RU2372936C1 - Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза - Google Patents
Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2372936C1 RU2372936C1 RU2008119771/13A RU2008119771A RU2372936C1 RU 2372936 C1 RU2372936 C1 RU 2372936C1 RU 2008119771/13 A RU2008119771/13 A RU 2008119771/13A RU 2008119771 A RU2008119771 A RU 2008119771A RU 2372936 C1 RU2372936 C1 RU 2372936C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- tuberculosis
- resuspended
- rpm
- autologous
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение касается способа получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза. Сущность изобретения заключается в активации in vitro мононуклеарной фракции лейкоцитов, выделенных из крови пациента, больного туберкулезом, путем наслаивания на градиент плотности фиколл-урографина. После центрифугирования отмывают собранные из ннтерфазы мононуклеары, ресуспендируют в культуральной среде DMEM и культивируют в этой среде с добавлением Туберкулина и Ронколейкина. Затем подсчитывают клетки, разбавляют до концентрации 2 млн клеток в 1 мл и культивируют при концентрации 5% углекислого газа, после чего клетки ресуспендируют в физрастворе с Ронколейкином. Использование способа позволяет получить высокоэффективную аутологичную вакцину для лечения туберкулеза. 3 табл.
Description
Изобретение откосится к способу получения аутологичной клеточной вакцины против возбудителя туберкулеза.
Развитие медицины в последние два десятилетия охарактеризовано глобальными достижениями в понимании механизмов иммунной защиты организма, принципиально новыми подходами к лекарственному воздействию на нее при наиболее распространенных заболеваниях. Широко распространенное во фтизиатрии индивидуально необоснованное назначение иммуномодулирующих препаратов на основе общих представлений о природе иммунодефицита при туберкулезе легких лишь в половине случаев обусловливает иммуностимулирующий эффект, в других случаях оказывает прямо противоположное негативное действие. Несмотря на повышенный интерес исследователей к проблеме лекарственно-резистентного туберкулеза, в имеющейся литературе недостаточно сведений, касающихся особенностей иммунопатогенеза лекарственно-устойчивых форм распространенного деструктивного туберкулеза легких. Между тем, немногочисленными экспериментальными и клиническими исследованиями установлено, что характер специфического воспаления а, вероятно, и иммунологическая реактивность организма во многом зависят от биологических свойств поражающего штамма М.tuberculosis. Так, комплексный анализ параметров иммунного статуса у больных с различными клиническими формами распространенного деструктивного туберкулеза легких позволил сделать, вывод о том, что при данной патологии имеется дефект Т-клеточного звена иммунитета. В основе его развития при лекарственно-чувствительном и лекарственно-резистентном вариантах инфекции лежат как сходные (угнетение пролиферации, секреции Т-активирующих цитокинов, активация апоптоза), так и различающиеся механизмы. В первом случае - свободно-радикальное повреждение лимфоцитов в условиях декомпенсированной клеванной активации факторов антиоксидантной защиты, во втором - делеция реактивных клонов клеток на фоне развивающейся иммунологической толерантности и нарастающей анергии. Эти данные могут быть интересны не только с теоретической точки зрения, но и с позиций иммунокоррекции выявленных нарушений.
Одним из возможных направлений в иммунотерапии туберкулеза является применение Т-клеток, предварительно «обученных» в присутствии антиген-активированных дендритных клеток. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-презентирующими клетками, которые обеспечивают наиболее эффективное представление различных антигенов и активацию Т-клеток. ДК, расположенные в воздухоносном эпителии и паренхиме легких, находятся в «незрелом» состоянии, неспособном к стимуляции Т-лимфоцитов, но обладают свойством специализации к захвату антигена. После взаимодействия с патогеном или продуктами воспаления ДК могут мигрировать в лимфоидные органы для осуществления Т-клеточного ответа. ДК, полученные из моноцитов, культивированные с М.tuberculosis, обладают высокой способностью к стимуляции Т-клеточной пролиферации и секреции цитокинов. Однако при непосредственном введении зрелых антиген-активированных ДК не исключена вероятность их повторного взаимодействия с компонентами клеточной стенки микобактерий, стимулирующими секрецию иммуносупрессорного цитокина ИЛ-10, который может ингибировать развитие клеточного ответа на микобактерий, подавляя секрецию ИЛ-12 ДК. Поэтому правильнее проводить совместное культивирование ДК с Т-клетками, в процессе которого происходит активация клеточного варианта иммунного ответа. Одним из факторов, «запускающих» активацию иммунного ответа по клеточному пути, является ИЛ-2. Он является фактором роста и дифференцировки Т-лимфоцитов и NK-клеток, повышает функциональную активность Т-хелперов, стимулирует выработку ими эндогенного γ-ИНФ, уменьшает их спонтанный апоптоз. Кроме того, ИЛ-2 стимулирует клональную пролиферацию В-лимфоцитов и антителообразование, увеличивает функциональную активность фагоцитов, улучшает процесс презентации и элиминации антигенов. В уже проводимых исследованиях in vitro было выявлено, что введение аутологичных лимфоцитов после культивирования с ИЛ-2 приводит не только к повышению их цитотоксической активности и расширению спектра клеток-мишеней, но и к снижению побочных реакций этого цитокина, которые при использовании его высоких доз бывают весьма значительными.
В этой связи есть основание полагать, что использование вакцины на основе мононуклеарных клеток, «обученных» антиген-активированными ДК, может быть эффективным подходом к восстановлению специфического иммунного ответа in vivo у больных туберкулезом легких.
Известен способ получения клеточной вакцины для лечения туберкулеза, сущность которого заключается в инфицировании алло- и ксеногенных макрофагов и клеток макрофагальных клеточных линий патогенным штаммом M.tuberculosis. После чего макрофаги обрабатываются лекарственными средствами, вызывающими гибель микобактерий. Затем клетки подвергаются воздействию гамма-облучения, приводящего к их гибели путем апоптоза. Полученной вакциной иммунизируются резистентные и чувствительные к туберкулезу линии животных, и осуществляется поствакцинальный контроль над показателями, свидетельствующими об активации иммунного ответа. Вакцинация приводила к активации иммунного ответа. Однако вакцина, полученная данным способом, содержит чужеродные организму клетки, что может послужить причиной развития поствакцинальной аллергической реакции.
Техническая задача изобретения - получение высокоэффективной аутологичной вакцины для лечения туберкулеза.
Для решения поставленной задачи в способе получения вакцины против туберкулеза. включающем выделение мононуклеарных клеток и их последующую инактивацию, монуклеарные клетки выделяют из крови пациента больного туберкулезом путем наслаивания на градиент плотности фиколл-урографина при соотношении крови и градиента 2:1, центрифугируют в течение 40-45 минут при скорости 1500 об/мин двукратно отмывают собранные из интерфазы мононуклеары центрифугированием в фосфат-забуференном физиологическом растворе при 1500 об/мин в течение сначала 15, а затем 10 минут, ресуспендируют в 1 мл культуральной среды DMEM, в 100 мл которой содержится 10% FCS; 5 мМ HEPES, 2 мМ глутамина, 5×10-5 М меркаптоэтанола, 2,5 мг/мл гентамицин, 100 ЕД/мл Ронколейкина, 500 ТЕ/мл Туберкулина, производят подсчет клеток в камере Горяева, разбавляют до концентрации 2 млн клеток в 1 мл и культивируют в течение 3-5 суток при 37°С и СО2- инкубаторе при концентрации 5% СО2, после этого однократно отмывают центрифугированием с физиологическим раствором при 1500 об/мин в течение 15 минут, ресуспендируют а 400 мл физраствора в сочетании с 500 ТЕ/мл Ронколейкина.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение вакцины
Пациенту производят гемоэксфузию в объеме 100 мл из периферической вены в контейнер с 4 мл гепарина (10 тыс.ЕД). Для выделений мононуклеарных клеток (МНК) наслаивают на градиент плотности фиколл-урографина (ρ 1.077 г/см) из расчета 8 мл крови на 4 мл градиента (2:1) и центрифугируют в центрифужных пробирках в течение 40-45 минут при скорости 1500 оборотов в минуту. Собранные из интерфазы мононуклеары двукратно отмывают центифугированием фосфат-забуференным физиологическим раствором при 1500 об/мин в течение 15, а затем 10 минут. Далее, ресуспендируют в 1 мл культуральной среды (состав среды DMEM на 100 мл: FCS 10%, HEPES 5 мМ, глутамин 2 мМ, меркаптоэтанол 5×10-5 M, антибиотик, например, гентамицин 2,5 мг/мл, Ронколейкин 100 ЕД/мл, Туберкулин 500 ТЕ/мл), производят подсчет клеток в камере Горяева. После чего клетки доводят до концентрации 2 млн в 1 мл и культивируют в течение 3-5 суток при 37°С, 5% СО2 (в CО2- инкубаторе). После культивирования МНК собирают и однократно отмывают центрифугированием с физиологическим раствором при 1500 об/мин, 15 минут, ресуспендируют в 400 мл физраствора в сочетании с 500 ТЕ Ронколейкина.
Режим обработки крови для получения вакцины подобран эмпирически и основан на следующем: первым этапом в создании вакцины является выделение мононуклеарной фракции лейкоцитов из крови пациента. Затем клетки переносятся в среду с добавлением туберкулина и ронколейкина, в результате чего культивируются антиген презентирующие клетки (дендритные клетки) и активированные лимфоциты. Туберкулин является белковым экстрактом микобактерии туберкулеза и используется в качестве антигена для активации дендритных клеток. Ронколейкин, рекомбинантный ИЛ-2, является полным структурным и функциональным аналогом эндогенного ИЛ-2. В организме ИЛ-2 способствует пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов, стимулирует клональную пролиферацию В-лимфоцитов и антителообразозание, увеличивает функциональную активность фагоцитов и клеток натуральных киллеров (NK-клеток). Этот цитокин участвует в регуляции иммунного ответа и направляет его по Т-хелпер 1 - клеточному пути развития. Введение ронколейкина в среду для культивирования способствует запуску и развертыванию клеточного иммунного ответа, который является наиболее эффективным в борьбе с микобактерией туберкулеза.
Пример 2.
Оценка специфических показателей вакцины.
В работе использовалась гепаринизированная венозная кровь пациентов, больных туберкулезом, получающих стандартную терапию на базе ГУЗОО «Клинический противотуберкулезный диспансер», г.Омск (n=18).
Для анализа фенотипических характеристик дендритных клеток использовались моноклональные антитела anti-CD83-PE (BD Pharmingen), anti-CD86-FITC (BD Pharmingen), anti-HLA-DR-FITC («Сорбент», Москва) с последующим анализом на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Признаком функциональной зрелости дендритных клеток считалось повышение уровня экспресии вышеперечисленных маркеров по сравнению с незрелыми ДК (нДК).
Фенотипические характеристики дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови пациентов, больных туберкулезом (n=18), приведены в Таблице 1, где * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с незрелыми дендритными клетками.
Через 72 часа созревание нДК приобретают фенотип зрелых дендритных клеток (зДК), увеличивая экспрессию CD83+CD86+HLA-DR+.
Для определения эффективности модуляции противотуберкулезного иммунного ответа оценивалась пролиферативная активность мононуклеарных клеток (MHК) с использованием системы APO-BRDU Flow Kit на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Тестирование проводилось через 72 часа культивирования MНК активированными зДК в ответ на специфический антиген M.tuberculosis - туберкулин.
Результаты приведены в таблице 2 (Пролиферативный ответ мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом, культивированных с антиген-активированными ДК (n=18), * - различия достоверны (p<0.05) по сравнению с группой МНК).
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что антиген-активированные дендритные клетки повышают пролиферативную активность мононуклеарных клеток больных туберкулезом in vitro.
Для определения эффективности ответа на специфический антиген М.tuberculosis (туберкулин) оценивали количество клеток, продуцирующих IFN-γ, с использованием системы BD FastImmune Cytokine на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Определение уровня продукции IFN-γ в культуральных супернатантах МНК проводили с помощью иммуноферментного анализа («Вектор-Бест») через 72 часа культивирования МНК активированных зДК. Под действием аутологичных антиген-активированных дендритных клеток больных туберкулезом легких достоверно повышается количество IFN-γ-секретирующих клеток и уровень продукции цитокина монокуклеарными клетками в ответ на туберкулин по сравнению с клетками исходной популяции. Данные представлены в таблице 3. (Продукция IFN-γ MHК пациентов, больных туберкулезом, культивированных с антиген-активированными ДК (n=18), * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК).
Для определения потенциальной цитотоксической активности лимфоцитов определялось содержание клеток, экспрессирующих внутриклеточный белок перфорин, с помощью соответствующих моноклональных антител anti-perforin-PE (BD Pharmingen) через 72 часа культивирования МНК, активированных зДК, в ответ на туберкулин. Повышение количества перфорин-позитивных клеток служит показателем активации цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения М.tuberculosis in vivo.
Содержание перфорин-позитивных клеток в популяции МНК составило 18,21±0.9% на 100 тыс. клеток исходной популяции и 37,37±1,83% - для популяции МНК + зДК.
Статистическая обработка результатов. Результаты представлены в виде среднего и ошибки среднего при p<0,05. Статистическая достоверность различий определялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с использованием программы Statistica 6.0.
Табл.1 | ||
Уровень экспрессии маркеров (% позитивных клеток) | Стадия развития ДК | |
Незрелые ДК (%) | Зрелые ДК (%); | |
CD 83+/CD 86+ | 18,59±1,05 | 31,33±1,56* |
CD 83+/HLA-DR+ | 7,67±0,45 | 22,26±1,12* |
Табл.2 | ||
Группы | Спонтанный пролиферативный ответ, % | Туберкулин -стимулированный пролиферативный ответ, % |
МНК | 10,09±0,65 | 13,03±0,71 |
МНК + ДК (без антигена) |
21,27±2,81 | 27,14±2,54 |
МНК + ДК (с антигеном) |
27,41±1,45* | 46,75±2,3* |
Табл.3 | ||||
Количество IFN-γ-продуцирующих клеток, % | Содержание IFN-γ в супернатантах МНК, пг/мл | |||
Спонтанное | Туберкулинстимулированное | Спонтанное | Туберкулинстимулированное | |
МНК | 32±1,3 | 64±3,2 | 65±3,25 | 135±6,75 |
МНК + ДК (без антигена) |
81±14,05 | 97±15,1 | 105±15,25 | 381±49,05 |
МНК + ДК (с антигеном) |
84±4,02* | 161±8,15* | 618±30,91* | 885±44,25* |
Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность индукции специфического противоинфекционного иммунного ответа при туберкулезе с помощью антиген-активированных дендритных клеток и «обученных» мононуклеарных клеток in vitro. Совместное культивирование специфических аутологичных дендритных клеток и мононуклеарных клеток больных туберкулезом легких приводит к активации мононуклеарных клеток, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, увеличении количества цитотоксических клеток и повышении их функциональной активности. Преимуществами данной вакцины является использование аутологичных клеток пациента, что обеспечивает индивидуальный подход к лечению заболевания и нивелирует развитие побочных реакций на вакцинацию. Полученная вакцина устраняет дефекты иммунного ответа, возникающие при длительной персистенции микобактерий туберкулеза в организме как на стадии презентации антигена и дифференцировки антиген представляющих дендритных клеток, так и на стадии активации основного клеточного варианта развития иммунного ответа, а также дополнительно гуморального. Таким образом, полученную предлагаемым способом вакцину можно рекомендовать для лечения больных туберкулезом путем внутривенного капельного введения с физраствором.
Claims (1)
- Способ получения вакцины против туберкулеза, включающий выделение мононуклеарных клеток и последующее их инактивирование, отличающийся тем, что мононуклеарные клетки выделяют из крови пациента, больного туберкулезом, путем наслаивания на градиент плотности фиколл-урографина при соотношении крови и градиента 2:1, центрифугируют в течение 40-45 мин при скорости 1500 об/мин, двукратно отмывают собранные из интерфазы мононуклеары центрифугированием в фосфат-забуференном физиологическом растворе при 1500 об/мин в течение сначала 15, а затем 10 мин, ресуспендируют в 1 мл культуральной среды DMEM, в 100 мл которой содержится 10% FCS, 5 мМ HEPES, 2 мМ глутамина, 5·10-5 М меркаптоэтанола, 2,5 мг/мл гентамицина, 100 Ед/мл Ронколейкина, 500 ТЕ/мл Туберкулина, производят подсчет клеток в камере Горяева, разбавляют до концентрации 2 млн клеток в 1 мл и культивируют в течение 3-5 суток при 37°С в СО2-инкубаторе при концентрации 5% СО2, после этого однократно отмывают центрифугированием с физиологическим раствором при 1500 об/мин в течение 15 мин, ресуспендируют в 400 мл физраствора в сочетании с 500 ТЕ Ронколейкина.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008119771/13A RU2372936C1 (ru) | 2008-05-19 | 2008-05-19 | Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008119771/13A RU2372936C1 (ru) | 2008-05-19 | 2008-05-19 | Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2372936C1 true RU2372936C1 (ru) | 2009-11-20 |
Family
ID=41477765
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008119771/13A RU2372936C1 (ru) | 2008-05-19 | 2008-05-19 | Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2372936C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014007667A1 (ru) * | 2012-06-25 | 2014-01-09 | Volgushev Sergei Anatolievich | Аутологичная вакцина для лечения туберкулеза легких и способ ее получения |
RU2771843C2 (ru) * | 2020-11-09 | 2022-05-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СПб НИИФ" Минздрава России) | Аутологичная композиция и способ лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии |
-
2008
- 2008-05-19 RU RU2008119771/13A patent/RU2372936C1/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014007667A1 (ru) * | 2012-06-25 | 2014-01-09 | Volgushev Sergei Anatolievich | Аутологичная вакцина для лечения туберкулеза легких и способ ее получения |
RU2771843C2 (ru) * | 2020-11-09 | 2022-05-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "СПб НИИФ" Минздрава России) | Аутологичная композиция и способ лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2016250570B2 (en) | Therapeutic pooled blood apoptotic cell preparations and uses thereof | |
US10188681B2 (en) | Method for inducing immune tolerance using non-proliferative polymer-modified allogeneic leukocytes | |
Nakajima et al. | Lung transplantation: infection, inflammation, and the microbiome | |
JP7332787B2 (ja) | 免疫細胞のインビトロ培養、誘導、活性化、凍結保存方法及びその細胞バンクの作成 | |
Odumosu et al. | Cholera toxin B subunit linked to glutamic acid decarboxylase suppresses dendritic cell maturation and function | |
US20100003270A1 (en) | Whole blood cultures comprising stimulated immune cells, and use thereof as medicaments | |
Won et al. | A Salmonella Typhi ghost induced by the E gene of phage φX174 stimulates dendritic cells and efficiently activates the adaptive immune response | |
RU2372936C1 (ru) | Способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза | |
WO2014089397A1 (en) | Compositions and methods of treating and preventing pulmonary fibrosis | |
US20240075063A1 (en) | Use of mait cells for controlling graft versus host disease | |
WO2013050413A1 (en) | Methods for obtaining a population of regulatory t cells | |
Ajit et al. | β-glucan induced trained immunity enhances antibody levels in a vaccination model in mice | |
US20190231822A1 (en) | Methods of reducing chronic graft-versus-host disease | |
RU2771843C2 (ru) | Аутологичная композиция и способ лечения туберкулеза легких с лекарственной устойчивостью возбудителя и отсутствием эффекта на фоне полихимиотерапии | |
US6884413B1 (en) | Induction of antigen-specific unresponsiveness by glioblastoma culture supernatants (GCS) | |
EP1871872B1 (en) | Method for activating cd8 t cells | |
ES2927913A1 (es) | Composición que comprende una combinación de las furanocumarinas psoraleno y angelicina y su uso en terapia | |
JP2004527230A (ja) | Ru41740を用いた樹状細胞の成熟化及びマクロファージの活性化方法 | |
CA3214433A1 (en) | New treatment of sepsis | |
JP2024527074A (ja) | 選択的寛容化-寛容原性樹状細胞を選択的に生成する方法 | |
EP4079312A1 (en) | New treatment of sepsis | |
WO2014007667A1 (ru) | Аутологичная вакцина для лечения туберкулеза легких и способ ее получения | |
CN106544319A (zh) | 一种用于刺激树突状细胞成熟的组合物及其用于刺激树突状细胞成熟的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100520 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20111210 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150520 |