RU2366716C2

RU2366716C2 - Method for identification and/or verification of inhibitors of receptor tyrosine kinases

Info

Publication number: RU2366716C2
Application number: RU2006117759/13A
Authority: RU
Inventors: Теа ГУНДЕ (CH); Теа ГУНДЕ; Катрин БЕРСЕТ (CH); Катрин БЕРСЕТ; Олсайд БАРБЕРИ (CH); Олсайд БАРБЕРИ
Original assignee: Эсбатек Аг
Priority date: 2003-10-24
Filing date: 2003-10-24
Publication date: 2009-09-10
Also published as: RU2006117759A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: there is offered method for identification and/or verification of inhibitors of receptor tyrosine kinases that involves application of a new test system which represents a yeast host cell containing an expression vector including a nucleic acid sequence that encodes fused protein essentially consisting of a complete cytoplasmic part of analysed receptor tyrosine kinase and the dimerisation domain and, if necessary, in addition including anchoring sequence for fused protein in a membrane wherein expression of fused protein conduces to termination of cell proliferation. The method provides production of specified host cells being in contact with a candidate compound and identification of inhibitors of tested tyrosine kinase activity as a result of cultivation on the assumption that inhibition of tyrosine kinase activity with a candidate compound causes restoration of proliferation process.

EFFECT: prospected application of the invention is related to development of selective therapeutic, including anticancer, agents.

13 cl, 5 dwg, 2 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящая заявка касается клеточного способа идентификации и/или проверки ингибиторов активности рецепторных тирозинкиназ.The present application relates to a cellular method for identifying and / or testing inhibitors of receptor tyrosine kinase activity.

Уровень техникиState of the art

Рецепторные тирозинкиназы (PTK) являются ключевыми регуляторами межклеточной коммуникации, которые контролируют рост, пролиферацию, дифференцировку, выживание и метаболизм клеток. Идентифицировано около 20 различных семейств PTK, имеющих одинаковую структуру, а именно: внеклеточный сайт связывания лигандов, трансмембранную область и внутриклеточный тирозинкиназный домен [1]. Внеклеточное связывание лигандов вызывает димеризацию рецептора или стабилизирует ее, что ведет к повышению киназной активности PTK. Внутриклеточный каталитический домен проявляет наибольшую степень консервативности среди PTK и включает АТФ-связывающий участок, который катализирует автофосфорилирование рецептора по цитоплазматическим остаткам тирозина, которые служат местом посадки для белков, содержащих домен гомологии с Src 2 (SH2) и домен связывания фосфотирозина (РТВ), таких как Grb2, She, Src, Cbl, или фосфолипазы Сγ. Эти белки впоследствии привлекают к активированному рецептору дополнительные эффекторы, содержащие домены SH2, SH3, РТВ, а также домен гомологии с плекстрином (РН), что приводит к сборке сигнальных комплексов на мембране и активации каскада внутриклеточных биохимических сигналов. К наиболее важным каскадам нисходящих сигналов, активируемых PTK, относятся путь Ras внеклеточной сигнал-регулирующей киназы (ERK) - митоген-активируемой (MAP) киназы, путь фосфоинозитид 3-киназы (PI 3-киназы) - Akt и путь JAK/STAT. Сложная сигнальная сеть, запускаемая PTK, в конечном счете, приводит либо к активации, либо к репрессии различных групп генов и, тем самым, определяет биологический ответ на данный сигнал.Receptor tyrosine kinases (PTKs) are key regulators of intercellular communication that control cell growth, proliferation, differentiation, survival, and metabolism. About 20 different PTK families with the same structure have been identified, namely, the extracellular ligand binding site, the transmembrane region, and the intracellular tyrosine kinase domain [1]. Extracellular binding of ligands causes dimerization of the receptor or stabilizes it, which leads to an increase in the kinase activity of PTK. The intracellular catalytic domain exhibits the highest degree of conservatism among PTK and includes an ATP-binding site that catalyzes receptor autophosphorylation at the tyrosine cytoplasmic residues, which serve as a landing site for proteins containing a homology domain with Src 2 (SH2) and a phosphotyrosine (PTB) binding domain, like Grb2, She, Src, Cbl, or Cγ phospholipase. These proteins subsequently attract additional effectors containing SH2, SH3, and PTB domains to the activated receptor, as well as a homology domain with plectrin (PH), which leads to the assembly of signal complexes on the membrane and activation of the cascade of intracellular biochemical signals. The most important cascades of downstream signals activated by PTK include the Ras pathway of the extracellular signal-regulating kinase (ERK) - mitogen-activated (MAP) kinase, the phosphoinositide 3-kinase (PI 3 kinase) pathway Akt, and the JAK / STAT pathway. The complex signaling network triggered by PTK ultimately leads to either activation or repression of different groups of genes and, thus, determines the biological response to this signal.

Активность PTK и опосредованная ими клеточная передача сигналов хорошо скоординированы и строго контролируются в нормальных клетках. Разбалансировка сигнальной системы PTK, как при стимуляции фактором роста, так и при генетических изменениях, ведет к нарушению регуляции тирозинкиназной активности. Такие нарушения обычно приводят к тому, что киназная активность, а тем самым и сигнальная способность PTK, становится конститутивной (постоянной) или сильно повышается, что приводит к злокачественному перерождению клетки. Поэтому их часто связывают с раком человека, а также с другими гиперпролиферативными заболеваниями, такими как псориаз [2]. К наиболее важным механизмам, вызывающим конститутивную PTK передачу сигналов, относятся суперэкспрессия и/или амплификация генов PTK, такие генетические изменения, как делеции и мутации во внеклеточном домене, равно как изменения каталитического центра, либо аутокринно-паракринная стимуляция через аномальные системы факторов роста.PTK activity and their mediated cellular signaling are well coordinated and strictly controlled in normal cells. Imbalance of the PTK signaling system, both during stimulation with a growth factor and with genetic changes, leads to a violation of the regulation of tyrosine kinase activity. Such disturbances usually lead to the fact that the kinase activity, and thereby the signaling ability of PTK, becomes constitutive (constant) or increases significantly, which leads to malignant degeneration of the cell. Therefore, they are often associated with human cancer, as well as with other hyperproliferative diseases, such as psoriasis [2]. The most important mechanisms causing constitutive PTK signaling include overexpression and / or amplification of PTK genes, such genetic changes as deletions and mutations in the extracellular domain, as well as changes in the catalytic center, or autocrine-paracrine stimulation through abnormal systems of growth factors.

Например, при многих видах рака у человека происходит амплификация генов и/или суперэкспрессия PTK, что может повысить восприимчивость раковых клеток к нормальным уровням факторов роста. Кроме того, суперэкспрессия специфической PTK на клеточной поверхности повышает частоту димеризации рецепторов даже в отсутствие активирующего лиганда. Во многих случаях это приводит к конститутивной активации PTK, что ведет к аномальной и неконтролируемой пролиферации клеток и образованию опухолей. Важным примером такого сценария является HER2, также известная как ЕrbВ2, которая принадлежит к семейству PTK рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Суперэкспрессия HER2 обнаруживалась при различных типах рака человека, особенно в карциномах молочной железы и яичников [3]. Очень важно то, что аномально высокие уровни HER2 коррелируют с более агрессивным прогрессированием заболевания и уменьшением продолжительности жизни пациентов [4]. EGFR, первая рецепторная тирозинкиназа, которая была клонирована на молекулярном уровне [5], также играет существенную роль в онкогенезе. EGFR часто подвергается суперэкспрессии при немелкоклеточном раке легких, мочевого пузыря, шейки матки, яичников, почек и поджелудочной железы и при плоскоклеточной карциноме головы и шеи [6]. Преобладающим механизмом, ведущим к суперэкспрессии EGFR, является амплификация EGFR генов, причем в определенных опухолях оказалось до 60 копий на одну клетку [7]. Обычно повышение уровня экспрессии EGFR связано с высокой частотой метастазирования и усилением пролиферации опухолей [8].For example, in many types of cancer in humans, gene amplification and / or overexpression of PTK occurs, which can increase the susceptibility of cancer cells to normal levels of growth factors. In addition, overexpression of specific PTK on the cell surface increases the frequency of receptor dimerization even in the absence of an activating ligand. In many cases, this leads to constitutive activation of PTK, which leads to abnormal and uncontrolled cell proliferation and the formation of tumors. An important example of this scenario is HER2, also known as ErbB2, which belongs to the PTK family of epidermal growth factor receptor (EGFR). HER2 overexpression was detected in various types of human cancer, especially in carcinomas of the breast and ovaries [3]. It is very important that abnormally high levels of HER2 correlate with more aggressive disease progression and a shorter life span of patients [4]. EGFR, the first receptor tyrosine kinase that has been cloned at the molecular level [5], also plays a significant role in oncogenesis. EGFR is often overexpressed in non-small cell carcinoma of the lung, bladder, cervix, ovary, kidney, and pancreas, and in squamous cell carcinoma of the head and neck [6]. The predominant mechanism leading to superexpression of EGFR is the amplification of EGFR genes, with up to 60 copies per cell in certain tumors [7]. Typically, increased levels of EGFR expression are associated with a high frequency of metastasis and increased tumor proliferation [8].

Поскольку тирозинкиназы оказались вовлеченными в различные симптомы рака, PTK и активируемые ими сигнальные каскады являются перспективными областями для разработки селективных по отношению к этим мишеням противораковых препаратов. Одним из подходов к ингибированию аномальной передачи сигналов PTK является разработка низкомолекулярных препаратов, избирательно подавляющих присущую PTK тирозинкиназную активность и, тем самым, блокирующих автофосфорилирование рецептора и активацию преобразователей (transducers) нисходящих сигналов [9].Since tyrosine kinases have been implicated in various cancer symptoms, PTK and the signaling cascades they activate are promising areas for developing cancer-selective drugs that are selective for these targets. One approach to inhibiting abnormal PTK signaling is the development of low molecular weight drugs that selectively suppress tyrosine kinase activity inherent in PTK and, thereby, block receptor autophosphorylation and activation of downstream signal transducers [9].

Для того чтобы идентифицировать PTK-специфичные ингибиторы, было разработано несколько методов скрининга библиотек соединений, в большинстве из которых применяются биохимические методы [10]. Одно из важных соображений при выборе эффективных ингибиторов тирозинкиназ состоит в том, что эти соединения должны проникать через клеточные мембраны и функционировать во внутриклеточной среде в течение необходимого времени. Кроме того, чтобы стать потенциальным прототипом лекарственного средства, ингибиторы киназ не должны проявлять цитотоксических эффектов. Поэтому желательно иметь клеточную систему для первичного скрининга соединений, способных ингибировать активность PTK. Требования к таким методам in vivo заключаются в возможности исследовать специфический клеточный процесс, запускаемый определенной мишенью, и в средстве для легкого измерения его результата в высокопроизводительной системе скрининга (HTS). Наличие все возрастающего числа средств биотехнологии для генетической модификации клеток и микроорганизмов позволило разработать простые цифровые методы анализа клеточных процессов, которые можно легко применить к автоматизированным системам при HTS [11-14]. Клеточный скрининг в идеальном случае должен проводиться на клетках из человека, которые, очевидно, представляют собой физиологически наиболее обоснованную модельную систему. Однако может оказаться, что будет трудно контролировать эффекты избыточных процессов на измеряемый результат и отличить их от тех эффектов, которые должны быть специфичными к заданной мишени; а генетическое манипулирование на клетках млекопитающих обычно является проблематичным и трудоемким. Более того, культивирование клеток человека стоит дорого, и их бывает затруднительно выращивать в автоматизированных системах для HTS. Микроорганизмы типа дрожжей представляют удобную альтернативу для измерения активности определенных белков человека хотя и в гетерологичной, но клеточной (эукариотической) среде. В клетках дрожжей функционирование белков человека зачастую может быть восстановлено и некоторые аспекты физиологических процессов человека могут быть воспроизведены вследствие высокой степени консервативности основных молекулярных и клеточных механизмов между клетками дрожжей и человека [14-17]. Тот факт, что многие белки человека функционируют в дрожжах, означает, что в этом эукариотическом организме имеет место требуемая для них конформация, стабильность, взаимодействие белок-белок и т.п.In order to identify PTK-specific inhibitors, several methods for screening compound libraries have been developed, most of which use biochemical methods [10]. One of the important considerations when choosing effective tyrosine kinase inhibitors is that these compounds must penetrate cell membranes and function in the intracellular environment for the required time. In addition, in order to become a potential prototype of a drug, kinase inhibitors should not exhibit cytotoxic effects. Therefore, it is desirable to have a cell system for primary screening of compounds capable of inhibiting PTK activity. The requirements for such in vivo methods are the ability to study a specific cellular process triggered by a specific target, and in a tool for easily measuring its result in a high-throughput screening system (HTS). The presence of an increasing number of biotechnology tools for the genetic modification of cells and microorganisms has allowed the development of simple digital methods for the analysis of cellular processes that can be easily applied to automated systems with HTS [11-14]. Cellular screening should ideally be carried out on cells from humans, which, obviously, are the physiologically most reasonable model system. However, it may turn out to be difficult to control the effects of excess processes on the measured result and distinguish them from those effects that should be specific to a given target; and genetic manipulation on mammalian cells is usually problematic and time consuming. Moreover, culturing human cells is expensive and can be difficult to grow in automated systems for HTS. Microorganisms such as yeast provide a convenient alternative for measuring the activity of certain human proteins, albeit in a heterologous, but cellular (eukaryotic) environment. In yeast cells, the functioning of human proteins can often be restored and some aspects of human physiological processes can be reproduced due to the high degree of conservatism of the basic molecular and cellular mechanisms between yeast and human cells [14-17]. The fact that many human proteins function in yeast means that the conformation required for them, stability, protein-protein interaction, etc., takes place in this eukaryotic organism.

Несмотря на то, что уже существуют способы выделения ингибиторов рецепторных тирозинкиназ, однако имеется потребность в надежном клеточном способе идентификации и/или проверки таких ингибиторов рецепторных тирозинкиназ, которые проникают через клеточные мембраны и не цитотоксичны.Although methods for isolating receptor tyrosine kinase inhibitors already exist, there is a need for a reliable cellular method for identifying and / or testing such receptor tyrosine kinase inhibitors that penetrate cell membranes and are not cytotoxic.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Таким образом, общим предметом изобретения является способ идентификации и/или проверки ингибиторов активности рецепторных тирозинкиназ. Данный способ включает следующие стадии:Thus, a general subject of the invention is a method for identifying and / or checking inhibitors of receptor tyrosine kinase activity. This method includes the following steps:

a) получения клеток реципиента, содержащих конструкцию из нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, который включает тирозинкиназный домен рецепторной тирозинкиназы или его функциональный фрагмент, причем данный пептид не имеет трансмембранного домена или его функционального фрагмента, а активность данной тирозинкиназы вызывает прекращение пролиферации данных клеток реципиента;a) obtaining recipient cells containing a nucleic acid construct encoding a peptide that includes the tyrosine kinase domain of the receptor tyrosine kinase or its functional fragment, the peptide having no transmembrane domain or functional fragment, and the activity of this tyrosine kinase terminates the proliferation of these recipient cells;

b) взаимодействия данных клеток реципиента с соединением-кандидатом;b) the interaction of these recipient cells with a candidate compound;

c) идентификации ингибиторов данной тирозинкиназной активности при культивировании данных клеток реципиента в соответствующих условиях, исходя из того, что модуляция тирозинкиназной активности соединением-кандидатом приводит к пролиферации клеток.c) the identification of inhibitors of this tyrosine kinase activity during cultivation of these recipient cells under appropriate conditions, on the basis that the modulation of tyrosine kinase activity by the candidate compound leads to cell proliferation.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения данная конструкция из нуклеиновой кислоты кодирует пептид, содержащий всю цитоплазматическую часть данной рецепторной тирозинкиназы.In a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid construct encodes a peptide containing the entire cytoplasmic portion of this receptor tyrosine kinase.

В другом предпочтительном воплощении данный пептид не имеет сигнальной последовательности и/или пептида, приводящего к ядерной локализации данного пептида.In another preferred embodiment, the peptide does not have a signal sequence and / or peptide leading to nuclear localization of the peptide.

В следующем предпочтительном воплощении данный пептид дополнительно содержит домен димеризации или его функциональный фрагмент. Домен димеризации предпочтительно выбирают из мотивов «лейциновой застежки» (leucine zipper motif) белков c-Fos, c-Jun и Gcn4.In a further preferred embodiment, the peptide further comprises a dimerization domain or a functional fragment thereof. The dimerization domain is preferably selected from the “leucine zipper motif” motifs of c-Fos, c-Jun and Gcn4 proteins.

В более предпочтительном воплощении клетки реципиента содержат два пептида, причем первый пептид включает лейциновую застежку c-Fos, а второй пептид включает лейциновую застежку c-Jun.In a more preferred embodiment, the recipient cells contain two peptides, the first peptide comprising a c-Fos leucine zipper and the second peptide comprising a c-Jun leucine zipper.

В следующем предпочтительном воплощении данный пептид включает последовательность, вызывающую заякоривание (anchoring) пептида в мембране, в частности, сигнал миристоилирования для заякоривания в мембране.In a further preferred embodiment, the peptide comprises a sequence for anchoring the peptide in the membrane, in particular a myristoylation signal for anchoring in the membrane.

Тирозинкиназная активность в способе настоящего изобретения может исходить от любой рецепторной тирозинкиназы. К предпочтительным рецепторным тирозинкиназам относятся EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, INSR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSF-1R, KIT/SCFR, FLK2/FLT3, VEGRF 1-3, FGFR 1-4, CCK4, TRKA, TRKB, TRKC, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRО3, TIE, ТЕК, RYK, DDR1, DDR2, RET, ROS, LTK, ALK, ROR1, ROR2, MUSK, AATYK, AATYK2, AATYK3, RTK 106.Tyrosine kinase activity in the method of the present invention may come from any receptor tyrosine kinase. Preferred receptor tyrosine kinases include EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, INSR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSF-1R, KIT / SCFR, FLK2 / FLT3, VEGRF 1-3, FGFR 1-4, CCK4, TRK , TRKB, TRKC, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRО3, TIE, TEK, RYK, DDR1, DDR2, RET, ROS, LTK, ALK, ROR1, ROR2, MUSK, AATYK , AATYK2, AATYK3, RTK 106.

В более предпочтительном воплощении тирозинкиназную активность выбирают из группы, состоящей из INSR, IGF-1R, PDGFRα, PDGFRβ, KIT/SCFR, FGFR-1, TRKA, MET, RON, EPHB2, ЕРНВ4, AXL, ТЕК, RET, ROS.In a more preferred embodiment, the tyrosine kinase activity is selected from the group consisting of INSR, IGF-1R, PDGFRα, PDGFRβ, KIT / SCFR, FGFR-1, TRKA, MET, RON, EPHB2, EPHB4, AXL, TEK, RET, ROS.

В следующем предпочтительном воплощении данная рецепторная тирозинкиназа происходит из человека.In a further preferred embodiment, the receptor tyrosine kinase is derived from humans.

В следующем предпочтительном воплощении конструкция из нуклеиновой кислоты включает индуцибельный промотор, предпочтительно индуцируемый галактозой промотор, который контролирует экспрессию данного пептида.In a further preferred embodiment, the nucleic acid construct comprises an inducible promoter, preferably a galactose-induced promoter, that controls the expression of the peptide.

В следующем предпочтительном воплощении клетки реципиента представляют собой клетки дрожжей или клетки бактерий, предпочтительно клетки S.cerevisiae, более предпочтительно клетки S.cerevisiae, несущие мутацию в гене АВС переносчика.In a further preferred embodiment, the recipient cells are yeast cells or bacterial cells, preferably S. cerevisiae cells, more preferably S. cerevisiae cells carrying a mutation in the ABC carrier gene.

В следующем аспекте настоящее изобретение касается дрожжевого экспрессионного вектора, включающего конструкцию из нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, а также набора для идентификации и/или проверки ингибиторов рецепторных тирозинкиназ.In a further aspect, the present invention relates to a yeast expression vector comprising the nucleic acid construct of the present invention, as well as a kit for identifying and / or testing receptor tyrosine kinase inhibitors.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

Изобретение станет более понятным, и станут явными и другие задачи, помимо изложенных выше, при рассмотрении нижеследующего подробного описания с привлечением приложенных фигур.The invention will become more understandable, and other tasks will become apparent, in addition to those described above, when considering the following detailed description using the attached figures.

На фиг.1a представлены три конструкции для c-Met и влияние их экспрессии на рост дрожжей.Figure 1a shows three constructs for c-Met and the effect of their expression on yeast growth.

На фиг.1b представлены три конструкции для PDGFRβ и влияние их экспрессии на рост дрожжей. Глюкоза = репрессивные условия, т.е. пептиды не экспрессируются, а галактоза = пермиссивные условия, т.е. пептиды экспрессируются.Figure lb shows three constructs for PDGFRβ and the effect of their expression on yeast growth. Glucose = repressive conditions, i.e. peptides are not expressed, and galactose = permissive conditions, i.e. peptides are expressed.

На фиг.2a представлен анализ экстрактов клеток методом Western-блот-гибридизации с помощью антител к Мус.On figa presents the analysis of cell extracts by Western blot hybridization using antibodies to Myc.

На фиг.2b представлен анализ экстрактов клеток методом Western-блот-гибридизации с помощью антител к фосфотирозину.Fig.2b presents the analysis of cell extracts by Western blot hybridization using antibodies to phosphotyrosine.

На фиг.3 представлено ингибирование активности рецепторной тирозинкиназы PDGFRβ под действием Gleevec в дрожжевых клетках.Figure 3 shows the inhibition of the activity of the receptor tyrosine kinase PDGFRβ under the action of Gleevec in yeast cells.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Настоящее изобретение предусматривает клеточную систему для идентификации и/или проверки специфических ингибиторов рецепторных тирозинкиназ (PTK), предпочтительно PTK человека. В этой системе клетки реципиента, предпочтительно дрожжевые клетки, экспрессирующие в определенных условиях заданные фрагменты PTK, способны расти только при ингибировании или инактивации протеинкиназной активности. Такой положительный признак позволяет проводить отбор специфических ингибиторов киназы, которые к тому же должны быть растворимы, стабильны и не цитотоксичны.The present invention provides a cell system for identifying and / or testing specific receptor tyrosine kinase (PTK) inhibitors, preferably human PTK. In this system, recipient cells, preferably yeast cells expressing specific PTK fragments under certain conditions, can grow only when protein kinase activity is inhibited or inactivated. This positive feature allows the selection of specific kinase inhibitors, which should also be soluble, stable and not cytotoxic.

В клеточной системе настоящего изобретения тирозинкиназный домен PTK или его функциональные фрагменты, предпочтительно цитоплазматический домен PTK или его функциональные фрагменты, подвергаются экспрессии в цитоплазме клеток реципиента либо «как есть», либо в виде слитных пептидов, имеющих известные белковые последовательности, образующих прочные димеры. Экспрессия этих белков в клетках, предпочтительно дрожжевых клетках, предпочтительно контролируется индуцибельными промоторами типа промотора гена GAL1. Экспрессия димеризующихся производных PTK значительно снижает рост дрожжевых клеток в селективных условиях (фиг.1a и 1b). Такое ингибирование роста вызвано зависящей от димеризации активацией тирозинкиназной активности, так как введение точечной мутации в активный центр, которая устраняет тирозинкиназную функцию PTK, снимает эффект ингибирования роста (фиг.1a и 1b). Анализ экстрактов клеток методом Western-блот-гибридизации с помощью антител к фосфотирозину показывает, что эффект ингибирования роста PTK, такими как, например, c-Met и PDGFRβ, коррелирует с их способностью катализировать фосфорилирование тирозина (фиг.2b).In the cell system of the present invention, the tyrosine kinase domain of PTK or its functional fragments, preferably the cytoplasmic domain of PTK or its functional fragments, are expressed in the cytoplasm of the recipient cells either “as is” or as fusion peptides having known protein sequences that form strong dimers. The expression of these proteins in cells, preferably yeast cells, is preferably controlled by inducible promoters such as the GAL1 gene promoter. Expression of dimerizable PTK derivatives significantly reduces the growth of yeast cells under selective conditions (FIGS. 1a and 1b). Such growth inhibition is caused by dimerization-dependent activation of tyrosine kinase activity, since the introduction of a point mutation into the active center, which eliminates the tyrosine kinase function of PTK, removes the effect of growth inhibition (Figs. 1a and 1b). Analysis of cell extracts by Western blot hybridization using antibodies to phosphotyrosine shows that the effect of inhibiting the growth of PTK, such as, for example, c-Met and PDGFRβ, correlates with their ability to catalyze tyrosine phosphorylation (Fig.2b).

Экспрессия пептидов PTK, включающих трансмембранный домен или его функциональный фрагмент, в особенности трансмембранный домен PTK, и сигнальный пептид для локализации N-концевого участка белка в просвете эндоплазматического ретикулума (ER) и внеклеточном пространстве, полностью устраняет эффект ингибирования роста (фиг.1а и 1b), тогда как она не уменьшает способности трансмембранной PTK катализировать фосфорилирование тирозина (фиг.2b). Встраивание активных цитоплазматических доменов PTK в цитозольную часть клеточных мембран, по-видимому, не существенно для фосфорилирования тирозина и эффектов ингибирования роста, так как не наблюдается различия между экспрессией простых цитоплазматических доменов PTK и тех же последовательностей, несущих сигнал миристоилирования для заякоривания в мембране (фиг.1a, 1b и 2a).Expression of PTK peptides, including the transmembrane domain or its functional fragment, in particular the transmembrane domain of PTK, and the signal peptide for localizing the N-terminal portion of the protein in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) and extracellular space, completely eliminates the effect of growth inhibition (figa and 1b ), while it does not reduce the ability of transmembrane PTK to catalyze tyrosine phosphorylation (Fig.2b). The incorporation of active cytoplasmic PTK domains into the cytosolic part of cell membranes is apparently not essential for tyrosine phosphorylation and growth inhibition effects, since there is no difference between the expression of simple cytoplasmic PTK domains and the same sequences carrying a myristoylation signal for anchoring in the membrane (Fig. .1a, 1b and 2a).

На предшествующем уровне техники показано, что экспрессия полноразмерной цитоплазматической тирозинкиназы c-src в S.pombe приводит к гибели клеток [18], а экспрессия pp60v-src в S.cerevisiae приводит к прекращению роста [19]. Мутанты pp60v-src, не имеющие функционального N-концевого сигнала миристоилирования, вызывают лишь частичное подавление остановки роста [19], т.е. полное прекращение роста, вызываемое экспрессией pp60v-src в S.cerevisiae, может наблюдаться только при попадании pp60v-src киназы в естественный для нее клеточный компартмент. Авторы настоящего изобретения, в отличие от предшествующего уровня техники, обнаружили, что экспрессия полноразмерной PTK в дрожжевых клетках не приводит к остановке роста, т.е. нахождение PTK в естественном клеточном компартменте (трансмембранная локализация) в дрожжевых клетках не приводит к остановке роста.In the prior art, it has been shown that expression of the full-length cytoplasmic tyrosine kinase c-src in S. pombe results in cell death [18], and pp60v-src expression in S. cerevisiae leads to cessation of growth [19]. The pp60v-src mutants lacking a functional N-terminal myristoylation signal cause only partial suppression of growth arrest [19], i.e. complete cessation of growth caused by expression of pp60v-src in S. cerevisiae can be observed only when the pp60v-src kinase enters the cell compartment natural for it. The authors of the present invention, in contrast to the prior art, found that expression of full-sized PTK in yeast cells does not lead to growth arrest, i.e. the presence of PTK in the natural cell compartment (transmembrane localization) in yeast cells does not stop growth.

В типичном воплощении настоящего изобретения добавление специфического ингибитора тирозинкиназ иматиниб-мезилата (Gleevec^®, Novartis) к модифицированным дрожжевым клеткам, экспрессирующим димеризующийся фрагмент PTK PDGFRβ, ведет к блокированию зависящей от димеризации киназной активности этой PTK и к возобновлению роста в селективных условиях (фиг.3). Ингибирование роста под действием другой PTK (напр., RET), на которую не влияет специфический ингибитор киназ Gleevec, не устранялось в присутствии этого соединения (фиг.3).In a typical embodiment of the present invention, the addition of a specific tyrosine kinase inhibitor imatinib mesylate (Gleevec ^®, Novartis) a modified yeast cells expressing dimerized fragment PTK PDGFRβ, leads to blocking dimerization-dependent kinase activity of the PTK and to restore growth under selective conditions (Figure 3 ) Growth inhibition by another PTK (eg, RET), which is not affected by the specific Gleevec kinase inhibitor, was not eliminated in the presence of this compound (FIG. 3).

Поскольку у бактериальных и дрожжевых клеток нет эндогенных тирозинкиназ того же типа, что у млекопитающих, эта клеточная система дает преимущество в нулевом фоне для экспрессии PTK и скрининга специфических ингибиторов этих мембранных киназ, что создает привилегированную ситуацию, которая не может быть достигнута на клетках млекопитающих.Since bacterial and yeast cells do not have endogenous tyrosine kinases of the same type as mammals, this cell system offers a zero background advantage for the expression of PTK and screening for specific inhibitors of these membrane kinases, which creates a privileged situation that cannot be achieved on mammalian cells.

Пептид настоящего изобретения можно экспрессировать из внехромосомной генной конструкции, например, из эписомного вектора, позволяющего экспрессировать слитный белок в клетках реципиента. Конструкция из нуклеиновой кислоты, кодирующей слитный пептид, может быть встроена в геном клеток реципиента. Нуклеиновую кислоту можно ввести в клетку любым методом трансфекции, приводящим к захвату последовательности нуклеиновой кислоты клеткой. Такие методы известны специалистам в этой области и описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory, 2001.The peptide of the present invention can be expressed from an extrachromosomal gene construct, for example, from an episomal vector that allows expression of a fusion protein in recipient cells. A nucleic acid construct encoding a fusion peptide can be integrated into the genome of recipient cells. The nucleic acid can be introduced into the cell by any transfection method, resulting in the capture of the nucleic acid sequence by the cell. Such methods are known to those skilled in the art and are described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.

Конструирование соответствующих клеток реципиента и других молекулярно-биологических реагентов для настоящего изобретения, например, конструкций для слитного пептида, может осуществляться стандартными методами молекулярной биологии, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory, 2001.The construction of appropriate recipient cells and other molecular biological reagents for the present invention, for example, constructs for a fusion peptide, can be carried out by standard molecular biology methods, as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.

Специалист в этой области также сможет установить подходящие условия культивирования, позволяющие детектирование и/или выживание используемых клеток. Эти условия зависят от используемых генетических конструкций и клеток реципиента.One skilled in the art will also be able to establish suitable culture conditions that allow the detection and / or survival of the cells used. These conditions depend on the genetic constructs and recipient cells used.

Существует, по меньшей мере, три различные категории соединений, которые можно подвергать отбору способом скрининга по настоящему изобретению: химические библиотеки, библиотеки природных продуктов и комбинаторные библиотеки. Химические библиотеки состоят из структурных аналогов известных соединений. Библиотеки природных продуктов представляют собой коллекции микроорганизмов, животных, растений или морских организмов, которые применяются для образования смесей для скрининга, например, путем ферментации и экстрагирования культуральной жидкости из почвенных, растительных или морских микроорганизмов, либо экстрагирования растений или морских организмов. Комбинаторные библиотеки состоят из большого числа пептидов, олигонуклеотидов или органических соединений в виде смеси. Они могут быть сравнительно легко получены, например, традиционными методами синтеза, ПЦР или клонирования.There are at least three different categories of compounds that can be screened by the screening method of the present invention: chemical libraries, natural product libraries, and combinatorial libraries. Chemical libraries consist of structural analogues of known compounds. Natural product libraries are collections of microorganisms, animals, plants or marine organisms that are used to form screening mixtures, for example, by fermenting and extracting culture fluid from soil, plant or marine microorganisms, or by extracting plants or marine organisms. Combinatorial libraries consist of a large number of peptides, oligonucleotides or organic compounds in a mixture. They can be relatively easily obtained, for example, by traditional methods of synthesis, PCR or cloning.

Далее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров.The invention will now be described in more detail using examples.

Эксперимент 1Experiment 1

Результаты этого эксперимента представлены на фиг.1 и фиг.2a и 2b. Рост клеток и образование колоний на чашках с глюкозой, на которых происходит репрессия генов PTK, представлены в левом ряду. Рост клеток и образование колоний на чашках с галактозой, на которых происходит индукция генов PTK, представлены в правом ряду. Экспрессия активных цитоплазматических доменов PTK c-Met и PDGFRβ вызывает зависимое от киназы ингибирование роста дрожжевых клеток (фиг.1а и 1b, дорожки 1 и 4). Инактивация киназной активности посредством мутации консервативного остатка лизина (Lys=K) в АТФ-связывающем участке этих PTK ведет к супрессии эффекта ингибирования роста (фиг.1a и 1b, дорожки 3 и 6). В отличие от изолированных цитоплазматических доменов этих PTK, включение соответствующих трансмембранных доменов этих белков, вместе с сигнальным пептидом для локализации в ER и секреции, вызывало устранение эффекта ингибирования роста клеток (фиг.1a и 1b, дорожки 2 и 5).The results of this experiment are presented in FIG. 1 and FIGS. 2a and 2b. Cell growth and colony formation on glucose plates that repress PTK genes are shown in the left row. Cell growth and colony formation on galactose plates, on which the induction of PTK genes occurs, are presented in the right row. Expression of the active cytoplasmic domains of PTK c-Met and PDGFRβ causes kinase-dependent inhibition of yeast growth (FIGS. 1a and 1b, lanes 1 and 4). Inactivation of kinase activity by mutation of the conserved lysine residue (Lys = K) in the ATP-binding region of these PTKs leads to suppression of the growth inhibition effect (FIGS. 1a and 1b, lanes 3 and 6). Unlike the isolated cytoplasmic domains of these PTKs, the inclusion of the corresponding transmembrane domains of these proteins, together with the signal peptide for localization in ER and secretion, caused the elimination of the effect of inhibition of cell growth (Figs. 1a and 1b, lanes 2 and 5).

Для конститутивной активации c-Met и PDGFRp проводили слияние гетерологического домена димеризации с цитоплазматическими доменами c-Met и PDGFRβ или с более длинными производными c-Met и PDGFRβ, включающими природный трансмембранный домен. В одной рамке считывания пришивали лейциновую застежку c-Jun или лейциновую застежку c-fos либо к N-концам цитоплазматических доменов c-Met (аминокислотные остатки, а.о. 932-1366) и PDGFRR (а.о. 524-1067), либо к N-концам конструкций для c-Met (а.о. 905-1366) и PDGFRβ (а.о. 496-1067), несущих трансмембранные домены. Для анализа экспрессии конструкций в дрожжевых клетках вставляли эпитоп НА или Мус между сайтом слияния домена димеризации и киназным доменом. Цитоплазматическим конструкциям придавали мембранную локализацию с помощью сигнала миристоилирования (черный столбик, заякоренный в мембране, фиг.1). Для того чтобы обеспечить надлежащую секрецию слитных белков, содержащих трансмембранные домены, по N-концам доменов димеризации пришивали дрожжевую сигнальную последовательность Suc2 (SS).For constitutive activation of c-Met and PDGFRp, the heterologous dimerization domain was fused with the cytoplasmic domains of c-Met and PDGFRβ or with longer derivatives of c-Met and PDGFRβ, including the natural transmembrane domain. In one reading frame, the c-Jun leucine fastener or the c-fos leucine fastener or to the N-ends of the cytoplasmic c-Met domains (amino acid residues, amino acid residues 932-1366) and PDGFRR (ai 524-1067) were sewn, or to the N-ends of the constructs for c-Met (a.o. 905-1366) and PDGFRβ (a.o. 496-1067) bearing transmembrane domains. To analyze the expression of constructs in yeast cells, an HA or Myc epitope was inserted between the fusion site of the dimerization domain and the kinase domain. The cytoplasmic constructs were imparted with membrane localization using a myristoylation signal (black column anchored in the membrane, FIG. 1). In order to ensure proper secretion of fusion proteins containing transmembrane domains, the yeast signal sequence Suc2 (SS) was sutured at the N-ends of the dimerization domains.

Экспрессию указанных гибридных белков исследовали методом SDS-PAGE с последующей Western-блот-гибридизацией с помощью антител к Мус (фиг.2a). Все указанные гибридные белки, несущие эпитоп Мус для детектирования, лейциновую застежку c-Fos для образования гетеродимеров и сигнал миристоилирования (Мyr) для заякоривания в мембране, подвергались экспрессии так же, как и аналогичные конструкции, несущие эпитоп НА и другую лейциновую застежку c-Jun вместо функционально эквивалентных последовательностей отмеченных белков. Фосфорилирование белков (автофосфорилирование PTK и трансфосфорилирование неизвестных субстратных белков) выявляли методом Western-блот-гибридизации с помощью антител к pTyr (фиг.2b). Несмотря на то, что производные c-Met и PDGFRβ, несущие трансмембранные домены (ТМ), подвергались экспрессии и обладали активностью на уровне, сравнимом с изолированными цитоплазматическими доменами этих PTK (ср. дорожки 1 и 2 и дорожки 4 и 5 на фиг.2b), они не ингибировали пролиферацию дрожжей. Как и ожидалось, мутанты с инактивированной киназой не проявляли фосфорилирования тирозина (фиг.2b, дорожки 3 и 6).The expression of these fusion proteins was investigated by SDS-PAGE followed by Western blot hybridization using anti-Myc antibodies (Fig. 2a). All of these hybrid proteins carrying the Myc epitope for detection, the c-Fos leucine zipper for heterodimer formation, and the Myroylation signal (Myr) for anchoring in the membrane were expressed in the same way as similar constructs carrying the HA epitope and the other c-Jun leucine zipper instead of functionally equivalent sequences of marked proteins. Protein phosphorylation (PTK autophosphorylation and transphosphorylation of unknown substrate proteins) was detected by Western blot hybridization using anti-pTyr antibodies (Figure 2b). Despite the fact that c-Met and PDGFRβ derivatives bearing transmembrane domains (TM) were expressed and possessed activity at a level comparable to the isolated cytoplasmic domains of these PTKs (cf. lanes 1 and 2 and lanes 4 and 5 in FIG. 2b ), they did not inhibit yeast proliferation. As expected, inactivated kinase mutants did not show tyrosine phosphorylation (Figure 2b, lanes 3 and 6).

Эксперимент 2Experiment 2

Результаты этого эксперимента представлены на фиг.3.The results of this experiment are presented in figure 3.

Селекция по специфическому ингибированию активности рецепторных тирозинкиназ проводилась на дрожжах. Экспрессия рецепторных тирозинкиназ человека PDGFRβ и RET у дрожжей вызывает сильное замедление роста клеток, судя по измерениям светорассеяния при 600 нм в обеих клеточных культурах. Добавление ингибитора киназ иматиниб-мезилата (Gleevec^®, Novartis), который ингибирует PDGFRp, но не RET, в концентрации 50 мкМ в дрожжевые культуры приводило к возобновлению роста именно PDGFRβ-экспрессирующих дрожжевых клеток, но не роста клеток, экспрессирующих RET.Selection for specific inhibition of receptor tyrosine kinase activity was carried out on yeast. The expression of human PDGFRβ and RET receptor tyrosine kinases in yeast causes a strong slowdown in cell growth, judging by measurements of light scattering at 600 nm in both cell cultures. The addition of the kinase inhibitor imatinib mesylate (Gleevec ^® , Novartis), which inhibits PDGFRp, but not RET, at a concentration of 50 μM in yeast cultures led to the resumption of growth of PDGFRβ-expressing yeast cells, but not the growth of cells expressing RET.

Наряду с тем, что были представлены и описаны предпочтительные сейчас воплощения изобретения, следует четко понимать, что изобретение не ограничивается ими, а может быть реализовано и осуществлено различными другими способами в рамках нижеследующей формулы изобретения.Along with the fact that the presently preferred embodiments of the invention have been presented and described, it should be clearly understood that the invention is not limited to them, but can be implemented and carried out in various other ways within the framework of the following claims.

БиблиографияBibliography

1. Ullrich and J.Schlesinger, Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 61, 203-212, 1990.1. Ullrich and J. Schlesinger, Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 61, 203-212, 1990.

2. S.C.Robertson et al., RTK mutations and human syndromes when good receptors turn bad. Trends Genet. 16, 265-271, 2000.2. S. C. Robertson et al., RTK mutations and human syndromes when good receptors turn bad. Trends Genet. 16, 265-271, 2000.

3. D.J.Slamon et al., Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER2/neu oncogene. Science 235, 77-82, 1987.3. D.J.Slamon et al., Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER2 / neu oncogene. Science 235, 77-82, 1987.

4. S.Paik et al., Pathologic findings from the national surgical adjuvant project: Prognostic significance of erbB-2 protein overexpression in primary breast cancer. J.Clin. Oncol. 8, 103-112, 1990.4. S. Paik et al., Pathologic findings from the national surgical adjuvant project: Prognostic significance of erbB-2 protein overexpression in primary breast cancer. J. Clin. Oncol. 8, 103-112, 1990.

5. Ullrich et al., Human epidermal growth factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cells. Nature 309, 418-425, 1984.5. Ullrich et al., Human epidermal growth factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cells. Nature 309, 418-425, 1984.

6. W.K.Hong and A.Ullrich, The role of EGFR in solid tumors and implications for therapy. Oncol. Biother. 1, 1-29, 2000.6. W.K. Hong and A. Ullrich, The role of EGFR in solid tumors and implications for therapy. Oncol. Biother. 1, 1-29, 2000.

7. T.A.Libermann et al., Amplification, enhanced expression and possible rearrangement of EGF receptor gene in primary human brain tumors of glial origin. Nature 313, 144-147, 1985.7. T.A. Liberman et al., Amplification, enhanced expression and possible rearrangement of EGF receptor gene in primary human brain tumors of glial origin. Nature 313, 144-147, 1985.

8. К.Pavelic et al., Evidence for a role of EGF receptor in the progression of human lung carcinoma. Anticancer Res.13, pp.1133-1138, 1993.8. K. Pavelic et al., Evidence for a role of EGF receptor in the progression of human lung carcinoma. Anticancer Res.13, pp. 113-1138, 1993.

9. Levitzki, Protein tyrosine kinase inhibitors as novel therapeutic agents. Pharmacol. Ther.82, 231-239, 1999.9. Levitzki, Protein tyrosine kinase inhibitors as novel therapeutic agents. Pharmacol Ther. 82, 231-239, 1999.

10. S.B.Noonberg and С.С.Benz, Tyrosine kinase inhibitors targeted to the epidermal growth factor receptor subfamily: Role as anticancer agents. Drugs 59, 753-767, 2000.10. S. B. Noonberg and C. S. Benz, Tyrosine kinase inhibitors targeted to the epidermal growth factor receptor subfamily: Role as anticancer agents. Drugs 59, 753-767, 2000.

11. R.P.Herzberg and A.J.Pope, High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr. Opin. Chem. Biol.4, 445-451, 2000.11. R.P. Herzberg and A.J. Pope, High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451, 2000.

12. Johnston P.A. Cellular platforms for HTS: three case studies. Drug Discov. Today 7, 353-363, 2002.12. Johnston P.A. Cellular platforms for HTS: three case studies. Drug Discov. Today 7, 353-363, 2002.

13. Gonzales J.E. and Negulescu P.A. Intracellular detection assays for high-throughput screening. Curr. Opin. Biotechnol. 9, 624-631, 1998.13. Gonzales J.E. and Negulescu P.A. Intracellular detection assays for high-throughput screening. Curr. Opin. Biotechnol. 9, 624-631, 1998.

14. Hughes T.R. Yeast and drug discovery. Funct. Integr. Genomics 2, 199-211, 2002.14. Hughes T.R. Yeast and drug discovery. Funct. Integr. Genomics 2, 199-211, 2002.

15. Botstein D., Chervitz S.A., and Cherry J.M. Yeast as a model organism. Science 277, 1259-1260, 1997.15. Botstein D., Chervitz S.A., and Cherry J.M. Yeast as a model organism. Science 277, 1259-1260, 1997.

16. Munder Т., and Hinnen A. Yeast cells as tools for target-oriented screening. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 311-320, 1999.16. Munder T., and Hinnen A. Yeast cells as tools for target-oriented screening. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 311-320, 1999.

17. Brenner C. A cultivated taste for yeast. Genome Biol.1, reviews 103.1-103.4, 2000.17. Brenner C. A cultivated taste for yeast. Genome Biol. 1, reviews 103.1-103.4, 2000.

18. Superti-Furga G., Jonsson K., Courtneidge S.A. A functional screen for regulators and antagonizers of heterologous protein tyrosine kinases. Nat. Biotechnol. 14, 600-605, 1996.18. Superti-Furga G., Jonsson K., Courtneidge S.A. A functional screen for regulators and antagonizers of heterologous protein tyrosine kinases. Nat. Biotechnol. 14, 600-605, 1996.

19. Florio M., Wilson L.K., Trager J.B., Thomer J., Martin G.S. Aberrant protein phosphorylation at tyrosine in responsible for the growth-inhibitory action of pp60v-src expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 5, 283-296, 1994.19. Florio M., Wilson L.K., Trager J.B., Thomer J., Martin G.S. Aberrant protein phosphorylation at tyrosine in responsible for the growth-inhibitory action of pp60v-src expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 5, 283-296, 1994.

Claims

1. Способ идентификации и/или проверки ингибиторов активности рецепторной тирозинкиназы, включающий стадии:
a) получения дрожжевых клеток, содержащих, по меньшей мере, один экспрессионный вектор, включающий находящуюся под контролем индуцибельного промотора последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок, который, по существу, состоит из полной цитоплазматической части исследуемой рецепторной тирозинкиназы или ее функционального фрагмента и домена димеризации или его функционального фрагмента и при необходимости дополнительно включает последовательность, приводящую к заякориванию слитого белка в мембране, где экспрессия слитого белка приводит к прекращению пролиферации клеток-хозяев;
b) контактирования данных клеток-хозяев с соединением-кандидатом;
c) идентификации ингибиторов активности данной тирозинкиназы при культивировании данных клеток-хозяев в соответствующих условиях, исходя из того, что ингибирование активности тирозинкиназы соединением-кандидатом ведет к восстановлению пролиферации клеток.1. A method for identifying and / or checking inhibitors of receptor tyrosine kinase activity, comprising the steps of:
a) producing yeast cells containing at least one expression vector comprising an inducible promoter-controlled nucleic acid sequence encoding a fusion protein, which essentially consists of the complete cytoplasmic portion of the test receptor tyrosine kinase or its functional fragment and a dimerization domain or its functional fragment and, if necessary, additionally includes a sequence leading to anchoring of the fusion protein in the membrane, where the expression a fusion protein ceases the proliferation of host cells;
b) contacting these host cells with a candidate compound;
c) the identification of inhibitors of the activity of this tyrosine kinase during cultivation of these host cells under appropriate conditions, on the basis that the inhibition of tyrosine kinase activity by the candidate compound leads to the restoration of cell proliferation.

2. Способ по п.1, в котором последовательность нуклеиновой кислоты кодирует слитый белок, содержащий полную цитоплазматическую часть данной рецепторной тирозинкиназы.2. The method according to claim 1, in which the nucleic acid sequence encodes a fusion protein containing the complete cytoplasmic portion of this receptor tyrosine kinase.

3. Способ по п.1, в котором домен димеризации выбран из лейциновой застежки c-Fos, лейциновой застежки c-Jun и лейциновой застежки Gcn4.3. The method according to claim 1, wherein the dimerization domain is selected from a c-Fos leucine fastener, a c-Jun leucine fastener, and a Gcn4 leucine fastener.

4. Способ по п.1, в котором клетки содержат два слитых белка, причем первый слитый белок включает лейциновую застежку c-Fos, а второй слитый белок включает лейциновую застежку c-Jun.4. The method according to claim 1, wherein the cells contain two fusion proteins, the first fusion protein comprising a c-Fos leucine fastener and the second fusion protein comprising a c-Jun leucine fastener.

5. Способ по п.1, в котором слитый белок дополнительно включает последовательность, вызывающую заякоривание пептида в мембране, в частности, сигнал миристоилирования для заякоривания в мембране.5. The method according to claim 1, in which the fusion protein further includes a sequence that causes anchoring of the peptide in the membrane, in particular, a myristoylation signal for anchoring in the membrane.

6. Способ по п.1, в котором рецепторная тирозинкиназа выбрана из группы, состоящей из EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, INSR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSF-1R, KIT/SCFR, FLK2/FLT3, VEGRF 1-3, FGFR 1-4, CCK4, TRKA, TRKB, TRKC, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE, ТЕК, RYK, DDR1, DDR2, RET, ROS, LTK, ALK, ROR1, ROR2, MUSK, AATYK, AATYK2, AATYK3, RTK106.6. The method according to claim 1, in which the receptor tyrosine kinase is selected from the group consisting of EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, INSR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSF-1R, KIT / SCFR, FLK2 / FLT3, VEGRF 1-3, FGFR 1-4, CCK4, TRKA, TRKB, TRKC, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE, TEK, RYK, DDR1, DDR2, RET, ROS, LTK, ALK, ROR1, ROR2, MUSK, AATYK, AATYK2, AATYK3, RTK106.

7. Способ по п.6, в котором рецепторная тирозинкиназа выбрана из INSR, IGF-1R, PDGFRα, PDGFRβ, KIT/SCFR, FGFR-1, TRKA, MET, RON, EPHB2, EPHB4, AXL, ТЕК, RET, ROS.7. The method according to claim 6, in which the receptor tyrosine kinase is selected from INSR, IGF-1R, PDGFRα, PDGFRβ, KIT / SCFR, FGFR-1, TRKA, MET, RON, EPHB2, EPHB4, AXL, TEK, RET, ROS.

8. Способ по п.6, в котором рецепторная тирозинкиназа происходит из человека.8. The method according to claim 6, in which the receptor tyrosine kinase comes from a person.

9. Способ по п.1, в котором вектор включает индуцибельный промотор, индуцируемый галактозой.9. The method according to claim 1, in which the vector includes an inducible promoter induced by galactose.

10. Способ по п.1, в котором клетки представляют собой клетки S.cerevisiae, более предпочтительно клетки S.cerevisiae, несущие мутацию в гене ABC переносчика.10. The method according to claim 1, in which the cells are S. cerevisiae cells, more preferably S. cerevisiae cells carrying a mutation in the ABC gene of the carrier.

11. Дрожжевой экспрессионный вектор, включающий находящуюся под контролем индуцибельного промотора последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок, который, по существу, состоит из полной цитоплазматической части исследуемой рецепторной тирозинкиназы или ее функционального фрагмента и домена димеризации или его функционального фрагмента и при необходимости включает последовательность, приводящую к заякориванию слитого белка в мембране.11. Yeast expression vector comprising an inducible promoter-controlled nucleic acid sequence encoding a fusion protein, which essentially consists of the complete cytoplasmic portion of the studied receptor tyrosine kinase or its functional fragment and the dimerization domain or its functional fragment and, if necessary, includes the sequence leading to anchoring of the fused protein in the membrane.

12. Дрожжевой экспрессионный вектор по п.11, в котором домен димеризации выбран из лейциновой застежки c-Jim, лейциновой застежки c-Fos и лейциновой застежки Gcn4.12. The yeast expression vector of claim 11, wherein the dimerization domain is selected from a c-Jim leucine fastener, a c-Fos leucine fastener, and a Gcn4 leucine fastener.

13. Дрожжевая клетка для идентификации и/или проверки ингибиторов активности рецепторной тирозинкиназы, содержащая дрожжевой экспрессионный вектор по любому из пп.11-12, в которой экспрессия указанного слитого белка приводит к остановке пролиферации. 13. A yeast cell for identifying and / or checking inhibitors of receptor tyrosine kinase activity, comprising the yeast expression vector according to any one of claims 11-12, wherein the expression of said fusion protein stops proliferation.