RU2379028C2 - Композиция, стимулирующая иммунный ответ, содержащая наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида - Google Patents
Композиция, стимулирующая иммунный ответ, содержащая наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида Download PDFInfo
- Publication number
- RU2379028C2 RU2379028C2 RU2006142094/15A RU2006142094A RU2379028C2 RU 2379028 C2 RU2379028 C2 RU 2379028C2 RU 2006142094/15 A RU2006142094/15 A RU 2006142094/15A RU 2006142094 A RU2006142094 A RU 2006142094A RU 2379028 C2 RU2379028 C2 RU 2379028C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoparticles
- allergen
- antigen
- composition
- specified
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 425
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 180
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 title claims abstract description 71
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 44
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 12
- XJRBAMWJDBPFIM-UHFFFAOYSA-N methyl vinyl ether Chemical compound COC=C XJRBAMWJDBPFIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 title claims description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 137
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 137
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 137
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims abstract description 135
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 72
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims abstract description 68
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 54
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 37
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 claims description 33
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 14
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 9
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 7
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 230000029662 T-helper 1 type immune response Effects 0.000 claims description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000029069 type 2 immune response Effects 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 117
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 117
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 69
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 39
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 39
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 description 37
- 230000004044 response Effects 0.000 description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 27
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 26
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 26
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 24
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 22
- XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N trimethylenediamine Chemical compound NCCCN XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 20
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 19
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 19
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 19
- 241000589568 Brucella ovis Species 0.000 description 17
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 14
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 13
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 13
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 13
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 12
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 12
- UPBDXRPQPOWRKR-UHFFFAOYSA-N furan-2,5-dione;methoxyethene Chemical compound COC=C.O=C1OC(=O)C=C1 UPBDXRPQPOWRKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 10
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 10
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 10
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 9
- 229920001567 vinyl ester resin Polymers 0.000 description 9
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 8
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 6
- 102100021878 Neuronal pentraxin-2 Human genes 0.000 description 6
- 101710155147 Neuronal pentraxin-2 Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000008064 anhydrides Chemical group 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- UFXGQUPBYNXNEW-UHFFFAOYSA-N photo-fenton reagent Chemical compound C1=CC(C(N(CC(OC)OO)C2=O)=O)=C3C2=CC=C2C(=O)N(CC(OC)OO)C(=O)C1=C32 UFXGQUPBYNXNEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 6
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 4
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000577180 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) Neutral protease 2 Proteins 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000017307 interleukin-4 production Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229940039328 nanoparticle-based vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- -1 trehallose Chemical compound 0.000 description 2
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 2
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000934064 Acarus siro Species 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010001742 Allergy to animal Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000223602 Alternaria alternata Species 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 235000004355 Artemisia lactiflora Nutrition 0.000 description 1
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 240000006891 Artemisia vulgaris Species 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000123966 Blomia tropicalis Species 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 240000006122 Chenopodium album Species 0.000 description 1
- 235000009344 Chenopodium album Nutrition 0.000 description 1
- 241001149956 Cladosporium herbarum Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 241000723198 Cupressus Species 0.000 description 1
- 244000052363 Cynodon dactylon Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 240000004585 Dactylis glomerata Species 0.000 description 1
- 241000238713 Dermatophagoides farinae Species 0.000 description 1
- 241000238740 Dermatophagoides pteronyssinus Species 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000238741 Euroglyphus maynei Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000234645 Festuca pratensis Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical class O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 208000001718 Immediate Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010060231 Insect Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001510164 Lepidoglyphus destructor Species 0.000 description 1
- 240000004296 Lolium perenne Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 235000002725 Olea europaea Nutrition 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 241001465379 Parietaria judaica Species 0.000 description 1
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- 244000239204 Plantago lanceolata Species 0.000 description 1
- 235000010503 Plantago lanceolata Nutrition 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 101001022461 Salmonella enteritidis Fimbrial protein Proteins 0.000 description 1
- 244000124765 Salsola kali Species 0.000 description 1
- 235000007658 Salsola kali Nutrition 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010045240 Type I hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000611866 Tyrophagus putrescentiae Species 0.000 description 1
- 244000274883 Urtica dioica Species 0.000 description 1
- 235000009108 Urtica dioica Nutrition 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- YEJAJYAHJQIWNU-UHFFFAOYSA-N azelastine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CN(C)CCCC1N1C(=O)C2=CC=CC=C2C(CC=2C=CC(Cl)=CC=2)=N1 YEJAJYAHJQIWNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- QSKWJTXWJJOJFP-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethoxyethane Chemical compound ClC(Cl)Cl.CCOCC QSKWJTXWJJOJFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013267 controlled drug release Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000003479 dental cement Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- LRMHFDNWKCSEQU-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;phenol Chemical compound CCOCC.OC1=CC=CC=C1 LRMHFDNWKCSEQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005428 food component Substances 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010028403 hemagglutinin esterase Proteins 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000002861 immature t-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- DQRZDIMTJNNJHB-UHFFFAOYSA-N isis 2922 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(O)=S)C(OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(S)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)C1 DQRZDIMTJNNJHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007935 oral tablet Substances 0.000 description 1
- 229940096978 oral tablet Drugs 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007119 pathological manifestation Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 102000007739 porin activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000024664 tolerance induction Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229940046536 tree pollen allergenic extract Drugs 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009959 type I hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 229920006163 vinyl copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
- A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
- A61K51/1241—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins
- A61K51/1244—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins microparticles or nanoparticles, e.g. polymeric nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/70—Nanostructure
- Y10S977/773—Nanoparticle, i.e. structure having three dimensions of 100 nm or less
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и касается композиции, стимулирующей иммунный ответ, содержащей наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида. Указанные наночастицы могут дополнительно содержать аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, который может находиться внутри указанных наночастиц и/или по крайней мере частично покрывать поверхность указанных наночастиц и необязательно перекрестно-связывающий агент. Композиция, стимулирующая иммунный ответ может использоваться в качестве адъюванта в иммунотерапии и вакцинах. Преимущество изобретения заключается в повышении активности. 6 н. и 26 з.п. ф-лы, 2 табл., 14 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению наночастиц на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида, необязательно содержащих аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, в качестве адъюванта в иммунотерапии и вакцинах. Также настоящее изобретение относится к композициям, стимулирующим иммунный ответ, содержащим указанные наночастицы.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Как известно, существуют высокоиммуногенные антигены, которые способны индуцировать защитные иммунные ответы у пациента, хотя существуют другие антигены, которые не индуцируют указанный защитный ответ или которые индуцируют очень слабый иммунный ответ. Как правило, иммунный ответ хозяина на слабый иммуногенный антиген может быть стимулирован посредством совместного введения с адъювантом.
Адъюванты
.
Адъювантом является любое вещество, которое усиливает иммунный ответ на антиген, с которым он смешан. Адъюванты, главным образом, действуют посредством трех механизмов: i) формирования антигенного или аллергенного депозита в месте вакцины, из которого биологически активный продукт будет выделяться в течение различного периода времени; ii) доставки антигена или аллергена к антиген-презентующим клеткам; iii) индуцирования секреции интерлейкина.
Некоторыми классическими примерами адъювантов являются соли алюминия (Alhydrogel) и катехоламины (которые усиливают Th2 ответ) и липополисахарид грамотрицательных бактерий и определенные последовательности CpG (которые усиливают Th1 ответ). С другой стороны, многочисленные исследования показывают, что определенные небиологические векторы, такие как микрочастицы (сферические частицы полимерной природы, покрытые веществом) или липосомы (сферические пузырьки с водной центральной полостью, покрытые различными бимолекулярными фосфолипидами и холестериновыми пленками), также могут действовать как адъюванты [Eldridge et al., Infect Immun, 59 (1991) 2978-2986; O`Hagan et al., Vaccine, 18 (2000) 1793-1801; Murillo et al., Vaccine, 30 (2001) 4099-4106].
Другим типом небиологических векторов, который может рассматриваться для использования в качестве адъювантов, являются твердые частицы коллоидных систем с размером менее микрометра, также называемые наночастицами, которые подразделяются на матриксные наносферы и везикулярные нанокапсулы [Orecchioni and Irache, Formes pharmaceutiques pour application locale. Lavoisier Tech and Doc., Paris, (1996) 441-457]. Нанокапсулы являются везикулярными системами, образованными внутренними полостями, которые окружены полимерной мембраной или стенкой. Наносферы являются матриксными формами, образованными пространственной полимерной сеткой. В обоих случаях молекулы биологически активного вещества могут быть растворены, захвачены или связаны с макромолекулярной структурой (в наносферах) или инкапсулированы полимерной мембраной (в нанокапсулах) и даже могут быть адсорбированы на поверхности наночастицы.
Распространение наночастиц в организме, как правило, зависит от его физикохимических характеристик (главным образом, размера и свойств поверхности), определяющих его взаимодействие с биологической средой. Таким образом, наночастицы являются фармакологическими формами, которые вызывают особенный интерес для иммунотерапии или в качестве адъювантов вакцины для введения антигенов и/или аллергенов.
Как правило, наиболее значимые возможности, предоставляемые такими векторами небиологической природы, являются следующими (i) они защищают инкапсулированный материал от химической, ферментативной или иммунологической инактивации при введении и на месте действия; (ii) они улучшают транспорт биологически активной молекулы к труднодоступным местам и ее проникновение в клетку; (iii) они пролонгируют время пребывания лекарственного средства в организме и контролируют его высвобождение; (iv) они повышают специфическую активность посредством избирательности, эффективности и регуляции концентрации инкапсулированных материалов в клетки мишени и/или молекулы мишени; и (v) они повышают стабильность материала, в который они введены в процессе производства, транспортировки и хранения медицинского препарата.
Применение адъювантов в вакцинации
Применение частиц адъювантов в форме эмульсий, микрочастиц ISCOMS или липосом были оценены ранее несколькими исследовательскими группами [см.: Singh et al., Int J Parasitology 33 (2003) 469-478].
Захват антигена «антиген-презентующими клетками» повышается, если эти антигены связаны с полимерными частицами или находятся внутри них. На протяжении многих лет в качестве контролируемых антиген производящих систем на людях и животных использовались биодеградируемые и биосовместимые полиэфиры [Okad et al., J Pharm Sci, 12 (1995) 1-99; Putney et al., Nat Biotechnol, 16 (1998) 153-157]. В отличие от аллюминевых адъювантов микрочастицы эффективны для индуцирования клеточных и цитотоксичных иммунных ответов у мышей [Nixon et al., Vaccine 14 (1996) 1523-1530; Maloy et al., Immunology 81 (1994)661-667; Moore et al., Vaccine 13 (1995) 1741-1749]. Пероральная иммунизация микрочастицами у мышей индуцирует сильные иммунные ответы на слизистой и на системном уровне по сравнению с инкапсулированными антигенами [Chalacombe et al., Immunology 176 (1992) 164-168; Eldrige et al., J Control Rel 11 (1990) 205-214; O`Hagan et al., Novel Delivery Systems for Oral Vaccines (1990) 175-205]. Эта способность является результатом интернализации антигена посредством специализированных клеток лимфоидной ткани слизистых оболочек [O`Hagan, J Anat, 189 (1996) 477-482]. Было показано, что мукозальная иммунизация различными корпускулярными системами эффективна против различных патогенов, таких как Bordetella pertussis [Chaill et al., Vaccine 13 (1995) 455-462; Jones et al., Vaccine 15 (1997) 814-817; Shahin et al., Infect Immun, 63 919950 1195-1200; Conway et al., Vaccine 19 (2001) 1940-1950], Chlamidia trachomatis [Whittum-Hudson et al., Nat Med 2 (1996) 1116-1121], Salmonella Typhimurium [Allaoui-Attarki et al., Infect Immun 65 (1997) 853-857] и Brucella [Murillo et al., Vaccine, 19 (2001) 4099-4106].
Применение адъювантов в иммунотерапии
Аллергические заболевания являются патологическим проявлением, вызванным негативным иммунным ответом (реакция гиперчувствительности) на, по сути, безвредные макромолекулы, называемые аллергенами. Такая реакция гиперчувствительности проявляется приблизительно у 30% мировой популяции, главным образом в индустриально развитых странах. Реакция гиперчувствительности является причиной таких заболеваний, как аллергические риниты, бронхиальная астма, пищевые аллергии и аллергии на лекарственные средства и насекомых [Settipane et al., Allergy Proc, 15 (1994) 21-25].
В Испании этот тип заболеваний характерен для возрастной группы от 4 до 17 лет и составляет 13,3%; среди них у 6,4% возникает бронхиальная астма, показатель смертности от астмы в Испании составляет 1,5/100000 жителей.
Согласно механистической теории аллергические заболевания возникают в результате нарушения баланса между двумя основными типами ответов, которые могут возникнуть после активации хелперных Т-клеток: Th1 и Th2. Цитокины, находящиеся во внешней среде клетки, действуют определенным образом, направляя дифференциацию незрелых Т-клеток (Th0) таким образом, что присутствие интерлейкина 12 (IL-12), гамма-интерферона (INF-γ), инрелейкина 18 (IL-18) и альфа-интерферона (INF-α) индуцирует дифференциацию в Th1, которые в основном характеризуются продукцией большого количества INF-γ и в меньшей степени интерлейкина 2 (IL-2) и бета-интерферона (INF-β). Последующая стимуляция В-клеток в этом типе ответа ведет к повышению продукции IgG2a, IgG2b, IgG3. С другой стороны, если Th0 клетка находится в окружающей среде, в которой преобладают интерлейкин 4 (IL-4) и простагландин Е2 (PGE2), то будет происходить дифференциация в Th2, для которой характерен синтез большого количества IL-4, интерлейкина 5 (IL-5) и интерлейкина 13 (IL-13), и синтез IgG1 и IgЕ, а биотип напрямую вовлечен в триггерный процесс [Hannah et al., Ann Rev Immunol, 21 (2003) 579-628].
Важность преобладания Th2 аллергенспецифического типа ответа при аллергических заболеваниях была подтверждена большим числом исследований [Romagnani, Ann Rev Immunol, 12 (1994) 227; Bousquet et al., Allergy, 53 (1998) 1-42; Majori et al., Clin Exp Allergy, 30 (2000) 341-347]. Клетки с фенотипом Th2 являются клетками, способными только непосредственно распознать аллергенные пептиды, и принимают участие в продукции IgЕ В-клетками, активации и продукции мастоцитов, активации и созревании эозинофилов, что было показано как на животных моделях, так и у людей [Cohn et al., Pharmacology and Therapeutics, 88 (2000) 187-196].
Таким образом, функциональное преобладание клеток Th2 над клетками Th1 ведет к аллергическому ответу, тогда как функциональное преобладание клеток Th1 над клетками Th2 может ингибировать аллергический ответ [Martin et al., Alergol Immunol Clin, 17 (2002) 104-110].
На основании других исследований было сделано утверждение, что ингибирование Th2 ответа с преобладанием Th1 может привести к развитию аутоиммуных заболеваний, поэтому было бы правильно усиливать иммунную регуляцию баланса Th1/Th2 посредством увеличения популяций регуляторных Т-клеток (Tr) и IL-10, и фактора роста β Т-клеток (TGF-β). Это могло бы привести к синтезу IgG4 и антител IgА (медиаторы невоспалительного ответа) и к подавлению продукции IgЕ В-клетками [Akids et al., Immunology, 103 (2001) 131-136; Akids et al., J Clin Invest, 102 (1998) 98-106; Blaser et al., Int Arch Allergy Immunol, 117 (1998) 1-10]. Недавние исследования подтвердили важность IL-10 в инактивации Th2-клеток (Gruning et al., J Exp Med, 185 (1997) 1089-1099; Adachi et al., Int Arch Allergy Immunol, 118 (1999) 391-394] и также было обнаружено, что введение IL-10 in vivo оказывает благотворное влияние при аллергиях у животных [Zuany-Amorim et al., J Clin Invest, 95 (2003) 2644-2651; Stampfli et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 21 (1999) 586-596; Hall et al., Vaccine, 21 (2003) 549-561]. На этом основании было сделано предположение, что IL-10 играет важную регуляторную роль в гиперактивной характеристике Th2-клеток у пациентов с аллергией.
IL-10 может играть важную физиопатологическую роль в противодействии воспалительным заболеваниям (болезнь Крона, ревматоидные артриты, псориаз и т.д.), некоторым вирусным инфекциям (гепатит С, инфекции, вызванные вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и т.д.) и даже в подавлении побочных эффектов при трансплантации органов. Таким образом, непосредственное применение IL-10 или, кроме того, применение адъювантов, стимулирующих продукцию IL-10, может оказать огромное воздействие на лечение этих заболеваний [Аsadullah et al., Pharmacol Rev, 55, (2003) 241-269]. В настоящий момент ведутся исследования возможности такого лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидные артриты [Feldman et al., Annu Rev Immunol (1996) 397-440; Katsikis et al., J Exp Med (1994) 1517-1527; Chomarat et al., J Immunol (1995) 1432-1439]. Противовоспалительная и регуляторная роль цитокина, таким образом, является существенной и в случае Th1 (аутоиммунные заболевания) и в случае Th2 (аллергия) гиперактивных ответов.
Существует, главным образом, три подхода в лечении аллергических заболеваний (i) избегание любых контактов с аллергеном; (ii) использование антигистаминных препаратов; и (iii) лечение посредством иммунотерапии. Принимая во внимание, что первые два способа могут в некоторых случаях быть неподходящими, иммунотерапия могла бы стать наиболее подходящим способом контроля.
Специфическая иммунотерапия аллергенами представляет собой повторное введение аллергенов пациентам с IgЕ-опосредованными нарушениями в целях обеспечения защиты против аллергических симптомов и воспалительных реакций, связанных с природным воздействием этих аллергенов [Jutel, M., J Immunol, 154 (1995) 4178-4194].
Это альтернативное лечение направлено на усиление функционального преобладания Th1 ответа по сравнению с Th2 ответом, что будет ингибировать аллергические симптомы. Модуляция Th1 также может использоваться в других процессах, таких как контроль посредством вакцинации против бактериальных внутриклеточных паразитов (таких как Brucella и Salmonella).
Несмотря на то, что было описано применение различных небиологических векторов, например наночастиц, таких как адъюванты, в иммунотерапии или вакцинах для введения антигенов и/или аллергенов, до сих пор существует потребность в создании альтернативных адъювантов взамен существующих с целью увеличения арсенала возможностей для производства вакцин и композиций для иммунотерапии. Преимущественно указанные адъюванты должны быть эффективными для иммунизации или иммунотерапии при пероральном введении без необходимости применения очень высоких доз аллергенов и антигенов. Как известно, несмотря на возможные преимущества пероральной иммунизации в терапевтических или профилактических целях должны быть решены некоторые сложности, связанные с тем, что требуемая для благотворного клинического эффекта доза иммуногенных или аллергенных активных ингредиентов является чрезмерно высокой по причине потери иммуногенной активности. Таким образом, как правило, из-за низкой стабильности аллергена или антигена в желудочно-кишечном тракте (pH и присутствие гидролитических ферментов) дозы должны быть всегда более высокими (вплоть до 200 кратного повышения), чем при подкожном введении [Taudorf et al., J Allergy Clin Immunol (1987) 153-161; Creticos et al., J Allergy Clin Immunol (1990) 165]. Кроме того, слизистая желудочно-кишечного тракта является труднопреодолимым барьером для абсорбции этих макромолекул.
Неожиданно было обнаружено, что наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида, необязательно содержащие аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, способны стимулировать или усиливать иммунный ответ при введении пациенту, что позволяет использовать их в иммунотерапии и вакцинах. Указанные наночастицы являются стабильными при пероральном приеме, обладают удовлетворительными биоадгезивными характеристиками и, таким образом, могут использоваться при иммунизации или иммунотерапии с применением различных способов введения, включая пероральный прием, без необходимости применения таких высоких доз аллергена или антигена, как те, которые были указаны в разделе, касающемся предшествующего уровня техники. Кроме того, указанные наночастицы являются низкотоксичными, биодеградируемыми и простыми для получения.
Наночастицы сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида
В патентной заявке WO 02/069938, принадлежащей тому же заявителю, описываются наночастицы сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида (PVM/MA), способ их получения и применение в качестве носителя лекарственных средств. Указанный сополимер PVM/MA структурно состоит из двух дифференцированных функциональных групп, имеющих различные характеристики растворимости: гидрофобная эфирная группа и ангидридная группа. Карбоксильная группа является солюбилизирующим агентом, так как способна растворять полимер, если он ионизирован, а эфирная группа является гидрофобной, то есть препятствует проникновению воды в полимер [Heller et al., J Appl Polym Sci, 22 (1978) 1991-2009]. Синтетические сополимеры PVM/MA имеют очень различное применение. Gantrez® AN широко применяется в качестве загустителя и флоккулирующего агента, дентального адгезива, наполнителя таблеток для перорального приема, наполнителя для трансдермальных пластырей и т.п. С другой стороны, было описано применение этих сополимеров для контролируемого высвобождения лекарственных средств [Heller et al.,J Appl Polym Sci, 22 (1978) 1991-2009] и в матриксных формах, для локального высвобождения лекарственного средства при офтальмологическом применении [Finne et al., J Pharm Sci, 80 (1991) 670-673; Finne et al., Int J Pharm, 78 (1992) 237-241].
Наночастицы на основе PVM/MA имеют биоадгезивные характеристики [Arbуs et al., Int J Pharm, (2002)129-136] и, таким образом, при пероральном приеме они могут взаимодействовать с пейеровыми бляшками, которые содержат 20% всех лимфоцитов организма и запускают усиленный иммунный ответ на те антигены и/или аллергены, которые были введены с водным раствором.
Наночастицы на основе PVM/MA являются коллоидными системами, которые способны удерживать биологически активные вещества посредством: (i) растворения или захвата макромолекулярных структур или матрикса, (ii) ковалентного связывания лекарственного средства с ангидридными группами сополимера и (iii) абсорбционных процессов, опосредованных слабыми связями. Чрезмерная реактивность сополимера PVM/MA из-за циклических ангидридных групп также способствует захвату молекул, лекарственных средств или других субстанций. В патентной заявке WO 02/069938 описывается применение наночастиц сополимера PVM/MA в качестве носителей лекарственных средств, в частности 5-фториодина, ганцикловира и антисмыслового олигонуклеотида ISIS 2922.
Краткое описание изобретения
Объектом настоящего изобретения является композиция, стимулирующая иммунный ответ у пациента, используемая в качестве адъюванта в иммунотерапии и вакцинах, стабильная при пероральном введении, обладающая удовлетворительными биоадгезивными характеристиками в отношении взаимодействия со слизистыми оболочками, способная необязательно нести аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент и высвобождать указанный агент контролируемым способом и, таким образом, используемая при иммунизации или иммунотерапии путем введения различными способами лекарственного средства, включая пероральное.
Неожиданно было обнаружено, что наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида, необязательно содержащие аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, способны стимулировать или усиливать иммунный ответ при их введении пациенту, что делает возможным их применение в иммунотерапии и вакцинах. В частности, было обнаружено, что указанные наночастицы просты в получении, обладают удовлетворительными биоадгезивными характеристиками, являются низкотоксичными и биодеградируемыми (например, они растворяются или разлагаются в течение периода времени, приемлемого для желаемой формы применения, в случае терапии in vivo, если они доступны в физиологическом растворе с уровнем рН 6-9 и температурой в промежутке от 25 до 40°С).
Кроме того, одним из аспектов настоящего изобретения является композиция, стимулирующая иммунный ответ, содержащая наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида. Указанные наночастицы могут дополнительно содержать аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, который может содержаться внутри указанных наночастиц и/или, по крайней мере, частично покрывать поверхность указанных наночастиц. Если необходимо, указанные метаболические пути также могут содержать перекрестно-связывающий агент. Указанная композиция, необязательно, может быть в лиофилизированной форме.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине или иммунотерапевтической композиции, содержащей указанную композицию, стимулирующую иммунный ответ. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения указанная иммунотерапевтическая вакцина или композиция является составом, подходящим для перорального приема, тогда как в другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная иммунотерапевтическая вакцина или композиция является составом, подходящим для парентерального введения.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению указанной композиции, стимулирующей иммунный ответ, при производстве вакцины или иммунотерапевтической композиции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению указанной композиции, стимулирующей иммунный ответ, при производстве фармакологической композиции для селективной стимуляции иммунного Th1 ответа, или при производстве фармакологической композиции для селективной стимуляции иммунного Th2 ответа, или при производстве фармакологической композиции для сбалансированной стимуляции иммунных Th1 и Th2 ответов.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции, стимулирующей иммунный ответ, содержащей указанные наночастицы на основе PVM/MA и аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, в котором предусмотрено добавление указанного аллергена или антигена и/или иммуностимулирующего агента в органический раствор, содержащий указанный сополимер PVM/MA перед десольватацией в водно-спиртовом растворе, или, в качестве альтернативы, инкубация указанного аллергена или указанного антигена и/или с иммуностимулирующим агентом с указанными наночастицами PVM/MA. В указанном способе, кроме того, может быть дополнительно предусмотрены элиминация органического растворителя и/или этапы очистки, а также этапы стабилизации наночастиц, полученных с помощью перекрестно-связывающих агентов. Указанный способ может необязательно предусматривать дополнительный этап лиофилизации.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 представлен график, показывающий зависимость высвобождения овальбумина (%) из составов NP-I, NP-II, NP-III, NP-IV во времени (дни).
На фигуре 2 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG1, IgG2a) после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина (OVA) в свободной форме, овальбумином, адсорбированным в альгидрогеле (OVA-Alum), и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-IV во времени.
На фигуре 3 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG1, IgG2a) после пероральной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина (OVA) в свободной форме и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-IV во времени.
На фигуре 4 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG1, IgG2a) после пероральной иммунизации мышей Balb/c различными дозами инкапсулированного овальбумина (NP-III25 и NP-III50) и пустыми наночастицами (NP) во времени.
На фигуре 5 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG1) после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина, свободного от (OVA), овальбумином, абсорбированном на альгидрогеле (OVA-Alum), и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-V, NP-VI и NP-VII во времени.
На фигуре 6 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG2a) после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина, свободного от (OVA), овальбумином, абсорбированном на альгидрогеле (OVA-Alum), и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-V, NP-VI и NP-VII во времени.
На фигуре 7 представлен график, показывающий зависимость концентрации сыворотки IL-10 после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина, свободного от (OVA), овальбумина, абсорбированного на альгидрогеле (OVA-Alum), и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-V, NP-VI и NP-VII во времени.
На фигуре 8 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG1, IgG2a) после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина, овальбумином, абсорбированном на альгидрогеле (OVA-Alum) OVASAL и раствором овальбумина (OVA) во времени.
На фигуре 9 представлен результат разделения экстракта НЕ электрофорезом на полиакриламидном геле с натрий додецил сульфатом (SDS-PAGE) и окрашивания Coomassie на белок (10 мкг на лунку).
На фигуре 10 представлен результат иммуноблоттинга экстракта НЕ перед (А) и после (В) инкапсуляции с использованием смеси сывороток инфицированных кур.
На фигуре 11 представлен график, показывающий результаты эксперимента по интраперитониальной защите у мышей Balb/c с летальной дозой 102 колониеобразующих единиц (КОЕ) S. enteritidis 3934.
На фигуре 12 представлена столбиковая диаграмма высвобождения IFN-γ (A) и IL-4 (B) клетками селезенки мышей Balb/c, рестимулированных экстрактом НЕ.
На фигуре 13 представлена столбиковая диаграмма, показывающая результат непрямого ELISA на сыворотках мышей Balb/c в сравнении с экстрактом НЕ с использованием антител IgG1 и IgG2a.
Подробное описание изобретения
Неожиданно было обнаружено, что наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида, необязательно содержащие аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, способны стимулировать или усиливать иммунный ответ при их введении пациенту, что позволяет использовать их в иммунотерапии и вакцинах.
Термин «пациент», используемый в настоящем описании, включает в себя любое животное, обладающее иммунной системой, предпочтительно, млекопитающее, более предпочтительно, человек.
Одним из аспектов настоящего изобретения является композиция, стимулирующая иммунный ответ, обозначенная в настоящем описании как композиция по изобретению, содержащая наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида. Указанные наночастицы могут дополнительно содержать аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, который может содержаться внутри указанных наночастиц и/или, по крайней мере, частично покрывать поверхность указанных наночастиц. Если желательно, указанные наночастицы также могут содержать перекрестно-связывающий агент.
Под использующимся в настоящем описании термином «наночастицы» понимают коллоидные системы твердых частиц размером менее чем 1,0 микрометр, предпочтительно, в пределах от 10 до 900 нанометров (нм), и к ним относятся матриксные наносферы и везикулярные нанокапсулы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения средний размер указанных наночастиц составляет менее чем 400 нм.
Наночастицы, присутствующие в композиции по настоящему изобретению, включают сополимер метилвинилового эфира малеинового ангидрида или PVM/MA. Указанный сополимер PVM/MA является известным продуктом, который может быть получен подходящими способами, например посредством полимеризации ацетилена с малеиновым ангидридом, или может быть закуплен на рынке. В этом смысле, компания International Specialty Products (ISP) производит сополимеры PVM/MA, имеющие различную молекулярную массу, представленные под торговой маркой Gantrez® AN. Как правило, для осуществления настоящего изобретения на практике молекулярная масса указанного сополимера PVM/MA может изменяться в очень широком диапазоне от 100 до 2400 кДа, более предпочтительно, от 200 до 2000 кДа. В одном из вариантов настоящего изобретения предпочтительной молекулярной массой сополимера PVM/MA является молекулярная масса от 180 до 250 кДа.
Применение указанного сополимера PVM/MA имеет особые преимущества, позволяя широко использовать его в фармацевтике вследствие его низкой токсичности (LD50=8-9 г/кг перорально) и его превосходной биосовместимости. Кроме того, он прост в получении и может реагировать с другими гидрофильными веществами, благодаря своим функциональным группам, без использования обычно используемых органических реагентов (производные глютаральдегида и карбодиимида), обладающих значительной токсичностью [Arbуs et al., J. Controlled Rel., 83 (2002) 321-330]. Сополимер PVM/MA нерастворим в водной среде, но присутствующая в нем ангидридная группа гидролизуется, образуя карбоксильные группы. Раствор является слабым и зависит от условий, в которых он получен. Благодаря доступности функциональных групп в PVM/MA при инкубировании в водной среде происходит ковалентное связывание молекул с нуклеофильными группами, такими как гидроксильные или аминогруппы. Указанные наночастицы PVM/MA также обладают биоадгезивными свойствами [Arbуs et al., Int J Pharm, (2002) 129-136], таким образом, при пероральном введении они взаимодействуют с пейеровыми бляшками, которые содержат 20% всех лимфоцитов организма и запускают усиленный иммунный ответ на те антигены и/или аллергены, которые были введены вместе с водным раствором.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению включает наночастицы на основе PVM/MA, не содержащие антиген или аллерген и иммуностимулирующий агент. Указанные наночастицы в настоящем описании называются «пустыми» наночастицами и могут быть легко получены способом, например, описанным в патентной заявке WO/069938, полное содержание которой приведено в данном описании в качестве ссылки. В качестве иллюстрации указанные пустые наночастицы легко получают десольватацией водно-спиртовой фазой раствора сополимера PVM/MA в ацетоне. Образовавшиеся наночастицы могут быть приведены в состояние стабильной водной суспензии или лиофилизированы. Необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент. Может быть использован фактически любой перекрестно-связывающий агент, содержащий одну или более функциональную группу, которая может взаимодействовать с ангидридными группами сополимера PVM/MA, преимущественно, полиамин или углевод, например аминокислота, белок, -оз или -озид и т.п., например, лизин, аргинин, гистидин, водорастворимые белки, поли-L-лизин, поли-L-аргинин, и т.п., предпочтительно, 1,3-диаминопропан.
Указанные пустые наночастицы могут выступать в роли адъюванта при вакцинации или в иммунотерапии, при совместном введении с вакцинами или композициями для иммунотерапии (иммунотерапевтическими композициями), содержащими антиген или аллерген соответственно, вызывая эффект стимуляции иммунного ответа после введения вакцины или иммунотерапевтической композиции и пустых наночастиц. На фигуре 12 показано, что введение пустых наночастиц индуцирует секрецию значительного количества IFN-γ. Совместное введение вакцины или иммунотерапевтической композиции и наночастиц может быть одновременным или последовательным в разное время в любом порядке, например первой может быть введена вакцина или иммунотерапевтическая композиция и затем наночастицы, или наоборот. В качестве альтернативы указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция и указанные наночастицы могут быть введены одновременно. Вакцина или иммунотерапевтическая композиция и наночастицы также могут быть введены в одной и той же композиции или различных композициях. Доза вводимых пустых наночастиц может изменяться в широких пределах, например, приблизительно от 0,01 до приблизительно 10 мг/кг массы тела, предпочтительно, от 0,1 до 2 мг/кг массы тела.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению включает наночастицы на основе PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном и/или иммуностимулирующим агентом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению включает наночастицы на основе PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном, где указанные наночастицы на основе PVM/MA включают аллерген или антиген.
Использованный в настоящем описании термин «аллерген» относится к веществу, к которому пациент чувствителен и которое является причиной иммунной реакции, например аллерген цветочной пыльцы, аллерген насекомых, пищевые аллергены или аллергены пищевых продуктов, компоненты, присутствующие в слюне, клещи и жалящие насекомые, вызывающие гиперреакцию у пациента, компоненты, присутствующие в растениях, индуцирующие реакцию чувствительности у пациента, и т.д. Следовательно, например, также может быть использован белок пыльцы растений, такой как, пыльца растений (Lolium perenne, Poa pretense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa) пыльца из других растений (таких как, Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Plantago lanceolata, Traxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica), или пыльца деревьев (таких как, Olea europea, Plantus sp., Cupressus sp.) и т.д. Также может быть использован белок насекомых, таких как пылевой клещ (такие, как, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acarus siro, Blomia tropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae) и т.д. Другой аллерген может быть получен из грибков и эпителия животного (Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, эпителий собак, эпителий кошек, эпителий лошади, смесь пера и пуха разных видов водоплавающих птиц, Penicillium notatum и т.д.), а также компонентов пищевых продуктов и т.д. Фактически в композиции по настоящему изобретению может быть использован любой аллерген для заполнения наночастиц; однако в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген представляет собой овальбумин (OVA) - белок, который широко используется в качестве экспериментальной модели аллергии.
Использованный в настоящем описании термин «антиген» относится к природному или рекомбинантному иммуногенному продукту, полученному из высшего организма или из микроорганизма, например бактерии, вируса, паразита, протозоа, грибка и т.д., содержащему один или более эпитопов, например структурные компоненты указанного организма; токсины, например экзотоксины и т.д. Фактически в композиции по настоящему изобретению может быть использован любой антиген для заполнения наночастиц; однако в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный антиген является экстрактом НЕ Salmonella enteritidis.
Как известно, Salmonella enteritidis в пищевых продуктах является обычным агентом желудочно-кишечного тракта человека, наиболее часто выявляемым при пищевых отравлениях (60% случаев, при которых был выделен этот агент). Птица и субпродукты из птицы признаны главным источником Salmonella и самым главным источником инфекций человека, вызываемых Salmonella enteritidis. Инфекция является зоонозом, передаваемым посредством переваривания зараженных пищевых продуктов или воды, и в настоящее время является пандемией. Для контроля сальмонеллеза Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) и Европейский Союз опубликовали рекомендации по мониторингу и уничтожению инфекции Salmonella enteritidis у птиц из-за очевидной эффективности для человеческой популяции. Для контроля Salmonella у птиц используют антибиотики, конкурентное исключение, генетический отбор птиц и вакцин, также улучшение гигиенических условий на фермах по разведению птиц. Из этих мер наиболее распространенной и самой практичной следует считать вакцинацию как самый простой и недорогой в использовании метод. Несмотря на широкое применение ослабленных живых вакцин и (убитых бактериальных) вакцин обе они являются достаточно неэффективными на птицеводческих фермах (куриных и других видов птиц) [Zhang-Barder et al., Vaccine, 17 (1999) 2538-2545]. Помимо своей низкой эффективности, большим недостатком живых вакцин является их вирулентный потенциал у животных с подавленным иммунитетом, а также их способность изменять инвазивный статус. Кроме того, вакцины должны быть введены парентерально и они взаимодействуют с обычными серологическими диагностическими тестами. Инактивированные (убитые) бактерии не обладают остаточной вирулентности, но они не индуцируют клеточный иммунный ответ. Требуется введение сильного адъюванта и существует необходимость многократного ревакцинирования. Альтернативой могло бы стать применение субклеточных вакцин, которые способны стимулировать соответствующий иммунный ответ против инфекции, вызванной Salmonella enteritidis. Несмотря на высокую степень защиты, описанную для этих вакцин на стадии эксперимента, как и в случае убитым бактериальным вакцинам, для них требуются многократные бустер-дозы для получения приемлемой степени защиты [Powell, Pharm Res, 13 (1996) 1777-1785]. С другой стороны, при пероральном введении происходит денатурация и расщепление в желудочно-кишечном тракте [Langer et al., Adv Drug Deliv. Rev, 28 (1997) 97-119], и таким образом, этот тип вакцин должен вводиться парентерально, что связанно с определенными материально-техническим и экономическими затруднениями. Антигены Salmonella enteritidis могут быть инкапсулированы в наночастицы PVM/MA, описанные в настоящем описании выше, с целью решения этих трудностей.
Аллерген или антиген, присутствующий в этом варианте композиции по настоящему изобретению, может по крайней мере частично покрывать поверхность указанных наночастиц и/или заполнять указанные наночастицы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген или антиген покрывает всю или часть поверхности указанных наночастиц. Этот вариант осуществления изобретения используется для селективной стимуляции Th2 ответа у пациента. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген или антиген инкапсулирован в указанные PVM/MA наночастицы. Этот вариант осуществления изобретения используется для стимуляции сбалансированного Th1 и Th2 ответа или для преобладания Th1 ответа.
PVM/MA наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, легко могут быть получены способом, аналогичным описанному в патентной заявке WO02/069938. В качестве иллюстрации указанные наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, легко могут быть получены десольватацией жидкой фазой, например водно-спиртовой фазой, такой как жидкая фаза, образованная этанолом и водой, раствора сополимера PVM/MA в органическом растворителе, таком как полярный органический растворитель, например ацетон. Образовавшиеся наночастицы могут быть приведены в состояние водной суспензии или они могут быть лиофилизированы. В зависимости от момента, в который был добавлен аллерген или антиген, будут получены различные составы с различными соотношениями аллергена или антигена (см. составы, такие как, NP I, NP II, NP III, NP IV, и NP НЕ 3934, описание в примерах 1 и 6). В качестве иллюстрации, при необходимости покрытия аллергеном или антигеном всей или части поверхности наночастицы указанный аллерген или указанный антиген инкубируют после упаривания органических растворителей. Подобным образом, при необходимости инкапсулирования аллергена или антигена внутрь наночастиц указанный аллерген или указанный антиген инкубируют, аллерген или антиген при этом диспергирован в растворителе, предпочтительно, в растворителе, в котором находится раствор сополимера PVM/MA или способный смешиваться с указанным растворителем, такой как, предпочтительно, полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетон. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. Если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент, который упомянут выше в контексте пустых наночастиц.
Конкретно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции по настоящему изобретению, содержащей наночастицы сополимера PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном, где указанные наночастицы сополимера PVM/MA включают аллерген или антиген, указанный способ включает стадии:
а) десольватации органического раствора сополимера PVM/MA, растворенного в органическом растворителе с водно-спиртовым раствором;
b) удаления органических растворителей с получением наночастиц; и
с) введения указанного аллергена или указанного антигена в указанный органический раствор сополимера PVM/MA перед десальватацией указанного органического раствора сополимера PVM/MA или, в качестве альтернативы, инкубации указанного аллергена или указанного антигена с указанными наночастицами, полученными на стадии b).
Органическим растворителем, в котором растворен сополимер PVM/MA, может быть любой растворитель, в котором растворим указанный сополимер, обычно полярный растворитель, такой как кетон, например ацетон. Жидкой фазой, используемой для проведения указанной десольватации, может быть любой водно-спиртовой раствор, содержащий спирт и воду, например этанол и воду, например спирт и вода фармацевтической категории (согласно заявке очищенная вода или вода для инъекции). Преимущественно соотношение раствора сополимера: водно-спиртового раствора составляет от 1:1 до 1:10, предпочтительно, 1:4. Затем органические растворители удаляют любым подходящим способом, например посредством упаривания при пониженном давлении, и в среде немедленно образуются наночастицы с получением стабильной водной мутной суспензии.
Введение аллергена или антигена в органический раствор сополимера PVM/MA перед десольватацией указанного органического раствора сополимера PVM/MA позволяет получить наночастицы, внутри которых содержится аллерген или антиген. Преимущественно, указанный аллерген или антиген введен, растворен или диспергирован в том же самом органическом растворителе, что и органический раствор сополимера PVM/MA, или в том, который способен смешиваться с указанным растворителем, таким как полярный органический растворитель, например ацетон. В качестве альтернативы инкубирование указанного аллергена или указанного антигена с наночастицами, полученными на стадии b), позволяет получить наночастицы, у которых аллерген или антиген покрывает всю или часть внешней поверхности наночастиц. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения инкубирование аллергена или антигена с наночастицами проводят в водной среде.
Если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент для улучшения стабильности наночастиц, как описано выше, в контексте пустых наночастиц.
Полученные наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, могут быть очищены подходящим способом, например центрифугированием, ультрацентрифугированием, тангенциальной фильтрацией или упариванием, включая использование вакуума.
И, наконец, если необходимо, наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, могут быть лиофилизированы с целью продолжительного хранения и консервации. Могут быть использованы стандартные криопротекторы, предпочтительно, в концентрации, составляющей от 0,1 до 10% от общей массы композиции для облегчения процесса лиофилизации.
Наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, могут действовать как адъювант при вакцинации или иммунотерапии и стимулировать иммунный ответ после их введения пациенту, как показано в примерах 3-6.
Дозы для введения наночастиц, заполненных аллергеном или антигеном, изменяются в широком диапазоне, например, приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела, предпочтительно, от 0,1 до 2 мг/кг массы тела.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению содержит наночастицы на основе PVM/MA, заполненные иммуностимулирующим агентом, где указанные наночастицы на основе PVM/MA содержат иммуностимулирующий агент.
Используемый в настоящем описании термин «иммуностимулирующий агент» или «иммуномодулятор» относится к продукту, который способен усиливать специфический или неспецифический иммунный ответ, например, к белкам или пептидам, действующим как природные адъюванты, стимулирующие ответ иммунной системы на аллерген или антиген, бактериальные липополисахариды, компоненты клеточных стенок грамположительных бактерий (мурамил дипептид (MDP)), CpG последовательности ДНК, выделяемые растением, главным образом сапонин, выделяемый растением и т.д. Фактически любой иммуностимулирующий агент может быть использован для получения наночастиц, заполненных иммуностимулирующим агентом, композиции по настоящему изобретению, тем не менее в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанным иммуностимулирующим агентом является крупный липополисахарид Brucella ovis.
Указанный иммуностимулирующий агент может по крайней мере частично покрывать поверхность указанных наночастиц и/или содержаться в указанных наночастицах. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный иммуностимулирующий агент покрывает всю или часть поверхности указанных наночастиц PVM/MA, хотя в другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный иммуностимулирующий агент инкапсулирован в указанные наночастицы PVM/MA.
Наночастицы PVM/MA, заполненные иммуностимулирующим агентом, легко могут быть получены способом, аналогичным описанному выше для получения наночастиц PVM/MA, заполненных аллергеном или антигеном, но с заменой указанного аллергена или антигена иммуностимулирующим агентом. Таким образом, в зависимости от момента, в который был введен иммуностимулирующий агент, будут получены различные составы с различными их соотношениями (см. пример 1 или 4). В качестве иллюстрации, когда необходимо, чтобы иммуностимулирующий агент покрыл всю или часть поверхности наночастиц, указанный иммуностимулирующий агент инкубируют после упаривания органических растворителей. Подобным образом, если необходимо, иммуностимулирующий агент инкапсулируют внутрь наночастиц. Для этого указанный иммуностимулирующий агент инкубируют. При этом агент диспергируют или растворяют в растворителе, преимущественно таком же, в котором находится раствор сополимера PVM/MA, или в растворителе, способном смешиваться с указанным растворителем сополимера. Предпочтительно это полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетоном. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. Если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент, который упомянут выше в связи с пустыми наночастицами, для улучшения стабильности наночастиц.
Наночастицы, заполненные иммуностимулирующим агентом, могут быть очищены подходящим способом, как упомянутый выше в связи с наночастицами, заполненными аллергеном или антигеном.
Если необходимо, наночастицы, заполненые иммуностимулирующим агентом, также могут быть сублимированы с использованием стандартных криопротекторов, предпочтительно, в концентрации, составляющей от 0,1 до 10% от общей массы композиции.
Наночастицы, заполненные иммуностимулирующим агентом, могут действовать как адъювант при вакцинации или иммунотерапии и стимулировать иммунный ответ после их введения пациенту.
Дозы для введения наночастиц, заполненных иммуностимулирующим агентом, изменяются в широком диапазоне, например, приблизительно от 0,01 до приблизительно 10 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,1 до 2 мг/кг массы тела.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению содержит наночастицы PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном с иммуностимулирующим агентом, где указанные наночастицы PVM/MA содержат аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент.
Аллерген или антиген, так же как и стимулирующий агент, присутствующий в этом варианте композиции по настоящему изобретению, может, по крайней мере, частично покрывать поверхность указанных наночастиц и/или заполнять указанные наночастицы.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген или антиген покрывает всю или часть поверхности указанных наночастиц, хотя иммуностимулирующий агент содержится внутри указанных наночастиц, обнаружено, что этот конкретный вариант осуществления изобретения позволяет селективно стимулировать Th2 ответ у пациента.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген или антиген инкапсулирован в наночастицы PVM/MA, в то время как указанный стимулирующий агент, по крайней мере, частично покрывает поверхность указанных наночастиц.
Этот вариант осуществления изобретения используется для стимуляции сбалансированного Th1 и Th2 ответа или ответа с преобладанием Th1 ответа.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения как аллерген или антиген, так и иммуностимулирующий агент инкапсулирован в указанные наночастицы PVM/MA.
Наночастицы PVM/MA, содержащие аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент, легко могут быть получены способом, аналогичным способу, который описан выше. В зависимости от момента, в который аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент был введен, будут получены различные составы с различными соотношениями указанных продуктов. В качестве иллюстрации, аналогично, если необходимо, иммуностимулирующий агент покрывает всю или часть поверхности наночастицы, для этого указанный иммуностимулирующий агент инкубируют после упаривания органических растворителей. Подобным образом, если необходимо, иммуностимулирующий агент инкапсулируют внутрь указанных наночастиц. Для этого указанный иммуностимулирующий агент инкубируют. Иммуностимулирующий агент диспергируют или растворяют в растворителе, преимущественно в котором находится раствор сополимера PVM/MA, или в растворителе, способном смешиваться с указанным растворителем сополимера. Предпочтительно это полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетон. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. Подобным образом, если необходимо, чтобы аллерген или антиген покрыл всю или часть поверхности наночастиц, то указанный аллерген или антиген инкубируют после упаривания органических растворителей. Подобным образом, если необходимо, аллерген или антиген инкапсулируют внутрь указанных наночастиц. Для этого указанный аллерген или антиген инкубируют. Аллерген или антиген диспергируют или растворяют в растворителе, преимущественно, в котором находится раствор сополимера PVM/MA, или в растворителе, способном смешиваться с указанным растворителем сополимера. Предпочтительно это полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетон. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. Подобным образом, когда необходимо, чтобы аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент был инкапсулирован внутрь указанных наночастиц, то указанный аллерген или антиген инкубируют, необязательно смешивают с указанным иммуностимулирующим агентом, который диспергирован или растворен в растворителе, преимущественно в котором находится раствор сополимера PVM/MA, или способный смешиваться с указанным растворителем, такой как предпочтительно полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетон. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. В любом случае, если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент к полученным наночастицам для улучшения их стабильности, как описано выше в связи с пустыми наночастицами.
А именно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции по настоящему изобретению, содержащей наночастицы сополимера PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном и иммуностимулирующим агентом, где указанные наночастицы сополимера PVM/MA включают аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент. Указанный способ включает стадии:
а) десольватации органического раствора сополимера PVM/MA, растворенного в органическом растворителе с водно-спиртовым раствором;
b) удаления органических растворителей с получением наночастиц; и
с) введения указанного аллергена или указанного антигена и/или указанного иммуностимулирующего агента в указанный органический раствор сополимера PVM/MA перед десальватацией указанного органического раствора сополимера PVM/MA или в качестве альтернативы инкубирование указанного аллергена или указанного антигена или указанного иммуностимулирующего агента с указанными наночастицами, полученными на стадии b).
Стадии а) и b) проводят способом, аналогичным тому, который описан выше в контексте способа получения композиции по настоящему изобретению, содержащей наночастицы сополимера PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном. Стадию с) проводят способом, аналогичным способу, описанному выше, в связи с указанным способом, при этом делая соответствующие модификации для введения иммуностимулирующего агента, либо для указанного органического раствора сополимера PVM/MA перед десольватацией указанного органического раствора сополимера PVM/MA, либо для необязательного введения аллергена или антигена, или в качестве альтернативы инкубируют указанный иммуностимулирующий агент с указанными наночастицами, полученными на стадии b), необязательно частично покрытыми указанным аллергеном или антигеном, согласно описанному выше.
Если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент для улучшения стабильности полученных наночастиц. Полученные наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном и иммуностимулирующим агентом, могут быть очищены подходящим способом, например центрифугированием, ультрацентрифугированием, тангенциальной фильтрацией или упариванием, включая использование вакуума.
И, наконец, если необходимо, наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, могут быть лиофилизированы для продолжительного хранения и консервации. Могут быть использованы стандартные криопротекторы, предпочтительно, в концентрации, составляющей от 0,1 до 10% от общей массы композиции для облегчения процесса лиофилизации.
Наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном и иммуностимулирующим агентом, могут действовать как адъювант при вакцинации или иммунотерапии и стимулируют иммунный ответ после их введения пациенту, как показано в примерах 3-6.
Дозы введения наночастиц, заполненных аллергеном или антигеном и иммуностимулирующим агентом, изменяются в широком диапазоне, например, приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,1 до 2 мг/кг массы тела.
Если необходимо, композиция по настоящему изобретению может быть в лиофилизированной форме или в форме, подходящей для перорального введения или парентерального введения. Лиофилизацию проводят подходящим способом, необязательно в присутствии подходящих криопротекторов, например сахарозы, маннитола, трегаллозы, глицерина, лактозы, сорбитола, поливинилпирролидона и т.п., предпочтительно, концентрация составляет от 0, 1 до 10% от общей массы композиции. Для получения различных форм, подходящих для перорального или парентерального введения, могут быть использованы подходящие наполнители и носители, пригодные для получения необходимых фармакологических форм для введения. Информация об указанных носителях и наполнителях, так же как и информация об указанных формах, подходящих для перорального или парентерального введения композиции по настоящему изобретению, может быть найдена в фармацевтических справочниках.
Как упоминалось ранее, композиция по настоящему изобретению стимулирует или усиливает иммунный ответ после ее введения пациенту и, таким образом, может быть использована в качестве адъюванта в вакцинах или иммунотерапии. Действительно, композиция по настоящему изобретению обладает способностью селективно стимулировать один из двух путей иммунного ответа (Тh1 или Тh2) или оба пути одновременно сбаласированно, и, таким образом, она может быть использована в вакцине или иммунотерапевтических составах, согласно стимулируемому ответу. В качестве иллюстрации, как правило, для вакцинной композиции требуется в зависимости от механизмов патогенности организма, из которого происходит антиген (внутриклеточный или внеклеточный, токсинзависимый, жгутикзависимый и т.п.), стимуляция Тh1 ответа (внутриклеточный, как в случае с Brucella, Salmonella и т.п.) или Тh2 ответа (внутриклеточный, как в случае с Staphylococcus, Escherichia coli, энтеротоксигенная бактерия и т.п.). Подобным образом, в качестве иллюстрации, требуется толерантная индукция для иммунотерапевтического состава ввиду наличия двух типов ответа, например сбалансированное индуцирование Тh1 и Тh2 ответов. Как правило, для стимуляции избирательного Тh2 ответа составы будут содержать наночастицы PVM/MA, полностью или частично покрытые аллергеном или антигеном, в то время как для сбалансированной стимуляции Тh1 и Тh2 ответов или с преобладанием Тh1 ответа составы будут содержать наночастицы PVM/MA, в которые антиген или аллерген будет инкапсулирован, и указанные наночастицы преимущественно будут содержать перекрестно-связывающий агент. В любом из ранее указанных случаев, если необходимо, наночастицы могут содержать иммуностимулирующий агент.
Кроме того, другой аспект настоящего изобретения относится к вакцине или иммунотерапевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество композиции, стимулирующей иммунный ответ (композиции по настоящему изобретению), вместе с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем. Указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция может быть в любой фармацевтической форме, вводимой любым путем, например пероральным, парентеральным, ректальным и т.п. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция является фармацевтической формой для перорального приема, хотя в другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция является фармацевтической формой для парентерального введения, например внутримышечного (i.m.), подкожного (s.c.), внутривенного (i.v.), интраперитонеального (i.p.), интрадермального (i.d.) и т.п. Дозы для различных форм введения лекарственных средств в общем случае и способы их получения могут быть взяты в «Tratado de Farmacia Galénica», С.Faulí I Trillo, 1st Edition, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
Композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению, включает наночастицы PVM/MA. Указанные наночастицы могут, кроме того, содержать аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, который может содержаться внутри указанных наночастиц и/или по крайней мере частично покрывать поверхность указанных наночастиц. Аналогично, указанные частицы необязательно могут содержать перекрестно-связывающий агент.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению, включает пустые наночастицы PVM/MA, необязательно вводится перекрестно-связывающий агент. В этом случае композицию по настоящему изобретению вводят совместно с вакциной или иммунотерапевтическими композициями, содержащими антиген или аллерген, соответственно стимулируя иммунный ответ после введения указанной вакцины или иммунотерапевтической композиции и пустых наночастиц. Совместное введение указанной вакцины или иммунотерапевтической композиции и пустых наночастиц может осуществляться одновременно или последовательно в различное время, в любом порядке, например первой может быть введена вакцина или иммунотерапевтическая композиция и затем пустые наночастицы, или наоборот. В качестве альтернативы, указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция и указанные пустые наночастицы могут быть введены одновременно. В этом случае вакцина или иммунотерапевтическая композиция и пустые наночастицы могут быть введены в одной и той же композиции или в различных композициях.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению, включает наночастицы PVM/MA, где указанные наночастицы PVM/MA, кроме того, содержат аллерген или антиген и, если это необходимо, перекрестно-связывающий агент.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению, включает наночастицы PVM/MA, где указанные наночастицы PVM/MA, кроме того, содержат иммуностимулирующий агент и, если это необходимо, перекрестно-связывающий агент.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению включает наночастицы PVM/MA, где указанные наночастицы PVM/MA, кроме того, содержат аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент и, если это, необходимо перекрестно-связывающий агент.
Иммунотерапевтическая вакцина или композиция, полученная по настоящему изобретению, содержит композицию по настоящему изобретению в терапевтически эффективной дозе, например, в количестве, которое подходит для усиления или стимуляции иммунного ответа. Кроме того, количество композиции по настоящему изобретению, находящейся в вакцине или иммунотерапевтической композиции, полученной по настоящему изобретению, может изменяться в широком диапазоне в зависимости от других факторов, среди которых тип наночастиц (пустые или заполненные аллергеном или антигенами и/или иммуностимулирующим агентом) и т.п. Кроме того, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, изобретение относится к вакцине или иммунотерапевтической композиции, содержащей:
Компонент | % от общей массы |
Наночастицы PVM/MA | 84-99,998% |
Перекрестно-связывающий агент | 0,001-1% |
Аллерген или антиген | 0,001-15% |
Указанная иммунотерапевтическая вакцина или композиция необязательно может содержать криопротектор в количестве, достаточном для защиты наночастиц во время процесса лиофилизирования.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген содержит аллергены, экстрагируемые из пыльцы, аллергены, экстрагируемые из насекомых, или аллергены, экстрагируемые из пищевых продуктов.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный антиген содержит иммуногены, экстрагируемые из организма, например, экстрагируемые мембраной Salmonella spp.
Как было указано ранее, композиция по настоящему изобретению способна стимулировать или усиливать иммунный ответ после введения пациенту, таким образом, она может быть использована в качестве адъюванта в вакцинах или иммунотерапии и, в частности, способна селективно стимулировать один из двух путей иммунного ответа (Th1 или Th2) или даже оба пути одновременно и сбалансированно.
Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению при производстве вакцины или иммунотерапевтической композиции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению при производстве фармацевтической композиции для селективной стимуляции или стимуляции с преобладанием, или усиления Th1 иммунного ответа.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению при производстве фармацевтической композиции для селективной стимуляции или стимуляции с преобладанием, или усиления Th2 иммунного ответа.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению при производстве фармацевтической композиции для сбалансированной стимуляции или усиления Th1 и Th2 иммунных ответов.
Применение композиции по настоящему изобретению для вакцинации или иммунотерапии имеет определенные преимущества, которые включают:
- применение фармацевтических форм, которые являются биодеградируемыми в нормальных условиях организма и которые получены из полимеров и материалов, приемлемых в фармакологической и медицинской практике;
- проведение иммунотерапии с использованием наночастиц и введение вакцинного препарата на основе наночастиц, который защищает инкапсулированный аллерген или антиген от преждевременной инактивации;
- получение иммунотерапевтического препарата и вакцины на основе наночастиц, которые демонстрируют замедленное высвобождение в течение времени; период времени, в течение которого будет происходить контролируемое высвобождение, будет зависеть от условий микроокружающей среды в месте введения;
- введение наночастичного адъюванта на основе наночастиц, которые передают свои характеристики (безвредность, биодеградация, авирулентность), он может применяться у людей и животных для иммунотерапевтических целей и при вакцинации посредством различных видов введения; и
- введение наночастичного адъюванта на основе наночастиц, которые передают свой биоадгезивный потенциал в желудочно-кишечном тракте, делая пероральное введение возможным видом введения.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его.
Примеры
Следующие примеры описывают получение различных типов наночастиц на основе PVM/MA, которые необязательно содержат аллергены или антигены и/или иммуностимулирующий агент, и демонстрируют способность указанных наночастиц действовать в качестве адъювантов в иммунотерапии или при вакцинации.
Основной способ получения наночастицы
Основной способ получения наночастицы PVM/MA включает десольватацию указанного сополимера в ацетоне с последующим введение этанола. В полученный в результате раствор введен такой объем воды, который немедленно образует частицы посередине в виде мутной суспензии. Затем органические растворители (этанол и ацетон) удаляют посредством упаривания при низком давлении, частицы остаются в стабильной водной суспензии [Arbos et al., J Control Rel, 83 (2002) 321-330]. В зависимости от момента, в который были введены аллергены или антигены, и где возможно применен иммуностимулирующий агент, будут получены различные композиции с различными их соотношениями (см. примеры 1, 5 и 6). В качестве примера:
А
Для получения композиций, содержащих аллерген или антиген, инкапсулированный в наночастицы (составы NP I и NP VI): инкубирование с аллергеном или антигеном для инкапсулирования проводится после упаривания органических растворителей.
В
Для получения композиций, содержащих аллерген или антиген, полностью или частично покрывающий внешнюю поверхность наночастиц (составы NP II, NP III, NP IV, NP V, NP VII, OVASAL и NP HE): перед введением этанола и воды инкубируют аллерген или антиген, диспергированный в ацетоне.
Следующий этап состоит в введении перекрестно-связывающего агента, которым в этом случае является 1,3-диаминопропаном, в составы NP III, NP V, NP VII, OVASAL, NP HE (в общей сложности 5 мкг/мг полимера) и NP IV (10 мкг/мг полимера).
Составы NP V, NP VI и NP VII содержат иммуностимулирующий агент, состоящий из крупного липополисахарида (R-LPS) Brucella ovis. Коротко, для его введения в случае состава NP V инкубирование с указанным иммуностимулирующим агентом проводят после упаривания органических растворителей, хотя в случаях с составами NP VI и NP VII R-LPS инкубируют после введения этанола и воды (см. примеры 1.4.2, 1.4.3 и 1.4.4).
Очистка наночастицы проводится посредством ультрацентрифугирования. И, наконец, очищенные наночастицы лиофилизируют для увеличения срока хранения и консервации.
Характеристика наночастицы
Размер и дзета-потенциал наночастицы были определены в Zetamaster (Malvern Instruments/Optilas, Spain).
Содержание инкапсулированного белка (активный ингредиент) было определено посредством анализа с микробицинхониновой кислоты (Micro BCA, Pierce, USA).
Крупный липополисахарид Brucella ovis (R-LPS), адсорбированный или инкапсулированный в наночастицы, был определен косвенно посредством одного из его эксклюзивных маркеров КDO (3-дезокси-D-манно-окто-2-улосоноковая кислота) методом с применением тиобарбитуровой кислоты [Warren, J Biol Chem, 243 (1959) 1971-1975].
Определение антитела против OVA, цитокина и IL-10
Сыворотка антител против OVA была исследована ELISA с конъюгатами анти-IgG1 и анти-IgG2а (Sigma-Aldrich Chemiе, Germany). Коротко, для проведения этого исследования были использованы 96-луночные планшеты (EB, Thermo Labsystems, Vantaa, Finland), каждая лунка содержала 1 мкг овальбумина, который был зафиксирован при температуре 4°С в течение 15 часов; были проведены последовательно 5 промываний, каждое в течение 1 минуты в промывном аппарате ELISA (Thermo Labsystems, Vantaa, Finland), сыворотки были введены в серийные растворы, начиная от 1:40, они были выдержаны при температуре 37°С в течение 4 часов, и были проведены последовательно 5 промываний, каждое в течение 1 минуты; затем коньюгат был инкубирован в течение 2 часов с пероксидазой, кроме того, были проведены последовательно 5 промываний, каждое в течение 1 минуты, субстрат [ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензен-тиазолин-6-сульфониковая кислота) (Sigma-Aldrich Chemiе, Germany)] был введен и считывание было проведено при 405 нм в считывающем устройстве (iEMS Reader MF, Labsystems, Vantaa, Finland) после 30 минут инкубации при комнатной температуре.
Цитокины (IFN-γ, IL-4) были исследованы с применением наборов ELISA (Biosource, USA) в супернатантах из рестимулированных клеток селезенки предварительно иммунизированных мышей.
IL-10 был исследован в сыворотках крови предварительно центрифугированных при 800 х g в течение 10 минут. IL-10 был исследован посредством набора ELISA (Biosource, USA).
Метод элекрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE)
Профиль образцов белка был определен с помощью SDS-PAGE [Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685] при 15% концентрации акриламида и бисакриламида (Biorad), взятых в соотношении 37,5:1 соответственно, в 125 мМ Tris-HCl (pH 6,8) и 0,1% SDS в геле. Использованный электродный буфер содержал 30 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 192 мМ глицина и 0,1% SDS. Образец был обработан при 100°С в течение 10 минут в 62,5 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 10% глицерина, 2% SDS, 5% β-меркаптоэтанола и 0,002% бромфенола голубого. Электрофорез был проведен в 8 х 7 см геля с постоянной плотностью 15 мА/гель. Гель был окрашен Coomassie blue [King, Anal Biochem, 71 (1976) 223-230]. Для этой цели он был инкубирован в 3% водном растворе трихлоруксусной кислоты в течение 1 часа для его закрепления. Окрашивание было проведено с 0,25% раствором Coomassie blue с инкубированием в 50% метаноле и 10% уксусной кислоте в течение 1 часа, и образцы были обесцвечены 50% метанолом и 20% уксусной кислотой до того момента, пока стали видимыми. Приблизительные молекулярные массы компонентов образца были определены путем сравнения их электрофоретической подвижности с маркером со стандартной молекулярной массой (Rainbow, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), содержащим миозин (220 кДа), фосфорилазу b (97 кДа), альбумин бычьей сыворотки (66 кДа), овальбумин (45 кДа), карбоангидразу (30 кДа), ингибитор трипсина (20,1 кДа) и лизоцим (14,3 кДа).
Иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг был проведен согласно ранее описанному протоколу [Towbin & Staehelin, Proc Natl Acad Sci USA, 76 (1979) 4350-4354]. Кратко, после проведения обработки образцов SDS-PAGE гель был пропущен через нитроцеллюлозные мембраны с размером пор 0,45 мкм (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany). Пропуск был осуществлен с использованием полусухого метода посредством Trans-Blot® SD, Semy-Dry transfer Cell system (Bio-Rad, Richmond, USA) при 200 мА, 5 В в течение 30 минут, в трансферном буфере 25 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 192 мМ глицина и 10% метанола.
Пример 1
Иммунотерапия
Получение и характеристика наночастиц на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида с овальбумином
Выбранный белок был альбумином (OVA), поскольку на данный момент он широко используется в качестве экспериментальной модели аллергии.
Около 50% белка, содержащегося в белых яйцах, представляет овальбумин. Он является мономерным фосфогликопротеином, содержащим 385 аминокислот, с молекулярной массой от 43 до 45 кДа [Johnsen and Elsayed, Mol Immunol, 27 (1990) 821]. Овальбумин является яичным белком, обладающим наибольшей аллергенностью, немедленно индуцирующим гиперчувствительность I типа, опосредованную IgE.
Описанный ниже способ является пригодным для получения лекарственных форм с наночастицами коллоидного типа, которые могут быть использованы для иммунотерапии.
1.1 Получение пустых наночастиц (NP)
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] были растворены в 5 мл ацетона. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута выпариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл.
Раствор был подвергнут очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные пустые наночастицы (NP) имели средний размер менее 200 нм и суммарный поверхностный заряд -45,1 мВ (см. Таблицу 1).
1.2 Получение наночастиц, покрытых овальбумином (NPI)
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] были растворены в 5 мл ацетона. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут.Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 5 мл. Этот раствор был инкубирован в течение 1 часа при комнатной температуре с 5 мл водного раствора овальбумина, содержащего 10 мг белка.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы (NPI) имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -61,3 мВ и содержание овальбумина составило 54,7 мкг/мг полимера (см. Таблицу 1).
1.3 Получение наночастиц с инкапсулированным овальбумином (NPII, NPIII и NPIV)
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] были растворены в 4 мл ацетона, кроме того, в то время как 5 мг овальбумина были диспергированы в 1 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (MicrosonTM) или ультразвуковой ванны в течение 1 минуты с охлаждением. Дисперсия овальбумина была введена в полимерную суспензию и перемешана в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл. Полученные наночастицы были инкапсулированы OVA (NPII). В случае составов NPIII и NPIV тогда же мог быть введен перекрестно-связывающий агент: 0,05 мл и 0,1 мл 1% раствора 1,3-диаминопропана соответственно.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -41,4 мВ в случае NPII, -50,8 мВ в случае NPIII, -57,5 мВ в случае NPIV, и содержание овальбумина было близко к 30 мкг/мг полимера (см. Таблицу 1).
1.4 Получение наночастиц с овальбумином и крупным липополисахаридом Brucella ovis (NPV, NPVI, NPVII)
1.4.1 Выделение и характеристика комплекса крупного липополисахарида Brucella ovis
Использованный экстракт является крупным полисахаридом Brucella ovis (R-LPS). R-LPS был получен описанным ранее способом (Galanos et al., Eur. J. Biochem. (1969), 245-249). После культивирования бактерий Brucella ovis они были ресуспендированы в абсолюте этанола с перемешиванием при температуре 4°С в течение ночи в закрытом контейнере. Затем клетки были центрифугированы (6000 х g, 20 минут, 4°С) и ресуспендированы в ацетоне с перемешиванием в течение 12 часов при температуре 4°С в закрытом контейнере. Последовательно клетки были собраны центрифугированием (6000 х g, 20 минут, 4°С), они были ресуспендированы в этиловом эфире и были выдержаны при комнатной температуре в течение от 3 до 4 часов с магнитным перемешиванием. Затем они были вновь центрифугированы (6000 х g, 20 минут, 4°С) и были подвергнуты упариванию для сухого состояния. Для проведения экстракции клетки смешивали до проведения гомогенизации с петролейным эфиром, простым эфиром фенола и хлороформом в соотношении 8:5:2 соответственно. Смесь центрифугировали (8000 х g, 15 минут, комнатная температура) и собирали супернатант. Осадок в пробирке был реэкстрагирован при тех же условиях еще дважды. Весь супернатант был объединен, и петролейный эфир и эфир хлороформа были выпарены в ротационном испарителе. Фенольный осадок был осажден дистиллированной водой и центрифугирован (8000 х g, 30 минут, комнатная температура). Затем он был дважды промыт с фенолом и дважды с этиловым эфиром. После последнего центрифугирования оставшийся этиловый эфир был извлечен под вакуумом, осадок в пробирке был ресуспендирован в деионизированной воде и был подвергнут диализу. Диализный мешок был центрифугирован (100000 х g, 6 часов, 4°С), осадок в пробирке был ресуспендирован в деионизированной воде и подвергнут лиофилизации.
Количество R-LPS было определено косвенно посредством одного из его эксклюзивных маркеров KDO с ипользованием метода с применением тиобарбитуровой кислоты.
1.4.2 Наночастицы с инкапсулированным овальбумином и R-LPS Brucella ovis
на поверхности (NP V).
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида [Gantrez® AN 119] были растворены в 4 мл ацетона, кроме того, в то время как 5 мг овальбумина были диспергированы в 1 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (MicrosonTM) или ультразвуковой ванны в течение 1 минуты с охлаждением. Дисперсия овальбумина была введена в сополимерную суспензию и перемешана в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 9 мл. Этот раствор был выдержан в течение 1 часа при комнатной температуре с 1 мл водной дисперсии (предварительно была проведена обработка ультразвуком в течение 1 минуты), содержащей 1 мг R-LPS Brucella ovis.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы (NP V) имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -46,1 мВ, содержание овальбумина составило 64,1 мкг/мг полимера и 15,2 мкг R-LPS /мг полимера (см. Таблицу 1).
1.4.3 Наночастицы с инкапсулированным R-LPS Brucella ovis и овальбумином на поверхности (NP VI).
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида [Gantrez® AN 119] были растворены в 4 мл ацетона, кроме того, в то же время 1 мг R-LPS Brucella ovis был диспергирован в 1 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (MicrosonTM) или ультразвуковой ванны в течение 1 минуты с охлаждением. Дисперсия R-LPS была введена в сополимерную суспензию и перемешана в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 5 мл. Этот раствор был инкубирован в течение 1 часа при комнатной температуре с 5 мл водного раствора, содержащего 5 мг овальбумина.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы (NP VI) имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -56,9 мВ, содержание овальбумина составило 68,5 мкг/мг полимера и 12,1 мкг R-LPS /мг полимера (см. Таблицу 1).
1.4.4 Наночастицы с инкапсулированным овальбумином и R-LPS Brucella ovis
на поверхности (NP VII)
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида [Gantrez® AN 119] были растворены в 3 мл ацетона, кроме того, в то же время 5 мг овальбумина были диспергированы в 1 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (MicrosonTM) или ультразвуковой ванны в течение 1 минут с охлаждением, и 1 мг R-LPS Brucella ovis был диспергирован в 1 мл ацетона, так же была проведена ультразвуковая обработка с охлаждением. Дисперсия овальбумина была введена в дисперсию R-LPS и эта смесь была введена в сополимерную суспензию и перемешана в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы (NP VII) имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -46,1 мВ, содержание овальбумина составило 54,7 мкг/мг полимера и 13,8 мкг R-LPS /мг полимера (см. Таблицу 1).
1.5 Характеристика наночастицы
Физикохимическая характеристика различных композиций показана в Таблице 1.
Согласно собранным результатам было установлено, что когда наночастицы были покрыты овальбумином (NP I и NP VI), размер увеличивался и дзета-потенциал становился более отрицательным, в то время как, если овальбумин находился внутри наночастиц (NP II, NP III, NP IV, NP V и NP VII), размер так же как и дзета-потенциал не изменялся по сравнению с пустыми наночастицами (NP).
В то же время было установлено, что размеры наночастиц уменьшались по мере того, как было уменьшено количество введенного перекрестно-связывающего агента и незначительно уменьшено количество овальбумина.
Присутствие R-LPS на поверхности наночастицы вынуждает количество инкапсулированного овальбумина увеличиваться (NP V в сравнении с NP II), хотя, если R-LPS преимущественно находится внутри наночастиц, количество адсорбированного овальбумина не изменяется (NP VI в сравнении с NP I).
Таблица 1 Физикохимическая характеристика различных композиций (с данными, полученными как средние±стандартное отклонение n=10) |
|||||
Размер (нм) | Дзета-потенциал (мВ) | Инкапсу- лированный OVA (мкг/мг) |
Эффективность инкапсу- ляции (%) |
R-LPS (мкг/мг) | |
NP | 158±3 | -45,1±0,5 | --- | --- | --- |
NP I | 300±4 | -61,3±3,8 | 67,8±20,2 | 47,50±2,12 | --- |
NP II | 205±1 | -41,4±2,5 | 36,1±3,8 | 50,48±5,32 | --- |
NP III | 239±4 | -50,8±2,9 | 30,1±4,5 | 42,14±6,30 | --- |
NP IV | 270±2 | -57,5±3,1 | 31,4±4,2 | 44,08±5,88 | --- |
NP V | 152 | -46,1 | 64,1±2,9 | 89,74±4,06 | 15,2±0,5 |
NP VI | 287 | -56,9 | 68,5±2,4 | 47,95±1,68 | 12,1±0,6 |
NP VII | 135 | -43,7 | 54,7±1,9 | 76,58±2,66 | 13,8±3,0 |
Выход наночастиц составил приблизительно 70%.
Пример 2
Тест in vitro высвобождения овальбумина из наночастиц
Для проведения оценки выделения овальбумина in vitro наночастицы были инкубированы в 1 мл PBS (фосфатно-буферный солевой раствор рН 7,4) в пробирках «Эппендорф» с концентрацией, приблизительно равной 8 мг/мл. Эти пробирки были инкубированы в термостате при температуре 37°С с ротацией, и образцы подвергали центрифугированию через заранее определенные промежутки времени при 26500 х g в течение 20 минут, собирая супернатант для его дальнейшего исследования. Высвобожденный овальбумин был измерен в супернатанте с использованием метода с применением бицинхониновой кислоты.
Полученная кривая выделения овальбумина показана на фигуре 1; было установлено, что в композиции NP I овальбумин высвободился гораздо быстрее, чем в композициях NP II, NP III и NP IV, которые показали аналогичный профиль высвобождения. Это происходит потому, что в композиции NP I овальбумин адсорбирован на внешней поверхности наночастиц, поэтому инициируется высвобождение (взрыв) гораздо более резкое, чем у других композиций, в которых часть овальбумина инкапсулирована (NP II, III и IV). В то же время в профилях высвобождения NP II, NP III и NP IV можно было наблюдать, что по мере того, как количество перекрестно-связывающего агента увеличивается, процентное соотношение высвободившегося овальбумина незначительно уменьшается.
Пример 3
Количественная оценка продуцирования антител против OVA после иммунизации овальбумином у мышей BALB/c
Были иммунизированы 65 мышей BALB/c, разделенные затем на 13 групп согласно схеме введения.
Для контроля использовались: раствор, свободный от овальбумина (OVA) (10 мкг внутрикожно и 25 мкг перорально), пустые наночастицы (NP) (внутрикожно и перорально) и овальбумин, адсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum) (10 мкг внутрикожно), в качестве позитивного контроля индуцирования Th2 ответа, характеризующегося высокими титрами IgG1 [Faquim-Mauro et al., Int Immunol, 12 (2000) 1733-1740].
Оставшиеся группы были инокулированы внутрикожно (10 мкг OVA) или перорально (25 мкг OVA), отличиями в обработке было:
А) раствор овальбумина (OVA) внутрикожно
B) раствор овальбумина (OVA) перорально
С) овальбумин, адсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum), внутрикожно
D) пустые наночастицы (NP) внутрикожно
Е) пустые наночастицы (NP) перорально
F) наночастицы, покрытые овальбумином (NP I), внутрикожно
G) наночастицы, покрытые овальбумином (NP I), перорально
H) наночастицы с инкапсулированым овальбумином (NP II) внутрикожно
I) наночастицы с инкапсулированым овальбумином (NP II) перорально
J) наночастицы с перекрестно-связывающим агентом 1,3-диаминопропаном с инкапсулированым овальбумином (NP III и NP IV) внутрикожно
K) наночастицы с перекрестно-связывающим агентом 1,3-диаминопропаном с инкапсулированым овальбумином (NP III и NP IV) перорально.
Последовательные извлечения крови были проведены на 7, 14, 28 и 35 дни после иммунизации. Сыворотки каждой группы были собраны и заморожены при температуре -80°С для их последующего исследования.
Уровни антител против OVA (IgG1 и IgG2a) были определены в различных сыворотках посредством ELISA, и полученные данные показаны на фигуре 2 и 3. Было установлено, что наночастицы, содержащие овальбумин (NP I, NP II, NP III и NP IV), каждый из которых покрывал наночастицы или был в них инкапсулирован, усилили иммунный ответ к овальбумину в растворе. На 14 день после введения указанных композиций с наночастицами повысили титр IgG1 в сыворотках мышей на 3 или 6 логарифмических единиц в зависимости от типа. В то же время в сыворотке мышей, которым был введен OVA-Alum, антитела IgG2а отсутствовали в течение всего эксперимента, хотя у мышей, которым был введен NP III на 35 день после иммунизации, они достигли титра в 5120.
Это показывает, что в основном указанные NP композиции (NP I, NP II, NP III и NP IV) способны увеличивать титры антител и Th1 и Th2, но, в частности, композиция NP III является самой иммуногенной.
В то же время, если титры мышей из группы, принимавшей NP III, сравнить с титрами мышей группы, принимавшей NP IV, можно увидеть, что там наблюдается оптимальное перекрестное связывание (Пример 2, последний абзац), постольку поскольку, хотя они имеют похожие кривые IgG1, титры IgG2а для NP III немного больше, чем в случае с NP IV.
Сопоставляя результаты, полученные у мышей при пероральном введении, было установлено, что только NP III явился той композицией, которая индуцировала поддающиеся количественному измерению уровни антител IgG1 и IgG2а (фиг.3).
После подтверждения этого в таких же экспериментальных условиях композиция NP III оказалась самой эффективной, подобное исследование было проведено с модифицированием вводимой дозы NP III. В этом случае следующие композиции были введены (перорально) животным:
А) пустые наночастицы (NP)
В) 25 мкг инкапсулированого овальбумина с наночастицами, перекрестно-связанными с 1,3-диаминопропаном с инкапсулированным овальбумином (NP III - 25)
С) 50 мкг инкапсулированого овальбумина с наночастицами, перекрестно-связанными с 1,3-диаминопропаном с инкапсулированным овальбумином (NP III-50).
В этом случае полученные результаты (фигура 4) показывают, что уровни IgG2а против OVA в сыворотке были значительно выше, когда доза составляла 50 мкг.
Пример 4.
Количественная оценка продуцирования антител против OVA и интерлейкина 10 (IL-10) после введения наночастиц овальбумина с липополисахаридом Brucella ovis
Были иммунизированы 40 мышей BALB/c, разделенные на 8 групп, согласно форме введения. Во всех группах было осуществлено внутрикожное введение (10 мкг овальбумина). В этот раз отличия в терапии были:
А) раствор овальбумина (OVA)
В) овальбумин, абсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum)
С) пустые наночастицы (NP)
D) наночастицы, покрытые овальбумином (NP I)
Е) наночастицы, перекрестно-связанные с 1,3-диаминопропаном с инкапсулированым овальбумином (NP III)
F) наночастицы, перекрестно-связанные с 1,3-диаминопропаном с инкапсулированым овальбумином и покрытые Brucella ovis R-LPS (NP V)
G) наночастицы с инкапсулированным Brucella ovis R-LPS и покрытые овальбумином (NP IV)
H) наночастицы, перекрестно-связанные с 1,3-диаминопропаном с овальбумином и инкапсулированным Brucella ovis R-LPS (NP VII).
Группа, которой был введен овальбумин, адсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum), была взята в качестве позитивного контроля эксперимента.
Последовательные извлечения крови были проведены на 7, 14, 28, 35, 42 и 49 дни после иммунизации. Образцы были обработаны (см. пример 3) и полученные результаты показаны на фигурах 5 и 6.
Ответ IgG 1 (Фигура 5): NP III, NP V и NP VII индуцировали высокие уровни IgG1 более быстро и более интенсивно, чем контрольная композиция (OVA-Alum). Только на 49 день после иммунизации составы на основе наночастиц и контроль (OVA-Alum) показали сходные уровни. И наконец, R-LPS на поверхности наночастиц не оказывал индуцирующего эффекта на уровни IgG1.
В то же время NP I также показывает большой потенциал индуцирования продуцирования антител IgG1. Кроме того, как в предыдущем случае, этот феномен был быстрее и интенсивнее, чем у контрольной композиции. Когда R-LPS введен внутрь наночастиц, покрытых OVA, было установлено значительное сокращение в сыворотке титра IgG1 в сравнении с NP I и контрольными композициями.
Ответ IgG 2а: на фигуре 6 показаны титры IgG2а в сыворотке мышей. В этом случае ни одна из контрольных композиций (OVA, NP, OVA-Alum) не индуцировала титры антител. Однако композиции с инкапсулированным OVA были способны обеспечить высокие титры IgG2а, главным образом когда R-LPS был адсорбирован на внешней поверхности наночастиц (композиция NP V). В то же время NP I проявил себя гораздо более эффективным, чем NP IV для индуцирования Th1 ответа, измеренного в титре сыворотке IgG2а.
IL-10: на фигуре 7 показаны уровни IL-10 сыворотки, которые были определены посредством набора ELISA (Biosource, Camarillo, USA). В этом случае ни одна из контрольных композиций не смогла индуцировать секрецию IL-10 сыворотки. Кроме того, все композиции с наночастицами в большей или меньшей степени индуцировали секрецию цитокина. Композиция с овальбумином, адсорбированным на поверхности NP (NP I), позволяет индуцировать максимальное значение IL-10 гораздо быстрее, чем остальные композиции. Кроме того, введение LPS (NP VI) значительно замедляет (14 дней) секрецию цитокина. В то же время NP III показал, что является самой эффективной композицией для индуцирования IL-10 сыворотки, приводя к уровням, которые оказались в два раза выше, чем у NP I, хотя задержка во времени составила одну неделю. Введение R-LPS в инкапсулированные частицы OVA (NP V и NP VII) позволяет индуцировать более дискретные уровни IL--10, но с максимальным значением в течение двух недель после введения. Этот потенциал композиций для индуцирования значительных уровней IL-10 предполагает применение их в качестве возможной терапии при заболеваниях, характеризующихся дисбалансом в балансе Th1/Th2 через регуляцию этого цитокина [Zuany-Amorim et al., J Clin Invest, 95 (1995) 2644-2651; Stampfli et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 21 (1999) 586-596; Нall et al, Vaccine, 21 (2003) 549-561].
Пример 5
Получение, характеристика и введение наночастиц с экстрактом ChE Salmonella enteritidis
5.1 Выделение экстракта ChE Salmonella enteritidis
ChE (хаотропный экстракт) бактериальный экстракт был получен посредством следующего протокола, описанного ранее Altman et al. (Altman et al., Biochem J (1982) 505-513). Инокулум (инокулят) Salmonella enteritidis в стабильной фазе был инкубирован в колбах, содержащих 400 мл среды BHI (бульон с сердечно-мозговым экстрактом Brain Heart Infusion, Difco Lab., Detroit, USA) при температуре 37°С в течение 48 часов, без перемешивания. Клетки были последовательно центрифугированы (7000 х g, 30 минут) и промыты с PBS (фосфатно-буферный солевой раствор; 10 ммоль; pH 7,4). Бактериальный экстракт был получен после обработки клеточного осадка в пробирке 3М KSCN/PBS с магнитным перемешиванием (1 час, комнатная температура) и последовательно центрифугирован (35000 х g, 30 минут). Супернатант, который содержал экстракт ChE, был собран и подвергнут диализу первый раз от PBS и затем от деионизированной воды. И наконец, он был лиофилизирован и хранился при температуре 4°С до момента дальнейшего использования.
5.2 Получение наночастиц с овальбумином и ChE Salmonella enteritidis (OVASAL)
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида [Gantrez® AN 119] были растворены в 3 мл ацетона, в то же время 5 мг овальбумина и 5 мг экстракта ChE были диспергированы в 2 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (MicrosonTM) в течение 1 минуты с охлаждением. Дисперсия овальбумина и дисперсия ChE были введены в полимерную суспензию и перемешаны в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл. Затем этот раствор был инкубирован с 0,1 мл 1% раствора 1,3-диаминопропана.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была сублимирована.
5.3 Количественная оценка продуцирования антител против OVA после иммунизации с OVASAL у мышей BALB/c
Внутрикожно 10 мкг овальбумина были иммунизированы 15 мышей, разделенные на 3 группы, согласно полученной обработке:
А) раствор овальбумина (OVA)
В) овальбумин, адсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum)
С) наночастицы овальбумина и ChE Salmonella enteritidis (OVASAL)
После введения различных композиций на 7, 14, 28, 35, 42 и 49 дни была взята кровь из ретроорбитального сплетения, и образцы были обработаны, как указано в примере 3. Полученные результаты показаны на фигуре 8. Неожиданно OVASAL значительно повысил титр IgG1, хотя титр IgG2а остался на очень низком уровне. Это показывает, что эта композиция оказалась способна усилить только Th2 ответ, который был также гораздо более быстрым и интенсивным, чем у контрольной композиции (OVA-Alum). Эти результаты позволяют думать о возможном применении заявляемой композиции в качестве адъюванта в вакцинах с получением высоких уровней антител или против токсинов, вырабатываемых микроорганизмами. Также было бы возможно применение при определенных аутоиммунных заболеваниях, характеризующихся чрезмерно высоким Th1 ответом в острой фазе.
Пример 6
Получение и характеристика биодеградируемых наночастиц с экстрактом НЕ Salmonella enteritidis (NP НЕ 3934)
6.1 Выделение и характеристика НЕ антигенного комплекса 3934 Salmonella enteritidis
Используемый антиген является экстрактом поверхностных белков S. enteritidis, названным НЕ (горячим солевым эксрактом Hot Saline Extract) из-за того факта, что он выделяет антигенный комплекс в солевой среде и с нагревом. Этот НЕ содержит фосфолипиды, поверхностные белки и чистый липополисахарид (S-LPS). Экстракт НЕ был получен способом, описанным ранее [Gamazo et al., Infect. Immun. (1989) 1419-1426]. После культивирования бактерий Salmonella enteritidis 3934 в пробирках, содержащих триптиказосоевый бульон (TSB), бактерии были центрифугированы при 7000 х g в течение 30 минут и дважды были промыты солевым раствором. Живые клетки были ресуспендированы в солевом растворе (10 г влажных клеток в 100 мл) и нагреты в паровом потоке при 100°С в течение 15 минут. После центрифугирования (12000 х g, 10 минут) супернатант был подвергнут диализу в течение 5 дней для удаления деионизированной воды. Подвергшийся диализу материал был ультрацентрифугирован в течение 4 часов при 60000 х g, и осадок в пробирке (НЕ) был ресуспендирован в деионизированной воде, лиофилизирован и хранился при комнатной температуре.
Характеристика включает определение процентного соотношения белка и липополисахарида. Определение количества белка было проведено посредством метода Лоури. Экстракт антигена Salmonella enteritidis 3934 содержит приблизительно 31% белка. Количество LPS было определено напрямую посредством одного из его эксклюзивных маркеров KDO с применением способа с использованием тиобарбитуровой кислоты. Посредством этого метода было установлено 0,86% KDO, соответствующее 65% S-LPS.
6.2 Продуцирование и физикохимические характеристики наночастиц с экстрактом НЕ Salmonella enteritidis 3934 (NP HE 3934)
Сначала 100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида были растворены в 5 мл ацетона; антигенный экстракт НЕ (4 мг), также ресуспендированный в 1 мл ацетона, был введен в этот раствор и подвергнут смешиванию с магнитным перемешиванием. Этот раствор был инкубирован в течение 15 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и такой же объем воды. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл.
Суспензия была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (10 минут при 35000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в 5% водном растворе сахарозы м/о (масса/объем). И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Конечный состав суспензии наночастиц перед лиофилизацией:
Сополимер метилвинилового эфира малеинового ангидрида [Gantrez® AN 119] |
1,0% w/v (м/о) |
Экстракт антигена | 0,4% |
Сахароза | 5,0% |
Вода для инъекций | до 10 мл |
Размер и поверхностный заряд наночастиц определялись перед лиофилизацией. Средний размер полученных наночастиц составлял менее 200 нм и отрицательный суммарный поверхностный заряд (-20,1±3,2 мВ). Конечный выход продукта определяли после процесса лиофилизации. Исходная масса сополимера составила 100 мг, в конце процесса было определено количество, перешедшее в наночастицы, и это было выражено в процентном соотношении к исходной массе сополимера.
Количество экстракта определяли с использованием метода с применением бицинхониновой кислоты. С этой целью брали аликвоту (1 мл) суспензии наночастиц до введения перекрестно-связывающего агента. Перед проверкой этих данных эта смесь была исследована колориметрическим методом с применением бицинхониновой кислоты на белок. Наночастицы расщепляли введением 0,1 н NaOH и эту смесь анализировали в отношении белка колориметрическим методом с бицинхолиновой кислотой. В этот образец был введен раствор бицинхониновой кислоты с 5% сульфатом меди в соотношении 100:2; смесь выдерживали 1,5 часа при температуре 37°С и затем проводили измерения спектрофотометром с длинной волны 562 нм.
Заполняемость экстрактом была выражена как количество экстракта в мкг на мг наночастиц, и эффективность инкапсуляции была определена отношением общего количества инкапсулированного экстракта к исходному количеству.
Таблица 2 показывает заполняемость экстрактом наночастиц (мкг экстракта/мг наночастиц) и эффективность инкапсуляции (%).
Таблица 2 Физикохимические характеристики наночастиц Gantrez® AN 119, заполненных экстрактом антигена |
|||
Композиция | Размер (нм) | Инкапсулированный экстракт (мкг/мг) |
Эффективность Инкапсуляцииа (%) |
NP | 171,4±3,9 | --- | --- |
NP-HE S. enteritidis |
178±55,4 | 18,1±6,6 | 45,2±5,4 |
а: эффективность инкапсуляции - процент инкапсулированного НЕ и он был высчитан, как количество инкапсулированного экстракта антигена, умноженное на 100 и разделенное на исходное количество. |
На фигуре 9 показан стандартный белок HE S. enteritidis, в котором различные компоненты могут быть разделены на: порин (приблизительно 36 кДа), OmpA (34 кДа) и фибрин SEF 14 (14 кДа) и SEF21 (21 кДа). Посредством электрофореза с додецил сульфатом натрия на полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и иммуноблоттингом было подтверждено, что икапсулированный экстракт сохранил структурную целостность и антигенные свойства. На фигуре 10 показан антигенный профиль экстракта перед и после инкапсуляции.
Пример 7
Исследование защиты у мышей, обеспечиваемой введением интраперитонеально вакцины NP НЕ 3934
Были использованы группы девятинедельных мышей BALB/c, каждая группа состояла из 10 животных. Вакцинация была проведена вакцинным препаратом с наночастицами (NP НЕ 3934), описанным в Примере 6, в соотношении 30 мкг экстракта на животное, включая также контрольных животных: i) такое же количество соответствующих пустых наночастиц; ii) 30 мкг/животное экстракт НЕ в свободной форме, неинкапсулированный; iii) 200 мкл коммерческой вакцины Salenvac® (Intervet UK Limited, Walton, England); iv) солевой раствор.
Через десять дней после вакцинации они были интраперитонеально инокулированы летальной дозой 102 КОЕ штамма S. enteritidis 3934 и после этой инокуляции было определено число животных, умерших от салмонеллеза. Результаты эксперимента по защите показывают, что препарат вакцины на основе наночастиц (NP НЕ 3934) при введении подкожно защищает от S. enteritidis подобно защите, вызываемой коммерческой вакциной Salenvac®, так же как и экстракт НЕ антигена, введенный в свободной форме (НЕ Se 3934).
Результаты показывают, что инкапсуляция экстрактов НЕ в наночастицы не повышает уровни защиты у мышей. В то же время иммунизация мышей пустыми наночастицами индуцирует неспецифический иммунный ответ, который обеспечивает защиту в течение трех недель. Кроме того, следует отметить, что способ введения НЕ антигена, как в свободной, так и в инкапсулированной форме, был проведен интраперитониально. В более ранних исследованиях предполагалось, что пероральное или интраназальное введение неинкапсулированных антигенов могло быть причиной их деградации, прежде чем они достигнут мест взаимодействия с антиген-презентующими клетками.
Кроме того, через 10 дней после вакцинации были проведены исследования иммунитета, обеспеченного наночастицами, введенными в момент экспериментальной инфекции, определялось количество IFN-γ и уровни продуцирования IL-4 (типичные для Th1 и Th2 типов иммунного ответа соответственно), выработанного клетками селезенки мышей (фигура 12). Также было определено продуцирование антител IgG2a и IgG1 в крови (Th1 и Th2 соответственно) (фигура 13).
Для изучения иммунного баланса Th1/Th2, индуцированного свободным и инкапсулированным экстрактами НЕ у мышей, участвовавших в исследовании, были определены IFN-γ и уровни продуцирования IL-4, выработанного клетками селезенки иммунизированных животных (фигура 12). На Панели А показаны индуцированные уровни IFN-γ, демонстрирующие повышение указанного продуцирования у мышей, иммунизированных наночастицами (NP HE 3934). В противовес на Панели В показано, как незначительно возрастает уровень продуцирования IL-4 у мышей, иммунизированных экстрактом НЕ (НЕ 3934) в свободной форме, и у мышей, иммунизированных наночастицами NP HE 3934. Принимая во внимание полученные результаты, можно подтвердить, что инкапсуляция экстрактов НЕ в наночастицы способствует повышению Th1 типа иммунного ответа, подтвержденного повышением продуцирования IFN-γ по сравнению с Th2.
Было исследовано посредством прямого ELISA продуцирование специфических антител против экстрактов НЕ S. enteritidis 3934 у иммунизированных мышей (фигура 13). У неиммунизированных мышей или мышей, иммунизированных пустыми наночастицами (пустые NP), не продуцировались антитела IgG2a или IgG1 против экстракта НЕ S. enteritidis 3934. Уровни IgG2a, определенные анализом ELISA, были значительно выше, чем уровни IgG1 во всех сыворотках, полученных от мышей. Кроме того, не наблюдалось повышение серологической реакции у мышей, иммунизированных экстрактами NP НЕ (НЕ 3934), в сравнении с реакцией, показанной мышами, иммунизированными экстрактами НЕ (НЕ 3934) в свободной форме.
IgG2a является доминирующим изотипом антитела в Th1 иммунных ответах, хотя IgG1 обладает такой же функцией для Th2 иммунных ответов, которые могли бы подтвердить результаты, полученные в исследовании высвобождения IFN-γ и IL-4, демонстрирующие, что интраперитонеальное введение наночастиц с экстрактами НЕ S. enteritidis индуцирует преобладание Th1 типа иммунного ответа. Это введение обеспечивает такую же степень защиты от сальмонеллеза, как и при введении антигена в свободной форме. Кроме того, как было описано ранее, применение этих не инкапсулированных антигенов через слизистую оболочку могло бы не дать эти уровни защиты, наблюдаемые в этом эксперименте, из-за кислоты и разрушения ферментами, которое они могли испытать, проходя через желудочно-кишечный тракт животного.
Claims (32)
1. Применение наночастиц на основе сополимера метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) в качестве адъюванта для получения вакцины, содержащей антиген, или для получения иммунотерапевтической композиции, содержащей аллерген.
2. Применение по п.1, где указанные наночастицы на основе PVM/MA содержат указанный аллерген или указанный антиген.
3. Применение по п.2, где указанный аллерген или антиген по крайней мере частично покрывает поверхность указанных наночастиц и/или находится внутри указанных наночастиц.
4. Применение по п.1 или 2, где указанные наночастицы на основе PVM/MA дополнительно содержат иммуностимулирующий агент.
5. Применение по п.4, где указанный иммуностимулирующий агент по крайней мере частично покрывает поверхность указанных наночастиц и/или находится внутри указанных наночастиц.
6. Применение по п.4, где указанный аллерген или антиген и иммуностимулирующий агента по крайней мере частично покрывает поверхность указанных наночастиц и/или находится внутри указанных наночастиц.
7. Применение по п.1, где указанные наночастицы дополнительно содержат перекрестно-связывающий агент.
8. Применение по п.1, где средний размер указанных наночастиц составляет от 10 до 900 нм, предпочтительно, равен 400 нм или менее.
9. Применение по п.1, где молекулярная масса указанного сополимера PVM/MA составляет от 100 до 2400 кДа, предпочтительно, от 200 до 2000 кДа, более предпочтительно, от 180 до 250 кДа.
10. Применение по п.1, где указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция находится в лиофилизированной форме.
11. Применение по п.1, где указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция находится в форме, подходящей для перорального или парентерального введения.
12. Применение по п.1, где указанным аллергеном является аллерген, экстрагированный из цветочной пыльцы, аллерген, экстрагированный из насекомых, или аллерген, экстрагированный из пищевых продуктов.
13. Применение по п.1, где указанный антиген является иммуногенным экстрактом организма.
14. Применение по п.13, где указанный организм является Salmonella spp., предпочтительно, S.enteritidis.
15. Применение по п.13, где указанный антиген является экстрактом НЕ S.enteritidis или экстрактом ChE S.enteritidis.
16. Применение наночастиц на основе сополимера метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) для получения композиции для усиления иммунного ответа на антиген или аллерген при их совместном введении.
17. Применение наночастиц на основе сополимера метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) совместно с антигеном или аллергеном для получения фармацевтической композиции для селективной стимуляции Тh1 иммунного ответа или для получения фармацевтической композиции для селективной стимуляции Th2 иммунного ответа, или для получения фармацевтической композиции для сбалансированной стимуляции Тh1 и Th2 иммунных ответов.
18. Применение по п.16 или 17, где указанным аллергеном является аллерген, экстрагированный из цветочной пыльцы, аллерген, экстрагированный из насекомых, или аллерген, экстрагированный из пищевых продуктов.
19. Применение по п.16 или 17, где указанный антиген является иммуногенным экстрактом организма.
20. Применение по п.19, где указанный организм является Salmonella spp., предпочтительно, S.enteritidis.
21. Применение по п.19, где указанный антиген является экстрактом НЕ S.enteritidis или экстрактом ChE S.enteritidis.
22. Продукт, содержащий раздельно (i) композицию, содержащую аллерген или антиген, и (ii) композицию, содержащую наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) в качестве композиции, усиливающей иммунный ответ на указанный аллерген или антиген для совместного одновременного или последовательного введения одному пациенту для усиления иммунного ответа на указанный аллерген или антиген у указанного пациента.
23. Композиция, стимулирующая иммунный ответ, содержащая наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) и антиген или аллерген, где указанный антиген содержит иммуногенный экстракт микроорганизма, и указанный аллерген содержит аллерген, экстрагированный из цветочной пыльцы, аллерген, экстрагированный из насекомых, аллерген, экстрагированный из пищевых продуктов, аллерген, экстрагированный из грибов или аллерген, экстрагированный из эпителия животных.
24. Композиция по п.23, где указанный организм является Salmonella spp.
25. Композиция по п.23, где указанный антиген является экстрактом НЕ S.enteritidis или экстрактом ChE S.enteritidis.
26. Композиция по п.23, где указанный аллерген или антиген по крайней мере частично покрывает поверхность указанных наночастиц и/или находится внутри указанных наночастиц.
27. Композиция по п.23, где указанные наночастицы на основе PVM/MA дополнительно содержат иммуностимулирующий агент.
28. Композиция по п.27, где указанный иммуностимулирующий агент по крайней мере частично покрывает поверхность указанных наночастиц и/или находится внутри указанных наночастиц.
29. Композиция по п.23, где указанные наночастицы дополнительно содержат перекрестно-связывающий агент.
30. Композиция по п.23, где указанная композиция находится в лиофилизированной форме.
31. Композиция по п.24, где указанная композиция находится в форме, подходящей для перорального или парентерального введения.
32. Вакцина, содержащая терапевтически эффективное количество композиции, стимулирующей иммунный ответ, по пп.23-31 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200401023A ES2246695B1 (es) | 2004-04-29 | 2004-04-29 | Composicion estimuladora de la respuesta inmunitaria que comprende nanoparticulas a base de un copolimero de metil vinil eter y anhidrido maleico. |
ESP200401023 | 2004-04-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2006142094A RU2006142094A (ru) | 2008-06-20 |
RU2379028C2 true RU2379028C2 (ru) | 2010-01-20 |
Family
ID=35241413
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006142094/15A RU2379028C2 (ru) | 2004-04-29 | 2005-04-28 | Композиция, стимулирующая иммунный ответ, содержащая наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8895067B2 (ru) |
EP (1) | EP1752141B1 (ru) |
JP (1) | JP4932704B2 (ru) |
CN (1) | CN1976687B (ru) |
AU (1) | AU2005237269B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0509828B1 (ru) |
CA (1) | CA2564974C (ru) |
DE (1) | DE602005015441D1 (ru) |
ES (2) | ES2246695B1 (ru) |
MX (1) | MXPA06012527A (ru) |
RU (1) | RU2379028C2 (ru) |
WO (1) | WO2005105056A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2669346C2 (ru) * | 2012-06-21 | 2018-10-10 | Норсвестерн Юниверсити | Частицы, конъюгированные с пептидами |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2246694B1 (es) | 2004-04-29 | 2007-05-01 | Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A. | Nanoparticulas pegiladas. |
ES2246695B1 (es) | 2004-04-29 | 2007-05-01 | Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A. | Composicion estimuladora de la respuesta inmunitaria que comprende nanoparticulas a base de un copolimero de metil vinil eter y anhidrido maleico. |
US9492400B2 (en) | 2004-11-04 | 2016-11-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals |
US7396886B2 (en) * | 2005-06-21 | 2008-07-08 | Isp Investments Inc. | Process for making copolymers of maleic anhydride and alkyl vinyl ether of high specific viscosity |
WO2007070682A2 (en) | 2005-12-15 | 2007-06-21 | Massachusetts Institute Of Technology | System for screening particles |
CA2648099C (en) | 2006-03-31 | 2012-05-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc | System for targeted delivery of therapeutic agents |
US8367113B2 (en) | 2006-05-15 | 2013-02-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymers for functional particles |
ES2286951B1 (es) * | 2006-05-26 | 2008-10-01 | Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A | Nanoparticulas bioadhesivas para la administracion de moleculas biologicamente activas. |
WO2007150030A2 (en) | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Microfluidic synthesis of organic nanoparticles |
US9217129B2 (en) | 2007-02-09 | 2015-12-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Oscillating cell culture bioreactor |
WO2008124634A1 (en) | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymer-encapsulated reverse micelles |
WO2008124632A1 (en) | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Amphiphilic compound assisted nanoparticles for targeted delivery |
MX350501B (es) * | 2007-10-12 | 2017-09-07 | Massachusetts Inst Technology | Nanotecnologia de vacuna. |
JP2010077057A (ja) * | 2008-09-25 | 2010-04-08 | Kagoshima Univ | 抗食物アレルギーワクチン |
US8277812B2 (en) * | 2008-10-12 | 2012-10-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen |
US8591905B2 (en) | 2008-10-12 | 2013-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Nicotine immunonanotherapeutics |
US8343498B2 (en) | 2008-10-12 | 2013-01-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics |
US8343497B2 (en) * | 2008-10-12 | 2013-01-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics |
WO2010114912A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-07 | University Of North Carolina At Greensboro | Minimally invasive assessment of ige mediated allergy |
EA028288B1 (ru) | 2009-05-27 | 2017-10-31 | Селекта Байосайенсиз, Инк. | Наноносители, имеющие компоненты с различными скоростями высвобождения |
KR20130108983A (ko) | 2010-05-26 | 2013-10-07 | 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. | 커플링되지 않은 애주번트를 갖는 나노담체 조성물 |
WO2012061717A1 (en) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | Selecta Biosciences, Inc. | Modified nicotinic compounds and related methods |
EP2510930A1 (en) * | 2011-04-15 | 2012-10-17 | Bionanoplus, S.L. | Nanoparticles comprising half esters of poly (methyl vinyl ether-co-maleic anhydride) and uses thereof |
ES2369949B1 (es) * | 2011-05-19 | 2013-08-13 | Universidade De Santiago De Compostela | Microesferas poliméricas como adyuvantes en la producción de vacunas frente a parásitos escuticociliados de peces. |
CN103702687A (zh) | 2011-07-29 | 2014-04-02 | 西莱克塔生物科技公司 | 产生体液和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)免疫应答的合成纳米载体 |
WO2013163176A1 (en) * | 2012-04-23 | 2013-10-31 | Allertein Therapeutics, Llc | Nanoparticles for treatment of allergy |
AU2014248090B2 (en) | 2013-04-03 | 2018-08-02 | N-Fold Llc | Novel nanoparticle compositions |
US9668970B2 (en) * | 2013-12-02 | 2017-06-06 | Intelgenx Corp. | Film dosage form with extended release mucoadhesive particles |
US11033493B2 (en) | 2013-12-02 | 2021-06-15 | Intelgenx Corp. | Film dosage form with extended release mucoadhesive particles |
US10272038B2 (en) | 2013-12-02 | 2019-04-30 | Intelgenx Corp. | Film dosage form with extended release mucoadhesive particles |
PL3233126T3 (pl) | 2014-12-01 | 2019-09-30 | Innoup Farma, S.L. | Nanocząstki do enkapsulacji związków, ich przygotowanie i zastosowania |
CN112057610A (zh) * | 2019-06-10 | 2020-12-11 | 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 | 一种超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4582865A (en) | 1984-12-06 | 1986-04-15 | Biomatrix, Inc. | Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels |
GB8601100D0 (en) | 1986-01-17 | 1986-02-19 | Cosmas Damian Ltd | Drug delivery system |
FR2634397B2 (fr) * | 1986-12-31 | 1991-04-19 | Centre Nat Rech Scient | Procede de preparation de systemes colloidaux dispersibles d'une proteine sous forme de nanoparticules |
FR2608988B1 (fr) * | 1986-12-31 | 1991-01-11 | Centre Nat Rech Scient | Procede de preparation de systemes colloidaux dispersibles d'une substance, sous forme de nanoparticules |
GB8723846D0 (en) | 1987-10-10 | 1987-11-11 | Danbiosyst Ltd | Bioadhesive microsphere drug delivery system |
SE8900422D0 (sv) | 1989-02-08 | 1989-02-08 | Pharmacia Ab | Tvaerbundna hyaluronatgeler samt foerfarande foer framstaellning av dessa |
IT1247472B (it) | 1991-05-31 | 1994-12-17 | Fidia Spa | Processo per la preparazione di microsfere contenenti componenti biologicamente attivi. |
AU636544B1 (en) | 1991-11-27 | 1993-04-29 | Lignyte Co., Ltd. | Water insoluble biocompatible hyaluronic acid polyion complex and method of making the same |
US5565215A (en) | 1993-07-23 | 1996-10-15 | Massachusettes Institute Of Technology | Biodegradable injectable particles for imaging |
US20010053359A1 (en) | 1994-07-26 | 2001-12-20 | Peter Watts | Drug delivery composition for the nasal administration of antiviral agents |
AU3159595A (en) | 1994-08-30 | 1996-03-22 | Hyal Pharmaceutical Corporation | Hyaluronic acid and derivatives for modulation of cellular activity |
ES2098188B1 (es) | 1995-05-11 | 1997-12-16 | Univ Santiago Compostela | Desarrollo de nanoparticulas a base de polimeros hidrofilicos. |
ES2098189B1 (es) | 1995-05-23 | 1997-12-16 | Fernandez Arenas Antonio | Sistema para la toma de impresiones destinadas a la confeccion de protesis dentales implantosoportadas y medios para su realizacion. |
PT752245E (pt) | 1995-07-05 | 2002-09-30 | Europ Economic Community | Nanoparticulas biocompativeis e biodegradaveis destinadas a absorcao e administracao de farmacos proteinaceos |
WO1997004747A1 (en) | 1995-07-27 | 1997-02-13 | Dunn James M | Drug delivery systems for macromolecular drugs |
US7276251B2 (en) | 1997-04-01 | 2007-10-02 | Lg Life Sciences, Ltd., Inc. | Sustained-release composition of drugs encapsulated in microparticles of hyaluronic acid |
ES2114502B1 (es) | 1996-07-29 | 1999-07-01 | Univ Santiago Compostela | Aplicacion de nanoparticulas a base de polimeros hidrofilicos como formas farmaceuticas. |
EP1021168A4 (en) | 1997-10-09 | 2006-08-30 | Univ Vanderbilt | MICRO AND NANOAPARTICULAR, POLYMERIC ADMINISTRATION SYSTEM |
DE19810965A1 (de) | 1998-03-13 | 1999-09-16 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Nanopartikel, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
FR2777193B1 (fr) | 1998-04-14 | 2001-06-08 | Coletica | Particule a groupement hydroxamique chelatante d'ions metalliques et leur utilisation en cosmetique ou en pharmacie |
FR2777895A1 (fr) | 1998-04-28 | 1999-10-29 | Debio Rech Pharma Sa | Polymere sequence non-reticule,procede pour sa preparation, et ses utilisations |
US20030059465A1 (en) | 1998-05-11 | 2003-03-27 | Unger Evan C. | Stabilized nanoparticle formulations of camptotheca derivatives |
CA2341358C (en) | 1998-09-01 | 2011-04-26 | David James Brayden | Method for inducing a cell-mediated immune response and parenteral vaccine formulations therefor |
IN191203B (ru) | 1999-02-17 | 2003-10-04 | Amarnath Prof Maitra | |
AU4476600A (en) | 1999-04-22 | 2000-11-10 | Vanderbilt University | Polymeric encapsulation system promoting angiogenesis |
US6645525B1 (en) | 1999-06-23 | 2003-11-11 | Sedum Laboratories, Inc. | Ionically formulated biomolecule microcarriers |
US20020009466A1 (en) | 1999-08-31 | 2002-01-24 | David J. Brayden | Oral vaccine compositions |
JP4703926B2 (ja) | 1999-10-15 | 2011-06-15 | ジェネティクス インスティテュート,エルエルシー | 骨形成蛋白をデリバリーするためのヒアルロン酸の処方 |
US6743446B2 (en) | 1999-12-15 | 2004-06-01 | The Ohio State University Research Foundation | Methods for stabilizing biologically active agents encapsulated in biodegradable controlled-release polymers |
EP1311288A1 (en) * | 2000-01-20 | 2003-05-21 | Ottawa Health Research Institute | Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response |
US6465425B1 (en) | 2000-02-10 | 2002-10-15 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Microencapsulation and sustained release of biologically active acid-stable or free sulfhydryl-containing proteins |
WO2001078687A1 (en) | 2000-04-18 | 2001-10-25 | Peptron Inc. | Injectable sustained release pharmaceutical composition and processes for preparing the same |
AU2001262596A1 (en) | 2000-05-03 | 2001-11-12 | Natural As | Compositions containing aminopolysaccharides and negatively charged polysaccharides |
US6773695B2 (en) * | 2000-10-05 | 2004-08-10 | Mannkind Corporation | Modulation of allergic response |
KR100375299B1 (ko) | 2000-10-10 | 2003-03-10 | 주식회사 엘지생명과학 | 히알루론산의 가교결합형 아마이드 유도체와 이의 제조방법 |
ES2178961B1 (es) * | 2001-03-06 | 2004-07-01 | Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A. | Fabricacion de nanoparticulas a base del copolimero de metil vinil eter y anhidrido maleico para la administracion de farmacos de naturaleza hidrofilica, en particular de bases puricas y pirimidinicas. |
WO2003049701A2 (en) * | 2001-12-10 | 2003-06-19 | Spherics, Inc. | Methods and products useful in the formation and isolation of microparticles |
ES2221530B1 (es) | 2002-07-19 | 2006-02-16 | Universidad De Santiago De Compostela | Nanoparticulas para la administracion de ingredientes activos,procedimiento para la elaboracion de dichas particulas y composicion que las contienen. |
US7273327B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-09-25 | Colgate-Palmolive Company | Oral care implement |
CN1867582B (zh) | 2003-08-12 | 2010-06-16 | 奥克塔法马股份有限公司 | 制备α-1-抗胰蛋白酶溶液的方法 |
ES2246695B1 (es) | 2004-04-29 | 2007-05-01 | Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A. | Composicion estimuladora de la respuesta inmunitaria que comprende nanoparticulas a base de un copolimero de metil vinil eter y anhidrido maleico. |
-
2004
- 2004-04-29 ES ES200401023A patent/ES2246695B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-04-28 WO PCT/ES2005/000225 patent/WO2005105056A1/es active Application Filing
- 2005-04-28 MX MXPA06012527A patent/MXPA06012527A/es active IP Right Grant
- 2005-04-28 BR BRPI0509828-9A patent/BRPI0509828B1/pt active IP Right Grant
- 2005-04-28 RU RU2006142094/15A patent/RU2379028C2/ru active
- 2005-04-28 JP JP2007510053A patent/JP4932704B2/ja active Active
- 2005-04-28 AU AU2005237269A patent/AU2005237269B2/en active Active
- 2005-04-28 CN CN2005800214936A patent/CN1976687B/zh active Active
- 2005-04-28 CA CA2564974A patent/CA2564974C/en active Active
- 2005-04-28 DE DE602005015441T patent/DE602005015441D1/de active Active
- 2005-04-28 ES ES05744091T patent/ES2329598T3/es active Active
- 2005-04-28 EP EP05744091A patent/EP1752141B1/en active Active
- 2005-04-28 US US11/568,455 patent/US8895067B2/en active Active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ARBOS P. et al., Quantification of the bioadhesive properties of protein-coated. PVM/MA nanoparticles, Int J. Pharm., 2002 Aug 21, v.242 (1-2), pp.129-136. ARBOS P. et al., Gantrez® An as a new polymer for the preparation of ligand-nanoparticle conjugates, J. of controlled release, 2002, v.83, pp.321-330. * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2669346C2 (ru) * | 2012-06-21 | 2018-10-10 | Норсвестерн Юниверсити | Частицы, конъюгированные с пептидами |
US10201596B2 (en) | 2012-06-21 | 2019-02-12 | Northwestern University | Peptide conjugated particles for the treatment of allergy |
US11413337B2 (en) | 2012-06-21 | 2022-08-16 | Northwestern University | Peptide conjugated particles for the treatment of inflammation |
US11826407B2 (en) | 2012-06-21 | 2023-11-28 | Northwestern University | Peptide conjugated particles |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2329598T3 (es) | 2009-11-27 |
DE602005015441D1 (de) | 2009-08-27 |
AU2005237269A1 (en) | 2005-11-10 |
EP1752141B1 (en) | 2009-07-15 |
US8895067B2 (en) | 2014-11-25 |
ES2246695A1 (es) | 2006-02-16 |
BRPI0509828B1 (pt) | 2021-07-13 |
CN1976687B (zh) | 2010-05-05 |
CA2564974C (en) | 2013-07-02 |
CN1976687A (zh) | 2007-06-06 |
CA2564974A1 (en) | 2005-11-10 |
BRPI0509828A (pt) | 2007-11-27 |
RU2006142094A (ru) | 2008-06-20 |
AU2005237269B2 (en) | 2011-08-11 |
MXPA06012527A (es) | 2007-04-10 |
JP2007534728A (ja) | 2007-11-29 |
JP4932704B2 (ja) | 2012-05-16 |
EP1752141A1 (en) | 2007-02-14 |
ES2246695B1 (es) | 2007-05-01 |
WO2005105056A1 (es) | 2005-11-10 |
US20070224225A1 (en) | 2007-09-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2379028C2 (ru) | Композиция, стимулирующая иммунный ответ, содержащая наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида | |
Florindo et al. | The enhancement of the immune response against S. equi antigens through the intranasal administration of poly-ɛ-caprolactone-based nanoparticles | |
JP2015078204A (ja) | 免疫調節剤粒子および処置方法 | |
US9585955B2 (en) | Lipid and nitrous oxide combination as adjuvant for the enhancement of the efficacy of vaccines | |
US20080014281A1 (en) | Chitin Micro-Particles As An Adjuvant | |
Murillo et al. | A Brucella ovis antigenic complex bearing poly-ε-caprolactone microparticles confer protection against experimental brucellosis in mice | |
US10786558B2 (en) | Oral dissolving films | |
US20210100880A1 (en) | System and method for microneedle delivery of microencapsulated vaccine and bioactive proteins | |
JP4601823B2 (ja) | 経口ワクチン組成物 | |
US10849962B2 (en) | Method and apparatus for microneedle transdermal delivery | |
RU2428991C9 (ru) | Сополимеры гетероцепных алифатических поли-n-оксидов, вакцинирующие и лекарственные средства на их основе | |
EP2804592A1 (en) | Inulin and inulin acetate formulations | |
RU2545714C1 (ru) | Способ получения адъюванта для вирусных вакцин | |
US10500283B2 (en) | Vaccine composition capable of inducing memory antibody response from single point immunization | |
WO2003059383A1 (es) | COMPOSICÍON DE VACUNA FRENTE A LA BRUCELOSIS QUE COMPRENDE MICROPARTÍCULAS DE POLI(&epsiv;-CAPROLACTONA) COMO ADYUVANTE | |
Plague | 1.5 CLASSIFICATION OF VACCINES AVAlLABLE TO THE PUBLIC |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20140311 |