RU2338200C1 - Method of human blood serum testing for oncomarker muc1 - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely to immunotechniques. Method of human blood serum testing for OncoMarker MUC1 is offered for diagnostics of breast cancer (BC) by direct solid-phase bivalent immune photometric analysis using pair of homogeneous antibodies M3F1/M3B11. Formed antigen-antibody complexes are detected using Mab-peroxidase conjugate followed by introduction of stain TMB, and standard OncoMarker is human fat lactoglobule antigen MUC1. Method allows for primary diagnostics of BC stages II and III and for prediction of secondary process development (relapses), and for efficient therapy in determined diagnosis. Application of declared method allows to detect 56-63% BC patients BC by blood serum analysis.

EFFECT: possibility of primary diagnostics of BC stages II and III and prediction of secondary process development (relapses).

4 ex, 2 tbl, 3 dwg

Description

Изобретение относится к биотехнологии и клинической иммунологии и состоит в разработке способа количественного определения уровня онкомаркера (антигена) MUC1 в сыворотке крови человека при диагностике рака молочной железы (РМЖ) путем прямого твердофазного двухсайтового иммунофотометрического анализа (ИФА).The invention relates to biotechnology and clinical immunology, and consists in developing a method for the quantitative determination of the level of the tumor marker (antigen) of MUC1 in human blood serum in the diagnosis of breast cancer (BC) by direct solid-phase two-site immunophotometric analysis (ELISA).

Антиген MUC1 представляет собой высоко гликозилированный трансмембранный белок, который обнаруживают как в нормальных, так и в злокачественных эпителиальных клетках (Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1241: 407-424). Молекула MUC1 состоит из трех доменов: цитоплазматического, трансмембранного и экстрацеллюлярного. Внеклеточный связанный с мембраной компонент антигена характеризуется высоким полиморфизмом. В нормальных физиологических условиях полиморфный MUC1 антиген экспрессируется на поверхности клеток и выполняет различные физиологические функции (J.Nucl.Med.Allied Sci 1990; 34 (Suppl 3):151-162).MUC1 antigen is a highly glycosylated transmembrane protein that is found in both normal and malignant epithelial cells (Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1241: 407-424). The MUC1 molecule consists of three domains: cytoplasmic, transmembrane and extracellular. The extracellular membrane-associated antigen component is characterized by high polymorphism. Under normal physiological conditions, the polymorphic MUC1 antigen is expressed on the cell surface and performs various physiological functions (J. Nucl. Med. Allied Sci 1990; 34 (Suppl 3): 151-162).

Часть мембраносвязанного антигена представляет собой растворимую форму MUC1 антигена (sMUC1) и циркулирует в различных жидкостях организма. Растворимые формы MUC1 обнаружены в грудном молоке, периферической крови, моче человека, а также в супернатантах культур опухолевых клеточных линий (Biochim Biophys Acta. 1995; 1241:407-424; Int J Cancer. 1995; 63:412-418; Cancer Res. 1987; 47:5476-5482; Dis Markers. 1988; 6, 185-194).Part of the membrane-bound antigen is a soluble form of the MUC1 antigen (sMUC1) and circulates in various body fluids. Soluble forms of MUC1 were found in human breast milk, peripheral blood, and urine, as well as in supernatants of tumor cell line cultures (Biochim Biophys Acta. 1995; 1241: 407-424; Int J Cancer. 1995; 63: 412-418; Cancer Res. 1987; 47: 5476-5482; Dis Markers. 1988; 6, 185-194).

По данным Европейского общества онкологов антиген MUC1 наряду с раковоэмбриональным антигеном (РЭА) является одним из главных онкомаркеров при диагностике РМЖ (EGTM// Tumor markers in breast cancer - EGTM recomendation, 1999). Наиболее изучен представитель семейства MUC1 антиген СА 15.3.According to the European Society of Oncologists, the MUC1 antigen along with cancer embryonic antigen (CEA) is one of the main tumor markers in the diagnosis of breast cancer (EGTM // Tumor markers in breast cancer - EGTM recomendation, 1999). The most studied representative of the MUC1 family is antigen CA 15.3.

Известно, что процесс злокачественного роста сопровождается повышением уровня опухолевых маркеров в сыворотке. У больных с аденокарциномой обнаружено повышение уровня СА 15.3 в сыворотке, которое коррелирует с размерами опухоли (Breast Cancer Res Treat. 1996; 37:209-216; Cancer Immun. Immunother. 1990; 31:269-273; J. Clin. Oncol. 1997; 15:2322-2328; Clin. Chem. 1997; 43:585-593). Антиген MUC1 играет существенную роль в метастатическом процессе (J. Nucl. Med. Allied Sci 1990; 34 (Suppl 3): 151-162). Однако чувствительность первичной диагностики по уровню СА 15.3 в сыворотке больных РМЖ составляет 15-35%, так как низкое содержание онкомаркера в сыворотке больного не гарантирует отсутствия злокачественного процесса. В то же время, пациенты с прогрессирующим заболеванием, при рецидиве и метастазировании, имеют устойчиво высокий уровень онкомаркеров (Br.J.Cancer, 63: 809-813), поэтому методы определения СА15.3 рекомендованы EGTM для мониторинговых исследований и прогнозирования течения РМЖ (Blood, 2000, v.96(9): 3147-3153).It is known that the process of malignant growth is accompanied by an increase in the level of tumor markers in serum. In patients with adenocarcinoma, an increase in serum CA 15.3 level was found which correlates with tumor size (Breast Cancer Res Treat. 1996; 37: 209-216; Cancer Immun. Immunother. 1990; 31: 269-273; J. Clin. Oncol. 1997; 15: 2322-2328; Clin. Chem. 1997; 43: 585-593). The MUC1 antigen plays a significant role in the metastatic process (J. Nucl. Med. Allied Sci 1990; 34 (Suppl 3): 151-162). However, the sensitivity of the initial diagnosis according to the level of CA 15.3 in the serum of breast cancer patients is 15-35%, since the low content of the tumor marker in the serum of the patient does not guarantee the absence of a malignant process. At the same time, patients with progressive disease, with relapse and metastasis, have a consistently high level of tumor markers (Br.J. Cancer, 63: 809-813), therefore, CA15.3 determination methods are recommended by EGTM for monitoring studies and predicting the course of breast cancer ( Blood, 2000, v. 96 (9): 3147-3153).

Первой коммерческой тест-системой для определения уровня MUC1 в сыворотке крови человека стала система Centocor СА 15-3^TM RIA (Malvern, РА) на основе двух моноклональных антител, специфичных к эпитопам, локализованным на внеклеточном домене молекулы MUC1 (Hybridoma 1984; 3:223-226). Первое моноклональное антитело (Mab) DF3 направлено к пептидной части молекулы (DTRPAGS); другое Mab - 115D8 специфично к углеводному эпитопу MUC1.The first commercial test system for determining the level of MUC1 in human serum was the Centocor CA 15-3 ^TM RIA system (Malvern, RA) based on two monoclonal antibodies specific for epitopes located on the extracellular domain of the MUC1 molecule (Hybridoma 1984; 3: 223 -226). The first monoclonal antibody (Mab) DF3 is directed to the peptide portion of the molecule (DTRPAGS); another Mab - 115D8 is specific for the MUC1 carbohydrate epitope.

На базе тех же Mab разработаны ИФА тест-системы IMx Са 15.3 MEIA (Abbott) и Enzymun-Test СА 15.3 (Boehringer Mannheim), а на их основе способы определения онкомаркера в сыворотке крови человека (Cancer J., 2001, 7: 181-190).Based on the same Mab, ELISA test systems IMx Ca 15.3 MEIA (Abbott) and Enzymun-Test CA 15.3 (Boehringer Mannheim) were developed, and based on them, methods for determining the tumor marker in human serum (Cancer J., 2001, 7: 181- 190).

В качестве ближайшего аналога рассмотрим способ Enzymun-Test СА 15.3 (Cancer J., 2001, 7: 181-190), обладающий чувствительностью 13-14% при диагностике РМЖ по содержанию в сыворотке больного онкомаркера СА 15.3. При осуществлении этого способа использован формат прямого твердофазного двухсайтового ИФА и, дополнительно, авидин-биотиновая система, в основу которой положено высокое сродство гликопротеина яичного белка (авидина) к молекуле биотина. Применение процедуры биотинилирования антител позволяет одновременно вносить в лунки планшета, обработанные стрептавидином, антиген MUC1, биотинилированные Mab DF3 и конъюгированные с пероксидазой Mab 115D8. Стандартом онкомаркера является антиген СА 15.3, выделенный из супернатантов клеточной линии ZR-75 (Ann. Clin.Biochem, 1999, 36: 579-586). Использование биотинилированных моноклональных антител имеет как достоинства (высокую чувствительность ИФА), так и недостатки (дополнительные трудозатраты).As the closest analogue, consider the Enzymun-Test CA 15.3 method (Cancer J., 2001, 7: 181-190), which has a sensitivity of 13-14% in the diagnosis of breast cancer by the serum content of the patient tumor marker CA 15.3. When implementing this method, the direct solid-phase two-site ELISA format was used and, in addition, the avidin-biotin system, which is based on the high affinity of egg protein glycoprotein (avidin) to the biotin molecule. The use of the antibody biotinylation procedure allows simultaneous addition of streptavidin-treated antigen MUC1, biotinylated Mab DF3 and conjugated to Mab 115D8 peroxidase to the wells of the plate. The tumor marker standard is CA 15.3 antigen isolated from supernatants of the ZR-75 cell line (Ann. Clin Biochem, 1999, 36: 579-586). The use of biotinylated monoclonal antibodies has both advantages (high sensitivity of ELISA) and disadvantages (additional labor costs).

Задача заявляемого изобретения - разработать более эффективный и чувствительный способ количественного определения опухоль ассоциированного антигена MUC1 в сыворотке крови человека.The task of the invention is to develop a more effective and sensitive method for the quantitative determination of a tumor associated MUC1 antigen in human serum.

Задача решена путем разработки способа количественного определения онкомаркера MUC1 в сыворотке крови человека в формате прямого твердофазного двухсайтового иммунофотометрического анализа с применением тест-системы из двух моноклональных антител, взаимодействующих с онкомаркером сыворотки крови, а в контроле со стандартом онкомаркера; отличающийся тем, что реакцию взаимодействия онкомаркер-антитело осуществляют в формате ИФА, в качестве тест-системы используют пару моноклональных антител M3F1/M3B11, для выявления образовавшихся комплексов антиген-антитело используют Mab-пероксидазный конъюгат с последующим введением красителя ТМБ, а в качестве стандарта онкомаркера выделенный из жировых глобул молока человека антиген MUC1.The problem was solved by developing a method for the quantitative determination of the MUC1 tumor marker in human blood serum in the format of a direct solid-phase two-site immunophotometric analysis using a test system of two monoclonal antibodies interacting with the blood serum tumor marker, and in control with the tumor marker standard; characterized in that the oncomarker-antibody interaction reaction is carried out in ELISA format, a pair of monoclonal antibodies M3F1 / M3B11 is used as a test system, Mab-peroxidase conjugate followed by the introduction of TMB dye is used to detect the antigen-antibody complexes formed, and as a standard oncomarker MUC1 antigen isolated from fat globules of human milk.

Набор для определения MUC1 в сыворотке крови человека.A kit for determining MUC1 in human serum.

Тест-система на основе моноклональных антител M3F1/M3B11 представляет собой стандартный набор компонентов для прямого твердофазного двухсайтового ИФА определения MUC1 антигена (ELISA):The test system based on monoclonal antibodies M3F1 / M3B11 is a standard set of components for direct solid-phase two-site ELISA determination of MUC1 antigen (ELISA):

1) анти-MUC1 Mab М3F1;1) anti-MUC1 Mab M3F1;

2) стандарт антигена MUC1;2) MUC1 antigen standard;

3) контроли 1 и 2 с содержанием антигена 8 и 16 нг/мл, соответственно;3) controls 1 and 2 with an antigen content of 8 and 16 ng / ml, respectively;

4) конъюгат анти- MUC1 Mab М3В11 с пероксидазой хрена (М3В11-РО);4) conjugate anti-MUC1 Mab M3B11 with horseradish peroxidase (M3B11-PO);

5) буферные растворы для разведения и нанесения образцов (фосфатный буфер с рН 7,2, содержащий 0,05% бычьего сывороточного альбумина и твина 20);5) buffer solutions for dilution and application of samples (phosphate buffer with a pH of 7.2, containing 0.05% bovine serum albumin and tween 20);

6) буферный раствор (фосфатно-цитратный буфер с рН 4,5) и субстрат для проявки (3,3',5,5'-тетраметилбензидин, ТМБ);6) a buffer solution (phosphate-citrate buffer with a pH of 4.5) and a substrate for development (3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine, TMB);

7) раствор для остановки реакции (10% раствор серной кислоты).7) a solution to stop the reaction (10% sulfuric acid solution).

Способ в общем виде.The method in general form.

Заявляемый способ основан на прямом твердофазном двухсайтовом ИФА. Исследуемые сыворотки и стандарт антигена вносят в лунки планшета, предварительно покрытые Mab M3F1. Исследуемые сыворотки разводят буфером для нанесения образцов в соотношении 1:40. При этом используют не более 25 мкл сыворотки пациента. Антиген MUC1 в нанесенных образцах сывороток и контролей, специфически связанный с Mab (M3F1) на подложке, выявляют путем нанесения Mab-пероксидазного конъюгата (М3В11-РО). Далее для развития цветной реакции в лунки планшета добавляют субстратную смесь, содержащую в качестве красителя ТМБ, и измеряют интенсивность окраски спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Количество антигена в исследуемых образцах сывороток определяют по калибровочной кривой, построенной для стандарта антигена MUC1. Стандартную кривую строят для каждого анализа в координатах: оптическая плотность против концентрации антигена в стандарте (Фиг.1), где: ось X - концентрация антигена MUC1 (1-64 нг/мл); ось Y - оптическая плотность при 450 нм. При определении в пробе более 16 нг антигена образец сыворотки разводят дополнительно в 2-4 раза.The inventive method is based on a direct solid-phase two-site ELISA. The test sera and antigen standard are added to the wells of the plate precoated with Mab M3F1. The test sera are diluted with sample buffer in a ratio of 1:40. In this case, no more than 25 μl of patient serum is used. MUC1 antigen in applied serum samples and controls, specifically bound to Mab (M3F1) on a support, is detected by applying Mab-peroxidase conjugate (M3B11-PO). Then, to develop a color reaction, a substrate mixture containing TMB as a dye is added to the wells of a plate, and the color intensity is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The amount of antigen in the studied serum samples is determined by the calibration curve constructed for the MUC1 antigen standard. A standard curve is built for each analysis in the coordinates: optical density versus antigen concentration in the standard (Fig. 1), where: X axis - MUC1 antigen concentration (1-64 ng / ml); Y axis - optical density at 450 nm. When determining more than 16 ng of antigen in a sample, a serum sample is diluted an additional 2-4 times.

Интерпретацию результатов теста проводят, используя расчетный средний уровень антигена MUC1 у здоровых доноров (cutoff) (The ELISA Guidebook, pp.301-394 in «Methods in Molecular Biology» (v.149), Humana Press, 2000). Сыворотки, содержащие антиген MUC1 в концентрации выше уровня cutoff, диагностируют как патологические. Уровень нормальных значений MUC1 антигена устанавливают с учетом локальных факторов окружающей среды и задач исследования. В заявляемом способе применяют два уровня cutoff, в зависимости от целей исследования: cutoff 1 - при мониторинге терапии и для обнаружения рецидивов, a cutoff 2 - для первичной диагностики РМЖ (см. Пример 4).Interpretation of the test results is carried out using the calculated average level of MUC1 antigen in healthy donors (cutoff) (The ELISA Guidebook, pp. 301-394 in "Methods in Molecular Biology" (v.149), Humana Press, 2000). Sera containing MUC1 antigen at a concentration above cutoff level are diagnosed as pathological. The level of normal values of MUC1 antigen is established taking into account local environmental factors and research objectives. In the inventive method, two levels of cutoff are used, depending on the objectives of the study: cutoff 1 - for monitoring therapy and for the detection of relapses, and cutoff 2 - for the initial diagnosis of breast cancer (see Example 4).

Основные параметры количественного определения MUC1 заявляемым способом.The main parameters of the quantitative determination of MUC1 by the claimed method.

Основные параметры количественного определения MUC1 соответствуют ГОСТу Р 51352-99 и представлены в табл.1. Перекрестные реакции с билирубином, гемоглобином человека, а также при использовании сывороток больных липимией, как возможных источников интерференции, не обнаружены (Method Validation-The Interference and Recovery Experiments, 2000).The main parameters for the quantitative determination of MUC1 correspond to GOST R 51352-99 and are presented in table 1. Cross-reactions with bilirubin, human hemoglobin, and also when using sera of patients with lipymia as possible sources of interference, were not detected (Method Validation-The Interference and Recovery Experiments, 2000).

Табл.1Table 1 Параметры по ГОСТ Р 51352-99Parameters according to GOST R 51352-99 Требования ГОСТGOST requirements Результаты определения заявляемым способомThe results of the determination of the claimed method Воспроизводимость (коэффициент отклонений)Reproducibility (deviation coefficient) Не более 15%No more than 15% 5-10%5-10% Предел обнаружения MUC1 антигенаMUC1 antigen detection limit   2±0,1 нг/мл2 ± 0.1 ng / ml ЛинейностьLinearity 90-110%90-110% 95-110%95-110% % открытия% discoveries 90-110%90-110% 95-115%95-115%

Иммуноспецифическая характеристика панели моноклональных антител к MUC1.Immunospecific characteristics of the panel of monoclonal antibodies to MUC1.

Mab M3F1 и М3В11 получают в результате гибридизации нормальных лимфоцитов иммунизированной мыши (Balb/c) с клетками миеломы (P3/X63-Ag8) и характеризуют по способности связываться с природным муцином, выделенным из молока (MUC1), рекомбинантным полипептидом VNTR, гипо- и дегликозилированным муцином - deMUC1 (остаточное содержание углеводов <1%; содержание сиаловых кислот - 1%), а также нативным муцином опухолевой клеточной линии карциномы человека Т47 D.Mab M3F1 and M3B11 are obtained by hybridization of normal immunized mouse lymphocytes (Balb / c) with myeloma cells (P3 / X63-Ag8) and are characterized by their ability to bind to natural mucin isolated from milk (MUC1), recombinant VNTR polypeptide, hypo- and by deglycosylated mucin - deMUC1 (residual carbohydrate content <1%; sialic acid content - 1%), as well as native mucin of the T47 D human carcinoma cell line.

Штаммы - продуценты моноклональных антител ВКПМ Н-97 (M3F1) и ВКПМ Н-98 (М3В11) депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. (Заявка на патент РФ 2006130857 и 2006130858, соответственно).Strains - producers of monoclonal antibodies VKPM N-97 (M3F1) and VKPM N-98 (M3B11) were deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms. (RF patent application 2006130857 and 2006130858, respectively).

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами. Фиг.1. Стандартная кривая определения количества антигена MUC1 заявляемым способом.The invention is illustrated by the following figures. Figure 1. The standard curve for determining the amount of MUC1 antigen of the claimed method.

Фиг.2. Распределение уровней онкомаркера (MUC1, нг/мл) среди доноров и больных при определении заявляемым способом.Figure 2. The distribution of tumor marker levels (MUC1, ng / ml) among donors and patients when determined by the claimed method.

Фиг.3. ROC кривые для заявляемого способа (обследован 71 больной с первичным диагнозом РМЖ II-III стадий) и Enzymun-Test СА 15.3 (обследовано 77 больных II-III стадий РМЖ).Figure 3. ROC curves for the proposed method (71 patients with a primary diagnosis of stage II-III breast cancer were examined) and Enzymun-Test CA 15.3 (77 patients with stage II-III breast cancer were examined).

Пример 1. Получение конъюгата Mab МЗВ11 с пероксидазой хрена.Example 1. Obtaining conjugate Mab MZB11 with horseradish peroxidase.

2-4 мг пероксидазы хрена (Amressco, conjugation grad, USA) подвергают окислению периодатом натрия и объединяют с диализованными Mab М3В11 в соотношении 1:2 (J.Histochem.Cytochem, 1974, 22, 1084). Реакцию останавливают тетраборатом натрия (4 мг/мл при 4°С). Полученный пероксидазный конъюгат диализуют против фосфатного буфера рН 7,4 и подвергают высаливанию насыщенным раствором сульфата аммония. Взвесь центрифугируют 20 мин при 5000g и растворяют осадок в боратном буфере (рН 8,0). Конъюгат хранят при 0°С после добавления глицерина в соотношении 1:1. Рабочее разведение полученного пероксидазного конъюгата составляет 1:2500.2-4 mg of horseradish peroxidase (Amressco, conjugation grad, USA) is oxidized with sodium periodate and combined with dialyzed Mab M3B11 in a 1: 2 ratio (J. Histochem. Kytochem, 1974, 22, 1084). The reaction was stopped with sodium tetraborate (4 mg / ml at 4 ° C). The resulting peroxidase conjugate was dialyzed against a pH 7.4 phosphate buffer and salted out with a saturated solution of ammonium sulfate. The suspension is centrifuged for 20 min at 5000 g and the residue is dissolved in borate buffer (pH 8.0). The conjugate is stored at 0 ° C after adding glycerol in a ratio of 1: 1. Working dilution of the obtained peroxidase conjugate is 1: 2500.

Пример 2. Получение стандарта антигена MUC1.Example 2. Obtaining a standard antigen MUC1.

MUC1 получают из жировых глобул человеческого молока методом иммуноаффинной хроматографии на бромциан сефарозе 4 В (Sigma, США), конъюгированной со специфичными к MUC1 Mab (М4С4), с последующей элюацией 0,1 М глицином (модификация метода Burshell J.et al./Cancer Invest., 1989, 17, 53-61). Полученный антиген MUC1 хранят в лиофилизированном виде с концентрацией 5 мг/мл при 4 С° или в виде готового к использованию раствора с добавлением консерванта (0,2% тимеросала).MUC1 is obtained from human milk fat globules by immuno-affinity chromatography on 4 B bromocyanine sepharose (Sigma, USA) conjugated to MUC1-specific Mab (M4C4), followed by elution with 0.1 M glycine (modification of the Burshell method J.et al./Cancer Invest., 1989, 17, 53-61). The resulting MUC1 antigen is stored in a lyophilized form with a concentration of 5 mg / ml at 4 ° C or as a ready-to-use solution with the addition of a preservative (0.2% thimerosal).

1 нг полученного антигена MUC1 соответствует 2 U антигена СА 15.3 (где U - универсальная единица по международной классификации MUC1 антигена).1 ng of the obtained MUC1 antigen corresponds to 2 U antigen CA 15.3 (where U is the universal unit according to the international classification of MUC1 antigen).

Пример 3. Определение уровней MUC1 в сыворотках крови доноров и больных РМЖ II и III стадий. Расчет cutoff.Example 3. Determination of levels of MUC1 in the blood serum of donors and patients with breast cancer stage II and III. Calculation of cutoff.

Исследовано 111 образцов сывороток. Из них 41 сыворотка здоровых женщин, 52 - больных РМЖ II стадии, 18 - больных РМЖ III стадии. Объем выборки нормальных и патологических сывороток определяют по формулам, исходя из заданных величин специфичности и чувствительности метода (The ELISA Guidebook, pp.301-394 in «Methods in Molecular Biology» (v. 149), Humana Press, 2000).111 serum samples were studied. Of these, 41 are serum from healthy women, 52 from stage II breast cancer patients, 18 from stage III breast cancer patients. The sample size of normal and pathological sera is determined by the formulas based on the specified values of the specificity and sensitivity of the method (The ELISA Guidebook, pp. 301-394 in "Methods in Molecular Biology" (v. 149), Humana Press, 2000).

Содержание MUC1 в сыворотках здоровых женщин при определении заявляемым способом колеблется от 3,5 до 16 нг/мл, а в отдельных случаях достигает и 20 нг/мл. Среднее статистическое содержание антигена MUC1 в норме равно 10 нг/мл со стандартным отклонением 3,5 (р=0,95).The content of MUC1 in the sera of healthy women, when determined by the claimed method, ranges from 3.5 to 16 ng / ml, and in some cases reaches 20 ng / ml. The average statistical content of the MUC1 antigen is normally 10 ng / ml with a standard deviation of 3.5 (p = 0.95).

Для выбора величины cutoff использован графический метод (The ELISA Guidebook, pp.301-394 in «Methods in Molecular Biology» (v. 149), Humana Press, 2000; Radiology, 2003, 228: 3-9).The graphic method was used to select the cutoff value (The ELISA Guidebook, pp. 301-394 in "Methods in Molecular Biology" (v. 149), Humana Press, 2000; Radiology, 2003, 228: 3-9).

Результаты определения уровня MUC1 в сыворотках крови больных РМЖ и здоровых доноров представляют в виде диаграммы (Фиг.2), где: ось X - отражает интервалы содержания антигена в сыворотке от 5 до 40 нг, а ось Y - количество образцов сывороток, содержание MUC1 антигена в которых соответствует этому интервалу. Величину cutoff определяют путем проведения вертикальной черты через точку пересечения двух массивов: области сосредоточения нормальных и патологических сывороток. Таким образом, cutoff в заявляемом способе определения онкомаркера лежит в пределах 10-15 нг/мл.The results of determining the level of MUC1 in the blood serum of breast cancer patients and healthy donors are presented in the form of a diagram (Figure 2), where: the X axis represents the intervals of serum antigen content from 5 to 40 ng, and the Y axis represents the number of serum samples, the antigen MUC1 content in which corresponds to this interval. The cutoff value is determined by drawing a vertical line through the intersection point of two arrays: the concentration area of normal and pathological sera. Thus, the cutoff in the claimed method for determining the tumor marker lies in the range of 10-15 ng / ml.

Cutoff 1 равен 15 нг/мл, что совпадает с величиной данного параметра у ближайшего аналога (30 U MUC1/мл, 1 нг=2 U). Уровень антигена MUC1 ниже cutoff1 имеют 93% протестированных доноров. 56% больных РМЖ II и III стадии имеют уровень онкомаркера выше cutoff1.Cutoff 1 is 15 ng / ml, which coincides with the value of this parameter for the nearest analogue (30 U MUC1 / ml, 1 ng = 2 U). MUC1 antigen levels below cutoff1 have 93% of the tested donors. 56% of patients with breast cancer stage II and III have a tumor marker level higher than cutoff1.

Для снижения доли ложнонегативных результатов, что принципиально важно при первичной диагностике онкологических заболеваний, применяют cutoff 2, равный 12 нг/мл (фиг.2). 63% больных РМЖ II и III стадии имеют уровень онкомаркера выше cutoff 2 и доля ложноотрицательных результатов диагностики РМЖ снижается на 7%.To reduce the share of false negative results, which is fundamentally important in the initial diagnosis of cancer, apply cutoff 2, equal to 12 ng / ml (figure 2). 63% of stage II and III breast cancer patients have a tumor marker level higher than cutoff 2 and the proportion of false-negative breast cancer diagnosis results is reduced by 7%.

Пример 4. Расчет параметров диагностической эффективности заявляемого способа в зависимости от cutoff 1 и 2.Example 4. The calculation of the parameters of the diagnostic effectiveness of the proposed method depending on cutoff 1 and 2.

На основании результатов количественного определения MUC1 онкомаркера в сыворотках здоровых и больных РМЖ проводят расчет чувствительности, специфичности и других параметров эффективности заявляемого способа (табл.2) (The ELISA Guidebook, pp.301-394 in «Methods in Molecular Biology» (v. 149), Humana Press, 2000).Based on the results of the quantitative determination of the tumor marker MUC1 in the sera of healthy and breast cancer patients, the sensitivity, specificity and other parameters of the effectiveness of the proposed method are calculated (Table 2) (The ELISA Guidebook, pp. 301-394 in “Methods in Molecular Biology” (v. 149 ), Humana Press, 2000).

50% сывороток больных II и 67% III стадии РМЖ имеют уровень онкомаркера выше cutoff 1. Чувствительность диагностики на II стадии РМЖ повышают до 61% путем использования cutoff 2.50% of the sera of patients of stage II breast cancer have a tumor marker level higher than cutoff 1. The sensitivity of diagnosis in stage II breast cancer is increased to 61% by using cutoff 2.

При диагностике РМЖ II и III стадий независимо от выбранного cutoff эффективность заявляемого способа в несколько раз выше, чем у ближайшего аналога.When diagnosing breast cancer of stages II and III, regardless of the selected cutoff, the effectiveness of the proposed method is several times higher than that of the closest analogue.

Сопоставление эффективности заявляемого способа диагностики и ближайшего аналога (Enzymun-Test СА 15.3) при РМЖ проводят также путем построения ROC кривых (Radiology, 2003, 228: 3-9), исходя из того, что, чем больше площадь под кривой, тем выше диагностическая эффективность метода. По оси X на фиг.3 - величина (1 - специфичность) при cutoff от 5 до 30 нг/мл, по оси Y - чувствительность ИФА тест-системы при заданных параметрах cutoff и специфичности. Для сопоставления использована ROC-кривая ближайшего аналога по опубликованным данным (Clincal.Chemistry, 1997, 43: 4, 585-593). Заявляемый способ определения онкомаркера MUC1 является более эффективным, чем ближайший аналог, так как при специфичности не менее 70% обладает более высокой, чем ближайший аналог чувствительностью (75% и 40%, соответственно) (фиг.3)A comparison of the effectiveness of the proposed diagnostic method and the closest analogue (Enzymun-Test CA 15.3) for breast cancer is also carried out by constructing ROC curves (Radiology, 2003, 228: 3-9), based on the fact that the larger the area under the curve, the higher the diagnostic effectiveness of the method. On the X axis in FIG. 3 - value (1 - specificity) with cutoff from 5 to 30 ng / ml, on the Y axis - sensitivity of the ELISA of the test system for the specified cutoff and specificity parameters. For comparison, we used the ROC curve of the closest analogue according to published data (Clincal.Chemistry, 1997, 43: 4, 585-593). The inventive method for determining the tumor marker MUC1 is more effective than the closest analogue, since with a specificity of at least 70% it has a higher sensitivity than the nearest analogue (75% and 40%, respectively) (Fig. 3)

Табл.2.Table 2. ИФА системаIFA system Cutoff (а)Cutoff (a) Se, % (b)Se,% (b) Sp, % (с)Sp,% (s) А, % (d)A,% (d) В, % (е)B,% (e) Е, % (f)E,% (f) M3F1/M3B11M3F1 / M3B11 15 нг/мл15 ng / ml 5656 9393 9191 6161 7272   12 нг/мл12 ng / ml 6363 8383 8383 6464 7272 Enzymun-Test СА 15.3Enzymun-Test CA 15.3 30 U/мл30 U / ml 13,413,4 93,993.9 8080 35,835.8 40,440,4 (a) - уровень MUC1 антигена у здоровых доноров;
(b) - чувствительность диагностики;
(c) - специфичность диагностики;
(d) - доля больных с установленным диагнозом, имеющих аналогичный диагноз при определении указанным методом;
(e) - доля здоровых, имеющих отрицательный результат при определении указанным методом;
(f) - коэффициент эффективности диагностического метода.(a) the level of MUC1 antigen in healthy donors;
(b) - diagnostic sensitivity;
(c) - specificity of the diagnosis;
(d) the proportion of patients with an established diagnosis who have a similar diagnosis when determined by the indicated method;
(e) - the proportion of healthy people who have a negative result when determined by the specified method;
(f) is the coefficient of efficiency of the diagnostic method.

Для заявляемого способа отмечают:For the proposed method note:

- более высокую точность положительных (А) и отрицательных (В) результатов теста (83-91% и 61-64%, вместо 80% и 36% у ближайшего аналога, соответственно);- higher accuracy of positive (A) and negative (B) test results (83-91% and 61-64%, instead of 80% and 36% for the closest analogue, respectively);

- в 2 раза более высокий коэффициент эффективности диагностики (Е), то есть корректной классификации больных и здоровых;- 2 times higher diagnostic efficiency coefficient (E), that is, the correct classification of patients and healthy;

увеличение специфичности способа до 93% и снижение доли ложноотрицательных результатов при прогнозировании рецидивов и метастазирования в случае использования cutoff 1;an increase in the specificity of the method to 93% and a decrease in the share of false negative results in predicting relapse and metastasis in the case of using cutoff 1;

- увеличение чувствительности способа до 63% в случае использования cutoff 2 при первичной диагностике II и III стадий РМЖ.- an increase in the sensitivity of the method to 63% in the case of using cutoff 2 in the primary diagnosis of stages II and III of breast cancer.

Из представленных данных следует, что заявляемый способ определения MUC1 онкомаркера в сыворотке крови человека обладает высокой диагностической эффективностью, позволяя при использовании его в клинической практике выявить 56-63% больных в процессе первичной диагностики РМЖ II и III стадий, мониторинга рецидивов заболевания и оценки эффективности терапии при установленном диагнозе.From the presented data it follows that the claimed method for determining the MUC1 tumor marker in human serum has a high diagnostic efficiency, allowing using it in clinical practice to identify 56-63% of patients in the primary diagnosis of breast cancer of the II and III stages, monitoring relapse of the disease and evaluating the effectiveness of therapy with a diagnosis.

Claims (1)

Способ количественного определения онкомаркера MUC1 в сыворотке крови человека в формате прямого твердофазного двухсайтового иммунофотометрического анализа с применением тест-системы из двух моноклональных антител, взаимодействующих с онкомаркером сыворотки крови, а в контроле со стандартом онкомаркера, отличающийся тем, что в качестве тест-системы используют пару моноклональных антител M3F1/M3B11, для выявления образовавшихся комплексов антиген-антитело используют Mab-пероксидазный коньюгат с последующим введением красителя ТМБ, а в качестве стандарта онкомаркера выделенный из жировых глобул молока человека антиген MUC1.A method for the quantitative determination of the MUC1 tumor marker in human blood serum in the format of a direct solid-phase two-site immunophotometric analysis using a test system of two monoclonal antibodies interacting with the blood serum tumor marker, and in the control with the tumor marker standard, characterized in that a couple is used as a test system monoclonal antibodies M3F1 / M3B11; to detect the formed antigen-antibody complexes, a Mab-peroxidase conjugate is used, followed by the introduction of TMB dye, and stve standard tumor marker isolated from human milk fat globule antigen MUC1.

Images