, 0.4% Tween 80, 5% block copolymer of ethylene and propylene oxide L121, and thr-MDP, micro-fluidized into a submicron emulsion, or mixed on a vortex to form an emulsion with a large particle size (see chapter 12 “Vaccine design”);

- адъювантная система Ribi™ (RAS) (Ribi Immunochem), содержащая 2% сквален, 0,2% Tween 80, и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM), и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL + CWS (Detox™);- adjuvant Ribi ™ system (RAS) (Ribi Immunochem), containing 2% squalene, 0.2% Tween 80, and one or more components of the bacterial cell wall from the group consisting of monophosphoryl lipid A (MPL), trehalose dimicolate (TDM), and cell wall skeleton (CWS), preferably MPL + CWS (Detox ™);

- адъюванты сапонина, такие как QuilA или QS21 (см. главу 22 «Vaccine design»), также известные как Stimulon™;- saponin adjuvants such as QuilA or QS21 (see chapter 22 “Vaccine design”), also known as Stimulon ™;

- ISCOM, которые могут быть лишены дополнительным детергентом (заявка на выдачу Международного патента WO 00/07621); - ISCOM, which may be deprived of an additional detergent (application for the grant of International patent WO 00/07621);

- полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA);- complete Freund's adjuvant (CFA) and incomplete Freund's adjuvant (IFA);

- цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, и т.д.), интерфероны (например, интерферон-γ), макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор некроза опухолей, и т.д. (см. главы 27 & 28 «Vaccine design»);- cytokines, such as interleukins (e.g., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferons (e.g., interferon γ), macrophage colony stimulating factor, tumor necrosis factor, etc. (see chapters 27 & 28 “Vaccine design”);

- монофосфориллипид A (MPL) или 3-O-деацетилированный MPL (3dMPL) (например, глава 21 «Vaccine design»);- monophosphoryl lipid A (MPL) or 3-O-deacetylated MPL (3dMPL) (for example, chapter 21 “Vaccine design”);

- комбинации 3dMPL, например QS21, и/или эмульсии масло-в-воде (заявки на выдачу Европейского патента 0835318, 0735898 и 0761231);- combinations of 3dMPL, for example QS21, and / or an oil-in-water emulsion (European patent applications 0835318, 0735898 and 0761231);

- олигонуклеотиды, содержащие CpG-мотивы (см. Krieg (2000) Vaccine, 19: 618-622; Krieg (2001) Curr.Open.Mol.Ther., 2001, 3: 15-24; WO 96/02555, WO 98/16247, WO98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO98/37919 и WO 98/52581, и т.д.), т.е. содержащие, по меньшей мере, один динуклеотид CG,- oligonucleotides containing CpG motifs (see Krieg (2000) Vaccine, 19: 618-622; Krieg (2001) Curr.Open.Mol.Ther., 2001, 3: 15-24; WO 96/02555, WO 98 / 16247, WO98 / 18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO98 / 37919 and WO 98/52581, etc.), i.e. containing at least one CG dinucleotide,

- полиоксиэтиленовый простой эфир или полиоксиэтиленовый сложный эфир (заявка на выдачу Международного патента WO 99/52549);- polyoxyethylene ether or polyoxyethylene ester (application for the grant of International patent WO 99/52549);

- поверхностно-активное вещество из полиоксиэтиленового сорбитанового эфира в комбинации с октоксинолом (см. заявку на выдачу Международного патента WO 01/21207) или поверхностно-активное вещество из полиоксиэтиленового алкильного простого эфира или сложного эфира в комбинации, по меньшей мере, с одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол (см. заявка на выдачу Международного патента WO01/21152);- a surfactant from polyoxyethylene sorbitan ether in combination with octoxynol (see International Patent Application WO 01/21207) or a surfactant from polyoxyethylene alkyl ether or ester in combination with at least one additional non-ionic a surfactant such as octoxynol (see International Patent Application WO01 / 21152);

- иммуностимуляторный олигонуклеотид (например, олигонуклеотид CpG) и сапонин (заявка на выдачу Международного патента WO00/62800); - immunostimulatory oligonucleotide (for example, CpG oligonucleotide) and saponin (application for the grant of International patent WO00 / 62800);

- иммуностимулятор и частица соли металла (заявка на выдачу Международного патента WO00/23105); - immunostimulant and a particle of metal salt (application for the grant of International patent WO00 / 23105);

- сапонин и эмульсия масла в воде (заявка на выдачу Международного патента WO99/11241); и - saponin and an oil-in-water emulsion (International Patent Application WO99 / 11241); and

- сапонин (например, QS21) + 3dMPL + IL-12 (необязательно + стерол) (заявка на выдачу Международного патента WO 98/57659).- saponin (e.g., QS21) + 3dMPL + IL-12 (optional + sterol) (International patent application WO 98/57659).

Мурамиловые пептиды включают в себя в качестве неограничивающих примеров N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-актеилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамат (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (MTP-PE), и т.д.Muramyl peptides include, but are not limited to, N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-acteylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutamate (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl -D-isoglutaminyl-L-alanine-2- (1'-2'-dipalmitoyl- sn- glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) ethylamine (MTP-PE), etc.

Другие адъюванты, подходящие для применения введения через слизистые и парентерального введения также доступны (например, см. главу 7 Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X). Other adjuvants suitable for applying mucosal and parenteral administration are also available (e.g. see chapter 7 of Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

Мутанты LT представляют собой предпочтительные адъюванты (например, адъюванты слизистых), в частности мутанты «K63» и «R72» (например, см. заявку на выдачу Международного патента WO 98/18928), поскольку они приводят к повышенному иммунному ответу.LT mutants are preferred adjuvants (eg, mucosal adjuvants), in particular the “K63” and “R72” mutants (for example, see International Patent Application WO 98/18928) because they lead to an enhanced immune response.

Микрочастицы также могут использоваться, и предпочтительно их получают из поли(α-гидроксикислоты), в частности из поли(лактида) («PLA»), сополимера D,L-лактида и гликолида или гликолевой кислоты, такого как поли(D,L-лактид-когликолид) («PLG» или «PLGA»), или сополимера D,L-лактида и капролактона. Микрочастицы могут быть получены из любого из различных полимерных исходных материалов, которые имеют различные молекулярные массы и, в случае сополимеров, таких как PLG, различные отношения лактида:гликолида, которые во многом являются предметом выбора. Прионы, антитела и/или полинуклеотиды по изобретению могут захватываться внутрь микрочастиц, или могут адсорбироваться на них. Захват внутрь микрочастиц PLG является предпочтительным. Микрочастицы PLG обсуждаются более подробно в Morris et al., (1994), Vaccine, 12: 5-11, в главе 13 Mucosal Vaccines, eds. Kiyono et al., Academic Press 1996 (ISBN 012410587), и в главах 16 & 18 Vaccine design : the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN0-306-44867-X). Microparticles can also be used, and are preferably prepared from poly (α-hydroxy acid), in particular from poly (lactide) ("PLA"), a copolymer of D, L-lactide and glycolide or glycolic acid, such as poly (D, L- lactide-coglycolide) (“PLG” or “PLGA”), or a copolymer of D, L-lactide and caprolactone. Microparticles can be obtained from any of various polymeric starting materials, which have different molecular weights and, in the case of copolymers, such as PLG, various lactide: glycolide ratios, which are largely the subject of choice. The prions, antibodies and / or polynucleotides of the invention can be trapped inside the microparticles, or can be adsorbed on them. Injection of PLG microparticles is preferred. Microparticles of PLG are discussed in more detail in Morris et al., (1994), Vaccine, 12: 5-11, in chapter 13 of Mucosal Vaccines, eds. Kiyono et al., Academic Press 1996 (ISBN 012410587), and in chapters 16 & 18 of Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN0-306-44867-X).

Мутанты LT можно успешно использовать в комбинации с захваченным внутрь микрочастицы антигеном, приводя к значительно повышенному иммунному ответу.LT mutants can be successfully used in combination with an antigen trapped inside the microparticle, resulting in a significantly enhanced immune response.

Соединения аллюминия и MF59 являются предпочтительными адъювантами для парентерального применения.Aluminum and MF59 compounds are preferred adjuvants for parenteral use.

Типично, композиции готовят в виде инъецируемых композиций, либо в качестве жидких растворов, либо суспензий; можно также приготовить твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидком растворителе перед инъекцией. Препарат также можно приготовить в виде эмульсии или инкапсулировать в липосомы для увеличения адъювантного эффекта, как обсуждалось выше.Typically, the compositions are formulated as injectable compositions, either as liquid solutions or suspensions; solid forms suitable for dissolution or suspension in a liquid solvent prior to injection may also be prepared. The drug can also be prepared in the form of an emulsion or encapsulated in liposomes to increase the adjuvant effect, as discussed above.

Фармацевтически приемлемые соли можно также использовать в композициях по изобретению, например минеральные соли, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты или сульфаты, а также соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты или бензоаты. Особенно применимые белковые субстраты представляют собой сывороточные альбумины, гемоцианин морского блюдечка, молекулы иммуноглобулинов, тироглобулин, овальбумин, столбнячный анатоксин и другие белки, хорошо известные специалистам в данной области.Pharmaceutically acceptable salts can also be used in the compositions of the invention, for example, mineral salts such as hydrochlorides, hydrobromides, phosphates or sulfates, as well as organic acid salts such as acetates, propionates, malonates or benzoates. Particularly useful protein substrates are serum albumin, hemocyanin of the saucer, immunoglobulin molecules, thyroglobulin, ovalbumin, tetanus toxoid and other proteins well known to those skilled in the art.

Композиции по изобретению могут также содержать жидкости или наполнители, такие как вода, физиологический раствор, глицерин, декстроза, этанол или тому подобное, отдельно или в комбинации, а также такие вещества, как смачивающие средства, эмульгирующие средства или буферизующие pH средства. Необязательно присутствует носитель, который является молекулой, которая сама по себе не вызывает продукцию антител, вредных для индивидуума, получающего композицию. Подходящие носители типично представляют собой большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолиевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты (такие как масляные капельки или липосомы) и инактивированные вирусные частицы. Такие носители хоршо известны обычным специалистам в данной области. Кроме того, один или более полипептидов в композиции можно конъюгировать с бактериальным анатоксином, таким как анатоксин дифтерии, столбняка, холеры и т.д.The compositions of the invention may also contain liquids or excipients, such as water, saline, glycerin, dextrose, ethanol or the like, alone or in combination, as well as substances such as wetting agents, emulsifying agents or pH buffering agents. Optionally, a carrier is present, which is a molecule that alone does not cause the production of antibodies harmful to the individual receiving the composition. Suitable carriers are typically large, slowly metabolized macromolecules, such as proteins, polysaccharides, polylactic acids, polyglycolic acids, polymeric amino acids, amino acid copolymers, lipid aggregates (such as oil droplets or liposomes) and inactivated viral particles. Such carriers are well known to those of ordinary skill in the art. In addition, one or more polypeptides in the composition can be conjugated to a bacterial toxoid, such as the toxoid of diphtheria, tetanus, cholera, etc.

D. ДоставкаD. Delivery

Композицию по изобретению можно вводить в однократной дозе или как часть режима приема. Нуклеиновые кислоты и/или пептиды можно вводить любым подходящим способом, включая в качестве неограничивающих примеров внутримышечно, через слизистую, подкожно, внутрикожно, чрескожно, интравагинально, интраректально, перорально и/или внутривенно. Режим дозировки может включать в себя первичные и стимулирующие дозы, которые можно вводить через слизистую, парентерально или различными их комбинациями.The composition of the invention can be administered in a single dose or as part of a dosage regimen. Nucleic acids and / or peptides can be administered by any suitable method, including, but not limited to, intramuscularly, through the mucosa, subcutaneously, intracutaneously, transdermally, intravaginally, intrarectally, orally and / or intravenously. The dosage regimen may include primary and stimulating doses that can be administered through the mucosa, parenterally or in various combinations thereof.

В некоторых осуществлениях один или более компонентов композиций вводят парентерально или через слизистую. Подходящие способы парентерального введения включают в себя внутримышечный (IM), подкожный, внутривенный, внутрибрюшинный, внутрикожный, чрескожный и трансдермальный (см., например, Международную заявку на патент WO 98/20734) способы, а также доставку в интерстициальное пространство ткани. Подходящие способы введения через слизистую включают в себя пероральный, интраназальный, внутрижелудочный, легочный, кишечный, ректальный, глазной и вагинальный способы. Композицию можно адаптировать для введения через слизистую. Например, если композиция предназначена для перорального введения, она может находиться в форме таблеток или капсул, необязательно покрытых энтеросолюбильной оболочкой жидкостей, трансгеных растений и т.д. Если композиция предназначена для интраназального введения, она может находиться в форме спрея для носа, капель в нос, геля или порошка. Дозировка при лечении может представлять собой режим однократной дозировки или режим многократной дозировки.In some embodiments, one or more components of the compositions are administered parenterally or through the mucosa. Suitable methods for parenteral administration include intramuscular (IM), subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, intradermal, transdermal and transdermal (see, for example, International Patent Application WO 98/20734) methods, as well as delivery into the interstitial space of the tissue. Suitable mucosal routes of administration include oral, intranasal, intragastric, pulmonary, intestinal, rectal, ophthalmic, and vaginal methods. The composition can be adapted for administration through the mucosa. For example, if the composition is intended for oral administration, it may be in the form of tablets or capsules, optionally enteric-coated liquids, transgenic plants, etc. If the composition is intended for intranasal administration, it may be in the form of a nasal spray, nasal drops, gel or powder. The dosage during treatment may be a single dosage regimen or a multiple dosage regimen.

Композиции (или ее компонентны) можно также инкапсулировать, адсорбировать или связать с частицами-носителями. Такие носители представляют собой многократные копии выбранного антигена для иммунной системы и обеспечивают захват и задержание антигенов в региональных лимфатических узлах. Макрофаги могут фагоцитировать частицы и могут усилить презентацию антигена посредством высвобождения цитокина. Примеры частиц-носителей включают в себя частицы, полученные из полиметилметакрилатовых полимеров, а также микрочастицы, полученные из поли(лактидов) и поли(лактид-когликолидов), известных как PLG. См., например, Jeffery et al., Phann. Res. (1993) 10: 362-368; McGee JP, et al., J Microeizcapsul. 14 (2): 197-210, 1997; O'Hagan DT, et al., Vaccine 11 (2): 149-54, 1993. Подходящие микрочастицы можно также промышленно получать в присутствии заряженных детергентов, таких как анионогенные и катионогенные детергенты, чтобы получить миктрочастицы с поверхностью, несущей суммарный отрицательный или суммарный положительный заряд. Например, микрочастицы, полученные с анионогенными детергентами, такими как бромид гексадецилтриметиламмониума (CTAB), то есть микрочастицы CTAB-PLG, адсорбируют отрицательно заряженные макромолекулы, такие как ДНК (см., например, Международную заявку № PCT/US99/17308).Compositions (or component thereof) can also be encapsulated, adsorbed, or bound to carrier particles. Such carriers are multiple copies of the selected antigen for the immune system and provide for the capture and retention of antigens in regional lymph nodes. Macrophages can phagocytize particles and can enhance the presentation of antigen through the release of a cytokine. Examples of carrier particles include particles derived from polymethyl methacrylate polymers, as well as microparticles derived from poly (lactides) and poly (lactide-co-glycolides) known as PLG. See, for example, Jeffery et al., Phann. Res. (1993) 10: 362-368; McGee JP, et al., J Microeizcapsul. 14 (2): 197-210, 1997; O'Hagan DT, et al., Vaccine 11 (2): 149-54, 1993. Suitable microparticles can also be industrially produced in the presence of charged detergents, such as anionic and cationogenic detergents, to obtain microparticles with a surface bearing a total negative or total positive charge. For example, microparticles prepared with anionic detergents, such as hexadecyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), i.e. CTAB-PLG microparticles, adsorb negatively charged macromolecules such as DNA (see, for example, International Application No. PCT / US99 / 17308).

Кроме того, другие системы частиц и полимеры можно использовать для доставки in vivo или ex vivo. Например, такие полимеры, как полилизин, полиаргинин, полиорнитин, спермин, спермидин, так же, как и конъюгаты данных молекул, применимы для переноса интересующей нуклеиновой кислоты. Подобным образом, опосредованная декстраном трансфекция DEAE, осаждение фосфатом кальция или осаждение с использованием других нерастворимых неорганических солей, таких как фосфат стронция, силикаты алюминия, включая сюда бентонит и каолин, окись хрома, силикат магния, тальк и тому подобное, найдет использование с настоящими способами. Для обзора систем доставки, применимых для переноса гена, см., например, Felgner, P.L., Advanced Drug Delivery Reviews (1990) 5: 163-187. Пептоиды (Zuckerman, R. N., et al., патент США №5831005, опубликованный 3 ноября 1998 г., включен сюда в качестве ссылки) можно также использовать для доставки конструкции по настоящему изобретению.In addition, other particle systems and polymers can be used for in vivo or ex vivo delivery. For example, polymers such as polylysine, polyarginine, polyornithine, spermine, spermidine, as well as conjugates of these molecules, are applicable for the transfer of the nucleic acid of interest. Similarly, dextran-mediated transfection of DEAE, precipitation with calcium phosphate, or precipitation using other insoluble inorganic salts such as strontium phosphate, aluminum silicates, including bentonite and kaolin, chromium oxide, magnesium silicate, talc and the like, will find use with the present methods. . For a review of delivery systems useful for gene transfer, see, for example, Felgner, P. L., Advanced Drug Delivery Reviews (1990) 5: 163-187. Peptoids (Zuckerman, R. N., et al., US Patent No. 5,831,005, published November 3, 1998, incorporated herein by reference) can also be used to deliver the constructs of the present invention.

Как отмечалось выше, пептиды (или антитела) можно также доставлять при помощи нуклеиновых кислот, кодирующих данные молекулы. Необходимую последовательность встраивают в одноцистронный или мультицистронный вектор, содержащий выбранные контрольные элементы (например, промотор, энхансер и т.д.). В собранном виде конструкции можно доставлять, используя стандартные протоколы доставки генов, включающих в себя инъекцию с использованием традиционного шприца (например, патенты США № 5399346, 5580859, 5589466) или генной пушки, такой как система доставки гена в клетки (Accell® gene delivery system; PowderJect Technologies, Inc., Оксфорд, Англия); используя системы, на основе вирусов, такие как ретровирусные системы, как описано в (патенте США № 5219740), аденовирусные системы (Barr et al., Gene Therapy (1994) 1: 51-58; Berkner, K. L. BioTechniques (1988) 6: 616-629; and Rich et al., Human Gene Therapy (1993)4 : 461-476), системы с аденоассоциированным вирусом (AAV) (патенты США № 5173414 и 5139941), системы на основе вируса оспы, системы доставки на основе вируса коровьей оспы (см., например, международную публикаци. № WO 94/26911), системы на основе вируса птичьей оспы, такие вирусы оспы домашней птицы и оспы канареек, альфавирусную систему доставки (патенты США № 5843723; 5789245; 6342372; 6329201), а также и другие вирусные системы; невирусные системы, такие как заряженные и незаряженные липосомы (см., например, Hug and Sleight, Biochim. Biophys. Acta. (1991) 1097: 1-17; Straubinger et al., in Methods of Enzymology (1983), Vol. 101, pp. 512-527; Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413-7416)); и/или кохлеатные липидные композиции, похожие на композиции, описанные Papahadjopoulos et al., Biochem. Bioplys. Acta. (1975) 394: 483-491. См. также патенты США № 4663161 и 4871488. Полинуклеотиды можно доставлять либо непосредственно позвоночным индивидуумам, либо альтернативно, доставлять ex vivo, в клетки, полученные от индивидуума, и клетки реимплантировать индивидууму.As noted above, peptides (or antibodies) can also be delivered using nucleic acids encoding these molecules. The desired sequence is inserted into a single-cistron or multicistronic vector containing selected control elements (e.g., promoter, enhancer, etc.). Assembled constructs can be delivered using standard gene delivery protocols, including injection using a traditional syringe (e.g., US Pat. Nos. 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466) or a gene gun, such as a gene delivery system in cells (Accell® gene delivery system ; PowderJect Technologies, Inc., Oxford, England); using virus-based systems such as retroviral systems as described in (US Pat. No. 5,217,940), adenoviral systems (Barr et al., Gene Therapy (1994) 1: 51-58; Berkner, KL BioTechniques (1988) 6: 616-629; and Rich et al., Human Gene Therapy (1993) 4: 461-476), Adeno-associated virus (AAV) systems (US Pat. Nos. 5,173,414 and 5,193,941), smallpox virus-based systems, virus-based delivery systems smallpox (see, for example, international publication. No. WO 94/26911), avianpox virus-based systems, such poultry and smallpox canary pox viruses, alphavirus delivery system (US Pat. No. 5,84372 3; 5789245; 6342372; 6329201), as well as other viral systems; non-viral systems, such as charged and uncharged liposomes (see, for example, Hug and Sleight, Biochim. Biophys. Acta. (1991) 1097: 1-17; Straubinger et al., in Methods of Enzymology (1983), Vol. 101 , pp. 512-527; Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413-7416)); and / or cochleate lipid compositions similar to those described by Papahadjopoulos et al., Biochem. Bioplys. Acta. (1975) 394: 483-491. See also US patents Nos. 4,663,161 and 4,871,488. Polynucleotides can be delivered either directly to vertebrate individuals, or alternatively, delivered ex vivo to cells obtained from the individual, and the cells are reimplanted to the individual.

Способы по изобретению дополнительно охватывают лечение или предупреждение развития связанного с прионом заболевания введением животному композиции, содержащей эффективное количество антител по изобретению.The methods of the invention further encompass the treatment or prevention of prion-related disease by administering to the animal a composition comprising an effective amount of antibodies of the invention.

Способы лечения могут объединять любые описанные здесь композиции, например, содержащие пептиды композиции и/или композиции антител. Различные компоненты можно вводить совместно или отдельно.The methods of treatment may combine any of the compositions described herein, for example, peptide-containing compositions and / or antibody compositions. The various components may be administered together or separately.

Животные, подходящие для использования в способах по изобретению, включают человека и других приматов, включая отличных от человека приматов, таких как шимпанзе, и другие виды человекообразных обезьян и мартышек; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади, домашних животных, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы, хомячки и морские свинки; птиц, включая домашних, диких и охотничьих птиц, таких как куры, индюки и другие куриные, утки, гуси и тому подобное. Животные, подходящие для использования в изобретении, могут быть любого возраста, включая как взрослых, так и новорожденных. Трансгенных животных также можно использовать в изобретении. Для обсуждения трансгенных животных, используемых в настоящее время для изучения связанных с прионами заболеваний, см., главным образом, Prusiner "Prions" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 13363-13383.Animals suitable for use in the methods of the invention include humans and other primates, including non-human primates such as chimpanzees and other species of apes and monkeys; farm animals such as cattle, sheep, pigs, goats and horses; domestic animals such as dogs and cats; laboratory animals, including rodents, such as mice, rats, hamsters and guinea pigs; birds, including domestic, wild and hunting birds, such as chickens, turkeys and other chicken, ducks, geese and the like. Animals suitable for use in the invention can be of any age, including both adults and newborns. Transgenic animals can also be used in the invention. For a discussion of the transgenic animals currently used to study prion related diseases, see mainly Prusiner "Prions" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 13363-13383.

Композиции по изобретению можно использовать для лечения или предупреждения развития связанных с прионами заболеваний. Такие связанные с прионами заболевания включают в себя заболевания, вызванные полностью или отчасти патогенным прионным белком (PrP^Sc). Связанные с прионами заболевания включают в себя скрэпи, губчатые энцефаломиелиты крупного рогатого скота (BSE), коровье бешенство, кошачий губчатый энцефаломиелит, куру, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), болезнь Герштманн-Штрасслера-Шейнкера (GSS) и фатальную семейную бессонницу (FFI).The compositions of the invention can be used to treat or prevent the development of prion-related diseases. Such prion-related diseases include diseases caused in whole or in part by pathogenic prion protein (PrP ^Sc ). Prion-related diseases include scrapie, bovine spongiform encephalomyelitis (BSE), mad cow disease, feline spongiform encephalomyelitis, chicken, Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), Gerstmann-Strassler-Scheckernick's disease (GFI) and )

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Ниже приведены примеры определенных осуществлений для выполнения настоящего изобретения. Примеры представлены исключительно с иллюстративными целями и не предназначены каким-либо образом ограничить объем настоящего изобретения.The following are examples of specific implementations for carrying out the present invention. The examples are presented for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.

Были приложены усилия для того, чтобы гарантировать точность используемых чисел (например, количества, температуры и т.д.), но некоторая экспериментальная ошибка и отклонение должны, конечно же, учитываться.Efforts have been made to ensure the accuracy of the numbers used (e.g., quantity, temperature, etc.), but some experimental error and deviation should, of course, be taken into account.

Пример 1. Пептидные реагенты Example 1. Peptide Reagents

ПолучениеGetting

Пептидные фрагменты прионных белков химически синтезировали, используя стандартные методики синтеза пептидов, по существу как описано у Merrifield (1969) Advan. Enzymol. 32: 221 и Holm и Medal(1989), Multiple column peptide synthesis, p. 208E, Bayer and G. Jung (ed.), Peptides 1988, Walter de Gruyter & Co. Berlin-N. Y. Пептиды очищали ВЭЖХ и последовательность подтверждали при помощи масс-спектроскопии.Peptide fragments of prion proteins were chemically synthesized using standard peptide synthesis techniques, essentially as described by Merrifield (1969) Advan. Enzymol. 32: 221 and Holm and Medal (1989), Multiple column peptide synthesis, p. 208E, Bayer and G. Jung (ed.), Peptides 1988, Walter de Gruyter & Co. Berlin-N. Y. The peptides were purified by HPLC and the sequence was confirmed by mass spectroscopy.

В некоторых случаях синтезированные пептиды включали в себя дополнительные остатки на N- или C-концах, например остатки GGG и/или включали в себя одну или более аминокислотные замены по сравнению с последовательностями дикого типа.In some cases, the synthesized peptides included additional residues at the N- or C-terminus, for example, GGG residues and / or included one or more amino acid substitutions compared to wild-type sequences.

A. Пептоидные заменыA. Peptoid substitutions

Пептоидные замены также делали в пептиде, представленном в SEQ ID NO : 14 (QWNKPSKPKTN, соответствующем остаткам с 97 по 107 SEQ ID NO : 2), SEQ ID NO : 67 (KKRPKPGGWNTGG, соответствующем остаткам 23-36 SEQ ID NO : 2) и SEQ ID NO : 68 (KKRPKPGG, соответсвующем остаткам 23-30 SEQ ID NO : 2). В частности, один или более остатков пролина данных пептидов замещали различными N-замещенными пептиодами. См. на фиг.3 пептоид, которым можно заменить дюбой пролин. Пептоиды получали и синтезировали, как описано в патентах США № 5877278 и 6033631, оба полностью включены сюда в качестве ссылки; Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367.Peptoid substitutions were also made in the peptide provided in SEQ ID NO: 14 (QWNKPSKPKTN corresponding to residues 97 to 107 of SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 67 (KKRPKPGGWNTGG corresponding to residues 23-36 of SEQ ID NO: 2) and SEQ ID NO: 68 (KKRPKPGG corresponding to residues 23-30 of SEQ ID NO: 2). In particular, one or more proline residues of these peptides were substituted with various N-substituted peptides. See figure 3 peptoid, which can be replaced with a dyed proline. Peptoids were obtained and synthesized as described in US patent No. 5877278 and 6033631, both fully incorporated here by reference; Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367.

B. МультимеризацияB. Multimerization

Некоторые пептидные реагенты можно получить в виде мультимеров, например, получая тандемные повторы (связывая множестово копий пептида посредством линкеров, таких как GGG), пептиды-множественные антигены (MAP) и/или линейно связанные пептиды. Some peptide reagents can be obtained as multimers, for example, by obtaining tandem repeats (linking multiple copies of a peptide via linkers such as GGG), multiple antigen peptides (MAPs) and / or linearly linked peptides.

В частности, MAP получали, используя стандартные методики, по существу, как описано у Wu et al. (2001) J Am Chem Soc. 2001 123 (28): 6778-84; Spetzler et al. (1995) Int J Pept Protein Res. 45 (1): 78-85.In particular, MAPs were prepared using standard techniques, essentially as described by Wu et al. (2001) J Am Chem Soc. 2001 123 (28): 6778-84; Spetzler et al. (1995) Int J Pept Protein Res. 45 (1): 78-85.

Линейные и разветвленные пептиды (например, мультимеризация с линкером ПЭГ) также получали, используя полиэтиленгликолевые (ПЭГ) линкеры, с использованием стандартных методик. В частности, каркасы ПЭГ разветвленных мультипептидов получали с использованием следующих структур: биотин-ПЭГ-Lys-ПЭГ-Lys-ПЭГ-Lys-ПЭГ-Lys-ПЭГ-Lys (без пептидного контроля) и биотин-ПЭГ-Lys(пептид)-ПЭГ-Lys(пептид)-ПЭГ-Lys(пептид)-ПЭГ-Lys(пептид)-ПЭГ-Lys(пептид). Дополнительно, связь пептида с Lys представляла собой: Lys-эпсилон-NH-CO-(CH₂)₃-Mal-S-Cys-пептид. См. фиг.5.Linear and branched peptides (for example, multimerization with a PEG linker) were also prepared using polyethylene glycol (PEG) linkers using standard techniques. In particular, PEG scaffolds of branched multi-peptides were prepared using the following structures: Biotin-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys (without peptide control) and Biotin-PEG-Lys (peptide) -PEG -Lys (peptide) -PEG-Lys (peptide) -PEG-Lys (peptide) -PEG-Lys (peptide). Additionally, the linkage of the peptide to Lys was: Lys-epsilon-NH-CO- (CH ₂ ) ₃ -Mal-S-Cys-peptide. See FIG. 5.

C. БиотинилированиеC. Biotinylation

Пептиды биотинилировали, используя стандартные методики, после синтеза и очистки. Биотин добавляли к N- или C-концу пептида.Peptides were biotinylated using standard techniques after synthesis and purification. Biotin was added to the N- or C-terminus of the peptide.

Пример 2: Анализы связыванияExample 2: Binding Assays

A. ОсаждениеA. Precipitation

Пептидные реагенты, как описано здесь, исследовали на их способность специфически связываться с прионными белками, используя анализ осаждения с магнитными гранулами. Для данного анализа пептидные реагенты помечали биотином, который обеспечивал связывание с покрытыми стрептавидином магнитными гранулами.Peptide reagents, as described herein, were tested for their ability to specifically bind to prion proteins using magnetic bead precipitation analysis. For this analysis, peptide reagents were labeled with biotin, which provided binding to streptavidin-coated magnetic beads.

Гомогенат мозга получали из мышей Balb-c RMLPrP^sc+ и PrP^c+. Вкратце, 5 мл буфера TBS (50 мМ Tris-HCl pH 7,5 и 37,5 мМ NaCl) с 1% TW20 и 1% Triton 100 добавляли к навеске мозга ~0,5 г, чтобы получить 10% гомогенат. Мозговую взвесь гомогенизировали до тех пор, пока не исчезнут большие частицы. Аликвоты по 200 мкл, разбавленные в соотношении 1:1 в буфере, добавляли в предварительно охлажденные пробирки типа эппендорф и образцы подвергали действию ультразвука при нескольких повторах в течение нескольких секунд каждый. Образцы центрифугировали в течение 10-15 минут при 500x и удаляли надосадочную жидкость.Brain homogenate was obtained from Balb-c mice RMLPrP ^{sc +} and PrP ^{c +} . Briefly, 5 ml of TBS buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5 and 37.5 mM NaCl) with 1% TW20 and 1% Triton 100 was added ~ 0.5 g to the brain sample to obtain a 10% homogenate. The cerebral suspension was homogenized until large particles disappeared. Aliquots of 200 μl diluted in a 1: 1 ratio in buffer were added to pre-chilled Eppendorf tubes and the samples were sonicated at several repetitions for several seconds each. Samples were centrifuged for 10-15 minutes at 500x and the supernatant was removed.

Для проверки расщепления протеиназой K некоторые супернатанты разделяли на два образца и 4 мкл протеиназы K добавляли в один образец и вращали при 37ºC в течение 1 часа. Восемь микролитров PMSF добавляли в пробирку с протеиназой K, чтобы остановить расщепление, и пробирки инкубировали минимум в течение 1 часа при 4ºC.To verify cleavage by proteinase K, some supernatants were separated into two samples and 4 μl of proteinase K was added to one sample and rotated at 37 ° C for 1 hour. Eight microliters of PMSF were added to the proteinase K tube to stop digestion, and the tubes were incubated for at least 1 hour at 4 ° C.

Гомогенаты хранили при 4ºC до дальнейшего использования и, если необходимо, снова подвергали действию ультразвука, как описано выше. 10 мас.%/об. препарата PrP^c+ или PrP^Sc+ гомогената мозга инкубировали в течение ночи при 4ºC с меченым биотином пептидным реагентом, как указано ниже: подготовили пробирки, содержащие 400 мкл буфера, 50 мкл экстракта и 5 мкл меченного биотином пептидного реагента (10 мМ маточный раствор). Пробирки инкубировали в течение 2 часов минимум при комнатной температуре или в течение ночи при 4ºC на шейкере с платформой.The homogenates were stored at 4 ° C until further use and, if necessary, again subjected to ultrasound, as described above. 10 wt.% / Vol. PrP ^{c +} or PrP ^{Sc +} brain homogenate was incubated overnight at 4 ° C with biotin-labeled peptide reagent, as follows: prepared tubes containing 400 μl of buffer, 50 μl of extract and 5 μl of biotin-labeled peptide reagent (10 mM mother liquor). The tubes were incubated for 2 hours at least at room temperature or overnight at 4 ° C on a platform shaker.

После инкубации добавляли 50 мкл SA-гранул (Dynal M280 Streptavidin 112,06) и пробирки мешали путем встряхивания. Пробирки инкубировали с использованием шейкера (VWR, Rocking platform, Model 100) в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4ºC. After incubation, 50 μl of SA granules (Dynal M280 Streptavidin 112.06) was added and the tubes were mixed by shaking. Tubes were incubated using a shaker (VWR, Rocking platform, Model 100) for 1 hour at room temperature or overnight at 4ºC.

Образцы забирали из шейкера, помещали в магнитное поле, чтобы отобрать магнитные гранулы с присоединенным пептидным реагентом и прионом и отмывали 5-6 раз, используя 1 мл буфера для анализа. Образцы использовали сразу же или хранили при -20ºC до вестерн-блоттинга или ELISA, описанных ниже. Samples were taken from a shaker, placed in a magnetic field to select magnetic beads with attached peptide reagent and prion and washed 5-6 times using 1 ml of assay buffer. Samples were used immediately or stored at -20 ° C until Western blotting or ELISA described below.

B. Вестерн-блоттингB. Western blotting

Анализ путем вестерн-блоттинга проводили, как указано ниже. Комплексы гранула-пептид-прион, осажденные, как описано выше, денатурировали после последней промывки, добавляя 25-30 мкл буфера SDS (Novex Tris-Glycine SDS-Sample Buffer 2X), добавленного к каждой пробирке. Пробирки перемешивали при встряхивании до тех пор, пока все гранулы не суспендировались. Содержимое пробирок кипятили до открывания крышек, разгоняли на стандартном SDS-PAGE геле и переносили на твердую мембрану для анализа WB.Western blot analysis was performed as follows. The pellet-peptide-prion complexes precipitated as described above were denatured after the last wash by adding 25-30 μl of SDS buffer (Novex Tris-Glycine SDS-Sample Buffer 2X) added to each tube. The tubes were mixed with shaking until all pellets were suspended. The contents of the tubes were boiled until caps were opened, dispersed on a standard SDS-PAGE gel and transferred onto a solid membrane for WB analysis.

Мембраны блокировали в течение 30 минут в 5% молоке/TBS-T [50 мл 1 M Tris pH 7,5; 37,5 мл 4M NaCl, 1-10 мл Tween доводили молоком до объема 1 л] при комнатной температуре. Поликлональные антитела против приона в объеме между 10 и 15 мл, как описано в Международной заявке № PCT/US03/31057, поданной 30 сентября 2003, называемой «Prion Chimeras and Uses Thereof», добавляли при разбавлении 1:50 к мембране и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембрану многократно отмывали в TBS-T. После отмывки, добавляли вторичное антитело (антитело козы против кроличьих IgG (H+L) (Pierce), конъюгированное с щелочной фосфатазой c (AP), в разведении 1:1000 (в TBS-T) и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Мембрану многократно отмывали в TBS-T. Добавляли реагент, осаждающий щелочную фосфатазу (1-стадийный NBT/BCIP (Pierce) и проявляли, пока не появлялся фон или пока не появлялся сигнал.Membranes were blocked for 30 minutes in 5% milk / TBS-T [50 ml of 1 M Tris pH 7.5; 37.5 ml of 4M NaCl, 1-10 ml of Tween was adjusted with milk to a volume of 1 l] at room temperature. Polyclonal anti-prion antibodies in a volume of between 10 and 15 ml, as described in International Application No. PCT / US03 / 31057, filed September 30, 2003, called "Prion Chimeras and Uses Thereof", were added at a dilution of 1:50 to the membrane and incubated for 1 hour at room temperature. The membrane was washed many times in TBS-T. After washing, a secondary antibody (goat anti-rabbit IgG antibody (H + L) (Pierce) conjugated with alkaline phosphatase c (AP) was added, diluted 1: 1000 (in TBS-T) and incubated for 20 minutes at room temperature The membrane was washed repeatedly in TBS-T. A reagent precipitating alkaline phosphatase (1-stage NBT / BCIP (Pierce) was added and developed until a background appeared or until a signal appeared.

C. ELISA C. ELISA

После последней отмывки комплексы гранула-пептид, описанный выше, денатурировали гуанидином тиоционатом и проводили ELISA с денатурированным белком, как ранее описано Ryou et al. (2003) Lab Invest. 83 (6): 837-43. Величины O.D., превышающие пустые контроли (в диапазоне 0,172-0,259), считались положительными.After the last wash, the bead-peptide complexes described above were denatured with guanidine thiocyanate and ELISA was performed with the denatured protein as previously described by Ryou et al. (2003) Lab Invest. 83 (6): 837-43. Values O.D. exceeding the empty controls (in the range of 0.172-0.259) were considered positive.

D. РезультатыD. Results

Результаты анализов связывания путем вестерн-блоттинга и ELISA сведены в таблице 2. Вкратце, расщепление протеиназой K гомогената мозга не являлось необходимым для того, чтобы определить специфическое связывание пептидных реагентов, как описано здесь, для связывания с PrP^Sc. Как показано на фиг.4, ни в одном из случаев не наблюдали связывание с гомогенатом мозга дикого типа, указывая на то, что пептидные реагенты связывались с PrP^Sc специфически. Кроме того, при анализе путем вестерн-блоттинга, описанным выше, определили PrP^Sc при более чем четырех логарифмических разведениях, в то время как ELISA была, по крайней мере, 10X более чувствительным, чем вестерн-блоттинг.The results of Western blot binding and ELISA binding assays are summarized in Table 2. Briefly, proteinase K digestion of the brain homogenate was not necessary in order to determine the specific binding of the peptide reagents, as described herein, for binding to PrP ^Sc . As shown in FIG. 4, in no case was binding to a wild-type brain homogenate observed, indicating that the peptide reagents bind specifically to PrP ^Sc . In addition, when analyzing by Western blotting described above, PrP ^{Sc was} determined at more than four logarithmic dilutions, while the ELISA was at least 10X more sensitive than western blotting.

Таблица 2 table 2

1: Визуально оцениваемая относительная интенсивность сигнала 1: Visually estimated relative signal strength

2: циклизованная2: cyclized

3: остатки GGGG, добавленные/встроенные в указанное положение 3: GGGG residues added / embedded in the indicated position

4: остатки GGG, добавленные/встроенные в указанное положение4: GGG residues added / embedded in the indicated position

5: остатки GG, добавленные/встроенные в указанное положение 5: GG residues added / embedded in the indicated position

6: остатки KKK, добавленные/встроенные в указанное положение6: KKK residues added / embedded in the indicated position

Также для идентификации остатков, вовлеченных в связывание, проводили аланиновое сканирование.Alanine scanning was also performed to identify residues involved in binding.

Результаты показаны в таблице 3.The results are shown in table 3.

Таблица 3 Table 3

Кроме того, как показано в таблице 4, связывание PrP^Sc пептидными реагентами, имеющими SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68, далее усиливали заменами пролиновых остатков несколькими N-замещенными глицинами (пиптоидами).In addition, as shown in Table 4, PrP ^Sc binding by peptide reagents having SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 67, and SEQ ID NO: 68 was further enhanced by replacing proline residues with several N-substituted glycines (piptoids).

Таблица 4Table 4   Вестерн-блотWestern blot ELISA A_{405 нм} ELISA A _{405 nm} в (GGG)in (GGG) ^1one QWNKPSK*KTN (SEQ ID NO: 14)QWNKPSK * KTN (SEQ ID NO: 14)     ПролинProline ++++++ 0,7750.775 N-(S)-(1-фенилэтил)глицин (пептоид, обведенный на фиг.3A) (SEQ ID NO : 109)N- (S) - (1-phenylethyl) glycine (peptoid circled in FIG. 3A) (SEQ ID NO: 109) ++++ 0,8650.865 N-(4-гидроксифенил)глицин (пептоид, обведенный на фиг.3B) (SEQ ID NO: 110)N- (4-hydroxyphenyl) glycine (peptoid circled in FIG. 3B) (SEQ ID NO: 110) -- 0,9340.934 N-(циклопропилметил)глицин (пептоид, обведенный на фиг.3С) (SEQ ID NO: 111)N- (cyclopropylmethyl) glycine (peptoid circled in FIG. 3C) (SEQ ID NO: 111) ++++++++++ 1,1411,141 N-(изопропил)глицин (пептоид, обведенный на фиг.3D) (SEQ ID NO: 112)N- (isopropyl) glycine (peptoid circled in FIG. 3D) (SEQ ID NO: 112) Не определеноUndefined 0,9740.974 N-(3,5-диметоксибензил)глицин (пептоид, обведенный на фиг.3E) (SEQ ID NO: 113)N- (3,5-dimethoxybenzyl) glycine (peptoid circled in FIG. 3E) (SEQ ID NO: 113) ++++++ 2,0452,045 N-бутилглицин (пептоид, обведенный на фиг.3F) (SEQ ID NO : 114)N-butyl glycine (peptoid circled in FIG. 3F) (SEQ ID NO: 114) ++++++++ 0,7760.776 *в (GGG)* in (GGG) ^1one QWNK*SKPKTN (SEQ ID NO: 14)QWNK * SKPKTN (SEQ ID NO: 14)     N-(циклопропилметил)глицин (SEQ ID NO: 115)N- (cyclopropylmethyl) glycine (SEQ ID NO: 115) Не определеноUndefined 0,4980.498 N-(изопропил)глицин (SEQ ID NO: 116) N- (isopropyl) glycine (SEQ ID NO: 116) Не определеноUndefined 1,571,57 N-(3,5-диметоксибензил)глицин (SEQ ID NO: 117) N- (3,5-Dimethoxybenzyl) glycine (SEQ ID NO: 117) Не определеноUndefined 0,8230.823 N-бутилглицин (SEQ ID NO: 118) N-butyl glycine (SEQ ID NO: 118) Не определеноUndefined 0,6190.619 *в (GGG)* in (GGG) ^1one KKRPK*GG (SEQ ID NO: 68)KKRPK * GG (SEQ ID NO: 68)     ПролинProline Не определеноUndefined 0,7650.765 N-бутилглицин (SEQ ID NO: 119) N-butyl glycine (SEQ ID NO: 119) Не определеноUndefined 0,610.61 N-(3,5-диметоксибензил)глицин (SEQ ID NO: 120)N- (3,5-dimethoxybenzyl) glycine (SEQ ID NO: 120) Не определеноUndefined 0,6310.631 N-(изопропил)глицин (SEQ ID NO: 121)N- (isopropyl) glycine (SEQ ID NO: 121) Не определеноUndefined 0,5090.509 N-(циклопропилметил)глицин (SEQ ID NO : 122)N- (cyclopropylmethyl) glycine (SEQ ID NO: 122) Не определеноUndefined 0,5030.503 ** в (GGG)in (GGG) ^1one KKRPK*GGWNTGG (SEQ ID NO: 67)KKRPK * GGWNTGG (SEQ ID NO: 67)     Пролин Proline Не определеноUndefined 0,4510.451 N-бутилглицин (SEQ ID NO: 123)N-butyl glycine (SEQ ID NO: 123) Не определеноUndefined 0,5030.503 N-(3,5-диметоксибензил)глицин (SEQ ID NO: 124)N- (3,5-dimethoxybenzyl) glycine (SEQ ID NO: 124) Не определеноUndefined 0,4640.464 N-(изопропил)глицин (SEQ ID NO: 125)N- (isopropyl) glycine (SEQ ID NO: 125) Не определеноUndefined 0,5550.555 N-(циклопропилметил)глицин (SEQ ID NO: 126) N- (cyclopropylmethyl) glycine (SEQ ID NO: 126) Не определеноUndefined 0,3440.344 (GGG)(Ggg) ^1one QWNKX1SKX2KTNQWNKX1SKX2KTN     N-(циклопропилметил)глицин в X1; N- (циклопропилметил) глицин в X2 (SEQ ID NO:129)N- (cyclopropylmethyl) glycine in X1; N- (cyclopropylmethyl) glycine in X2 (SEQ ID NO: 129) Не определеноUndefined Не определеноUndefined N-(циклопропилметил)глицин в X1; N-(3,5-диметоксибензил)глицин в X2 (SEQ ID NO:130)N- (cyclopropylmethyl) glycine in X1; N- (3,5-Dimethoxybenzyl) glycine in X2 (SEQ ID NO: 130) Не определеноUndefined Не определеноUndefined N-(циклопропилметил)глицин в X1; N-бутилглицин в X2 (SEQ ID NO:131)N- (cyclopropylmethyl) glycine in X1; N-butyl glycine in X2 (SEQ ID NO: 131) Не определеноUndefined Не определеноUndefined N-(изопропил)глицин в X1; N-(циклопропилметил)глицин в X2 (SEQ ID NO:132)N- (isopropyl) glycine in X1; N- (cyclopropylmethyl) glycine in X2 (SEQ ID NO: 132) Не определеноUndefined Не определеноUndefined ¹Необязательный линкер GGG не присутствовал в пептидных реагентах в экспериментах, показанных в данной таблице ^{1 The} optional GGG linker was not present in the peptide reagents in the experiments shown in this table.

Более того, мультимеризация связывающих PrP^Sc реагентов также улучшала сродство к PrP^Sc. В частности, тандемные повторы давали более сильные сигналы (измеряемые вестерн-блоттингом), чем единичные копии. Предварительно дериватизированные формы MAP на гранулах в некоторых случаях повышали связывания до 2 раз. Однако формы MAP вызывали осаждение пептида в растворе. Линейно связанные пептиды также тестировали на их способность усиливать связывания, не вызывая преципитации.Moreover, multimerization of PrP ^Sc binding reagents also improved affinity for PrP ^Sc . In particular, tandem repeats gave stronger signals (measured by Western blotting) than single copies. In some cases, pre-derivatized forms of MAP on granules increased binding up to 2 times. However, the forms of MAP caused precipitation of the peptide in solution. Linearly bound peptides were also tested for their ability to enhance binding without causing precipitation.

Пример 3. Продукция антителExample 3. Production of antibodies

Далее предоставляется пример протокола, который может использоваться для получения антител к пептидным реагентам по изобретению.The following provides an example protocol that can be used to produce antibodies to the peptide reagents of the invention.

Мышей иммунизируют композицией, содержащей описанный здесь пептидный реагент (например, любой из SEQ ID NO: 12-108, предпочтительно, любой из SEQ ID NO: 14, 35, 50, 51, 56, 57, 65, 66, 67, 68, 72, 73, 77, 81, 82) ВМ (внутримышечно) или ВБ (внутрибрюшинно) на 0 сутки, с последующими 2-5 стимуляциями с интервалами не чаще, чем каждые 2 недели. Кровь собирали перед первой иммунизацией и затем через 7 суток после каждой стимуляции для мониторинга гуморального ответа на антиген. 6 порций крови из орбитальной вены брали от каждого животного (три из каждого глаза) примерно по 0,2 мл или менее на одну порцию. Последнюю стимуляцию доставляли путем ВВ (внутривенной) инъекции. Через трое суток после последней стимуляции мышей подвергали эвтаназии путем воздействия CО₂ или изофлурана с последующим смещением шейных позвонков. Затем собирали селезенки для продукции гибридом. Mice are immunized with a composition containing the peptide reagent described herein (for example, any of SEQ ID NO: 12-108, preferably any of SEQ ID NO: 14, 35, 50, 51, 56, 57, 65, 66, 67, 68, 72, 73, 77, 81, 82) BM (intramuscularly) or WB (intraperitoneal) on day 0, followed by 2-5 stimulations at intervals of no more than every 2 weeks. Blood was collected before the first immunization and then 7 days after each stimulation to monitor the humoral response to the antigen. 6 portions of blood from the orbital vein were taken from each animal (three from each eye), approximately 0.2 ml or less per serving. The last stimulation was delivered by BB (intravenous) injection. Three days after the last stimulation, the mice were euthanized by exposure to CO ₂ or isoflurane followed by cervical vertebrae displacement. Then the spleens were collected for the production of hybridomas.

Для первой инъекции использовали полный адъювант Фрейнда с последующим применением неполного адъюванта Фрейнда для остальных инъекций, за исключением ВВ инъекции. Препарат для ВВ инъекции получали в солевом растворе.For the first injection, Freund's complete adjuvant was used, followed by the use of Freund's incomplete adjuvant for the remaining injections, with the exception of the BB injection. A preparation for BB injection was obtained in saline.

Хотя предпочтительные осуществления настоящего изобретения описаны в некоторых подробностях, понятно, что могут быть сделаны очевидные вариации без уклонения от определенных здесь сущности и объема изобретения.Although preferred embodiments of the present invention have been described in some detail, it will be appreciated that obvious variations can be made without departing from the spirit and scope of the invention defined herein.

Claims (52)

1. Выделенный пептидный реагент, который преимущественно взаимодействует с патогенными формами белка конформационного заболевания по сравнению с непатогенными формами белка конформационного заболевания,
где пептидный реагент получают из фрагмента пептидного белка,
где пептидный реагент получают из пептида, выбранного из группы, включающей пептиды с SEQ ID NO:12-132.1. The selected peptide reagent, which mainly interacts with pathogenic forms of the protein conformational disease compared with non-pathogenic forms of the protein conformational disease,
where the peptide reagent is obtained from a fragment of a peptide protein,
where the peptide reagent is obtained from a peptide selected from the group comprising peptides with SEQ ID NO: 12-132. 2. Пептидный реагент по п.1, где конформационное заболевание представляет собой прионное заболевание, а патогенный белок представляет собой PrP^Sc, и непатогенный белок представляет собой PrP^C.2. The peptide reagent according to claim 1, where the conformational disease is a prion disease, and the pathogenic protein is PrP ^Sc , and the non-pathogenic protein is PrP ^C. 3. Пептидный реагент по п.2, где пептидный реагент содержит полипролиновый спиральный мотив II типа.3. The peptide reagent according to claim 2, where the peptide reagent contains a polyproline spiral type II motif. 4. Пептидный реагент по п.1, где пептидный реагент содержит мотив последовательности РХХР, в котором Р представляет собой пролин или N-замещенный глицин, и Х представляет собой любую аминокислоту.4. The peptide reagent according to claim 1, where the peptide reagent contains a motif of the sequence RCP, in which P is a proline or N-substituted glycine, and X represents any amino acid. 5. Пептидный реагент по п.2, где пептидный реагент содержит мотив последовательности РХХР, в котором Р представляет собой пролин или N-замещенный глицин, и Х представляет собой любую аминокислоту.5. The peptide reagent according to claim 2, where the peptide reagent contains a motif of the sequence RCP, in which P is a proline or N-substituted glycine, and X represents any amino acid. 6. Пептидный реагент по п.1, где указанный пептидный реагент кодируется генетически.6. The peptide reagent according to claim 1, where the specified peptide reagent is encoded genetically. 7. Пептидный реагент по п.1, где пептидный реагент получают из пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов SEQ ID NO:66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82 и 84.7. The peptide reagent according to claim 1, where the peptide reagent is obtained from a peptide selected from the group consisting of peptides SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120 , 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 , 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, and 84. 8. Пептидный реагент по п.1, где пептидный реагент получают из пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов с SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 и 127.8. The peptide reagent according to claim 1, where the peptide reagent is obtained from a peptide selected from the group consisting of peptides with SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 and 127. 9. Пептидный реагент по п.1, где пептидный реагент включает в себя аминокислотную последовательность (G)_n, где n=1, 2, 3 или 4, с N-конца и/или C-конца.9. The peptide reagent according to claim 1, where the peptide reagent includes the amino acid sequence (G) _n , where n = 1, 2, 3 or 4, from the N-terminus and / or C-terminus. 10. Пептидный реагент по п.7 или 8, где пептидный реагент биотинилирован.10. The peptide reagent according to claim 7 or 8, where the peptide reagent is biotinylated. 11. Пептидный реагент по п.1, где пептидный реагент получают из пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов SEQ ID NO:14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131 и 132.11. The peptide reagent according to claim 1, where the peptide reagent is obtained from a peptide selected from the group consisting of peptides SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109 , 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131 and 132. 12. Пептидный реагент по п.11, где пептидный реагент включает аминокислотную последовательность (G)_n, где n-1, 2, 3 или 4, с N-конца и/или C-конца.12. The peptide reagent according to claim 11, where the peptide reagent includes the amino acid sequence (G) _n , where n is 1, 2, 3 or 4, from the N-terminus and / or C-terminus. 13. Пептидный реагент по п.11 или 12, где пептидный реагент биотинилирован.13. The peptide reagent according to claim 11 or 12, where the peptide reagent is biotinylated. 14. Пептидный реагент по п.1, где пептидный реагент получают из пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов SEQ ID NO:109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 129, 130, 131, и 132.14. The peptide reagent according to claim 1, where the peptide reagent is obtained from a peptide selected from the group consisting of peptides SEQ ID NO: 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 , 121, 122, 123, 124, 125, 126, 129, 130, 131, and 132. 15. Пептидный реагент по п.14, где пептидный реагент биотинилирован.15. The peptide reagent according to 14, where the peptide reagent is biotinylated. 16. Пептидный реагент по п.1, где пептидный реагент получают из пептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов SEQ ID NO:56, 57, 65, 82, и 84.16. The peptide reagent according to claim 1, where the peptide reagent is obtained from a peptide selected from the group consisting of peptides SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, and 84. 17. Пептидный реагент по п.16, где пептидный реагент биотинилирован.17. The peptide reagent according to clause 16, where the peptide reagent is biotinylated. 18. Полинуклеотид, кодирующий пептидный реагент по п.1.18. The polynucleotide encoding the peptide reagent according to claim 1. 19. Комплекс, содержащий пептидный реагент по любому из пп.2-17 и патогенный прионный белок.19. A complex containing the peptide reagent according to any one of claims 2-17 and a pathogenic prion protein. 20. Способ обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающий:
(a) контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с первым пептидным реагентом по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14, в условиях, которые обеспечивают связывание первого пептидного реагента с патогенным прионным белком, если он присутствует, с образованием первого комплекса; и
(b) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце путем его связывания с первым пептидным реагентом.20. A method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:
(a) contacting a sample in which the presence of a pathogenic prion is expected with the first peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11, or 14, under conditions that ensure the binding of the first peptide reagent to a pathogenic prion protein, if he present, with the formation of the first complex; and
(b) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to the first peptide reagent. 21. Способ по п.20, в котором указанный первый пептидный реагент является меченым и может быть обнаружен.21. The method of claim 20, wherein said first peptide reagent is labeled and can be detected. 22. Способ по п.20, в котором указанный первый пептидный реагент биотинилирован.22. The method according to claim 20, wherein said first peptide reagent is biotinylated. 23. Способ по п.20, в котором указанный первый пептидный реагент присоединен к твердой основе.23. The method according to claim 20, wherein said first peptide reagent is attached to a solid base. 24. Способ обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающий:
(a) контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с первым пептидным реагентом по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14, в условиях, которые обеспечивают связывание первого пептидного реагента с патогенным прионом, если он присутствует, с образованием первого комплекса;
(b) контактирование указанного первого комплекса со вторым пептидным реагентом по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14, в условиях, которые обеспечивают связывание второго пептидного реагента с патогенным прионом в указанном первом комплексе, где указанный второй пептидный реагент включает в себя выявляемую метку; и
(c) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце путем его связывания со вторым пептидным реагентом.24. A method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:
(a) contacting a sample in which the presence of a pathogenic prion is expected with the first peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11, or 14, under conditions that ensure the binding of the first peptide reagent to the pathogenic prion, if present , with the formation of the first complex;
(b) contacting said first complex with a second peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11, or 14, under conditions that allow the second peptide reagent to bind to a pathogenic prion in said first complex, wherein said second peptide reagent includes a detectable label; and
(c) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to a second peptide reagent. 25. Способ по п.24, в котором указанный первый пептидный реагент и указанный второй пептидный реагент различны.25. The method according to paragraph 24, wherein said first peptide reagent and said second peptide reagent are different. 26. Способ по п.24, в котором указанный первый пептидный реагент и указанный второй пептидный реагент одинаковы.26. The method according to paragraph 24, wherein said first peptide reagent and said second peptide reagent are the same. 27. Способ по п.24, в котором указанный первый пептидный реагент присоединен к твердой основе.27. The method according to paragraph 24, wherein said first peptide reagent is attached to a solid base. 28. Способ по п.24, в котором указанный первый пептид биотинилирован.28. The method according to paragraph 24, wherein said first peptide is biotinylated. 29. Способ обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающий:
(a) контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с первым пептидным реагентом по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14, в условиях, которые обеспечивают связывание первого пептидного реагента с патогенным прионом, если он присутствует, с образованием первого комплекса;
(b) удаление несвязанных материалов образца;
(c) диссоциацию указанного патогенного приона с указанного первого комплекса;
(d) контактирование указанного диссоциированного патогенного приона со вторым пептидным реагентом по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14, в условиях, которые обеспечивают связывание второго пептидного реагента с патогенным прионом, где указанный второй пептидный реагент включает в себя выявляемую метку; и
(e) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце за счет его связывания со вторым пептидным реагентом.29. A method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:
(a) contacting a sample in which the presence of a pathogenic prion is expected with the first peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11, or 14, under conditions that ensure the binding of the first peptide reagent to the pathogenic prion, if present , with the formation of the first complex;
(b) removal of unbound sample materials;
(c) dissociating said pathogenic prion from said first complex;
(d) contacting said dissociated pathogenic prion with a second peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11, or 14, under conditions that allow binding of the second peptide reagent to a pathogenic prion, wherein said second peptide reagent includes detectable label; and
(e) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to the second peptide reagent. 30. Способ обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающий:
(a) контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, с первым пептидным реагентом по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14, в условиях, которые обеспечивают связывание первого пептидного реагента с патогенным прионом, если он присутствует, с образованием первого комплекса;
(b) удаление несвязанных материалов образца;
(b) диссоциацию указанного патогенного приона с указанного первого комплекса;
(d) контактирование указанного диссоциированного патогенного приона со связывающим прион реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание связывающего прион реагента с патогенным прионом, где указанный связывающий прион реагент включает в себя выявляемую метку;и
(e) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце за счет его связывания со связывающим прион реагентом.30. A method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:
(a) contacting a sample in which the presence of a pathogenic prion is expected with the first peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11, or 14, under conditions that ensure the binding of the first peptide reagent to the pathogenic prion, if present , with the formation of the first complex;
(b) removal of unbound sample materials;
(b) dissociating said pathogenic prion from said first complex;
(d) contacting said dissociated pathogenic prion with a prion binding reagent under conditions that allow binding of a prion binding reagent to a pathogenic prion, wherein said prion binding reagent includes a detectable label; and
(e) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to a prion binding reagent. 31. Способ по п.30, где связывающий прион реагент выбран из группы, включающей антитела против приона, гибридные полипептиды с привитым мотивом, катионные или анионные полимеры, катализаторы размножения и плазминоген.31. The method according to clause 30, where the prion binding reagent is selected from the group comprising antibodies against prion, hybrid polypeptides with a grafted motif, cationic or anionic polymers, propagation catalysts and plasminogen. 32. Способ обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающий:
(a) контактирование образца, в котором предполагается наличие патогенного приона, со связывающим прион реагентом в условиях, которые обеспечивают связывание связывающего прион реагента с патогенным прионом, если он присутствует, с образованием первого комплекса;
(b) удаление несвязанных материалов образца;
(c) контактирование указанного первого комплекса с пептидным реагентом по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14, в условиях, которые обеспечивают связывание пептидного реагента с патогенным прионом, где указанный пептидный реагент включает в себя выявляемую метку; и
(d) обнаружение патогенного приона, если он есть, в образце за счет его связывания с пептидным реагентом.32. A method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:
(a) contacting a sample in which the presence of a pathogenic prion is expected with a prion binding reagent under conditions that allow the binding of the prion binding reagent to the pathogenic prion, if present, to form the first complex;
(b) removal of unbound sample materials;
(c) contacting said first complex with a peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11, or 14, under conditions that allow the peptide reagent to bind to a pathogenic prion, wherein said peptide reagent includes a detectable label; and
(d) detecting a pathogenic prion, if any, in the sample by binding to a peptide reagent. 33. Способ обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающий:
(a) получение твердой основы, содержащей первый пептидный реагент по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14;
(b) контактирование твердой основы с образцом, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенных прионов, если они присутствуют в данном образце, с первым пептидным реагентом; контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации вторым пептидным реагентом по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14, в условиях, которые обеспечивают связывание второго пептидного реагента с патогенными прионами, связанными с первым пептидным реагентом; и
(c) выявление комплексов, образованных между первым пептидным реагентом, патогенным прионом из образца и вторым пептидным реагентом, с обнаружением за счет этого наличия патогенного приона в образце.33. A method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:
(a) obtaining a solid base containing the first peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11 or 14;
(b) contacting the solid base with the sample, under conditions that allow the binding of pathogenic prions, if present in the sample, to the first peptide reagent; contacting the solid base with a labeled and capable of visualizing the second peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11 or 14, under conditions that ensure the binding of the second peptide reagent to pathogenic prions associated with the first peptide reagent; and
(c) detecting complexes formed between the first peptide reagent, the pathogenic prion from the sample and the second peptide reagent, thereby detecting the presence of a pathogenic prion in the sample. 34. Способ обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающий:
(a) получение твердой основы, содержащей связывающий прион реагент;
(b) контактирование твердой основы с образцом в условиях, которые обеспечивают связывание прионных белков, если они присутствуют в данном образце, со связывающим прион реагентом;
(c) контактирование твердой основы с меченым и способным к визуализации вторым пептидным реагентом по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14; и
(d) выявление комплексов, образованных между связывающим прион реагентом, патогенным прионом из биологического образца, и вторым пептидным реагентом.34. A method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:
(a) obtaining a solid base containing a prion binding reagent;
(b) contacting the solid base with a sample under conditions that allow the binding of prion proteins, if present in the sample, to a prion binding reagent;
(c) contacting the solid base with a labeled and visualizable second peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11, or 14; and
(d) detecting complexes formed between a prion binding reagent, a pathogenic prion from a biological sample, and a second peptide reagent. 35. Способ обнаружения в образце патогенного приона, предусматривающий:
(a) получение твердой основы, содержащей первый пептидный реагент по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14;
(b) объединение твердой основы с меченым и способным к визуализации первым лигандом, причем сродство связывания первого пептидного реагента с меченым и способным к визуализации первым лигандом слабее, чем сродство связывания первого пептидного реагента с патогенным прионом;
(c) объединение образца с твердой основой в условиях, которые позволяют патогенному приону, когда он присутствует в образце, связываться с первым пептидным реагентом и вытеснять первый лиганд; и
(d) выявление комплексов, образованных между первым пептидным реагентом и патогенным прионом из образца.35. A method for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:
(a) obtaining a solid base containing the first peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11 or 14;
(b) combining the solid base with a labeled and visualizable first ligand, wherein the affinity of binding of the first peptide reagent to a labeled and visualizable first ligand is weaker than the affinity of binding of the first peptide reagent to a pathogenic prion;
(c) combining the sample with a solid base under conditions that allow the pathogenic prion, when present in the sample, to bind to the first peptide reagent and displace the first ligand; and
(d) detecting complexes formed between the first peptide reagent and the pathogenic prion from the sample. 36. Способ по п.23, в котором твердая основа выбрана из группы, состоящей из нитроцеллюлозы, полистирольного латекса, поливинилфторида, диазотированной бумаги, нейлоновых мембран, активированных гранул и отвечающих на магнитное поле гранул.36. The method according to item 23, in which the solid base is selected from the group consisting of nitrocellulose, polystyrene latex, polyvinyl fluoride, diazotized paper, nylon membranes, activated granules and responding to the magnetic field of the granules. 37. Способ по п.20, в котором образец представляет собой биологический образец.37. The method according to claim 20, in which the sample is a biological sample. 38. Способ по п.37, в котором биологический образец выбран из группы, включающей органы, цельную кровь, фракцию крови, компоненты крови, плазму, тромбоциты, сыворотку, цереброспинальную жидкость (ЦСЖ), ткань головного мозга, ткань нервной системы, мышечную ткань, костный мозг, мочу, слезы, не относящиеся к ткани нервной системы, органы и/или продукты биопсии или некропсии.38. The method according to clause 37, in which the biological sample is selected from the group comprising organs, whole blood, blood fraction, blood components, plasma, platelets, serum, cerebrospinal fluid (CSF), brain tissue, tissue of the nervous system, muscle tissue , bone marrow, urine, tears not related to tissue of the nervous system, organs and / or biopsy or necropsy products. 39. Способ по п.38, в котором биологический образец представляет собой цельную кровь, плазму, тромбоциты, фракции крови или сыворотку.39. The method of claim 38, wherein the biological sample is whole blood, plasma, platelets, blood fractions, or serum. 40. Твердая основа, содержащая по меньшей мере один пептидный реагент по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14.40. A solid base containing at least one peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11 or 14. 41. Набор для обнаружения в образце патогенного приона, содержащий:
(а) твердую основу по п.40; и другие необходимые реагенты и, необязательно, положительные и отрицательные контроли.41. A kit for detecting a pathogenic prion in a sample, comprising:
(a) a solid base according to claim 40; and other necessary reagents and, optionally, positive and negative controls. 42. Композиция, содержащая пептидный реагент по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14.42. A composition comprising a peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11 or 14. 43. Композиция, содержащая полинуклеотид по п.18.43. A composition comprising a polynucleotide according to claim 18. 44. Способ лечения или профилактики прионного заболевания, предусматривающий введение животному одной или нескольких композиций по п.42.44. A method for the treatment or prophylaxis of prion disease, comprising administering to the animal one or more compositions of claim 42. 45. Способ по п.44, где индивидуум представляет собой млекопитающее.45. The method according to item 44, where the individual is a mammal. 46. Способ по п.45, в котором млекопитающее представляет собой человека.46. The method according to item 45, in which the mammal is a human. 47. Способ по п.44, в котором композицию вводят внутримышечно, через слизистую оболочку, интраназально, подкожно, внутрикожно, чрезкожно, интравагинально, интраректально, перорально или внутривенно.47. The method according to item 44, in which the composition is administered intramuscularly, through the mucous membrane, intranasally, subcutaneously, intradermally, percutaneously, intravaginally, intrarectally, orally or intravenously. 48. Способ выделения из образца патогенного прионного белка, предусматривающий:
(a) получение твердой основы, содержащей пептидный реагент по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14;
(b) контактирование указанного образца с указанной твердой основой в условиях, которые обеспечивают связывание патогенного прионного белка, если он присутствует в указанном образце, с указанным первым пептидным реагентом, для образования первого комплекса, и
(a) удаление несвязанных материалов образца.48. A method for isolating a pathogenic prion protein from a sample, the method comprising:
(a) obtaining a solid base containing the peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11 or 14;
(b) contacting said sample with said solid base under conditions which allow the pathogenic prion protein to bind, if present in said sample, to said first peptide reagent to form a first complex, and
(a) removal of unbound sample materials. 49. Способ по п.48, дополнительно предусматривающий стадию диссоциации указанного патогенного прионного белка с указанного первого комплекса.49. The method of claim 48, further comprising the step of dissociating said pathogenic prion protein from said first complex. 50. Способ элиминации из образца патогенных прионных белков, включающий в себя:
(a) получение твердой основы, содержащей пептидный реагент по любому из пп.1, 2, 7, 8, 11 или 14;
(b) контактирование указанной твердой основы с образцом, в котором предполагается наличие патогенных прионных белков, в условиях, которые обеспечивают связывание патогенных прионных белков, если они присутствуют, с пептидным реагентом; и
(a) получение несвязанных материалов образца.50. The method of elimination from a sample of pathogenic prion proteins, including:
(a) obtaining a solid base containing the peptide reagent according to any one of claims 1, 2, 7, 8, 11 or 14;
(b) contacting said solid base with a sample in which the presence of pathogenic prion proteins is expected under conditions which allow the binding of pathogenic prion proteins, if present, to the peptide reagent; and
(a) obtaining unbound sample materials. 51. Способ получения продукта крови, который, по существу, лишен патогенных прионов, причем указанный продукт крови включает в себя цельную кровь, плазму, тромбоциты или сыворотку, указанный способ предусматривает:
(a) скрининг аликвот цельной крови, плазмы, тромбоцитов или сыворотки из собранных образцов крови способом по п.20;
(a) элиминацию образцов, в которых обнаружены патогенные прионы; и
(a) комбинирование образцов, в которых не обнаружены патогенные прионы, для получения продукта крови, по существу, лишенного патогенных прионов.51. A method for producing a blood product that is substantially devoid of pathogenic prions, said blood product comprising whole blood, plasma, platelets or serum, said method comprising:
(a) screening aliquots of whole blood, plasma, platelets or serum from collected blood samples by the method of claim 20;
(a) elimination of samples in which pathogenic prions are found; and
(a) combining samples in which pathogenic prions are not found to produce a blood product substantially devoid of pathogenic prions. 52. Способ получения продукта питания, который, по существу, лишен патогенных прионов, причем указанный способ предусматривает:
(a) скрининг образца, взятого из живых организмов, которые пойдут на продукты питания, или образца, взятого из пищи, предназначенного для снабжения питанием, способом по п.20;
(b) элиминацию образцов, в которых обнаружены патогенные прионы; и
(c) комбинирование образцов, в которых не обнаружены патогенные прионы, для предоставления продукта питания, по существу, лишенного патогенных прионов. 52. A method of obtaining a food product that is essentially devoid of pathogenic prions, said method comprising:
(a) screening a sample taken from living organisms that go for food, or a sample taken from food intended to be provided with food, by the method of claim 20;
(b) elimination of samples in which pathogenic prions are found; and
(c) combining samples in which pathogenic prions are not found to provide a food product substantially devoid of pathogenic prions.

Images