RU2371474C2

RU2371474C2 - Method of producing carbohydrate ester, protein ester, ester of protein subunits or hydroxyacid ester using lipidacyltransferase

Info

Publication number: RU2371474C2
Application number: RU2005126047/13A
Authority: RU
Inventors: Арно Де КРЭИЙ (DK); Арно Де КРЭИЙ; Сусан Мампуста МАДРИД (DK); Сусан Мампуста МАДРИД; Йерн Дальгор МИККЕЛЬСЕН (DK); Йерн Дальгор МИККЕЛЬСЕН; Йерн Борх СЕЭ (DK); Йерн Борх Сеэ
Original assignee: Даниско А/С
Priority date: 2003-01-17
Filing date: 2004-01-15
Publication date: 2009-10-27
Also published as: RU2005126046A; RU2376868C2; RU2005126047A

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and can be used for producing esters of such compounds as carbohydrates, proteins, protein subunits and hydroxyacids. The method involves mixing an acyl group donor, acyl group acceptor and water with formation of a medium with high water content, containing 5 to 98% water. The acyl group donor used is a lipid substrate, chosen from phospolipid, lysophospholipid, triacylglyceride, diglyceride, glycolipid or lysoglycolipid, and the acyl group acceptor used is carbohydrate, protein, protein subunitor hydroxyacid. The mixture is brought into contact with lipidacyltransferase, which catalyses alcoholysis and/or re-esterification and is an enzyme which has acyltransferase activity, containing a GDSX fragment of amino acid sequence, where X stands for one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S.

EFFECT: invention allows for obtaining one or more carbohydrate esters, protein esters, esters of protein subunits or hydroxyacid esters using lipidacyltransferase.

18 cl, 51 dwg, 10 tbl, 13 ex

Description

Ссылка на родственные заявкиLink to related applications

В данном описании изобретения сделана ссылка на нижеследующие заявки: заявка на патент США № 09/750990, поданная 20 июля 1999 г., и заявка на патент США № 10/409391. Вышеуказанные заявки, все документы, приведенные в данных заявках (“документы, приведенные в заявках”), и все документы, которые приведены или на которые дана ссылка в документах, приведенных в заявках, как в тексте, так и во время ведения дела по заявкам, а также все доводы в поддержку патентоспособности, представленные во время рассмотрения заявок, включены в данное описание изобретения в качестве ссылки. В данном описании изобретения приведены также разные документы (именуемые “документами, на которые имеется ссылка в материалах заявки”). Все документы, на которые имеется ссылка в материалах заявки, и все документы, приведенные в таких документах, включены в данное описание изобретения в качестве ссылки.In this description of the invention, reference is made to the following applications: application for US patent No. 09/750990, filed July 20, 1999, and application for US patent No. 10/409391. The above applications, all documents cited in these applications (“documents cited in applications”), and all documents cited or referenced in documents cited in applications, both in the text and during the conduct of business on applications , as well as all arguments in support of patentability presented during the consideration of applications, are incorporated into this description by reference. This document also describes various documents (referred to as “documents referred to in the application materials”). All documents referred to in the application materials, and all documents cited in such documents, are incorporated into this description by reference.

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к способу биоконверсии липидов при помощи липидацилтрансферазы с целью получения сложного эфира углевода, и/или сложного эфира белка, и/или сложного эфира белковой субъединицы, и/или сложного эфира гидроксикислоты.The present invention relates to a method for lipid bioconversion using lipid acyltransferase to produce a carbohydrate ester and / or protein ester and / or protein subunit ester and / or hydroxy acid ester.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению липидацилтрансферазы для биоконверсии липида в один или несколько нижеследующих продуктов: сложный эфир углевода, и/или сложный эфир белка, и/или сложный эфир белковой субъединицы, и/или сложный эфир гидроксикислоты.The present invention also relates to the use of lipid acyltransferase for bioconversion of a lipid into one or more of the following products: carbohydrate ester and / or protein ester and / or protein subunit ester and / or hydroxy acid ester.

Настоящее изобретение, более того, относится к применению вышеуказанной иммобилизованной липидацилтрансферазы для биоконверсии липида в среде с высоким содержанием воды с целью получения одного или нескольких сложных эфиров углеводов, и/или сложных эфиров белков, и/или сложных эфиров белковых субъединиц, и/или сложных эфиров гидроксикислот.The present invention further relates to the use of the above immobilized lipid acyltransferase for lipid bioconversion in a high water medium to produce one or more carbohydrate esters and / or protein esters and / or protein subunit esters and / or esters esters of hydroxyacids.

Настоящее изобретение также относится к иммобилизованной липидацилтрансферазе.The present invention also relates to immobilized lipid acyltransferase.

Уровень техникиState of the art

Липазы широко используются для биоконверсии липидов с целью получения ценных продуктов, например сложных эфиров сахаров, предназначенных для применения в разных отраслях промышленности, включая пищевую промышленность и/или промышленность по производству кормов, косметическую и/или парфюмерную промышленность, олеохимическую промышленность и фармацевтическую промышленность.Lipases are widely used for lipid bioconversion to produce valuable products, such as sugar esters, for use in a variety of industries, including the food and / or feed industries, cosmetics and / or perfumes, oleochemicals, and pharmaceuticals.

Если процессы биоконверсии требуют гидролиза липидных субстратов, то можно использовать липолитические ферменты в средах с высоким содержанием воды. Однако когда процессы биоконверсии требуют выполнения реакций переэтерификации, таких как алкоголиз, применение липаз в средах с высоким содержанием воды может быть неприемлемым из-за нежелательных реакций гидролиза, вызывающих образование нежелательных биопродуктов и/или из-за более низкого выхода продукта биоконверсии.If bioconversion processes require hydrolysis of lipid substrates, then lipolytic enzymes can be used in environments with a high water content. However, when bioconversion processes require transesterification reactions, such as alcoholysis, the use of lipases in high-water environments may be unacceptable due to undesirable hydrolysis reactions causing undesirable biological products and / or due to a lower yield of the bioconversion product.

При выполнении процессов биоконверсии, требующих переэтерификации, обычно используют липазы в безводных средах, таких как масляные системы, и/или системы органических растворителей, таких как бутанол, метанол или гексан. Такие системы образуют среду, в которой по крайней мере частично могут быть солюбилизованы как полярная акцепторная молекула, так и донорная молекула липида и липаза обладает достаточной ферментативной активностью. Хотя для обеспечения любой ферментативной активности необходимо небольшое количество воды, ее количество строго контролируется на низком уровне во избежание гидролитической активности фермента.When performing bioconversion processes requiring transesterification, lipases are usually used in anhydrous environments such as oil systems and / or organic solvent systems such as butanol, methanol or hexane. Such systems form an environment in which at least partially a polar acceptor molecule can be solubilized, and the donor lipid and lipase molecule possesses sufficient enzymatic activity. Although a small amount of water is needed to ensure any enzymatic activity, its amount is strictly controlled at a low level to avoid hydrolytic activity of the enzyme.

Сложные эфиры сахаров, сложные эфиры белков или сложные эфиры гидроксикислот получают химическим синтезом с использованием неорганических катализаторов. При выполнении процессов биоконверсии, направленных на получение сложных эфиров сахаров или сложных эфиров гидроксикислот, используют липазы в органических растворителях или сверхкритических жидкостях, в которых присутствует лишь незначительное количество воды (если вообще присутствует).Sugar esters, protein esters or hydroxyacid esters are obtained by chemical synthesis using inorganic catalysts. When performing bioconversion processes aimed at producing sugar esters or hydroxyacid esters, lipases are used in organic solvents or supercritical fluids in which only a small amount of water is present (if at all).

В публикации Lecointe et al., Biotechnology Letters, Vol. 28, No. 8 (August), стр. 869-874, описано исследование ряда ферментов липазы и их активности в водных средах при получении сложного метилового эфира или сложного бутилового эфира соответственно из метанола и бутанола. В публикации Lecointe et al. указано, что липаза/ацилтрансфераза из Candida parapsilosis при увеличении концентраций метанола или бутанола демонстрирует пониженную гидролизную активность и повышенную способность фермента продуцировать сложный метиловый эфир и сложный бутиловый эфир. Использование липазы/ацилтрансферезы из C. parapsilosis при получении жирной гидроксамовой кислоты рассмотрено в публикации Vaysse et al., J. of Biotechnology 53 (1997) 41-46.In Lecointe et al., Biotechnology Letters, Vol. 28, No. 8 (August), pp. 869-874, describes the study of a number of lipase enzymes and their activity in aqueous media in the preparation of methyl ester or butyl ester from methanol and butanol, respectively. In a publication by Lecointe et al. it is indicated that lipase / acyltransferase from Candida parapsilosis with increasing concentrations of methanol or butanol shows a reduced hydrolysis activity and increased ability of the enzyme to produce methyl ester and butyl ester. The use of lipase / acyltransferase from C. parapsilosis in the preparation of fatty hydroxamic acid is discussed in Vaysse et al., J. of Biotechnology 53 (1997) 41-46.

На протяжении некоторого времени известна липаза:холестерол-ацилтрансфераза (см., например, публикацию Buckley, Biochemistry 1983, 22, 5490-5493). В частности, было обнаружено, что глицерофосфолипид: холестерол-ацилтрансферазы (часто именуемые GCAT), которые, как и лецитин:холестерол-ацилтрансферазы (LCAT) растений и/или млекопитающих, катализируют перенос жирных кислот между фосфатидилхолином и холестерином.Lipase has been known for some time: cholesterol acyltransferase (see, for example, Buckley, Biochemistry 1983, 22, 5490-5493). In particular, it was found that glycerophospholipid: cholesterol acyltransferase (often referred to as GCAT), which, like lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT) of plants and / or mammals, catalyze the transfer of fatty acids between phosphatidylcholine and cholesterol.

В публикациях Upron and Buckley (TIBS 20, May 1995 стр. 178-179) и Brumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996 стр. 2060-2064) описана липаза/ацилтрансфераза из Aeromonas hydrophila, которая способна осуществлять перенос ацильной группы в спиртовые акцепторы в водных средах.Upron and Buckley (TIBS 20, May 1995 p. 178-179) and Brumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996 p. 2060-2064) disclose a lipase / acyltransferase from Aeromonas hydrophila that is capable of transferring an acyl group to alcohol acceptors in aqueous media.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Первым объектом настоящего изобретения является способ получения одного или нескольких сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц или сложных эфиров гидроксикислот, который включает смешивание донора ацильной группы, акцептора ацильной группы и воды с образованием среды с высоким содержанием воды, содержащей 5-98% воды, при этом вышеуказанный донор ацильной группы является липидным субстратом, выбранным из одного или нескольких членов группы, включающей фосфолипид, лизофосфолипид, триацилглицерид, диглицерид, гликолипид или лизогликолипид, и вышеуказанный акцептор ацильной группы выбирают из одного или нескольких членов группы, включающей углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту; и контактирование указанной смеси с липидацилтрансферазой, осуществляемого таким образом, что липидацилтрансфераза катализирует одну или обе нижеследующие реакции: алкоголиз или переэтерификацию.The first object of the present invention is a method for producing one or more carbohydrate esters, protein esters, protein subunit esters or hydroxy acid esters, which comprises mixing an acyl donor, an acyl acceptor and water to form a high water medium containing 5- 98% of water, while the aforementioned acyl donor is a lipid substrate selected from one or more members of the group including phospholipid, lysophospholipid, triacylglyce id, a diglyceride, a glycolipid or a lyso-glycolipids, and said acyl acceptor is selected from one or more members of the group consisting of carbohydrate, protein, protein subunit or hydroxy; and contacting said mixture with a lipid acyltransferase, such that the lipid acyltransferase catalyzes one or both of the following reactions: alcoholysis or transesterification.

Другим объектом настоящего изобретения является применение липидацилтрансферазы для получения одного или нескольких сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц или сложных эфиров гидроксикислот путем катализа алкоголиза или переэтерификации либо обеих указанных реакций в смеси донора ацильной группы, акцептора ацильной группы и воды, содержащей 5-98% воды в смеси, при этом вышеуказанным донором ацильной группы является липидный субстрат, выбираемый из одного или нескольких членов группы, включающей фосфолипид, лизофосфолипид, триацилглицерид, диглицерид, гликолипид или лизогликолипид, и вышеуказанный акцептор ацильной группы выбирают из одного или нескольких членов группы, включающей углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту.Another object of the present invention is the use of lipid acyltransferase to produce one or more carbohydrate esters, protein esters, protein subunit esters or hydroxy acid esters by catalysis of alcoholysis or transesterification, or both of these reactions in a mixture of an acyl donor, an acyl acceptor and water containing 5-98% of water in the mixture, while the above-mentioned donor of the acyl group is a lipid substrate selected from one or more members of the group, including a phospholipid, lysophospholipid, triacylglyceride, diglyceride, glycolipid or lysoglycolipid, and the aforementioned acyl acceptor is selected from one or more members of the group comprising a carbohydrate, protein, protein subunit or hydroxy acid.

Другим объектом настоящего изобретения является сложный эфир углевода, сложный эфир белка, сложный эфир белковой субъединицы или сложный эфир гидроксикислоты, полученный способом по настоящему изобретению.Another object of the present invention is a carbohydrate ester, protein ester, protein subunit ester or hydroxy acid ester obtained by the method of the present invention.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются фармацевтический препарат, косметический препарат, пищевой продукт, кормовой продукт и краска, содержащие сложный эфир углевода, сложный эфир белка, сложный эфир белковой субъединицы или сложный эфир гидроксикислоты, полученный способом по настоящему изобретению.Another object of the present invention is a pharmaceutical preparation, cosmetic preparation, food product, feed product and paint containing carbohydrate ester, protein ester, protein subunit ester or hydroxy acid ester obtained by the method of the present invention.

Еще одним объектом настоящего изобретения является иммобилизованный фермент липидацилтрансфераза, описанный в данной заявке.Another object of the present invention is the immobilized enzyme lipid acyltransferase described in this application.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Термин “липидацилтрансфераза” в используемом здесь значении означает фермент, который кроме того, что обладает липазной активностью (обычно классифицируемой как Е.С. 3.1.1.х в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов (1992) Комитета по номенклатуре Международного союза по биохимии и молекулярной биологии), также обладает ацилтрансферазной активностью (обычно классифицируемой как Е.С. 2.3.1.х), благодаря чему фермент способен переносить ацильную группу из липида в один или несколько нижеследующих акцепторных субстратов: углевод, белок, белковая субъединица или гидроксикислота.The term “lipid acyltransferase” as used herein means an enzyme which, in addition to possessing lipase activity (usually classified as ES 3.1.1.x, in accordance with the recommendations on the nomenclature of enzymes (1992) of the Committee on the Nomenclature of the International Union for Biochemistry molecular biology) also has acyltransferase activity (usually classified as ES 2.3.1.x), due to which the enzyme is able to transfer the acyl group from lipid to one or more of the following acceptor substrates: carbohydrate d, protein, protein subunit or hydroxy acid.

“Акцептор ацильной группы” по настоящему изобретению предпочтительно не является водой.The “acyl group acceptor” of the present invention is preferably not water.

В соответствии с одним объектом изобретения фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу из липидного субстрата в углевод.In accordance with one aspect of the invention, the enzyme is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid substrate to a carbohydrate.

Углеводным акцетором ацильной группы может быть одно или несколько нижеследующих веществ: моносахарид, дисахарид, олигосахарид или полисахарид. Углеводом предпочтительно является одно или несколько нижеследующих веществ: глюкоза, фруктоза, ангидро-фруктоза, мальтоза, лактоза, сахароза, галактоза, ксилоза, ксилоолигосахариды, арабиноза, мальтоолигосахариды, тагатоза, микротецин, аскопирон Р, аскопирон Т или кортальцерон.One or more of the following substances can be a carbohydrate acyl accentor: monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide or polysaccharide. The carbohydrate is preferably one or more of the following substances: glucose, fructose, anhydro-fructose, maltose, lactose, sucrose, galactose, xylose, xylo-oligosaccharides, arabinose, maltooligosaccharides, tagatose, microthecin, ascopyron P, ascopyron T, or cortal.

Сложные эфиры углеводов могут быть ценными эмульгаторами, например, в пищевых продуктах. Carbohydrate esters can be valuable emulsifiers, for example, in foods.

В соответствии с одним объектом изобретения фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу из липидного субстрата в белок и/или белковую субъединицу.In accordance with one aspect of the invention, an enzyme is preferably capable of transferring an acyl group from a lipid substrate to a protein and / or protein subunit.

Белковой субъединицей предпочтительно является одно или несколько нижеследующих веществ: аминокислота, гидролизат белка, пептид, дипептид, олигопептид, полипептид.The protein subunit is preferably one or more of the following substances: amino acid, protein hydrolyzate, peptide, dipeptide, oligopeptide, polypeptide.

Приемлемые белки могут представлять собой одно или несколько нижеследующих веществ: белки, присутствующие в пищевых продуктах, например в молочных и/или мясных продуктах. В качестве примера можно привести белки, обнаруживаемые в свернувшемся молоке или сыворотке, такие как лактоглобулин. Другие приемлемые белки включают овальбумин (из яйца), глиадин, глютенин, пуроиндолин, пшеничный белок, липидпереносящие белки из зерна, миозин из мяса или нижеследующие молочные белки: казеины, лактоальбумины и лактоферрины.Suitable proteins may be one or more of the following: proteins present in foods, for example, dairy and / or meat products. As an example, proteins found in clotted milk or serum, such as lactoglobulin, can be cited. Other suitable proteins include ovalbumin (from an egg), gliadin, glutenin, puroindoline, wheat protein, lipid-transporting proteins from grain, meat myosin or the following milk proteins: caseins, lactoalbumins and lactoferrins.

Акцептором ацильной группы в белке или белковой субъединице может быть один или несколько нижеследующих компонентов белка или белковой субъединицы: серин, треонин, тирозин или циcтеин.The acceptor of the acyl group in a protein or protein subunit may be one or more of the following components of the protein or protein subunit: serine, threonine, tyrosine or cysteine.

Когда белковой субъединицей является аминокислота, то такой аминокислотой может быть любая аминокислота. Аминокислотой предпочтительно является, например, серин, треонин, тирозин или цистеин.When the protein subunit is an amino acid, then such an amino acid can be any amino acid. The amino acid is preferably, for example, serine, threonine, tyrosine or cysteine.

В соответствии с одним объектом изобретения фермент способен переносить ацильную группу из липидного субстрата в гидроксикислоту.In accordance with one aspect of the invention, an enzyme is capable of transferring an acyl group from a lipid substrate to a hydroxy acid.

Приемлемой гидроксикислотой может быть одна или несколько нижеследующих кислот: лимонная кислота, винная кислота, молочная кислота, аскорбиновая кислота, гликолевая кислота, яблочная кислота, альфа-гидроксиэтановая кислота, альфа-гидроксиоктановая кислота, альфа-гидроксикаприловая кислота, гидроксикаприловая кислота, глюконовая кислота, лактобионовая кислота или мальтобионовая кислота.A suitable hydroxy acid may be one or more of the following acids: citric acid, tartaric acid, lactic acid, ascorbic acid, glycolic acid, malic acid, alpha hydroxyethanoic acid, alpha hydroxyoctanoic acid, alpha hydroxycaprylic acid, hydroxycaprylic acid, gluconic acid, lactobionic acid acid or maltobionic acid.

Приемлемой гидроксикислотой может быть фруктовая кислота, например одна или несколько кислот, таких как яблочная кислота, молочная кислота, винная кислота, лимонная кислота или гликолевая кислота.A suitable hydroxy acid may be fruit acid, for example one or more acids such as malic acid, lactic acid, tartaric acid, citric acid or glycolic acid.

В одном варианте осуществления изобретения предпочтительной гидроксикислотой является одна или несколько нижеследующих кислот: лимонная кислота, молочная кислота, винная кислота или яблочная кислота.In one embodiment, a preferred hydroxy acid is one or more of the following acids: citric acid, lactic acid, tartaric acid, or malic acid.

Термин “оксикислота” в используемом здесь значении означает карбоновую кислоту, в которой один или несколько атомов водорода алкильной группы заменены гидроксильной группой.The term “hydroxy acid” as used herein means a carboxylic acid in which one or more hydrogen atoms of an alkyl group are replaced by a hydroxyl group.

В соответствии с одним объектом изобретения липидацилтрансфераза помимо способности переносить ацильную группу из липидного субстрата в один или неколько углеводов, белков, белковых субъединиц или гидроксикислот может также переносить ацильную группу из липида в одно или несколько нижеследующих веществ, представляющих собой стерол и/или станол, в частности фитостерол и/или фитостанол.According to one aspect of the invention, lipid acyltransferase, in addition to being able to transfer an acyl group from a lipid substrate to one or more carbohydrates, proteins, protein subunits or hydroxy acids, can also transfer an acyl group from a lipid to one or more of the following substances, which are sterol and / or stanol, in in particular phytosterol and / or phytostanol.

Когда липидным субстратом является фосфолипид, он может быть лецитином, например фосфатидилхолином. Термин “лецитин” в используемом здесь значении означает фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин.When the phospholipid is the lipid substrate, it may be lecithin, for example phosphatidylcholine. The term “lecithin” as used herein means phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine and phosphatidylglycerol.

Когда липидным субстратом является лизофосфолипид, он может быть лизолецитином, например лизофосфатидилхолином. Термин “лизофосфатидилхолин” в ипользуемом здесь значении синонимичен термину “лизолецитин”, поэтому указанные термины можно использовать взаимозаменяемо.When the lipid substrate is a lysophospholipid, it may be a lysolecithin, for example a lysophosphatidylcholine. The term “lysophosphatidylcholine” as used here is synonymous with the term “lysolecithin”, therefore, these terms can be used interchangeably.

Когда липидным субстратом является гликолипид, он может быть, например, дигалактозилдиглицеридом (DGDG).When the lipid substrate is glycolipid, it can be, for example, digalactosyl diglyceride (DGDG).

Липидный субстрат может именоваться в данном описании изобретения как “липидный донор ацильной группы” или “донор ацильной группы”. Указанные термины использованы взаимозаменяемо в данной заявке.A lipid substrate may be referred to herein as a “lipid acyl donor” or “acyl donor”. These terms are used interchangeably in this application.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидным субстратом, в котором действует липидацилтрансфераза, предпочтительно является фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин.In accordance with some aspects of the invention, the lipid substrate in which the lipid acyltransferase acts is preferably a phospholipid, such as lecithin, for example phosphatidylcholine.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидным субстратом предпочтительно является гликолипид, такой как, например, DGDG.In accordance with some aspects of the invention, the lipid substrate is preferably a glycolipid, such as, for example, DGDG.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидным субстратом может быть пищевой липид, то есть липидный компонент пищевого продукта.In accordance with some aspects of the invention, the lipid substrate may be a food lipid, that is, a lipid component of a food product.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может быть неспособна или по существу неспособна воздействовать на триглицерид, 1-моноглицерид и/или 2-моноглицерид.In accordance with some aspects of the invention, the lipid acyltransferase of the present invention may be unable or substantially unable to act on triglyceride, 1-monoglyceride and / or 2-monoglyceride.

Липидный субстрат или липидный донор ацильной группы может представлять собой один или несколько липидов, присутствующих в одном или нескольких нижеследующих субстратах, таких как жиры, включая лярд, сало и молочный жир; масла, включая масла, экстрагированные или выделенные из пальмового масла, подсолнечного масла, соевого масла, сафлорового масла, хлопкового масла, арахисового масла, кукурузного масла, оливкового масла, кокосового масла и рапсового масла. Лецитин из сои, рапсовых семян или яичного желтка также является приемлемым липидным субстратом. Липидный субстрат может быть липидом овса или другого растения, содержащего галактолипиды.The lipid substrate or the lipid donor of the acyl group may be one or more lipids present in one or more of the following substrates, such as fats, including lard, lard and milk fat; oils, including oils extracted or extracted from palm oil, sunflower oil, soybean oil, safflower oil, cottonseed oil, peanut oil, corn oil, olive oil, coconut oil and rapeseed oil. Lecithin from soy, rapeseed or egg yolk is also an acceptable lipid substrate. The lipid substrate may be a lipid of oats or another plant containing galactolipids.

В соответствии с некоторыми объектами настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, имеющих цепь жирных кислот длиной от 8 до 22 атомов углерода.In accordance with some objects of the present invention, the lipid can be selected from lipids having a chain of fatty acids with a length of from 8 to 22 carbon atoms.

В соответствии с некоторыми объектами нестоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, имеющих цепь жирных кислот длиной от 16 до 22 атомов углерода, более предпочтительно от 16 до 20 атомов углерода.In accordance with some objects of the present invention, the lipid may be selected from lipids having a chain of fatty acids with a length of from 16 to 22 carbon atoms, more preferably from 16 to 20 carbon atoms.

В соответствии с некоторыми объектами настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, имеющих цепь жирных кислот длиной не более 14 атомов углерода, в частности из липидов, имеющих цепь жирных кислот длиной от 4 до 14 атомов углерода, в частности от 4 до 10 атомов углерода, в частности от 4 до 8 атомов углерода.In accordance with some objects of the present invention, the lipid can be selected from lipids having a chain of fatty acids with a length of not more than 14 carbon atoms, in particular from lipids having a chain of fatty acids with a length of 4 to 14 carbon atoms, in particular from 4 to 10 carbon atoms , in particular from 4 to 8 carbon atoms.

Донор ацильной группы предпочтительно не является свободной жирной кислотой.The acyl donor is preferably not a free fatty acid.

Донор ацильной группы предпочтительно не является сложным эфиром углевода (сахара).The acyl donor is preferably not a carbohydrate (sugar) ester.

Липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может обладать одной или несколькими нижеследующими липазными активностями: активностью гликолипазы (Е.С. 3.1.1.26), триацилглицерол-липазы (Е.С. 3.1.1.3), фосфолипазы А2 (Е.С. 3.1.1.4) или фосфолипазы А1 (Е.С. 3.1.1.32). Термин “активность гликолипазы” в используемом здесь значении означает также “активность галактолипазы”.The lipid acyltransferase of the present invention may have one or more of the following lipase activities: glycolipase activity (E.C. 3.1.1.26), triacylglycerol lipase (E.C. 3.1.1.3), phospholipase A2 (E.C. 3.1.1.4) or phospholipase A1 (E.C. 3.1.1.32). The term “glycolipase activity” as used herein also means “galactolipase activity”.

Липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может обладать по крайней мере одной или несколькими нижеследующими активностями: активностью гликолипазы (Е.С. 3.1.1.26), и/или фосфолипазы А1 (Е.С. 3.1.1.32), и/или фосфолипазы А2 (Е.С. 3.1.1.4).The lipid acyltransferase of the present invention may have at least one or more of the following activities: glycolipase activity (E.C. 3.1.1.26) and / or phospholipase A1 (E.C. 3.1.1.32) and / or phospholipase A2 (E. S. 3.1.1.4).

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может обладать по крайней мере активностью гликолипазы (Е.С. 3.1.1.26).In accordance with certain aspects of the invention, the lipid acyltransferase of the present invention may have at least glycolipase activity (EC 3.1.1.26).

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может быть способна переносить ацильную группу из гликолипида и/или фосфолипида в один или несколько нижеследующих акцепторных субстратов: углевод, белок, белковую субъединицу, гидроксикислоту.In accordance with certain aspects of the invention, the lipid acyltransferase of the present invention may be capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to one or more of the following acceptor substrates: carbohydrate, protein, protein subunit, hydroxy acid.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению предпочтительно способна переносить ацильную группу из гликолипида и/или фосфолипида в углевод с образованием по крайней мере сложного эфира углевода.In accordance with some aspects of the invention, the lipid acyltransferase of the present invention is preferably capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to a carbohydrate to form at least a carbohydrate ester.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению предпочтительно способна переносить ацильную группу из гликолипида и/или фосфолипида в белок или белковую субъединицу с образованием по крайней мере сложного эфира белка (или конденсата жирной кислоты белка) или сложного эфира белковой субъединицы.In accordance with some aspects of the invention, the lipid acyltransferase of the present invention is preferably capable of transferring an acyl group from a glycolipid and / or phospholipid to a protein or protein subunit to form at least a protein ester (or protein fatty acid condensate) or protein subunit ester.

Термин “сложный эфир белковой субъединицы” в используемом здесь значении означает сложный эфир, образованный из любой белковой субъединицы, такой как, например, сложный эфир дипептида, сложный эфир олигопептида, сложный эфир полипептида или сложный эфир гидролизата белка.The term “protein subunit ester” as used herein means an ester formed from any protein subunit, such as, for example, dipeptide ester, oligopeptide ester, polypeptide ester or protein hydrolyzate ester.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению предпочтительно не обладает активностью триацилглицерол-липазы (Е.С. 3.1.1.3).In accordance with certain aspects of the invention, the lipid acyltransferase of the present invention preferably does not have triacyl glycerol lipase activity (EC 3.1.1.3).

Фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению предпочтительно можно охарактеризовать на основании нижеследующих критериев:The lipid acyltransferase enzyme of the present invention can preferably be characterized based on the following criteria:

(i) данный фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которую можно определить как активность переноса сложного эфира, в результате которого ацильная часть исходной сложноэфирной связи липидного донора ацильной группы переносится в один или несколько акцепторов ацильной группы, представляющих собой углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту, с образованием нового сложного эфира, то есть сложного эфира углевода, сложного эфира белка, сложного эфира белковой субъединицы и/или сложного эфира гидроксикислоты; и(i) this enzyme has acyltransferase activity, which can be defined as the activity of ester transfer, as a result of which the acyl part of the initial ester linkage of the lipid donor of the acyl group is transferred to one or more acceptors of the acyl group, which are a carbohydrate, protein, protein subunit or hydroxy acid, to form a new ester, i.e. a carbohydrate ester, protein ester, protein subunit ester and / or hydroxy acid ester; and

(ii) данный фермент содержит фрагмент GDSX в аминокислотной последовательности, где Х означает один или несколько нижеследующих аминокислотных остатков: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, М или S.(ii) the enzyme contains a GDSX fragment in the amino acid sequence, where X is one or more of the following amino acid residues: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M, or S.

Х в фрагменте GDSX означает L. Таким образом, фермент по настоящему изобретению предпочтительно содержит фрагмент GSDL в аминокислотной последовательности.X in the GDSX fragment is L. Thus, the enzyme of the present invention preferably contains a GSDL fragment in the amino acid sequence.

Фрагмент GDSX состоит из четырех консервативных аминокислот. Серин в данном фрагменте предпочтительно является каталитическим серином фермента липидацилтрансферазы. Серин фрагмента GDSX может находиться в положении, соответствующем положению Ser-16 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, как указано в публикации Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vоl. 178, No. 7, стр. 2060-2064).The GDSX fragment consists of four conserved amino acids. The serine in this fragment is preferably a catalytic serine of the lipid acyltransferase enzyme. The serine of the GDSX fragment may be in the position corresponding to the position of Ser-16 in the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme, as described in Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, pp. 2060-2064).

Чтобы определить наличие в белке фрагмента GDSX по настоящему изобретению, последовательность предпочтительно сравнивают со скрытыми профилями модели Маркова (профили НММ) в базе данных Рfam.To determine the presence of a GDSX fragment of the present invention in a protein, the sequence is preferably compared with hidden Markov model profiles (HMM profiles) in the Pfam database.

Pfam является базой данных семейства доменов белка. База данных Рfam содержит несколько выверенных последовательностей для каждого семейства, а также модели скрытых профилей Маркова (профили НММ) для идентификации указанных доменов в новых последовательностях. С базой данных Рfam можно ознакомиться в публикации Bateman A. et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280. Модели скрытых профилей Маркова использованы в ряде баз данных, предназначенных для классификации белков, и с ними можно ознакомиться в публикации Bateman A. and Haft D.H. (2002) Brief Bioinform 3; 236-245.Pfam is a protein domain family database. The Pfam database contains several verified sequences for each family, as well as models of hidden Markov profiles (HMM profiles) to identify these domains in new sequences. The Pfam database can be found in Bateman A. et al., (2002) Nucleic Acids Res. thirty; 276-280. Markov's hidden profile models have been used in a number of databases for protein classification, and can be found in the publication by Bateman A. and Haft D.H. (2002) Brief Bioinform 3; 236-245.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&listhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list _{__} uids=12230032&dopt=Abstractuids = 12230032 & dopt = Abstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&listhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list _{__} uids=11752314&dopt=Abstractuids = 11752314 & dopt = Abstract

Для детального ознакомления с моделями скрытых профилей Маркова и с их использованием в базе данных Pfam следует обратиться к публикации Durbin R., Eddy S., and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. Пакет программ Хаммера можно приобрести в Вашингтонском университете, Сент-Луис, США.For a detailed review of Markov's hidden profile models and their use in the Pfam database, see Durbin R., Eddy S., and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. Hammer's software package is available at the University of Washington, St. Louis, USA.

Альтернативно фрагмент GDSX можно идентифицировать при помощи пакета программ Хаммера, инструкции по использованию которых приведены в публикации Durbin R., Eddy S., and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4, ссылках, приведенных в указанной публикации, и в профиле HMMER2, рассмотренном в данном описании изобретения.Alternatively, the GDSX fragment can be identified using the Hammer software package, instructions for use of which are given in Durbin R., Eddy S., and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4, the references cited in the publication, and in the HMMER2 profile discussed in this specification.

Доступ к базе данных PFAM можно получить, например, через несколько серверов, которые в настоящее время расположены на следующих Web-сайтах.Access to the PFAM database can be obtained, for example, through several servers, which are currently located on the following websites.

http://www.sanger.ac.uc/Software/Pfam/index.shtmlhttp: //www.sanger.ac.uc/Software/Pfam/index.shtml

http://pfam.wustl.edu/http://pfam.wustl.edu/

http://pfam.jouy.inra.fr/http://pfam.jouy.inra.fr/

http://pfam.cgb.ki.se/http://pfam.cgb.ki.se/

Данная база данных предоставляет возможность поиска с получением доступа к белковой последовательности. Используя параметры по умолчанию базы данных, можно произвести анализ белковой последовательности на наличие доменов Pfam. Домен GDSX является устойчивым доменом, поэтому его присутствие будет обнаружено в любой запрашиваемой последовательности. Указанная база данных производит сравнение согласованной последовательности Pfam00657 с запрашиваемой последовательностью.This database provides the ability to search with access to the protein sequence. Using the default settings of the database, it is possible to analyze the protein sequence for the presence of Pfam domains. The GDSX domain is a stable domain, so its presence will be detected in any requested sequence. The specified database compares the agreed sequence Pfam00657 with the requested sequence.

Сравнительный анализ нескольких последовательностей, включая Aeromonas salmonicida или Aeromonas hydrophila, можно выполнить:A comparative analysis of several sequences, including Aeromonas salmonicida or Aeromonas hydrophila , can be performed:

а) вручнуюa) manually

для чего необходимо произвести сравнение представляющего интерес белка с согласованной последовательностью Pfam00657 и сравнение Р10480 с согласованной последовательностью Pfam00657 вышеописанным способом;why it is necessary to compare the protein of interest with the coordinated sequence of Pfam00657 and compare P10480 with the coordinated sequence of Pfam00657 as described above;

илиor

b) при помощи базы данныхb) using the database

после идентификации согласованной последовательности Pfam00657 база данных предлагает вариант сравнения запрашиваемой последовательности с отобранной согласованной последовательностью Pfam00657. Р10480 является частью сравнения отобранных последовательностей и имеет имя GCAT_AERHY. Запрашиваемая последовательность и Р10480 будут отображены в одном окне.after identifying the matched sequence Pfam00657, the database offers an option to compare the requested sequence with the selected matched sequence Pfam00657. P10480 is part of the comparison of selected sequences and is named GCAT_AERHY. The requested sequence and P10480 will be displayed in one window.

Эталонная последовательность Aeromonas hydrophila: Aeromonas hydrophila reference sequence:

остатки липазы GDSX Aeromonas hydrophila пронумерованы в файле Р10480 NCBI, и номера в описании изобретения относятся к номерам, указанным в данном файле, который в настоящем изобретении использован для определения конкретных аминокислотных остатков, присутствующих в предпочтительном варианте осуществления изобретения в ферментах липидацилтрансферазы по данному изобретению.the GDSX Aeromonas hydrophila lipase residues are numbered in the P10480 NCBI file, and the numbers in the description of the invention refer to the numbers indicated in this file, which in the present invention was used to determine the specific amino acid residues present in the preferred embodiment of the invention in the lipid acyltransferase enzymes of this invention.

Сравнение последовательностей было выполнено с использованием базы данных Pfam (фигуры 33 и 34).Comparison of sequences was performed using the Pfam database (figures 33 and 34).

Распознаны нижеследующие консервативные остатки, которые могут присутствовать в ферментах, предназначенных для использования в композициях и способах по данному изобретению в соответствии с предпочтительным вариантом его осуществления.The following conserved residues that may be present in enzymes intended for use in the compositions and methods of this invention in accordance with a preferred embodiment are recognized.

где “hid” означает гидрофобный остаток, выбираемый из Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.where “hid" means a hydrophobic residue selected from Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.

Сравнение фермента липидацилтрансферазы, предназначенного для использования в композициях и способах по данному изобретению, предпочтительно можно произвести с помощью согласованной последовательности Pfam00657.Comparison of the lipid acyltransferase enzyme for use in the compositions and methods of this invention can preferably be done using the consistent sequence Pfam00657.

Положительное соответствие скрытому профилю модели Маркова (профиль НММ) семейства доменов pfam00657 предпочтительно указывает на присутствие домена GDSL или GDSX по настоящему изобретению.A positive match for the hidden Markov model profile (HMM profile) of the pfam00657 domain family preferably indicates the presence of the GDSL or GDSX domain of the present invention.

При соответствии согласованной последовательности Pfam00657 липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в композициях и способах по данному изобретению, предпочтительно содержит по крайней мере один, предпочтительно более одного, предпочтительно более двух нижеследующих блоков: блок GDSX, блок GANDY, блок НРТ. Липидтрансфераза соответственно может содержать блок GDSX и блок GANDY. Альтернативно фермент может содержать блок GDSX и блок НРТ. Фермент предпочтительно содержит по крайней мере блок GDSX.In accordance with the agreed sequence Pfam00657, a lipid acyltransferase for use in the compositions and methods of this invention preferably contains at least one, preferably more than one, preferably more than the following two blocks: GDSX block, GANDY block, HPT block. Lipid transferase may accordingly comprise a GDSX block and a GANDY block. Alternatively, the enzyme may comprise a GDSX block and an HPT block. The enzyme preferably contains at least a GDSX block.

При соответствии согласованной последовательности Pfam00657 фермент, предназначенный для использования в композициях и способах по данному изобретению, предпочтительно содержит по крайней мере один, предпочтительно более одного, предпочтительно более двух, предпочтительно более трех, предпочтительно более четырех, предпочтительно более пяти, предпочтительно более шести, предпочтительно более семи, предпочтительно более восьми, предпочтительно более девяти, предпочтительно более десяти, предпочтительно более одиннадцати, предпочтительно более двенадцати, предпочтительно более тринадцати, предпочтительно более четырнадцати нижеследующих аминокислотных остатков при сравнении с эталонной полипептидной последовательностью A. hydrophilia, в частности SEQ ID NO:32: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.In accordance with the agreed sequence Pfam00657, the enzyme for use in the compositions and methods of this invention preferably contains at least one, preferably more than one, preferably more than two, preferably more than three, preferably more than four, preferably more than five, preferably more than six, preferably more than seven, preferably more than eight, preferably more than nine, preferably more than ten, preferably more than eleven, preferred but more than twelve, preferably more than thirteen, preferably more than fourteen of the following amino acid residues when compared with the reference polypeptide sequence of A. hydrophilia , in particular SEQ ID NO: 32: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131 Gly, 132hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.

Домен GDSX pfam00657 является уникальным идентификатором, позволяющим отличить белки, содержащие указанный домен, от других ферментов.The GDSX domain pfam00657 is a unique identifier that distinguishes proteins containing the specified domain from other enzymes.

Согласованная последовательность pfam00657 представлена на фигуре 1 как SEQ ID NO:1. Указанная последовательность получена в результате идентификации семейства pfam 00657, база данных, версия 6, которая может быть также определена в данном описании изобретения как pfam00657.6.The agreed sequence pfam00657 is shown in FIG. 1 as SEQ ID NO: 1. This sequence was obtained by identifying the family pfam 00657, database version 6, which can also be defined in this description of the invention as pfam00657.6.

Согласованная последовательность может быть обновлена в последующих выпусках базы данных pfam.The consistent sequence may be updated in subsequent releases of the pfam database.

Например, на фигурах 33 и 34 показано сравнение последовательности pfam семейства 00657 из базы данных, версия 11, которая может быть также определена в данном описании изобретения как pfam00657.11.For example, Figures 33 and 34 show a comparison of the pfam sequence of the 00657 family from the database, version 11, which can also be defined in this description of the invention as pfam00657.11.

Блоки GDSX, GANDY и НРТ обнаружены в семействе pfam 00657 в обеих выпусках базы данных. Для идентификации семейства pfam 00657 могут быть использованы последующие выпуски базы данных pfam.The GDSX, GANDY, and HPT blocks were found in the pfam 00657 family in both database releases. Subsequent releases of the pfam database can be used to identify the pfam 00657 family.

Фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению можно охарактеризовать на основании нижеследующих критериев:The lipid acyltransferase enzyme of the present invention can be characterized based on the following criteria:

(i) данный фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса сложного эфира, в результате которого ацильная часть исходной сложноэфирной связи липидного донора ацильной группы переносится в один или несколько акцепторов ацильной группы, представляющих собой углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту, с образованием нового сложного эфира, то есть сложного эфира углевода и/или сложного эфира белка и/или сложного эфира белковой субъединицы и/или сложного эфира гидроксикислоты;(i) this enzyme has an acyltransferase activity, which can be defined as the activity of ester transfer, as a result of which the acyl part of the initial ester linkage of the lipid donor of the acyl group is transferred to one or more acceptors of the acyl group, which are a carbohydrate, protein, protein subunit or hydroxy acid to form a new ester, i.e. a carbohydrate ester and / or protein ester and / or protein subunit ester and / or hydroxycis ester lots;

(ii) данный фермент содержит фрагмент GDSX аминокислотной последовательности, в котором Х означает один или несколько нижеследующих аминокислотных остатков L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S;(ii) the enzyme contains a GDSX fragment of an amino acid sequence in which X is one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M, or S;

(iii) данный фермент содержит His-309 или остаток гистидина в положении, соответствующем положению His-309 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, показанном на фигуре 2 (SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32).(iii) the enzyme contains His-309 or a histidine residue at a position corresponding to His-309 in the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32).

Предпочтительным аминокислотным остатком фрагмента GDSX является L.A preferred amino acid residue of the GDSX fragment is L.

В SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32 первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность. His-309 непроцессированной последовательности, то есть белка, содержащего сигнальную последовательность, соответствует His-291 зрелой части белка, то есть последовательности без сигнальной последовательности.In SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32, the first 18 amino acid residues form a signal sequence. His-309 unprocessed sequence, that is, a protein containing the signal sequence, corresponds to the His-291 mature portion of the protein, that is, a sequence without a signal sequence.

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению предпочтительно содержит нижеследующую каталитическую триаду: Ser-34, Asp-134 и His-309 или соответственно остаток серина, остаток аспарагиновой кислоты и остаток гистидина в положениях, соответствующих Ser-34, Asp-134 и His-309 в липолитическом фрагменте Aeromonas hydrophila, показанном на фигуре 2 (SEQ ID NO:2) или фигуре 28 (SEQ ID NO:32). Как было указано выше, в последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32, первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность. Ser-34, Asp-134 и His-309 непроцессированной последовательности, то есть белка, содержащего сигнальную последовательность, соответствуют Ser-16, Asp-116 и His-291 зрелой части белка, то есть последовательности без сигнальной последовательности. В согласованной последовательности pfam00657, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NO:1), остатки активного сайта соответствуют Ser-7, Asp-157 и His-348.The lipid acyltransferase enzyme of the present invention preferably contains the following catalytic triad: Ser-34, Asp-134 and His-309 or a serine residue, aspartic acid residue and histidine residue at the positions corresponding to Ser-34, Asp-134 and His-309 in the lipolytic a fragment of Aeromonas hydrophila shown in figure 2 (SEQ ID NO: 2) or figure 28 (SEQ ID NO: 32). As indicated above, in the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32, the first 18 amino acid residues form a signal sequence. Ser-34, Asp-134 and His-309 of the unprocessed sequence, i.e., a protein containing the signal sequence, correspond to the Ser-16, Asp-116 and His-291 of the mature portion of the protein, i.e., a sequence without a signal sequence. In the consistent sequence pfam00657 shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), the remains of the active site correspond to Ser-7, Asp-157 and His-348.

(i) данный фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса сложного эфира, в результате которого ацильная часть исходной сложноэфирной связи первого липидного донора ацильной группы переносится в один или несколько акцепторов ацильной группы, представляющих собой углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту, с образованием нового сложного эфира, то есть сложного эфира углевода, сложного эфира белка, сложного эфира белковой субъединицы и/или сложного эфира гидроксикислоты; и(i) this enzyme has acyltransferase activity, which can be defined as the activity of ester transfer, as a result of which the acyl part of the initial ester bond of the first lipid donor of the acyl group is transferred to one or more acceptors of the acyl group, which are a carbohydrate, protein, protein subunit, or hydroxy acid, to form a new ester, i.e. a carbohydrate ester, protein ester, protein subunit ester and / or hydroxy acid ester you; and

(ii) данный фермент содержит по крайней мере Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 и His-309 или остатки глицина, аспарагиновой кислоты, серина, аспарагиновой кислоты и гистидина в положениях, соответствующих Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 и Gis-309 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, показанном на фигуре 2 (SEQ ID NO:2) или фигуре 28 (SEQ ID NO:32).(ii) this enzyme contains at least Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 and His-309 or the remains of glycine, aspartic acid, serine, aspartic acid and histidine at positions corresponding to Gly-32, Asp -33, Ser-34, Asp-134, and Gis-309 in the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme shown in Figure 2 (SEQ ID NO: 2) or Figure 28 (SEQ ID NO: 32).

Фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению можно получить из организмов, относящихся к одному или нескольким нижеследующим родам: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas и Candida.The lipid acyltransferase enzyme of the present invention can be obtained from organisms belonging to one or more of the following genera: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactocococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Xulfylobacterium, Vacylobusfer, Schulphibella, Bacillus, Campylorus biblaebergibolum, Campylobusfer, Scholomida bibillus, Campylobacterium, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas and Candida .

Фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению можно получить из одного или нескольких нижеследующих организмов: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Мycobacterium, Streprococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp., Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstoniа solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis и Candida parapsilosis.Lipid acyltransferase enzyme according to the present invention can be prepared from one or more of the following organisms: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streprococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp,. Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenesomissonomesomorida meoridaeomorida meorida meloha

В соответствии с одним объектом изобретения фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению предпочтительно получают из одного или нескольких организмов Aeromonas hydrophila или Aeromonas salmonicida.According to one aspect of the invention, the lipid acyltransferase enzyme of the present invention is preferably obtained from one or more Aeromonas hydrophila or Aeromonas salmonicida organisms.

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит одну или несколько нижеследующих аминокислотных последовательностей:The lipid acyltransferase enzyme of the present invention contains one or more of the following amino acid sequences:

(i) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:2 (см. фигуру 2);(i) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (see figure 2);

(ii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:3 (см. фигуру 3);(ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (see figure 3);

(iii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:4 (см. фигуру 4);(iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (see figure 4);

(iv) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:5 (см. фигуру 5);(iv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (see figure 5);

(v) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:6 (см. фигуру 6);(v) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (see figure 6);

(vi) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:12 (см. фигуру 14);(vi) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (see figure 14);

(vii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:20 (см. фигуру 16);(vii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 (see figure 16);

(viii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:22 (см. фигуру 18);(viii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 (see figure 18);

(ix) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:24 (см. фигуру 20);(ix) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 (see figure 20);

(x) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:26 (см. фигуру 22);(x) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 (see figure 22);

(xi) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:28 (см. фигуру 24);(xi) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 (see figure 24);

(xii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:30 (см. фигуру 26);(xii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 (see figure 26);

(xiii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:32 (см. фигуру 28);(xiii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 (see figure 28);

(xiv) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:34 (см. фигуру 30) или(xiv) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 (see figure 30) or

аминокислотная последовательность, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей, представленных SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34.an amino acid sequence that is 75% or more identical to one of the sequences represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12 , SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 34.

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34, либо аминокислотную последовательность, которая на 75% или более, предпочтительно на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, предпочтительно на 95% или более идентична аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:2, аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:3, аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:32, или аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:34.The lipid acyltransferase enzyme of the present invention contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence that is 75% or more, preferably 80% or more, preferably 85% or more, preferably 90% or more, preferably 95% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO : 32, or aminoki the slot sequence represented by SEQ ID NO: 34.

В соответствии с целями настоящего изобретения степень идентичности основана на количестве одинаковых элементов последовательности. Степень идентичности по настоящему изобретению можно определить при помощи компьютерных программ, известных в данной области, таких как GAP, входящая в пакет программ GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45), используя нижеследующие установки для сравнения полипептидных последовательностей: штрафные очки за создание пробела равны 3.0 и штрафные очки за удлинение пробела равны 0,1.In accordance with the objectives of the present invention, the degree of identity is based on the number of identical elements of the sequence. The degree of identity of the present invention can be determined using computer programs known in the art, such as the GAP included in the GCG software package (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45) using the following settings for comparing polypeptide sequences: penalty points for creating a gap are 3.0 and penalty points for lengthening a gap are 0.1.

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще предпочтительнее на 95% или более идентична одной из последовательностей, представленных SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34.The lipid acyltransferase enzyme of the present invention contains an amino acid sequence that is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more identical to one of the sequences represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 34.

(а) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 1-100 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;(a) the amino acid sequence represented by amino acid residues 1-100 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32;

(b) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 101-200 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;(b) the amino acid sequence represented by amino acid residues 101-200 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32;

(с) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 201-300 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;(c) the amino acid sequence represented by amino acid residues 201-300 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32;

(d) аминокислотная последовательность, которая на 75% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще предпочтительнее на 95% или более идентична одной из аминокислотных последовательностей, приведенных выше в пунктах (а)-(с).(d) an amino acid sequence that is 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more identical to one of the amino acid sequences set forth in paragraphs (a) to ( from).

(а) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 28-39 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;(a) the amino acid sequence represented by amino acid residues 28-39 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32;

(b) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 77-88 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;(b) the amino acid sequence represented by amino acid residues 77-88 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32;

(с) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 126-136 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;(c) the amino acid sequence represented by amino acid residues 126-136 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32;

(d) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 163-175 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;(d) the amino acid sequence represented by amino acid residues 163-175 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32;

(е) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 304-311 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;(e) the amino acid sequence represented by amino acid residues 304-311 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32;

(f) аминокислотная последовательность, которая на 75% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще предпочтительнее на 95% или более идентична одной из аминокислотных последовательностей, приведенных выше в пунктах (а)-(е).(f) an amino acid sequence that is 75% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, is identical to one of the amino acid sequences set forth in paragraphs (a) to ( e).

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, полученную путем экспрессии одной или нескольких нижеследующих нуклеотидных последовательностей:The lipid acyltransferase enzyme of the present invention may contain an amino acid sequence obtained by expression of one or more of the following nucleotide sequences:

(а) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:7 (см. фигуру 9);(a) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 (see figure 9);

(b) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:8 (см. фигуру 10);(b) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 (see figure 10);

(с) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:9 (см. фигуру 11);(c) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 (see figure 11);

(d) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:10 (см. фигуру 12);(d) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 (see figure 12);

(е) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:11 (см. фигуру 13);(e) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 (see figure 13);

(f) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:13 (см. фигуру 15);(f) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 (see figure 15);

(g) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:21 (см. фигуру 17);(g) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 (see figure 17);

(h) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:23 (см. фигуру 19);(h) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 (see figure 19);

(i) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:25 (см. фигуру 21);(i) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25 (see figure 21);

(j) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:27 (см. фигуру 23);(j) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 (see figure 23);

(k) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:29 (см. фигуру 25);(k) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 (see figure 25);

(l) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:31 (см. фигуру 27);(l) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31 (see figure 27);

(m) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:33 (см. фигуру 29);(m) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 33 (see figure 29);

(n) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:35 (см. фигуру 31);(n) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35 (see figure 31);

(o) или нуклеотидная последовательность, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей, представленных SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:35.(o) or a nucleotide sequence that is 75% or more identical to one of the sequences represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO : 35.

Нуклеотидная последовательность может быть на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, предпочтительнее на 90% или более и еще предпочтительнее на 95% или более идентична одной из последовательностей, представленных SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:35.The nucleotide sequence may be 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more identical to one of the sequences represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 35.

В соответствии с одним объектом изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может представлять собой лецитин:холестерол-ацилтрансферазы (LCAT) или их варианты (например, вариант, полученный в результате молекулярной эволюции).In accordance with one aspect of the invention, the lipid acyltransferase of the present invention may be lecithin: cholesterol acyltransferases (LCAT) or variants thereof (for example, a variant resulting from molecular evolution).

Приемлемые LCAT известны в данной области и могут быть получены из одного или нескольких нижеследующих организмов, таких как млекопитающие, крысы, мыши, цыплята, Drosophila melanogaster, растения, включающие Arabidopsis и Oryza sativa, нематоды, грибы и дрожжи.Suitable LCATs are known in the art and can be obtained from one or more of the following organisms, such as mammals, rats, mice, chickens, Drosophila melanogaster , plants including Arabidopsis and Oryza sativa , nematodes, fungi and yeast.

В одном варианте осуществления изобретения фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может представлять собой липидацилтрансферазу, полученную из штаммов TOP 10 E. coli, включающих pPet12aAhydro и pPet12aASalmo, которые были депонированы компанией Даниско A/S, Лангеброгаде 1, DK-1001, Копенгаген К, Дания, согласно Будапештскому соглашению о международном признании депонирования микроорганизмов в соответствии с процедурой выдачи патентов в Национальную коллекцию промышленных, морских и пищевых бактерий (NCIMB) по адресу: 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB, 22 декабря 2003 г. соответственно под номерами доступа NICMB 41204 и NCIMB 41205.In one embodiment, the lipid acyltransferase enzyme of the present invention may be a lipid acyltransferase derived from E. coli TOP 10 strains including pPet12aAhydro and pPet12aASalmo that were deposited by Danisko A / S, Langebrogade 1, DK-1001, Copenhagen K, Denmark according to the Budapest agreement on the international recognition of the deposit of microorganisms in accordance with the procedure for granting patents to the National collection of industrial, marine and food bacteria (NCIMB) at 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB, December 22, 2003, respectively, with access numbers NICMB 41204 and NCIMB 41205.

Термин “трансфераза” в используемом здесь значении является взаимозаменяемым с термином “липидацилтрансфераза”.The term “transferase” as used herein is used interchangeably with the term “lipid acyltransferase”.

Липидацилтранcфераза, представленная в данном описании изобретения, катилизирует одну или обе нижеследующие реакции: переэтерификацию и алкоголиз.The lipid acyltransferase described herein catalyzes one or both of the following reactions: transesterification and alcoholysis.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением может быть достигнуто одно или несколько нижеследующих преимуществ: биоконверсия липидов с образованием одного или нескольких сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц или сложных эфиров гидроксикислот может происходить в среде с высоким содержанием воды, которая не содержит органического растворителя или содержит меньшее количество органического растворителя по сравнению с известными процессами биоконверсии.Thus, in accordance with the present invention, one or more of the following advantages can be achieved: lipid bioconversion with the formation of one or more carbohydrate esters, protein esters, protein subunit esters or hydroxy acid esters can occur in a high water medium that does not contain an organic solvent or contains a smaller amount of an organic solvent compared to known bioconversion processes.

Термин “биоконверсия” в используемом здесь значении означает модификацию одного органического соединения с образованием другого органического соединения и/или синтез органических соединений из других органических соединений путем ферментативного катализа.The term “bioconversion” as used herein means the modification of one organic compound to form another organic compound and / or synthesis of organic compounds from other organic compounds by enzymatic catalysis.

Термин “переэтерификация” в используемом здесь значении означает катализируемый ферментом перенос ацильной группы из липидного донора (не являющегося свободной жирной кислотой) в акцептор ацильной группы (не являющийся водой). Во избежание неправильного толкования следует отметить, что термин “переэтерификация” в используемом здесь значении означает перенос ацильной группы из липидного донора в акцептор ацильной группы (не являющийся водой), содержащий приемлемую химическую группу, которая может быть, например, группой -ОН или -SH.The term “transesterification” as used herein means enzyme-catalyzed transfer of an acyl group from a lipid donor (not a free fatty acid) to an acyl acceptor (not a water). To avoid misinterpretation, it should be noted that the term “transesterification” as used here means the transfer of an acyl group from a lipid donor to an acceptor of an acyl group (not being water) containing an acceptable chemical group, which may be, for example, —OH or —SH .

В используемом здесь значении термин “алкоголиз” означает ферментативное расщепление ковалентной связи производного кислоты в результате взаимодействия со спиртовой группой ROH, благодаря чему один продукт связывается с атомом Н спиртовой группы и другой продукт связывается с группой ОR спиртовой группы.As used herein, the term “alcoholysis” means the enzymatic cleavage of a covalent bond of an acid derivative as a result of interaction with an alcohol group of ROH, whereby one product binds to an atom H of the alcohol group and another product binds to the alcohol group OR.

В используемом здесь значении термин “гидролиз” означает катализируемый ферментом перенос ацильной группы из липида в группу ОН молекулы воды. Перенос ацильной группы, происходящий в результате гидролиза, требует отделения молекулы воды.As used herein, the term “hydrolysis” means enzyme-catalyzed transfer of an acyl group from a lipid to an OH group of a water molecule. Acyl group transfer resulting from hydrolysis requires the separation of a water molecule.

Термин “взаимная переэтерификация” означает катализируемый ферментом перенос ацильных групп между липидным донором и липидным акцептором, в котором липидный донор не является свободной ацильной группой. Другими словами, “взаимная переэтерификация” означает взаимообмен жирной кислоты между двумя молекулами липида.The term “mutual transesterification” means an enzyme-catalyzed transfer of acyl groups between a lipid donor and a lipid acceptor, in which the lipid donor is not a free acyl group. In other words, “mutual transesterification” means the interchange of a fatty acid between two lipid molecules.

В соответствии с одним объектом изобретения липидацилтрансфераза, представленная в данном описании изобретения, катализирует взаимную переэтерификацию.In accordance with one aspect of the invention, the lipid acyltransferase provided herein catalyzes mutual transesterification.

Способ или применение по настоящему изобретению может далее включает одну или несколько нижеследующих стадий: растворение акцептора ацильной группы в воде; добавление липидного донора ацильной группы к растворенному акцептору ацильной группы с образованием двухфазной системы или эмульсии; перемешивание или обработку ультразвуком реакционной смеси; нагревание реакционной смеси, например, для денатурации фермента; отделение водной фазы от фазы жира/эмульгатора стандартными методами отделения, такими как, например, экстракция растворителем или выпаривание воды; фракционирование жировой фазы при помощи хроматографии с гидрофобным взаимодействием, кристаллизации или перегонки в глубоком вакууме. Одну или несколько стадий нагревания, разделения или фракционирования можно выполнить после уравновешивания реакционной смеси.The method or application of the present invention may further include one or more of the following steps: dissolving the acyl acceptor in water; adding a lipid acyl donor to the dissolved acyl acceptor to form a biphasic system or emulsion; mixing or sonication of the reaction mixture; heating the reaction mixture, for example, to denature the enzyme; separating the aqueous phase from the fat / emulsifier phase by standard separation methods, such as, for example, solvent extraction or evaporation of water; fractionation of the fatty phase by hydrophobic interaction chromatography, crystallization or distillation in high vacuum. One or more stages of heating, separation or fractionation can be performed after equilibration of the reaction mixture.

В одном варианте осуществления изобретения липаза-ацилтрансфераза, предназначенная для использования в способах по настоящему изобретению, может быть иммобилизована. В случае иммобилизации фермента смесь, содержащую донор ацильной группы, акцептор ацильной группы и воду, пропускают через колонку, заполненную, например, иммобилизованным ферментом. Благодаря иммобилизации фермента можно легко обеспечить его повторное использование.In one embodiment, a lipase acyltransferase for use in the methods of the present invention can be immobilized. In the case of enzyme immobilization, a mixture containing an acyl donor, an acyl acceptor and water is passed through a column filled with, for example, an immobilized enzyme. By immobilizing the enzyme, it can be easily reused.

Иммобилизованный фермент можно использовать в проточном реакторе или реакторе периодического действия, в котором находится реакционная смесь, содержащая акцептор ацильной группы, растворенный в воде, и липидный донор ацильной группы в виде двухфазной системы или эмульсии. Реакционная смесь может быть необязательно перемешана или обработана ультразвуком. После достижения равновесного состояния реакции можно произвести разделение реакционной смеси и иммобилизованного фермента. Продукт реакции может быть фракционирован, например, при помощи хроматографии с гидрофобным взаимодействием, кристаллизации или перегонки в глубоком вакууме.The immobilized enzyme can be used in a flow reactor or a batch reactor, in which there is a reaction mixture containing an acyl acceptor dissolved in water and acyl group lipid donor in the form of a two-phase system or emulsion. The reaction mixture may optionally be mixed or sonicated. After reaching the equilibrium state of the reaction, it is possible to separate the reaction mixture and the immobilized enzyme. The reaction product can be fractionated, for example, by hydrophobic interaction chromatography, crystallization or distillation in high vacuum.

Иммобилизованную липидацилтрансферазу можно получить методами иммобилизации, известными в данной области. Существует много методов получения иммобилизованных ферментов, которые должны быть известны специалисту в данной области (например, методы, описанные в европейском патенте № 0746608 или в публикациях Balcao V.M., Paiva A.L., Malcata F.X., Enzyme Microb Technol. 1996 May 1; 18(6):392-416; или Retz M.T., Jaeger K.E. Chem Phys Lipids. 1998 Jun; 93(l-2):3-14; Bornscheuer U.T., Bessler C, Srinivas R, Krishna S.H. Trends Biotechnol. 2002 Oct; 20(10):433-7; Plou et al, J. Biotechnology 92 (2002) 55-66; Warmuth et al., 1992. Bio Forum 9,282-283; Ferrer et al., 2000. J. Chem. Technol. Biotechnol. 75, 1-8; или Christensen et al., 1998. Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105; Petersen и Christenen, 2000, Applied Biocatalysis. Harwood Academic Publishers, Amsterdam (которые включены в данное описание изобретения в качестве ссылки). Методы, которые могут быть использованы при осуществлении данного изобретения, включают, например, ковалентное связывание с эупергитом С, адсорбцию на полипропилене и грануляцию кремнезема.Immobilized lipid acyltransferase can be obtained by immobilization methods known in the art. There are many methods for producing immobilized enzymes that should be known to a person skilled in the art (for example, the methods described in European Patent No. 0746608 or in the publications Balcao VM, Paiva AL, Malcata FX, Enzyme Microb Technol. 1996 May 1; 18 (6) : 392-416; or Retz MT, Jaeger KE Chem Phys Lipids. 1998 Jun; 93 (l-2): 3-14; Bornscheuer UT, Bessler C, Srinivas R, Krishna SH Trends Biotechnol. 2002 Oct; 20 (10) : 433-7; Plou et al, J. Biotechnology 92 (2002) 55-66; Warmuth et al., 1992. Bio Forum 9,282-283; Ferrer et al., 2000. J. Chem. Technol. Biotechnol. 75, 1-8; or Christensen et al., 1998. Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105; Petersen and Christenen, 2000, Applied Biocatalysis. Harwood Academic Publishers, Amsterdam (which are incorporated herein and finding as a reference). Techniques which may be employed in the practice of this invention include, for example, covalent binding eupergitom C, adsorption on polypropylene and silica-granulation.

Термин “среда с высоким содержанием воды” в используемом здесь значении предпочтительно означает среду с низким содержанием или полным отсутствием органического растворителя, предпочтительно с низким содержанием или полным отсутствием полярного органического растворителя. В определение термина “органический растворитель” в используемом здесь значении предпочтительно не входят пищевые масла, используемые в качестве липидного субстрата, и предпочтительно не входят пищевые масла с высоким содержанием неполярных липидов. Среда с высоким содержанием воды по настоящему изобретению может включать менее 50 об.% органических растворителей, менее 30 об.% органических растворителей, более предпочтительно менее 15 об.% органических растворителей, более предпочтительно менее 5 об.%, более предпочтительно менее 1 об.%, более предпочтительно менее 0,5 об.% органического растворителя, более предпочтительно 0 об.% органических растворителей.The term “high water medium” as used herein preferably means a medium with a low content or complete absence of an organic solvent, preferably a low content or complete absence of a polar organic solvent. The definition of “organic solvent” as used herein preferably does not include edible oils used as a lipid substrate, and preferably edible oils with a high non-polar lipid content are not included. The high water medium of the present invention may include less than 50 vol.% Organic solvents, less than 30 vol.% Organic solvents, more preferably less than 15 vol.% Organic solvents, more preferably less than 5 vol.%, More preferably less than 1 vol. %, more preferably less than 0.5 vol.% organic solvent, more preferably 0 vol.% organic solvents.

В случае получения сложного эфира углевода по настоящему изобретению сложный эфир углевода предпочтительно является сложным эфиром олигосахарида, сложным эфиром моносахарида или сложным эфиром дисахарида.In the case of producing the carbohydrate ester of the present invention, the carbohydrate ester is preferably an oligosaccharide ester, a monosaccharide ester or a disaccharide ester.

Сложный эфир углевода, получаемый по настоящему изобретению, может представлять собой один или несколько нижеследующих сложных эфиров: сложный эфир глюкозы, сложный эфир фруктозы, сложный эфир ангидрофруктозы, сложный эфир мальтозы, сложный эфир лактозы, сложный эфир галактозы, сложный эфир ксилозы, сложный эфир ксилоолигосахарида, сложный эфир арабинозы, сложный эфир мальтоолигосахарида, сложный эфир тагатозы, сложный эфир сахарозы, сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т или сложный эфир кортальцерона.The carbohydrate ester obtained by the present invention can be one or more of the following esters: glucose ester, fructose ester, anhydrofructose ester, maltose ester, lactose ester, galactose ester, xylose ester, xyloligosaccharide ester , arabinose ester, maltooligosaccharide ester, tagatose ester, sucrose ester, microtetcin ester, ascopyron P ester, ascopyrone T ester or cortal ester Yoron.

Сложный эфир углевода, получаемый по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой один или несколько нижеследующих сложных эфиров: сложный моноэфир углевода, сложный моноэфир сахара, сложный моноэфир олигосахарида, сложный моноэфир трисахарида, сложный моноэфир дисахарида, сложный моноэфир моносахарида, сложный моноэфир глюкозы, сложный моноэфир фруктозы, сложный моноэфир ангидрофруктозы, сложный моноэфир мальтозы, сложный моноэфир лактозы, сложный моноэфир галактозы, сложный моноэфир ксилозы, сложный моноэфир ксилоолигосахарида, сложный моноэфир арабинозы, сложный моноэфир мальтоолигосахарида, сложный моноэфир тагатозы, сложный моноэфир сахарозы, сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т или сложный эфир кортальцерона.The carbohydrate ester obtained by the present invention is preferably one or more of the following esters: carbohydrate monoester, sugar monoester, oligosaccharide monoester, trisaccharide monoester, disaccharide monoester, monosaccharide monoester, monosaccharide monoester, , anhydrofructose monoester, maltose monoester, lactose monoester, galactose monoester, xylose monoester, xyloo monoester igosaharida, monoester arabinose, maltooligosaccharides monoester, the monoester tagatose, sucrose monoester, ester mikrotetsina ester askopirona P, T askopirona ester or ester kortaltserona.

В одном варианте осуществления изобретения сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т и/или сложный эфир кортальцерона может быть антимикробным средством. Альтернативно или дополнительно к вышеизложенному сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т и/или сложный эфир кортальцерона может быть антиоксидантом и/или эмульгатором либо тем и другим вместе.In one embodiment of the invention, the microtectin ester, the ascopyron ester P, the ascopyrone ester T and / or the cortalcerone ester may be an antimicrobial agent. Alternatively or in addition to the foregoing, the microtecin ester, the ascospiron ester P, the ascospiron ester T and / or the cortalcerone ester may be an antioxidant and / or emulsifier, or both.

Образование сложного эфира углевода по настоящему изобретению предпочтительно не зависит от UDP-глюкозы.The carbohydrate ester formation of the present invention is preferably independent of UDP glucose.

Пищевой продукт по настоящему изобретению предпочтительно не содержит UDP-глюкозы или содержит UDP-глюкозу в незначительных количествах.The food product of the present invention preferably does not contain UDP-glucose or contains minor amounts of UDP-glucose.

Установлено, что липидацилтрансферазы, используемые в композициях и способах по данному изобретению, обладают уникальными свойствами по сравнению с липолитическими ферментами, выражающимися в том, что они предпочтительно переносят ацильные группы из липидов в акцепторы, не являющиеся водой, даже в присутствии значительного количества воды. По сравнению с ранее известными ферментами липидацилтрансфераза, используемая в данном изобретении, обладает высокой относительной трансферазной активностью в присутствии 6% воды, 54% воды, 73% воды, 89% воды и примерно 95% воды. Исследованные липолитические ферменты фактически не обладают значительной относительной трансферазной активностью в указанных концентрациях воды.It has been found that lipid acyltransferases used in the compositions and methods of this invention have unique properties compared to lipolytic enzymes, which are expressed in that they preferably transfer acyl groups from lipids to non-water acceptors, even in the presence of a significant amount of water. Compared to previously known enzymes, the lipid acyltransferase used in this invention has a high relative transferase activity in the presence of 6% water, 54% water, 73% water, 89% water and about 95% water. The lipolytic enzymes studied did not actually have significant relative transferase activity at the indicated water concentrations.

Процентное значение трансферазной активности (то есть трансферазная активность в процентах от общей ферментативной активности) можно определить следующим методом:The percentage value of the transferase activity (i.e., the transferase activity as a percentage of the total enzymatic activity) can be determined by the following method:

Метод определения процентного значения ацилтрансферазной активностиMethod for determining the percentage of acyltransferase activity

Субстрат, в который добавляют липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, можно экстрагировать после выполнения ферментативной реакции с использованием CHCl₃:CH₃OH (2:1), при этом органическую фазу, содержащую липид, отделяют и анализируют при помощи ГЖХ и ВЭЖХ методом, подробно описанным ниже. В результате выполнения ГЖХ и ВЭЖХ определяют количество свободных жирных кислот и одного или нескольких сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц и сложных эфиров гидроксикислот. Аналогичным образом анализируют контрольный субстрат, в который не добавляли фермент по настоящему изобретению.The substrate to which the lipid acyltransferase of the present invention is added can be extracted after performing an enzymatic reaction using CHCl ₃ : CH ₃ OH (2: 1), while the organic phase containing the lipid is separated and analyzed by GLC and HPLC by the method described in detail below. As a result of GLC and HPLC, the amount of free fatty acids and one or more carbohydrate esters, protein esters, protein subunit esters and hydroxy acid esters are determined. In a similar manner, a control substrate was analyzed in which the enzyme of the present invention was not added.

Вычисления:Calculations:

На основании результатов анализов ГЖХ и ВЭЖХ можно вычислить увеличение свободных жирных кислот и сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц и/или сложных эфиров гидроксикислот:Based on the results of GLC and HPLC analyzes, it is possible to calculate an increase in free fatty acids and carbohydrate esters, protein esters, protein subunit esters and / or hydroxy acid esters:

Δ % жирной кислоты=% жирной кислоты (фермент) - % жирной кислоты (контрольный образец); Mv жирной кислоты=средняя молекулярная масса жирных кислот;Δ% fatty acid =% fatty acid (enzyme) -% fatty acid (control); Mv fatty acid = average molecular weight of fatty acids;

А=Δ % сложного эфира белка/Mv сложного эфира белка (где Δ % сложного эфира белка=% сложного эфира белка (фермент) - % сложного эфира белка (контрольный образец) и Mv сложного эфира белка=средняя молекулярная масса сложных эфиров белка) - применяется в тех случаях, когда акцептором ацильного группы является белок;A = Δ% protein ester / Mv protein ester (where Δ% protein ester =% protein ester (enzyme) -% protein ester (control) and protein Mv ester = average molecular weight of protein esters) - used in cases where the acceptor of the acyl group is a protein;

В=Δ % сложного эфира углевода/Mv сложного эфира углевода (где Δ % сложного эфира углевода=% сложного эфира углевода (фермент) - % сложного эфира углевода (контрольный образец) и Mv сложного эфира углевода=средняя молекулярная масса сложного эфира углевода) - применяется, когда акцептором ацильной группы является углевод;B = Δ% carbohydrate ester / Mv carbohydrate ester (where Δ% carbohydrate ester =% carbohydrate ester (enzyme) -% carbohydrate ester (control) and Mv carbohydrate ester = average molecular weight of carbohydrate ester) - used when the acceptor of the acyl group is a carbohydrate;

С=Δ % сложного эфира белковой субъединицы/Mv сложного эфира белковой субъединицы (где Δ % сложного эфира белковой субъединицы=% сложного эфира белковой субъединицы (фермент) - % сложного эфира белковой субъединицы (контрольный образец) и Mv сложного эфира белковой субъединицы=средняя молекулярная масса сложного эфира белковой субъединицы) - применяется, когда акцептором ацильной группы является белковая субъединица; иC = Δ% protein subunit ester / Mv protein subunit ester (where Δ% protein subunit ester =% protein subunit ester (enzyme) -% protein subunit ester (control) and protein subunit Mv Mv = molecular weight average mass of the ester of the protein subunit) - is used when the protein subunit is the acceptor of the acyl group; and

D=Δ % сложного эфира гидроксикислоты/Mv сложного эфира гидроксикислоты (где Δ % сложного эфира гидроксикислоты=% сложного эфира гидроксикислоты (фермент) - % сложного эфира гидроксикислоты (контрольный образец) и Mv сложного эфира гидроксикислоты=средняя молекулярная масса сложного эфира гидроксикислоты) - применяется, когда акцептором ацильной группы является гидроксикислота.D = Δ% hydroxy acid ester / Mv hydroxy acid ester (where Δ% hydroxy acid ester =% hydroxy acid ester (enzyme) -% hydroxy acid ester (control sample) and Mv hydroxy acid ester = average molecular weight of hydroxy acid ester) used when the acyl acceptor is a hydroxy acid.

Трансферазную активность высчитывают в виде процентного значения от общей ферментативной активности:The transferase activity is calculated as a percentage of the total enzymatic activity:

* - удалить при необходимости* - delete if necessary

Липазную и ацилтрансферазную активность фермента можно высчитать, выполняя нижеследующие анализы. Таким образом можно получить/идентифицировать липидацилтрансферазу, обладающую характеристиками фермента, рассмотренного в данном описании изобретения.The lipase and acyltransferase activity of the enzyme can be calculated by performing the following assays. Thus, it is possible to obtain / identify a lipid acyltransferase having the characteristics of the enzyme described in this description of the invention.

Анализ трансферазы в забуференном субстрате (см. пример 6)Analysis of transferase in a buffered substrate (see example 6)

Ферменты, предназначенные для использования в качестве липидацилтрансфераз в композициях и способах по данному изобретению, можно идентифицировать, выполняя анализ, описанный в примере 6. Данный анализ далее определяется как “Анализ трансферазы в забуференном субстрате”. В примере 6 фермент липидацилтрансферазу, выделенный из Aeromonas salmonicida по настоящему изобретению, анализировали и сравнивали с рядом липолитических ферментов, не входящих в объем настоящего изобретения. Было установлено, что только липолитические ферменты LIPOPAN® F (Novozymes, Denmark) обладают трансферазной активностью и лишь на очень низком уровне (1,3%).Enzymes intended for use as lipid acyltransferases in the compositions and methods of this invention can be identified by performing the assay described in Example 6. This assay is hereinafter referred to as “Transferase Assay in a Buffered Substrate”. In Example 6, the lipid acyltransferase enzyme isolated from the Aeromonas salmonicida of the present invention was analyzed and compared with a number of lipolytic enzymes not included in the scope of the present invention. It was found that only lipolytic enzymes LIPOPAN® F (Novozymes, Denmark) have transferase activity and only at a very low level (1.3%).

Ферменты, пригодные для использования в композициях и способах по данному изобретению, можно идентифицировать, выполняя анализ трансферазы в забуференном субстрате. При выполнении указанного анализа в среде с очень высоким содержанием воды, равным примерно 95%, липидацилтрансферазами по настоящему изобретению являются ферменты, обладающие по крайней мере 2% ацилтрансферазной активностью (относительная трансферазная активность), предпочтительно по крайней мере 5% относительной трансферазной активностью, предпочтительно по крайней мере 10% относительной трансферазной активностью, предпочтительно по крайней мере 15%, 20%, 25%, 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 60% или 75% относительной трансферазной активностью. Липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может обладать менее чем 28%, менее чем 30%, предпочтительно менее чем 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% ацилтрансферазной активностью.Enzymes suitable for use in the compositions and methods of this invention can be identified by performing a transferase assay in a buffered substrate. When performing this analysis in an environment with a very high water content of about 95%, the lipid acyltransferases of the present invention are enzymes having at least 2% acyltransferase activity (relative transferase activity), preferably at least 5% relative transferase activity, preferably at at least 10% relative transferase activity, preferably at least 15%, 20%, 25%, 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 60% or 75% relative transferase activity. The lipid acyltransferase of the present invention may have less than 28%, less than 30%, preferably less than 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 100% acyltransferase activity.

Анализ трансферазы в среде с низким содержанием водыAnalysis of transferase in a low water environment

В качестве альтернативы (или дополнительно) “Анализу трансферазы в забуференном субстрате” липидацилтрансферазы, пригодные для использования в настоящем изобретении, можно идентифицировать при помощи “Анализа трансферазы в среде с низким содержанием воды”.Alternatively (or additionally) to the “Assay of transferase in a buffered substrate” lipid acyltransferases suitable for use in the present invention can be identified by “Assay of transferase in a low water environment”.

Чтобы определить, является ли фермент липидацилтрансферазой по настоящему изобретению, можно выполнить “Анализ трансферазы в среде с низким содержанием воды”, а именно в масляной среде с 6% воды в соответствии с описанием, приведенным в примере 9. Указанный пример служит для иллюстрации того, что липидацилтрансфераза по данному изобретению обладает высокой относительной трансферазной активностью в масляной среде, содержащей 6% воды, в которой известные липолитические ферменты проявляют гидролитическую активность.To determine whether the enzyme is a lipid acyltransferase according to the present invention, it is possible to perform “Transferase assay in a medium with a low water content”, namely in an oil medium with 6% water, as described in Example 9. This example illustrates that the lipid acyltransferase according to this invention has a high relative transferase activity in an oil medium containing 6% water, in which known lipolytic enzymes exhibit hydrolytic activity.

В одном варианте осуществления изобретения липидацилтрансфераза, пригодная для использования в способах и/или применениях по настоящему изобретению, представляет собой фермент, который при исследовании с помощью “Анализа трансферазы в среде с низким содержанием воды”, выполненного через 30, 20 или 120 минут, обладает относительной трансферазной активностью, равной по крайней мере 1%, предпочтительно по крайней мере 2%, предпочтительно по крайней мере 5%, предпочтительно по крайней мере 10%, предпочтительно по крайней мере 20%, предпочтительно по крайней мере 30%, предпочтительно по крайней мере 40%, предпочтительно по крайней мере 50%, предпочтительно по крайней мере 60%, предпочтительно по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 75%. Липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может обладать менее чем 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% активностью при измерении через 10, 20, 30 или 120 минут методом “Анализ трансферазы в среде с низким содержанием воды”.In one embodiment, a lipid acyltransferase suitable for use in the methods and / or applications of the present invention is an enzyme that, when tested with a “Low Water Content Transferase Assay” performed after 30, 20 or 120 minutes, has a relative transferase activity of at least 1%, preferably at least 2%, preferably at least 5%, preferably at least 10%, preferably at least 20%, preferably at least about 30%, preferably at least 40%, preferably at least 50%, preferably at least 60%, preferably at least 70%, preferably at least 75%. The lipid acyltransferase of the present invention may have less than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, or 80% activity when measured after 10, 20, 30, or 120 minutes using the Transferase Assay in a Low Water Medium Method.

Как было указано выше, липаза-ацилтрансфераза по данному изобретению может быть идентифицирована методом “Анализ трансферазы в забуференном субстрате” или “Анализ трансферазы в среде с низким содержанием воды” с использованием холестерина в качестве акцептора ацильной группы. Специалисту в данной области должны быть очевидны изменения, которые необходимо внести в аналитические методы “Анализ трансферазы в забуференном субстрате” или “Анализ трансферазы в среде с низким содержанием воды” для определения активности липидацилтрансферазы в отношении любого липидного донора ацильной группы или любой комбинации акцепторов ацильной группы. Квалифицированный специалист при необходимо может просто заменить субстрат донора ацильной группы (например, фосфолипид) альтернативным субстратом донора ацильной группы (например, гликолипидом, триацилглицеридом) и/или заменить акцептор ацильной группы (например, холестерин) альтернативным субстратом акцептора ацильной группы (например, углеводом, белком, белковой субъединицей или гидроксикислотой) (см., например, примеры 10-13).As indicated above, the lipase acyltransferase according to this invention can be identified by the method “Analysis of transferase in a buffered substrate” or “Analysis of transferase in a medium with a low water content” using cholesterol as an acyl acceptor. The person skilled in the art will appreciate the changes that need to be made to the analytical methods “Transferase Analysis in Buffered Substrate” or “Transferase Analysis in a Low Water Medium” to determine the activity of lipid acyltransferase in relation to any lipid donor of the acyl group or any combination of acyl acceptors . If necessary, a qualified person can simply replace the substrate of the acyl group donor (e.g., phospholipid) with an alternative substrate of the acyl group donor (e.g., glycolipid, triacylglyceride) and / or replace the acyl group acceptor (e.g., cholesterol) with an alternative substrate of the acyl group acceptor (e.g., carbohydrate, protein, protein subunit or hydroxyacid) (see, for example, examples 10-13).

Термин “среда с высоким содержанием воды” в используемом здесь значении означает любую среду, содержащую 5-98% воды. Указанная среда предпочтительно содержит более 6% воды, предпочтительно более 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. Среда с высоким содержанием воды может содержать 20-98%, в частности 50-98%, в частности 70-98%, в частности 75-98% воды.The term “high water medium” as used herein means any medium containing 5-98% water. The specified medium preferably contains more than 6% water, preferably more than 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90%. A medium with a high water content may contain 20-98%, in particular 50-98%, in particular 70-98%, in particular 75-98% water.

В одном варианте осуществления изобретения в указанной смеси отношение количества добавляемой липидацилтрансферазы к воде составляет по крайней мере 1:700, предпочтительно 1:10000 при измерении в расчете на массу.In one embodiment of the invention in said mixture, the ratio of the amount of added lipid acyltransferase to water is at least 1: 700, preferably 1: 10000 when measured on a weight basis.

Термин “низкое содержание воды” в используемом здесь значении означает любой субстрат или пищевой продукт, содержащий менее 5% воды, предпочтительно менее 4%, 3%, 2%, 1% или 0,5%.The term “low water content” as used herein means any substrate or food product containing less than 5% water, preferably less than 4%, 3%, 2%, 1% or 0.5%.

Способ и/или применение по настоящему изобретению предпочтительно можно осуществлять при температуре 15-60°С, предпочтительно при температуре 20-60°С, предпочтительно при 20-50°С, предпочтительно при 20-45°С, предпочтительно при 20-40°С.The method and / or use of the present invention can preferably be carried out at a temperature of 15-60 ° C, preferably at a temperature of 20-60 ° C, preferably at 20-50 ° C, preferably at 20-45 ° C, preferably at 20-40 ° FROM.

Способ или применение по настоящему изобретению включает дальнейшую стадию очистки и/или выделения продукта реакции, а именно одного или нескольких сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц или сложных эфиров гидроксикислот. Таким образом, продукт реакции предпочтительно получают в очищенной и/или выделенной форме.The method or application of the present invention includes a further step of purifying and / or isolating the reaction product, namely one or more carbohydrate esters, protein esters, protein subunit esters or hydroxy acid esters. Thus, the reaction product is preferably obtained in purified and / or isolated form.

Квалифицированному специалисту известны многие методы очистки сложных эфиров. В качестве примера можно отметить, что сложные эфиры, полученные способами по настоящему изобретению, могут быть очищены хроматографией, такой как хроматография с гидрофобным взаимодействием, фильтрацией, центрифугированием, экстракцией растворителем/перегонкой или кристаллизацией. Приемлемые методы рассмотрены в публикации Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KgaA.The skilled artisan knows many methods for purifying esters. As an example, it can be noted that esters obtained by the methods of the present invention can be purified by chromatography, such as hydrophobic interaction chromatography, filtration, centrifugation, solvent extraction / distillation or crystallization. Acceptable methods are discussed in Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KgaA.

Липидацилтрансфераза по данному изобретению может быть экспрессирована в любом приемлемом экспрессирующем хозяине. Например, липидацилтрансфераза по данному изобретению может быть экспрессирована в Bacillus subtilis и может быть очищена ультрафильтрацией, осаждением в этаноле и/или центрифугированием и затем может быть подвергнута распылительной сушке с использованием крахмала (мальтодекстрина) в качестве носителя для фермента. Высушенный распылением фермент может быть стандартизирован в соответствии с точно определенной активностью PLU путем добавления дополнительного количества носителя в порошкообразной форме. Применяемые методы хорошо отработаны и представляют собой общепринятую практику в данной области.The lipid acyltransferase of this invention can be expressed in any suitable expression host. For example, the lipid acyltransferase of this invention can be expressed in Bacillus subtilis and can be purified by ultrafiltration, ethanol precipitation and / or centrifugation, and then can be spray dried using starch (maltodextrin) as an enzyme carrier. The spray dried enzyme can be standardized according to precisely defined PLU activity by adding an additional amount of carrier in powder form. The methods used are well established and are generally accepted practice in this area.

В одном варианте осуществления изобретения способ по настоящему изобретению является способом in vitro. Указанный способ может быть соответственно непрерывным или периодическим процессом.In one embodiment, the method of the present invention is an in vitro method. The specified method may be respectively a continuous or batch process.

Фермент по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с одним или несколькими другими ферментами. Так, в объем настоящего изобретения помимо фермента по данному изобретения входит смесь, контактирующая по крайней мере еще с одним ферментом. Такие дополнительные ферменты включают амилолитические ферменты, в частности эндо- или оксоамилазы, пуллуланазы, деветвящие ферменты, гемицеллюлазы, включающие ксиланазы, целлюлазы, оксидоредуктазы, например глюкозооксидазу или оксидазу углеводов, способную окислять мальтозу, например гексозооксидазу (НОХ), липазы, фосфолипазы и протеазы. Смесь может контактировать с ферментом по данному изобретению и по крайней мере еще с одним дополнительным ферментом одновременно или последовательно.The enzyme of the present invention can be used in combination with one or more other enzymes. So, in the scope of the present invention in addition to the enzyme of this invention includes a mixture in contact with at least one other enzyme. Such additional enzymes include amylolytic enzymes, in particular endo- or oxoamylases, pullulanases, branching enzymes, hemicellulases, including xylanases, cellulases, oxidoreductases, for example, glucose oxidase or carbohydrate oxidase, capable of oxidizing maltose, for example, hexose oxidase, HCl. The mixture may be contacted with the enzyme of this invention and at least one additional enzyme simultaneously or sequentially.

В одном варианте осуществления изобретения липидацилтрансфераза может быть использована в комбинации с липазой, обладающей одной или несколькими нижеследующими липазными активностями: активностью гликолипазы (Е.С. 3.1.1.26), триацилглицероллипазы (Е.С. 3.1.1.3), фосфолипазы А2 (Е.С. 3.1.1.4) или фосфолипазы А1 (Е.С. 3.1.1.32). Приемлемые ферменты липазы хорошо известны в данной области и включают приведенные в качестве примера нижеследующие липазы: LIPOРAN® F и/или LECITASE® ULTRA (Novozymes A/S, Denmark), фосфолипаза А2 (например, фосфолипаза А2 компании LIPOMOD™, 22L компании Biocatalysts, LIPOMAX™ компании Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A/S, Denmark), липазы, описанные в заявке WO 03/97835, европейском патенте № 0977869 или европейском патенте № 1193314.In one embodiment, lipid acyltransferase can be used in combination with a lipase having one or more of the following lipase activities: glycolipase activity (E.C. 3.1.1.26), triacylglycerolipase (E.C. 3.1.1.3), phospholipase A2 (E. C. 3.1.1.4) or phospholipase A1 (E.C. 3.1.1.32). Suitable lipase enzymes are well known in the art and include the following lipases exemplified: LIPOPAN® F and / or LECITASE® ULTRA (Novozymes A / S, Denmark), phospholipase A2 (e.g., phospholipase A2 from LIPOMOD ™, 22L from Biocatalysts, LIPOMAX ™ from Genecor), LIPOLASE® (Novozymes A / S, Denmark), the lipases described in WO 03/97835, European Patent No. 0977869 or European Patent No. 1193314.

ПримененияApplications

Таким образом, в результате осуществления способов по настоящему изобретению можно получить один или несколько сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц, сложных эфиров гидроксикислот. Многие из указанных сложных эфиров являются полезными эмульгаторами. В качестве примера можно отметить, что сложные эфиры аминокислот, сложные эфиры пептидов, сложные эфиры белков, сложные эфиры углеводов и сложные эфиры гидроксикислот (такие как сложные эфиры винной кислоты) являются функционально важными эмульгаторами. Эмульгаторы применяются в целом ряде отраслей промышленности, таких как пищевая промышленность, кормовая промышленность, косметическая промышленность (например, основы для косметических средств), фармацевтическая промышленность (например, синтез и приготовление лекарственных средств) и лакокрасочной промышленности. Эмульгаторы могут быть смачивающими веществами, ингредиентами пищевых продуктов и активными ингредиентами.Thus, as a result of the methods of the present invention, one or more carbohydrate esters, protein esters, protein subunit esters, hydroxy acid esters can be obtained. Many of these esters are useful emulsifiers. As an example, it may be noted that amino acid esters, peptide esters, protein esters, carbohydrate esters and hydroxy acid esters (such as tartaric acid esters) are functionally important emulsifiers. Emulsifiers are used in a number of industries, such as the food industry, the feed industry, the cosmetics industry (for example, the basis for cosmetics), the pharmaceutical industry (for example, the synthesis and preparation of medicines) and the paint and varnish industry. Emulsifiers may be wetting agents, food ingredients, and active ingredients.

Кроме того, конденсаты жирной кислоты белка благодаря присущим им великолепным физиологическим свойствам можно применять, например, в косметике и средствах личной гигиены. Например, сложные эфиры белков можно использовать в средствах для душа и ванны, а также в шампунях и моющих средствах для тела. Конденсаты жирной кислоты белка можно также использовать в фармацевтических композициях, например, в качестве основы.In addition, protein fatty acid condensates due to their inherent excellent physiological properties can be used, for example, in cosmetics and personal care products. For example, protein esters can be used in shower and bath products, as well as in shampoos and body cleansers. Protein fatty acid condensates can also be used in pharmaceutical compositions, for example, as a base.

Конденсаты жирной кислоты белка широко применяются в косметической промышленности. Указанные продукты обычно получают в результате взаимодействия гидролизата белка с хлорангидридом жирной кислоты в условиях реакции Скоттена-Бауманна с использованием воды в качестве растворителя.Protein fatty acid condensates are widely used in the cosmetic industry. These products are usually obtained by reacting a protein hydrolyzate with a fatty acid chloride under the conditions of the Scott-Baumann reaction using water as a solvent.

(_{_} e/rawmaterials26 _{_} e _{_} .htm#5). ( _{_} e / rawmaterials26 _{_} e _{_} .htm # 5).

В процессе получения конденсатов жирной кислоты белка можно объединять возобновляемые ресурсы жирных кислот (из растительного масла) и белка, который может быть получен из отходов переработки животного сырья (кожа) и многих растений, для создания структуры поверхностно-активного вещества с гидрофобной (жирная кислота) и гидрофильной (белок) частью. В данном процессе хлор-ангидрид жирной кислоты подвергают взаимодействию с аминогруппой аминокислоты с образованием конденсата жирной кислоты белка (см. фигуру 49). При этом получают продукты, которые характеризуются великолепной совместимостью с кожей и, кроме того, обладают хорошим очищающим действием.In the process of obtaining protein fatty acid condensates, renewable resources of fatty acids (from vegetable oil) and protein, which can be obtained from animal waste products (skin) and many plants, can be combined to create a structure of a surfactant with hydrophobic (fatty acid) and hydrophilic (protein) part. In this process, a fatty acid chlorine anhydride is reacted with an amino group of an amino acid to form a protein fatty acid condensate (see FIG. 49). This gives products that are characterized by excellent compatibility with the skin and, in addition, have a good cleansing effect.

Тот факт, что даже небольшие добавки гидролизата ацилированного белка оказывают синергичное действие на совместимость с кожей других поверхностно-активных веществ, имеет очень важное значение с технической точки зрения получения продукта. Указанное защитное действие можно объяснить амфотерным характером продукта. Между конденсатом жирной кислоты белка и коллагеном кожи происходит взаимодействие. Благодаря такому взаимодействию образуется защитный слой, который уменьшает чрезмерное воздействие поверхностно-активных веществ на верхние слои кожи, ослабляет их сильное обезжиривающее действие и прямое взаимодействие анионогенных поверхностно-активных веществ с кожей.The fact that even small additives of the acylated protein hydrolyzate have a synergistic effect on the compatibility with the skin of other surfactants is very important from a technical point of view of obtaining the product. The indicated protective effect can be explained by the amphoteric nature of the product. An interaction occurs between the protein fatty acid condensate and the skin collagen. Due to this interaction, a protective layer is formed, which reduces the excessive effect of surfactants on the upper layers of the skin, weakens their strong degreasing effect and the direct interaction of anionic surfactants with the skin.

В косметической промышленности поверхностно-активные вещества на белковой основе используют главным образом в продуктах для душа и ванны, оказывающих мягкое действие, мягких шампунях, очищающих средствах для лица на основе поверхностно-активных веществ, средствах для холодной укладки и фиксации волос или средствах на основе поверхностно-активных веществ для малышей.In the cosmetic industry, protein-based surfactants are mainly used in soft and gentle shower and bath products, soft shampoos, surfactants based face cleansers, hair styling and fixing products, or surfactant-based products -active substances for babies.

Конденсаты жирной кислоты гидролизата белка можно также использовать в качестве основ для фармацевтических препаратов, например для кремов и мазей, содержащих активные ингредиенты для местного нанесения на кожу.Protein hydrolyzate fatty acid condensates can also be used as bases for pharmaceutical preparations, for example, creams and ointments containing the active ingredients for topical application to the skin.

Настоящее изобретение относится к новому способу получения конденсата жирной кислоты белка без использования хлорангидрида жирной кислоты. Реакция по настоящему изобретению показана на фигуре 50. Указанную реакцию можно выполнять в водной или буферной системе при низкой температуре без образования отходов производства.The present invention relates to a new method for producing a protein fatty acid condensate without using a fatty acid chloride. The reaction of the present invention is shown in FIG. 50. This reaction can be performed in an aqueous or buffer system at a low temperature without generating production waste.

Термин “конденсат жирной кислоты белка” в используемом здесь значении означает все нижеследующие сложные эфиры белков, сложные эфиры полипептидов, сложные эфиры дипептидов, сложные эфиры олигопептидов, сложные эфиры пептидов и сложные эфиры аминокислот.The term “protein fatty acid condensate” as used herein means all of the following protein esters, polypeptide esters, dipeptide esters, oligopeptide esters, peptide esters and amino acid esters.

Квалифицированному специалисту должно быть известно, что сложные эфиры углеводов (в частности, сложные эфиры сахаров) широко применяются в пищевой промышленности. Другими областями применения указанных продуктов являются косметика, средства для ухода за полостью рта и медицинские препараты. Кроме того, указанные соединения можно использовать в качестве антибиотиков, противоопухолевых средств, фунгицидов и инсектицидов. Липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может катализировать образование сложного эфира глюкозы в среде с высоким содержанием воды (фигура 51).A qualified person should be aware that carbohydrate esters (in particular sugar esters) are widely used in the food industry. Other applications for these products are cosmetics, oral care products, and medications. In addition, these compounds can be used as antibiotics, antitumor agents, fungicides and insecticides. The lipid acyltransferase of the present invention can catalyze the formation of a glucose ester in a high water medium (Figure 51).

Сложные эфиры по настоящему изобретению находят применение в нижеследующих областях.The esters of the present invention find application in the following areas.

Косметика: основные масляные эмульсии (масло в воде, HLB 16-18); парафиновые эмульсии в масле (масло в воде, HLB 10-14); эмульсии стеариновой кислоты; восковые эмульсии (масло в воде, HLB 14-16); ланолиновые эмульсии (масло в воде, HLB 12-14); силиконовые эмульсии; зубные пасты (масло в воде); пены для ванн (масло в воде, HLB 14-18); лосьоны для волос.Cosmetics: basic oil emulsions (oil in water, HLB 16-18); paraffin emulsions in oil (oil in water, HLB 10-14); stearic acid emulsions; wax emulsions (oil in water, HLB 14-16); lanolin emulsions (oil in water, HLB 12-14); silicone emulsions; toothpastes (oil in water); bath foams (oil in water, HLB 14-18); lotions for hair.

Фармацевтические препараты: лекарственные эмульсии; основы для мазей; суппозитории (вода в масле); инкапсулированные препараты; инъекционные препараты.Pharmaceuticals: drug emulsions; the basis for ointments; suppositories (water in oil); encapsulated drugs; injectable drugs.

Сельское хозяйство: препараты для улучшения почвы; в качестве добавки к удобрению; в качестве очищающих средств широкого назначения; очищающих средств для фруктов и овощей; очищающих средств для маслобоек.Agriculture: preparations for soil improvement; as an additive to fertilizer; as general-purpose cleaning agents; cleansers for fruits and vegetables; cleansers for churns.

Защита урожая: природные инсектициды; хлорированные углеводы и препарат 140; сложные эфиры фосфорной кислоты (эмульсия масла в воде, HLB 10-14); фунгициды (эмульсия масла в воде); гербициды (эмульсия масла в воде).Harvest protection: natural insecticides; chlorinated carbohydrates and preparation 140; phosphoric acid esters (oil in water emulsion, HLB 10-14); fungicides (oil in water emulsion); herbicides (oil in water emulsion).

Пищевая промышленность: хлеб и выпечка; маргарин; шоколад; средство от помутнения жира (эмульсия воды в масле, HLB 5-10); сахарная глазурь (эмульсия масла в воде, HLB 14-16); мягчители для карамели и жевательной резинки (эмульсия воды в масле, HLB 2-4); средства от прилипания (эмульсия воды в масле, HLB 2-4); добавки в мороженое (эмульсия воды в масле, HLB 4-6); смачивающие вещества для сухого молока и пекарного порошка (эмульсия воды в масле, HLB 9-11); заварной крем-концентрат (эмульсия воды в масле, HLB 2-4); фруктовые и овощные напитки; ароматизаторы (эмульсия воды в масле и эмульсия масла в воде, HLB 10-12); приправы к мясу, салату или другие ароматизирующие приправы (эмульсия масла в воде); пищевые красители (эмульсия воды в масле, HLB 2-4; эмульсия масла в воде, HLB 8-18); пеногасители.Food industry: bread and pastries; margarine; chocolate; a remedy for clouding of fat (emulsion of water in oil, HLB 5-10); sugar icing (oil in water emulsion, HLB 14-16); softeners for caramel and chewing gum (water in oil emulsion, HLB 2-4); anti-stick agents (water in oil emulsion, HLB 2-4); additives in ice cream (water in oil emulsion, HLB 4-6); wetting agents for powdered milk and baking powder (water in oil emulsion, HLB 9-11); custard concentrate (water in oil emulsion, HLB 2-4); fruit and vegetable drinks; flavors (water in oil emulsion and oil in water emulsion, HLB 10-12); seasonings for meat, salad or other flavoring seasonings (oil in water emulsion); food coloring (water in oil emulsion, HLB 2-4; oil in water emulsion, HLB 8-18); defoamers.

Преимущество использования сложных эфиров конденсата жирной кислоты белка, сложных эфиров гидроксикислот и сложных эфиров углеводов по настоящему изобретению в качестве эмульгаторов в пищевой промышленности состоит в том, что указанные вещества являются безвредными совместимыми с пищевыми продуктами компонентами, которые гораздо легче подвергаются биологическому разрушению по сравнению с другими обычно применяемыми эмульгаторами, такими как, например, сложные эфиры этоксилированных жирных кислот. Таким образом, указанные эмульгаторы являются более дружественными для окружающей среды как в пищевой промышленности, так и в непищевой промышленности.The advantage of using protein fatty acid ester esters, hydroxy acid esters and carbohydrate esters of the present invention as emulsifiers in the food industry is that these substances are harmless food-compatible components that are much more readily biodegradable than others commonly used emulsifiers, such as, for example, ethoxylated fatty acid esters. Thus, these emulsifiers are more environmentally friendly both in the food industry and in the non-food industry.

В одном варианте осуществления изобретения сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т и/или сложный эфир кортальцерона можно использовать в качестве антимикробного средства. Альтернативно или дополнительно к вышеуказанному применению сложный эфир микротецина, сложный эфир аскопирона Р, сложный эфир аскопирона Т и/или сложный эфир кортальцерона может представлять собой антиоксидант и/или эмульгатор либо то и другое вместе.In one embodiment of the invention, the microtecin ester, the ascopyron ester P, the ascopyrone ester T and / or the cortalcerone ester can be used as an antimicrobial agent. Alternatively or in addition to the aforementioned use, the microtecin ester, the ascospiron ester P, the ascospiron ester T and / or the cortalcerone ester may be an antioxidant and / or emulsifier or both together.

В одном варианте осуществления изобретения способы или применения по настоящему изобретению можно использовать для получения эмульгаторов, предназначенных для приготовления лекарственных средств, в частности для получения препаратов с контролируемым высвобождением активных ингредиентов, в которых активный ингредиент ацилирован липидацилтрансферазой. Такие препараты пролонгированного действия особенно пригодны для фармацевтических композиций для перорального введения благодаря тому, что постепенный гидролиз сложного эфира в пищеварительном тракте обеспечивает постепенную доставку активного ингредиента. Такие ацилированные композиции можно далее использовать для получения препаратов, предназначенных для подкожного или внутривенного введения.In one embodiment of the invention, the methods or applications of the present invention can be used to obtain emulsifiers intended for the preparation of drugs, in particular for the preparation of controlled release active ingredients in which the active ingredient is acylated by lipid acyltransferase. Such sustained release formulations are particularly suitable for pharmaceutical compositions for oral administration because the gradual hydrolysis of the ester in the digestive tract provides for the gradual delivery of the active ingredient. Such acylated compositions can further be used to prepare formulations intended for subcutaneous or intravenous administration.

В другом варианте осуществления изобретения способы или применения по настоящему изобретению можно использовать для получения межфазных катализаторов, предназначенных для переноса солей в раствор органических растворителей, например, в процессе органического взаимодействия. Например, перенос ацильной группы в соответствующий катионный акцептор, такой как гидроксикислота (лимонная кислота), или альтернативно в анионный акцептор, такой как гидроксиамины, позволяет получить межфазные катализаторы для переноса солей в раствор органических растворителей.In another embodiment, the methods or applications of the present invention can be used to produce interfacial catalysts for transferring salts to a solution of organic solvents, for example, in an organic reaction process. For example, transferring an acyl group to an appropriate cationic acceptor, such as hydroxyacid (citric acid), or alternatively to an anionic acceptor, such as hydroxyamines, provides interfacial catalysts for transferring salts to an organic solvent solution.

В другом варианте осуществления изобретения способы по настоящему изобретению можно использовать для получения сложноэфирных пролекарств фармацевтических соединений с низкой биологической доступностью и/или плохой растворимостью, например антивирусных средств, таких как ацикловир и гангацикловир. Указанный способ можно далее использовать для получения других лекарственных соединений со свободной гидроксильной группой, например с первичной, вторичной или третичной гидроксильной группой.In another embodiment, the methods of the present invention can be used to produce ester prodrugs of pharmaceutical compounds with low bioavailability and / or poor solubility, for example, antiviral agents such as acyclovir and gangacyclovir. The specified method can be further used to obtain other medicinal compounds with a free hydroxyl group, for example with a primary, secondary or tertiary hydroxyl group.

Сложный эфир, полученный по настоящему изобретению, предпочтительно используют в фармацевтическом препарате.The ester obtained by the present invention is preferably used in a pharmaceutical preparation.

Сложный эфир, полученный по настоящему изобретению, предпочтительно используют в косметических средствах и/или средствах личной гигиены.The ester obtained according to the present invention is preferably used in cosmetics and / or personal care products.

Сложный эфир, полученный по настоящему изобретению, предпочтительно используют в пищевых продуктах и/или кормовых продуктах.The ester obtained by the present invention is preferably used in food and / or feed products.

Способ по настоящему изобретению может быть одной стадией в процессе получения одного или нескольких фармацевтических препаратов, косметических средств, средств личной гигиены, пищевых или кормовых продуктов.The method of the present invention may be one step in the process of obtaining one or more pharmaceuticals, cosmetics, personal care products, food or feed products.

ПреимуществаBenefits

Одним преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что он позволяет получить один или несколько сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц или сложных эфиров гидроксикислот без необходимости использования органических растворителей. Таким образом, настоящее изобретение позволяет сократить или полностью устранить использование органических растворителей. Следствием этого являются многие преимущества, выражающиеся, например, в снижении производственных затрат, уменьшении воздействия органических растворителей на человека и/или окружающую среду, упрощении производственного процесса.One advantage of the method of the present invention is that it allows one or more carbohydrate esters, protein esters, protein subunit esters or hydroxy acid esters to be prepared without the need for organic solvents. Thus, the present invention reduces or eliminates the use of organic solvents. The consequence of this is many advantages, expressed, for example, in reducing production costs, reducing the effects of organic solvents on humans and / or the environment, and simplifying the production process.

При производстве сложных эфиров для пищевой промышленности особенно эффективным является использование липидов вместо жирных кислот, так как в данном случае не нужно удалять избыточные липиды, поскольку они могут образовывать часть пищевого продукта, в котором использован вышеуказанный продукт реакции. С другой стороны, избыток свободных жирных кислот необходимо удалять, так как они являются вредными для большинства пищевых продуктов.In the production of esters for the food industry, the use of lipids instead of fatty acids is particularly effective, since in this case it is not necessary to remove excess lipids, since they can form part of the food product in which the above reaction product is used. On the other hand, excess free fatty acids must be removed, as they are harmful to most foods.

Выделенный продуктHighlighted product

В соответствии с одним объектом изобретения полипептид или белок, предназначенный для использования в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой выделенный продукт. Термин “выделенный” означает, что последовательность по существу не содержит ни одного другого компонента, с которым данная последовательность естественно связана в природе и встречается в природе.In accordance with one aspect of the invention, the polypeptide or protein intended for use in the present invention is preferably an isolated product. The term “isolated” means that the sequence essentially does not contain any other component with which the sequence is naturally associated in nature and is found in nature.

В соответствии с одним объектом изобретения продукт биоконверсии по настоящему изобретению, например сложный эфир углевода, сложный эфир белка, сложный эфир белковой субъединицы и/или сложный эфир гидроксикислоты, выделен из реакционной смеси. Термин “выделен” означает, что продукт биоконверсии по существу не содержит ни одного другого компонента, с которым данный продукт связан в процессе реакции биоконверсии.According to one aspect of the invention, the bioconversion product of the present invention, for example, a carbohydrate ester, a protein ester, a protein subunit ester and / or a hydroxy acid ester, is isolated from the reaction mixture. The term “isolated” means that the bioconversion product essentially does not contain any other component with which the product is associated in the course of the bioconversion reaction.

Очищенный продуктPurified product

В соответствии с одним объектом изобретения полипептид или белок, предназначенный для использования в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой очищенный продукт. Термин “очищенный” означает, что последовательность находится в относительно чистом состоянии, например является чистой по крайней мере примерно на 51%, по крайней мере примерно на 75%, по крайней мере примерно на 80%, по крайней мере примерно на 90%, по крайней мере примерно на 95% или по крайней мере примерно на 98%.In accordance with one aspect of the invention, the polypeptide or protein intended for use in the present invention is preferably a purified product. The term “purified” means that the sequence is in a relatively pure state, for example, is at least about 51% pure, at least about 75% pure, at least about 80% pure, at least about 90% pure, at least about 95% or at least about 98%.

В соответствии с одним объектом изобретения продукт биоконверсии, полученный по настоящему изобретению, например сложный эфир углевода, сложный эфир белка, сложный эфир белковой субъединицы и/или сложный эфир гидроксикислоты, предпочтительно очищен от реакционной смеси и поэтому является чистым. Термин “очищен” означает, что продукт биоконверсии находится в относительно чистом состоянии, например, является чистым по крайней мере примерно на 51%, по крайней мере примерно на 75%, по крайней мере примерно на 80%, по крайней мере примерно на 90%, по крайней мере примерно на 95% или по крайней мере примерно на 98%.According to one aspect of the invention, the bioconversion product obtained according to the present invention, for example, carbohydrate ester, protein ester, protein subunit ester and / or hydroxy acid ester, is preferably purified from the reaction mixture and therefore is pure. The term “purified” means that the bioconversion product is in a relatively pure state, for example, is at least about 51% pure, at least about 75% pure, at least about 80% pure, at least about 90% pure at least about 95% or at least about 98%.

Фармацевтические композицииPharmaceutical Compositions

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей продукт по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель (включая их комбинации).The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a product of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient (including combinations thereof).

Фармацевтические композиции могут быть предназначены для введения человеку или животному в медицине или ветеринарии и обычно содержат один или несколько фармацевтических приемлемых разбавителей, носителей или наполнителей. Приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической области и описаны, например, в публикации Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Фармацевтический носитель, наполнитель или разбавитель может быть выбран в зависимости от предполагаемого способа введения и обычной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции могут содержать в качестве носителя, наполнителя или разбавителя или дополнительно к ним любые приемлемые связывающие вещества, смазывающие вещества, суспендирующие вещества, покровные вещества, солюбилизирующие вещества.The pharmaceutical compositions may be intended for administration to a human or animal in medicine or veterinary medicine and typically contain one or more pharmaceutically acceptable diluents, carriers or excipients. Acceptable carriers or diluents for therapeutic use are well known in the pharmaceutical field and are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). A pharmaceutical carrier, excipient or diluent may be selected depending on the intended route of administration and normal pharmaceutical practice. The pharmaceutical compositions may contain, as a carrier, excipient or diluent, or in addition to any suitable binders, lubricants, suspending agents, coating agents, solubilizing agents.

В фармацевтической композиции могут присутствовать консерванты, стабилизаторы, красители и даже ароматизаторы. Примеры консервантов включают бензоат натрия, сорбиновую кислоту и сложные эфиры п-гидроксиоксибензойной кислоты. Могут быть также использованы антиоксиданты и суспендирующие вещества.Preservatives, stabilizers, colorants and even flavoring agents may be present in the pharmaceutical composition. Examples of preservatives include sodium benzoate, sorbic acid, and p-hydroxyoxybenzoic acid esters. Antioxidants and suspending agents may also be used.

К композиции/препарату могут предъявляться разные требования в зависимости от разных систем доставки. В качестве примера можно отметить, что фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть предназначена для введения при помощи мини-насоса или через слизистую оболочку, например, в виде распыляемого в нос раствора, аэрозоля для ингаляции, принимаемого внутрь раствора или для парентерального введения, в соответствии с которым композиция представляет собой инъекционный препарат, предназначенный для внутривенной, внутримышечной или подкожной доставки. Альтернативно препарат может быть предназначен для введения несколькими способами.The composition / preparation may have different requirements depending on different delivery systems. As an example, it can be noted that the pharmaceutical composition of the present invention can be intended for administration by mini-pump or through the mucous membrane, for example, in the form of a solution sprayed into the nose, inhalation aerosol, oral solution or for parenteral administration, in accordance with which the composition is an injectable preparation intended for intravenous, intramuscular or subcutaneous delivery. Alternatively, the preparation may be intended for administration in several ways.

Лекарственное средство, предназначенное для введения через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, должно оставаться устойчивым при перемещении по желудочно-кишечному тракту; например оно должно быть устойчиво к протеолитическому разложению, кислотному показателю рН и детергентному действию желчи.A drug intended for administration through the mucous membrane of the gastrointestinal tract must remain stable when moving along the gastrointestinal tract; for example, it must be resistant to proteolytic degradation, acid pH and the detergent action of bile.

Фармацевтические композиции можно вводить путем ингаляции, в форме анальных или вагинальных суппозиториев, местно в форме лосьона, раствора, крема, мази или тонкого порошка, при помощи кожного пластыря, перорально в форме таблеток, содержащих наполнители, такие как крахмал или лактоза, капсул или шариков отдельно или в смеси с наполнителями, в форме эликсиров, растворов или суспензий, содержащих ароматизаторы или красители, либо в виде парентеральных инъекций, таких как внутривенные, внутримышечные или подкожные инъекции. Композиции для парентерального введения можно использовать в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например соли или моносахариды, позволяющие сделать раствор изотоническим в отношении крови. Композицию для трансбуккального или подъязычного введения можно вводить в форме таблеток или лепешек, которые могут быть получены известными методами.The pharmaceutical compositions can be administered by inhalation, in the form of anal or vaginal suppositories, topically in the form of a lotion, solution, cream, ointment or fine powder, with a skin patch, orally in the form of tablets containing excipients such as starch or lactose, capsules or balls alone or in a mixture with excipients, in the form of elixirs, solutions or suspensions containing flavorings or colorings, or as parenteral injections, such as intravenous, intramuscular or subcutaneous injections. Compositions for parenteral administration can be used in the form of a sterile aqueous solution, which may contain other substances, for example salts or monosaccharides, which make the solution isotonic with respect to blood. The composition for buccal or sublingual administration may be administered in the form of tablets or lozenges, which can be prepared by known methods.

Клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид по настоящему изобретениюCloning a nucleotide sequence encoding a polypeptide of the present invention

Нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфическими свойствами, представленными в данном описании изобретения, или полипептид, пригодный для модификации, можно выделить из любой клетки или организма, продуцирующего указанный полипептид. В данной области хорошо известны разные методы выделения нуклеотидных последовательностей.The nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties presented in this description of the invention, or a polypeptide suitable for modification, can be isolated from any cell or organism producing the specified polypeptide. Various methods for isolating nucleotide sequences are well known in the art.

Например, библиотеку геномных ДНК и/или кДНК можно создать, используя хромосомную ДНК или матричную РНК из организма, продуцирующего данный полипептид. Если известна аминокислотная последовательность полипептида, можно синтезировать меченые олигонуклеотидные зонды и использовать их для идентификации полипептидкодирующих клонов из геномной библиотеки, полученной из данного организма. Альтернативно для идентификации полипептидкодирующих клонов можно использовать меченый олигонуклеотидный зонд, содержащий последовательности, гомологичные другому известному гену полипептида. В последнем случае используют менее строгие условия гибридизации и промывки.For example, a library of genomic DNA and / or cDNA can be created using chromosomal DNA or messenger RNA from an organism producing the given polypeptide. If the amino acid sequence of the polypeptide is known, labeled oligonucleotide probes can be synthesized and used to identify polypeptide-coding clones from a genomic library obtained from a given organism. Alternatively, a labeled oligonucleotide probe containing sequences homologous to another known polypeptide gene can be used to identify polypeptide-encoding clones. In the latter case, less stringent hybridization and washing conditions are used.

Альтернативно полипептидкодирующие клоны можно идентифицировать путем вставки фрагментов геномной ДНК в экспрессирующий вектор, такой как плазмида, трансформирующий ферментотрицательные бактерии при помощи полученной библиотеки геномных ДНК, и последующего культивирования трансформированных бактерий на агаре, содержащем фермент, ингибированный полипептидом, благодаря чему можно идентифицировать клоны, экспрессирующие данный полипептид.Alternatively, polypeptide-encoding clones can be identified by inserting genomic DNA fragments into an expression vector, such as a plasmid transforming enzyme-negative bacteria using the resulting genomic DNA library, and then culturing the transformed bacteria on agar containing an enzyme inhibited by the polypeptide, so that clones expressing this polypeptide can be identified polypeptide.

В соответствии с другой альтернативой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, можно синтезировать известными стандартными методами, например методом на основе фосфорамидита, описанным в публикации Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, стр. 1859-1869, или методом, описанным в публикации Matthes et al (1984) EMBO J. 3, стр. 801-805. При использовании метода на основе фосфорамидита олигонуклеотиды синтезируют в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в соответствующих векторах.According to another alternative, the nucleotide sequence encoding the polypeptide can be synthesized by known standard methods, for example, the phosphoramidite-based method described in Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, pp. 1859-1869, or by the method described in Matthes et al (1984) EMBO J. 3, pp. 801-805. When using the phosphoramidite-based method, oligonucleotides are synthesized in an automatic DNA synthesizer, purified, annealed, ligated and cloned in the corresponding vectors.

Нуклеотидная последовательность может иметь смешанное геномное и синтетическое происхождение, смешанное синтетическое и кДНК происхождение или смешанное геномное и кДНК происхождение и может быть получена лигированием фрагментов синтетического, геномного или кДНК происхождения (в соответствии с требованием) стандартными методами. Каждый лигированный фрагмент соответствует разным частям всей нуклеотидной последовательности. Последовательность ДНК можно также получить при помощи полимеразной реакции синтеза цепи (PCR), используя специфические затравки, например, описанные в патенте США № 4683202 или в публикации Saiki R.K. et al. (Science (1988) 239, стр. 487-491).The nucleotide sequence can be of mixed genomic and synthetic origin, mixed synthetic and cDNA origin, or mixed genomic and cDNA origin and can be obtained by ligation of fragments of synthetic, genomic or cDNA origin (as required) by standard methods. Each ligated fragment corresponds to different parts of the entire nucleotide sequence. The DNA sequence can also be obtained using the polymerase chain synthesis reaction (PCR), using specific seeds, for example, described in US patent No. 4683202 or in the publication Saiki R.K. et al. (Science (1988) 239, pp. 487-491).

Нуклеотидные последовательностиNucleotide sequences

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, кодирующим полипептиды, обладающие описанными здесь специфическими свойствами. Термин “нуклеотидная последовательность” в используемом здесь значении означает олигонуклеотидную последовательность или полинуклеотидную последовательность, а также ее варианты, гомологи, фрагменты и их производные (в частности, их части). Нуклеотидная последовательность может быть геномной, синтетической или рекомбинантной, двухцепочечной или одноцепочечной, представляя смысловую или антисмысловую цепь.The present invention also relates to nucleotide sequences encoding polypeptides having the specific properties described herein. The term "nucleotide sequence" as used here means an oligonucleotide sequence or polynucleotide sequence, as well as its variants, homologues, fragments and their derivatives (in particular, parts thereof). The nucleotide sequence may be genomic, synthetic or recombinant, double-stranded or single-stranded, representing a sense or antisense strand.

Термин “нуклеотидная последовательность” применительно к настоящему изобретению означает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК. Нуклеотидная последовательность предпочтительно означает ДНК, более предпочтительно кДНК для кодирующей последовательности.The term “nucleotide sequence” as used in the present invention means genomic DNA, cDNA, synthetic DNA and RNA. The nucleotide sequence preferably means DNA, more preferably cDNA, for the coding sequence.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения в определение нуклеотидной последовательности, per se кодирующей полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, не входит нативная нуклеотидная последовательность в естественном окружении, в котором она естественно связана с другими последовательностями, присутствующими в ее естественном окружении. Для простоты понимания данный предпочтительный вариант будет именоваться “ненативной нуклеотидной последовательностью”. В этой связи термин “нативная нуклеотидная последовательность” означает всю нуклеотидную последовательность, находящуюся в своем естественном окружении, причем в естественное окружение входит весь промотор, с которым функционально связана данная последовательность. Таким образом, полипептид по настоящему изобретению может быть экспрессирован нуклеотидной последовательностью в природном организме, где нуклеотидная последовательность не находится под контролем промотора, с которым она естественно связана в данном организме.In a preferred embodiment, the definition of a nucleotide sequence per se encoding a polypeptide having the specific properties described herein does not include a native nucleotide sequence in a natural environment in which it is naturally linked to other sequences present in its natural environment. For ease of understanding, this preferred embodiment will be referred to as a “non-native nucleotide sequence”. In this regard, the term “native nucleotide sequence” means the entire nucleotide sequence in its natural environment, and the whole promoter with which this sequence is functionally linked enters the natural environment. Thus, the polypeptide of the present invention can be expressed by a nucleotide sequence in a natural organism, where the nucleotide sequence is not under the control of the promoter with which it is naturally associated in this organism.

Указанный полипептид предпочтительно не является нативным полипептидом. В этой связи термин “нативный полипептид” означает весь полипептид, находящийся в своем естественном окружении и экспрессированный нативной нуклеотидной последовательностью.The specified polypeptide is preferably not a native polypeptide. In this regard, the term “native polypeptide” means the entire polypeptide located in its natural environment and expressed by the native nucleotide sequence.

Нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды, обладающие описанными здесь специфическими свойствами, обычно получают методами рекомбинантных ДНК (то есть с помощью рекомбинантной ДНК). Однако в альтернативном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность может быть полностью или частично синтезирована химическими методами, хорошо известными в данной области (см. публикации Caruthers M.H. et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 и Horn T. et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).The nucleotide sequence encoding the polypeptides having the specific properties described herein is usually obtained by recombinant DNA methods (i.e., using recombinant DNA). However, in an alternative embodiment, the nucleotide sequence can be fully or partially synthesized by chemical methods well known in the art (see Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T. et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

Молекулярная эволюцияMolecular evolution

После выделения кодирующей фермент нуклеотидной последовательности или идентификации предполагаемой кодирующей фермент нуклеотидной последовательности может быть желательно модифицировать выбранную нуклеотидную последовательность, например может быть желательно мутировать последовательность с целью получения фермента по настоящему изобретению.After isolation of the nucleotide sequence encoding the enzyme or identification of the putative nucleotide sequence encoding the enzyme, it may be desirable to modify the selected nucleotide sequence, for example, it may be desirable to mutate the sequence to obtain the enzyme of the present invention.

Мутации могут быть введены при помощи синтетических олигонуклеотидов. Указанные олигонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, фланкирующие требуемые сайты мутации.Mutations can be introduced using synthetic oligonucleotides. These oligonucleotides contain nucleotide sequences flanking the desired mutation sites.

Приемлемый метод описан в публикации Morinaga et al. (Biotechnology (1984) 2, стр. 646-649). Другой метод введения мутаций в кодирующие фермент нуклеотидные последовательности описан в публикации Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, стр. 147-151).A suitable method is described in Morinaga et al. (Biotechnology (1984) 2, pp. 646-649). Another method for introducing mutations into enzyme coding nucleotide sequences is described in Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, pp. 147-151).

Вместо сайтнаправленного мутагенеза, аналогичного описанному выше, можно произвести неспецифическое введение мутаций, используя коммерческий набор, в частности набор для мутагенеза методом PCR GeneMorph компании Stratagene или набор для неспецифического мутагенеза методом PCR Diversify компании Clontech. В европейском патенте № 0583265 описаны методы оптимизации мутагенеза на основе PCR, которые могут быть также объединены с использованием мутагенных аналогов ДНК, подобных описанным в европейском патенте № 0866796. Допускающие возможность ошибки методы на основе PCR пригодны для получения вариантов липидацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками. В заявке WO 0206457 рассмотрена молекулярная эволюция липаз.Instead of site-directed mutagenesis similar to that described above, nonspecific mutation can be performed using a commercial kit, in particular Stratagene's PCR GeneMorph mutagenesis kit or Clontech's PCR Diversify mutagenesis kit. European Patent No. 0583265 describes methods for optimizing PCR-based mutagenesis, which can also be combined using mutagenic DNA analogues similar to those described in European Patent No. 0866796. Error-prone PCR-based methods are suitable for producing lipid acyltransferases with preferred characteristics. WO 0206457 discloses the molecular evolution of lipases.

Третьим методом получения новых последовательностей является фрагментация неидентичных нуклеотидных последовательностей с использованием любого числа рестрикционных ферментов или такого фермента как ДНКаза I, и повторная сборка полных нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональные белки. Альтернативно можно использовать одну или несколько неидентичных нуклеотидных последовательностей и вводить мутации во время повторной сборки полной нуклеотидной последовательности. Методы перестановки ДНК или членов семейств пригодны для получения вариантов липидацилтрансфераз с предпочтительными характеристиками. Приемлемые методы выполнения “перестановки” рассмотрены в европейских патентах №№ 0752008, 1138763, 1103606. Перестановка может быть объединена с другими формами мутагенеза ДНК, описанными в патенте США № 6180406 и заявке WO 01/34835.A third method for generating new sequences is the fragmentation of non-identical nucleotide sequences using any number of restriction enzymes or an enzyme such as DNase I, and the reassembly of complete nucleotide sequences encoding functional proteins. Alternatively, one or more non-identical nucleotide sequences can be used and mutations introduced during reassembly of the complete nucleotide sequence. DNA or family rearrangement methods are suitable for preparing lipid acyltransferase variants with preferred characteristics. Acceptable methods for performing “permutation” are discussed in European patents Nos. 0752008, 1138763, 1103606. Permutation can be combined with other forms of DNA mutagenesis described in US Pat. No. 6,180,406 and WO 01/34835.

Таким образом можно ввести многочисленные сайтнаправленные или неспецифические мутации в нуклеотидную последовательность in vivo или in vitro и затем разными способами произвести скрининг с целью выявления улучшенных функциональных свойств кодированного полипептида. Используя методы силико- и экзоопосредованной рекомбинации (см. заявку WO 00/58517, патент США № 6344328, патент США № 6361974), можно произвести молекулярную эволюцию, в результате которой полученный вариант сохраняет очень слабую гомологию с известными ферментами или белками. Такие варианты могут характеризоваться значительной структурной аналогией с известными ферментами трансферазы и при этом могут обладать очень слабой гомологией с аминокислотной последовательностью.In this way, numerous site-directed or non-specific mutations can be introduced into the nucleotide sequence in vivo or in vitro and then screened in various ways to identify improved functional properties of the encoded polypeptide. Using methods of silicone and exo-mediated recombination (see application WO 00/58517, US patent No. 6344328, US patent No. 6361974), molecular evolution can be performed, as a result of which the resulting variant retains very weak homology with known enzymes or proteins. Such variants may be characterized by significant structural analogy with known transferase enzymes and may have very weak homology with the amino acid sequence.

Кроме того, мутации или естественные варианты полинуклеотидной последовательности могут быть рекомбинированы с последовательностями дикого типа, другими мутациями или естественными вариантами с целью получения новых вариантов. Такие новые варианты также могут быть подвергнуты скринингу для выявления улучшенных функциональных свойств кодированного полипептида.In addition, mutations or natural variants of the polynucleotide sequence can be recombined with wild-type sequences, other mutations or natural variants in order to obtain new variants. Such new variants may also be screened to detect improved functional properties of the encoded polypeptide.

Применение вышеуказанных и подобных методов молекулярной эволюции позволяет идентифицировать и отобрать варианты ферментов по настоящему изобретению, обладающие предпочтительными характеристиками без какого-либо предварительного знания структуры или функции белка, и получить непрогнозируемые, но полезные мутации или варианты. В данной области существует много примеров применения молекулярной эволюции для оптимизации или изменения активности фермента, которые включают, не ограничиваясь ими, нижеследующие применения: оптимизированная экспрессия и/или активность в клетке-хозяине или in vitro, повышенная ферментативная активность, измененный субстрат и/или специфичность продукта, повышенная или пониженная ферментативная или структурная устойчивость, измененная ферментативная активность/специфичность в предпочтительных окружающих условиях, таких как температура, рН, субстрат.The use of the above and similar methods of molecular evolution allows the identification and selection of variants of the enzymes of the present invention that have preferred characteristics without any prior knowledge of the structure or function of the protein, and to obtain unpredictable, but useful mutations or variants. There are many examples in the art of using molecular evolution to optimize or alter enzyme activity, which include, but are not limited to, the following applications: optimized expression and / or activity in a host cell or in vitro , increased enzymatic activity, altered substrate and / or specificity product, increased or decreased enzymatic or structural stability, altered enzymatic activity / specificity in preferred environmental conditions, such as temperature cheers, pH, substrate.

Как должно быть понятно специалисту в данной области, при помощи средств молекулярной эволюции фермент можно изменить с достижением лучших функциональных свойств данного фермента.As should be clear to a person skilled in the art, by means of molecular evolution, the enzyme can be changed to achieve the best functional properties of the enzyme.

Липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может предтавлять собой вариант, то есть может содержать по крайней мере одну замену, делецию или добавление аминокислоты по сравнению с исходным ферментом. Варианты ферментов остаются гомологичными исходному ферменту по крайней мере на 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%. Приемлемые исходные ферменты могут включать любой фермент, обладающий эстеразной или липазной активностью. Исходный фермент предпочтительно соответствует согласованной последовательности pfam00657.The lipid acyltransferase of the present invention may be a variant, that is, it may contain at least one substitution, deletion or addition of an amino acid compared to the parent enzyme. Enzyme variants remain homologous to the original enzyme by at least 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 95%, 97%, 99%. Suitable starting enzymes may include any enzyme having esterase or lipase activity. The starting enzyme preferably corresponds to the agreed sequence pfam00657.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант фермента липидацилтрансферазы сохраняет или включает по крайней мере один или несколько аминокислотных остатков согласованной последовательности pfam00657, встречающихся в блоках GDSX, GANDY и НРТ.In a preferred embodiment, a variant of the lipid acyltransferase enzyme stores or comprises at least one or more amino acid residues of the coordinated sequence pfam00657 found in GDSX, GANDY and HPT blocks.

Ферменты, такие как липазы, не обладающие активностью липидацилтрансферазы или обладающие низкой активностью указанного фермента в водной среде, могут быть мутированы методами молекулярной эволюции с целью сообщения или усиления трансферазной активности, что позволяет получить фермент липидацилтрансферазу, обладающий значительной трансферазной активностью, который пригоден для использования в композициях и способах по настоящему изобретению.Enzymes, such as lipases, which do not have lipid acyltransferase activity or have a low activity of this enzyme in an aqueous medium, can be mutated by molecular evolution methods to communicate or enhance transferase activity, which allows one to obtain a lipid acyltransferase enzyme with significant transferase activity, which is suitable for use in compositions and methods of the present invention.

Липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в данном изобретении, может представлять собой вариант с повышенной ферментативной активностью в отношении полярных липидов, предпочтительно фосфолипидов и/или гликолипидов, по сравнению с исходным ферментом. Такие варианты предпочтительно обладают низкой активностью или вообще не обладают активностью в отношении полярных лизолипидов. Повышенная активность в отношении полярных липидов, фосфолипидов и/или гликолипидов может быть результатом гидролиза и/или трансферазной активности либо их комбинации.Lipid acyltransferase intended for use in this invention may be a variant with increased enzymatic activity against polar lipids, preferably phospholipids and / or glycolipids, compared to the starting enzyme. Such variants preferably have low activity or no activity against polar lysolipids. Increased activity against polar lipids, phospholipids and / or glycolipids may result from hydrolysis and / or transferase activity, or a combination thereof.

Вариантные липидацилтрансферазы, предназначенные для использования в данном изобретении, могут обладать пониженной активностью в отношении триглицеридов, моноглицеридов и/или диглицеридов по сравнению с исходным ферментом.Variant lipid acyltransferases for use in the present invention may have reduced activity against triglycerides, monoglycerides and / or diglycerides compared to the parent enzyme.

Вариантный фермент может не обладать активностью в отношении триглицеридов, моноглицеридов и/или диглицеридов.A variant enzyme may not have activity against triglycerides, monoglycerides and / or diglycerides.

Альтернативно вариантный фермент, предназначенный для использования в данном изобретении, может обладать повышенной активностью в отношении триглицеридов и/или может также обладать повышенной активностью в отношении одного или нескольких нижеследующих веществ, таких как полярные липиды, фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин, гликолипиды, дигалактозилмоноглицерид, моногалактозилмоноглицерид.Alternatively, the variant enzyme for use in this invention may have increased activity against triglycerides and / or may also have increased activity against one or more of the following substances, such as polar lipids, phospholipids, lecithin, phosphatidylcholine, glycolipids, digalactosylmonoglyceride, monogaliceride .

Известны варианты липидацилтрансфераз, и один или несколько таких вариантов могут быть пригодны для использования в способах и применениях по данному изобретению. Например, варианты липидацилтрансфераз описаны в нижеследующих ссылках:Variants of lipid acyltransferases are known, and one or more of such variants may be suitable for use in the methods and applications of this invention. For example, lipid acyltransferase variants are described in the following references:

Hilton S, Buckley JT. Studies on the reaction mechanism of a microbial lipase/acyltransferase using chemical modification and site-directed mutagenesis J. Biol. Chem. 1991 Jan 15; 266(2):997-1000.Hilton S, Buckley JT. Studies on the reaction mechanism of a microbial lipase / acyltransferase using chemical modification and site-directed mutagenesis J. Biol. Chem. 1991 Jan 15; 266 (2): 997-1000.

Robertson DL, Hilton S, Wong KR, Koepke A, Buckley JT. Influence of active site and tyrosine modification on the secretion and activity of the Aeromonas hydrophila lipase/acyltransferase. J Biol Chem. 1994 Jan 21; 269(3):2146-50.Robertson DL, Hilton S, Wong KR, Koepke A, Buckley JT. Influence of active site and tyrosine modification on the secretion and activity of the Aeromonas hydrophila lipase / acyltransferase. J Biol Chem. 1994 Jan 21; 269 (3): 2146-50.

Brumlik MJ, Buckley JT.Identification of the catalytic triad of the lipase/acyltransferase from Aeromonas hydrophila. J Bacteriol. 1996 Apr; 178(7):2060-4.Brumlik MJ, Buckley JT. Identification of the catalytic triad of the lipase / acyltransferase from Aeromonas hydrophila. J Bacteriol. 1996 Apr; 178 (7): 2060-4.

Peelman F, Vinaimont N, Verhee A, Vanloo B, Verschelde JL, Labeur C, Seguret-Mace S, Duverger N, Hutchinson G, Vandekerckhove J, Tavernier J, Rosseneu M. A proposed architecture for lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT): identification of the catalytic triad and molecular modeling. Protein Sci. 1998 Mar; 7(3):587-99.Peelman F, Vinaimont N, Verhee A, Vanloo B, Verschelde JL, Labeur C, Seguret-Mace S, Duverger N, Hutchinson G, Vandekerckhove J, Tavernier J, Rosseneu M. A proposed architecture for lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT): identification of the catalytic triad and molecular modeling. Protein Sci. 1998 Mar; 7 (3): 587-99.

Аминокислотные последовательностиAmino Acid Sequences

Настоящее изобретение относится также к аминокислотным последовательностям полипептидов, обладающих специфическими свойствами, представленными в данном описании изобретения.The present invention also relates to amino acid sequences of polypeptides having the specific properties described herein.

В используемом здесь значении термин “аминокислотная последовательность” синонимичен термину “полипептид” и/или термину “белок”. В некоторых случаях термин “аминокислотная последовательность” синонимичен термину “пептид”.As used herein, the term “amino acid sequence” is synonymous with the term “polypeptide” and / or the term “protein”. In some cases, the term “amino acid sequence” is synonymous with the term “peptide”.

Аминокислотную последовательность можно получить/выделить из приемлемого источника, синтезировать или получить методами рекомбинантных ДНК.Amino acid sequence can be obtained / isolated from an acceptable source, synthesized or obtained by recombinant DNA methods.

Аминокислотные последовательности можно получить стандартными методами из выделенных полипептидов, рассмотренных в данном описании изобретения.Amino acid sequences can be obtained by standard methods from the isolated polypeptides contemplated herein.

Один приемлемый метод определения аминокислотных последовательностей из выделенных полипептидов заключается в следующем.One acceptable method for determining amino acid sequences from isolated polypeptides is as follows.

Очищенный полипептид высушивают вымораживанием и 100 мкг высушенного вымораживанием материала растворяют в 50 мкл смеси 8М мочевины и 0,4М гидрокарбоната аммония, рН 8,4. Растворенный белок денатурируют и восстанавливают в течение 15 минут при 50°С, затем помещают в атмосферу азота и добавляют 5 мкл 45 мМ дитио-треитола. Смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют 5 мкл 100 мМ иодацетамида для замены остатков цистеины в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте в атмосфере азота.The purified polypeptide is freeze-dried and 100 μg of the freeze-dried material is dissolved in 50 μl of a mixture of 8M urea and 0.4M ammonium bicarbonate, pH 8.4. The dissolved protein is denatured and reduced for 15 minutes at 50 ° C, then placed in a nitrogen atmosphere and 5 μl of 45 mM dithio-threitol are added. The mixture was cooled to room temperature and 5 μl of 100 mM iodoacetamide was added to replace cysteine residues for 15 minutes at room temperature in the dark under nitrogen atmosphere.

К вышеуказанной реакционной смеси добавляют 135 мкл воды и 5 мкг эндопротеиназы Lys-C в 5 мкл воды и гидролизуют смесь при 37°С в атмосфере азота в течение 24 часов.To the above reaction mixture, 135 μl of water and 5 μg of Lys-C endoproteinase are added to 5 μl of water, and the mixture is hydrolyzed at 37 ° C. under nitrogen for 24 hours.

Полученные пептиды отделяют при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой в колонке VYDAC C18 (0,46х15 см; 10 мкм; The Separation Group, California, USA), используя растворитель А: 0,1% ТФУ в воде и растворитель В: 0,1% ТФУ в ацетонитриле. Отобранные пептиды повторно хроматографируют в колонке Develosil C18, используя такую же систему растворителей, и затем секвенируют N-конец. Секвенирование можно произвести в секвенаторе 476А компании Applied Biosystems, используя быстрые циклы импульсно-меченой жидкости в соответствии с инструкциями изготовителя (Applied Biosystems, California, USA).The resulting peptides were separated by reverse phase HPLC on a VYDAC C18 column (0.46 x 15 cm; 10 μm; The Separation Group, California, USA) using solvent A: 0.1% TFA in water and solvent B: 0.1% TFA in acetonitrile. The selected peptides are rechromatographed on a Develosil C18 column using the same solvent system, and then the N-terminus is sequenced. Sequencing can be performed on an Applied Biosystems 476A sequencer using fast pulsed-labeled fluid cycles in accordance with the manufacturer's instructions (Applied Biosystems, California, USA).

Идентичность или гомологичность последовательностейSequence identity or homology

Настоящее изобретение относится также к использованию последовательностей с определенной степенью идентичности или гомологии аминокислотным последовательностям полипептида, обладающего описанными здесь специфическими свойствами, или любой нуклеотидной последовательности, кодирующей такой полипептид (далее именуемая “гомологичная последовательность”). Термин “гомолог” в используемом здесь значении означает структурную единицу, обладающую определенной гомологией с аминокислотными последовательностями и нуклеотидными последовательностями, являющимися объектами данного изобретения. Термин “гомология” может быть аналогичен термину “идентичность”.The present invention also relates to the use of sequences with a certain degree of identity or homology to the amino acid sequences of a polypeptide having the specific properties described herein, or any nucleotide sequence encoding such a polypeptide (hereinafter referred to as “homologous sequence”). The term “homologue” as used herein means a structural unit having a defined homology with the amino acid sequences and nucleotide sequences that are the subject of this invention. The term “homology” may be similar to the term “identity”.

Гомологичная аминокислотная последовательность и/или нуклеотидная последовательность должна представлять и/или кодировать полипептид, сохраняющий функциональную активность и/или повышающий активность фермента.A homologous amino acid sequence and / or nucleotide sequence should represent and / or encode a polypeptide that retains functional activity and / or increases the activity of the enzyme.

В контексте настоящего изобретения гомологичная последовательность означает аминокислотную последовательность, которая может быть по крайней мере на 75%, 85% или 90% идентична, предпочтительно по крайней мере на 95% или 98% идентична последовательности по настоящему изобретению. Гомологи обычно содержат такие же активные сайты и т.д., что и аминокислотная последовательность по данному изобретению. Хотя гомологию можно также рассматривать с точки зрения сходства (то есть аминокислотных остатков, обладающих подобными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения гомология предпочтительно выражена в виде идентичности последовательностей.In the context of the present invention, a homologous sequence means an amino acid sequence that may be at least 75%, 85% or 90% identical, preferably at least 95% or 98% identical to the sequence of the present invention. Homologs typically contain the same active sites, etc., as the amino acid sequence of this invention. Although homology can also be considered in terms of similarity (i.e., amino acid residues having similar chemical properties / functions), in the context of the present invention, homology is preferably expressed as sequence identity.

В контексте настоящего изобретения гомологичная последовательность означает нуклеотидную последовательность, которая может быть по крайней мере на 75%, 85% или 90% идентична, предпочтительно по крайней мере на 95% или 98% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид по настоящему изобретению (последовательность, являющаяся объектом изобретения). Гомологами обычно являются последовательности, кодирующие такие же активные сайты и т.д., что и последовательность, являющаяся объектом изобретения. Хотя гомологию можно также рассматривать с точки зрения сходства (то есть аминокислотных остатков, обладающих подобными химическими свойствами/функциями), в контексте настоящего изобретения гомология предпочтительно выражена в виде идентичности последовательностей.In the context of the present invention, a homologous sequence means a nucleotide sequence that may be at least 75%, 85% or 90% identical, preferably at least 95% or 98% identical to the nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention (a sequence that is the subject of the invention). Homologs are usually sequences encoding the same active sites, etc., as the sequence that is the subject of the invention. Although homology can also be considered in terms of similarity (i.e., amino acid residues having similar chemical properties / functions), in the context of the present invention, homology is preferably expressed as sequence identity.

Гомологию можно сравнить приблизительно или, как правило, при помощи легко доступных программ сравнения последовательностей. Указанные коммерчески доступные компьютерные программы могут высчитать % гомологии у двух или более последовательностей.Homology can be compared approximately or, as a rule, using readily available sequence comparison programs. These commercially available computer programs can calculate% homology in two or more sequences.

Процентное значение (%) гомологии можно вычислить для смежных последовательностей, при этом одна последовательность сравнивается с другой последовательностью и каждая аминокислота в одной последовательности непосредственно сравнивается остаток за остатком с соответствующей аминокислотой в другой последовательности. Такое сравнение называется сравнением “без пробелов”. Сравнения без пробелов обычно выполняют лишь в отношении относительно небольшого числа остатков.The percentage value (%) of homology can be calculated for adjacent sequences, with one sequence being compared with another sequence and each amino acid in one sequence directly comparing residue by residue with the corresponding amino acid in another sequence. Such a comparison is called a “no space” comparison. Comparisons without spaces are usually performed only with respect to a relatively small number of residues.

Хотя данный метод является очень простым и сопоставимым, он не принимает во внимание то, что, например, в идентичной паре последовательностей одна инсерция или делеция может вывести из сравнения указанные аминокислотные остатки, в результате чего происходит значительное уменьшение процентного значения (%) гомологии при выполнении глобального сравнения. Поэтому большинство методов сравнения последовательностей направлены на достижение оптимального сравнения, при котором учитываются все возможные инсерции и делеции без необоснованного начисления штрафных очков при определении общей гомологии. Такой результат достигается путем введения “пробелов” в сравниваемую последовательность для достижения максимальной локальной гомологии.Although this method is very simple and comparable, it does not take into account the fact that, for example, in an identical pair of sequences, one insertion or deletion can deduce the indicated amino acid residues from the comparison, resulting in a significant decrease in the percentage (%) of homology when performed global comparison. Therefore, most methods for comparing sequences are aimed at achieving an optimal comparison, which takes into account all possible insertions and deletions without unreasonable calculation of penalty points in determining the overall homology. This result is achieved by introducing “gaps” in the sequence being compared to achieve maximum local homology.

Однако при выполнении указанных более сложных методов присваиваются “штрафные очки” за каждый пробел, обнаруживаемый при сравнении, в результате чего при наличии одинакового числа идентичных аминокислот последовательность, имеющая как можно меньше пробелов, отражающих более высокое сродство между двумя сравниваемыми последовательностями, получает более высокую оценку, чем последовательность, имеющая много пробелов. Обычно используют “оценки связанных пробелов”, на основании которых присваивают относительно высокие баллы за существование пробела и меньшие штрафные очки за каждый последующий остаток в данном пробеле. Такова наиболее широко используемая система оценки пробелов. Высокие штрафные очки за пробел, несомненно, позволяют получить оптимальные сравнения с меньшим числом пробелов. Большинство программ сравнения позволяют изменять штрафные очки, начисляемые за пробелы. Однако желательно использовать значения по умолчанию, существующие в программах сравнения последовательностей. Например, в пакете программ GCG Wisconsin Bestfit штрафные очки по умолчанию, начисляемые за пробел в аминокислотных последовательностях, составляют -12 за пробел и -4 за каждый последующий остаток.However, when performing these more complicated methods, “penalty points” are assigned for each gap found during the comparison, as a result of which, with the same number of identical amino acids, a sequence having as few spaces as possible reflecting a higher affinity between the two compared sequences gets a higher rating than a sequence having many spaces. Usually, “bound gap estimates” are used, based on which they assign relatively high points for the existence of a gap and lower penalty points for each subsequent remainder in this gap. This is the most widely used gap rating system. High penalty points for the gap, of course, allow you to get optimal comparisons with fewer spaces. Most comparison programs allow you to change the penalty points awarded for spaces. However, it is advisable to use the default values that exist in sequence comparison programs. For example, in the GCG Wisconsin Bestfit software package, the default penalty points awarded for a gap in amino acid sequences are -12 for a gap and -4 for each subsequent remainder.

Поэтому вычисление максимальной % гомологии прежде всего требует выполнения оптимального сравнения с учетом штрафных очков за пробелы. Приемлемой компьютерной программой для выполнения такого сравнения является пакет программ GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al., 1984, Nuc. Acids Research 12, стр. 387). Примеры других программ, которые могут выполнять сравнение последовательностей, включают, не ограничиваясь ими, пакет программ BLAST (см. публикацию Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, 4^th Ed - Chapter 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 403-410) и комплект программ сравнения GENEWORKS. Программы BLAST и FASTA предназначены для поиска в автономном и интерактивном режиме (см. публикацию Ausubel et al., 1999, стр. 7-58, 7-60). Однако в некоторых применениях желательно использовать программу GCG Bestfit. Кроме того, существует новая программа, именуемая BLAST 2 Sequences, предназначенная для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (см. публикацию FEMS Microbiol Lett 1999, 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett, 1999 177(1): 187-8 и mailto:[email protected]).Therefore, the calculation of the maximum% homology primarily requires an optimal comparison taking into account the penalty points for spaces. An acceptable computer program for performing such a comparison is the GCG Wisconsin Bestfit software package (Devereux et al., 1984, Nuc. Acids Research 12, p. 387). Examples of other programs that can perform sequence comparisons include, but are not limited to, the BLAST software package (see Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, 4 ^th Ed - Chapter 18), FASTA (Altschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 403-410) and a set of comparison programs GENEWORKS. The BLAST and FASTA programs are designed for offline and interactive searches (see Ausubel et al., 1999, pp. 7-58, 7-60). However, in some applications, it is desirable to use the GCG Bestfit program. In addition, there is a new program called BLAST 2 Sequences designed to compare protein and nucleotide sequences (see FEMS Microbiol Lett 1999, 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett, 1999 177 (1): 187-8 and mailto: [email protected]).

Хотя конечную % гомологию можно измерить в виде идентичности, процесс сравнения обычно не основывается на сравнении пар оснований по принципу “все или ничего”. Вместо этого обычно используют масштабированную матрицу оценок сходства, в соответствии с которой оценки начисляются за каждое попарное сравнение на основании химического сходства или эволюционного расхождения. Примером обычно используемой матрицы может служить матрица BLOSUM62, которая является матрицей по умолчанию для комплекта программ BLAST. В программах GCG Wisconsin обычно использованы общедоступные значения по умолчанию или таблица сравнения обычных символов, если она имеется (см. руководство пользователя для более подробного ознакомления c программами). В некоторых применениях желательно использовать общедоступные значения по умолчанию для пакета программ GCG или в случае других программ матрицу по умолчанию, такую как BLOSUM62.Although the final% homology can be measured in the form of identity, the comparison process is usually not based on a comparison of base pairs on an all-or-nothing basis. Instead, they usually use a scaled matrix of similarity ratings, according to which ratings are awarded for each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary discrepancy. An example of a commonly used matrix is the BLOSUM62 matrix, which is the default matrix for the BLAST software suite. GCG Wisconsin programs typically use public defaults or a simple character comparison table, if available (see the user manual for more information on the programs). In some applications, it is desirable to use the public default values for the GCG software package or, in the case of other programs, a default matrix such as BLOSUM62.

Альтернативно процентное значение гомологии можно высчитать, используя функцию множественного сравнения в программе DNASIS™ (Hitachi Software), основанную на алгоритме, аналогичном программе CLUSTAL (Higgins D.G. & Sharp P.M. (1988), Gene 73(1), 237-244).Alternatively, the percent homology can be calculated using the multiple comparison function in the DNASIS ™ program (Hitachi Software), based on an algorithm similar to the CLUSTAL program (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244).

После выполнения программой оптимального сравнения можно высчитать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательностей. Программы обычно выполняют такие вычисления в виде части сравнения последовательностей и выдает числовой результат.After the program performs an optimal comparison,% homology, preferably% sequence identity, can be calculated. Programs typically perform such calculations as part of a sequence comparison and produce a numerical result.

Последовательности могут также иметь делеции, инсерции или замены аминокислотных остатков, которые вызывают молчащую замену и позволяют получить функционально эквивалентное вещество. Целенаправленные замены аминокислот можно производить на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера остатков при сохранении вторичной активности связывания вещества. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, обладающие схожими значениями гидрофильности, включают лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.The sequences may also have deletions, insertions, or substitutions of amino acid residues that cause silent substitution and produce a functionally equivalent substance. Targeted amino acid substitutions can be made based on the similarity of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and / or amphipathic nature of the residues while maintaining the secondary activity of binding of the substance. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid; positively charged amino acids include lysine and arginine; and amino acids with uncharged polar head groups having similar hydrophilicity values include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine and tyrosine.

Замены консервативных аминокислот можно производить, например, в соответствии с нижеследующей таблицей. Аминокислоты в одном блоке второго столбца и предпочтительно в одной строке третьего столбца могут заменять друг друга:Conservative amino acid substitutions can be made, for example, in accordance with the following table. Amino acids in one block of the second column and preferably in one row of the third column can replace each other:

АлифатическиеAliphatic НеполярныеNon-polar G A PG a p I L VI L V Полярные - незаряженныеPolar - Uncharged C S T MC S T M N QN Q Полярные - заряженныеPolar - charged D ED e K RK r АроматическиеAromatic H F W YH F W Y

Настоящее изобретение относится также к гомологичному замещению (термины “замещение” и “замена” использованы в данном описании изобретения в значении замены существующего аминокислотного остатка альтернативным остатком), которое может иметь место, то есть к замещению подобного остатка подобным, например основного основным, кислотного кислотным, полярного полярным и т.д. Негомологичное замещение также может иметь место, то есть замещение остатка одного класса остатком другого класса или альтернативно введение неприродных аминокислот, таких как орнитин (далее обозначаемый символом Z), орнитин диаминомасляной кислоты (далее обозначаемый символом В), орнитин норлейцина (далее обозначаемый символом О), пириилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенил-глицин.The present invention also relates to homologous substitution (the terms “substitution” and “substitution” are used in this description to replace an existing amino acid residue with an alternative residue), which may occur, that is, to replace a similar residue with a similar, for example basic basic, acidic acid polar polar etc Non-homologous substitution can also take place, that is, substitution of the residue of one class with a residue of another class, or alternatively the introduction of non-natural amino acids such as ornithine (hereinafter referred to as Z), ornithine diaminobutyric acid (hereinafter referred to as B), ornithine norleucine (hereinafter designated O) , pyridylalanine, thienylalanine, naphthylalanine and phenyl glycine.

Замены могут также производиться неприродными аминокислотами.Substitutions may also be made by unnatural amino acids.

Вариантные аминокислотные последовательности могут содержать приемлемые спейсерные группы, которые могут быть введены между двумя любыми аминокислотными остатками последовательности и включают алкильные группы, такие как метильные, этильные или пропильные группы, дополнительно к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина. Другой тип изменения, предполагающий наличие одного или нескольких аминокислотных остатков в пептоидной форме, должен быть хорошо известен специалистам в данной области. Во избежание неправильного толкования следует отметить, что термин “пептоидная форма” означает вариантные аминокислотные остатки, в которых α-углеродная замещающая группа находится в положении атома азота остатка, а не α-атома углерода. Методы получения пептидов в пептоидной форме известны в данной области и описаны, например, в публикациях Simon R.J. et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 и Horwell D.C., Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-234.Variant amino acid sequences may contain acceptable spacer groups that can be inserted between any two amino acid residues of the sequence and include alkyl groups, such as methyl, ethyl or propyl groups, in addition to amino acid spacers, such as glycine or β-alanine residues. Another type of change, involving the presence of one or more amino acid residues in peptoid form, should be well known to those skilled in the art. To avoid misinterpretation, it should be noted that the term “peptoid form” means variant amino acid residues in which the α-carbon substituent group is in the position of the nitrogen atom of the residue, and not the α-carbon atom. Methods for preparing peptides in peptoid form are known in the art and are described, for example, in Simon R.J. et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 and Horwell D.C., Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-234.

Нуклеотидные последовательности, предназначенные для использования в настоящем изобретении или кодирующие полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, могут включать синтетические или модифицированные нуклеотиды. В данной области известен ряд разных типов модификации олигонуклеотидов. Указанные модификации включают метилфосфонатные и фосфортиоатные остовы и/или добавление акридиновых или полилизиновых цепей в положении 3'- и/или 5'-концов молекулы. В соответствии с целями настоящего изобретения должно быть понятно, что описанные здесь нуклеотидные последовательности могут быть модифицированы любым методом, существующим в данной области. Такие модификации могут быть выполнены для усиления активности in vivo или увеличения продолжительности жизни нуклеотидных последовательностей.Nucleotide sequences intended for use in the present invention or encoding a polypeptide having the specific properties described herein may include synthetic or modified nucleotides. A number of different types of modification of oligonucleotides are known in the art. These modifications include methylphosphonate and phosphorothioate backbones and / or the addition of acridine or polylysine chains at the 3 ′ and / or 5 ′ ends of the molecule. In accordance with the objectives of the present invention, it should be understood that the nucleotide sequences described herein can be modified by any method existing in the art. Such modifications can be made to enhance in vivo activity or increase the life span of nucleotide sequences.

Настоящее изобретение относится также к использованию нуклеотидных последовательностей, которые являются комплементарными описанным здесь последовательностям, любым их производным, фрагментам или производным фрагментов. Если последовательность является комплементарной фрагменту последовательности, тогда указанную последовательность можно использовать в качестве зонда для идентификации подобных кодирующих последовательностей в других организмах и т.д.The present invention also relates to the use of nucleotide sequences that are complementary to the sequences described herein, any derivatives, fragments or derivatives thereof. If the sequence is complementary to a fragment of the sequence, then this sequence can be used as a probe to identify similar coding sequences in other organisms, etc.

Полинуклеотиды, которые не являются гомологичными последовательностям по настоящему изобретению на 100%, но входят в объем данного изобретения, можно получить рядом методов. Другие варианты описанных здесь последовательностей можно получить зондированием библиотек ДНК, созданных из ряда особей, например особей из разных популяций. Кроме того, можно получить другие вирусные/ бактериальные или клеточные гомологи, в частности клеточные гомологи, обнаруженные в клетках млекопитающих (например, в клетках крыс, мышей, крупного рогатого скота и приматов), и такие гомологи и их фрагменты обычно способны избирательно гибридизировать с последовательностями, представленными в приведенной здесь списке последовательностей. Такие последовательности можно получить, зондируя библиотеки кДНК, созданные из библиотек геномных ДНК других видов животных, зондами, содержащими всю или часть любой последовательности из прилагаемого списка последовательностей, в условиях от средней до высокой строгости. То же самое относится к получению гомологов и аллельных вариантов полипептидных или нуклеотидных последовательностей по данному изобретению.Polynucleotides that are not 100% homologous to the sequences of the present invention but are within the scope of this invention can be obtained by a number of methods. Other variants of the sequences described here can be obtained by probing libraries of DNA created from a number of individuals, for example, individuals from different populations. In addition, other viral / bacterial or cellular homologs can be obtained, in particular cellular homologs found in mammalian cells (e.g., rat, mouse, cattle and primates cells), and such homologues and fragments thereof are usually capable of selectively hybridizing to sequences shown in the sequence listing here. Such sequences can be obtained by probing cDNA libraries created from genomic DNA libraries of other animal species with probes containing all or part of any sequence from the attached list of sequences under medium to high stringency conditions. The same applies to the preparation of homologues and allelic variants of the polypeptide or nucleotide sequences of this invention.

Варианты и гомологи штамма/вида можно также получить методом PCR вырожденной последовательности с использованием затравок, предназначенных для направленного воздействия на последовательности в указанных вариантах и гомологах, кодирующих консервативные аминокислотные последовательности в последовательностях по настоящему изобретению. Консервативные последовательности можно прогнозировать, например, сравнивая аминокислотные последовательности из нескольких вариантов/гомологов. Сравнение последовательностей можно произвести при помощи компьютерных программ, известных в данной области. Например, широко используется программа GCG Wisconsin PileUp.Variants and homologues of the strain / species can also be obtained by PCR degenerate sequences using seeds designed to target sequences in these variants and homologues encoding conserved amino acid sequences in the sequences of the present invention. Conservative sequences can be predicted, for example, by comparing amino acid sequences from several variants / homologs. Comparison of sequences can be made using computer programs known in the art. For example, the GCG Wisconsin PileUp program is widely used.

Затравки, используемые при выполнении РCR вырожденной последовательности, содержат одно или несколько вырожденных положений и применяются в условиях более низкой строгости по сравнению с условиями, используемыми для клонирования последовательностей при помощи затравок для одной последовательности против известных последовательностей.The seeds used in performing the PCR of a degenerate sequence contain one or more degenerate positions and are used under conditions of lower stringency compared to the conditions used for cloning sequences using seeds for one sequence against known sequences.

Альтернативно такие полинуклеотиды можно получить сайтнаправленным мутагенезом описанных последовательностей. Данный метод можно использовать, например, в тех случаях, когда необходимо изменить последовательность с молчащим кодоном для оптимизации предпочтительности кодона для определенной клетки-хозяина, в которой экспрессированы полинуклеотидные последовательности. Другие изменения последовательности могут быть желательны для введения сайтов узнавания рестрикционного полипептида или для изменения свойства или функции полипептидов, кодированных данными полинуклеотидами.Alternatively, such polynucleotides can be obtained by site-directed mutagenesis of the described sequences. This method can be used, for example, in cases where it is necessary to change the sequence with a silent codon to optimize the preference of the codon for a particular host cell in which polynucleotide sequences are expressed. Other sequence changes may be desirable for introducing restriction polypeptide recognition sites or for changing the property or function of polypeptides encoded by these polynucleotides.

Полинуклеотиды (нуклеотидные последовательности) по данному изобретению можно использовать для получения затравки, например затравки для PCR, затравки для альтернативной реакции амплификации, зонда, например, меченного опознаваемой меткой обычными методами с использованием радиоактивных или нерадиоактивных меток, либо полинуклеотиды могут быть клонированы в векторах. Такие затравки, зонды и другие фрагменты имеют длину, равную по крайней мере 15, предпочтительно по крайней мере 20, например, по крайней мере 25, 30 или 40 нуклеотидам, и входят в определение термина “полинуклеотиды” по настоящему изобретению.The polynucleotides (nucleotide sequences) of this invention can be used to obtain a seed, e.g., a seed for PCR, an seed for an alternative amplification reaction, a probe, for example, labeled with an identifiable label using conventional methods using radioactive or non-radioactive labels, or the polynucleotides can be cloned in vectors. Such seeds, probes, and other fragments have a length of at least 15, preferably at least 20, for example at least 25, 30, or 40 nucleotides, and are included in the definition of the term “polynucleotides” of the present invention.

Полинуклеотиды, такие как полинуклеотиды ДНК и зонды по данному изобретению, можно получить рекомбинантными, синтетическими или любыми другими методами, известными специалистам в данной области. Они могут быть также клонированы стандартными методами.Polynucleotides, such as the DNA polynucleotides and probes of this invention, can be obtained by recombinant, synthetic, or any other methods known to those skilled in the art. They can also be cloned by standard methods.

Затравки обычно получают методами синтеза, включающими поэтапное создание требуемой нуклеотидной последовательности по одному нуклеотиду. Методы синтеза с применением автоматических методов хорошо известны в данной области.Seeds are usually obtained by synthesis methods, including the stepwise creation of the desired nucleotide sequence of one nucleotide each. Synthesis methods using automatic methods are well known in the art.

Полинуклеотиды с более длинной цепью обычно получают рекомбинантными методами, например, при помощи методов клонирования с выполнением PCR (полимеразной реакции синтеза цепи). Указанные методы включают создание двух затравок (например, содержащих примерно 15-30 нуклеотидов), фланкирующих область воздействующей на липид последовательности, которую желательно клонировать, введение затравок в соприкосновение с мРНК или кДНК, полученной из клетки животного или человека, выполнение полимеразной реакции синтеза цепи в условиях, вызывающих амплификацию требуемой области, выделение амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси на агарозном геле) и получение амплифицированной ДНК. Затравки могут содержать приемлемые сайты узнавания рестрикционных ферментов, благодаря чему амплифицированная ДНК может быть клонирована в приемлемом клонирующем векторе.Longer chain polynucleotides are usually prepared by recombinant methods, for example, using cloning techniques using PCR (polymerase chain synthesis) reaction. These methods include the creation of two seeds (for example, containing approximately 15-30 nucleotides) flanking the region acting on the lipid sequence, which it is desirable to clone, introducing seeds in contact with mRNA or cDNA obtained from an animal or human cell, performing a polymerase chain synthesis reaction in conditions causing the amplification of the desired area, the selection of the amplified fragment (for example, by purification of the reaction mixture on an agarose gel) and obtaining amplified DNA. The seeds may contain acceptable restriction enzyme recognition sites, whereby the amplified DNA can be cloned into an acceptable cloning vector.

ГибридизацияHybridization

Настоящее изобретение относится также к последовательностям, которые являются комплементарными последовательностям по настоящему изобретению или последовательностям, способным гибридизировать с последовательностями по настоящему изобретению или с комплементарными им последовательностями.The present invention also relates to sequences that are complementary to sequences of the present invention or sequences capable of hybridizing with sequences of or complementary to the sequences of the present invention.

Термин “гибридизация” в используемом здесь значении означает “процесс, в соответствии с которым цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью в результате спаривания оснований”, а также процесс амплификации, выполняемый методами полимеразной реакции синтеза цепи (PCR).The term “hybridization” as used herein means “a process in which a nucleic acid chain is coupled to a complementary chain as a result of base pairing,” as well as an amplification process carried out by a polymerase chain reaction (PCR).

Настоящее изобретение относится также к использованию нуклеотидных последовательностей, способных гибридизировать с последовательностями, которые являются комплементарными последовательностям по настоящему изобретению, их производным, фрагментам или производным фрагментов.The present invention also relates to the use of nucleotide sequences capable of hybridizing with sequences that are complementary to the sequences of the present invention, their derivatives, fragments or derivatives of fragments.

Настоящее изобретение относится также к последовательностям, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизировать с описанными здесь нуклеотидными последовательностями.The present invention also relates to sequences that are complementary to sequences capable of hybridizing to the nucleotide sequences described herein.

Условия гибридизации включают температуру плавления (Тm) нуклеотидсвязывающего комплекса, как это описано в публикации Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), и определяют установленную “строгость”, рассматриваемую ниже.Hybridization conditions include the melting temperature (Tm) of the nucleotide binding complex, as described in Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA), and the established “stringency” is determined discussed below.

Максимальная строгость обычно соответствует температуре, примерно равной Тm-5°С (на 5°С ниже Тm зонда); высокая строгость соответствует температуре, которая примерно на 5-10°С ниже Тm; средняя строгость соответствует температуре, которая примерно на 10-20°С ниже Тm; и низкая строгость соответствует температуре, которая примерно на 20-25°С ниже Тm. Как должно быть понятно специалистам в данной области, гибридизацию в условиях максимальной строгости можно использовать для идентификации или обнаружения идентичных нуклеотидных последовательностей, в то время как гибридизацию в условиях средней (или низкой) строгости можно использовать для идентификации или обнаружения подобных или родственных полинуклеотидных последовательностей.Maximum stringency usually corresponds to a temperature of approximately Tm-5 ° C (5 ° C below the Tm of the probe); high stringency corresponds to a temperature that is about 5-10 ° C below Tm; medium stringency corresponds to a temperature that is about 10-20 ° C below Tm; and low stringency corresponds to a temperature that is about 20-25 ° C. below Tm. As should be understood by those skilled in the art, hybridization under maximum stringency conditions can be used to identify or detect identical nucleotide sequences, while hybridization under medium (or low) stringency conditions can be used to identify or detect similar or related polynucleotide sequences.

Настоящее изобретение предпочтительно относится к последовательностям, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизировать с условиях высокой или средней строгости с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, обладающие описанными здесь специфическими свойствами.The present invention preferably relates to sequences that are complementary to sequences capable of hybridizing with high or medium stringency conditions to nucleotide sequences encoding polypeptides having the specific properties described herein.

Более предпочтительно настоящее изобретение относится к последовательностям, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизировать в условиях высокой строгости (например, 65°С и 0,1хSSC {1xSSC=0,15М NaCl, 0,015М цитрата натрия, рН 7,0}) с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептиды, обладающие описанными здесь специфическими свойствами.More preferably, the present invention relates to sequences that are complementary to sequences capable of hybridizing under high stringency conditions (eg, 65 ° C and 0.1xSSC {1xSSC = 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0}) with nucleotide sequences encoding polypeptides having the specific properties described herein.

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, способным гибридизировать с вышеуказанными нуклеотидными последовательностями (включая последовательности, комплементарные рассмотренным последовательностям).The present invention also relates to nucleotide sequences capable of hybridizing with the above nucleotide sequences (including sequences complementary to the considered sequences).

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, которые являются комплементарными последовательностям, способным гибридизировать с описанными здесь нуклеотидными последовательностями (включая последовательности, комплементарные описанными здесь последовательностям).The present invention also relates to nucleotide sequences that are complementary to sequences capable of hybridizing to the nucleotide sequences described herein (including sequences complementary to the sequences described herein).

В объем настоящего изобретения входят также полинуклеотидные последовательности, способные гибридизировать с описанными здесь нуклеотидными последовательностями в условиях от средней до максимальной строгости.Polynucleotide sequences capable of hybridizing to the nucleotide sequences described herein under conditions of medium to maximum stringency are also within the scope of the present invention.

В соответствии с предпочтительным объектом изобретения настоящее изобретения относится к нуклеотидным последовательностям, способным гибридизировать с описанными здесь нуклеотидными последовательностями или с их комплементом в строгих условиях (например, 50°С и 0,2хSSC).According to a preferred aspect of the invention, the present invention relates to nucleotide sequences capable of hybridizing with the nucleotide sequences described herein or with their complement under stringent conditions (e.g., 50 ° C and 0.2 x SSC).

В соответствии с более предпочтительным объектом изобретения настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, способным гибридизировать с описанными здесь нуклеотидными последовательностями или с их комплементом в условиях высокой строгости (например, 65°С и 0,1хSSC).According to a more preferred aspect of the invention, the present invention relates to nucleotide sequences capable of hybridizing with the nucleotide sequences described herein or with their complement under high stringency conditions (e.g., 65 ° C and 0.1 x SSC).

Экспрессия полипептидовThe expression of polypeptides

Нуклеотидная последовательность, предназначенная для использования в настоящем изобретении или для кодирования полипептида, обладающего описанными здесь специфическими свойствами, может быть введена в рекомбинантный реплицируемый вектор. Указанный вектор может быть использован для репликации и экспрессии нуклеотидной последовательности в форме полипептида в совместимой клетке-хозяине. Экспрессия может контролироваться при помощи регулярных последовательностей, которые включают промоторы/энхансеры и другие регулирующие экспрессию сигналы. Можно использовать прокариотические промоторы и промоторы, функционирующие в эукариотических клетках. Можно использовать тканеспецифические или стимулспецифические промоторы. Кроме того, можно использовать химерные промоторы, содержащие элементы последовательности из двух или более разных вышеописанных промоторов.A nucleotide sequence for use in the present invention or for encoding a polypeptide having the specific properties described herein can be introduced into a recombinant replicable vector. The specified vector can be used for replication and expression of the nucleotide sequence in the form of a polypeptide in a compatible host cell. Expression can be controlled using regular sequences that include promoters / enhancers and other expression-regulating signals. You can use prokaryotic promoters and promoters that function in eukaryotic cells. Tissue-specific or stimulus-specific promoters may be used. In addition, you can use chimeric promoters containing sequence elements from two or more different promoters described above.

Полипептид, продуцированный рекомбинантной клеткой-хозяином в результате экспрессии нуклеотидной последовательности, может быть секретирован или может находиться внутри клетки в зависимости от используемой последовательности и/или вектора. Кодирующие последовательности могут содержать сигнальные последовательности, направляющие секрецию кодирующих вещество последовательностей через мембрану определенной прокариотической или эукариотической клетки.A polypeptide produced by a recombinant host cell as a result of expression of a nucleotide sequence may be secreted or may be located inside the cell depending on the sequence and / or vector used. The coding sequences may contain signal sequences directing the secretion of substance coding sequences through the membrane of a particular prokaryotic or eukaryotic cell.

Экспрессирующий векторExpression vector

Термин “экспрессирующий вектор” означает конструкцию, которая способна вызывать экспрессию in vivo или in vitro.The term “expression vector” means a construct that is capable of inducing expression in vivo or in vitro .

Экспрессирующий вектор предпочтительно вводят в геном организма. Термин “вводят” предпочтительно означает устойчивое включение в геном.The expression vector is preferably introduced into the genome of the body. The term “administered” preferably means stable incorporation into the genome.

Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению или нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, может находиться в векторе, где нуклеотидная последовательность функционально связана с регуляторными последовательностями так, что регуляторные последовательности способны обеспечить экспрессию нуклеотидной последовательности приемлемым организмом-хозяином, то есть данный вектор является экспрессирующим вектором.The nucleotide sequence of the present invention or the nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties described herein may be in a vector where the nucleotide sequence is operably linked to regulatory sequences so that the regulatory sequences are capable of providing expression of the nucleotide sequence by an acceptable host organism, i.e., this vector is an expression vector.

Векторы по настоящему изобретению могут быть введены в приемлемую клетку-хозяина в соответствии с нижеследующим описанием для экспрессии полипептида, обладающего описанными здесь специфическими свойствами.The vectors of the present invention can be introduced into an acceptable host cell as described below for expression of a polypeptide having the specific properties described herein.

Выбор вектора, например, плазмидного, космидного, вирусного или фагового вектора, часто зависит от клетки-хозяина, в которую вводят указанный вектор.The choice of a vector, for example, a plasmid, cosmid, viral or phage vector, often depends on the host cell into which the vector is introduced.

Векторы могут содержать один или несколько селектируемых генов-маркеров, таких как ген, обладающий устойчивостью к антибиотикам, например устойчивостью к ампициллину, канамицину, хлор-амфениколу или тетрациклину. Альтернативно выбор может сопровождаться котрансформацией (как это описано в заявке WO 91/17243).The vectors may contain one or more selectable marker genes, such as a gene that is resistant to antibiotics, for example, resistance to ampicillin, kanamycin, chloro-amphenicol or tetracycline. Alternatively, the selection may be accompanied by cotransformation (as described in WO 91/17243).

Векторы могут быть использованы in vitro, например, для продуцирования РНК либо для трансфекции или трансформации клетки-хозяина.Vectors can be used in vitro , for example, for the production of RNA or for transfection or transformation of a host cell.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу получения нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению или нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды, обладающие описанными здесь специфическими свойствами, путем введения нуклеотидной последовательности в реплицируемый вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяина и выращивания клетки-хозяина в условиях, вызывающих репликацию вектора.Another embodiment of the invention relates to a method for producing nucleotide sequences of the present invention or nucleotide sequences encoding polypeptides having the specific properties described herein, by introducing a nucleotide sequence into a replicable vector, introducing the vector into a compatible host cell, and growing the host cell under conditions causing replication vector.

Вектор может далее содержать нуклеотидную последовательность, обеспечивающую репликацию вектора в клетке-хозяине. Примерами таких последовательностей являются ориджины репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 и pIJ702.The vector may further comprise a nucleotide sequence enabling replication of the vector in the host cell. Examples of such sequences are the origin of replication of plasmids pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 and pIJ702.

Регуляторные последовательностиRegulatory sequences

В некоторых применениях нуклеотидная последовательность, предназначенная для использования в настоящем изобретении, или нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, может быть функционально связана с регуляторной последовательностью, способной обеспечить экспрессию нуклеотидной последовательности выбранной клеткой-хозяином. В качестве примера можно отметить, что настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, функционально связанную с такой регуляторной последовательностью, то есть данный вектор является экспрессирующим вектором.In some applications, a nucleotide sequence for use in the present invention, or a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties described herein, may be operably linked to a regulatory sequence capable of expressing the nucleotide sequence of a selected host cell. As an example, it can be noted that the present invention relates to a vector containing the nucleotide sequence of the present invention, operably linked to such a regulatory sequence, that is, this vector is an expression vector.

Термин “функционально связанный” означает смежное положение, обеспечивающее взаимосвязь компонентов, благодаря которой указанные компоненты могут функционировать требуемым образом. Регуляторная последовательность, “функционально связанная” с кодирующей последовательностью, лигирована так, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с контрольными последовательностями.The term "functionally connected" means an adjacent position, providing the interconnection of components, due to which these components can function as desired. A regulatory sequence “operably linked” to a coding sequence is ligated so that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.

В определение термина “регуляторные последовательности” входят промоторы, энхансеры и другие сигналы, регулирующие экспрессию.The definition of “regulatory sequences” includes promoters, enhancers and other signals that regulate expression.

Термин “промотор” имеет значение, обычно употребляемое в данной области, например, сайт связывания РНК-полимеразы.The term “promoter” has the meaning commonly used in this field, for example, an RNA polymerase binding site.

Усиленная экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, может быть также достигнута в результате выбора гетерологичных регуляторных областей, например промоторных, секретирующих, лидерных и терминирующих областей.Enhanced expression of the nucleotide sequence encoding an enzyme having the specific properties described here can also be achieved by choosing heterologous regulatory regions, for example, promoter, secretion, leader and termination regions.

Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению предпочтительно может быть функционально связана по крайней мере с промотором.The nucleotide sequence of the present invention may preferably be operably linked to at least a promoter.

Примеры приемлемых промоторов, направляющих транскрипцию нуклеотидной последовательности в бактериальном, грибном или дрожжевом хозяине, хорошо известны в данной области.Examples of suitable promoters directing the transcription of the nucleotide sequence in a bacterial, fungal, or yeast host are well known in the art.

КонструкцииConstructions

Термин “конструкция”, который синонимичен таким терминам, как “конъюгат”, “кластер” и “гибрид”, означает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, которая предназначена для использования в настоящем изобретении. Примером непрямого присоединения является приемлемая спейсерная группа, такая как интронная последовательность, в частности Sh1-интрон или ADH-интрон, расположенная между промотором и нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению. Такое же определение относится к термину “слитый” в значении, используемом в настоящем изобретении, которое включает прямое или непрямое присоединение. В некоторых случаях указанные термины не относятся к природной комбинации нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, ординарно связанной с промотором гена дикого типа, когда они находятся в своем естественном окружении.The term “construct”, which is synonymous with terms such as “conjugate”, “cluster” and “hybrid”, means a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties described herein, which is intended for use in the present invention. An example of indirect attachment is an acceptable spacer group, such as an intron sequence, in particular a Sh1 intron or an ADH intron located between the promoter and the nucleotide sequence of the present invention. The same definition refers to the term “fused” in the sense used in the present invention, which includes direct or indirect connection. In some cases, these terms do not refer to a natural combination of a nucleotide sequence encoding a protein that is ordinarily linked to the promoter of a wild-type gene when they are in their natural environment.

Конструкция может даже содержать или экспрессировать маркер, обеспечивающий выбор генетической конструкции.The construct may even contain or express a marker for selection of the genetic construct.

В некоторых применениях указанная конструкция предпочтительно содержит по крайней мере одну нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, который функционально связан с промотором.In some applications, said construct preferably comprises at least one nucleotide sequence of the present invention or a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties described herein that is operably linked to a promoter.

Клетки-хозяеваHost cells

Термин “клетка-хозяин” применительно к настоящему изобретению означает любую клетку, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, или вышеописанный экспрессирующей вектор и используется для рекомбинантного продуцирования полипептида, обладающего описанными здесь специфическими свойствами.The term “host cell” as used in the present invention means any cell that contains a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties described herein or an expression vector described above and is used to recombinantly produce a polypeptide having the specific properties described herein.

Таким образом, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к клеткам-хозяевам, трансформированным или трансфецированным нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, или нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей полипептид, обладающий опианными здесь специфическими свойствами. Выбираемые клетки должны быть совместимы с указанным вектором и могут быть, например, прокариотическими (например, бактериальными), грибными, дрожжевыми или растительными клетками. Клетки-хозяева предпочтительно не являются клетками человека.Thus, another embodiment of the present invention relates to host cells transformed or transfected with a nucleotide sequence of the present invention, or a nucleotide sequence expressing a polypeptide having specific properties described herein. The selected cells must be compatible with the specified vector and can be, for example, prokaryotic (e.g. bacterial), fungal, yeast or plant cells. The host cells are preferably not human cells.

Примерами приемлемых бактериальных организмов-хозяев являются грамотрицательные или грамположительные бактерии.Examples of suitable bacterial host organisms are gram-negative or gram-positive bacteria.

В зависимости от характера нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, и/или желательности последующего процессинга экспрессированного белка предпочтительными могут быть эукариотические хозяева, такие как дрожжи или другие грибы. Дрожжевые клетки обычно являются более предпочтительными по сравнению с грибными клетками, так как ими легче манипулировать. Однако некоторые белки плохо секретируются из дрожжевой клетки или в некоторых случаях не подвергаются требуемому процессингу (например, гипергликозилирование в дрожжах). В таких случаях следует выбрать другой грибной организм-хозяин.Eukaryotic hosts such as yeast or other fungi may be preferred depending on the nature of the nucleotide sequence encoding the polypeptide having the specific properties described here and / or the desirability of subsequent processing of the expressed protein. Yeast cells are usually preferred over fungal cells since they are easier to manipulate. However, some proteins are poorly secreted from the yeast cell or in some cases are not subjected to the required processing (for example, hyperglycosylation in yeast). In such cases, another host fungal organism should be selected.

Использование приемлемых клеток-хозяев, таких как дрожжевые, грибные и растительные клетки-хозяева, позволяет производить пост-трансляционные модификации (миристоилирование, гликозилирование, усечение, лапидирование, фосфорилирование тирозина, серина или треонина), которые могут быть необходимы для сообщения оптимальной биологической активности продуктам рекомбинантной экспрессии по настоящему изобретению.The use of acceptable host cells, such as yeast, fungal and plant host cells, allows for post-translational modifications (myristoylation, glycosylation, truncation, lapidation, phosphorylation of tyrosine, serine or threonine) that may be necessary to communicate optimal biological activity to the products recombinant expression of the present invention.

Клетка-хозяин может относится к штамму с дефицитом протеазы или без протеазы.A host cell may refer to a strain with or without protease deficiency.

ОрганизмOrganism

Термин “организм” применительно к настоящему изобретению означает любой организм, который может содержать нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий описанным здесь специфическими свойствами, и/или полученные из него продукты.The term “organism” as used in the present invention means any organism that may contain a nucleotide sequence of the present invention or a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties described herein and / or products derived therefrom.

Приемлемые организмы могут включать прокариоты, грибы, дрожжи или растения.Suitable organisms may include prokaryotes, fungi, yeast, or plants.

Термин “трансгенный организм” применительно к настоящему изобретению означает любой организм, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, и/или полученные из него продукты, и/или в котором промотор позволяет экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами. Нуклеотидную последовательность предпочтительно вводят в геном организма.The term “transgenic organism” as used in the present invention means any organism that contains a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties described herein and / or products derived from it, and / or in which a promoter allows the expression of a nucleotide sequence encoding a polypeptide having specific properties described here. The nucleotide sequence is preferably introduced into the genome of the body.

Термин “трансгенный организм” не относится к нативным нуклеотидным кодирующим последовательностям, находящимся в своем естественном окружении, когда они находятся под контролем нативного промотора, который также находится в своем естественном окружении.The term “transgenic organism” does not refer to native nucleotide coding sequences in their natural environment when they are under the control of the native promoter, which is also in its natural environment.

Поэтому термин “трансгенный организм” по настоящему изобретению означает организм, содержащий одну или комбинации нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, вышеуказанные конструкции, векторы, плазмиды, клетки или их продукты. Например, трансгенный организм может также содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, которая находится под контролем гетерологичного промотора.Therefore, the term “transgenic organism” of the present invention means an organism containing one or a combination of nucleotide sequences encoding a polypeptide having the specific properties described here, the above constructs, vectors, plasmids, cells or their products. For example, a transgenic organism may also contain a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the specific properties described herein, which is controlled by a heterologous promoter.

Трансформация клеток-хозяев/организмаTransformation of host cells / organism

Как было указано выше, организм-хозяин может быть прокариотическим или эукариотическим организмом. Примеры приемлемых прокариотических хозяев включают E. coli и Bacillus subtilis.As indicated above, the host organism may be a prokaryotic or eukaryotic organism. Examples of suitable prokaryotic hosts include E. coli and Bacillus subtilis .

Трансформация прокариотических хозяев хорошо описана в данной области, например, в публикации Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). При использовании прокариотического хозяина может потребоваться соответствующее изменение нуклеотидной последовательности до трансформации, например, путем удаления интронов.Transformation of prokaryotic hosts is well described in the art, for example, in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ^nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). When using a prokaryotic host, a corresponding change in the nucleotide sequence may be required prior to transformation, for example, by removing introns.

В другом варианте осуществления изобретения трансгенным организмом могут быть дрожжи.In another embodiment, the transgenic organism may be yeast.

Клетки нитевидных грибов могут быть трансформированы разными методами, известными в данной области, такими как процесс, включающий образование протопласта и трансформацию протопластов с последующей регенерацией клеточной оболочки известным образом. Применение Aspergillus в качестве организма-хозяина описано в европейском патенте № 0238023.Filamentous fungal cells can be transformed using various methods known in the art, such as a process involving protoplast formation and protoplast transformation followed by regeneration of the cell wall in a known manner. The use of Aspergillus as a host is described in European Patent No. 0238023.

Другим организмом-хозяином может быть растение. Обзор общих методов, используемых для трансформации растений, можно найти в статьях Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) и Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27). Трансформация растений далее описана в заявке на европейский патент № 0449375.Another host organism may be a plant. An overview of common methods used to transform plants can be found in Potrykus ( Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March / April 1994 17-27) . Plant transformation is further described in European Patent Application No. 0449375.

В нижеследующих разделах приведены общие сведения о трансформации грибов, дрожжей и растений.The following sections provide general information on the transformation of fungi, yeast, and plants.

Трансформированные грибыTransformed mushrooms

Организмом-хозяином могут быть грибы, в частности нитевидные грибы. Примеры подобных приемлемых хозяев включают любые организмы, относящиеся к родам Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicilliun, Mucor, Neurospora, Triсhoderma и тому подобным.The host organism may be fungi, in particular filamentous fungi. Examples of such acceptable hosts include any organisms belonging to the genera Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicilliun, Mucor, Neurospora, Trichoderma and the like.

Трансформация нитевидных грибов описана в заявке на патент США № 5741665, в которой указано, что стандартные методы трансформации нитевидных грибов и культивирования грибов хорошо известны в данной области. Всесторонний обзор методов, применяемых для трансформации N. crassa, представлен в публикации Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.Transformation of filamentous fungi is described in US patent application No. 5741665, which states that standard methods for transforming filamentous fungi and cultivating fungi are well known in the art. A comprehensive review of the methods used to transform N. crassa is presented in Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.

Трансформация нитевидных грибов далее описана в заявке на патент США № 5674707.Transformation of filamentous fungi is further described in US Patent Application No. 5674707.

В соответствии с одним объектом изобретения организм-хозяин может относится к роду Aspergillus, такому как Aspergillus niger.In accordance with one aspect of the invention, the host organism may belong to the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger .

Трансгенный организм-хозяин Aspergillus по настоящему изобретению можно также получить в соответствии с описанием, приведенным, например, в публикации Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994, стр. 641-666).The transgenic host Aspergillus of the present invention can also be obtained as described, for example, in Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli SD, Kinghorn JR (Editors) Aspergillus : 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994, pp. 641-666).

Экспрессия гена в нитевидных грибах описана в публикации Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.Gene expression in filamentous fungi is described in Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20 (5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17 (4): 273-306.

Трансформированные дрожжиTransformed yeast

Принципы экспрессии гетерологичного гена в дрожжах рассмотрены, например, в публикациях Methods Mol Biol (1995), 49:341-54 и Curr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8(5):554-60.The principles of heterologous gene expression in yeast are discussed, for example, in Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54 and Curr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8 (5): 554-60.

В этой связи дрожжи, в частности виды Saccharomyces cerevisi или Pichia pastoris (см. FEMS Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), можно использовать в качестве организма для экспрессии гетерологичного гена.In this regard, yeast, in particular Saccharomyces cerevisi or Pichia pastoris species (see FEMS Microbiol Rev (2000 24 (1): 45-66), can be used as an organism for expression of a heterologous gene.

Принципы экспрессии гетерологичного гена в Saccharomyces cerevisiae и секреции генных продуктов описаны в публикации E. Hinchcliffe E Kenny (1993, “Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts, Vol 5, Anthony H. Rose and J. Stuart Harrison, eds, 2^nd edition, Academic Press Ltd.).The principles of heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae and secretion of gene products are described in E. Hinchcliffe E Kenny (1993, “Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts , Vol 5, Anthony H. Rose and J. Stuart Harrison, eds, 2 ^nd edition, Academic Press Ltd.).

Были разработаны несколько методов трансформации дрожжей. Например, трансгенные дрожжи Saccharomyces по настоящему изобретению можно получить в соответствии с описанием, приведенным в публикациях Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J.D. (1978, Nature, London, 275, 104); и Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153, 163-168).Several methods for transforming yeast have been developed. For example, the Saccharomyces transgenic yeast of the present invention can be prepared as described in Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J.D. (1978, Nature, London, 275, 104); and Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153, 163-168).

Приемлемый дрожжевой организм-хозяин можно выбрать из пригодных в биотехнологическом отношении видов дрожжей, которые включают, не ограничиваясь ими, виды Pichia sp., Hansenula sp. или Kluyveromyces, Yarrowinia, вид Saccharomyces, включающий Saccharomyces cerevisiae, или вид, относящийся к Schizosaccharomyce, такой как, например, S. pombe.An acceptable host yeast may be selected from biotechnologically suitable yeast species, which include, but are not limited to, Pichia sp., Hansenula sp. or Kluyveromyces , Yarrowinia, a species of Saccharomyces, including Saccharomyces cerevisiae , or a species related to Schizosaccharomyce , such as, for example, S. pombe .

В качестве организма-хозяина можно использовать штамм метилотрофных дрожжей вида Pichia pastoris.A strain of methylotrophic yeast of the species Pichia pastoris can be used as the host organism.

В одном варианте осуществления изобретения организмом-хозяином является вид Hansenula, такой как Hansenula polymorpha (описанный в заявке WO 01/38544).In one embodiment, the host organism is a Hansenula species, such as Hansenula polymorpha (described in WO 01/38544).

Трансформированные дрожжевые клетки можно отобрать при помощи разных селектируемых маркеров, таких как ауксотрофные маркеры, являющиеся главными маркерами устойчивости к антибиотикам.Transformed yeast cells can be selected using a variety of selectable markers, such as auxotrophic markers, which are the main markers of antibiotic resistance.

Трансформированные растения/растительные клеткиTransformed Plants / Plant Cells

Организмом-хозяином, пригодным для использования в настоящем изобретении, может быть растение. С обзором общих методов можно ознакомиться в статьях Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) и Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27) или в заявке WO 01/16308. Трансгенное растение может продуцировать сложные эфиры фитостерола и сложные эфиры фитостанола в больших количествах.A host organism suitable for use in the present invention may be a plant. A review of general methods can be found in Potrykus ( Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March / April 1994 17-27) or in WO 01 / 16308. A transgenic plant can produce phytosterol esters and phytostanol esters in large quantities.

Поэтому настоящее изобретение относится также к способу получения трансгенного растения с повышенными уровнями продуцирования сложных эфиров фитостерола и сложных эфиров фитостанола, который включает стадии трансформации растительной клетки описанной здесь липидацилтрансферазой (в частности, экспрессирующим вектором или конструкцией, содержащей липидацилтрансферазу), и выращивания растения из трансформированной растительной клетки.Therefore, the present invention also relates to a method for producing a transgenic plant with increased levels of production of phytosterol esters and phytostanol esters, which comprises the steps of transforming a plant cell with a lipid acyltransferase described herein (in particular, an expression vector or construct containing a lipid acyltransferase), and growing the plant from a transformed plant cells.

СекрецияSecretion

Часто желательно секретировать полипептид из экспрессирующего хозяина в культуральную среду, из которой фермент гораздо легче удалить. В соответствии с настоящим изобретением секретирующую лидерную последовательность можно выбрать в зависимости от требуемого экспрессирующего хозяина. В контексте настоящего изобретения можно также использовать гибридные сигнальные последовательности.It is often desirable to secrete a polypeptide from an expression host into a culture medium from which the enzyme is much easier to remove. In accordance with the present invention, the secreting leader sequence can be selected depending on the desired expression host. Hybrid signal sequences may also be used in the context of the present invention.

Типичными примерами гетерологичных секретирующих лидерных последовательностей являются последовательности, полученные из гена амилоглюкозидазы (AG) грибов (glaA - варианты, содержащие 18 и 24 аминокислоты, выделенные, например, из вида Aspergillus), гена а-фактора (дрожжи, например, Saccharomyces, Kluyveromyces и Hansenula) или гена α-амилазы (Bacillus).Typical examples of heterologous secreting leader sequences are sequences derived from fungal amyloglucosidase (AG) gene (glaA - variants containing 18 and 24 amino acids isolated from, for example, Aspergillus species), a-factor gene (yeast, for example, Saccharomyces , Kluyveromyces and Hansenula ) or the α-amylase gene ( Bacillus ).

ОбнаружениеDetection

В данной области имеется ряд методов обнаружения и измерения экспрессии аминокислотной последовательности. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) радиоиммуноанализ (RIA) и клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (FACS).There are a number of methods in the art for detecting and measuring the expression of an amino acid sequence. Examples include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) radioimmunoassay (RIA) and fluorescence stimulated cell sorting (FACS).

Специалистам в данной области должен быть известен целый ряд меток и методов конъюгации, которые могут быть использованы в разных анализах нуклеиных кислот и аминокислот.Specialists in this field should be aware of a number of labels and conjugation methods that can be used in various analyzes of nucleic acids and amino acids.

Ряд компаний, таких как Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) и US Biochemical Corp (Cleveland, OH) поставляют коммерческие наборы и инструкции по осуществлению указанных методов.A number of companies, such as Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) and US Biochemical Corp (Cleveland, OH) supply commercial kits and instructions for implementing these methods.

Приемлемые репортерные молекулы или метки включают радиоактивные изотопы, ферменты, флуоресцентные, хемилюминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и тому подобные. Патенты, в которых описано использование таких меток, включают US-A-3817837, US-A-3850752, US-A-3939350, US-A-3996345, US-A-4277437, US-A-4275149 и US-A-4366241.Suitable reporter molecules or labels include radioactive isotopes, enzymes, fluorescent, chemiluminescent or chromogenic agents, as well as substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles and the like. Patents that describe the use of such labels include US-A-3817837, US-A-3850752, US-A-3939350, US-A-3996345, US-A-4277437, US-A-4275149 and US-A- 4,366,241.

Кроме того, могут быть получены рекомбинантные иммуноглобулины в соответствии с описанием, приведенным в патенте US-A-4816567.In addition, recombinant immunoglobulins can be prepared as described in US-A-4816567.

Слитые белкиFusion proteins

Полипептид, обладающий описанными здесь специфическими свойствами, может быть получен в виде слитого белка, например, для облегчения экстракции и очистки указанного полипептида. Примеры партнеров, образующих слитый белок, включают глутатион-S-трансферазу (GST), 6xHis, GAL4 (домены связывания ДНК и/или активации транскрипции) и β-галактозидазу. Кроме того, весьма удобно вводить протеолитический сайт расщепления между партнером слитого белка и представляющей интерес белковой последовательностью, что позволяет удалять последовательности слитого белка. Слитый белок предпочтительно не подавляет активность белковой последовательности.A polypeptide having the specific properties described herein can be prepared as a fusion protein, for example, to facilitate extraction and purification of the polypeptide. Examples of fusion protein partners include glutathione S-transferase (GST), 6xHis, GAL4 (DNA binding and / or transcription activation domains) and β-galactosidase. In addition, it is very convenient to introduce a proteolytic cleavage site between the fusion protein partner and the protein sequence of interest, which allows removal of the fusion protein sequences. The fusion protein preferably does not inhibit the activity of the protein sequence.

Системы экспрессии слитого белка гена в E. coli описаны в публикации Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5):501-6.Gene fusion protein expression systems in E. coli are described in Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6 (5): 501-6.

В другом варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность полипептида, обладающего описанными здесь специфическими свойствами, может быть лигирована с гетерологичной последовательностью для кодирования слитого белка. Например, для скрининга пептидных библиотек с целью выявления агентов, способных воздействовать на активность вещества, может быть полезно кодировать химерное вещество, экспрессирующее гетерологичный эпитоп, узнаваемый коммерчески доступным антителом.In another embodiment, the amino acid sequence of a polypeptide having the specific properties described herein may be ligated to a heterologous sequence to encode a fusion protein. For example, for screening peptide libraries to identify agents that can affect the activity of a substance, it may be useful to encode a chimeric substance expressing a heterologous epitope recognized by a commercially available antibody.

Далее настоящее изобретение будет описано на примере его осуществления со ссылкой на нижеследующие фигуры и примеры.The invention will now be described by way of example with reference to the following figures and examples.

На фигуре 1 показана согласованная последовательность pfam00657 из базы данных, версия 6 (SEQ ID NO:1).The figure 1 shows the consistent sequence pfam00657 from the database, version 6 (SEQ ID NO: 1).

На фигуре 2 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2), полученная из организма Aeromonas hydrophila (P10480; GI:121051).The figure 2 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) obtained from the body of Aeromonas hydrophila (P10480; GI: 121051).

На фигуре 3 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3), полученная из организма Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI:9964017).The figure 3 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) obtained from the body of Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI: 9964017).

На фигуре 4 показана аминокислотная последовательностьи (SEQ ID NO:4), полученная из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (номер доступа в банке генов Genbank NP_631558).The figure 4 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) obtained from the organism Streptomyces coelicolor A3 (2) (access number in the genebank Genbank NP_631558).

На фигуре 5 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:5), полученная из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (номер доступа в банке генов Genbank CAC42140).The figure 5 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) obtained from the organism Streptomyces coelicolor A3 (2) (access number in the genebank of Genbank CAC42140).

На фигуре 6 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6), полученная из организма Saccharomyces cerevisiae (номер доступа в банке генов Genbank P41734).The figure 6 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) obtained from the body of Saccharomyces cerevisiae (access number in the genebank of Genbank P41734).

На фигуре 7 показано сравнение выбранных последовательностей с согласованной последовательностью pfam00657.Figure 7 shows a comparison of the selected sequences with the coordinated sequence pfam00657.

На фигуре 8 показано попарное сравнение SEQ ID NO:3 с SEQ ID NO:2, свидетельствующее о 93% идентичности аминокислотных последовательностей. Сигнальная последовательность подчеркнута. Символ “+” означает различия. Фрагмент GDSX, содержащий активный сайт серина 16 и активные сайты аспарагиновой кислоты 116 и гистидина 291, выделен (см. затемненные области). Числа после аминокислоты означают длину аминокислоты без сигнальной последовательности.Figure 8 shows a pairwise comparison of SEQ ID NO: 3 with SEQ ID NO: 2, indicating 93% identity of amino acid sequences. The signal sequence is underlined. The “+” symbol means differences. A GDSX fragment containing the active site of serine 16 and the active sites of aspartic acid 116 and histidine 291 is highlighted (see shaded areas). The numbers after the amino acid mean the length of the amino acid without a signal sequence.

На фигуре 9 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:7), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Aeromonas hydrophila.Figure 9 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) encoding the lipid acyltransferase of the present invention obtained from Aeromonas hydrophila .

На фигуре 10 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:8), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Aeromonas salmonicida.Figure 10 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from the body of Aeromonas salmonicida .

На фигуре 11 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:9), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (номер доступа в банке генов Genbank NC_003888.1:8327480..8328367).Figure 11 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from Streptomyces coelicolor A3 (2) (Genbank accession number NC_003888.1: 8327480..8328367).

На фигуре 12 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:10), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Streptomyces coelicolor A3(2) (номер доступа в банке генов Genbank AL939131.1:265480..266367).Figure 12 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 10) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from Streptomyces coelicolor A3 (2) (access number in the genebank Genbank AL939131.1: 265480..266367).

На фигуре 13 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:11), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Saccharomyces cerevisiae (номер доступа в банке генов Genbank Z75034).Figure 13 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 11) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from Saccharomyces cerevisiae (access number in the Genbank genebank Z75034).

На фигуре 14 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12), полученная из организма Ralstonia (номер доступа в банке генов Genbank AL646052).The figure 14 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) obtained from the body of Ralstonia (access number in the genebank of Genbank AL646052).

На фигуре 15 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:13), кодирующая липидацилтрансферазу по настоящему изобретению, полученную из организма Ralstonia.Figure 15 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 13) encoding the lipid acyltransferase of the present invention, obtained from the organism of Ralstonia .

На фигуре 16 показана SEQ ID NO:20. Белок Scoe1 NCBI c кодом доступа CAB39707.1. GI:4539178 определяет консервативный гипотетический белок [Streptomyces coelicolor A3(2)].The figure 16 shows SEQ ID NO: 20. Protein Scoe1 NCBI with access code CAB39707.1. GI: 4539178 defines a conservative hypothetical protein [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 17 показана нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:21, кодирующая белок NCBI с кодом доступа САВ39707.1. GI:4539178 определяет консервативный гипотетический белок [Streptomyces coelicolor A3(2)].Figure 17 shows the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 encoding an NCBI protein with access code CAB39707.1. GI: 4539178 defines a conservative hypothetical protein [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 18 показана аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:22, кодирущая белок Scoe2 NCBI с кодом доступа CAC01477.1. GI:9716139 определяет консервативный гипотетический белок [Streptomyces coelicolor A3(2)].Figure 18 shows the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 encoding the Scoe2 NCBI protein with access code CAC01477.1. GI: 9716139 defines a conservative hypothetical protein [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 19 показана нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:23, кодирующая белок Scoe2 NCBI с кодом доступа САС01477.1. GI:9716139 определяет консервативный гипотетический белок [Streptomyces coelicolor A3(2)].Figure 19 shows the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 encoding the Scoe2 NCBI protein with access code CAC01477.1. GI: 9716139 defines a conservative hypothetical protein [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 20 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:24). Белок Scoe3 NCBI с кодом доступа САВ88833.1. GI:7635996 определяет предполагаемый секретированный белок [Streptomyces coelicolor A3(2)].The figure 20 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 24). Protein Scoe3 NCBI with access code CAB88833.1. GI: 7635996 defines the putative secreted protein [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 21 показана нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:25, кодирующая белок Scoe3 NCBI с кодом доступа САВ88833.1. GI:7635996 определяет предполагаемый секретированный белок. [Streptomyces coelicolor A3(2)].The figure 21 shows the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25 encoding a Scoe3 NCBI protein with access code CAB88833.1. GI: 7635996 determines the putative secreted protein. [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 22 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:26). Белок Scoe4 NCBI с кодом доступа САВ89450.1. GI:7672261 определяет предполагаемый секретированный белок. [Streptomyces coelicolor A3(2)].The figure 22 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 26). Protein Scoe4 NCBI with access code САВ89450.1. GI: 7672261 defines the putative secreted protein. [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 23 показана нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:27, кодирующая белок Scoe4 NCBI с кодом доступа САВ89450.1. GI:7672261 определяет предполагаемый секретированный белок [Streptomyces coelicolor A3(2)].Figure 23 shows the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 encoding a Scoe4 NCBI protein with access code CAB89450.1. GI: 7672261 defines the putative secreted protein [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 24 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:28). Белок Scoe5 NCBI с кодом доступа САВ62724.1. GI:6562793 определяет предполагаемый липопротеин [Streptomyces coelicolor A3(2)].The figure 24 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 28). Protein Scoe5 NCBI with access code САВ62724.1. GI: 6562793 determines the putative lipoprotein [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 25 показана нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:29, кодирующая белок Scoe5 NCBI с кодом доступа САВ62724.1. GI:6562793 определяет предполагаемый липопротеин [Streptomyces coelicolor A3(2)].Figure 25 shows the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 encoding a Scoe5 NCBI protein with access code CAB62724.1. GI: 6562793 determines the putative lipoprotein [Streptomyces coelicolor A3 (2)].

На фигуре 26 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:30. Белок Srim1 NCBI с кодом доступа ААК84028.1. GI:15082088 определяет GDSL-липазу [Streptomyces rimosus].Figure 26 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 30. Srim1 NCBI protein with access code AAK84028.1. GI: 15082088 determines GDSL lipase [Streptomyces rimosus].

На фигуре 27 показана нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:31, кодирующая белок Srim1 NCBI с кодом доступа ААК84028.1. GI:15082088 определяет GDSL-липазу [Streptomyces rimosus].Figure 27 shows the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31 encoding the Srim1 NCBI protein with access code AAK84028.1. GI: 15082088 determines GDSL lipase [Streptomyces rimosus].

На фигуре 28 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:32) липидацилтрансферазы из Aeromonas hydrophila (ATCC № 7965).Figure 28 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) of a lipid acyltransferase from Aeromonas hydrophila (ATCC No. 7965).

На фигуре 29 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:33), кодирующая липидацилтрансферазу из Aeromonas hydrophila (ATCC № 7965).Figure 29 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 33) encoding a lipid acyltransferase from Aeromonas hydrophila (ATCC No. 7965).

На фигуре 30 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:34) липидацилтрансферазы из Aeromonas salmonicida, подвид Salmonicida (ATCC № 14174).Figure 30 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 34) of a lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida , a subspecies of Salmonicida (ATCC No. 14174).

На фигуре 31 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:35), кодирующая липидацилтрансферазу из Aeromonas salmonicida, подвид Salmonicida (ATCC № 14174).Figure 31 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 35) encoding a lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida , a subspecies of Salmonicida (ATCC No. 14174).

На фигуре 32 показано, что гомологи генов Aeromonas можно идентифицировать при помощи базовой локальной поисковой службы сравнения в Национальном центре биотехнологической информации, NIH, MD, USA, и баз данных полных геномов. Для поиска в базе данных был использован фрагмент GDSX, при этом был идентифицирован ряд последовательностей/генов, потенциально кодирующих ферменты с липолитической активностью. Были идентифицированы гены из рода Streptomyces, Xanthomonas и Ralstonia. В качестве примера ген Ralstonia solanacearum сравнивали с геном Aeromonas salmonicida (satA). Попарное сравнение показало наличие 23% идентичности. Активный сайт серина находится у аминоконца, при этом можно идентифицировать каталитические остатки гистидина и аспарагиновой кислоты.Figure 32 shows that Aeromonas gene homologues can be identified using the base local search comparison service at the National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, USA, and complete genome databases. A GDSX fragment was used to search the database, and a number of sequences / genes were identified that potentially encoded enzymes with lipolytic activity. Genes from the genus Streptomyces, Xanthomonas, and Ralstonia have been identified. As an example, the Ralstonia solanacearum gene was compared with the Aeromonas salmonicida (satA) gene. Pairwise comparisons showed a 23% identity. The active site of serine is located at the amino terminus, and catalytic residues of histidine and aspartic acid can be identified.

На фигуре 33 показана согласованная последовательность Pfam00657.11 [семейство 00657, база данных, вариант 11] (далее именуемая согласованной последовательностью Pfam) и сравнение разных последовательностей с согласованной последовательностью Pfam. Стрелками показаны остатки активного сайта, подчеркнутыми рамками обозначены три области гомологии, описанные в публикации [Upton C. and Buckley J.T. (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Заглавными буквами в согласованной последовательности Pfam обозначены консервативные остатки во многих членах семейства. Символ “-“ означает положение, в котором при помощи модели скрытых профилей Маркова согласованной последовательности Pfam предполагалось обнаружить остаток, который в данном положении отсутствовал, поэтому был введен пробел. Символ “.” означает остаток, не имеющий соответствующего остатка в согласованной последовательности Pfam. Указанные последовательности являются аминокислотными последовательностями, показанными на фигурах 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 и 30.Figure 33 shows the matched sequence Pfam00657.11 [family 00657, database variant 11] (hereinafter referred to as the matched Pfam sequence) and the comparison of different sequences with the matched Pfam sequence. The arrows indicate the remains of the active site, underlined frames indicate three areas of homology described in the publication [Upton C. and Buckley J.T. (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Capital letters in the consistent Pfam sequence indicate conservative residues in many members of the family. The symbol “-“ means a position in which, using the Markov model of hidden profiles of the consistent Pfam sequence, it was supposed to detect a residue that was not present in this position, so a space was entered. The symbol “.” Means a residue that does not have a corresponding residue in the agreed upon Pfam sequence. These sequences are the amino acid sequences shown in figures 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 and 30.

На фигуре 34 показана согласованная последовательность Pfam00657.11 [семейство 00657, база данных, версия 11] (далее именуемая согласованной последовательностью Pfam) и сравнение разных последовательностей с согласованной последовательностью Pfam. Стрелками показаны остатки активного сайта, подчеркнутыми рамками обозначены три области гомологии, описанные в публикации [Upton C. and Buckley J.T. (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Заглавными буквами в согласованной последовательности Pfam обозначены консервативные остатки во многих членах семейства. Символ “-“ означает положение, в котором при помощи модели скрытых профилей Маркова согласованной последовательности Pfam предполагалось обнаружить остаток, который в данном положении отсутствовал, поэтому был введен пробел. Символ “.” означает остаток, не имеющий соответствующего остатка в согласованной последовательности Pfam. Указанные последовательности являются аминокислотными последовательностями, показанными на фигурах 2, 16, 18, 20, 26, 28 и 30. Было установлено, что все указанные белки являются активными в отношении липидных субстратов.Figure 34 shows the matched sequence Pfam00657.11 [family 00657, database version 11] (hereinafter referred to as the matched sequence Pfam) and the comparison of different sequences with the matched sequence Pfam. The arrows indicate the remains of the active site, underlined frames indicate three areas of homology described in the publication [Upton C. and Buckley J.T. (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]. Capital letters in the consistent Pfam sequence indicate conservative residues in many members of the family. The symbol “-“ means a position in which, using the Markov model of hidden profiles of the consistent Pfam sequence, it was supposed to detect a residue that was not present in this position, so a space was entered. The symbol “.” Means a residue that does not have a corresponding residue in the agreed upon Pfam sequence. These sequences are the amino acid sequences shown in figures 2, 16, 18, 20, 26, 28 and 30. It was found that all these proteins are active against lipid substrates.

На фигуре 35 показан экспрессирующий вектор pet12-AsalGCAT=pSM, содержащий С-концевой His-меченный ген липидацилтрансферазы Aeromonas salmonicida.Figure 35 shows the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM containing the C-terminal His-labeled Aeromonas salmonicida lipid acyltransferase gene.

На фигуре 36 приведены результаты исследования клеточных экстрактов при помощи анализа с использованием набора NEFA, которые свидетельствуют об активности рекомбинантной липидацилтрансферазы A. salmonicida в отношениии лицитина.The figure 36 shows the results of a study of cell extracts using analysis using a set of NEFA, which indicate the activity of the recombinant lipid acyltransferase A. salmonicida in relation to lycithin.

В лунках слева направо расположены: положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец (то есть экстракты из пустой плазмиды) и образцы, собранные после культивирования в течение 0, 1, 2 и 3 часов после индукции IPTG.In the wells from left to right are located: a positive control sample, a negative control sample (i.e. extracts from an empty plasmid) and samples collected after cultivation for 0, 1, 2 and 3 hours after IPTG induction.

На фигуре 37 приведены результаты оптимизации роста клеток BL21(DE3)pLysS, содержащих экспрессирующий вектор pet12-AsalGCAT=pSM, которые показывают, что культивирование при 30°С позволяет получить фермент с высокой активностью в отношении лецитина. Клеточные экстракты исследовали на наличие фосфолипазной активности, выполняя анализ с использованием набора NEFA. В лунках слева направо расположены: положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, 20°С, 30°С.The figure 37 shows the results of the optimization of the growth of BL21 (DE3) pLysS cells containing the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM, which show that cultivation at 30 ° C provides an enzyme with high activity against lecithin. Cell extracts were examined for phospholipase activity by performing analysis using the NEFA kit. In the wells from left to right are located: positive control sample, negative control sample, 20 ° C, 30 ° C.

На фигуре 38 показаны неочищенные клеточные экстракты из клеток BL21(DE3)pLysS, экспрессирующие активную липидацилтрансферазу, инкубируемую с лецитиновым субстратом, при этом реакционную смесь анализировали тонкослойной хроматографией, результаты которой свидетельствовали о наличии продуктов разложения. Ряды: 1. Отсутствие фермента; 2. +А.sal-10мкл, 37°С; 3. +А.sal-20мкл, 37°С; 4. +А.sal-10мкл, 24°С; 5. +А.sal-20мкм, 24°С.38 shows crude cell extracts from BL21 (DE3) pLysS cells expressing active lipid acyltransferase incubated with lecithin substrate, the reaction mixture being analyzed by thin layer chromatography, the results of which indicated the presence of decomposition products. Rows: 1. Lack of enzyme; 2. + A.sal-10 μl, 37 ° C; 3. + A.sal-20 μl, 37 ° C; 4. + A.sal-10 μl, 24 ° C; 5. + A.sal-20mkm, 24 ° C.

На фигуре 39 приведены результаты частичной очистки ацилтрансферазы Aeromonas salmonicida, свидетельствующие о наличии фосфолипазной активности в отношении очищенного His-меченного белка. SE=экстракты, обработанные ультразвуком, His=очищенный при помощи набора для центрифугирования Ni-NTA компании Qiagen.Figure 39 shows the results of partial purification of the Aeromonas salmonicida acyltransferase, indicating the presence of phospholipase activity in relation to purified His-labeled protein. SE = sonicated extracts; His = purified using Qiagen Ni-NTA Centrifugation Kit.

На фигуре 40 показан экспрессирующий вектор pet12-A.h. GCAT=pSMa, содержащий С-концевой His-меченный ген глицеролипидацилтрансферазы (GCAT) Aeromonas hydrophila, который был использован для трансформации штамма E.coli BL21(DE3)pLysS.Figure 40 shows the expression vector pet12-Ah GCAT = pSMa containing the C-terminal His-labeled Aeromonas hydrophila glycerolipid acyltransferase (GCAT) gene that was used to transform E. coli strain BL21 (DE3) pLysS.

На фигуре 41 приведены результаты активности неочищенных экстрактов (5 и 10 мкл), содержащих рекомбинантный фермент GCAT Aeromonas hydrophila, которые исследовали в отношении лецитина с использованием набора неэтерифицированных жирных кислот (NEFA) (Roche, Switzerland); полученные результаты свидетельствуют о наличии фермента с активностью в отношении фосфолипида, лецитина.The figure 41 shows the results of the activity of crude extracts (5 and 10 μl) containing the recombinant enzyme GCAT Aeromonas hydrophila , which was investigated against lecithin using a set of non-esterified fatty acids (NEFA) (Roche, Switzerland); The results obtained indicate the presence of an enzyme with activity against phospholipid, lecithin.

На фигуре 42 приведены результаты оптимизации роста клеток BL21(DE3)pLysS, содержащих экспрессирующий вектор pet12-AsalGCAT=pSM, которые показывают, что культивирование при 30°С позволяет получить фермент с высокой активностью в отношении лецитина. Клекточные экстракты анализировали в отношении активности фосфолипазы с использованием набора NEFA.The figure 42 shows the results of the optimization of the growth of BL21 (DE3) pLysS cells containing the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM, which show that cultivation at 30 ° C allows to obtain an enzyme with high activity against lecithin. Cell extracts were analyzed for phospholipase activity using an NEFA kit.

На фигуре 43 приведены результаты частичной очистки ацилтрансфераз Aeromonas hydrophila и A. salmonicida, свидетельствующие о наличии фосфолипазной активности в отношении очищенного His-меченного белка. SE=экстракты, обработанные ультразвуком, His=очищенный при помощи набора для центрифугирования Ni-NTA компании Qiagen.The figure 43 shows the results of partial purification of acyltransferases of Aeromonas hydrophila and A. salmonicida , indicating the presence of phospholipase activity in relation to purified His-labeled protein. SE = sonicated extracts; His = purified using Qiagen Ni-NTA Centrifugation Kit.

На фигуре 44 приведены результаты экспрессии генов Aeromonas в Bacillus subtilis 163, свидетельствующие о продуцировании секретированного фермента с активностью в отношении лецитина и DGDG. pUB-AH=конструкция, содержащая ген A. hydrophila, и pUB-AS=конструкция, содержащая ген A. salmonicida. Фильтрат культуры инкубировали с субстратами в течение 60 минут.The figure 44 shows the results of the expression of the Aeromonas genes in Bacillus subtilis 163, indicating the production of a secreted enzyme with activity against lecithin and DGDG. pUB-AH = construct containing the A. hydrophila gene, and pUB-AS = construct containing the A. salmonicida gene. The filtrate cultures were incubated with substrates for 60 minutes.

На фигуре 45 и фигуре 46 приведены графики, показывающие воздействие жирной кислоты и сложного эфира холестерина в зависимости от времени. Указанные графики отображают результаты, полученные при выполнении анализа методом ГЖХ в процессе измерения ацилтрансферазной активности в пищевом продукте с использованием лецитина и холестерина в буфере, используемом в качестве субстрата.Figure 45 and Figure 46 are graphs showing the effects of fatty acid and cholesterol ester versus time. These graphs show the results obtained by performing GLC analysis in the process of measuring acyltransferase activity in a food product using lecithin and cholesterol in a buffer used as a substrate.

На фигуре 47 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:36) слитой конструкции, используемой для мутагенеза гена липидацилтрансферазы Aeromonas hysrophila в примере 17. Подчеркнутые аминокислоты образуют сигнальный пептид ксиланазы.Figure 47 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 36) of the fusion construct used for mutagenesis of the Aeromonas hysrophila lipid acyltransferase gene in Example 17. The underlined amino acids form the xylanase signal peptide.

На фигуре 48 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:54), кодирующая фермент из Aeromonas hydrophila, включая сигнальный пептид ксиланазы.48 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 54) encoding an enzyme from Aeromonas hydrophila , including the xylanase signal peptide.

На фигуре 49 показана структура конденсатов жирной кислоты белка аминокислот.Figure 49 shows the structure of the fatty acid condensates of an amino acid protein.

На фигуре 50 показана схема взаимодействия жирной кислоты, выделенной из фосфатидилхолина, при переносе в свободную гидроксильную группу аминокислот, содержащих свободную гидроксильную группу, пригодную для этерификации, например тирозин или серин.The figure 50 shows the interaction diagram of a fatty acid isolated from phosphatidylcholine when transferred to a free hydroxyl group of amino acids containing a free hydroxyl group suitable for esterification, for example tyrosine or serine.

На фигуре 51 показана схема взаимодействия DGDG и глюкозы, катализируемого липидацилтрансферазой.The figure 51 shows a diagram of the interaction of DGDG and glucose catalyzed by lipid acyltransferase.

ПримерыExamples

Пример 1. Клонирование, секвенирование и гетерологичная экспрессия трансферазы из Aeromonas salmonicida, подвид Salmonicida Example 1. Cloning, sequencing and heterologous expression of transferase from Aeromonas salmonicida , subspecies Salmonicida

Используемые штаммыUsed strains

Aeromonas salmonicida, подвид Salmonicida (АТСС 14174), полученный из Американской коллекции типовых культур (АТСС), выращивали в течение ночи при 30°С на среде Лурия-Бертани (LB). Клетки центрифугировали и геномную ДНК выделяли методами, применяемыми для выделения геномной ДНК, компании Qiagen Ltd. Буфер для геномной ДНК (№ по каталогу 19060), протеаза К (№ по каталогу 19131) и РНКаза А (№ по каталогу 19101) были приобретены в компании Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX). Aeromonas salmonicida, a subspecies of Salmonicida (ATCC 14174), obtained from the American Type Culture Collection (ATCC), was grown overnight at 30 ° C in Luria-Bertani (LB) medium. Cells were centrifuged and genomic DNA was isolated by the methods used to isolate genomic DNA from Qiagen Ltd. Genomic DNA buffer (catalog number 19060), protease K (catalog number 19131) and RNase A (catalog number 19101) were purchased from Qiagen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).

Бактериальный штамм-хозяин BL21(DE3)pLysS (Novagen) использовали для продуцирования рекомбинантных ферментов Aeromonas. Компетентные клетки BL21(DE3)pLysS использовали в качестве хозяина для трансформации экспрессирующим вектором pet12-AsalGCAT=pSM. Трансформанты, содержащие соответствующую плазмиду, выращивали при 37°С на агаровой среде LB, содержащей 100 мкг ампициллина/мл.The bacterial host strain BL21 (DE3) pLysS (Novagen) was used to produce Aeromonas recombinant enzymes. Competent BL21 (DE3) pLysS cells were used as a host for transformation with the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM. Transformants containing the corresponding plasmid were grown at 37 ° C on LB agar medium containing 100 μg ampicillin / ml.

Создание экспрессирующего вектора pet12-AsalGCAT-pSMThe creation of the expression vector pet12-AsalGCAT-pSM

Геномную ДНК (0,2-1 мкл) использовали в качестве матрицы для амплификации ДНК генов трансферазы из Aeromonas и ДНК-полимеразу pfu (2,5 ед.) использовали с 10 мкл 10-кратного буфера для pfu, 1 мкл каждой затравки (50 пМоль/мкл), 200 мкМ dNTP в общем объеме реакционной смеси, равном 100 мкл. Реакции PCR выполняли в программируемом термоблоке в нижеследующих условиях: при 95°С в течение 30 секунд, 30 циклов при 95°С в течение 30 секунд, при 60°С в течение 1 минуты и при 68°С в течение 2 минут. Производили дополнительное удлинение цепи при 72°С в течение 5 минут.Genomic DNA (0.2-1 μl) was used as a template for amplification of DNA transferase genes from Aeromonas and pfu DNA polymerase (2.5 units) was used with 10 μl of 10-fold pfu buffer, 1 μl of each seed (50 pmol / μl), 200 μm dNTP in the total volume of the reaction mixture, equal to 100 μl. PCR reactions were performed in a programmable fuser under the following conditions: at 95 ° C for 30 seconds, 30 cycles at 95 ° C for 30 seconds, at 60 ° C for 1 minute, and at 68 ° C for 2 minutes. Additional chain elongation was performed at 72 ° C for 5 minutes.

Ген трансферазы из A. salmonicida амплифицировали методом PCR, выполняя 2 отдельные реакции PCR. Первую реакцию PCR выполняли, используя две затравки, 1USNEW(5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG3' [SEQ ID NO:36] и asls950new (5' GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3' [SEQ ID NO:37]. Вторую реакцию РCR выполняли для введения С-концевой гистидиновой метки, используя продукт PCR, полученный в результате выполнения первой реакции, и затравки: 1USNEW (5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG 3' [SEQ ID NO:38] и AHLS1001 (5'TTGGATCC GAATTCAT CAATG GTG ATG GTG ATG GTG GGC3' [SEQ ID NO:39]). Продукт PCR, полученный в результате выполнения второй реакции, очищали и расщепляли рестрикционными ферментами Ndel и BamHI. 2 мкг ДНК вектора рЕТ 12а также расщепляли рестрикционными ферментами Ndel и BamHI и обрабатывали фосфатазой. Обработанный рестрикционным ферментом вектор pet12a и продукт РCR, полученный в результате выполнения второй реакции, очищали и лигировали, используя набор для экспресс-лигирования (Roche, Switzerland). Лигированную смесь использовали для трансформации клеток ТОР10 E.coli. Трансформанты культивировали на агаровой среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.The transferase gene from A. salmonicida was amplified by PCR by performing 2 separate PCR reactions. The first PCR reaction was performed using two primers, 1USNEW (5'AGCATATGAAAA AATGGTTTGT TTGTTTATTG GGG3 '[SEQ ID NO: 36] and asls950new (5' GTG ATG GTG GGC GAG GAA CTC GTA CTG3 '[SEQ ID NO: 37]. PCR was performed to introduce the C-terminal histidine tag using the PCR product from the first reaction and seed: 1USNEW (5'AGCATATGAAAA AATGGTTTTT TTGTTTATTG GGG 3 '[SEQ ID NO: 38] and AHLS1001 (5'TTTGGATG GAATTC ATG GTG ATG GTG GGC3 '[SEQ ID NO: 39]). The second reaction PCR product was purified and digested with restriction enzymes Ndel and BamHI. 2 μg of pET 12a vector DNA was also digested with restriction enzymes. rmentami Ndel and BamHI and treated with phosphatase. restriction enzyme treated vector pet12a and PCR product obtained by performing the second reaction was purified and ligated using the kit for rapid ligation (Roche, Switzerland). The ligation mixture was used to transform TOP10 E.coli cells . Transformants were cultured on LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin.

Промоторную затравку Т7 (5'TAATACGACTCACTATAG3' [SEQ ID NO:40]) и терминаторную затравку Т7 (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3' [SEQ ID NO:41]) использовали для проверки последовательностей и ориентации клонированных генов трансферазы в векторе pET12a. ДНК секвенировали при помощи набора для секвенирования ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle, используя 500 нг плазмидной ДНК в качестве матрицы и 3,2 пМоль промоторных и терминаторных затравок Т7.The T7 promoter seed (5'TAATACGACTCACTATAG3 '[SEQ ID NO: 40]) and the T7 terminator seed (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3' [SEQ ID NO: 41]) were used to verify the sequences and orientation of the cloned transferase genes in the pET12a vector. DNA was sequenced using the ABI Prism® BigDye ™ Terminators Cycle Sequencing Kit using 500 ng of plasmid DNA as template and 3.2 pM T7 promoter and terminator seeds.

Конструкцию, показанную на фигуре 35, использовали для трансформации компетентного бактериального штамма-хозяина BL21(DE3)pLysS (Novagen), после чего устойчивые к ампициллину трансформанты собирали и использовали для анализа экспрессии.The construct shown in FIG. 35 was used to transform the competent bacterial host strain BL21 (DE3) pLysS (Novagen), after which ampicillin-resistant transformants were harvested and used for expression analysis.

Экспрессия рекомбинантной липидацилтрансферазы из Aeromonas salmonicida Expression of Recombinant Lipid Acyltransferase from Aeromonas salmonicida

Активность фермента в отношении лецитина определяли количественным методом на клеточных экстрактах, используя набор неэтерифицированных жирных кислот (NEFA) (Roche, Switzerland).The activity of the enzyme against lecithin was determined quantitatively on cell extracts using a set of unesterified fatty acids (NEFA) (Roche, Switzerland).

Как показано на фигуре 36, клетки BL21(DE3)pLysS, содержащие экспрессирующий вектор pet12-AsalGCAT=pSM, выращивали на среде LB с 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали, встряхивая, при 37°С до достижения оптической плотности OD₆₀₀=0,6-1,0. Затем культуры индуцировали, используя IPTG (0,4 мМ), и продолжали инкубировать в течение следующих 3 часов. Образцы отбирали через 0, 1, 2 и 3 часа после индукции IPTG. Активность фермента исследовали, используя набор NEFA и лецитин в качестве субстрата.As shown in FIG. 36, BL21 (DE3) pLysS cells containing the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM were grown on LB medium with 100 μg / ml ampicillin and incubated by shaking at 37 ° C until an optical density of OD ₆₀₀ = 0 was reached. 6-1.0. Cultures were then induced using IPTG (0.4 mM) and incubation continued for the next 3 hours. Samples were taken at 0, 1, 2, and 3 hours after IPTG induction. The enzyme activity was investigated using a set of NEFA and lecithin as a substrate.

Оптимизация роста для получения более активных ферментовGrowth Optimization for More Active Enzymes

Клетки BL21(DE3)pLysS, содержащие экспрессирующий вектор pet12-AsalGCAT=pSM, выращивали на среде LB с 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали, встряхивая, при разных температурах выращивания (37°С, 30°С и 20°С). Оптимальные условия для продуцирования активного фермента липидацилтрансферазы соответствовали выращиванию культур при 30°С, как показано на фигуре 37.BL21 (DE3) pLysS cells containing the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM were grown on LB medium with 100 μg / ml ampicillin and incubated, shaking, at different growth temperatures (37 ° C, 30 ° C, and 20 ° C). The optimal conditions for the production of the active enzyme lipid acyltransferase corresponded to the cultivation of cultures at 30 ° C, as shown in figure 37.

Частичная очистки рекомбинантной трансферазы из Aeromonas salmonicida Partial purification of recombinant transferase from Aeromonas salmonicida

Штамм клеток BL21(DE3)pLysS, содержащих экспрессирующий вектор pet12-AsalGCAT=рSM, выращивали при 37°С и неочищенные клеточные экстракты получали, производя обработку ультразвуком. Рекомбинантный фермент затем очищали от обработанных ультразвуком неочищенных клеточных экстрактов при помощи набора для центрифугирования Ni-NTA компании Qiagen. Активность фосфолипазы определяли, используя набор NЕFA и лецитин в качестве субстрата. Неочищенные клеточные экстракты из клеток BL21(DE3)pLysS, экспрессирующих активную трансферазу, инкубировали с лецитином, используемым в качестве субстрата, и реакционную смесь анализировали тонкослойной хроматографией, результаты которой свидетельствовали о наличии продуктов разложения (см. фигуру 38).The strain of BL21 (DE3) pLysS cells containing the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM was grown at 37 ° C and the crude cell extracts were obtained by sonication. The recombinant enzyme was then purified from sonicated crude cell extracts using a Qiagen Ni-NTA centrifugation kit. Phospholipase activity was determined using a set of NEFA and lecithin as a substrate. The crude cell extracts from BL21 (DE3) pLysS cells expressing active transferase were incubated with the lecithin used as a substrate, and the reaction mixture was analyzed by thin layer chromatography, the results of which indicated the presence of decomposition products (see figure 38).

Частичная очистка рекомбинантной трансферазы из Aeromonas salmonicidaе Partial purification of recombinant transferase from Aeromonas salmonicidae

Штамм клеток BL21(DE3)pLysS, содержащих экспрессирующий вектор pet12-AsalGCAT=pSM, выращивали при 37°С и неочищенные клеточные экстракты получали, производя обработку ультразвуком. Рекомбинантный фермент затем очищали от обработанного ультразвуком неочищенного клеточного экстракта, используя набор для центрифугирования Ni-NTA компании Qiagen. Активность фосфолипазы определяли, используя набор NEFA и лецитин в качестве субстрата (см. фигуру 39).The strain of BL21 (DE3) pLysS cells containing the expression vector pet12-AsalGCAT = pSM was grown at 37 ° C and the crude cell extracts were obtained by sonication. The recombinant enzyme was then purified from the sonicated crude cell extract using a Qiagen Ni-NTA centrifugation kit. Phospholipase activity was determined using a set of NEFA and lecithin as a substrate (see figure 39).

Пример 2. Клонирование и экспрессия трансферазы из Aeromonas hydrophila в E.coli Example 2. Cloning and expression of transferase from Aeromonas hydrophila in E. coli

Aeromonas hydrophila (АТСС № 7965), полученный из Американской коллекции типовых культур, выращивали в течение ночи при 30°С на среде Лурия-Бертани (LB). Клетки центрифугировали и выделяли геномную ДНК методами выделения геномной ДНК компании Qiagen Ltd. Буфер для геномной ДНК( № по каталогу 19060), протеаза К (№ по каталогу 19131) и РНКаза А (№ по каталогу 19101) были приобретены в компании Quigen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX). Aeromonas hydrophila (ATCC No. 7965), obtained from the American Type Culture Collection, was grown overnight at 30 ° C. in Luria-Bertani (LB) medium. Cells were centrifuged and genomic DNA was isolated by Qiagen Ltd. genomic DNA extraction methods. Genomic DNA buffer (catalog number 19060), protease K (catalog number 19131) and RNase A (catalog number 19101) were purchased from Quigen Ltd. (Boundary court Gatwick Court, West Sussex, RH10 2AX).

Бактериальный штамм-хозяин BL21(DE3)pLysS (Novagen) использовали для продуцирования рекомбинантных ферментов Aeromonas. Компетентные клетки BL21(DE3)pLysS использовали в качестве хозяина для трансформации экспрессирующим вектором pet12-A.h.GCAT=pSMа. Трансформанты, содержащие соответствующую плазмиду, выращивали при 37°С на агаровой среде LB, содержащей 100 мкг ампициллина/мл.The bacterial host strain BL21 (DE3) pLysS (Novagen) was used to produce Aeromonas recombinant enzymes. Competent BL21 (DE3) pLysS cells were used as the host for transformation with the expression vector pet12-AhGCAT = pSMa. Transformants containing the corresponding plasmid were grown at 37 ° C on LB agar medium containing 100 μg ampicillin / ml.

Создание экспрессирующего вектора pet12a-A.h.GCAT-pSMaThe creation of the expression vector pet12a-A.h.GCAT-pSMa

Геномную ДНК (0,2-1 мкл) использовали в качестве матрицы для амплификации ДНК гена трансферазы из Aeromonas и ДНК-полимеразу pfu (2,5 ед.) использовали с 10 мкл 10-кратного буфера для pfu, 1 мкл каждой затравки (50 пМоль/мкл), 200 мкМ dNTP в общем объеме реакционной смеси, равном 100 мкл. Реакции PCR выполняли в программируемом термоблоке в нижеследующих условиях: при 95°С в течение 30 секунд, 30 циклов при 95°С в течение 30 секунд, при 60°С в течение 1 минуты и при 68°С в течение 2 минут. Производили дополнительное удлинение цепи при 72°С в течение 5 минут.Genomic DNA (0.2-1 μl) was used as a template for amplification of the transferase gene DNA from Aeromonas and pfu DNA polymerase (2.5 units) was used with 10 μl of 10-fold pfu buffer, 1 μl of each seed (50 pmol / μl), 200 μm dNTP in the total volume of the reaction mixture, equal to 100 μl. PCR reactions were performed in a programmable fuser under the following conditions: at 95 ° C for 30 seconds, 30 cycles at 95 ° C for 30 seconds, at 60 ° C for 1 minute, and at 68 ° C for 2 minutes. Additional chain elongation was performed at 72 ° C for 5 minutes.

Ген трансферазы из A. hydrophila (АТСС № 7965) амплифицировали методом PCR, выполняя две отдельные реакции PCR.The transferase gene from A. hydrophila (ATCC No. 7965) was amplified by PCR by performing two separate PCR reactions.

Первую реакцию PCR выполняли, используя две затравки, AHUS1 (5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC 3', SEQ ID NO:42) и ahls950 (5'ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG 3', SEQ ID NO:43).The first PCR reaction was performed using two primers, AHUS1 (5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC 3 ', SEQ ID NO: 42) and ahls950 (5'ATGGTGATGGTGGGCGAGGAACTCGTACTG 3').

Вторую реакцию PCR выполняли для введения С-концевой гистидиновой метки, используя продукт PCR, полученный в результате выполнения первой реакции, и две затравки:A second PCR reaction was performed to introduce a C-terminal histidine tag using the PCR product obtained from the first reaction and two seeds:

AHUS1(5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3', SEQ ID NO:44) и AHLS1001 (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3', SEQ ID NO:45).AHUS1 (5'GTCATATGAAAAAATGGTTTGTGTGTTTATTGGGATTGGTC3 ', SEQ ID NO: 44) and AHLS1001 (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATGGTGATGGTGGGC3', SEQ ID NO: 45).

Продукт PCR, полученный в результате выполнения второй реакции, очищали и расщепляли рестрикционными ферментами Ndel и BamHI. 2 мкг ДНК вектора рЕТ12а также расщепляли рестрикционными ферментами Ndel и BamHI и обрабатывали фосфатазой. Обработанный рестрикционным ферментом вектор pet12a и продукт РCR, полученный в результате выполнения второй реакции, очищали и лигировали, используя набор для экспресс-лигирования (Roche, Switzerland). Лигированную смесь использовали для трансформации клеток ТОР10 E.coli. Трансформанты культивировали на агаровой среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.The PCR product resulting from the second reaction was purified and digested with restriction enzymes Ndel and BamHI. 2 μg of pET12a vector DNA was also digested with restriction enzymes Ndel and BamHI and treated with phosphatase. The restriction enzyme-treated vector pet12a and the PCR product from the second reaction were purified and ligated using an express ligation kit (Roche, Switzerland). The ligation mixture was used to transform E. coli TOP10 cells. Transformants were cultured on LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin.

Промоторную затравку Т7 (5'TAATACGACTCACTATAG3') и терминаторную затравку Т7 (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3') использовали для проверки последовательностей и ориентации клонированных генов GCAT в векторе pET12a. ДНК секвенировали при помощи набора для секвенирования ABI Prism® BigDye™ Terminators Cycle, используя 500 нг плазмидной ДНК в качестве матрицы и 3,2 пМоль промоторных и терминаторных затравок Т7.The T7 promoter seed (5'TAATACGACTCACTATAG3 ') and the T7 terminator seed (5'CTAGTTATTGCTCAGCGG3') were used to check the sequences and orientation of the cloned GCAT genes in pET12a vector. DNA was sequenced using the ABI Prism® BigDye ™ Terminators Cycle Sequencing Kit using 500 ng of plasmid DNA as template and 3.2 pM T7 promoter and terminator seeds.

Конструкцию, показанную на фигуре 40, использовали для трансформации компетентного бактериального штамма-хозяина BL21(DE3)pLysS (Novagen), после чего устойчивые к ампициллину трансформанты собирали и использовали для анализа экспрессии.The construct shown in FIG. 40 was used to transform the competent bacterial host strain BL21 (DE3) pLysS (Novagen), after which ampicillin-resistant transformants were harvested and used for expression analysis.

Экспрессия трансферазы из Aeromonas hydrophila в клетках BL21(DE3)pLysSTransferase expression from Aeromonas hydrophila in BL21 (DE3) pLysS cells

Штамм клеток BL21(DE3)pLysS E.coli, содержащих экспрессирующий вектор pet12а-A.h.GCAT=pSMа, выращивали на среде LB с 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали, встряхивая, при 37°С до достижения оптической плотности OD₆₀₀=0,6-1,0. Затем культуры индуцировали, используя IPTG (0,4 мМ), и продолжали инкубировать в течение следующих 3 часов. Образцы отбирали через 0, 1, 2 и 3 часа после индукции IPTG. Активность фермента исследовали, используя набор NEFA и лецитин в качестве субстрата (фигура 41).The strain of BL21 (DE3) pLysS E. coli cells containing the expression vector pet12a-AhGCAT = pSMa was grown on LB medium with 100 μg / ml ampicillin and incubated, shaking, at 37 ° C until the optical density OD ₆₀₀ = 0.6- 1,0. Cultures were then induced using IPTG (0.4 mM) and incubation continued for the next 3 hours. Samples were taken at 0, 1, 2, and 3 hours after IPTG induction. The enzyme activity was investigated using a set of NEFA and lecithin as a substrate (figure 41).

Клетки BL21(DE3)pLysS, содержащие экспрессирующий вектор pet12а-A.h.GCAT=pSMа, выращивали на среде LB с 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали, встряхивая, при разных температурах выращивания (37°С, 30°С и 20°С). Оптимальные условия для продуцирования активного фермента GCAT соответствовали выращиванию культур при 30°С, как показано на фигуре 42.BL21 (DE3) pLysS cells containing the expression vector pet12a-A.h.GCAT = pSMa were grown on LB medium with 100 μg / ml ampicillin and incubated, shaking, at different growth temperatures (37 ° C, 30 ° C, and 20 ° C). The optimal conditions for the production of the active GCAT enzyme corresponded to the cultivation of cultures at 30 ° C, as shown in figure 42.

Частичная очистки рекомбинантной трансферазы из A.hydrophila (GCAT)Partial Purification of Recombinant Transferase from A.hydrophila (GCAT)

Штамм клеток BL21(DE3)pLysS, содержащих экспрессирующий вектор pet12а-A.h.GCAT=рSMа, выращивали при 37°С и неочищенные клеточные экстракты получали, производя обработку ультразвуком. Рекомбинантный фермент затем очищали от обработанных ультразвуком неочищенных клеточных экстрактов при помощи набора для центрифугирования Ni-NTA компании Qiagen. Активность фосфолипазы анализировали, используя набор NEFA и лецитин в качестве субстрата. (фигура 43).The strain of BL21 (DE3) pLysS cells containing the expression vector pet12a-A.h.GCAT = pSMa was grown at 37 ° C and the crude cell extracts were obtained by sonication. The recombinant enzyme was then purified from sonicated crude cell extracts using a Qiagen Ni-NTA centrifugation kit. Phospholipase activity was analyzed using a set of NEFA and lecithin as a substrate. (figure 43).

Пример 3. Экспрессия трансфераз из Aeromonas в Bacillus subtilis 163Example 3. Expression of transferases from Aeromonas to Bacillus subtilis 163

Создание плазмидыCreation of a plasmid

Для гетерологичной экспрессии генов Aeromonas в Bacillus subtilis использовали два разных экспрессирующих вектора Bacillus subtilis (pUB110 и рВЕ5). Вектор pUB110 содержит альфа-амилазный промотор, в то время как вектор рВЕ содержит промотор Р32 в виде регуляторной области для экспрессии слитых генов Aeromonas. В векторе pUB110 первая аминокислота зрелых генов GCAT Aeromonas была слита в рамке считывания с последней аминокислотой последовательности сигнального пептида ксиланазы из Bacillus subtilis на сайте рестрикции Nhe1, создавая две дополнительные аминокислоты впереди зрелых белков. Вектор РВЕ5 содержит сигнальную последовательность cgtase, слитую на сайте Ncol для секреции рекомбинантных белков в фильтрат культуры.For heterologous expression of Aeromonas genes in Bacillus subtilis , two different Bacillus subtilis expression vectors (pUB110 and pBE5) were used. The pUB110 vector contains the alpha-amylase promoter, while the pBE vector contains the P32 promoter as a regulatory region for the expression of Aeromonas fusion genes. In vector pUB110, the first amino acid of the mature GCAT Aeromonas genes was fused to the last amino acid of the sequence of the Bacillus subtilis xylanase signal peptide at the Nhe1 restriction site, creating two additional amino acids ahead of the mature proteins. The PBE5 vector contains the cgtase signal sequence fused at the Ncol site for secretion of recombinant proteins into the culture filtrate.

Реакции РCR выполняли для слияния генов Aeromonas в рамке считывания с сигнальными последовательностями векторов pUB110 и рВЕ5. Реакции PCR выполняли, используя две нижеследующие затравки для гена A. hydrophila.PCR reactions were performed to fuse Aeromonas genes in the reading frame with the signal sequences of the vectors pUB110 and pBE5. PCR reactions were performed using the two following primers for the A. hydrophila gene.

Первая реакция PCR: usAHncol (5'ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEQ ID NO:46) и 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID NO:47).First PCR reaction: usAHncol (5'ATGCCATGGCCGACAGCCGTCCCGCC3 ', SEQ ID NO: 46) and 1sAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID NO: 47).

Вторая реакция PCR: US-AhnheI (5'TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3', SEQ ID NO:48) и lsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID NO:49).Second PCR reaction: US-AhnheI (5'TTGCTAGCGCCGACAGCCGTCCCGCC3 ', SEQ ID NO: 48) and lsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID NO: 49).

Реакции PCR выполняли, используя две нижеследующие затравки для гена A. salmonicida.PCR reactions were performed using the two following primers for the A. salmonicida gene.

Третья реакция PCR: US-Asncol (5'TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3', SEQ ID NO:50) и lsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID NO:51).Third PCR reaction: US-Asncol (5'TTGCCATGGCCGACACTCGCCCCGCC3 ', SEQ ID NO: 50) and lsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID NO: 51).

Четвертая реакция PCR: US-ASnhel (5'TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3', SEQ ID NO:52) и lsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID NO:53).Fourth PCR Reaction: US-ASnhel (5'TTGCTAGCGCCGACACTCGCCCCGCC3 ', SEQ ID NO: 52) and lsAH (5'TTGGATCCGAATTCATCAATGGTGATG3', SEQ ID NO: 53).

Все продукты PCR клонировали по тупому концу II PCR (вектор ТОРО) и секвенировали с использованием нижней и верхней затравок для секвенирования.All PCR products were cloned at the blunt end of PCR II (TOPO vector) and sequenced using the lower and upper primers for sequencing.

Клоны, полученные в результате выполнения реакций PCR 1 и 3, разрезали Ncol и BamHI и использовали в качестве вставок для лигирования с вектором рВЕ5, разрезанным Ncol/BamHI/фосфатазой. Клоны, полученные в результате выполнения реакций РCR 2 и 4, разрезали Nhel и BamHI и использовали в качестве вставок для лигирования с вектором pUB, разрезанным Nhel/BamHl/фосфатазой.Clones obtained by performing PCR reactions 1 and 3 were cut with Ncol and BamHI and used as ligation inserts with the pBE5 vector cut with Ncol / BamHI / phosphatase. Clones obtained from PCR reactions 2 and 4 were cut with Nhel and BamHI and used as ligation inserts with the pUB vector cut with Nhel / BamHl / phosphatase.

Экспрессия генов трансферазы из Aeromonas в Bacillus subtilis и исследование ферментативной активностиThe expression of transferase genes from Aeromonas in Bacillus subtilis and the study of enzymatic activity

Ацилтрансферазы, полученные из двух видов Aeromonas, были успешно экспрессированы в E.coli (результаты приведены выше). Слитые конструкции генов в векторах pUB110 и рВЕ5 Bacillus использовали для трансформации Bacillus subtilis и трансформанты отбирали, культивируя клетки на планшетах с канамицином. Устойчивые к канамицину трансформанты, выделенные и выращенные в 2-кратном объеме YT, способны гетерологично экспрессировать гены Aeromonas в Bacillus. Фильтраты культуры обладают галактолипазной активностью дигалактозилдиацилглицерина (DGDG) помимо ацилтрансферазной и фосфолипазной активностей. Активность в отношении дигалактозилдиацил-глицерина (DGDG) и активность в отношении лецитина измеряли после инкубации супернатанта культуры с субстратом DGDG из пшеничной муки (приобретенной в компании Sigma) в течение 60 минут, как показано на фигуре 44. Bacillus продуцировал фермент в виде секретированного белка при культивировании в культуральной среде в течение периода от 20-24 часов до 48 часов. В некоторых случаях было установлено, что экспрессия генов Aeromonas влияет на жизнеспособность и рост клеток в Вacillus и E.coli, поэтому необходимо тщательно отбирать экспрессирующие штаммы и оптимизировать условия роста для гарантии экспрессии. Например, несколько штаммов-хозяев Bacillus (B.s 163, DB104 и OS21) трансформировали экспрессирующими векторами для сравнения роста. Штамм B.s163 трансформируется двумя генами Aeromonas и способен экспрессировать активный белок. Штамм DB104 трансформируется всеми конструкциями, но способен экспрессировать только трансферазу из A. salmonicida.Acyltransferases obtained from two Aeromonas species were successfully expressed in E. coli (results are given above). Gene fusions in vectors pUB110 rVE5 Bacillus and used to transform Bacillus subtilis and transformants were selected by culturing the cells on plates with kanamycin. Kanamycin-resistant transformants isolated and grown in a 2-fold volume of YT are able to heterologously express Aeromonas genes in Bacillus . Culture filtrates possess galactolipase activity of digalactosyldiacylglycerol (DGDG) in addition to acyltransferase and phospholipase activities. Digalactosyldiacyl-glycerol (DGDG) activity and lecithin activity were measured after incubating the culture supernatant with DGDG substrate from wheat flour (purchased from Sigma) for 60 minutes, as shown in Figure 44. Bacillus produced the enzyme as a secreted protein when cultivation in a culture medium for a period from 20-24 hours to 48 hours. In some cases, it was found that the expression of Aeromonas genes affects cell viability and growth in Bacillus and E. coli , therefore, it is necessary to carefully select expressing strains and optimize the growth conditions to guarantee expression. For example, several Bacillus host strains (Bs 163, DB104, and OS21) were transformed with expression vectors to compare growth. The B.s163 strain is transformed with two Aeromonas genes and is able to express the active protein. Strain DB104 is transformed by all constructs, but is able to express only transferase from A. salmonicida .

Пример 4. Ферментация и очистка липидацилтрансфераз из Aeromonas, продуцированных в E.coli Example 4. Fermentation and purification of lipid acyltransferases from Aeromonas produced in E. coli

Ферментация E.coli Fermentation of E. coli

МикроорганизмыMicroorganisms

В данном исследовании были использованы два штамма Eschericia coli, один из которых содержал липидацилтрансферазу из Aeromonas hydrophila (пример 2) и второй содержал липидацилтрансферазы из Aeromonas salmonicida (пример 1).Two strains of Eschericia coli were used in this study, one of which contained a lipid acyltransferase from Aeromonas hydrophila (Example 2) and the second one contained a lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida (Example 1).

Штамм E.coli, содержавший ген A. hydrophila, получил название DIDK0124, и штамм E.coli, содержавший ген A. salmonicida, получил название DIDK0125. Ферментация DIDK0124 получила название HYDRO0303, и ферментация DIDK0125 получила название SAL0302. Очищенный белок, полученный в результате HYDRO025, был назван REF#138. Очищенный белок, полученный в результате HYDRO0303, был назван REF#135.The E. coli strain containing the A. hydrophila gene was named DIDK0124, and the E. coli strain containing the A. salmonicida gene was called DIDK0125. Fermentation DIDK0124 was named HYDRO0303, and fermentation DIDK0125 was called SAL0302. The purified protein obtained by HYDRO025 was named REF # 138. The purified protein obtained by HYDRO0303 was named REF # 135.

Питательные среды и условия культивированияCulture media and cultivation conditions

Агаровая среда LBAgar medium LB

Планшеты с агаровой средой LB, используемые для культивирования штаммов, содержали: 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 15 г/л агара, 100 мг/л ампициллина и 35 мг/л хлорамфеникола. Планшеты с агаровой средой инкубировали при 30°С.The LB agar plate tablets used for culturing the strains contained: 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 5 g / L NaCl, 15 g / L agar, 100 mg / L ampicillin and 35 mg / L chloramphenicol. Agar plate plates were incubated at 30 ° C.

Встряхиваемая колба со средой LBShake flask with LB medium

Среда LB (50 мл в одной встряхиваемой колбе), используемая для продуцирования инокулята для культивирования в биореакторе, содержала: 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 100 мг/л ампициллина и 35 мг/л хлорамфеникола. Встряхиваемые колбы инокулировали культурой с планшетов с агаровой средой LB и инкубировали при 30°С и скорости вращения 200 оборотов/мин.LB medium (50 ml in one shake flask) used to produce an inoculum for cultivation in a bioreactor contained: 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 5 g / L NaCl, 100 mg / L ampicillin and 35 mg / l chloramphenicol. Shake flasks were inoculated with culture from LB agar plates and incubated at 30 ° C. and 200 rpm.

Культивирование в биореактореCultivation in a bioreactor

Для культивирования в биореакторе использовали биореакторы емкостью 6 л, созданные в собственной лаборатории, которые наполняли 4 л среды, содержащей: 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 8 г/л КН₂РО₄, 0,9 г/л MgSO₄·7Н₂О, 40 г/л моногидрата глюкозы, 0,4 мл/л ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, The Netherlands), 10 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O, 0,7 мг/л CuSO₄·5H₂O, 3 мг/л ZnSO₄·7H₂O, 3 мг/л MnSO₄·H₂O, 10мг/л EDTA, 0,1 мг/л NiSO₄·6H₂O, 0,1 мг/л СоCl₂, 0,1 мг/л Н₃ВО₄, 0,1 мг/л KI, 0,1 мг/л Na₂MoO₄·2H₂O, 1 г/л ампициллина и 35 мг/л хлорамфеникола.For cultivation in a bioreactor used bioreactors with a capacity of 6 l, created in our own laboratory, which filled 4 l of medium containing: 10 g / l of tryptone, 5 g / l of yeast extract, 5 g / l of NaCl, 8 g / l of KH ₂ PO ₄ , 0.9 g / l MgSO ₄ · 7H ₂ O, 40 g / l glucose monohydrate, 0.4 ml / l ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, The Netherlands), 10 mg / l ( NH ₄ ) ₂ Fe (SO ₄ ) ₂ · 6H ₂ O, 0.7 mg / L CuSO ₄ · 5H ₂ O, 3 mg / L ZnSO ₄ · 7H ₂ O, 3 mg / L MnSO ₄ · H ₂ O, 10 mg / L EDTA, 0.1 mg / L NiSO ₄ · 6H ₂ O, 0.1 mg / L CoCl ₂ , 0.1 mg / L H ₃ BO ₄ , 0.1 mg / L KI, 0.1 mg / l Na ₂ MoO ₄ · 2H ₂ O, 1 g / l of ampicillin and 35 mg / l of chloramphenicol.

Биореакторы инокулировали культурой LB в количестве, гарантирующем окончание роста после культивирования в течение примерно через 20 часов (высчитано с учетом максимальной удельной скорости роста 0,6 час^-1, OD₆₀₀ в стряхиваемой колбе со средой LB и конечного значения OD₆₀₀ в биореакторе примерно через 20 часов).The bioreactors were inoculated with LB culture in an amount guaranteeing the completion of growth after cultivation for about 20 hours (calculated taking into account the maximum specific growth rate of 0.6 h ^-1 , OD ₆₀₀ in a shake flask with LB medium and the final value of OD ₆₀₀ in the bioreactor after about 20 hours).

Ферментер SAL0302 инокулировали 10 мл культуры LB и ферментер HYDRO0303 инокулировали 4 мл культуры LB.Fermenter SAL0302 was inoculated with 10 ml of LB culture and fermenter HYDRO0303 was inoculated with 4 ml of LB culture.

Биореакторы действовали в следующих условиях: температура 30°С, перемешивание со скоростью 800-1000 оборотов/мин (в зависимости от эксперимента), аэрация со скоростью 5 л/мин, рН 6,9, контрольное значение рН 8,75% (мас./об.) при добавлении смеси NH₃-вода и 2М раствора H₂SO₄. Индукция достигалась путем добавления изопропил-β-D-тиогалактозида до конечной концентрации 0,6 мМ, при которой было продуцировано соответственно 0,4 моля (HUDRO0303) и 0,7 моль СО₂.Bioreactors operated under the following conditions: temperature 30 ° C, stirring at a speed of 800-1000 rpm / min (depending on the experiment), aeration at a speed of 5 l / min, pH 6.9, control pH 8.75% (wt. / vol.) when adding a mixture of NH ₃ water and 2M solution of H ₂ SO ₄ . Induction was achieved by adding isopropyl-β-D-thiogalactoside to a final concentration of 0.6 mM, at which 0.4 mol (HUDRO0303) and 0.7 mol of CO ₂ were produced, respectively.

Сбор биомассыBiomass harvesting

Сбор и гомогенизацию биомассы выполняли нижеследующим способом.The collection and homogenization of biomass was performed as follows.

1) Ферментационный бульон, полученный в результате ферментаций, центрифугировали с ускорением 5000g при 4°С в течение 10 минут и удаляли супернатант. Биомассу хранили при -20°С до использования. Затем биомассу оттаивали и вторично суспендировали в 500 мл 20 мМ NaH₂PO₄, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и полного ингибитора протеазы (без EDTA) (Roche, Germany).1) The fermentation broth obtained by fermentation was centrifuged with an acceleration of 5000g at 4 ° C for 10 minutes and the supernatant was removed. Biomass was stored at -20 ° C until use. The biomass was then thawed and resuspended in 500 ml of 20 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 7.4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole and a complete protease inhibitor (without EDTA) (Roche, Germany).

2) Суспендированную биомассу гомогенизировали под давлением 2 кбар и 4°С в клеточном дезинтеграторе компании Constant Systems Ltd (Warwick, UK).2) The suspended biomass was homogenized under a pressure of 2 kbar and 4 ° C in a cell disintegrator from Constant Systems Ltd (Warwick, UK).

3) Клеточный дебрис удаляли центрифугированием с ускорением 10000g при 4°С в течение 30 минут, после чего собирали супернатант.3) Cell debris was removed by centrifugation with an acceleration of 10,000 g at 4 ° C for 30 minutes, after which the supernatant was collected.

4) Супернатант очищали центрифугированием с ускорением 13700g при 4°С в течение 60 минут, после чего супернатант собирали.4) The supernatant was purified by centrifugation with acceleration of 13700g at 4 ° C for 60 minutes, after which the supernatant was collected.

5) Супернатант фильтровали через 0,2 мкм фильтры с вакуумной крышкой (Pall Life Science, UK) и фильтрат собирали для немедленного выполнения хроматографической очистки.5) The supernatant was filtered through 0.2 μm vacuum cap filters (Pall Life Science, UK) and the filtrate was collected for immediate chromatographic purification.

Хроматографическая очистка трансферазChromatographic purification of transferases

Колонку (2,5×10 см) заполняли 50 мл геля, представляющего собой хелатирующую сефарозу (Sapharose ff.), и вводили сульфат никеля (методом, описанным изготовителем, Amersham Biosciences). Колонку уравновешивали 200 мл 20 мМ The column (2.5 × 10 cm) was filled with 50 ml of a gel, which is a chelating Sepharose (Sapharose ff.), And Nickel sulfate was introduced (by the method described by the manufacturer, Amersham Biosciences). The column was balanced with 200 ml of 20 mm

NaH₂PO₄, pH 7,4, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола. В колонку вводили 400 мл неочищенной трансферазы со скоростью потока 5 мл/мин. Затем колонку промывали 20 мМ NaH₂PO₄, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола до тех пор, пока значение UV₂₈₀ не достигало базового уровня. GCAT затем элюировали 40 мл 20 мМ NaH₂PO₄, рН 7,4, 500 мМ NaCl и 500 мМ имидазола.NaH ₂ PO ₄ , pH 7.4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole. 400 ml of crude transferase was injected into the column at a flow rate of 5 ml / min. The column was then washed with 20 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 7.4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole until the UV ₂₈₀ value reached a baseline. GCAT was then eluted with 40 ml of 20 mM NaH ₂ PO ₄ , pH 7.4, 500 mM NaCl and 500 mM imidazole.

Пример 5. Ферментация и очистка липидацилтрансфераз из Aeromonas, продуцированных в Bacillus subtilis Example 5. Fermentation and purification of lipid acyltransferases from Aeromonas produced in Bacillus subtilis

ФерментацииFermentation

ВАС0318-19, ВАС0323-24BAC0318-19, BAC0323-24

МикроорганизмMicroorganism

Микроорганизмы, использованные в данном исследовании, были получены в результаты трансформации штамма-хозяина Bacillus subtilis № 163 плазмидой, содержащей ген, кодирующий трансферазу Aeromonas salmonicida, который был введен в вектор pUB1210OIS. Экспрессия данного гена контролировалась альфа-амилазным промотором, и секреция трансферазы была опосредована сигнальной последовательностью ксиланазы B. subtilis (пример 3). Указанные штаммы получили названия DIDK0138 (ферментация ВАС0318-10) и DIDK0153 (ферментация ВАС0323-24).The microorganisms used in this study were obtained by transforming the Bacillus subtilis host strain No. 163 with a plasmid containing the gene encoding Aeromonas salmonicida transferase, which was introduced into the vector pUB1210OIS. The expression of this gene was controlled by the alpha-amylase promoter, and transferase secretion was mediated by the B. subtilis xylanase signal sequence (Example 3). These strains were named DIDK0138 (fermentation BAC0318-10) and DIDK0153 (fermentation BAC0323-24).

Предкультуральная средаPrecultural environment

Во встряхиваемую колбу (общий объем 500 мл с перегородками) добавляли 100 мл среды, содержащей:In a shake flask (total volume of 500 ml with partitions) was added 100 ml of medium containing:

NaClNaCl 5 г/л5 g / l К₂НРО₄ K ₂ NRA ₄ 10 г/л10 g / l Соевая мукаSoya flour 20 г/л20 g / l Дрожжевой экстракт, BioSpringer 106Yeast Extract, BioSpringer 106 20 г/л20 g / l Пеногаситель, SIN260Defoamer, SIN260 5 мл/л5 ml / l

Показатель рН доводили до 7,0 до обработки в автоклаве.The pH was adjusted to 7.0 before autoclaving.

После обработки в автоклаве в каждую колбу добавляли 6 мл 50% (мас./мас.) нутриозы. Канамицин добавляли в концентрации 50 мг/л после обработки в автоклаве.After autoclaving, 6 ml of 50% (w / w) nutriose were added to each flask. Kanamycin was added at a concentration of 50 mg / L after autoclaving.

ИнокуляцияInoculation

Встряхиваемую колбу с предкультуральной средой инокулировали замороженной культурой непосредственно из 25% (мас./об.) исходного раствора в глицерине. Встряхиваемую колбу инкубировали при 33°С со скоростью вращения 175 оборотов/мин в течение примерно 16 часов, после чего 50 мл использовали для инокуляции ферментера.A shaken flask with precultural medium was inoculated with a frozen culture directly from 25% (w / v) stock solution in glycerol. The shaken flask was incubated at 33 ° C at a speed of 175 rpm for about 16 hours, after which 50 ml was used to inoculate the fermenter.

ФерментацииFermentation

Ферментации выполняли в ферментерах емкостью 6 л, изготовленных в собственной лаборатории.Fermentations were performed in 6 L fermenters manufactured in our own laboratory.

Порция среды (3 л) содержала:A portion of the medium (3 l) contained:

Жидкость для замачивания кукурузы (50% собственная масса)Liquid for soaking corn (50% own weight) 40 г/л40 g / l Дрожжевой экстракт BioSpringer 153 (50% собственная масса)BioSpringer 153 Yeast Extract (50% Net Weight) 10 г/л10 g / l NaClNaCl 5 г/л5 g / l CaCl₂, 2H₂OCaCl ₂ , 2H ₂ O 0,25 г/л0.25 g / l Mn(NO₃)₂, H₂OMn (NO ₃ ) ₂ , H ₂ O 0,2 г/л0.2 g / l Пеногаситель SIN260Defoamer SIN260 1 мл/л1 ml / l Канамицин (стерилизованный через фильтр при добавлении в ферментер после обработки в автоклаве)Kanamycin (sterilized through a filter when added to the fermenter after autoclaving) 50 мг/л50 mg / l

Подаваемая смесь содержала:The feed mixture contained:

Моногидрат глюкозыGlucose monohydrate 540 г/кг540 g / kg MgSO₄·7H₂OMgSO ₄ · 7H ₂ O 4,8 г/кг4.8 g / kg Пеногаситель SIN260Defoamer SIN260 4 мл/кг4 ml / kg Дрожжевой экстракт BioSpringer 153 (50% собственная масса)BioSpringer 153 Yeast Extract (50% Net Weight) 150 г/кг150 g / kg

Подачу в процессе ферментации ВАС0318 и ВАС0323 начинали с учетом аккумулированного СО₂, вычисляемого из нижеследующих уравнений:The feed in the fermentation process BAC0318 and BAC0323 was started taking into account the accumulated CO ₂ calculated from the following equations:

Подача-поток [г/час]=0, АсСО₂<0,15Flow rate [g / h] = 0, AcCO ₂ <0.15

Подача-поток [г/час]=2,85+t·1,54, АсСО₂≥0,15 и t<12Flow rate [g / h] = 2.85 + t · 1.54, AcCO ₂ ≥0.15 and t <12

Подача-поток [г/час]=21,3, t>12Flow rate [g / h] = 21.3, t> 12

t: время (часы) с момента достижения аккумулированным СО₂ (АсСО₂) 0,15 моль.t: time (hours) from the moment accumulated CO ₂ (AcCO ₂ ) reaches 0.15 mol.

Подачу в процессе ферментации ВАС0319 и ВАС0324 начинали с учетом аккумулированного СО₂, вычисляемого из нижеследующих уравнений:The feed in the fermentation process BAC0319 and BAC0324 was started taking into account the accumulated CO ₂ calculated from the following equations:

Подача-поток [г/час]=2,0+t·1,08, АсСО₂≥0,15 и t<12Flow rate [g / h] = 2.0 + t · 1.08, AcCO ₂ ≥0.15 and t <12

Подача-поток [г/час]=15, t>12Flow rate [g / h] = 15, t> 12

Показатель рН доводили до 7,0, добавляя 12,5% (мас./об.) смеси NH₃-вода или 2М раствор фосфорной кислоты.The pH was adjusted to 7.0 by adding 12.5% (w / v) of a mixture of NH ₃ water or a 2M solution of phosphoric acid.

Аэрацию производили со скоростью 3 л/мин, соответствующей 1 vvm.Aeration was carried out at a speed of 3 l / min, corresponding to 1 vvm.

Температура была равна 33°С.The temperature was 33 ° C.

Ферментер был оснащен двумя импеллерами Rushton диаметром 8 см, расположенными на расстоянии 10 см.The fermenter was equipped with two Rushton impellers with a diameter of 8 cm, located at a distance of 10 cm.

Сбор биомассыBiomass harvesting

Биомассу удаляли центрифугированием с ускорением 16000g в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатант стерилизовали фильтрацией и фильтрат использовали для очистки и исследований возможностей применения.Biomass was removed by centrifugation at an acceleration of 16000g for 10 minutes at room temperature. The supernatant was sterilized by filtration and the filtrate was used for purification and application studies.

Пример 6. “Анализ трансферазы в забуференном субстрате” с целью измерения ацилтрансферазной активности ферментаExample 6. “Analysis of transferase in a buffered substrate” to measure the acyltransferase activity of the enzyme

Липидацилтрансферазу выделяли из Aeromonas salmonicida и экспрессировали в Bacillus subtilis. Данный фермент очень эффективно переносит жирную кислоту из лецитина в холестерин в процессе образования сложных эфиров холестерина. Кроме того, было установлено, что данный фермент обладает некоторой гидролитической активностью, которая проявляется в образовании свободной жирной кислоты. Традиционные фосфолипазы (ЕС3.1.1.4 и ЕС3.1.1.32) обладают способностью гидролизовать лецитин в процессе образования свободных жирных кислот и лизолецитина, при этом не сообщалось о трансферазной реакции указанных ферментов.Lipid acyltransferase was isolated from Aeromonas salmonicida and expressed in Bacillus subtilis. This enzyme very effectively transfers fatty acid from lecithin to cholesterol during the formation of cholesterol esters. In addition, it was found that this enzyme has some hydrolytic activity, which manifests itself in the formation of free fatty acid. Conventional phospholipases (EC3.1.1.4 and EC3.1.1.32) have the ability to hydrolyze lecithin during the formation of free fatty acids and lysolecithin, and no transferase reaction of these enzymes has been reported.

В данном описании изобретения подробно рассмотрен анализ, позволяющий измерить трансферазную и гидролитическую активность ферментов и таким образом идентифицировать липидацилтрансферазы по настоящему изобретению; при выполнении данного анализа используют субстрат, содержащий лецитин и холестерин. В данной работе был использован субстрат на основе фосфатидилхолина и холестерина, диспергированный в буфере. Количественное определение продуктов реакции производили путем экстракции липидов из субстрата и последующего анализа липидных компонентов методом ГЖХ.In this description of the invention, an analysis is described in detail to measure the transferase and hydrolytic activity of enzymes and thus identify the lipid acyltransferases of the present invention; when performing this analysis, a substrate containing lecithin and cholesterol is used. In this work, we used a substrate based on phosphatidylcholine and cholesterol dispersed in a buffer. Quantification of reaction products was carried out by extraction of lipids from the substrate and subsequent analysis of lipid components by GLC.

Способ измеренияMeasuring method

ВеществаSubstances

L-альфа-фосфатидилхолин 95% (растительный) Avanti № 441601L-alpha-phosphatidylcholine 95% (plant) Avanti No. 441601

Холестерин: Sigma, № по каталогу С 8503Cholesterol: Sigma, Catalog No. C 8503

Холестерилпальмитат, Sigma C6072Cholesteryl palmitate, Sigma C6072

Холестерилстеарат, Sigma C 3549Cholesteryl stearate, Sigma C 3549

Буфер HEPES, Sigma, № по каталогу Н 3375HEPES buffer, Sigma, catalog No. H 3375

Хлороформ, аналитическая чистотаChloroform, analytical purity

ФерментыEnzymes

Очищенная GCAT из A. salmonicida № 178-9Purified GCAT from A. salmonicida No. 178-9

Анализ методом ТСХTLC analysis

Пластинки для тонкослойной хроматографии (ТСХ) активировали в термостате (110°С) в течение 1/2 часа.Thin layer chromatography plates (TLC) were activated in a thermostat (110 ° C) for 1/2 hour.

В хроматографическую камеру с крышкой выливали 100 мл рабочего буфера. Стенки камеры покрывали фильтровальной бумагой (Whatman 2) для насыщения камеры парами растворителя. 100 ml of working buffer was poured into a chromatographic chamber with a lid. The walls of the chamber were covered with filter paper (Whatman 2) to saturate the chamber with solvent vapor.

Пластинки для ТСХ помещали в рамку и на пластинку для ТСХ наносили образец на расстоянии 2 см от основания. Затем пластинку для ТСХ помещали в камеру для ТСХ с рабочим буфером. Когда рабочий буфер достигал 14 см от основания пластинки, пластинку для ТСХ удаляли, сушили в вытяжном шкафу и затем помещали в термостат при 110°С на 10 минут.TLC plates were placed in a frame and a sample was applied to the TLC plate at a distance of 2 cm from the base. Then the plate for TLC was placed in a chamber for TLC with a working buffer. When the working buffer reached 14 cm from the base of the plate, the TLC plate was removed, dried in a fume hood, and then placed in a thermostat at 110 ° C for 10 minutes.

Затем пластинку для ТСХ погружали в проявляющий реагент и сушили в термостате при 110°С в течение 15 минут.Then, the TLC plate was immersed in a developing reagent and dried in a thermostat at 110 ° C for 15 minutes.

Рабочий буферWorking buffer

№ IV: хлороформ:метанол:Н₂О (65:25:4)No. IV: chloroform: methanol: H ₂ O (65: 25: 4)

№ I: петролейный эфир:МТВЕ:уксусная кислота (60:40:1)No. I: petroleum ether: MTBE: acetic acid (60: 40: 1)

Проявляющий буфер (ванадатный буфер)Developing buffer (vanadate buffer)

32 г Na₂CO₃ и 300 мл Н₂О (1М)32 g of Na ₂ CO ₃ and 300 ml of H ₂ O (1M)

Добавляют 18,2 пентоксида ванадия (V₂O₅) и растворяют при осторожном нагревании.Add 18.2 vanadium pentoxide (V ₂ O ₅ ) and dissolve with gentle heating.

Раствор охлаждают до комнатной температуры.The solution was cooled to room temperature.

Осторожно добавляют 460 мл 2,5М раствора H₂SO₄ (460 мл Н₂О + 61 мл H₂SO₄).Carefully add 460 ml of a 2.5M solution of H ₂ SO ₄ (460 ml of H ₂ O + 61 ml of H ₂ SO ₄ ).

Воду добавляют до 1000 мл.Water is added up to 1000 ml.

Анализ методом ГЖХGLC analysis

Капиллярный газовый хроматограф Autosystem 9000 компании Perkin Elmer, оснащенный колонкой с кварцевым стеклом WCOT 12,5 м × внутренний диаметр 0,25 мм × толщина пленки 5% фенилметилсиликона 0,1 мкм (СР Sil 8 CB компании Chrompack).Perkin Elmer Autosystem 9000 capillary gas chromatograph equipped with a 12.5 m WCOT quartz glass column × 0.25 mm inner diameter × 0.1 μm film thickness 5% phenylmethyl silicone (Chrompack CP Sil 8 CB).

Газ-носитель: гелий.Carrier gas: helium.

Инжектор: раздельное впрыскивание в холодном состоянии PSSI (начальная температура 50°С, повышаемая до 385°С), объем 1,0 мклInjector: separate cold-injected PSSI (initial temperature 50 ° C, increased to 385 ° C), volume 1.0 μl

Детектор FID: 395°СFID detector: 395 ° C

Программа термостата:Thermostat program: 1one 22 33 Температура термостата, °СThermostat temperature, ° С 9090 280280 350350 Изотерма, время, минутыIsotherm, time, minutes 1one 00 1010 Скорость изменения температуры, °С/минThe rate of temperature change, ° C / min 15fifteen 4four

Получение образца: 30 мг образца растворяли в 9 мл смеси гептан:пиридин (2:1), содержащей гептадекан (0,5 мг/мл), соответствующий внутреннему стандарту. 300 мкл раствора образца переносили в изогнутую пробирку, добавляли 300 мкл MSTFA (N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамида) и осуществляли взаимодействие в течение 20 минут при 60°С.Sample preparation: 30 mg of the sample was dissolved in 9 ml of a heptane: pyridine (2: 1) mixture containing heptadecane (0.5 mg / ml) in accordance with the internal standard. 300 μl of the sample solution was transferred into a curved tube, 300 μl of MSTFA (N-methyl-N-trimethylsilyl trifluoroacetamide) was added and reacted for 20 minutes at 60 ° C.

Вычисление: коэффициенты реакции для монодитриглицеридов и свободной жирной кислоты определяли с использованием эталона 2 (монодитриглицерида). Коэффициенты реакции для холестерина, холестерилпальмитата и холестерилстеарата определяли с использованием чистых эталонных веществ.Calculation: reaction coefficients for monoditriglycerides and free fatty acid were determined using reference 2 (monoditriglyceride). The reaction coefficients for cholesterol, cholesteryl palmitate and cholesteryl stearate were determined using pure reference substances.

Результаты: анализ трансферазы с использованием фосфатидилхолина и холестерина в качестве субстрата.Results: transferase assay using phosphatidylcholine and cholesterol as a substrate.

Трансферазную активность трансферазы испытывали в субстрате на основе фосфатидилхолина и холестерина нижеследующим методом.The transferase activity of the transferase was tested in a substrate based on phosphatidylcholine and cholesterol using the following method.

450 мг фосфатидилхолина (>95% PC Avanti, № 441601) и 50 мг холестерина растворяли в хлороформе и упаривали досуха в вакууме. 300 мг смеси холестерин/фосфатидилхолин переносили в стакан Витона и добавляли 15 мл 50 мМ буфера HEPES, рН 7. Липид диспергировали в буфере при перемешивании.450 mg of phosphatidylcholine (> 95% PC Avanti, No. 441601) and 50 mg of cholesterol were dissolved in chloroform and evaporated to dryness in vacuo. 300 mg of a cholesterol / phosphatidylcholine mixture was transferred to a Viton glass and 15 ml of 50 mM HEPES buffer, pH 7, was added. The lipid was dispersed in the buffer with stirring.

Субстрат нагревали до 35°С, перемешивая магнитной мешалкой, и добавляли 0,25 мл раствора фермента. Данный субстрат представляет собой среду с очень высоким содержанием воды, равным примерно 95%.The substrate was heated to 35 ° C, stirring with a magnetic stirrer, and 0.25 ml of the enzyme solution was added. This substrate is a medium with a very high water content of approximately 95%.

Образцы, равные 2 мл, отбирали по истечении 0, 5, 10, 15, 25, 40 и 60 минут времени реакции. Сразу же добавляли 25 мкл 4М раствора HCl для подкисления свободной жирной кислоты и прекращали ферментативную реакцию. Добавляли 3,00 мл хлороформа и интенсивно встряхивали образец в вихревом шейкере в течение 30 секунд. Образец центрифугировали, отделяли 2 мл фазы хлороформа и фильтровали через 0,45 мкм фильтры в 10 мл градуированный стакан Драма. Хлороформ выпаривали в потоке азота при 60°С и образцы снова измеряли. Экстрагированный липид анализировали методом ГЖХ.Samples of 2 ml were taken after 0, 5, 10, 15, 25, 40, and 60 minutes of reaction time. Immediately 25 μl of a 4M HCl solution was added to acidify the free fatty acid and the enzymatic reaction was stopped. 3.00 ml of chloroform was added and the sample was vigorously shaken in a vortex shaker for 30 seconds. The sample was centrifuged, 2 ml of the chloroform phase was separated and filtered through 0.45 μm filters in a 10 ml graduated Dram glass. Chloroform was evaporated in a stream of nitrogen at 60 ° C and the samples were again measured. The extracted lipid was analyzed by GLC.

Результаты анализа методом ГЖХ приведены в таблице 1. Результаты выражены в %, высчитанных в расчете на экстрагированный липид. Количество жирной кислоты и сложного эфира холестерина, образованное в зависимости от времени, показано на фигуре 45. Исходя из фигуры 45 можно сделать вывод о том, ферментативная реакция не являются линейной в зависимости от времени, так как в начале реакции наблюдается сильная гидролитическая активность и трансферазная активность. Примерно через 10 минут и до истечения примерно 60 минут наблюдалась почти линейная реакция образования жирной кислоты и сложного эфира холестерина в зависимости от времени. Поэтому было решено проанализировать ферментативную реакцию в указанный временной период.The results of the analysis by GLC are shown in table 1. The results are expressed in% calculated based on the extracted lipid. The amount of fatty acid and cholesterol ester formed as a function of time is shown in FIG. 45. Based on FIG. 45, it can be concluded that the enzymatic reaction is not linear as a function of time, since strong hydrolytic activity and transferase activity are observed at the beginning of the reaction. activity. After about 10 minutes and before about 60 minutes, an almost linear reaction was observed for the formation of fatty acid and cholesterol ester versus time. Therefore, it was decided to analyze the enzymatic reaction in the specified time period.

Таблица 1Table 1 МинутыMinutes 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 Холестерин, %Cholesterol% 10,06410,064 8,9438,943 8,5778.577 8,6568,656 8,1028,102 7,8567,856 7,8097,809 Сложный эфир холестерина, %Cholesterol ester,% 0,0000,000 1,5711,571 2,0302,030 2,0582,058 2,2822,282 2,6592,659 3,0813,081 Общее содержание свободных жирных кислот, %The total content of free fatty acids,% 0,2600.260 1,1971,197 1,2391,239 1,4661,466 2,4452,445 2,9432,943 3,9403,940

Зная количество липида в реакционной смеси и количество добавленного фермента, можно высчитать количество образованной жирной кислоты и сложного эфира холестерина, выраженное в мкмоль/мл фермента (таблица 2 и фигура 46).Knowing the amount of lipid in the reaction mixture and the amount of enzyme added, the amount of formed fatty acid and cholesterol ester expressed in μmol / ml of the enzyme can be calculated (table 2 and figure 46).

Таблица 2table 2 МинутыMinutes 1010 15fifteen 2525 4040 6060 мкмоль/млμmol / ml мкмоль/млμmol / ml мкмоль/млμmol / ml мкмоль/млμmol / ml мкмоль/млμmol / ml Общее содержание свободных жирных кислотTotal Free Fatty Acids 58,158.1 68,768.7 114,6114.6 138,0138.0 184,7184.7 Сложный эфир холестеринаCholesterol ester 88,888.8 90,090.0 99,399.3 115,6115.6 133,8133.8

На основании результатов, приведенных в таблице 2, и наклона кривых, показанных на фигуре 46, можно высчитать количество жирной кислоты и сложного эфира холестерина в зависимости от времени, выраженное в мкмоль/мин на мл фермента.Based on the results shown in table 2 and the slope of the curves shown in figure 46, the amount of fatty acid and cholesterol ester can be calculated as a function of time, expressed in μmol / min per ml of enzyme.

Вычисление гидрофильной и трансферазной активности представлено в таблице 3. Относительную трансферазную активность определяли методом измерения % ацилтрансферазной активности в соответствии с приведенным выше описанием.The calculation of hydrophilic and transferase activity is presented in table 3. The relative transferase activity was determined by measuring% acyltransferase activity in accordance with the above description.

Таблица 3Table 3 Гидролитическая активность (жирная кислота)Hydrolytic activity (fatty acid) 2,252.25 мкмоль/мин на мл ферментаμmol / min per ml of enzyme Трансферазная активность (сложный эфир холестерина)Transferase activity (cholesterol ester) 0,940.94 мкмоль/мин на мл ферментаμmol / min per ml of enzyme Общая активностьTotal activity 3,453.45 мкмоль/мин на мл ферментаμmol / min per ml of enzyme Относительная трансферазная активностьRelative transferase activity 27,127.1 %% Относительная гидролитическая активностьRelative hydrolytic activity 72,972.9 %%

Скрининг других ферментов в отношении трансферазной активностиScreening for other enzymes for transferase activity

Вышеуказанный метод использовали для скрининга разных липолитических ферментов в отношении трансферазной и гидролитической активности. Ферменты испытывали в соответствии с таблицей 4.The above method was used to screen different lipolytic enzymes for transferase and hydrolytic activity. Enzymes were tested in accordance with table 4.

Таблица 4Table 4 1one 22 33 4four 55 СубстратSubstrate млml 15fifteen 15fifteen 15fifteen 15fifteen 15fifteen Трансфераза № 178-9 из A. salmonicida 32 PLU-7/млTransferase No. 178-9 from A. salmonicida 32 PLU-7 / ml млml 0,250.25 5% № 3016, LIPOPAN® F (F. oxysporum)5% No. 3016, LIPOPAN® F (F. oxysporum) млml 0,250.25 5% Thermomyces lanuginosus5% Thermomyces lanuginosus млml 0,250.25 5% Candida rugosa № 29835% Candida rugosa No. 2983 млml 0,250.25 5% Candida cylindracea № 30765% Candida cylindracea No. 3076 0,250.25

Субстрат, содержащий 300 мг смеси фосфатидилхолин/холестерин, диспергированной в 50 мМ буфера HEPES, рН 7,0, нагревали до 35°С при перемешивании. Добавляли раствор фермента и образец выдерживали, перемешивая, при 35°С. Образцы отбирали через определенные интервалы времени и экстрагировали хлороформом. Выделенные липиды анализировали методом ГЖХ, результаты которой приведены в таблице 5.A substrate containing 300 mg of a phosphatidylcholine / cholesterol mixture dispersed in 50 mM HEPES buffer, pH 7.0, was heated to 35 ° C. with stirring. An enzyme solution was added and the sample was kept stirring at 35 ° C. Samples were taken at specific time intervals and extracted with chloroform. The isolated lipids were analyzed by GLC, the results of which are shown in table 5.

Таблица 5Table 5 ОбразецSample 1one Трансфераза 178-9Transferase 178-9 МинутыMinutes 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 Свободная жирная кислота (FFA)Free Fatty Acid (FFA) 1,2161,216 2,5162,516 2,9832,983 2,622.62 2,8942,894 3,4483,448 3,9113,911 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 6,4386,438 6,3656,365 6,156.15 6,1366,136 5,9365,936 5,6625,662 Сложный эфир холестеринаCholesterol ester 00 1,8351,835 2,1772,177 2,442.44 2,582,58 2,8512,851 3,3313,331 22 Fusarium oxysporum (LIPOPAN® F)Fusarium oxysporum (LIPOPAN® F) 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 Свободная жирная кислота (FFA)Free Fatty Acid (FFA) 1,2161,216 1,3451,345 1,7961,796 1,951.95 2,4872,487 2,4242,424 2,9772,977 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 7,3097,309 7,3667,366 7,337.33 7,4297,429 7,3417,341 7,3267,326 Сложный эфир холестеринаCholesterol ester 00 0,260.26 0,3860.386 0,350.35 0,2670.267 0,360.36 0,3940.394 33 Thermomyces lanuginosusThermomyces lanuginosus 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 Свободная жирная кислота (FFA)Free Fatty Acid (FFA) 1,2161,216 0,8530.853 0,8750.875 1one 0,8960.896 1,1051.105 1,0091.009 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 7,3847,384 7,6397,639 7,637.63 7,6757,675 7,6037,603 7,5297,529 Сложный эфир холестеринаCholesterol ester 00 00 00 00 00 00 00 4four Candida rugosa (№ 2938)Candida rugosa (No. 2938) 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 Свободная жирная кислота (FFA)Free Fatty Acid (FFA) 1,2161,216 0,9820.982 0,9870.987 1,021,02 1,1351,135 1,1311,131 1,151.15 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 7,4387.438 7,6567,656 7,667.66 7,6387,638 7,5757,575 7,5857,585 Сложный эфир холестеринаCholesterol ester 00 00 00 00 00 00 00 55 Candida cylandracea (№ 3076)Candida cylandracea (No. 3076) 00 55 1010 15fifteen 2525 4040 6060 Свободная жирная кислота (FFA)Free Fatty Acid (FFA) 1,2161,216 1,0321,032 1,0971,097 1,071,07 1,2031,203 1,1311,131 1,431.43 ХолестеринCholesterol 7,5477,547 7,5027,502 7,4257,425 7,657.65 7,6197,619 7,5027,502 7,4117,411 Сложный эфир холестеринаCholesterol ester 00 00 00 00 00 00 00

Результаты анализа методом ГЖХ показывают, что только липидацилтрансфераза (178-9) продуцировала значительное количество сложного эфира холестерина и жирных кислот. Фосфолипаза из Fusarium oxysporum также характеризовалась устойчивым увеличением свободной жирной кислоты, но сложный эфир холестерина образовался в небольшом количестве лишь на начальной стадии реакции, и при этом не наблюдалось увеличения выхода сложного эфира холестерина в зависимости от времени.GLC analysis showed that only lipid acyltransferase (178-9) produced a significant amount of cholesterol ester and fatty acids. Phospholipase from Fusarium oxysporum was also characterized by a steady increase in free fatty acid, but cholesterol ester was formed in small quantities only at the initial stage of the reaction, and there was no increase in the yield of cholesterol ester depending on time.

Зная количество липидного субстрата и результаты анализов ГЖХ, можно высчитать относительную трансферазную активность и относительную гидролитическую активность на основании результатов, полученных за время реакции с 10 до 60 минут. Результаты, полученные для трансферазы 178-9 и липазы Fusariun oxysporum, приведены в таблице 6. Другие испытанные ферменты не проявляли активности.Knowing the amount of lipid substrate and the results of GLC analyzes, the relative transferase activity and relative hydrolytic activity can be calculated based on the results obtained during the reaction from 10 to 60 minutes. The results obtained for transferase 178-9 and Fusariun oxysporum lipase are shown in Table 6. Other enzymes tested did not show activity.

Таблица 6Table 6 Трансфераза 178-9Transferase 178-9 Fusarium oxysporumFusarium oxysporum Гидролитическая активность, микромоль/мин на мл ферментаHydrolytic activity, micromol / min per ml of enzyme 1,031,03 0,960.96 Трансферазная активность, микромоль/мин на мл ферментаTransferase activity, micromol / min per ml of enzyme 0,400.40 0,010.01 Общая активность, микромоль/мин на мл ферментаTotal activity, micromol / min per ml of enzyme 1,431.43 0,980.98 Относительная гидролитическая активностьRelative hydrolytic activity 71,871.8 98,798.7 Относительная трансферазная активностьRelative transferase activity 28,228,2 1,31.3

Результаты, приведенные в таблице 6, подтверждают значительную трансферазную активность липидацилтрансферазы (образец 178-9). Кроме того, установлено, что относительная трансферазная активность хорошо согласуется с результатами эксперимента, приведенными в таблице 3.The results shown in table 6 confirm the significant transferase activity of lipid acyltransferase (sample 178-9). In addition, it was found that the relative transferase activity is in good agreement with the experimental results shown in table 3.

При этом была обнаружена очень низкая трансферазная активность фосфолипазы Fusarium oxysporum. Указанный уровень трансферазной активности является таким низким, что он попадает в категорию неопределенного результата анализа. Как ожидалось, фосфолипаза Fusarium oxysporum обладает значительной гидролитической активностью.In this case, a very low transferase activity of Fusarium oxysporum phospholipase was found. The indicated level of transferase activity is so low that it falls into the category of indefinite analysis result. As expected, Fusarium oxysporum phospholipase has significant hydrolytic activity.

ЗаключениеConclusion

Искусственный субстрат на основе очищенного фосфатидилхолина и холестерина использовали в качестве субстрата для измерения активности трансферазы из Aeromonas salmonicida. Между 10 и 60 минутами времени реакции результаты анализа свидетельствовали о почти линейном образовании свободных жирных кислот и сложного эфира холестерина в зависимости от времени. С учетом активности между 10 и 60 минутами времени реакции были высчитаны значения гидролитической и трансферазной активности.An artificial substrate based on purified phosphatidylcholine and cholesterol was used as a substrate for measuring transferase activity from Aeromonas salmonicida . Between 10 and 60 minutes of the reaction time, analysis showed an almost linear formation of free fatty acids and cholesterol ester versus time. Taking into account the activity between 10 and 60 minutes of the reaction time, the values of hydrolytic and transferase activity were calculated.

На основании результатов анализа липидацилтрансферазы (в данном случае GCAT) из Aeromonas salmonicida в искусственном субстрате, представляющем собой смесь фосфатидилхолин/холестерин в буфере, сделан вывод о том, что данный фермент обладает также очень хорошей трансферазной активностью в системе с очень высоким содержанием воды.Based on the results of the analysis of lipid acyltransferase (in this case GCAT) from Aeromonas salmonicida in an artificial substrate, which is a mixture of phosphatidylcholine / cholesterol in a buffer, it was concluded that this enzyme also has very good transferase activity in a system with a very high water content.

Анализ с использованием субстрата на основе смеси фосфатидилхолин/холестерин в буфере можно применять для измерения трансферазной и гидролитической активности фермента. Результаты анализа с использованием субстрата на основе смеси фосфатидилхолин/ холестерин в буфере являются линейными только в определенном временном интервале.Analysis using a substrate based on a phosphatidylcholine / cholesterol mixture in a buffer can be used to measure the transferase and hydrolytic activity of the enzyme. The results of the analysis using a substrate based on a mixture of phosphatidylcholine / cholesterol in the buffer are linear only in a certain time interval.

Пример 7. Иммобилизация липидацилтрансферазы из Aeromonas salmonicida Example 7. Immobilization of lipid acyltransferase from Aeromonas salmonicida

Липидацилтрансферазу (в данном случае GCAT) из A.salmonicida иммобилизовали на целите 535 535 (компании Fluka) путем осаждения ацетоном. 10 мл раствора фермента в 20 мМ буфера ТЕА, рН 7, медленно перемешивали с 0,1 г целита 535 535 (компании Fluka) в течение 2 часов при комнатной температуре.Lipid acyltransferase (in this case GCAT) from A. salmonicida was immobilized on Celite 535 535 (Fluka) by precipitation with acetone. 10 ml of the enzyme solution in 20 mM TEM buffer, pH 7, was slowly mixed with 0.1 g of Celite 535 535 (Fluka) for 2 hours at room temperature.

При непрерывном перемешивании добавляли 50 мл холодного ацетона.With continuous stirring, 50 ml of cold acetone was added.

Осадок отделяли центрифугированием с ускорением 5000g в течение 1 минуты.The precipitate was separated by centrifugation with an acceleration of 5000g for 1 minute.

Осадок дважды промывали 20 мл холодного ацетона.The precipitate was washed twice with 20 ml of cold acetone.

Целит проверяли при комнатной температуре в течение примерно 1 часа.Celite was checked at room temperature for about 1 hour.

Кроме того, было установлено, что данный фермент обладает высокой активностью в средах с высоким содержанием воды (6-89%), поэтому данную трансферазу и другие трансферазы можно использовать в применениях с иммобилизованным ферментом по данному изобретению с достаточно высоким содержанием воды. Это позволяет заменить растворители, используемые с применяемыми в настоящее время иммобилизованными липазами в процессе биоконверсии липидов с использованием трансфераз.In addition, it was found that this enzyme has high activity in environments with a high water content (6-89%), therefore, this transferase and other transferases can be used in applications with the immobilized enzyme according to this invention with a sufficiently high water content. This allows you to replace the solvents used with currently used immobilized lipases in the process of lipid bioconversion using transferases.

Пример 8. Варианты липидацилтрансферазы из Aeromonas hydrophila (Ahyd2) (SEQ ID NO:36 (см. фигуру 47))Example 8. Variants of lipid acyltransferase from Aeromonas hydrophila (Ahyd2) (SEQ ID NO: 36 (see figure 47))

Мутации вводили при помощи набора для мультисайтнаправленного мутагенеза QuikChange® компании Stratagene, La Jolla, CA 92037, USA, в соответствии с инструкциями, предоставленными компанием Stratagene.Mutations were introduced using the QuikChange® Multisite Directional Mutagenesis Kit from Stratagene, La Jolla, CA 92037, USA, in accordance with the instructions provided by Stratagene.

Варианты в положении Tyr256 характеризовались повышенной активностью в отношении фосфолипидов.Options at position Tyr256 were characterized by increased activity against phospholipids.

Варианты в положении Tyr256 и Tyr260 характеризовались повышенной активностью в отношении галактолипидов.Variants at position Tyr256 and Tyr260 were characterized by increased activity against galactolipids.

Варианты в положении Tyr265 характеризовались повышенной трансферазной активностью с использованием галактолипидов в качестве донора ацильной группы.Variants at position Tyr265 were characterized by increased transferase activity using galactolipids as an acyl donor.

Числами указаны положения в нижеследующей последовательности: фермент из Aeromonas hydrophila, аминокислотная последовательность которого представлена SEQ ID NO:36 на фигуре 47 (подчеркнутые аминокислоты образуют сигнальный пептид ксиланазы). Нуклеотидная последовательность соответствует SEQ ID NO:54 на фигуре 48.The numbers indicate the positions in the following sequence: an enzyme from Aeromonas hydrophila , the amino acid sequence of which is represented by SEQ ID NO: 36 in figure 47 (underlined amino acids form the xylanase signal peptide). The nucleotide sequence corresponds to SEQ ID NO: 54 in figure 48.

Пример 9. “Анализ в среде с низким содержанием воды”Example 9. “Analysis in a low water environment”

Трансферазные реакции липолитических ферментов в среде с низким содержанием воды.Transferase reactions of lipolytic enzymes in a low water medium.

Способ выполненияExecution method

ВеществаSubstances

Холестерин, Sigma, № по каталогу С 8503Cholesterol, Sigma, Cat. No. 8503

Соевое масло, Aarhus United, DKSoybean Oil, Aarhus United, DK

ФерментыEnzymes

№ 179, GCAT из A. salmonicida No. 179, GCAT from A. salmonicida

№ 2427, фосфолипаза А1 из Fusarium oxysporum. LIPOPAN® F компании Novozymes, ДанияNo. 2427, phospholipase A1 from Fusarium oxysporum . LIPOPAN® F by Novozymes, Denmark

№ 1991, фосфолипаза А2 из поджелудочной железы, LIPOMOD 22L компании Biocatalysts, UKNo. 1991, pancreatic phospholipase A2, LIPOMOD 22L from Biocatalysts, UK

№ 2373, липаза из Candida Antarctica, новозим 525 L компании Novozymes, ДанияNo. 2373, a lipase from Candida Antarctica , Novozyme 525 L company Novozymes, Denmark

Ферментативный анализEnzymatic analysis

13,1% лецитина и 6,6% холестерина растворяли в соевом масле, нагревая до 60°С при перемешивании.13.1% lecithin and 6.6% cholesterol were dissolved in soybean oil, heating to 60 ° C with stirring.

Субстрат помещали в 20 мл стакан Витона и нагревали до 46°С.The substrate was placed in a 20 ml Viton glass and heated to 46 ° C.

Добавляли воду и раствор фермента и включали секундомер с остановом.Water and an enzyme solution were added and the stopwatch turned on.

Через определенные промежутки времени 50 мг образцы переносили в 10 мл стакан Драма и замораживали.At certain intervals of 50 mg, the samples were transferred to a 10 ml Dram glass and frozen.

Выделенные липиды анализировали методом ГЖХ.The isolated lipids were analyzed by GLC.

Анализ методом ГЖХGLC analysis

Для ознакомления с описанием анализа методом ГЖХ см. пример 6.For a description of the analysis by GLC, see Example 6.

Результатыresults

Результаты эксперимента приведены в таблице 8.The experimental results are shown in table 8.

Субстрат на основе соевого масла, содержащий 13,1% лецитина и 6,6% холестерина, нагревали до 46°С. Добавляли раствор фермента и включали секундомер с остановом. По истечении 30, 60 и 120 минут времени реакции отбирали образцы для анализа методом ГЖХ.A soybean oil based substrate containing 13.1% lecithin and 6.6% cholesterol was heated to 46 ° C. The enzyme solution was added and the stopwatch turned on. After 30, 60 and 120 minutes of the reaction time, samples were taken for analysis by GLC.

Таблица 8Table 8 1one 22 33 4four 55 СубстратSubstrate гg 55 55 55 55 55 Трансфераза № 179-С72, 56 PLU-7/млTransferase No. 179-C72, 56 PLU-7 / ml млml 0,30.3 № 2427, 200 PLU-7/млNo. 2427,200 PLU-7 / ml млml 0,30.3 PLA 2 из поджелудочной железы, № 1991 6300 PLU/млPancreas PLA 2, No. 1991 6300 PLU / ml млml 0,30.3 Новозим 525 L, № 2373, 200 LIPU/млNovozyme 525 L, No. 2373, 200 LIPU / ml млml 0,30.3 ВодаWater млml 0,30.3 % воды% water 66 66 66 66 66

Результаты анализа методом ГЖХ приведены в таблице 9. Результаты выражены в процентах от общего состава образца. На основании результатов ГЖХ можно высчитать количество жирной кислоты и сложного эфира холестерина, продуцированное в результате ферментативной реакции, по сравнению с контрольным образцом без добавления фермента. В указанных экспериментальных условиях общую ферментативную активность определяли в виде гидролитической активности, измеренной с учетом образования свободной жирной кислоты, и трансферазную активность определяли с учетом образования сложного эфира холестерина. На основании указанных результатов и информации о молекулярной массе жирной кислоты и сложного эфира холестерина можно высчитать относительную молярную гидролитическую активность и относительную молярную трансферазную активность, значения которых приведены в таблице 10.The results of the analysis by GLC are shown in table 9. The results are expressed as a percentage of the total composition of the sample. Based on the results of GLC, the amount of fatty acid and cholesterol ester produced as a result of the enzymatic reaction can be calculated in comparison with the control sample without the addition of the enzyme. Under these experimental conditions, the total enzymatic activity was determined as hydrolytic activity, measured taking into account the formation of free fatty acid, and the transferase activity was determined taking into account the formation of cholesterol ester. Based on the above results and information on the molecular weight of the fatty acid and cholesterol ester, relative molar hydrolytic activity and relative molar transferase activity can be calculated, the values of which are given in table 10.

Таблица 9Table 9 ФерментEnzyme Время реакции, минутыReaction time, minutes Жирная кислота, %Fatty acid% Холестерин, %Cholesterol% Сложный эфир холестерина, %Cholesterol ester,% КонтрольныйControl 120120 0,5330.533 7,0947,094 0,0000,000 #179# 179 30thirty 0,7700.770 5,7615,761 2,2292,229 #179# 179 6060 0,8520.852 5,3695,369 2,8832,883 #179# 179 120120 0,8760.876 4,9004,900 3,6673,667 #2427# 2427 30thirty 3,2693,269 7,0947,094 0,0000,000 #2427# 2427 6060 3,4203,420 7,0947,094 0,0000,000 #2427# 2427 120120 3,7103,710 7,0947,094 0,0000,000 #1991# 1991 30thirty 2,8712,871 7,0947,094 0,0000,000 #1991# 1991 6060 3,5783,578 7,0947,094 0,0000,000 #1991# 1991 120120 3,9283,928 7,0947,094 0,0000,000 #2373# 2373 30thirty 1,4181,418 7,0947,094 0,0000,000 #2373# 2373 6060 1,4211,421 7,0947,094 0,0000,000 #2373# 2373 120120 1,9151,915 7,0947,094 0,0000,000

Таблица 10Table 10 ФерментEnzyme Время реакции, минутыReaction time, minutes Полученная жирная кислотаThe resulting fatty acid Использованный холестеринUsed cholesterol Полученный сложный эфир холестеринаCholesterol ester obtained Гидролитическая активность, %Hydrolytic activity,% Трансферазная активность, %Transferase activity,% #179# 179 30thirty 0,2380.238 1,3341,334 2,2292,229 20twenty 8080 #179# 179 6060 0,3190.319 1,7251,725 2,8832,883 2121 7979 #179# 179 120120 0,3430.343 2,1952,195 3,6673,667 18eighteen 8282 #2427# 2427 30thirty 2,7372,737 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2427# 2427 6060 2,8872,887 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2427# 2427 120120 3,1773,177 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #1991# 1991 30thirty 2,3382,338 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #1991# 1991 6060 3,0463,046 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #1991# 1991 120120 3,3953,395 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2373# 2373 30thirty 0,8850.885 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2373# 2373 6060 0,8880.888 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00 #2373# 2373 120120 1,3831,383 0,0000,000 0,0000,000 100one hundred 00

ЗаключениеConclusion

При выполнении вышеуказанных экспериментов было установлено, что все испытанные ферменты обладали гидролитической активностью, о чем свидетельствовало увеличение количества жирной кислоты. При этом единственным ферментом, проявляющим трансферазную активность, был GCAT из A.salmonicida. Поэтому был сделан вывод о том, что в масляной системе с лецитином и холестерином, содержащей 6% воды, только фосфолипаза А1 из Fusarium oxysporum, фосфолипаза А2 из поджелудочной железы и липаза из Candida antarctica проявляют гидролитическую активность.When performing the above experiments, it was found that all tested enzymes had hydrolytic activity, as evidenced by an increase in the amount of fatty acid. The only enzyme exhibiting transferase activity was GCAT from A.salmonicida . Therefore, it was concluded that in the oil system with lecithin and cholesterol containing 6% water, only phospholipase A1 from Fusarium oxysporum , phospholipase A2 from the pancreas and lipase from Candida antarctica exhibit hydrolytic activity.

Пример 10. Получение сложного эфира углевода с использованием иммобилизованной липидацилтрансферазы по настоящему изобретениюExample 10. Obtaining a carbohydrate ester using the immobilized lipid acyltransferase of the present invention

Сложные эфиры углеводов жирных кислот, такие как сложные эфиры сахарозы и сложные эфиры глюкозы, обычно получают, осуществляя взаимодействие жирной кислоты или мыла жирной кислоты с углеводом при высокой температуре (Journal of the American Oil Chemists' Society (1978) 55; 4; 398-401). Однако недостатком данного метода являются побочные реакции и образование окрашенных побочных продуктов.Fatty acid carbohydrate esters, such as sucrose esters and glucose esters, are usually prepared by reacting a fatty acid or fatty acid soap with a carbohydrate at high temperature (Journal of the American Oil Chemists' Society (1978) 55; 4; 398- 401). However, the disadvantage of this method is adverse reactions and the formation of colored by-products.

В соответствии с настоящим изобретением сложные эфиры углеводов жирных кислот получают в результате выполнения трансферазной реакции с использованием лецитина в качестве донора жирной кислоты и углевода, такого как глюкоза, в качестве акцепторной молекулы.In accordance with the present invention, fatty acid carbohydrate esters are obtained by performing a transferase reaction using lecithin as a donor of a fatty acid and a carbohydrate such as glucose as an acceptor molecule.

Указанную реакцию выполняют в проточном реакторе, в котором липидацилтрансфераза иммобилизована на твердом носителе.The reaction is carried out in a flow reactor in which the lipid acyltransferase is immobilized on a solid support.

Способ выполненияExecution method

100 г глюкозы растворяют в 1000 мл воды при перемешивании, затем 200 г фосфатидилхолина диспергируют в водной фазе при перемешивании и нагревают до 40°С.100 g of glucose is dissolved in 1000 ml of water with stirring, then 200 g of phosphatidylcholine is dispersed in the aqueous phase with stirring and heated to 40 ° C.

Показатель рН доводят до рН 6,5.The pH is adjusted to pH 6.5.

В проточный реактор вводят 100 г липидацилтрансферазы из A. salmonicidа, иммобилизованной на твердом носителе.100 g of lipid acyltransferase from A. salmonicida immobilized on a solid support is introduced into the flow reactor.

Проточный реактор устанавливают в термокамеру при 40°С.The flow reactor is installed in a heat chamber at 40 ° C.

Реакционную смесь подают насосом в колонку со скоростью 2 мл/мин.The reaction mixture is pumped into the column at a rate of 2 ml / min.

Продукт реакции собирают.The reaction product is collected.

Из продукта реакции удаляют воду в тонкопленочном вакуумном выпарном аппарате и выделяют липиды.Water is removed from the reaction product in a thin-film vacuum evaporator and lipids are isolated.

Сложный эфир глюкозы отделяют от других липидов сольвентным фракционированием.The glucose ester is separated from other lipids by solvent fractionation.

Сложные эфиры углеводов можно использовать во многих применениях, таких как эффективные эмульгаторы в пищевой и непищевой промышленности.Carbohydrate esters can be used in many applications, such as effective emulsifiers in the food and non-food industries.

Пример 11. Получение сложного эфира белка с использованием липидацилтрансферазы по настоящему изобретениюExample 11. Obtaining a protein ester using the lipid acyltransferase of the present invention

В соответствии с настоящим изобретением конденсаты жирных кислот аминокислот, пептидов или белков получают в результате выполнения трансферазной реакции. При выполнении данной реакции фосфатидилхолин используют в качестве донора для переноса жирной кислоты в свободную гидроксильную группу аминокислот (таких как тирозин, верин или треонин), имеющих свободную гидроксильную группу, пригодную для этерификации.In accordance with the present invention, fatty acid condensates of amino acids, peptides or proteins are obtained by performing a transferase reaction. In carrying out this reaction, phosphatidylcholine is used as a donor to transfer fatty acids to the free hydroxyl group of amino acids (such as tyrosine, verine or threonine) having a free hydroxyl group suitable for esterification.

Способ выполнения 1Execution Method 1

50 г 1-тирозина (серина или треонина) растворяют в 1000 мл воды при перемешивании, затем 200 г фосфатидилхолина диспергируют в водной фазе при перемешивании и нагревают до 40°С.50 g of 1-tyrosine (serine or threonine) is dissolved in 1000 ml of water with stirring, then 200 g of phosphatidylcholine is dispersed in the aqueous phase with stirring and heated to 40 ° C.

Показатель рН доводят до рН 7 и сохраняют данное значение рН при помощи NaOH или HCl.The pH is adjusted to pH 7 and the pH is maintained with NaOH or HCl.

Добавляют 50 мл фермента липидацилтрансферазы из A.salmonicida и продолжают взаимодействие при перемешивании при 40°С.Add 50 ml of the lipid acyltransferase enzyme from A. salmonicida and continue to interact with stirring at 40 ° C.

Образцы отбирают через определенные периоды времени и анализируют методами ТСХ и ВЭЖХ.Samples are taken at specific time periods and analyzed by TLC and HPLC.

По истечении 20 часов времени реакции реакционная смесь достигает равновесия, после чего реакцию прекращают.After 20 hours of reaction time, the reaction mixture reaches equilibrium, after which the reaction is stopped.

Конденсат жирной кислоты тирозина, лецитин и лизолецитин выделяют из реакционной среды центрифугированием стандартными методами (см., например, публикацию “Centrifuges, Filtering” in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA).Tyrosine fatty acid condensate, lecithin and lysolecithin are isolated from the reaction medium by centrifugation using standard methods (see, for example, Centrifuges, Filtering in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA).

Конденсат жирной кислоты тирозина подвергают дальнейшей очистке хроматографией на колонке с гидрофобным взаимодействием, отделяют фракцию, содержащую конденсат жирной кислоты тирозина, и удаляют растворитель выпариванием. (См. публикацию “Basic Principles of Chromatography” in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA).The tyrosine fatty acid condensate is further purified by hydrophobic interaction column chromatography, the fraction containing the tyrosine fatty acid condensate is separated, and the solvent is removed by evaporation. (See publication “Basic Principles of Chromatography” in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA).

Способ выполнения 2Method 2

Трансферазную активность липидацилтрансферазы испытывают в субстрате на основе фосфатидилхолина и 1-тирозина в соответствии с нижеследующим способом.The transferase activity of lipid acyltransferase is tested in a substrate based on phosphatidylcholine and 1-tyrosine in accordance with the following method.

450 мг фосфатидилхолина (>95% PC Avanti, № 441601) и 50 мг 1-тирозина вводят в стакан Витона и добавляют 15 мл 50 мМ буфера HEPES, рН 7. Липид диспергируют в указанном буфере при перемешивании.450 mg of phosphatidylcholine (> 95% PC Avanti, No. 441601) and 50 mg of 1-tyrosine are introduced into a Viton glass and 15 ml of 50 mM HEPES buffer, pH 7, are added. The lipid is dispersed in the indicated buffer with stirring.

Субстрат нагревают до 35°С, перемешивая магнитной мешалкой, и добавляют 0,25 мл трансферазы в количестве 10 PLU/мл.The substrate is heated to 35 ° C, stirring with a magnetic stirrer, and 0.25 ml of transferase is added in an amount of 10 PLU / ml.

Образцы, равные 2 мл, отбирают по истечении 0, 5, 10, 15, 25, 40 и 60 минут времени реакции.Samples of 2 ml are taken after 0, 5, 10, 15, 25, 40, and 60 minutes of the reaction time.

Сразу же добавляют 25 мкл 4М раствора HCl для подкисления свободной жирной кислоты и прекращения ферментативной реакции. Добавляют 3,00 мл хлороформа и образец интенсивно встряхивают в вихревом шейкере в течение 30 секунд. Образец центрифугируют, отделяют 2 мл фазы хлороформа и фильтруют через 0,45 мкм фильтры в 10 мл градуированный стакан Драма. Immediately add 25 μl of a 4M HCl solution to acidify the free fatty acid and terminate the enzymatic reaction. 3.00 ml of chloroform is added and the sample is vigorously shaken in a vortex shaker for 30 seconds. The sample is centrifuged, 2 ml of the chloroform phase is separated and filtered through 0.45 μm filters in a 10 ml graduated Dram glass.

Хлороформ выпаривают в потоке азота при 60°С и образец снова измеряют. Экстрагированный липид анализируют методом ТСХ.Chloroform was evaporated in a stream of nitrogen at 60 ° C and the sample was measured again. The extracted lipid was analyzed by TLC.

Пример 12. Получение сложного эфира гидроксикислоты (в частности, сложного эфира молочной кислоты) с использованием липидацилтрансферазы по настоящему изобретениюExample 12. Obtaining a hydroxy acid ester (in particular a lactic acid ester) using the lipid acyltransferase of the present invention

Сложные эфиры гидроксикислоты жирных кислот обычно получают, осуществляя взаимодействие жирной кислоты и гидроксикислоты при высокой температуре с использованием неорганических солей или ионов металла в качестве катализаторов (см., например, публикацию Bailey's Industrial Oil and Fat Products, Fifth edition, Volume 3. Edible Oil and Fat Products: Products and Application Technology, page 502-511). Однако недостатком данного способа являются побочные реакции и образование окрашенных побочных продуктов.Fatty acid hydroxy acids are usually prepared by reacting fatty acids and hydroxy acids at high temperatures using inorganic salts or metal ions as catalysts (see, for example, Bailey's Industrial Oil and Fat Products, Fifth edition, Volume 3. Edible Oil and Fat Products: Products and Application Technology, page 502-511). However, the disadvantage of this method is adverse reactions and the formation of colored by-products.

В соответствии с настоящим изобретением сложные эфиры гидроксикислоты жирных кислот получают в результате выполнения трансферазной реакции с использованием лецитина в качестве донора жирной кислоты и гидроксикислоты (в частности, молочной кислоты) в качестве акцепторной молекулы.In accordance with the present invention, fatty acid hydroxy acid esters are obtained by performing a transferase reaction using lecithin as a donor of a fatty acid and hydroxy acid (in particular lactic acid) as an acceptor molecule.

Способ выполненияExecution method

50 г молочной кислоты растворяют в 1000 мл воды при перемешивании, затем 200 г фосфатидилхолина диспергируют в водной фазе при перемешивании и нагревают до 40°С.50 g of lactic acid are dissolved in 1000 ml of water with stirring, then 200 g of phosphatidylcholine is dispersed in the aqueous phase with stirring and heated to 40 ° C.

Показатель рН доводят до рН 6,5 и сохраняют данное значение рН при помощи NaOH или HCl.The pH was adjusted to pH 6.5 and maintained at this pH with NaOH or HCl.

Образцы отбирают через определенные периоды времени и анализируют методами ТСХ и ГЖХ.Samples are taken at specific time periods and analyzed by TLC and GLC.

Сложный эфир молочной кислоты, лецитин и лизолецитин выделяют из реакционной среды центрифугированием стандартными методами (см., например, публикацию “Centrifuges, Filtering” in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA).Lactic acid ester, lecithin and lysolecithin are isolated from the reaction medium by centrifugation by standard methods (see, for example, Centrifuges, Filtering in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA).

Сложный эфир молочной кислоты подвергают дальнейшей очистке методом молекулярной перегонки, получая при этом сложный эфир молочной кислоты жирной кислоты с высокой степенью чистоты.The lactic acid ester is further purified by molecular distillation to obtain a high purity fatty acid lactic acid ester.

Пример 13. Получение сложного эфира лимонной кислоты с использованием липидацилтрансферазы по настоящему изобретениюExample 13. Obtaining a citric acid ester using the lipid acyltransferase of the present invention

Анализ трансферазы в субстрате на основе фосфатидилхолина и лимонной кислотыAnalysis of transferase in a substrate based on phosphatidylcholine and citric acid

Трансферазную активность липидацилтрансферазы из A.salmonicida испытывали в субстрате на основе фосфатидилхолина и лимонной кислоты в соответствии с нижеследующим способом.The transferase activity of lipid acyltransferase from A. salmonicida was tested in a substrate based on phosphatidylcholine and citric acid in accordance with the following method.

450 мг фосфатидилхолина (>95% PC Avanti, № 441601) и 50 мг лимонной кислоты вводят в стакан Витона и добавляют 15 мл 50 мМ буфера HEPES, рН 7. Липид диспергируют в буфере при перемешивании.450 mg of phosphatidylcholine (> 95% PC Avanti, No. 441601) and 50 mg of citric acid are introduced into a Viton glass and 15 ml of 50 mM HEPES buffer, pH 7, are added. The lipid is dispersed in the buffer with stirring.

Субстрат нагревают до 35°С, перемешивая магнитной мешалкой, и добавляют 0,25 мл липидацилтрансферазы из A. salmonicida в количестве 10 PLU/мл.The substrate is heated to 35 ° C, stirring with a magnetic stirrer, and 0.25 ml of lipid acyltransferase from A. salmonicida is added in an amount of 10 PLU / ml.

Все публикации, указанные в приведенном выше описании изобретения, включены в данную заявку в качестве ссылки. Специалистам в данной области должны быть очевидны разные модификации и изменения описанных способов и систем по настоящему изобретению, не выходящие за пределы объема настоящего изобретения. Несмотря на то что настоящее изобретение было описано на примере конкретных предпочтительных вариантов его осуществления, должно быть понятно, что заявленное изобретение не может быть необоснованно ограничено конкретными вариантами осуществления. Предполагается, что все возможные модификации описанных вариантов осуществления изобретения, очевидные специалистам в области биохимии, биотехнологии или родственных областях, входят в объем нижеследующей формулы изобретения.All publications cited in the above description of the invention are incorporated herein by reference. Various modifications and changes to the described methods and systems of the present invention, without departing from the scope of the present invention, should be apparent to those skilled in the art. Although the present invention has been described with specific preferred embodiments, it should be understood that the claimed invention cannot be unreasonably limited to specific embodiments. It is assumed that all possible modifications of the described embodiments of the invention, obvious to experts in the field of biochemistry, biotechnology or related fields, are included in the scope of the following claims.

Claims

1. Способ получения одного или нескольких сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц, сложных эфиров гидроксикислот, который включает смешивание донора ацильной группы, акцептора ацильной группы и воды с образованием среды с высоким содержанием воды, содержащей 5-98% воды, при этом указанный донор ацильной группы является липидным субстратом, выбранным из одного или нескольких представителей группы, состоящей из фосфолипида, лизофосфолипида, триацилглицерида, диглицерида, гликолипида или лизогликолипида, и указанный акцептор ацильной группы выбран из одного или нескольких представителей группы, состоящей из углевода, белка, белковой субъединицы или гидроксикислоты; и контактирование смеси с липидацилтрансферазой, при котором указанная липидацилтрансфераза катализирует одну или обе нижеследующие реакции: алкоголиз или переэтерификацию, причем липидацилтрансфераза является ферментом, обладающим ацилтрансферазной активностью и содержащим фрагмент GDSX аминокислотной последовательности, где Х означает один или несколько нижеследующих аминокислотных остатков L, А, V, I, F, Y, H, Q, Т, N, М или S.1. The method of obtaining one or more esters of carbohydrates, esters of proteins, esters of protein subunits, esters of hydroxyacids, which includes mixing an acyl donor, an acyl acceptor and water to form a medium with a high water content containing 5-98% water wherein said acyl donor is a lipid substrate selected from one or more representatives of the group consisting of phospholipid, lysophospholipid, triacylglyceride, diglyceride, glycolipid or lysoglyc an olipid, and said acyl acceptor is selected from one or more representatives of the group consisting of a carbohydrate, protein, protein subunit, or hydroxy acid; and contacting the mixture with a lipid acyltransferase, wherein said lipid acyltransferase catalyzes one or both of the following reactions: alcoholysis or transesterification, wherein the lipid acyltransferase is an enzyme having acyltransferase activity and containing a GDSX fragment of the amino acid sequence, where X is one or more of the following L, the following, , I, F, Y, H, Q, T, N, M, or S.

2. Способ по п.1, где липидацилтрансфераза является иммобилизованной.2. The method according to claim 1, where the lipid acyltransferase is immobilized.

3. Способ по п.1, который включает очистку сложного эфира углевода, сложного эфира белка, сложного эфира белковой субъединицы, сложного эфира гидроксикислоты.3. The method according to claim 1, which comprises purifying the carbohydrate ester, protein ester, protein subunit ester, hydroxy acid ester.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором
фермент липидацилтрансфераза содержит Н-309 или остаток гистидина в положении, соответствующем положению His-309 в аминокислотной последовательности липолитического фермента Aeromonas hydrophila, представленной как SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32.4. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which
the lipid acyltransferase enzyme contains H-309 or a histidine residue at the position corresponding to His-309 in the amino acid sequence of the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme represented as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32.

5. Способ по п.1, в котором липидацилтрансферазу получают из организма, относящегося к одному или нескольким нижеследующим родам: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas и Candida.5. The method according to claim 1, in which the lipid acyltransferase is obtained from an organism belonging to one or more of the following genera: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campyloylbacterium, Campyloylbactae, Campyloylbacterium, Campyloylbactae, , Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas and Candida.

6. Способ по п.1, в котором липидацилтрансфераза содержит одну из нижеследующих аминокислотных последовательностей:
(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;
(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3;
(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;
(iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5;
(v) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;
(vi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12;
(vii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20;
(viii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22;
(ix) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24;
(x) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;
(xi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28;
(xii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30;
(xiii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32;
(xiv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34, или
аминокислотную последовательность, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34.6. The method according to claim 1, in which the lipid acyltransferase contains one of the following amino acid sequences:
(i) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(iii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(iv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
(v) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(vi) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(vii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(viii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(ix) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;
(x) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(xi) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(xii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30;
(xiii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32;
(xiv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, or
an amino acid sequence that is 75% or more identical to one of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 34.

7. Способ по п.1, где фермент липидацилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, полученную путем экспрессии одной из нижеследующих нуклеотидных последовательностей:
(a) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:7 (см. фигуру 9);
(b) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:8 (см. фигуру 10);
(c) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:9 (см. фигуру 11);
(d) нуклеотидной последовательности SEQ ID No:10 (см. фигуру 12);
(e) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:11 (см. фигуру 13);
(f) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:13 (см. фигуру 15);
(g) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:21 (см. фигуру 17);
(h) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:23 (см. фигуру 19);
(i) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:25 (см. фигуру 21);
(j) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:27 (см. фигуру 23);
(k) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:29 (см. фигуру 25);
(l) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:31 (см. фигуру 27);
(m) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:33 (см. фигуру 29);
(n) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:35 (см. фигуру 31);
(о) или нуклеотидной последовательности, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:35.7. The method according to claim 1, where the lipid acyltransferase enzyme contains an amino acid sequence obtained by expression of one of the following nucleotide sequences:
(a) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 (see figure 9);
(b) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 (see figure 10);
(c) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 (see figure 11);
(d) the nucleotide sequence of SEQ ID No: 10 (see figure 12);
(e) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 (see figure 13);
(f) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 (see figure 15);
(g) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 (see figure 17);
(h) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 (see figure 19);
(i) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 (see figure 21);
(j) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 (see figure 23);
(k) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 (see figure 25);
(l) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 (see figure 27);
(m) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 (see figure 29);
(n) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 (see figure 31);
(o) or a nucleotide sequence that is 75% or more identical to one of the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 35 .

8. Способ по п.1, в котором липидацилтрансфераза является иммобилизованной липидацилтрансферазой, обладающей ацилтрансферазной активностью и содержащей фрагмент GDSX аминокислотной последовательности, где Х означает один или несколько нижеследующих аминокислотных остатков L, А, V, I, F, Y, H, Q, Т, N, М или S, которая содержит Н-309 или остаток гистидина в положении, соответствующем положению His-309 в аминокислотной последовательности липолитического фермента Aeromonas hydrophila, представленной SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32, и где фермент липидацилтрансфераза содержит одну из следующих последовательностей:
(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;
(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3;
(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;
(iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5;
(v) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;
(vi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12;
(vii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20;
(viii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22;
(ix) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24;
(x) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;
(xi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28;
(xii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30;
(xiii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32;
(xiv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34 или аминокислотную последовательность, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34,
или содержит аминокислотную последовательность, полученную путем экспрессии одной из нижеследующих нуклеотидных последовательностей:
(a) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:7 (см. фигуру 9);
(b) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:8 (см. фигуру 10);
(c) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:9 (см. фигуру 11);
(d) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:10 (см. фигуру 12);
(e) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:11 (см. фигуру 13);
(f) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:13 (см. фигуру 15);
(g) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:21 (см. фигуру 17);
(h) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:23 (см. фигуру 19);
(i) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:25 (см. фигуру 21);
(j) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:27 (см. фигуру 23);
(k) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:29 (см. фигуру 25);
(1) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:31 (см. фигуру 27);
(m) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:33 (см. фигуру 29);
(n) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:35 (см. фигуру 31); или
(о) нуклеотидной последовательности, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:35.8. The method according to claim 1, in which the lipid acyltransferase is an immobilized lipid acyltransferase having acyltransferase activity and containing a fragment of the GDSX amino acid sequence, where X means one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S that contains H-309 or a histidine residue at a position corresponding to His-309 in the amino acid sequence of the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32, and where the lipid acyltransferase enzyme contains about Well of the following sequences:
(i) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(iii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(iv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
(v) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(vi) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(vii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(viii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(ix) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;
(x) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(xi) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(xii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30;
(xiii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32;
(xiv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or an amino acid sequence that is 75% or more identical to one of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 34,
or contains an amino acid sequence obtained by expression of one of the following nucleotide sequences:
(a) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 (see figure 9);
(b) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 (see figure 10);
(c) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 (see figure 11);
(d) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 (see figure 12);
(e) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 (see figure 13);
(f) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 (see figure 15);
(g) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 (see figure 17);
(h) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 (see figure 19);
(i) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 (see figure 21);
(j) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 (see figure 23);
(k) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 (see figure 25);
(1) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 (see figure 27);
(m) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 (see figure 29);
(n) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 (see figure 31); or
(o) a nucleotide sequence that is 75% or more identical to one of the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 35.

9. Способ по п.8, где иммобилизованную липидацилтрансферазу получают из организма, относящегося к одному или нескольким нижеследующим родам: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas и Candida.9. The method according to claim 8, where the immobilized lipid acyltransferase is obtained from an organism belonging to one or more of the following genera: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Vulbillus, Campocelus bibillus, Campulus bacteria, Campus, Campanius, Campanus vulgaris, Campus , Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas and Candida.

10. Применение липидацилтрансферазы для получения одного или нескольких сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц или сложных эфиров гидроксикислот путем катализа алкоголиза или переэтерификации либо обеих указанных реакций в смеси донора ацильной группы, акцептора ацильной группы и воды, содержащей 5-98% воды, при этом указанный донор ацильной группы является липидным субстратом, выбранным из одного или нескольких представителей группы, состоящей из фосфолипида, лизофосфолипида, триацилглицерида, диглицерида, гликолипида или лизогликолипида, указанный акцептор ацильной группы выбран из одного или нескольких представителей группы, состоящей из углевода, белка, белковой субъединицы или гидроксикислоты, и липидацилтрансфераза является ферментом, обладающим ацилтрансферазной активностью и содержащим фрагмент GDSX аминокислотной последовательности, где Х означает один или несколько нижеследующих аминокислотных остатков L, А, V, I, F, Y, H, Q, Т, N, М или S.10. The use of lipid acyltransferase to produce one or more carbohydrate esters, protein esters, protein subunit esters or hydroxy acid esters by catalysis of alcoholysis or transesterification or both of these reactions in a mixture of an acyl donor, an acyl acceptor and water containing 5-98 % of water, wherein said acyl donor is a lipid substrate selected from one or more representatives of the group consisting of phospholipid, lysophospholipid, triacylglycer yes, diglyceride, glycolipid or lysoglycolipid, said acyl acceptor is selected from one or more representatives of the group consisting of a carbohydrate, protein, protein subunit or hydroxy acid, and lipid acyltransferase is an enzyme having acyltransferase activity and containing a GDSX fragment of the amino acid sequence, where or several of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M or S.

11. Применение по п.10, при котором липидацилтрансфераза является иммобилизованной.11. The use of claim 10, wherein the lipid acyltransferase is immobilized.

12. Применение по п.10, при котором сложный эфир углевода, сложный эфир белка, сложный эфир белковой субъединицы или сложный эфир гидроксикислоты является очищенным.12. The use of claim 10, wherein the carbohydrate ester, protein ester, protein subunit ester or hydroxy acid ester is purified.

13. Применение по п.10, при котором фермент липидацилтрансфераза содержит Н-309 или остаток гистидина в положении, соответствующем положению His-309 в аминокислотной последовательности липолитического фермента Aeromonas hydrophila, представленной SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32.13. The use of claim 10, wherein the lipid acyltransferase enzyme contains H-309 or a histidine residue at a position corresponding to His-309 in the amino acid sequence of the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32.

14. Применение по п.10, где липидацилтрансферазу получают из организма, относящегося к одному или нескольким нижеследующим родам: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas и Candida.14. The use according to claim 10, where the lipid acyltransferase is obtained from an organism belonging to one or more of the following genera: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campyloylbacterium, Campyloylbacterium, Campyloylbacterae, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas and Candida.

15. Применение по п.10, при котором липидацилтрансфераза содержит одну из нижеследующих аминокислотных последовательностей:
(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;
(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3;
(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;
(iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5;
(v) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;
(vi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12;
(vii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20;
(viii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22;
(ix) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24;
(x) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;
(xi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28;
(xii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30;
(xiii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32;
(xiv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34, или аминокислотную последовательность, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34.15. The use of claim 10, in which the lipid acyltransferase contains one of the following amino acid sequences:
(i) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(iii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(iv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
(v) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(vi) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(vii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(viii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(ix) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;
(x) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(xi) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(xii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30;
(xiii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32;
(xiv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence that is 75% or more identical to one of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 32 or SEQ ID NO: 34.

16. Применение по п.10, где фермент липидацилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, полученную путем экспрессии одной из нижеследующих нуклеотидных последовательностей:
(a) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:7 (см. фигуру 9);
(b) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:8 (см. фигуру 10);
(c) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:9 (см. фигуру 11);
(d) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:10 (см. фигуру 12);
(e) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:11 (см. фигуру 13);
(f) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:13 (см. фигуру 15);
(g) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:21 (см. фигуру 17);
(h) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:23 (см. фигуру 19);
(i) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:25 (см. фигуру 21);
(j) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:27 (см. фигуру 23);
(k) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:29 (см. фигуру 25);
(l) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:31 (см. фигуру 27);
(m) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:33 (см. фигуру 29);
(n) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:35 (см. фигуру 31); или
(о) нуклеотидной последовательности, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:35.16. The use of claim 10, where the lipid acyltransferase enzyme contains an amino acid sequence obtained by expression of one of the following nucleotide sequences:
(a) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 (see figure 9);
(b) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 (see figure 10);
(c) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 (see figure 11);
(d) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 (see figure 12);
(e) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 (see figure 13);
(f) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 (see figure 15);
(g) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 (see figure 17);
(h) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 (see figure 19);
(i) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 (see figure 21);
(j) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 (see figure 23);
(k) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 (see figure 25);
(l) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 (see figure 27);
(m) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 (see figure 29);
(n) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 (see figure 31); or
(o) a nucleotide sequence that is 75% or more identical to one of the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 35.

17. Применение по п.10, где липидацилтрансфераза является иммобилизованной липидацилтрансферазой, обладающей ацилтрансферазной активностью и содержащей фрагмент GDSX аминокислотной последовательности, где Х означает один или несколько нижеследующих аминокислотных остатков L, А, V, I, F, Y, H, Q, Т, N, М или S, которая содержит Н-309 или остаток гистидина в положении, соответствующем положению His-309 в аминокислотной последовательности липолитического фермента Aeromonas hydrophila, представленной как SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32, и где фермент липидацилтрансфераза содержит одну из следующих последовательностей:
(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;
(ii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3;
(iii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;
(iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5;
(v) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;
(vi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12;
(vii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20;
(viii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22;
(ix) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24;
(x) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;
(xi) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28;
(xii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30;
(xiii) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32;
(xiv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34, или аминокислотную последовательность, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34,
или содержащую аминокислотную последовательность, полученную путем экспрессии одной из нижеследующих нуклеотидных последовательностей:
(a) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:7 (см. фигуру 9);
(b) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:8 (см. фигуру 10);
(c) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:9 (см. фигуру 11);
(d) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:10 (см. фигуру 12);
(e) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:11 (см. фигуру 13);
(f) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:13 (см. фигуру 15);
(g) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:21 (см. фигуру 17);
(h) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:23 (см. фигуру 19);
(i) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:25 (см. фигуру 21);
(j) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:27 (см. фигуру 23);
(k) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:29 (см. фигуру 25);
(l) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:31 (см. фигуру 27);
(m) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:33 (см. фигуру 29);
(n) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:35 (см. фигуру 31); или (о) нуклеотидной последовательности, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:35.17. The use of claim 10, where the lipid acyltransferase is an immobilized lipid acyltransferase having acyltransferase activity and containing a GDSX fragment of the amino acid sequence, where X means one or more of the following amino acid residues L, A, V, I, F, Y, H, Q, T , N, M or S, which contains H-309 or a histidine residue at the position corresponding to His-309 in the amino acid sequence of the Aeromonas hydrophila lipolytic enzyme represented as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 32, and where the lipid acyltransferase enzyme contains t one of the following sequences:
(i) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(iii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(iv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
(v) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
(vi) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(vii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(viii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(ix) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;
(x) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(xi) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(xii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30;
(xiii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32;
(xiv) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence that is 75% or more identical to one of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 32 or SEQ ID NO: 34,
or containing an amino acid sequence obtained by expression of one of the following nucleotide sequences:
(a) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 (see figure 9);
(b) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 (see figure 10);
(c) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 (see figure 11);
(d) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 (see figure 12);
(e) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 (see figure 13);
(f) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 (see figure 15);
(g) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 (see figure 17);
(h) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 (see figure 19);
(i) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 (see figure 21);
(j) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 (see figure 23);
(k) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 (see figure 25);
(l) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 (see figure 27);
(m) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 (see figure 29);
(n) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 (see figure 31); or (o) a nucleotide sequence that is 75% or more identical to one of the sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 35 .

18. Применение по п.17, где липидацилтрансферазу получают из организма, относящегося к одному или нескольким нижеследующим родам: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas и Candida. 18. The use according to claim 17, wherein the lipid acyltransferase is obtained from an organism belonging to one or more of the following genera: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Vacillobus bollillae, Campylobolae bacillus, Campylobulus Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas and Candida.