RU2350656C2 - Method of determination of foodstuff contamination with pathogenic biological agents in extreme situations - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine; microbiology.

SUBSTANCE: invention concerns area of medical microbiology and can be used at carrying out of the laboratory control of the foodstuffs on contamination pathogenic biological agents in the conditions of extreme situations. In the invention the new technological scheme of carrying out of the laboratory control of the foodstuffs where preparation of assays spend to two stages is offered: the first stage - sample preparation - depending on density, fat content and fluidity of a product it is exposed, accordingly: to weighing, allocating 25 g (ml) of a product with the subsequent crushing, to transfer in a liquid phase in volume of 50-100 ml by means of normal saline solution addition, and at water research in number of 500 ml filter last through membranous filters; the second stage provides division of assay into parts: on 2 ml of assays separate for researches by methods of fluorescent antibodies (MFA), in the reaction of an indirect hemagglutination (RIHA), in reaction of a sintering of volume (RSV), enzyme immunoassay (EIA), polimerase chain reaction (PCR) and a bacteriological method and on 5 ml of assays take for research by a biological method, infecting biotrial animals. Research of assays by the express or accelerated methods (MFA, RIHA, RSV, EIA, PCR) spend within 4-10 hours, and research by a biological method - within 48-120 hours with use of selective nutrient mediums, such as the ADET-agar diagnostic elective tularemic, ADEA-agar diagnostic elective anthracic, EEDC-environment elective diagnostic choleraic, PYM-37 plague yeast medium.

EFFECT: unification of carrying out of the laboratory analysis of the foodstuff; parallel research of 25 assays, which preparation takes 1,5-2 hours.

6 cl, 10 tbl

Description

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано при проведении лабораторного контроля продовольствия на зараженность патогенными биологическими агентами в условиях чрезвычайных ситуаций.The present invention relates to the field of medical microbiology and can be used in laboratory food control for contamination with pathogenic biological agents in emergency situations.

Совершенствование системы и методов мониторинга и прогнозирования чрезвычайных ситуаций является в настоящее время актуальной задачей для специалистов различных служб и ведомств, занимающихся организацией и проведением специфической индикации (СИ) патогенных биологических агентов и лабораторного контроля продовольствия (ЛКП) на зараженность ими. Использование патогенных биологических агентов (ПБА) для целей биотерроризма может создать чрезвычайную ситуацию, поэтому повышение уровня готовности специалистов к ликвидации последствий использования ПБА приобретает в настоящее время особую значимость.Improving the system and methods for monitoring and forecasting emergencies is currently an urgent task for specialists of various services and departments involved in organizing and conducting specific indications (SI) of pathogenic biological agents and laboratory food control (LCP) for their infection. The use of pathogenic biological agents (PBA) for the purposes of bioterrorism can create an emergency, therefore increasing the level of preparedness of specialists to eliminate the consequences of the use of PBA is currently gaining special significance.

Известен способ специфической индикации бактерий, риккетсий, хламидий, вирусов, грибов и токсинов (см. «Руководство по индикации и идентификации бактериальных (биологических) средств», М.: Военное издательство, 1989 г., стр.24-30), включающий лабораторные методы микробиологического экспресс-анализа, предусматривающие два взаимодополняющих этапа исследования:A known method for the specific indication of bacteria, rickettsia, chlamydia, viruses, fungi and toxins (see "Guide to the indication and identification of bacterial (biological) agents", M .: Military Publishing House, 1989, pp. 24-30), including laboratory methods of microbiological rapid analysis, providing for two complementary stages of the study:

- непосредственный анализ нативных материалов проб посредством экспресс-методов;- direct analysis of native sample materials through express methods;

- исследование этими же методами материалов тех же проб после их предварительного биологического обогащения.- research by the same methods of materials of the same samples after their preliminary biological enrichment.

Однако известный способ предназначен для исследования объектов внешней среды, материала от больных людей и сельскохозяйственных животных, а также диких грызунов и насекомых - переносчиков заболеваний, но не учитывает специфику контроля продуктов питания.However, the known method is intended for the study of environmental objects, material from sick people and farm animals, as well as wild rodents and insects - carriers of diseases, but does not take into account the specifics of food control.

Известны способы лабораторных исследований продовольствия (см. «Инструкцию по лабораторному контролю продовольствия на зараженность возбудителями опасных инфекционных заболеваний и токсинами», М.: Военное издательство, 1983 г., стр.6-12), заключающиеся в том, что из каждой доставленной пробы делают три навески по 25 г (мл) и проводят с ними следующие технологические приемы:Known methods of laboratory research of food (see "Instructions for laboratory control of food for infection with pathogens of dangerous infectious diseases and toxins", M .: Military Publishing House, 1983, p.6-12), consisting in the fact that from each delivered sample make three weights of 25 g (ml) and carry out the following technological methods with them:

- первую предназначают для посева на элективные среды, вторую - для заражения лабораторных животных при исследовании на бактериальные и риккетсиозные возбудители, третью - для исследования экспрессными методами, при этом четвертая и пятая навески по 100 г (мл) предназначаются для вирусологических исследований и для обнаружения токсинов.- the first is intended for inoculation on elective media, the second - for infection of laboratory animals when tested for bacterial and rickettsial pathogens, the third - for research by express methods, while the fourth and fifth weighed 100 g (ml) are used for virological studies and to detect toxins .

Недостатком известного способа является громоздкость технологии исследования пищевых продуктов на всех этапах экспертизы, а длительность их проведения снижает в целом его эффективность, что важно при исследовании ряда возбудителей инфекционных заболеваний, а именно: чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, сальмонеллеза, патогенной кишечной палочки, которые в настоящее время рассматриваются как возможные агенты для целей биотерроризма.The disadvantage of this method is the cumbersome technology of food research at all stages of the examination, and the duration of their implementation reduces its overall effectiveness, which is important in the study of a number of pathogens of infectious diseases, namely: plague, cholera, anthrax, tularemia, salmonellosis, pathogenic Escherichia coli which are currently considered as potential agents for bioterrorism.

Кроме того, в известном способе включены приемы исследований, которые малочувствительны и неэффективны, например:In addition, in the known method included research methods that are insensitive and ineffective, for example:

- нагрев и расплавление жиров до 40°С затрудняет исследование жиров классическими и экспрессными методами, снижая чувствительность и специфичность;- heating and melting of fats to 40 ° C makes it difficult to study fats by classical and express methods, reducing sensitivity and specificity;

- использование формалина для инактивации проб, исследуемых МФА, резко снижает специфичность свечения, причем необходимость в его использовании может быть полностью исключена, т.к. обеззараживание достигается путем фиксации мазков ацетоном или спиртом;- the use of formalin for inactivation of samples studied by MFA sharply reduces the specificity of the glow, and the need for its use can be completely eliminated, because disinfection is achieved by fixing smears with acetone or alcohol;

- прогревание проб до 56° в течение 30 минут при постановке серологических реакций используют при исследовании сывороток людей и животных для разрушения комплимента, что неэффективно для инактивации ПБА;- heating of samples to 56 ° for 30 minutes when setting up serological reactions is used in the study of human and animal sera to break the compliment, which is ineffective for inactivation of PBA;

- низкоэффективен в плане чувствительности встречный иммуноэлектрофорез.- counter immunoelectrophoresis is ineffective in terms of sensitivity.

Эти обстоятельства указывают на актуальность создания нового, современного способа лабораторного контроля продовольствия, который бы удовлетворял требованиям оперативности, четкости и результативности проводимых анализов, предъявляемых специалистами лабораторной службы, занимающихся вопросами индикации и идентификации ПБА в условиях ЧС.These circumstances indicate the relevance of creating a new, modern way of laboratory food control, which would satisfy the requirements for the efficiency, clarity and effectiveness of the tests performed by laboratory service specialists involved in the indication and identification of PBA in emergency situations.

Задача предлагаемого изобретения состояла в повышении эффективности и совершенствовании существующих методов лабораторного контроля продовольствии с целью их унификации и приближения к специфической индикации патогенных биологических агентов.The objective of the invention was to increase the efficiency and improve the existing methods of laboratory control of food in order to unify them and approximate the specific indication of pathogenic biological agents.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе определения зараженности продовольствия патогенными биологическими агентами в условиях чрезвычайных ситуаций, включающем подготовку проб и их лабораторное исследование, подготовку проб проводят в два этапа, на первом, в зависимости от плотности, жиросодержания и текучести продукта, его подвергают соответственно: взвешиванию, выделяя 25 г (мл) продукта с последующим измельчением, и переводу в жидкую фазу в объеме 50-100 мл посредством добавления физиологического раствора, а при исследовании воды последнюю в количестве 500 мл фильтруют через мембранные фильтры; второй этап включает разделение жидкой фазы пробы на 5 частей: первые три части (по 2 мл) используют для проведения экспрессных и ускоренных методов анализа - МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР, четвертую часть пробы (также 2 мл) высевают на питательные среды для проведения бактериологического анализа, а 5 часть (5 мл) - для заражения лабораторных животных, причем проведение этапов на 25 пробах осуществляют параллельно в течение 1,5-2 часов, исследование проб экспрессными методами - в течение 4-10 часов, а биологическим путем - в течение 48-120 часов, при этом зараженность продуктов подтверждают при высокой обсемененности (≥1·10⁶ м.к. в 1 мл или 1 г) на стадии исследований нативного материала, в случае низкой обсемененности (≤1·10⁴ м.к. в 1 мл или 1 г) - положительный результат фиксируют в ПЦР и ИФА и после биологического накопления патогенных биологических агентов в посевах и органах ослабленных биопробных животных - в ПЦР, ИФА, МФА, РНГА или РАО.The problem is achieved in that in the known method for determining food contamination with pathogenic biological agents in emergency situations, including sample preparation and laboratory testing, sample preparation is carried out in two stages, at the first, depending on the density, fat content and fluidity of the product, it is subjected respectively: weighing, isolating 25 g (ml) of the product, followed by grinding, and transferring it to the liquid phase in a volume of 50-100 ml by adding physiological saline, and when and follow the last water in an amount of 500 ml was filtered through a membrane filter; the second stage involves the separation of the liquid phase of the sample into 5 parts: the first three parts (2 ml each) are used for rapid and accelerated analysis methods - MFA, RNGA, RAO, ELISA, PCR, the fourth part of the sample (also 2 ml) is sown on nutrient media for bacteriological analysis, and 5 part (5 ml) - for infection of laboratory animals, and the steps in 25 samples are carried out in parallel for 1.5-2 hours, the study of samples by express methods for 4-10 hours, and biological way - within 48-120 hours, while infected the products are confirmed at high seed rate (≥1 · 10 ⁶ mk in 1 ml or 1 g) at the stage of research of native material, in case of low seedliness (≤1 · 10 ⁴ mk in 1 ml or 1 g) - a positive result is recorded in PCR and ELISA, and after the biological accumulation of pathogenic biological agents in the crops and organs of weakened test animals, in PCR, ELISA, MFA, RNGA or RAO.

При этом МФА проводят в следующей последовательности: первоначально пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут, осаждая микробные клетки, затем к осадку добавляют 0,1 мл физиологического раствора и готовят мазки, причем при анализе жиров на мазки перед фиксацией наносят для обезжиривания эфир на 1-2 минуты, в последующем мазки подвергают фиксации в спирте или ацетоне с дальнейшей обработкой люминесцирующей сывороткой и просмотром в люминесцентном микроскопе.In this case, MFAs are carried out in the following sequence: initially, the samples are centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, precipitating microbial cells, then 0.1 ml of physiological saline is added to the sediment and smears are prepared, and when analyzing fats, smears are applied for degreasing before fixing ether for 1-2 minutes, then smears are subjected to fixation in alcohol or acetone, followed by treatment with luminescent serum and viewing in a luminescent microscope.

При проведении РАО используют полимерные иммуноглобулиновые диагностические препараты, которые вводят по 25 мкл в опытную лунку, содержащую 50 мкл исследуемого материала, и в контрольную лунку, в которую наливают 25 мкл исследуемого материала и 25 мкл специфической сыворотки в разведении 1:10, при этом учет реакции проводят через 2-3 часа по характеру цветового агломерата.When conducting RAO, polymer immunoglobulin diagnostic preparations are used, which are injected 25 μl into an experimental well containing 50 μl of the test material, and into the control well, into which 25 μl of the test material and 25 μl of specific serum are diluted 1:10, reactions are carried out after 2-3 hours according to the nature of the color agglomerate.

Для проведения ПЦР выделяют ДНК микроорганизмов из проб пищевых продуктов, применяя в зависимости от сложности их состава гуанидинтиоцианатный метод или фенольную экстракцию, а затем проводят постановку ПЦР, используя 1-5 мкл раствора, содержащего ДНК, с последующим учетом ее реакции, обеспечивающей чувствительность 2·10³ м.к./мл.For PCR, the DNA of microorganisms is isolated from samples of food products, using the guanidine thiocyanate method or phenolic extraction, depending on the complexity of their composition, and then PCR is carried out using 1-5 μl of a solution containing DNA, followed by its reaction, providing sensitivity 2 · 10 ³ m.k. / ml.

Биологическое исследование на присутствие микроорганизмов проводят в два этапа, первоначально осуществляют посев по 0,2 мл материала на 1-2 чашки селективной питательной среды, проводят инкубацию при 28 и 37°С и после появления колоний осуществляют исследование посредством экспрессных и ускоренных методов (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР), второй этап заключается в том, что четырем исследуемым животным предварительно (за 2-4 часа до заражения) подкожно вводят гидрокортизон в объеме 5 мг, а исследуемый материал - по 1 мл внутрибрюшинно, в случае использования других иммунодепрессантов (желток, циклофосфан, муцин) их вводят вместе с исследуемым материалом внутрибрюшинно в количестве 0,5 мл иммунодепрессанта и 0,5 мл пробы; через 24 часа двух мышей вскрывают, делают посевы на питательные среды, мазки-отпечатки для МФА, а материал из органов животных исследуют в ПЦР, РНГА, РАО или ИФА, причем двух оставшихся животных подвергают вскрытию через 48 часов и исследуют по вышеприведенной технологии.Biological testing for the presence of microorganisms is carried out in two stages, initially 0.2 ml of material is sown in 1-2 cups of selective nutrient medium, incubated at 28 and 37 ° C and, after colonies appear, they are tested using rapid and accelerated methods (MPA, RNGA, RAO, ELISA, PCR), the second stage consists in the fact that the four test animals are previously (2-4 hours before infection) subcutaneously injected with hydrocortisone in a volume of 5 mg, and the test material - 1 ml intraperitoneally, if used studies of other immunosuppressants (yolk, cyclophosphamide, mucin) are administered intraperitoneally with the test material in an amount of 0.5 ml of immunosuppressant and 0.5 ml of sample; after 24 hours, two mice are opened, inoculated on culture media, smears for fingerprints, and the material from the organs of animals is examined in PCR, RNGA, RAO or ELISA, the two remaining animals are opened after 48 hours and examined using the above technology.

Кроме того, в качестве селективных питательных сред используют: АДЭТ-агар диагностический элективный туляремийный, АДЭСБ-агар диагностический элективный сибиреязвенный, СЭДХ-среду элективную диагностическую холерную, ЧДС-37 чумную дрожжевую среду.In addition, the following are used as selective nutrient media: ADET-agar diagnostic elective tularemia, ADESB-agar diagnostic elective anthrax, SEDC-elective diagnostic cholera, ChDS-37 plague yeast medium.

Предлагаемый способ (см. таблицу 1) осуществляют по следующим этапам:The proposed method (see table 1) is carried out in the following steps:

I этап - подготовительныйStage I - preparatory

1. Готовят одну навеску пробы пищевого продукта, причем в зависимости от его плотности, жиросодержания, текучести - проводят:1. Prepare one sample of the food product, and depending on its density, fat content, fluidity - spend:

а) взвешивание по 25 г (мл) продукта с последующим измельчением;a) weighing 25 g (ml) of the product, followed by grinding;

б) перевод пробы в жидкую фазу в объеме 50-100 мл посредством добавления физиологического раствора;b) transferring the sample to the liquid phase in a volume of 50-100 ml by adding physiological saline;

в) фильтрование воды в количестве не менее 500 мл через мембранные фильтры.c) filtering water in an amount of at least 500 ml through membrane filters.

2. Деление проб на части:2. The division of samples into parts:

а) по 2 мл для исследования:a) 2 ml for research:

- МФА;- MFA;

- РНГА (РАО) или ИФА;- RNGA (RAO) or ELISA;

- ПЦР;- PCR;

- бактериологическим методом (посев на питательные среды);- the bacteriological method (culture on culture media);

б) 5 мл для исследования:b) 5 ml for research:

- биологическим методом (заражение биопробных животных).- biological method (infection of bioassay animals).

Подготовительный этап на 25 пробах осуществляют в течение 1,5-2 часов.The preparatory stage for 25 samples is carried out within 1.5-2 hours.

При наличии в надосадочной жидкости частиц продукта пробу предварительно центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут. Исследуют надосадочную часть пробы.If there are particles of the product in the supernatant, the sample is pre-centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. Examine the supernatant of the sample.

II этап - исследовательскийII stage - research

1. Пробы исследуют ускоренными и экспрессными методами в течение 4-10 часов, используя высокоспецифичные и чувствительные методы для экспресс-диагностики продовольствия на наличие патогенных биологических агентов (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР):1. Samples are examined by accelerated and rapid methods for 4-10 hours, using highly specific and sensitive methods for the rapid diagnosis of food for the presence of pathogenic biological agents (MFA, RNGA, RAO, ELISA, PCR):

а) исследование методом флюоресцирующих антител (МФА) проводят в следующей последовательности:a) a study by the method of fluorescent antibodies (MFA) is carried out in the following sequence:

Во-первых, пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут для осаждения микробных клеток, затем к осадку добавляют 0,1 мл физиологического раствора и готовят мазки для МФА.Firstly, the samples are centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes to precipitate microbial cells, then 0.1 ml of physiological saline is added to the precipitate and MFA swabs are prepared.

При исследовании жиров и жиросодержащих продуктов методом флюоресцирующих антител проводят обезжиривание приготовленных мазков эфиром в течение нескольких минут перед их фиксацией в ацетоне или спирте, что на 2-3 порядка повышает чувствительность МФА. Мазки обрабатывают люминесцирующими сыворотками и просматривают в люминесцентном микроскопе. Чувствительность метода 1·10⁴-1·10⁵ м.к./мл;In the study of fats and fat-containing products by the method of fluorescent antibodies, the prepared smears are degreased with ether for several minutes before being fixed in acetone or alcohol, which increases the sensitivity of MFA by 2–3 orders of magnitude. Smears are treated with luminescent serums and viewed under a luminescent microscope. The sensitivity of the method 1 · 10 ⁴ -1 · 10 ⁵ MK / ml;

б) исследование с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) заключается в том, что в подготовленную пробу добавляют формалин до концентрации 4%, контакт длится 1 час, рН доводят до 7,0. Реакцию ставят в 2 лунках как при специфической индикации: 1 - опытная, 2 - контрольная (торможение), через 2-3 часа учитывают реакцию. Чувствительность метода 1·10⁵-1·10⁷ м.к./мл;b) a study using the reaction of indirect hemagglutination (RIGA) is that formalin is added to the prepared sample to a concentration of 4%, the contact lasts 1 hour, the pH is adjusted to 7.0. The reaction is put in 2 holes as with a specific indication: 1 - experimental, 2 - control (inhibition), after 2-3 hours, the reaction is taken into account. The sensitivity of the method 1 · 10 ⁵ -1 · 10 ⁷ MK / ml;

в) исследование посредством реакции агломерации объемной (РАО) осуществляют посредством полимерных иммуноглобулиновых диагностических препаратов, где в качестве носителя используют не эритроциты, а полимеры. Чувствительность метода 1·10⁵-1·10⁷ м.к./мл. Ростовским НИПЧИ раз работаны диагностикумы для обнаружения возбудителя чумы (РП №978-00 от 20.06.2000 г., регистрационный №94/90/3) и туляремийного микроба (РП №979-00 от 20.06.2000 г., регистрационный №94/90/2).c) the study through the reaction of agglomeration of volumetric (RAO) is carried out by means of polymer immunoglobulin diagnostic preparations, where polymers are used as carriers, not red blood cells. The sensitivity of the method is 1 · 10 ⁵ -1 · 10 ⁷ m.k. / ml. Rostov NIPCH once developed diagnosticums for the detection of the plague pathogen (RP No. 978-00 of 06/20/2000, registration No. 94/90/3) and tularemia microbe (RP No. 979-00 of June 20, 2000, registration No. 94 / 90/2).

Методика постановки РАО для всех продуктов питания одинакова и проводится в следующей последовательности: подготовленную пробу в соответствии с технологией по I этапу (см. таблицу 1) обрабатывают формалином до концентрации 4%, контакт 1 час, доводят рН до 7,0, после этого ставят реакцию в 2 лунках. В первую лунку (опытную) наливают 50 мкл исследуемого материала, а во вторую лунку (контрольную) - по 25 мкл исследуемого материала и специфической сыворотки в разведении 1:10, длительность контакта 10-15 минут. Затем через 15 минут в обе лунки вводят диагностический препарат в объеме 25 мкл. Учет реакции предварительный ведут через 2- 3 часа, а окончательный через сутки.The procedure for setting RW for all food products is the same and is carried out in the following sequence: the prepared sample in accordance with the technology of stage I (see table 1) is treated with formalin to a concentration of 4%, contact is 1 hour, the pH is adjusted to 7.0, then put reaction in 2 wells. 50 μl of the test material is poured into the first well (test), and 25 μl of the test material and specific serum at a dilution of 1:10 are added to the second well (control), the contact duration is 10-15 minutes. Then after 15 minutes, a diagnostic drug in a volume of 25 μl was injected into both wells. The preliminary reaction is taken into account after 2–3 hours, and the final one in a day.

За положительный результат принимают цветной ярко-розовый агломерат, выстилающий все дно лунки равномерно. При отрицательном результате в опыте и контроле образуется компактное «колечко» или «точка» в центре лунки.For a positive result, take a color bright pink agglomerate, lining the entire bottom of the hole evenly. With a negative result, a compact “ring” or “point” is formed in the center of the hole in the experiment and control.

г) исследование проб посредством иммуноферментного анализа (ИФА) проводят в соответствии с общепринятыми методами. Чувствительность метода 1·10³-1·10⁴ м.к./мл.g) the study of samples through enzyme immunoassay (ELISA) is carried out in accordance with generally accepted methods. The sensitivity of the method is 1 · 10 ³ -1 · 10 ⁴ m.k. / ml.

Для обеззараживания проб их кипятят в течение 10-15 минут, а постановку реакции осуществляют в 2 лунках (опытной и контрольной) и через 2-3 часа учитывают реакцию.To disinfect samples, they are boiled for 10-15 minutes, and the reaction is carried out in 2 wells (experimental and control) and after 2-3 hours the reaction is taken into account.

д) исследование патогенных микроорганизмов с помощью ПЦР осуществляют в соответствии с разработанной технологией (см. таблицу 1). Чувствительность метода 1·10¹-1·10³ м.к./мл.d) the study of pathogenic microorganisms using PCR is carried out in accordance with the developed technology (see table 1). The sensitivity of the method 1 · 10 ¹ -1 · 10 ³ MK./ml

Для проведения реакции из 2 мл проб пищевых продуктов выделяют ДНК микроорганизмов. Пробы твердых продуктов и пробы, представленные смывами, подвергают обработке гуанидинтиоцианатным методом, который обеспечивает чувствительность 2·10³ м.к./мл.For the reaction, DNA of microorganisms is isolated from 2 ml of food samples. Samples of solid products and samples, represented by swabs, are subjected to treatment with the guanidine thiocyanate method, which provides a sensitivity of 2 · 10 ³ m.k. / ml.

Пробы, содержащие большое количество белка, такие как простое и сквашенное молоко, подвергают фенольной экстракции, обеспечивая высокую чувствительность и воспроизводимость результатов. Затем проводят постановку полимеразной цепной реакции, используя от 1 до 5 мкл раствора, содержащего ДНК, с последующим учетом результатов реакции. На получение положительного результата влияет состав пищевых продуктов, некоторые компоненты которых могут ингибировать течение реакции, поэтому подбор метода выделения ДНК, устранение интерферирующих веществ и ингибиторов являются основными моментами при проведении ПЦР.Samples containing large amounts of protein, such as plain and fermented milk, are subjected to phenolic extraction, providing high sensitivity and reproducibility of the results. Then a polymerase chain reaction is carried out using from 1 to 5 μl of a solution containing DNA, followed by the results of the reaction. A positive result is affected by the composition of food products, some components of which can inhibit the course of the reaction, therefore, the selection of the method for DNA isolation, elimination of interfering substances and inhibitors are the main points during PCR.

Экспрессные и ускоренные методы проводят в течение 4-10 часов.Express and expedited methods are carried out within 4-10 hours.

2. Исследование проб биологическим методом:2. Research of samples by a biological method:

а) путем посева на питательные среды. Для этого производят посев по 0,2 мл исследуемого материала на одну чашку питательной селективной среды (в случае исследования на возбудителя чумы посев делают на две чашки), выращивают в термостате при 37°С, для Y.pestis - инкубация при 28 и 37°С. При появлении характерных для каждого вида микроорганизмов колоний проводят их исследование посредством экспрессных и ускоренных методов (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР), отсевают колонии для получения чистых культур с последующей идентификацией до вида.a) by seeding on nutrient media. For this, 0.2 ml of test material is inoculated per cup of selective nutrient medium (in the case of a plague pathogen test, two cups are sown), grown in an incubator at 37 ° C, for Y. pestis, incubation at 28 and 37 ° FROM. When colonies characteristic of each type of microorganism appear, they are examined using express and accelerated methods (MPA, RNGA, RAO, ELISA, PCR), colonies are screened out to obtain pure cultures with subsequent identification to the species.

Причем для выделения патогенных биологических агентов из пищевого сырья, продуктов и воды впервые были использованы питательные селективные среды, зарегистрированные в госреестре:Moreover, for the isolation of pathogenic biological agents from food raw materials, products and water, nutrient selective media registered in the state registry were used for the first time:

агар диагностический элективный туляремийный - АДЭТ (№93/270/11, 2001 г.)diagnostic elective tularemia agar - ADET (No. 93/270/11, 2001)

агар диагностический элективный сибиреязвенный - АДЭСБ (№93/270/13, 2001 г.)diagnostic elective anthrax diagnostic agar - ADESB (No. 93/270/13, 2001)

среда элективная диагностическая холерная - СЭДХ (№93/270/17, 2001 г.).Elective diagnostic cholera medium - SEDH (No. 93/270/17, 2001).

Выделение бруцелл из пищевых продуктов осуществляют на эритрит-агаре с генцианвиолетом в разведении 1:500000 и полимиксином в концентрации 0,02 г/л, чумного микроба - на эритрит-агаре с генцианвиолетом в разведении 1:200000 и 0,02 г/л полимиксина. На эритрит-агаре чумной микроб одинаково хорошо вырастает как при 28°С, так и при 37°С. Среда обеспечивает продукцию фракции 1 (Ф1) чумным микробом, которая выявляется табельными индикационными методами.Isolation of brucella from food products is carried out on erythritol agar with a gentian violet at a dilution of 1: 500000 and polymyxin at a concentration of 0.02 g / l, plague microbe on erythritol agar with a gentian violet at a dilution of 1: 200000 and 0.02 g / l of polymyxin . On erythritol agar, the plague microbe grows equally well both at 28 ° C and at 37 ° C. The environment provides the production of fraction 1 (F1) with a plague microbe, which is detected by time-based indicator methods.

При проведении лабораторного контроля продовольствия на энтеробактерии используют висмут-сульфитный агар, среды Эндо и Плоскирева.When conducting laboratory food control on enterobacteria, bismuth-sulfite agar, Endo and Ploskirev media are used.

В предлагаемых средах использованы новые антибиотики, не вызывающие резистентность в сравнении с ранее использованными.In the proposed environments used new antibiotics that do not cause resistance in comparison with previously used.

б) путем заражения биопробных животных.b) by infection of bioassay animals.

Для снижения естественной резистентности лабораторных животных чаще используется гидрокортизон ацетат. Гидрокортизон вводят четырем белым мышам за 2-4 часа до заражения в количестве 5 мг под кожу бедра. Подготовленный образец продуктов инъецируют мышам внутрибрюшинно в объеме 1 мл. При отсутствии гидрокортизона используют другие иммунодепрессанты (суспензию желтка, 4 мг/мышь циклофосфана, 5% муцин). Их вводят вместе с исследуемым материалом внутрибрюшинно (0,5 мл иммуно-депрессанта и 0,5 мл пробы).To reduce the natural resistance of laboratory animals, hydrocortisone acetate is often used. Hydrocortisone is administered to four white mice 2-4 hours before infection in an amount of 5 mg under the skin of the thigh. The prepared product sample is injected intraperitoneally to mice in a volume of 1 ml. In the absence of hydrocortisone, other immunosuppressants are used (yolk suspension, 4 mg / mouse cyclophosphamide, 5% mucin). They are administered along with the test material intraperitoneally (0.5 ml of immunosuppressant and 0.5 ml of sample).

Вскрывают животных по аналогии со схемой специфической индикации в два срока (по две белых мыши через 24 и 48 часов). При вскрытии лабораторных животных из всех органов делают посевы, мазки-отпечатки на стеклах для обработки флуоресцирующими сыворотками. Ткани органов используют для постановки РНГА, РАО, ИФА, ПЦР. После выделения чистых культур от биопробных животных их идентифицируют с помощью классических и экспрессных методов.Animals are opened by analogy with the specific indication scheme in two periods (two white mice after 24 and 48 hours). When opening laboratory animals from all organs make crops, smears, fingerprints on glasses for processing fluorescent serums. Organ tissues are used for staging RNGA, RAO, ELISA, PCR. After isolation of pure cultures from biological samples, they are identified using classical and express methods.

В зависимости от вида ПБА все исследование по схеме ЛКП проводится в течение 48-120 часов (см. таблицу 1).Depending on the type of PBA, the entire study according to the LCP scheme is carried out within 48-120 hours (see table 1).

Пример 1. Обнаружение (индикация) чумного микроба в пищевых продуктах с помощью предлагаемого способа.Example 1. Detection (indication) of the plague microbe in food using the proposed method.

В примере приведен ход исследования колбасы, пшена, сливочного и растительного масел, сыра, хлеба пшеничного и ржаного, сахара, молока пресного и простокваши, воды на зараженность их чумным микробом по схеме лабораторного контроля продовольствия (см. таблицу 1).The example shows the study of sausages, millet, butter and vegetable oils, cheese, wheat and rye bread, sugar, fresh milk and yogurt, water for infection with their plague microbe according to the laboratory food control scheme (see table 1).

Индикация Y.pestis в пищевых продуктах осуществляется в соответствии с предлагаемыми в таблице 1 этапами.Indication of Y. pestis in food products is carried out in accordance with the stages proposed in Table 1.

I этап - подготовка проб к исследованиюStage I - preparation of samples for research

На I этапе проводится специальная подготовка продуктов к исследованию и деление их на части для последующего проведения индикации:At stage I, special preparation of the products for research is carried out and their division into parts for the subsequent indication:

а) колбасаa) sausage

Продукт в количестве 25 г измельчают, затем добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость.The product in an amount of 25 g is ground, then 50 ml of physiological saline are added. The suspension is shaken for 5 minutes and then stand for 15 minutes. For further work using a supernatant.

Далее пробу делят на 5 частей по количеству методов исследования:Next, the sample is divided into 5 parts by the number of research methods:

1. 2 мл для исследования методом флуоресцирующих антител (МФА);1. 2 ml for research by a method of fluorescent antibodies (MFA);

2. 2 мл для постановки РНГА (РАО), ИФА;2.2 ml for staging RNGA (RAO), ELISA;

3. 2 мл для постановки ПЦР;3. 2 ml for PCR;

4. 2 мл для посева на питательные среды;4. 2 ml for plating on culture media;

5. 5 мл для заражения биопробных животных.5. 5 ml for infection of bioassay animals.

б) пшено:b) millet:

В 25 г пшена добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость. Деление пробы, как в пункте «а».In 25 g of millet add 50 ml of physiological saline. The suspension is shaken for 5 minutes and then stand for 15 minutes. For further work using a supernatant. Sample division, as in paragraph “a”.

в) сливочное и растительное масла:c) butter and vegetable oil:

25 г сливочного масла режут на кусочки, добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. Для дальнейшей работы используют жидкость из-под слоя жира. При исследовании растительного масла физиологический раствор в пробы не добавляют.25 g of butter are cut into pieces, 50 ml of physiological saline are added. The suspension is shaken for 5 minutes and then stand for 15 minutes. For further work, use fluid from under the layer of fat. In the study of vegetable oil, physiological saline is not added to the samples.

Деление пробы, как в пункте «а».Sample division, as in paragraph “a”.

г) сыр:d) cheese:

Сыр в количестве 25 г измельчают, затем добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. После встряхивания и отстаивания исследуют жидкость из-под слоя жира, но над осадком.Cheese in an amount of 25 g is ground, then 50 ml of physiological saline are added. The suspension is shaken for 5 minutes and then stand for 15 minutes. After shaking and settling, examine the liquid from under the layer of fat, but above the sediment.

Деление пробы, как в пункте «а».Sample division, as in paragraph “a”.

д) хлеб:d) bread:

Хлеб (пшеничный и ржаной) в количестве 25 г измельчают, затем в каждую пробу добавляют по 100 мл физиологического раствора (хлеб впитывает в себя много жидкости). Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость.Bread (wheat and rye) in the amount of 25 g is crushed, then 100 ml of physiological saline is added to each sample (bread absorbs a lot of liquid). The suspension is shaken for 5 minutes and then stand for 15 minutes. For further work using a supernatant.

Деление пробы, как в пункте «а».Sample division, as in paragraph “a”.

е) сахар:e) sugar:

К 25 г сахара добавляют 50 мл физиологического раствора и после растворения пробу немедленно (поскольку в растворе сахара микроорганизмы быстро погибают) делят на части, сеют на питательные среды и заражают биопробных животных.To 25 g of sugar add 50 ml of physiological saline and after dissolution, the sample immediately (because microorganisms die quickly in the sugar solution) are divided into parts, sown on nutrient media and infect the test animals.

Деление пробы, как в пункте «а».Sample division, as in paragraph “a”.

ж) молоко и простокваша:g) milk and yogurt:

Молоко 50 мл исследуют без предварительной обработки, если простокваша густая, то ее необходимо развести 50 мл физиологического раствора.Milk of 50 ml is examined without preliminary treatment, if yogurt is thick, then it is necessary to dilute 50 ml of physiological saline.

Деление пробы, как в пункте «а».Sample division, as in paragraph “a”.

з) вода:h) water:

Воду 500 мл фильтруют через мембранные фильтры, которые затем смывают 15 мл физиологического раствора.500 ml of water is filtered through membrane filters, which are then washed with 15 ml of physiological saline.

Деление пробы, как в пункте «а».Sample division, as in paragraph “a”.

II этап - исследование пробStage II - study of samples

II этап включает в себя необходимую дополнительную подготовку проб и их исследование экспрессными, ускоренными и биологическими методами.Stage II includes the necessary additional preparation of samples and their study by express, accelerated and biological methods.

1. Исследование продуктов экспрессными и ускоренными методами:1. Product research by express and expedited methods:

а) колбаса: для исследования подготовленной на I этапе пробы экспрессными и ускоренными методами (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР) ее предварительно центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин для осаждения грубых частиц продуктов. После центрифугирования исследуют надосадочную жидкость.a) sausage: to study samples prepared at stage I by express and accelerated methods (MFA, RNGA, RAO, ELISA, PCR), it is pre-centrifuged at 1000 rpm for 10 min to precipitate coarse particles of products. After centrifugation, the supernatant is examined.

Часть пробы, предназначенную для МФА, дополнительно центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин для осаждения микробных клеток. После центрифугирования к осадку добавляют 0,1 мл физиологического раствора и готовят на предметных стеклах мазки для люминесцентной микроскопии, которые после высыхания фиксируют в ацетоне или спирте. Затем мазки обрабатывают флуоресцирующей чумной адсорбированной лошадиной сывороткой производства Всероссийского НИПЧИ «Микроб» (г.Саратов) и просматривают в люминесцентном микроскопе.The portion of the sample intended for MPA is further centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes to precipitate microbial cells. After centrifugation, 0.1 ml of physiological saline is added to the precipitate and smears for luminescence microscopy are prepared on slides, which, after drying, are fixed in acetone or alcohol. Then the smears are treated with fluorescent plague adsorbed horse serum produced by the All-Russian Research Institute of Microbiology "Microbe" (Saratov) and viewed under a luminescent microscope.

Перед постановкой РНГА в пробу для обеззараживания добавляют формалин до конечной концентрации 4%, экспозиция 1 час, доводят рН до 7,0, ставят и учитывают реакции.Before staging RNGA in the sample for disinfection, formalin is added to a final concentration of 4%, the exposure is 1 hour, the pH is adjusted to 7.0, the reactions are set and taken into account.

Перед постановкой ИФА материал кипятят 10-15 мин.Before staging ELISA, the material is boiled for 10-15 minutes.

Реакции ставят микрометодом в 2 лунках полистироловых пластин (1 - опытная, 2 - контроль торможения). Для РНГА используют диагностикум эритроцитарный чумной иммуноглобулиновый сухой производства НИИМ МО РФ (г.Киров), для РАО - чумной иммуноглобулиновый полимерный сухой диагностикум производства РостНИПЧИ, для ИФА - тест-систему иммуноферментную моноклональную для обнаружения и идентификации капсульного антигена Ф1 возбудителя чумы производства НИИМ МО РФ (г.Киров).The reactions are set by micromethod in 2 wells of polystyrene plates (1 - experimental, 2 - inhibition control). For RNGA, use the erythrocyte plague immunoglobulin dry diagnosticum produced by the NIIM of the Russian Federation Ministry of Defense (Kirov), for RAO use the plague immunoglobulin polymer dry diagnostic production of RostNIPCHI, for the ELISA, the enzyme-linked immunosorbent assay monoclonal for the detection and identification of the capsule antigen F1 of the MII of the Russian plague pathogen (Kirov).

Для постановки ПЦР выделяют ДНК, ставят и учитывают реакцию с Ген-Пест Тест-системой производства Российского НИПЧИ «Микроб» (г.Саратов);For PCR, DNA is isolated, the reaction with the Gen-Pest Test System manufactured by the Russian NIIPCH Microbe (Saratov) is set up and taken into account;

б) пшено: исследование пшена экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;b) millet: the study of millet by express and accelerated methods is carried out by analogy with the study of sausage;

в) сливочное и растительное масла: исследование масел экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы.c) butter and vegetable oil: the study of oils by express and accelerated methods is carried out by analogy with the study of sausage.

Особенности исследования жиров для обнаружения чумного микроба с помощью МФА: на мазки перед фиксацией наносят для обезжиривания эфир на 1-2 мин;Features of the study of fats to detect the plague microbe using MFAs: ether is applied to the smears before fixation for degreasing for 1-2 minutes;

г) сыр: исследование сыра экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;d) cheese: cheese research by express and expedited methods is carried out by analogy with the study of sausage;

д) хлеб: исследование хлеба экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;d) bread: the study of bread by express and accelerated methods is carried out by analogy with the study of sausage;

е) сахар: исследование сахара экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;e) sugar: sugar research by express and accelerated methods is carried out by analogy with the study of sausage;

ж) молоко и простокваша: исследование молока и простокваши экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;g) milk and yogurt: the study of milk and yogurt by express and expedited methods is carried out by analogy with the study of sausage;

з) вода: исследование воды экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы.h) water: water research by express and accelerated methods is carried out by analogy with the study of sausage.

Вероятность обнаружения чумного микроба в нативном материале экспрессными и ускоренными методами зависит от:The probability of detecting a plague microbe in native material by express and accelerated methods depends on:

а) обсемененности продуктов Y.pestis;a) seed contamination of Y. pestis products;

б) срока (давности) заражения продуктов;b) the period (limitation) of contamination of products;

в) чувствительности используемых для индикации методов.c) the sensitivity of the methods used for indication.

Было экспериментально доказано, что удельный вес микроорганизмов, сохраняющихся в различных пищевых продуктах, зависит как от характера продукта, так и от времени, прошедшего от момента заражения продуктов до начала их исследования (см. таблицу 2).It was experimentally proved that the specific gravity of microorganisms stored in various food products depends both on the nature of the product and on the time elapsed from the moment of infection of the products to the start of their research (see table 2).

Из таблицы 2 видно, что в таких продуктах, как сливочное и растительное масло, вода, микроорганизмы хорошо сохраняются довольно длительное время, так через 1 сутки в этих продуктах сохраняется от 48,8 до 100% живых микробных клеток, а через 3 суток - от 5 до 100% (растительное масло).From table 2 it can be seen that in products such as butter and vegetable oil, water, microorganisms are well preserved for a fairly long time, so after 1 day in these products from 48.8 to 100% of living microbial cells are stored, and after 3 days from 5 to 100% (vegetable oil).

Наиболее быстрая гибель бактерий происходит в таких продуктах, как простокваша, пшено, хлеб ржаной, сахар. Уже через 1 час после заражения этих продуктов в них остается всего 5-11,6% жизнеспособных микроорганизмов; через 24 часа - от 0,2 до 6%, а через 72 часа - от 0 до 0,08%, что создает определенные сложности для индикации Y.pestis экспрессными и ускоренными методами, имеющими определенную чувствительность (см. таблицу 3).The fastest death of bacteria occurs in products such as yogurt, millet, rye bread, sugar. Within 1 hour after infection of these products, only 5-11.6% of viable microorganisms remain in them; after 24 hours - from 0.2 to 6%, and after 72 hours - from 0 to 0.08%, which creates certain difficulties for the indication of Y. pestis by express and accelerated methods having a certain sensitivity (see table 3).

При исследовании нативных проб экспрессными и ускоренными методами были сделаны выводы: наиболее чувствительным является метод ПЦР (возможность обнаружения ДНК чумного микроба составляет 2·10³ м.к./г(мл) продукта).In the study of native samples by express and accelerated methods, the following conclusions were drawn: the PCR method is the most sensitive (the possibility of detecting plague microbe DNA is 2 · 10 ³ mk / g (ml) of the product).

Второе место по чувствительности занимает метод РАО (выявляет от 1·10⁵ до 2·10⁷ м.к./г (мл), т.е он дает положительные результаты только с достаточно высоко обсемененными пробами), но даже при высокой обсеменности РАО не дает положительных результатов при исследовании растительного масла.The second place in sensitivity is taken by the RW method (it reveals from 1 · 10 ⁵ to 2 · 10 ⁷ m.k./g (ml), i.e. it gives positive results only with rather high seeded samples), but even with high RW dissemination does not give positive results in the study of vegetable oil.

Метод РНГА по чувствительности приближается к РАО (выявляет от 2·10⁶ до 1·10⁷ м.к./г (мл) продукта и при этом неэффективен при исследовании молока, простокваши, сливочного и растительного масел, пшена.In terms of sensitivity, the RNGA method approaches RAO (detects from 2 · 10 ⁶ to 1 · 10 ⁷ m.k. / g (ml) of the product and is ineffective in the study of milk, yogurt, butter and vegetable oils, and millet.

Методом МФА выявляются микробы, находящиеся только в жизнеспособном состоянии, при этом обсемененность продуктов должна быть не ниже 2·10⁵-2·10⁷ м.к./г (мл). В таких продуктах, как молоко фляжное и простокваша, чумную палочку не удается выявить уже через 1 час после заражения, хотя обсемененность остается достаточно высокой (5-50%). По-видимому, сам продукт вызывает гашение специфической люминесценции.By the method of MFA microbes are found that are only in a viable state, while the seed contamination of the products should not be less than 2 · 10 ⁵ -2 · 10 ⁷ m.k. / g (ml). In products such as flask milk and yogurt, plague bacillus can not be detected 1 hour after infection, although the seeding remains quite high (5-50%). Apparently, the product itself causes the quenching of specific luminescence.

Метод МФА достаточно эффективен при анализе растительного масла (даже через 3 суток от момента заражения в этом продукте возбудитель чумы обнаруживается в концентрации 1·10⁵ м.к./мл, так как чумная палочка за этот период, как показано в таблице 2, практически не отмирает).The MFA method is quite effective in the analysis of vegetable oil (even after 3 days from the moment of infection in this product, the plague pathogen is detected at a concentration of 1 · 10 ⁵ m.k./ ml, since the plague stick for this period, as shown in table 2, is practically does not die off).

Представленные данные иллюстрируют динамику снижения концентрации Y.pestis в ряде продуктов и достаточно ограниченные возможности экспрессных и ускоренных методов при исследовании нативных проб, поэтому схема лабораторного контроля предусматривает биологическое накопление (размножение) возбудителя с последующим исследованием проб с помощью тех же экспрессных и ускоренных методов. Предполагается, что высокая концентрация Y.pestis даст возможность провести успешную индикацию возбудителя.The data presented illustrate the dynamics of a decrease in the concentration of Y. pestis in a number of products and the rather limited possibilities of express and accelerated methods in the study of native samples, therefore, the laboratory control scheme provides for the biological accumulation (reproduction) of the pathogen with subsequent study of samples using the same express and accelerated methods. It is assumed that a high concentration of Y. pestis will enable the successful indication of the pathogen.

2. Исследование продуктов биологическими методами2. Research of products by biological methods

Проведение исследования проб биологическими методами включает в себя посев на питательные среды, заражение биопробных животных.Biological research of samples includes inoculation on nutrient media, infection of bio-test animals.

а) посев на питательные среды:a) sowing on nutrient media:

Для выделения культуры Y.pestis производят посев всех подготовленных на I этапе проб пищевых продуктов в объеме 0,2 мл на 2 чашки селективной питательной среды, посевы инкубируют в термостате при 37 и 28° в течение 48 часов. Выращивание при 28 позволяет выделить культуру для ее идентификации, при 37° происходит накопление фракции 1, которая может быть выявлена с помощью вышеуказанных серологических методов и в ПЦР.To isolate the Y. pestis culture, all food samples prepared in stage I are sown in a volume of 0.2 ml per 2 cups of selective nutrient medium, the crops are incubated in an incubator at 37 and 28 ° for 48 hours. Growing at 28 makes it possible to isolate the culture for its identification; at 37 ° C, fraction 1 accumulates, which can be detected using the above serological methods and in PCR.

При появлении колоний Y.pestis их изучают с помощью экспрессных и ускоренных методов (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР), отсевают для получения чистых культур с последующей идентификацией до вида.When Y. pestis colonies appear, they are studied using rapid and accelerated methods (MFA, RNGA, RAO, ELISA, PCR), sifted out to obtain pure cultures with subsequent identification to the species.

Хорошей средой для выделения Y.pestis является эритрит-агар (показатели прорастания чумного микроба на этой среде при 37° на 2 порядка выше, чем на агаре Хоттингера или среде Морриса) (см. таблицу 4).Erythritol agar is a good medium for Y. pestis isolation (the rate of germination of the plague microbe on this medium at 37 ° C is 2 orders of magnitude higher than on Hottinger agar or Morris medium) (see table 4).

При использовании этой среды минимальное количество микробных клеток Y.pestis, выявляемое при помощи серологических методов, составляет 1:10⁴-1·10⁵.When using this medium, the minimum number of microbial cells of Y. pestis detected using serological methods is 1:10 ⁴ -1 · 10 ⁵ .

Добавление генцианвиолета в эритрит-агар в концентрации 1:200000 и полимиксина 0,02 г/л придает ей селективные свойства, не препятствуя росту чумного микроба и тормозя размножение как грамположительной, так и грамотрицательной микрофлоры (кроме Proteus vulgaris, который при этом не роится).Adding gentian violet to erythritol agar at a concentration of 1: 200000 and polymyxin 0.02 g / l gives it selective properties, without inhibiting the growth of the plague microbe and inhibiting the reproduction of both gram-positive and gram-negative microflora (except for Proteus vulgaris, which does not swarm) .

Помимо эритрит-агара для выделения возбудителя чумы из пищевых продуктов использовали среду ЧДС-37 (чумная дрожжевая среда), на которую в РостНИПЧИ в настоящее время оформляется нормативно-техническая документация. Морфология колоний чумного микроба на опытной среде ЧДС-37 типична для культуры, выращенной при 37°С.In addition to erythritol agar, ChDS-37 medium (plague yeast medium) was used to isolate the plague pathogen from food products, for which regulatory and technical documentation is currently being prepared at RostNIPCHI. The morphology of the plague microbe colonies on the test medium ChDS-37 is typical for a culture grown at 37 ° C.

Среда ЧДС-37 обеспечивает пророст не менее 40% клеток в популяции штамма EV (см. таблицу 5), т.е. по показателю прорастания она превосходит эритрит-агар.ChDS-37 medium provides a seedling of at least 40% of the cells in the population of strain EV (see table 5), i.e. in terms of germination, it exceeds erythritol-agar.

Использование в качестве селективной добавки генцианвиолета в разведении 1:200000 и полимиксина в концентрации 0,02 г/л не угнетает рост чумного микроба, не снижает продукции Ф1, определяемой в МФА, РАО, РНГА. Среда ЧДС-37 обладает такими же селективными свойствами, как и эритрит-агар.The use of a gentian violet in a dilution of 1: 200000 and polymyxin at a concentration of 0.02 g / l as a selective additive does not inhibit the growth of the plague microbe, does not reduce the production of F1, as determined in MPA, RAO, RNGA. ChDS-37 medium has the same selective properties as erythritol agar.

ЧДС-37 с генцианвиолетом 1:200000 и 0,02 г/л полимиксина впервые была использована для обнаружения чумного микроба в пищевых продуктах. Возможности выявления Y.pestis из различных продуктов при разной степени их обсемененности представлены в таблице 6.ChDS-37 with a gentian violet of 1: 200000 and 0.02 g / l of polymyxin was first used to detect the plague microbe in food products. The possibilities for identifying Y. pestis from various products with different degrees of seeding are presented in table 6.

На ЧДС-37 через час после заражения можно выделить Y.pestis в пищевых продуктах (кроме пшена, сахара, простокваши, ржаного хлеба), если количество микробных клеток в 10 г (мл) продукта не ниже 1·10³ м.к. Из-за быстрого отмирания микроорганизмов в сахаре, пшене, кислом молоке и ржаном хлебе через час Y.pestis можно обнаруживать лишь в дозе 1·10⁴ м.к.On CDS-37, one hour after infection, Y. pestis can be isolated in foods (except for millet, sugar, yogurt, rye bread), if the number of microbial cells in 10 g (ml) of the product is not less than 1 · 10 ³ m.k. Due to the rapid death of microorganisms in sugar, millet, sour milk and rye bread, after an hour, Y. pestis can be detected only at a dose of 1 · 10 ⁴ mk.

Через 24 часа вероятность выделения микробных клеток из пшена, колбасы, кислого молока и ржаного хлеба снижается на порядок, т.е. составляет 1·10⁵ м.к. Выживаемость чумного микроба в молоке, сыре, сливочном и растительном масле, воде достаточно высока, поэтому в них возбудитель на среде ЧДС-37 мог быть обнаружен в дозе 1·10³ м.к.After 24 hours, the probability of isolating microbial cells from millet, sausage, sour milk and rye bread is reduced by an order of magnitude, i.e. makes 1 · 10 ⁵ m.k. The survival rate of the plague microbe in milk, cheese, butter and vegetable oil, water is quite high, so the pathogen in the medium ChDS-37 could be detected in a dose of 1 · 10 ³ mk.

Таким образом, возможность выделения чумного микроба из пищевых продуктов путем посева на питательные среды в определенной степени ограничена сроками заражения, обсемененностью и качеством продуктов.Thus, the possibility of isolating the plague microbe from food by seeding on nutrient media is to some extent limited by the time of infection, seeding and quality of the products.

При невозможности выделения культуры чумного микроба на селективных питательных средах при низком содержании возбудителя в продуктах это удавалось сделать с помощью заражения биопробных животных, в организме которых происходит размножение даже единичных микробных клеток, сохранившихся в продукте, что позволяет проводить их индикацию с помощью экспрессных и ускоренных методов.If it was not possible to isolate the plague microbe culture on selective nutrient media with a low pathogen content in the products, this could be done by infecting biological samples, in the body of which even single microbial cells preserved in the product reproduce, which allows their indication using express and accelerated methods .

б) заражение биопробных животных.b) infection of bioassay animals.

В качестве биологического метода для накопления и выделения чумного микроба используют биопробных животных (белых мышей), у которых предварительно снижают естественную резистентность с помощью иммунодепрессантов (схема). Гидрокортизон вводят четырем белым мышам за 2-4 часа до заражения исследуемым материалом в количестве 5 мг под кожу бедра. Подготовленный образец продуктов вводят мышам внутрибрюшинно в объеме 1 мл. При отсутствии гидрокортизона используют другие препараты (суспензию желтка, 4 мг/мышь циклофосфана, 5% муцин). Их вводят вместе с исследуемым материалом внутрибрюшинно (0,5 мл иммунодепрессанта и 0,5 мл пробы).As a biological method for the accumulation and isolation of the plague microbe, bioprobe animals (white mice) are used, in which the natural resistance is previously reduced by immunosuppressants (scheme). Hydrocortisone is administered to four white mice 2-4 hours before infection with the test material in an amount of 5 mg under the skin of the thigh. The prepared sample of products is administered to mice intraperitoneally in a volume of 1 ml. In the absence of hydrocortisone, other drugs are used (yolk suspension, 4 mg / mouse cyclophosphamide, 5% mucin). They are administered along with the test material intraperitoneally (0.5 ml of immunosuppressant and 0.5 ml of sample).

Вскрывают животных в 2 срока (по две белые мыши через 24 и 48 часов). При вскрытии лабораторных животных из всех органов делают посевы, мазки-отпечатки на стеклах для МФА. Ткани органов используют для постановки РНГА, РАО, ИФА, ПНР. После выделения чистых культур от биопробных животных их идентифицируют с помощью классических и экспрессных методов.The animals were opened in 2 periods (two white mice after 24 and 48 hours). When opening laboratory animals from all organs do crops, smears, fingerprints on glasses for MFA. Organ tissues are used for staging RNGA, RAO, ELISA, Poland. After isolation of pure cultures from biological samples, they are identified using classical and express methods.

Таким образом, все исследование по предложенному способу проводится в течение 5 дней.Thus, the entire study of the proposed method is carried out within 5 days.

Пример 2. Обнаружение (индикация) сибиреязвенного микроба в пищевых продуктах с помощью предлагаемого способа (таблица 1).Example 2. Detection (indication) of anthrax microbe in food using the proposed method (table 1).

Индикацию В. anthracis в пищевых продуктах (плотных, сыпучих, жирах, жиросодержащих, сахаре, воде, молочных) осуществляют в соответствии с предлагаемым способом (см. таблицу 1).Indication of B. anthracis in food products (dense, loose, fats, fat-containing, sugar, water, dairy) is carried out in accordance with the proposed method (see table 1).

I этап - подготовка проб к исследованиюStage I - preparation of samples for research

Плотные продукты (например, колбасу) готовят к исследованию, как в примере 1, пункте «а»: 25 г продукта измельчают, затем добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 15 минут. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость.Dense products (for example, sausage) are prepared for the study, as in example 1, paragraph "a": 25 g of the product is ground, then 50 ml of physiological saline are added. The suspension is shaken for 15 minutes. For further work using a supernatant.

Сыпучие продукты (например, пшено), сливочное и растительное масло, сыр, ржаной и пшеничный хлеб, сахар, воду, молоко и простоквашу готовят для дальнейшего исследования так же, как описано в 1 примере, пункты «б», «в», «г», «д», «е», «ж» и «з».Bulk products (for example, millet), butter and vegetable oil, cheese, rye and wheat bread, sugar, water, milk and yogurt are prepared for further research in the same way as described in 1 example, paragraphs “b”, “c”, “ g ”,“ e ”,“ e ”,“ g ”and“ h ”.

Далее, как в 1 примере, подготовленные пробы делят на 5 частей по количеству методов исследования:Further, as in 1 example, the prepared samples are divided into 5 parts according to the number of research methods:

1. 2 мл для исследования методом флуоресцирующих антител (МФА);1. 2 ml for research by a method of fluorescent antibodies (MFA);

2. 2 мл для постановки РИГА и ИФА;2. 2 ml for the formulation of RIGA and ELISA;

3. 2 мл для постановки ПЦР (при наличии праймеров);3. 2 ml for PCR (in the presence of primers);

4. 2 мл для посева на питательные среды;4. 2 ml for plating on culture media;

5. 5 мл для заражения биопробных животных.5. 5 ml for infection of bioassay animals.

II этап - исследование пробStage II - study of samples

Второй этап включает в себя необходимую дополнительную подготовку проб и исследование их экспрессными, ускоренными и биологическими методами.The second stage includes the necessary additional preparation of samples and their research by express, accelerated and biological methods.

1. Исследование продуктов экспрессными методами (МФА, РНГА, ИФА, ПЦР) осуществляют, как в примере 1, на II этапе в пунктах «а» «б», «в», «г», «д», «е», «ж» и «з» с использованием специфических сибиреязвенных диагностикумов: иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных неадсорбированных (производитель: предприятие по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, Москва); экспериментальные серии иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных неадсорбированных сухих (производитель: научно-производственное объединение «Пульс», НИИПЧИ, Ставрополь); экспериментальные серии иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных соматических люминесцирующих сухих; экспериментальные серии иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных антиспоровых адсорбированных люминесцирующих сухих (производитель: нучно-производственное объединение «Пульс», НИПЧИ, Ставрополь); диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного иммуноглобулинового сухого (производитель: НИИМ МО РФ, Киров); экспериментальные серии иммуноферментной тест-системы для диагностики возбудителя сибирской язвы (производитель: Российский НИПЧИ «Микроб», Саратов); ГенСибТест-системы для выявления ДНК B.anthracis pX0I+ методом полимеразной цепной реакции (производитель: Российский НИПЧИ «Микроб», Саратов и НИИМ МО РФ, Киров).1. The study of products by express methods (MFA, RNGA, ELISA, PCR) is carried out, as in example 1, in stage II in paragraphs “a”, “b”, “c”, “d”, “d”, “e”, “G” and “h” using specific anthrax diagnostic diagnostics: immunoglobulins of diagnostic fluorescent anthrax non-adsorbed (manufacturer: bacterial production facility of the NF Gamalei Research Institute of Nuclear Medicine, Moscow); experimental series of immunoglobulins for diagnostic fluorescent anthrax non-adsorbed dry (manufacturer: Scientific and Production Association "Pulse", NIIPCHI, Stavropol); experimental series of immunoglobulins for diagnostic anthrax somatic dry luminescent; experimental series of immunoglobulins of diagnostic anthrax antispore adsorbed dry luminescent (manufacturer: scientific and production association "Pulse", NIIPCH, Stavropol); erythrocyte anthrax immunoglobulin dry diagnosticum (manufacturer: NIIM MO RF, Kirov); experimental series of an enzyme-linked immunosorbent assay system for the diagnosis of anthrax pathogen (manufacturer: Russian NIPCHI "Microbe", Saratov); GeneSibTest systems for detecting B.anthracis pX0I + DNA by polymerase chain reaction (manufacturer: Russian Research Institute of Microbiology "Microbe", Saratov and NIIM MO RF, Kirov).

Вероятность обнаружения сибиреязвенного микроба в нативном материале экспрессными и ускоренными методами зависит от:The probability of detecting anthrax microbe in native material by express and accelerated methods depends on:

а) обсемененности продуктов возбудителем сибирской язвы или его спорами;a) contamination of products by the causative agent of anthrax or its spores;

б) срока (давности) заражения продуктов;b) the period (limitation) of contamination of products;

в) чувствительности используемых методов исследования.c) the sensitivity of the research methods used.

При отработке технологии способа лабораторного контроля продуктов на наличие сибиреязвенного микроба (или его спор) было установлено, что удельный вес микроорганизмов, сохраняющихся в различных продуктах, зависит как от характера пищевых продуктов, так и от времени, прошедшего от момента их заражения до начала исследования (см. таблицу 7).When testing the technology of the method of laboratory control of products for the presence of anthrax microbe (or its spores), it was found that the specific gravity of microorganisms stored in various products depends on the nature of the food products and on the time elapsed from the moment of their infection to the start of the study ( see table 7).

Результаты экспериментального изучения выживаемости вакцинного штамма B.anthracis в различных продуктах были следующими. Через час после «заражения» количество выявляемых бацилл в кислом молоке и сахаре резко снизилось (1,5 и 2,1% соответственно); через сутки в этих продуктах живых клеток осталось 10 и 17%, через трое суток единичные микробные клетки выявлялись только в сахаре (0,3%).The results of an experimental study of the survival of the vaccine strain B.anthracis in various products were as follows. An hour after the “infection”, the number of detected bacilli in sour milk and sugar dropped sharply (1.5 and 2.1%, respectively); after 24 hours, 10 and 17% remained in these products of living cells; after three days, single microbial cells were detected only in sugar (0.3%).

Через час в два-три раза снизилось количество жизнеспособных клеток в ржаном хлебе, пшене, воде; через сутки их удельный вес составил 2,8-14,2%, через трое суток в этой группе продуктов клетки В. anthracis выживали только в пшене (2%).After an hour, the number of viable cells in rye bread, millet, water decreased two to three times; after a day, their specific gravity was 2.8-14.2%, after three days in this group of products, B. anthracis cells survived only in millet (2%).

В жирах и жиросодержащих продуктах (сливочное масло, сыр, колбаса) бациллы сохранялись на протяжении трех суток в большом количестве (10-18%), в подсолнечном масле - 100%.In fats and fat-containing products (butter, cheese, sausage), the bacilli remained for three days in large quantities (10-18%), in sunflower oil - 100%.

Полученные экспериментальным путем результаты свидетельствуют о том, что вероятность обнаружения возбудителя сибирской язвы экспрессными и ускоренными методами, с учетом их чувствительности, снижается по мере снижения удельного веса жизнеспособных микробных клеток в пробах.Experimentally obtained results indicate that the probability of detecting the causative agent of anthrax by express and accelerated methods, taking into account their sensitivity, decreases as the proportion of viable microbial cells in the samples decreases.

Методом флюоресцирующих антител выявляются микробы, находящиеся только в жизнеспособном состоянии, при этом обсемененность продуктов должна быть не ниже 5,0·10⁵-5,5·10⁶ м.к./г (мл) (таблица 8). В таких продуктах, как простокваша и сахар, сибиреязвенную палочку не удавалось выявить даже через 1 час после заражения, что соответствовало их низкой обсемененности (1,5-2%).By the method of fluorescent antibodies, microbes that are only in a viable state are detected, while the seeding of products should not be lower than 5.0 · 10 ⁵ -5.5 · 10 ⁶ m.k. / g (ml) (table 8). In products such as yogurt and sugar, anthrax bacillus could not be detected even 1 hour after infection, which corresponded to their low seeding (1.5-2%).

МФА достаточно эффективен при анализе растительного масла, так как сибиреязвенная палочка практически не отмирала в этом продукте даже через трое суток после заражения и возбудитель сибирской язвы обнаруживался в концентрации 5,5·10⁶ м.к./мл.MFA is quite effective in the analysis of vegetable oil, since anthrax bacillus practically did not die in this product even three days after infection and the causative agent of anthrax was detected at a concentration of 5.5 · 10 ⁶ m.k. / ml.

Метод РНГА дает положительные результаты только с высоко обсемененными пробами (2·10⁶-1·10⁷ м.к./г (мл) продукта), независимо от того в жизнеспособном или нежизнеспособном состоянии находятся микробные клетки (таблица 8). В пресном молоке, простокваше, растительном масле при помощи РНГА возбудитель сибирской язвы не мог быть выявлен даже в таких высоких концентрациях, так как в этих продуктах эритроцитарный диагностикум не осаждался, с пшеном результаты были также отрицательными из-за большого количества взвешенных частиц в пробе.RNGA method gives positive results only with highly seeded samples (2 · 10 ⁶ -1 · 10 ⁷ m.k. / g (ml) of the product), regardless of whether the microbial cells are in a viable or non-viable state (table 8). In fresh milk, yogurt, vegetable oil with RNGA, the causative agent of anthrax could not be detected even at such high concentrations, since the erythrocytic diagnosticum did not precipitate in these products, with millet the results were also negative due to the large number of suspended particles in the sample.

Нереальность обнаружения возбудителя сибирской язвы во всех без исключения продуктах, контаминированных низкими дозами В.anthracis, на первом этапе исследования с помощью экспрессных и ускоренных методов диктует необходимость использование методов биологического накопления.The unreality of detecting the causative agent of anthrax in all, without exception, products contaminated with low doses of B.anthracis, at the first stage of the study using express and accelerated methods dictates the need to use biological accumulation methods.

2. Исследование продуктов биологическими методами.2. Research of products by biological methods.

Проведение исследования проб биологическими методами включает в себя посев на питательные среды, заражение биопробных животных:Biological research of samples includes inoculation on nutrient media, infection of bio-test animals:

а) посев на питательные среды.a) sowing on nutrient media.

Для выявления культуры В.anthracis производят посев всех подготовленных на 1 этапе проб пищевых продуктов в объеме 0,2 мл на 1 чашку среды АДЭСБ (агар дрожжевой элективный сибиреязвенный), разработанной в РостНИПЧИ, которая включена в Государственный реестр лекарственных средств под №87/12/9 и производится ФГУП ГНЦПМ (г.Махачкала). Среда обладает выраженными элективными свойствами. Посевы на АДЭСБ инкубируют при 37°С в течение 1-5 суток. Показатели прорастания сибиреязвенного микроба на среде АДЭСБ практически не отличаются от таковых при выращивании на контрольной неселективной среде (агаре Хоттингера) (см. таблицу 9). Культурально-морфологические свойства сибиреязвенного микроба, выращенного на среде АДЭСБ, типичны.To identify the culture of B.anthracis, all food samples prepared at the 1st stage are sown in a volume of 0.2 ml per 1 cup of ADESB medium (elective anthrax yeast agar) developed at RostNIPCHI, which is included in the State Register of Medicines No. 87/12 / 9 and is made by FSUE GNTsPM (Makhachkala). The environment has pronounced elective properties. Crops on ADESB incubated at 37 ° C for 1-5 days. The rates of germination of the anthrax microbe on ADESB medium practically do not differ from those when grown on a control non-selective medium (Hottinger agar) (see table 9). The cultural and morphological properties of the anthrax microbe grown on ADESB medium are typical.

При появлении колоний B.anthracis их изучают с помощью экспрессных и ускоренных методов (МФА, РНГА, ИФА, ПЦР), отсевают для получения чистых культур с последующей идентификацией до вида.When B.anthracis colonies appear, they are studied using express and accelerated methods (MFA, RNGA, ELISA, PCR), sifted out to obtain pure cultures with subsequent identification to the species.

При использовании этой среды минимальное количество микробных клеток B.anthracis, выявляемых при помощи серологических методов, составляет 1·10⁵, что характерно для этого вида возбудителя.When using this medium, the minimum number of microbial cells of B.anthracis detected by serological methods is 1 · 10 ⁵ , which is typical for this type of pathogen.

Среда АДЭСБ впервые апробирована для проведения лабораторного контроля пищевых продуктов с целью выделения сибиреязвенного микроба. Как видно из таблицы 10, на этой среде через 1 час после «заражения» сибиреязвенный микроб можно выделить из большинства продуктов (кроме сахара и простокваши), если количество микробных клеток в 10 г (мл) продукта не ниже 1·10³ м.к. Из-за быстрого отмирания микроорганизмов в сахаре и простокваше через 1 час после заражения B.anthracis можно обнаружить лишь в дозах 1·10⁴-1·10⁵ м.к.The ADESB medium was first tested for laboratory control of food products in order to isolate the anthrax microbe. As can be seen from table 10, in this medium, 1 hour after the "infection", the anthrax microbe can be isolated from most products (except sugar and yogurt), if the number of microbial cells in 10 g (ml) of the product is not less than 1 · 10 ³ m.k. . Due to the rapid death of microorganisms in sugar and yogurt 1 hour after infection, B.anthracis can be detected only in doses of 1 · 10 ⁴ -1 · 10 ⁵ mk

Через 24 часа от момента заражения вероятность выделения микробных клеток снижается на порядок из таких продуктов, как пшено, сахар, хлеб ржаной и из воды.After 24 hours from the moment of infection, the probability of isolating microbial cells is reduced by an order of magnitude from products such as millet, sugar, rye bread and water.

Таким образом, возможность выделения сибиреязвенного микроба из пищевых продуктов путем посева на среду АДЭСБ зависит от сроков заражения продуктов, характера продуктов и степени их обсемененности.Thus, the possibility of isolating the anthrax microbe from food products by plating on ADESB medium depends on the timing of the contamination of the products, the nature of the products and the degree of contamination.

Приведенные экспериментальные данные позволяют сделать вывод, что при заражении продуктов за двое-трое суток до момента их забора на исследование снижается вероятность обнаружения возбудителя сибирской язвы не только экспрессными и ускоренными методами (с учетом их чувствительности), но снижается также возможность их выделения на селективной питательной среде АДЭСБ. В этой ситуации наиболее результативным будет использование биологического метода, предусматривающего накопление возбудителя в организме биопробных животных, даже при заражении их единичными клетками возбудителя;The experimental data presented allow us to conclude that when products are infected two to three days before they are taken for research, the probability of detecting the anthrax pathogen not only by express and accelerated methods (taking into account their sensitivity) decreases, but the possibility of their isolation on selective ADESB environment. In this situation, the most effective will be the use of the biological method, which provides for the accumulation of the pathogen in the body of bioassay animals, even when they are infected with single cells of the pathogen;

б) заражение биопробных животных.b) infection of bioassay animals.

Производится так же, как в 1 примере (см. таблицу 1, II, 2 этап исследования, пункт «б»).It is produced in the same way as in example 1 (see table 1, II, stage 2 of the study, paragraph "b").

Все исследование на наличие в пищевых продуктах возбудителя сибирской язвы по схеме лабораторного контроля проводят в течение 5 дней.The entire study for the presence of anthrax pathogen in food products according to the laboratory control scheme is carried out within 5 days.

Таким образом, возможность индикации B.anthracis достигается с помощью использования предлагаемого способа, включающего исследование экспрессными и ускоренными методами как нативного материала, в котором можно обнаружить возбудитель в высоких дозах, так и единичные микробные клетки после их биологического накопления (посева на питательные среды и заражения биопробных животных).Thus, the ability to indicate B.anthracis is achieved by using the proposed method, which includes the rapid and accelerated investigation of both native material in which the pathogen can be detected in high doses and single microbial cells after their biological accumulation (plating on nutrient media and infections bioassay animals).

Использование предложенного способа определения зараженности продовольствия патогенными биологическими агентами при проведении лабораторного контроля позволяет повысить его эффективность и усовершенствовать существующие методы контроля с целью унификации и приближения их к специфической индикации патогенных биологических агентов.Using the proposed method for determining food contamination with pathogenic biological agents during laboratory control can increase its effectiveness and improve existing control methods in order to unify and bring them closer to the specific indication of pathogenic biological agents.

Применение предлагаемой технологии дает возможность проводить индикацию и идентификацию патогенных биологических агентов в пищевом сырье, продуктах и воде в регламентированные сроки с высокой результативностью, что особенно важно в условиях чрезвычайных ситуаций.The application of the proposed technology makes it possible to indicate and identify pathogenic biological agents in food raw materials, products and water in a timely manner with high efficiency, which is especially important in emergency situations.

Универсальность предлагаемого способа, учитывающего особенности исследования различных по характеру продуктов, часть из которых сложна для экспресс-диагностики (жиры, сахар, молочные продукты), значительно упрощает и сокращает ход анализа. Это особенно важно при массовом поступлении проб, когда требуется максимальная четкость и организованность на всех этапах проводимой специфической индикации и идентификации ПБА. Особенно важным является включение в систему лабораторного контроля продовольствия высокочувствительных и специфичных методов, позволяющих обнаруживать в исследуемых продуктах даже минимальное количество ПБА.The universality of the proposed method, taking into account the features of the study of products of various nature, some of which are difficult for rapid diagnosis (fats, sugar, dairy products), greatly simplifies and shortens the analysis. This is especially important for mass receipt of samples, when maximum clarity and organization are required at all stages of the specific indication and identification of PBA. Particularly important is the inclusion in the laboratory food control system of highly sensitive and specific methods that make it possible to detect even a minimal amount of PBA in the studied products.

Предлагаемый способ проведения лабораторного контроля продовольствия дает выраженный экономический эффект, поскольку требует меньшего количества питательных сред, лабораторных животных и посуды.The proposed method of laboratory control of food gives a pronounced economic effect, since it requires less nutrient media, laboratory animals and utensils.

Таким образом, технология контроля ЛКП, предлагаемая заявителем, позволит эффективно осуществлять лабораторный контроль продовольствия всеми учреждениями медицинской службы ГО.Thus, the LCP control technology proposed by the applicant will allow for efficient laboratory food control by all institutions of the GO medical service.

Таблица 2table 2 Выживаемость Y. pestis EV в пищевых продуктахY. pestis EV survival in food № п/пNo. p / p ПродуктыProducts Количество клеток (%), выживших в течение 1 часаThe number of cells (%) surviving within 1 hour Количество клеток (%), выживших в течение 24 часовThe number of cells (%) surviving within 24 hours Количество клеток (%), выживших в течение 72 часовThe number of cells (%) surviving within 72 hours 1one 22   4four 55 1.one. Пресное молокоFresh milk 50%fifty% 34%34% 0%0% 2.2. Кислое молоко (простокваша)Sour milk (yogurt) 5%5% 0,2%0.2% 0%0% 3.3. СырCheese 56%56% 20%twenty% 8%8% 4.four. Хлеб ржанойRye bread 11,6%11.6% 1,6%1.6% 0%0% 5.5. Хлеб пшеничныйWheat bread 60%60% 10%10% 3%3% 6.6. СахарSugar 11%eleven% 6%6% 0,08%0.08% 7.7. Сливочное маслоButter 67%67% 48,8%48.8% 11,6%11.6% 8.8. КолбасаSausage 40%40% 10%10% 5%5% 9.9. ПшеноMillet 10%10% 0,2%0.2% 0,01%0.01% 10.10. ВодаWater 90%90% 69,7%69.7% 0%0% 11.eleven. Масло растительноеVegetable oil 100%one hundred% 100%one hundred% 100%one hundred%

Таблица 3Table 3 Определение минимального количества выявляемых микробных клеток Y.pestis EV экспрессными и ускоренными методамиDetermination of the minimum number of detectable microbial cells of Y. pestis EV by express and accelerated methods №№ п/п№№ ПродуктыProducts Минимальная доза Y.pestis, выявляемая методамиThe minimum dose of Y. pestis detected by methods МФАMFA РНГАRnga РАОRAO ПЦРPCR 1 час1 hour 24 часа24 hours 72 часа72 hours 1 час1 hour 24 часа24 hours 72 часа72 hours 1 час1 hour 24 часа24 hours 72 часа72 hours 1 час1 hour 24 часа24 hours 72 часа72 hours 1.one. Молоко фляжноеFlask milk -- -- -- н/уWell н/уWell н/уWell 5·10⁶ 5 · 10 ⁶ 5·10⁶ 5 · 10 ⁶ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 × 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2.2. ПростоквашаYogurt -- -- -- н/уWell н/уWell н/уWell 5·10⁶ 5 · 10 ⁶ 5·10⁶ 5 · 10 ⁶ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³   СырCheese 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ -- 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 × 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 4.four. Хлеб ржанойRye bread 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ -- -- 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 5.5. Хлеб пшеничныйWheat bread 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ -- -- 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 6.6. СахарSugar 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ -- -- 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 7.7. Масло сливочноеButter 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ -- н/уWell н/у.Well. н/уWell 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 8.8. Масло растительноеVegetable oil 2·10⁵*2 · 10 ⁵ * 2·10⁵*2 · 10 ⁵ * 2·10⁵*2 · 10 ⁵ * н/уWell н/уWell н/уWell н/уWell н/уWell н/уWell 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 9.9. КолбасаSausage 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ -- 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 10.10. ПшеноMillet 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ -- -- н/уWell н/уWell н/уWell 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 11.eleven. Вода водопроводнаяTap water 2·10⁶ 2 × 10 ⁶ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ -- 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 · 10 ⁶ 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 × 10 ⁶ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ 2·10³ 2 · 10 ³ Условные обозначения:Legend: - - результат реакции отрицательный;- - the result of the reaction is negative; н/у - нельзя учесть (диагностикам не оседает);n / a - cannot be taken into account (does not settle down to the diagnostics); * - просмотр мазков возможен только после обезжиривания их эфиром* - viewing smears is possible only after degreasing them with ether

Таблица 4Table 4 Показатели прорастания чумного микроба на эритрит-агаре при 37°СIndices of germination of the plague microbe on erythritol agar at 37 ° C ШтаммStrain СредаWednesday Среднее количество колоний, выросших при посеве взвеси Y.pestis из разведенийThe average number of colonies grown by sowing suspensions of Y. pestis from dilutions Перерасчет количества микробных клеток на 1 млRecalculation of the number of microbial cells per 1 ml 10^-4 10 ^-4 10^-5 10 ^-5 10^-6 10 ^-6 10^-7 10 ^-7 Y.pestis EV 1290Y.pestis EV 1290 Эритрит-агарErythritol agar Полусливной ростHalf-wet growth 136136 14fourteen 22 1,4·10⁸ 1.410 ⁸ Агар ХоттингераAgar Hottinger 2525 22 00 00 2,5·10⁶ 2.510 ⁶ Среда МоррисаWednesday Morris 20twenty 1one 00 00 2,0·10⁶ 2.010 ⁶

Таблица 5Table 5 Показатели прорастания вакцинного штамма чумного микроба на среде ЧДС-37Indices of germination of the plague microbe vaccine strain on ChDS-37 medium Штамм Strain Среднее количество колоний, выросших при посеве взвеси Y.pestis из разведенийThe average number of colonies grown by sowing suspensions of Y. pestis from dilutions Перерасчет количества микробных клеток на 1 млRecalculation of the number of microbial cells per 1 ml 10^-4 10 ^-4 10^-5 10 ^-5 10^-6 10 ^-6 10^-7 10 ^-7 Y.pestis EV 1290Y.pestis EV 1290 Полусливной ростHalf-wet growth 405405 4242 4four 4,10·10⁸ 4.1010 ⁸

Таблица 6Table 6 Возможность выявление вакцинного штамма Y.pestis, выращенного на ЧДС-37, в пробах пищевых продуктовThe ability to identify vaccine strain Y.pestis grown on CDS-37 in food samples №№ п/п№№ ПродуктProduct Продолжительность контактаContact Duration Обнаружение Y.pestis в пробах при «заражении» продуктов дозамиDetection of Y. pestis in samples when products are “contaminated” with doses 1·10⁸ 1 · 10 ⁸ 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 1·10⁵ 1 · 10 ⁵ 1·10⁵ 1 · 10 ⁵ 1·10⁴ 1 · 10 ⁴ 1·10³ 1 · 10 ³ 1·10² 1 · 10 ² 1one ПшеноMillet 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ -- -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ -- -- -- 22 Молоко пресноеFresh milk 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 33 ПростоквашаYogurt 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ -- -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ -- -- -- 4four СырCheese 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 55 Колбаса варенаяCooked sausage 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ -- -- 66 Сливочное маслоButter 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 77 СахарSugar 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ -- -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ -- -- 88 Хлеб ржанойRye bread 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ -- -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ -- -- -- 99 Хлеб пшеничныйWheat bread 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ -- -- 1010 ВодаWater 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 11eleven Масло растительноеVegetable oil 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ ±± 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ ±± Условные обозначения: + - наличие роста Y.pestis EV; - - отсутствие роста; ± - рост единичных колонийLegend: + - the presence of growth Y.pestis EV; - - lack of growth; ± - growth of single colonies

Таблица 7Table 7 Выживаемость B.anthracis в пищевых продуктахB.anthracis survival in food №/№ п/п№ / № п / п ПродуктыProducts Количество микробных клеток %, сохранившихся в пробе в течение The number of microbial cells% preserved in the sample during 1 часа1 hour 24 часов24 hours 72 часов72 hours 1one Пресное молокоFresh milk 95,295.2 90,490,4 1,51,5 22 Кислое молоко (простокваша)Sour milk (yogurt) 1,51,5 1,01,0 00 33 СырCheese 61,961.9 61,961.9 10,10, 4four Хлеб ржанойRye bread 42,842.8 2,82,8 00 55 Хлеб пшеничныйWheat bread 66,766.7 23,823.8 6,06.0 66 СахарSugar 2,12.1 1,71.7 0,30.3 77 Сливочное маслоButter 71,471,4 62,062.0 18,018.0 88 КолбасаSausage 71,471,4 57,157.1 15,015.0 99 ПшеноMillet 28,528.5 11,911.9 2,02.0 1010 ВодаWater 23,823.8 14,214.2 0,0 11eleven Масло растительноеVegetable oil 100,0100.0 100,0100.0 100,0100.0

Таблица 8Table 8 Определение минимального количества выявляемых микробных клеток В.anthracis экспрессными и ускоренными методами Determination of the minimum number of detectable microbial cells of B.anthracis by express and accelerated methods №№ п/п №№ ПродуктыProducts Минимальная доза В. anthracis, выявляемая методамиThe minimum dose of B. anthracis detected by methods МФАMFA РНГАRnga 1 час1 hour 24 часа24 hours 72 часа72 hours 1 час1 hour 24 часа24 hours 72 часа72 hours 1.one. Молоко фляжноеFlask milk 5,0·10⁶ 5.0 · 10 ⁶ 4,5·10⁶ 4,510 ⁶ -- н/уWell н/уWell н/уWell 2.2. ПростоквашаYogurt -- -- -- н/уWell н/уWell н/уWell 3.3. СырCheese 3,0·10⁶ 3.0 · 10 ⁶ 2,7·10⁶ 2.7 · 10 ⁶ -- 5·10⁶ 5 · 10 ⁶ 5·10⁶ 5 · 10 ⁶ 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 4.four. Хлеб ржанойRye bread 1,0·10⁶ 1,0 · 10 ⁶ -- -- 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 5·10⁶ 5 · 10 ⁶ 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 5.5. Хлеб пшеничныйWheat bread 2,0·10⁶ 2.010 ⁶ 5,0·10⁵ 5.0 · 10 ⁵ -- 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 × 10 ⁶ 6.6. СахарSugar -- -- -- 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ 7.7. Масло сливочноеButter 3,0·10⁶ 3.0 · 10 ⁶ 2,0·10⁶ 2.010 ⁶ 5,0·10⁵ 5.0 · 10 ⁵ н/уWell н/уWell н/уWell 8.8. Масло растительноеVegetable oil 5,5·10^б*5.510 ^b * 5,5·10⁶*5.5 · 10 ⁶ * 5,5·10⁶*5.5 · 10 ⁶ * н/уWell н/уWell н/уWell 9.9. КолбасаSausage 3,0·10^ь 3.0 · 10 ^b 1,8·10⁶ 1.810 ⁶ 5,0·10⁵ 5.0 · 10 ⁵ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 2·10⁶ 2 × 10 ⁶ 10.10. ПшеноMillet 5,0·10⁵ 5.0 · 10 ⁵ -- -- н/уWell н/уWell н/уWell 11.eleven. Вода водопроводнаяTap water 4,0·10⁵ 4.0 · 10 ⁵ -- -- 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 2·10⁷ 2 · 10 ⁷ Условные обозначения:Legend: - - результат реакций отрицательный;- - the result of the reactions is negative; н/у - нельзя учесть (диагностикум не оседает);n / a - cannot be taken into account (the diagnosticum does not settle); * - просмотр мазков возможен только после обезжиривания их эфиром* - viewing smears is possible only after degreasing them with ether

Таблица 9Table 9 Показатель прорастания вакцинного штамма сибиреязвенного на контрольной и опытных средах микробаThe rate of germination of the vaccine strain of anthrax in the control and experimental environments of the microbe ШтаммStrain Среда Wednesday Среднее количество колоний, выросших при посеве взвеси B.anthracis 41 из разведенийThe average number of colonies grown when sowing suspension of B.anthracis 41 from dilutions Перерасчет количества микробных клеток на 1 млRecalculation of the number of microbial cells per 1 ml 10^-4 10 ^-4 10^-5 10 ^-5 10^-6 10 ^-6 10^-7 10 ^-7 B.anthracis 41B.anthracis 41 Агар Хоттингера (контроль)Agar Hottinger (control) Полусливной ростHalf-wet growth 157157 15fifteen 22 1,5·10⁸ 1.5 · 10 ⁸ АДЭСБADESB Полусливной ростHalf-wet growth 130130 15fifteen 1one 1,3·10⁸ 1.310 ⁸

Таблица 10Table 10 Выявление вакцинного штамма B.anthracis, выращенного на среде АДЭСБ, в пробах пищевых продуктовDetection of vaccine strain B.anthracis grown on ADESB in food samples №№ п/п№№ ПродуктProduct Продолжительность контактаContact Duration Обнаружение В.anthracis, в пробах при «заражении» продуктов дозамиDetection of B.anthracis, in samples with "infection" of products with doses 1·10⁸ 1 · 10 ⁸ 1·10⁷ 1 · 10 ⁷ 1·10⁶ 1 · 10 ⁶ 1·10⁵ 1 · 10 ⁵ 1·10⁴ 1 · 10 ⁴ 1·10³ 1 · 10 ³ 1·10² 1 · 10 ² 1one ПшеноMillet 60 минут60 minutes +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * -*- * 24 часа24 hours +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * -*- * -*- * 22 Молоко пресноеFresh milk 60 минут60 minutes +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * -*- * 24 часа24 hours +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * -*- * 33 ПростоквашаYogurt 60 минут60 minutes +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * -*- * -*- * -*- * 24 часа24 hours +*+ * +*+ * +*+ * +*+ * -*- * -*- * -*- * 4four СырCheese 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 55 Колбаса варенаяCooked sausage 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 66 Масло сливочноеButter 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 77 Масло растительноеVegetable oil 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ ±± 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ ±± 88 СахарSugar 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ -- -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ -- -- -- 99 Хлеб ржанойRye bread 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ -- -- 1010 Хлеб пшеничныйWheat bread 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 11eleven ВодаWater 60 минут60 minutes ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- 24 часа24 hours ++ ++ ++ ++ ++ -- -- Условные обозначения: + - наличие роста;Legend: + - the presence of growth; - - отсутствие роста;- - lack of growth; ± - рост единичных колоний;± - growth of single colonies; * - рост посторонней микрофлоры* - growth of extraneous microflora

Claims (6)

1. Способ определения зараженности продовольствия патогенными биологическими агентами в условиях чрезвычайных ситуаций, включающий подготовку проб и их лабораторное исследование, отличающийся тем, что подготовку проб проводят в два этапа, на первом, в зависимости от плотности, жиросодержания и текучести продукта, его подвергают соответственно: взвешиванию, выделяя 25 г (мл) продукта с последующим измельчением, переводу в жидкую фазу в объеме 50-100 мл посредством добавления физиологического раствора, а при исследовании воды последнюю в количестве 500 мл фильтруют через мембранные фильтры, второй этап включает разделение жидкой фазы пробы на 5 частей: первые три части (по 2 мл) используют для проведения экспрессных и ускоренных методов анализа - МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР, четвертую часть пробы (также 2 мл) высевают на питательные среды для проведения бактериологического анализа, а пятую часть (5 мл) - для заражения лабораторных животных, причем проведение этапов на 25 пробах осуществляют параллельно в течение 1,5-2 ч, исследование проб экспрессными методами - в течение 4-10 ч, а биологическим - в течение 48-120 ч, при этом зараженность продуктов подтверждают при высокой обсемененности (≥1·10⁶ м.к. в 1 мл или 1 г) на стадии исследований нативного материала, в случае низкой обсемененности (≤1·10 ⁴ м.к. в 1 мл или 1 г) - положительный результат фиксируют в ПЦР и ИФА и после биологического накопления патогенных биологических агентов в посевах и органах ослабленных биопробных животных - в ПЦР, ИФА, МФА, РНГА или РАО.1. A method for determining food contamination by pathogenic biological agents in emergency situations, including sample preparation and laboratory testing, characterized in that the sample preparation is carried out in two stages, at the first, depending on the density, fat content and fluidity of the product, it is subjected, respectively: weighing, isolating 25 g (ml) of the product, followed by grinding, transferring to a liquid phase in a volume of 50-100 ml by adding physiological saline, and when examining water, the latter in col 500 ml are filtered through membrane filters, the second stage involves the separation of the liquid phase of the sample into 5 parts: the first three parts (2 ml each) are used for rapid and accelerated analysis methods - MFA, RNGA, RAO, ELISA, PCR, the fourth part of the sample ( also 2 ml) are sown on nutrient media for bacteriological analysis, and the fifth part (5 ml) is used to infect laboratory animals, and the steps on 25 samples are carried out in parallel for 1.5-2 hours, the samples are examined by express methods for 4-10 hours, and biologically m - within 48-120 hours, while the contamination of the products is confirmed with high seeding (≥1 · 10 ⁶ m.k. in 1 ml or 1 g) at the stage of research of native material, in case of low seeding (≤1 · 10 ⁴ m.k. in 1 ml or 1 g) - a positive result is recorded in PCR and ELISA and after biological accumulation of pathogenic biological agents in crops and organs of attenuated biological test animals - in PCR, ELISA, MFA, RNGA or RAO. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что МФА проводят в следующей последовательности: первоначально пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, осаждая микробные клетки, затем к осадку добавляют 0,1 мл физиологического раствора и готовят мазки, причем при анализе жиров на мазки перед фиксацией наносят для обезжиривания эфир на 1-2 мин, в последующем мазки подвергают фиксации в спирте или ацетоне с дальнейшей обработкой люминесцирующей сывороткой и просмотром в люминесцентном микроскопе.2. The method according to claim 1, characterized in that the MFA is carried out in the following sequence: initially, the samples are centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, precipitating microbial cells, then 0.1 ml of physiological saline is added to the precipitate and smears are prepared, in the analysis of fats, smears are applied to the smears before fixation for degreasing for 1-2 minutes before fixation; subsequently, the smears are fixed in alcohol or acetone, followed by treatment with luminescent serum and viewed under a luminescent microscope. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении РАО используют полимерный иммуноглобулиновый диагностический препарат, который вводят по 25 мкл в опытную лунку, содержащую 50 мкл исследуемого материала и в контрольную лунку, в которую налито 25 мкл исследуемого материала и 25 мкл специфической сыворотки в разведении 1:10, при этом учет реакции проводят через 2-3 ч по характеру цветового агломерата.3. The method according to claim 1, characterized in that during the RAO use a polymer immunoglobulin diagnostic drug, which is injected 25 μl into an experimental well containing 50 μl of the test material and in the control well, in which 25 μl of the test material and 25 μl are poured specific serum at a dilution of 1:10, while the reaction is carried out after 2-3 hours according to the nature of the color agglomerate. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для проведения ПЦР выделяют ДНК микроорганизмов из проб пищевых продуктов, применяя в зависимости от сложности их состава гуанидинтиоцианатный метод или фенольную экстракцию, а затем проводят постановку ПЦР, используя 1-5 мкл раствора, содержащего ДНК пробы, с последующим учетом реакции, обеспечивающей чувствительность 2-10³ м.к./мл пробы.4. The method according to claim 1, characterized in that for PCR the DNA of microorganisms is isolated from samples of food products, using the guanidine thiocyanate method or phenolic extraction, depending on the complexity of their composition, and then PCR is carried out using 1-5 μl of a solution containing DNA sample, followed by a reaction that provides a sensitivity of 2-10 ³ MK / ml sample. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологическое исследование на присутствие микроорганизмов проводят в два этапа, первоначально осуществляют посев по 0,2 мл материала на 1-2 чашки селективной питательной среды, проводят инкубацию при 28, 37°С и после появления колоний осуществляют исследование посредством экспрессных и ускоренных методов (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР), второй этап заключается в том, что четырем биопробным животным (белым мышам) за 2-4 ч до заражения подкожно вводят гидрокортизон в объеме 5 мг, а исследуемый материал - по 1 мл внутрибрюшинно, в случае использования других иммунодепрессантов (желток, циклофосфан, муцин), их вводят вместе с исследуемым материалом внутрибрюшинно в количестве 0,5 мл иммунодепрессанта и 0,5 мл пробы, через 24 ч двух мышей вскрывают, делают посевы на питательные среды, мазки-отпечатки для МФА, а материал из органов животных исследуют в ПНР, РНГА, РАО или ИФА, причем двух оставшихся животных подвергают вскрытию через 48 ч и исследуют по вышеприведенной технологии.5. The method according to claim 1, characterized in that the biological test for the presence of microorganisms is carried out in two stages, initially sow 0.2 ml of material per 1-2 cups of selective nutrient medium, incubate at 28, 37 ° C and after the appearance of colonies is carried out by means of rapid and accelerated methods (MFA, RNGA, RAO, ELISA, PCR), the second stage is that four bioprobe animals (white mice) are injected subcutaneously with hydrocortisone in a volume of 5 mg 2-4 hours before infection, and the test material - 1 ml intrabu in case of using other immunosuppressants (yolk, cyclophosphamide, mucin), they are administered intraperitoneally with the test material in the amount of 0.5 ml of immunosuppressant and 0.5 ml of the sample, after 24 hours two mice are opened, inoculations for culture media, smears are made -prints for MPA, and the material from the organs of animals examined in Poland, RNGA, RAO or ELISA, and the two remaining animals are opened after 48 hours and examined by the above technology. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве селективных питательных сред используют: АДЭТ-агар диагностический элективный туляремийный, АДЭСБ-агар диагностический элективный сибиреязвенный, СЭДХ-среду элективную диагностическую холерную, ЧДС-37 чумную дрожжевую среду. 6. The method according to claim 1, characterized in that the following are used as selective nutrient media: ADET-agar diagnostic elective tularemia, ADESB-agar diagnostic elective anthrax, CEDH-environment selective diagnostic cholera, ChDS-37 plague yeast medium.