RU2333949C2 - STRAINS OF BACTERIA Bacillus subtilis AND Bacillus amyloliquefaciens - PRODUCENTS OF INOSINE AND METHOD FOR PRODUCING INOSINE USING THEM - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. Inosine is obtained by means of fermentation method which includes growing becteria - producents of inosine in nutritional medium and its isolation from culture broth. As producents mutant strains of bacteria Bacillus subtilis " ВКПМ-8998" and Bacillus amyloliquefaciens "ВКПМ-9789" are used, which are resistant to inhibition of growth by 3,4-dehydro-DL-proline. The obtained mutant strains and the claimed method allow producing inosine with high yield.

EFFECT: elaboration of method for producing inosine with high yield.

3 cl, 3 tbl, 3 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к способу получения пуриновых нуклеозидов, таких как инозин, ксантозин и гуанозин, которые являются важными исходными реагентами для синтеза инозин-5'-фосфата, ксантозин-5'-фосфата и гуанин-5'-фосфата, и к новому микроорганизму, используемому для их продукции.The present invention relates to a method for producing purine nucleosides, such as inosine, xanthosine and guanosine, which are important starting materials for the synthesis of inosine-5'-phosphate, xanthosine-5'-phosphate and guanine-5'-phosphate, and to a new microorganism, used for their products.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Традиционно пуриновые нуклеозиды (инозин, гуанозин, ксантозин) получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов, ауксотрофных по аденину, или этих же штаммов, которым в дальнейшем была придана устойчивость к различным соединениям, таким как пуриновые аналоги, сульфасоединения, аналоги метионина, антифолатные и полимиксиновые соединения и которые принадлежат либо к роду Bacillus (опубликованные патентные заявки Японии №38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980) и 55-45199 (1980), выложенные патентные заявки Японии №56-162998 (1981), опубликованные патентные заявки Японии №57-14160 (1982) и 57-41915 (1982), выложенные патентные заявки Японии №59-42895 (1984), патентная заявка РФ №2002103333), либо к роду Brevibacterium (опубликованная патентная заявка Японии №51-5075 (1976) и 58-17592 (1972) и Agric.Biol.Chem., 42, 399 (1978)), либо к роду Escherichia (заявка РСТ W 09903988) и подобные им.Traditionally, purine nucleosides (inosine, guanosine, xanthosine) are produced on an industrial scale by fermentation using strains auxotrophic for adenine, or the same strains, which were later given resistance to various compounds, such as purine analogues, sulfonates, methionine analogs, anti-folate and polymyxin compounds and which belong either to the genus Bacillus (published Japanese patent applications No. 38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980) and 55-45199 (1980), Japanese patent applications laid out No. 56 -162998 (1981), published Japanese patent applications No. 57-14160 (1982) and 57-41915 (1982), Japanese patent applications laid out No. 59-42895 (1984), RF patent application No. 2002103333), or to the genus Brevibacterium (published Japanese patent application No. 51- 5075 (1976) and 58-17592 (1972) and Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), or to the genus Escherichia (PCT application W 09903988) and the like.

Получение указанных мутантных штаммов обычно состоит из обработки микроорганизмов мутагенными дозами ионизирующего излучения (УФ-излучение, рентгеновское излучение, гамма-излучение) и отбора нужного штамма с использованием соответствующей среды для селекции.Obtaining these mutant strains usually consists of treating microorganisms with mutagenic doses of ionizing radiation (UV radiation, X-ray radiation, gamma radiation) and selecting the desired strain using an appropriate selection medium.

Добавление L-пролина в среду для ферментации усиливало продукцию инозинмонофосфата (ИМФ) штаммом-продуцентом ИМФ Corynebacterium ammoniagenes (Agr. Biol. Chem., 55, 2221-2225, (1991)). Более того, мутантные штаммы, устойчивые к 3,4-дегидро-DL-пролину, и, как предполагается, содержащие гамма-глутамилкиназу (первый фермент пути биосинтеза L-пролина), устойчивую к ингибированию L-пролином по принципу обратной связи, обладают более высокой продуктивностью ИМФ.The addition of L-proline to the fermentation medium enhanced the production of inosine monophosphate (IMP) by the producer strain IMP Corynebacterium ammoniagenes (Agr. Biol. Chem. 55, 2221-2225, (1991)). Moreover, mutant strains that are resistant to 3,4-dehydro-DL-proline and are believed to contain gamma-glutamyl kinase (the first enzyme of the L-proline biosynthesis pathway), which is resistant to feedback by L-proline inhibition, have more high productivity IMP.

Увеличение продуктивности мутантных штаммов коррелировало с ростом концентрации L-пролина внутри клетки (Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1347-1348, (1992)).An increase in the productivity of mutant strains correlated with an increase in the concentration of L-proline inside the cell (Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1347-1348, (1992)).

Способ продукции 5'-инозиновой кислоты штаммами Corynebacterium ammoniagenes, устойчивыми к 3,4-дегидро-DL-пролину, раскрыт (патентная заявка США 20030054504 А1).A method for the production of 5'-inosinic acid by Corynebacterium ammoniagenes strains resistant to 3,4-dehydro-DL-proline is disclosed (US Patent Application 20030054504 A1).

Способ продукции 5'-ксантиловой кислоты штаммами Corynebacterium ammoniagenes, устойчивыми к 3,4-дегидро-DL-пролину, также раскрыт (патентная заявка США 20030148498 А1).A method of producing 5'-xanthyl acid by Corynebacterium ammoniagenes strains resistant to 3,4-dehydro-DL-proline is also disclosed (US Patent Application 20030148498 A1).

Способ получения рибофлавина штаммами Bacillus subtilis, устойчивым к аналогам пролина, таким как 3,4-дегидро-DL-пролин, раскрыт (патентная заявка США 20040110249 А1).A method for producing riboflavin by Bacillus subtilis strains resistant to proline analogs such as 3,4-dehydro-DL-proline is disclosed (US Patent Application 20040110249 A1).

Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо сообщения об использовании бактерий, принадлежащих к роду Bacillus и устойчивых к 3,4-дегидро-DL-пролину, для получения пуриновых нуклеозидов, таких как инозин, ксантозин и гуанозин.However, there are currently no reports of the use of bacteria belonging to the genus Bacillus and resistant to 3,4-dehydro-DL-proline for the production of purine nucleosides such as inosine, xanthosine and guanosine.

Описание изобретенияDescription of the invention

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности пуриновых нуклеозидов штаммами-продуцентами пуриновых нуклеозидов и предоставление способа получения пуриновых нуклеозидов, например инозина или гуанозина, с использованием указанных штаммов.The aim of the present invention is to increase the productivity of purine nucleosides by producer strains of purine nucleosides and to provide a method for producing purine nucleosides, for example, inosine or guanosine, using these strains.

Для достижения этой цели авторы настоящего изобретения изучали бактерии-продуценты инозина и установили, что микроорганизмы, принадлежащие к роду Bacillus и несущие мутацию, которая придает бактериальной клетке устойчивость к 3,4-дегидро-DL-пролину, продуцируют и накапливают значительно большее количество пуриновых нуклеозидов в среде. Ранее не было общепризнанным, что продуктивность пуриновых нуклеозидов может быть улучшена в результате наделения микроорганизмов-продуцентов пуриновых нуклеозидов такими свойствами.To achieve this goal, the authors of the present invention studied the bacteria producing inosine and found that microorganisms belonging to the genus Bacillus and carrying a mutation that gives the bacterial cell resistance to 3,4-dehydro-DL-proline, produce and accumulate significantly more purine nucleosides in the environment. It was previously not universally recognized that the productivity of purine nucleosides can be improved as a result of endowing microorganisms producing purine nucleosides with such properties.

Поэтому для завершения настоящего изобретения работа была продолжена на основании этого наблюдения.Therefore, to complete the present invention, work was continued based on this observation.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus и обладающий повышенной способностью к продукции пуринового нуклеозида.Thus, the present invention provides a microorganism belonging to the genus Bacillus and having an increased ability to produce purine nucleoside.

В частности, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, чья способность продуцировать пуриновый нуклеозид улучшена за счет мутации, придающей клеткам устойчивость к 3,4-дегидро-DL-пролину.In particular, the present invention provides a microorganism whose ability to produce a purine nucleoside is improved by a mutation that confers resistance to 3,4-dehydro-DL-proline cells.

Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуринового нуклеозида методом ферментации, включающей культивирование вышеупомянутого микроорганизма в питательной среде с целью продукции и накопления пуринового нуклеозида в среде и сбор пуринового нуклеозида.Further, the present invention provides a method for producing purine nucleoside by a fermentation method, comprising culturing the aforementioned microorganism in a nutrient medium for the purpose of production and accumulation of purine nucleoside in the medium and collecting purine nucleoside.

ОПИСАНИЕ НАИБОЛЕЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE MOST PREFERRED EMBODIMENTS FOR CARRYING OUT THE INVENTION

Настоящее изобретение подробно описывается ниже.The present invention is described in detail below.

(1) Бактерия-продуцент пуринового нуклеозида принадлежит к роду Bacillus.(1) The purine nucleoside producing bacterium belongs to the genus Bacillus.

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент пуринового нуклеозида, принадлежащая к роду Bacillus и обладающая устойчивостью к 3,4-дегидро-DL-пролину.The bacterium of the present invention is a purine nucleoside producing bacterium belonging to the genus Bacillus and resistant to 3,4-dehydro-DL-proline.

Термин "бактерия-продуцент пуринового нуклеозида" означает бактерию, которая обладает способностью к продукции и выделению в питательную среду значительного количества пуринового нуклеозида в процессе выращивания бактерии в среде. Обычно это означает способность к накоплению не менее чем 50 мг/л пуринового нуклеозида в среде, предпочтительно не менее чем 0,5 г/л пуринового нуклеозида в условиях, описанных в Примерах (см. ниже).The term “purine nucleoside producing bacterium” means a bacterium which is capable of producing and releasing a significant amount of purine nucleoside into the nutrient medium during the growth of the bacterium in the medium. Usually this means the ability to accumulate not less than 50 mg / l of purine nucleoside in the medium, preferably not less than 0.5 g / l of purine nucleoside under the conditions described in the Examples (see below).

Термин "пуриновый нуклеозид", используемый здесь, включает инозин, ксантозин, аденозин и гуанозин.The term “purine nucleoside” as used herein includes inosine, xanthosine, adenosine and guanosine.

Термин "бактерия принадлежит к роду Bacillus" означает, что бактерия классифицируется как род Bacillus согласно классификации, известной специалисту в области микробиологии. Примерами микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus, использованного в настоящем изобретении, являются Bacillus subtilis (В. subtilis) и Bacillus amyloliquefaciens (В. amyloliquefaciens), но не ограничивается ими.The term "bacterium belongs to the genus Bacillus" means that the bacterium is classified as a genus Bacillus according to the classification known to the specialist in the field of microbiology. Examples of a microorganism belonging to the genus Bacillus used in the present invention are, but are not limited to, Bacillus subtilis (B. subtilis) and Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, включают, но не ограничиваются ими, штамм Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC 6051), штамм Bacillus subtilis PY79 (Plasmid, 1984, 12, 1-9) и так далее, а примеры Bacillus amyloliquefaciens включают, но не ограничиваются ими, штамм Bacillus amyloliquefaciens Т (ATCC 23842), штамм Bacillus amyloliquefaciens N (ATCC 23845) и так далее.Examples of bacteria belonging to the genus Bacillus include, but are not limited to, the Bacillus subtilis 168 Marburg strain (ATCC 6051), the Bacillus subtilis PY79 strain (Plasmid, 1984, 12, 1-9) and so on, and the examples of Bacillus amyloliquefaciens include, but not limited to, Bacillus amyloliquefaciens T strain (ATCC 23842), Bacillus amyloliquefaciens N strain (ATCC 23845), and so on.

Термин "бактерия, обладающая устойчивостью к ингибированию роста 3,4-дегидро-DL-пролином" означает бактерию, полученную из родительского штамма и обладающую генетическими свойствами, модифицированными таким образом, что она может расти в питательной среде, содержащей в своем составе 3,4-дегидро-DL-пролин. Твердая среда является предпочтительной.The term "bacterium resistant to growth inhibition of 3,4-dehydro-DL-proline" means a bacterium obtained from the parent strain and having genetic properties modified so that it can grow in a nutrient medium containing 3.4 dehydro-DL-proline. A solid medium is preferred.

Бактерия, принадлежащая к роду Bacillus, может быть также получена путем придания способности к продукции пуринового нуклеозида бактерии, модифицированной таким образом, что ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином снижено, что приводит к улучшению способности к продукции пуринового нуклеозида.A bacterium belonging to the genus Bacillus can also be obtained by imparting the ability to produce a purine nucleoside to a bacterium modified in such a way that the growth inhibition of 3,4-dehydro-DL-proline is reduced, which leads to an improvement in the ability to produce purine nucleoside.

Бактерия, которая обладает устойчивостью к подавлению роста 3,4-дегидро-DL-пролином, проявляет лучшие ростовые качества по сравнению с родительским штаммом, когда культивируется в среде, содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин. Например, бактерия, которая может образовывать колонии в течение 40 часов культивирования при температуре 34°С в чашках с минимальной средой М9, содержащей 0,4 г/л или более, предпочтительно 1,6 г/л 3,4-дегидро-DL-пролина, может считаться устойчивой к 3,4-дегидро-DL-пролину.The bacterium, which is resistant to growth suppression by 3,4-dehydro-DL-proline, exhibits better growth qualities compared to the parent strain when cultured in a medium containing 3,4-dehydro-DL-proline. For example, a bacterium that can colonize within 40 hours of cultivation at 34 ° C in plates with a minimum M9 medium containing 0.4 g / l or more, preferably 1.6 g / l 3,4-dehydro-DL- proline can be considered resistant to 3,4-dehydro-DL-proline.

Вдобавок к уже упомянутым свойствам, бактерия может обладать другими специфическими свойствами, такими как потребность в различных питательных добавках, устойчивость или чувствительность к химическим реагентам и зависимость от химических соединений, не выходя при этом за границы настоящего изобретения.In addition to the properties already mentioned, a bacterium may possess other specific properties, such as the need for various nutritional supplements, resistance or sensitivity to chemicals, and dependence on chemicals, without going beyond the scope of the present invention.

Мутантные микроорганизмы, используемые в осуществлении настоящего изобретения, могут быть получены с помощью воздействия обычных мутагенных факторов, таких как УФ-облучение, рентгеновское облучение, радиоактивное облучение и обработки химическими мутагенами с последующим отбором методом реплик. Предпочтительным мутагеном является N-нитро-N'-метил-N-нитрозогуанидин (здесь и далее обозначается как НТГ).Mutant microorganisms used in the practice of the present invention can be obtained by exposure to common mutagenic factors such as UV irradiation, X-ray irradiation, radioactive irradiation and treatment with chemical mutagens, followed by selection using the replica method. A preferred mutagen is N-nitro-N'-methyl-N-nitrosoguanidine (hereinafter referred to as NTG).

Примеры способов выведения бактерии, принадлежащей к роду Bacillus и обладающей способностью к продукции пуринового нуклеозида, включают следующие способы. Например, способы, предусматривающие усиление внутриклеточной активности фермента, включенного в биосинтез пуринового нуклеозида (патентная заявка США 2004-0166575). Выражение "усиление внутриклеточной активности" означает усиление активности до уровня, более высокого, чем уровень в немодифицированной бактерии рода Bacillus, такой как дикий штамм бактерии Bacillus. Примеры включают, но не ограничиваются только ими, увеличение количества молекул фермента на одну клетку, усиление специфической активности на одну молекулу фермента и так далее.Examples of methods for removing a bacterium belonging to the genus Bacillus and having the ability to produce purine nucleoside include the following methods. For example, methods involving enhancing the intracellular activity of an enzyme included in the purine nucleoside biosynthesis (US patent application 2004-0166575). The expression "increased intracellular activity" means an increase in activity to a level higher than the level in unmodified bacteria of the genus Bacillus, such as a wild strain of the bacterium Bacillus. Examples include, but are not limited to, increasing the number of enzyme molecules per cell, enhancing specific activity per enzyme molecule, and so on.

Примеры фермента, участвующего в биосинтезе пуринового нуклеозида, включают, например, фосфорибозилпирофосфат (ФРПФ) амидотрансферазу, фосфорибозилпирофосфат (ФРПФ) синтетазу, аденозиндеаминазу и так далее.Examples of an enzyme involved in the purine nucleoside biosynthesis include, for example, phosphoribosyl pyrophosphate (FRPF) amidotransferase, phosphoribosyl pyrophosphate (FRPF) synthetase, adenosine deaminase, and so on.

Кроме того, примеры включают также снятие регуляции фермента, участвующего в биосинтезе инозина, особенно метод снятия ингибирования такого фермента по принципу обратной связи (WO 99/03988). Примеры способов снятия регуляции такого фермента, как отмечалось выше, участвующих в биосинтезе пуринового нуклеозида, включают, например, делецию пуринового репрессора (патент США №6284495). Примеры метода делеции пуринового репрессора включают метод разрушения гена, кодирующего пуриновый репрессор (purR, GenBank Accession No.Z99104).In addition, examples also include deregulation of an enzyme involved in the inosine biosynthesis, especially a feedback feedback inhibition method for such an enzyme (WO 99/03988). Examples of methods for deregulating such an enzyme, as noted above, involved in the purine nucleoside biosynthesis include, for example, a purine repressor deletion (US Pat. No. 6,284,495). Examples of a purine repressor deletion method include a method for destroying a gene encoding a purine repressor (purR, GenBank Accession No. Z99104).

Кроме того, способность к продукции пуринового нуклеозида может также быть усилена путем блокирования реакции, ответвляющейся от пути биосинтеза инозина и приводящей к другому метаболическому продукту (WO 99/03988). Примеры реакции ответвления от пути биосинтеза пуринового нуклеотида, приводящей к другому метаболическому продукту, включают реакции, катализируемые, к примеру, сукцинил-аденозин монофосфат (АМФ) синтетазой, инозин-гуанозинкиназой, 6-фосфоглюконатдегидразой, фосфоглюкоизомеразой и так далее. Сукцинил-аденозин монофосфат (АМФ) синтетаза кодируется геном purA (GenBank Accession No.Z99104).In addition, the ability to produce a purine nucleoside can also be enhanced by blocking a reaction that branches off from the inosine biosynthesis pathway and leads to another metabolic product (WO 99/03988). Examples of a branch reaction from a purine nucleotide biosynthesis pathway leading to a different metabolic product include reactions catalyzed, for example, by succinyl adenosine monophosphate (AMP) synthetase, inosine guanosine kinase, 6-phosphogluconate dehydrase, phosphoglucoisomerase, and the like. Succinyl Adenosine Monophosphate (AMP) synthetase is encoded by the purA gene (GenBank Accession No. Z99104).

Кроме того, способность к продукции пурина может быть также усилена путем снижения или удаления активности, вызывающей деградацию пуринового нуклеозида (WO 99/03998). Примеры такого метода снижения или удаления активности, вызывающей деградацию пуринового нуклеозида, включают метод разрушения гена, кодирующего фосфорилазу пуринового нуклеозида (ген deoD).In addition, the ability to produce purine can also be enhanced by reducing or removing activity that causes degradation of purine nucleoside (WO 99/03998). Examples of such a method of reducing or removing the activity causing degradation of a purine nucleoside include a method of destroying a gene encoding a purine nucleoside phosphorylase (deoD gene).

Таким образом, возможно подвергнуть любой известный штамм, принадлежащий к роду Bacillu и уже обладающий способностью к продукции пуринового нуклеозида, одной из вышеперечисленных процедур мутагенеза для получения мутантного штамма и затем протестировать мутантный штамм для того, чтобы определить, удовлетворяет ли он вышеперечисленным требованиям настоящего изобретения, касающегося устойчивости к подавлению роста 3,4-дегидро-DL-пролином, и поэтому пригодным для использования в настоящем изобретении. Полученные штаммы отбираются в процессе выращивания в питательной среде и штаммы, обладающие способностью к продукции пуринового нуклеозида в большем количестве, чем его родительский штамм, отбираются и используются в этом изобретении.Thus, it is possible to expose any known strain belonging to the genus Bacillu and already possessing the ability to produce purine nucleoside, one of the above mutagenesis procedures to obtain a mutant strain and then test the mutant strain in order to determine whether it satisfies the above requirements of the present invention, regarding resistance to growth suppression of 3,4-dehydro-DL-proline, and therefore suitable for use in the present invention. The resulting strains are selected in the process of growing in a nutrient medium and strains with the ability to produce purine nucleoside in larger quantities than its parent strain are selected and used in this invention.

Штаммы, удовлетворяющие требованиям настоящего изобретения, могут быть получены также с помощью техники генетической рекомбинации, которая хорошо известна специалисту в данной области техники.Strains that satisfy the requirements of the present invention can also be obtained using the genetic recombination technique, which is well known to a person skilled in the art.

Вышеупомянутые свойства устойчивости могут комбинироваться в одном штамме с помощью последовательной селекции или техники генетической рекомбинации.The aforementioned resistance properties can be combined in a single strain using sequential selection or genetic recombination techniques.

(2) Конкретные примеры бактерий, продуцирующих пуриновые нуклеозиды.(2) Specific examples of bacteria producing purine nucleosides.

В качестве примеров микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus и использованных в настоящем изобретении, должны быть отмечены Bacillus subtilis (В. subtilis), Bacillus amyloliquefaciens и подобные им. Типичными примерами штаммов, практически использованных в изобретении, являются Bacillus subtilis 43-142K (VKPM B-8998), Bacillus amyloliquefaciens 36-59H (VKPM B-8995). Штаммы Bacillus subtilis 43-142K и Bacillus amyloliquefaciens 36-59H были депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 марта 2005 года с регистрационными номерами VKPM B-8998 и VKPM B-8995,соответственно.As examples of microorganisms belonging to the genus Bacillus and used in the present invention, Bacillus subtilis (B. subtilis), Bacillus amyloliquefaciens and the like, should be noted. Typical examples of strains practically used in the invention are Bacillus subtilis 43-142K (VKPM B-8998), Bacillus amyloliquefaciens 36-59H (VKPM B-8995). The strains Bacillus subtilis 43-142K and Bacillus amyloliquefaciens 36-59H were deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on March 10, 2005 with registration numbers VKPM B-8998 and VKPM B -8995, respectively.

Бактерия, которую предполагается использовать для продукции пуринового нуклеозида в соответствии с настоящим изобретением, имеет те же бактериологические свойства, что и родительский штамм за исключением устойчивости к 3,4-дегидро-DL-пролин и способности продуцировать большее количество пуринового нуклеозида. Штаммы Bacillus subtilis 51-53H и Bacillus amyloliquefaciens 23-68H были депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 марта 2005 года с регистрационными номерами VKPM B-8997, VKPM B-8996, соответственно.The bacterium to be used for the production of purine nucleoside in accordance with the present invention has the same bacteriological properties as the parent strain, with the exception of resistance to 3,4-dehydro-DL-proline and the ability to produce more purine nucleoside. The strains Bacillus subtilis 51-53H and Bacillus amyloliquefaciens 23-68H were deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on March 10, 2005 with registration numbers VKPM B-8997, VKPM B -8996, respectively.

В качестве родительских штаммов, которые необходимо улучшить для получения бактерии, в настоящем изобретении могут быть использованы бактериальные штаммы-продуценты инозина, принадлежащие к роду Bacillus, такие как штамм Bacillus subtilis AJ12707 (FERM Р-12951) (патентная заявка Японии JP 6113876), штамм Bacillus subtilis AJ3772 (FERM-P 2555) (патентная заявка Японии JP 62014794), Bacillus pumilus NA-1102 (FERM BP-289), Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291), Bacillus amyloliquefaciens ("Bacillus subtilis") G 1136 A (ATCC No.19222) (патент США 3575809), Bacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292) (патент США 4701413), В. pumilis Gottheil No.3218 (ATCC No.21005) (патент США 3616206), штамм В. amyloliquefaciens AS 115-7 (VKPM B-6134) (патент РФ №2003678) или подобные им. Also the В. subtilis strain KMBS16 may be used. This strain is a derivative of the known B. subtilis 168 trpC2 strain having mutations introduced intopurR gene coding for a purine represser (purR::spc), purA gene coding for succinyl-AMP synthase (purA::erm), and deoD gene coding for purine nucleoside phosphorylase (deoD::kan) (Russian Patent application No 2002103333).As parent strains that need to be improved to obtain bacteria, bacterial inosine-producing strains belonging to the genus Bacillus can be used in the present invention, such as Bacillus subtilis strain AJ12707 (FERM P-12951) (Japanese Patent Application JP 6113876), strain Bacillus subtilis AJ3772 (FERM-P 2555) (Japanese patent application JP 62014794), Bacillus pumilus NA-1102 (FERM BP-289), Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291), Bacillus amyloliquefaciens ("Bacillus subtilis") G 1136 A (ATCC No.19222) (US Pat. No. 3,575,809), Bacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292) (US Pat. No. 4,701,413), B. pumilis Gottheil No.3218 (ATCC No. 211005) (US Pat. No. 3,616,206), B. Amyloliquefaciens AS 115-7 strain (VKPM B-613 4) (RF patent No. 2003678) or the like. Also the B. subtilis strain KMBS16 may be used. This strain is a derivative of the known B. subtilis 168 trpC2 strain having mutations introduced intopurR gene coding for a purine represser (purR :: spc), purA gene coding for succinyl-AMP synthase (purA :: erm), and deoD gene coding for purine nucleoside phosphorylase (deoD :: kan) (Russian Patent application No 2002103333).

(3) Метод придания бактериям рода Bacillus свойства снижать ингибирующее влияние 3,4-дегидро-DL-пролина.(3) A method of imparting properties to bacteria of the genus Bacillus to reduce the inhibitory effect of 3,4-dehydro-DL-proline.

Далее будет дано объяснение снижению ингибирующего влияния 3,4-дегидро-DL-пролина на рост бактерий рода Bacillus. Если в среде присутствует 3,4-дегидро-DL-пролин, то рост бактерий рода Bacillus ингибируется. Это означает, что если бактерии рода Bacillus культивируются в среде, содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин, то бактерии не будут расти или их рост замедлится по сравнению с бактериями, которые культивируются в среде, не содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин. В особенности, когда бактерии культивируются в твердой среде определенный период времени, диаметр колоний, к примеру, становится меньше в среде, содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин, по сравнению с диаметром колоний, наблюдаемых в среде, не содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин. С другой стороны, бактерии рода Bacillus согласно настоящему изобретению модифицированы таким образом, что вышеупомянутое ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином снижено.An explanation will be given below on the decrease in the inhibitory effect of 3,4-dehydro-DL-proline on the growth of bacteria of the genus Bacillus. If 3,4-dehydro-DL-proline is present in the medium, then the growth of bacteria of the genus Bacillus is inhibited. This means that if bacteria of the genus Bacillus are cultured in a medium containing 3,4-dehydro-DL-proline, then the bacteria will not grow or their growth will slow down compared to bacteria that are cultured in a medium containing 3,4-dehydro-DL DL proline. In particular, when bacteria are cultured in a solid medium for a certain period of time, the diameter of the colonies, for example, becomes smaller in a medium containing 3,4-dehydro-DL-proline, compared with the diameter of the colonies observed in a medium not containing 3.4 dehydro-DL-proline. On the other hand, the bacteria of the genus Bacillus according to the present invention are modified so that the aforementioned growth inhibition of 3,4-dehydro-DL-proline is reduced.

У таких бактерий рода Bacillus, модифицированных таким образом, что ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином снижено как описано выше, способность продуцировать пуриновые нуклеозиды улучшена по сравнению с немодифицированным штаммом. Поэтому свойство 3,4-дегидро-DL-пролина может быть применено для выращивания бактерий рода Bacillus, продуцирующих пуриновые нуклеозиды. То есть, бактерии рода Bacillus, обладающие улучшенной способностью продуцировать пуриновый нуклеозид, могут быть получены путем отбора штаммов, проявляющих удовлетворительные ростовые качества в среде, содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин, из популяции бактерий рода Bacillus и отбора из полученных штаммов штамма с высокой способностью к продукции пуринового нуклеозида.In such bacteria of the genus Bacillus, modified in such a way that growth inhibition by 3,4-dehydro-DL-proline is reduced as described above, the ability to produce purine nucleosides is improved compared to an unmodified strain. Therefore, the property of 3,4-dehydro-DL-proline can be used to grow bacteria of the genus Bacillus producing purine nucleosides. That is, bacteria of the Bacillus genus with improved ability to produce purine nucleoside can be obtained by selection of strains showing satisfactory growth qualities in a medium containing 3,4-dehydro-DL-proline from a population of bacteria of the genus Bacillus and selection from the obtained strain strains with high ability to produce purine nucleoside.

Бактерия рода Bacillus в настоящем изобретении может быть получена как мутантный штамм, выведенный из бактерии рода Bacillus, выступающей в качестве родительского штамма. Мутагенная обработка для получения такого мутантного штамма не ограничена каким-либо образом и примеры поэтому включают, но не ограничиваются, обработкой УФ-облучением или обработкой мутагенным агентом, используемым для обычной мутагенной обработки, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (НТГ) и азотистая кислота. Кроме того, могут быть также получены спонтанно-возникающие мутации.A bacterium of the genus Bacillus in the present invention can be obtained as a mutant strain derived from a bacterium of the genus Bacillus, acting as the parent strain. The mutagenic processing to produce such a mutant strain is not limited in any way and examples therefore include, but are not limited to, UV treatment or treatment with a mutagenic agent used for conventional mutagenic processing, such as N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine (NTG) and nitrous acid. In addition, spontaneously arising mutations can also be obtained.

Мутантный штамм, в котором ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином снижено, отбирается как штамм, проявляющий более успешные ростовые качества по сравнению с немодифицированным штаммом, например родительским штаммом, когда они культивируются в среде, содержащей, к примеру, 3,4-дегидро-DL-пролин. То есть, можно сказать, что у бактерии рода Bacillus в настоящем изобретении чувствительность к 3,4-дегидро-DL-пролину снижена или устойчивость к 3,4-дегидро-DL-пролину улучшена по сравнению с родительским штаммом.A mutant strain in which growth inhibition of 3,4-dehydro-DL-proline is reduced is selected as a strain exhibiting more successful growth qualities compared to an unmodified strain, for example, a parent strain, when they are cultured in a medium containing, for example, 3, 4-dehydro-DL-proline. That is, it can be said that in a bacterium of the genus Bacillus in the present invention, the sensitivity to 3,4-dehydro-DL-proline is reduced or the resistance to 3,4-dehydro-DL-proline is improved compared to the parent strain.

Примеры вышеупомянутой среды включают минимальные среды, но не ограничиваются ими. Примеры минимальных сред включают, в частности, минимальную среду М9 (Sambrook, J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).Examples of the above environment include, but are not limited to, minimal environments. Examples of minimal media include, in particular, M9 minimal media (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

В настоящем изобретении минимальная среда может содержать, если необходимо, питательные вещества, требующиеся для роста. Например, многие из инозинпродуцирующих бактериальных штаммов являются ауксотрофными по аденину, и поэтому аденин добавляется в среду в концентрации, необходимой для роста. Однако, если количество аденина слишком велико, продуктивность бактерии-продуцента инозина может быть снижена и поэтому количество аденина желательно ограничить. Более точно, концентрация около 0.1 г/л является предпочтительной.In the present invention, the minimal medium may contain, if necessary, the nutrients required for growth. For example, many of the inosin-producing bacterial strains are auxotrophic for adenine, and therefore adenine is added to the medium at the concentration necessary for growth. However, if the amount of adenine is too large, the productivity of the bacteria producing the inosine can be reduced, and therefore it is desirable to limit the amount of adenine. More specifically, a concentration of about 0.1 g / l is preferred.

Отбор целевого мутантного штамма или оценка подавления роста 3,4-дегидро-DL-пролином для полученного мутантного штамма может проводиться как в жидкой, так и в твердой среде. В случае использования твердой среды, к примеру, мутантный штамм и родительский штамм выращиваются в жидкой среде до достижения ими логарифмической фазы роста или стационарной фазы роста, затем культуральный бульон разводится средой, содержащей раствор хлорида натрия или подобным раствором, полученная клеточная суспензия переносится на твердую среду, содержащую 3,4-дегидро-DL-пролин, и мутантный штамм и родительский штамм культивируются в одинаковых условиях. Инкубация обычно проводится при температуре, близкой к оптимальной температуре роста, например 34°С, от одного до трех дней. Затем, если колонии мутантного штамма, которые появились, больше по размеру, чем колонии родительского штамма, это может быть расценено как то, что рост мутантного штамма более успешный, чем рост родительского штамма и ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином у него снижено. Количество 3,4-дегидро-DL-пролина, добавляемого в среду, составляет, к примеру, 0.4 г/л или более, предпочтительно около 1.6 г/л.The selection of the target mutant strain or assessment of growth inhibition of 3,4-dehydro-DL-proline for the obtained mutant strain can be carried out both in liquid and in solid medium. In the case of using solid medium, for example, the mutant strain and the parent strain are grown in liquid medium until they reach a logarithmic growth phase or stationary growth phase, then the culture broth is diluted with a medium containing sodium chloride solution or a similar solution, the resulting cell suspension is transferred to a solid medium containing 3,4-dehydro-DL-proline, and the mutant strain and the parent strain are cultured under the same conditions. Incubation is usually carried out at a temperature close to the optimum growth temperature, for example 34 ° C, from one to three days. Then, if the colonies of the mutant strain that appeared are larger than the colonies of the parent strain, this can be regarded as the fact that the growth of the mutant strain is more successful than the growth of the parent strain and inhibition of growth of 3,4-dehydro-DL-proline in him reduced. The amount of 3,4-dehydro-DL-proline added to the medium is, for example, 0.4 g / l or more, preferably about 1.6 g / l.

Более того, при использовании жидкой среды клеточные суспензии мутантного штамма и родительского штамма культивируются и разводятся тем же способом, как описано ранее и каждый переносится в жидкую среду, содержащую 3,4-дегидро-DL-пролин и клетки культивируются при температуре, приближенной к оптимальной температуре роста, например 34°С, от нескольких часов до одного дня, предпочтительно около 6 часов. Количество 3,4-дегидро-DL-пролина, добавленного к среде, к примеру, 0.4 г/л или более. Затем, если мутантный штамм проявляет более высокую оптическую плотность (OD) или мутность среды, по крайней мере, либо в логарифмической фазе роста, либо в стационарной фазе роста, по сравнению с родительским штаммом, это расценивается как то, что рост является успешным. Более точно, если клетки быстрее достигают логарифмической фазы роста или если максимальное значение OD является более высоким, то рост более успешен. Вышеупомянутая логарифмическая фаза роста означает период, в который количество клеток логарифмически увеличивается на кривой роста. Стационарная фаза означает период после окончания логарифмической фазы роста, когда деление и рост клеток останавливается и увеличение количества клеток больше не наблюдается (Dictionary of Biochemistry, 3rd Edition, Tokyo Kagaku Dojin).Moreover, when using a liquid medium, cell suspensions of the mutant strain and the parent strain are cultured and diluted in the same manner as previously described and each is transferred to a liquid medium containing 3,4-dehydro-DL-proline and the cells are cultured at a temperature close to the optimal growth temperature, for example 34 ° C, from several hours to one day, preferably about 6 hours. The amount of 3,4-dehydro-DL-proline added to the medium, for example, 0.4 g / l or more. Then, if the mutant strain exhibits a higher optical density (OD) or turbidity of the medium, at least either in the logarithmic growth phase or in the stationary growth phase, compared with the parent strain, this is regarded as that the growth is successful. More precisely, if the cells reach the logarithmic growth phase faster, or if the maximum OD value is higher, then the growth is more successful. The aforementioned logarithmic growth phase means a period in which the number of cells increases logarithmically on the growth curve. The stationary phase means the period after the end of the logarithmic growth phase, when cell division and growth stops and the increase in the number of cells is no longer observed (Dictionary of Biochemistry, 3rd Edition, Tokyo Kagaku Dojin).

При использовании жидкой среды выявить различие в ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином может быть более трудно, чем при использовании твердой среды. В настоящем изобретении даже, если различие в ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином не может быть выявлено с использованием жидкой среды, мутантным штаммом является штамм, проявляющий успешный рост, как отмечалось в настоящем изобретении, при условии, что установлено, что этот мутантный штамм обладает более успешным ростом на твердой среде по сравнению с родительским штаммом.When using a liquid medium, it can be more difficult to detect differences in growth inhibition by 3,4-dehydro-DL-proline than using a solid medium. In the present invention, even if a difference in growth inhibition of 3,4-dehydro-DL-proline cannot be detected using a liquid medium, the mutant strain is a strain exhibiting successful growth, as noted in the present invention, provided that it has been found that this mutant strain has more successful growth on solid medium compared to the parent strain.

Более того, степень подавления роста 3,4-дегидро-DL-пролином может также быть оценена путем перенесения суспензии мутантного штамма на твердую среду, содержащую 3,4-дегидро-DL-пролин, и на твердую среду, не содержащую 3,4-дегидро-DL-пролин, и сравнения размера колоний, которые появляются после культивирования в тех же условиях, как описано ранее. Например, когда штамм KMBS16, содержащий три мутации в генах purR, pur А и deoD, полученный из штамма Bacillus subtilis 168 Marburg, культивировался в присутствии 3,4-дегидро-DL-пролина, относительная степень роста, рассчитанная согласно вышеупомянутому уравнению, не превышала 5% при сроке культивирования приблизительно 18 часов, тогда как мутантный штамм, полученный в разделе Примеры настоящего изобретения, проявлял относительную степень роста не более 50% при времени культивирования приблизительно 18 часов и при том же содержании 3,4-дегидро-DL-пролина. Более того, использование относительной степени роста в качестве индекса позволяет оценить ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином без процедуры сравнения с родительским штаммом. Однако ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином можно также оценить путем сравнения относительной степени роста родительского штамма и мутантного штамма.Moreover, the degree of growth inhibition of 3,4-dehydro-DL-proline can also be assessed by transferring the suspension of the mutant strain to a solid medium containing 3,4-dehydro-DL-proline, and to a solid medium not containing 3,4- dehydro-DL-proline, and colony size comparisons that appear after cultivation under the same conditions as previously described. For example, when the KMBS16 strain containing three mutations in the purR, pur A, and deoD genes obtained from the Marburg Bacillus subtilis 168 strain was cultured in the presence of 3,4-dehydro-DL-proline, the relative growth rate calculated according to the above equation did not exceed 5% with a cultivation period of approximately 18 hours, while the mutant strain obtained in the Examples section of the present invention showed a relative growth rate of not more than 50% at a cultivation time of approximately 18 hours and at the same content of 3,4-dehydro-DL-proline. Moreover, using the relative degree of growth as an index makes it possible to evaluate growth inhibition by 3,4-dehydro-DL-proline without a comparison procedure with the parent strain. However, growth inhibition by 3,4-dehydro-DL-proline can also be assessed by comparing the relative growth rates of the parent strain and the mutant strain.

(4) Метод получения пуринового нуклеозида путем ферментации микроорганизма, обладающего улучшенной способностью продуцировать пуриновый нуклеозид, описывается ниже.(4) A method for producing a purine nucleoside by fermenting a microorganism having an improved ability to produce a purine nucleoside is described below.

Для продукции пуринового нуклеозида может быть использована обычная питательная среда, содержащая источник углерода, азота, неорганических ионов и других органических компонентов по необходимости. В качестве источника углерода могут быть использованы сахариды, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трехалоза, рибоза и гидролизаты крахмала; могут быть использованы спирты, такие как глицерол, маннитол и сорбитол; органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота и подобные им. В качестве источника азота может быть использованы неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; может быть использован органический азот, такой как гидролизат бобов сои, газ аммиак, жидкий аммиак и подобные им. Желательно, чтобы витамины, такие как витамин В1, необходимые компоненты, например, нуклеиновые кислоты, такие как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и подобные им, содержались в необходимых количествах, в качестве следовых количествах неорганических питательных веществ. В отличие от этих малые количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, ионов магния и подобные им могут быть добавлены по необходимости.For the production of purine nucleoside, a conventional nutrient medium containing a source of carbon, nitrogen, inorganic ions and other organic components, if necessary, can be used. As a carbon source, saccharides such as glucose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trialose, ribose and starch hydrolysates can be used; alcohols such as glycerol, mannitol and sorbitol may be used; organic acids such as gluconic acid, fumaric acid, citric acid and succinic acid and the like. Inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate can be used as a nitrogen source; organic nitrogen such as a soy bean hydrolyzate, ammonia gas, liquid ammonia and the like can be used. It is desirable that vitamins such as vitamin B1, essential components, for example, nucleic acids such as adenine and RNA, or yeast extract and the like, are contained in the required amounts as trace amounts of inorganic nutrients. In contrast, small amounts of calcium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, magnesium ions and the like can be added as needed.

Инкубирование предпочтительно проводить в аэробных условиях в течение 16-72 часов и температура культуры в процессе культивирования контролируется в пределах от 30 до 45°С, а pH в пределах от 5 до 8. Значения pH могут достигаться с использованием неорганических или органических кислот или щелочных субстанций, таких как газ аммиак.Incubation is preferably carried out under aerobic conditions for 16-72 hours and the temperature of the culture during cultivation is controlled in the range from 30 to 45 ° C, and the pH in the range from 5 to 8. The pH values can be achieved using inorganic or organic acids or alkaline substances such as ammonia gas.

Пуриновый нуклеозид может быть извлечен из жидкости для ферментации любым методом или комбинацией обычных методов, таких как методы выделения на ионнообменных смолах и методы преципитация.Purine nucleoside can be recovered from the fermentation liquid by any method or a combination of conventional methods such as separation methods on ion exchange resins and precipitation methods.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

В дальнейшем, настоящее изобретение будет разъяснено более детально со ссылкой на следующие примеры, не ограничивающие рамки настоящего изобретения.Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to the following examples, not limiting the scope of the present invention.

Пример 1. Отбор мутанта Bacillus subtilis штамма-продуцента инозина, устойчивого к 3,4-дегидро-DL-пролину.Example 1. Selection of a mutant of Bacillus subtilis inosine producer strain resistant to 3,4-dehydro-DL-proline.

3,4-Дегидро-DL-пролин является аналогом пролина, который, как известно, является ингибитором гамма-глутамилкиназы - первого фермента в биосинтезе L-пролина. Среди мутантов, устойчивых к аналогу, могут быть найдены мутанты, нечувствительные к ингибиции L-пролином по принципу обратной связи и избыточно продуцирующие L-пролин. Кроме того, были отобраны мутанты В. subtilis KMBS16, устойчивые к ингибиции роста реагентом.3,4-Dehydro-DL-proline is an analogue of proline, which is known to be an inhibitor of gamma-glutamyl kinase, the first enzyme in the biosynthesis of L-proline. Among mutants that are resistant to the analogue, mutants that are insensitive to L-proline inhibition by the feedback principle and excessively produce L-proline can be found. In addition, B. subtilis KMBS16 mutants resistant to growth inhibition by the reagent were selected.

Клетки штамма В. subtilis KMBS16 в количестве приблизительно 10⁸ были помещены в минимальной среде М9 (Sambrook, J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) в чашки с агаризованной средой (агар - 20 г/л), содержащей глюкозы - 2%, L-триптофана - 50 мг/л и 0.1 или 0.2 г/л 3,4-дегидро-DL-пролина (Fluka, Швейцария). Инокулированные чашки инкубировали при 34°С в течение 5 дней. Из числа появившихся колоний-спонтанных мутантов был выбран штамм Bacillus subtilis 43-142K (VKPMB-8998).Approximately 10 ⁸ cells of B. subtilis KMBS16 strain were placed in M9 minimal medium (Sambrook, J., Fritsch EF and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) in plates with agar medium (agar - 20 g / L) containing glucose - 2%, L-tryptophan - 50 mg / L and 0.1 or 0.2 g / L 3,4-dehydro-DL-proline (Fluka , Switzerland). Inoculated plates were incubated at 34 ° C for 5 days. From the number of emerging spontaneous mutant colonies, the Bacillus subtilis 43-142K strain (VKPMB-8998) was selected.

Устойчивость этого штамма, также как и родительского штамма к 3,4-дегидро-DL-пролину, оценивалась путем помещения их в агаризованную минимальную среду М9 с глюкозой, как описано выше, содержащую ступенчатую концентрацию аналога. Рост штаммов наблюдали через 40 часов (Таблица 1).The resistance of this strain, as well as the parent strain to 3,4-dehydro-DL-proline, was assessed by placing them in agarized minimal medium M9 with glucose, as described above, containing a stepwise concentration of the analogue. Strain growth was observed after 40 hours (table 1).

Таблица 1.Table 1. ШтаммStrain Рост в среде М9, содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин, мг/лGrowth in M9 medium containing 3,4-dehydro-DL-proline, mg / l   00 0.050.05 0.10.1 0.20.2 0.40.4 0.80.8 1.61.6 KMBS16KMBS16 ++ -- -- -- -- -- -- 43-142К43-142K ++ ++ ++ ++ ++ ±± ±± Note. +: хороший рост; ±: слабый рост (размер колоний меньше, чем в контрольном эксперименте); -: рост отсутствует (видимых колоний не наблюдалось).Note +: good growth; ±: weak growth (colony size is smaller than in the control experiment); -: no growth (no visible colonies were observed).

Как следует из Таблицы 1, мутантный штамм В. subtilis 43-142 K проявлял более высокий уровень устойчивости к 3,4-дегидро-DL-пролину по сравнению с родительским штаммом.As follows from Table 1, the mutant strain B. subtilis 43-142 K showed a higher level of resistance to 3,4-dehydro-DL-proline compared to the parent strain.

Пример 2: Влияние мутации, обуславливающей устойчивость к 3,4-дегидро-DL-пролину, на продукцию инозина штаммом-продуцентом инозина В. subtilis.Example 2: Effect of a mutation causing resistance to 3,4-dehydro-DL-proline on the production of inosine by the B. subtilis inosine producer strain.

Штамм В. subtilis 43-142 K и родительский штамм В. subtilis KMBS16 каждый культивировали при температуре 34°С с аэрацией в течение 18 часов в L-бульоне. Затем 0.3 мл полученной культуры переносили в 3 мл среды для ферментации, имеющей следующий состав (см. ниже), в пробирки 20×200 мм и инкубировали при 34°С в течение 72 часов на роторной качалке.The strain B. subtilis 43-142 K and the parent strain B. subtilis KMBS16 each were cultured at a temperature of 34 ° C with aeration for 18 hours in L-broth. Then, 0.3 ml of the obtained culture was transferred into 3 ml of fermentation medium having the following composition (see below) in 20 × 200 mm tubes and incubated at 34 ° С for 72 hours on a rotary shaker.

Состав среды для ферментации: (г/л)The composition of the medium for fermentation: (g / l)

ГлюкозаGlucose 80.080.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 1.01.0 MgSO₄ MgSO ₄ 0.40.4 FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄×5H₂OMnSO ₄ × 5H ₂ O 0.010.01 NH₄ClNH ₄ Cl 32.032.0 АденинAdenine 0.10.1 Общий азот (в виде Mameno)Total Nitrogen (as Mameno) 1.351.35 СаСО₃ CaCO ₃ 50.050.0 DL-МетионинDL-methionine 0.30.3 ТриптофанTryptophan 0.020.02

Глюкоза и сульфат магния стерилизовались раздельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром в режиме 180°С в течение 2 часов, рН доводили до 7.0.Glucose and magnesium sulfate were sterilized separately. CaCO _{3 was} sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours, the pH was adjusted to 7.0.

После выращивания количество инозина и гуанозина, накопленного в среде, определяли с помощью ВЭЖХ. Образец культуральной среды (500 мкл) центрифугировали при 15000 об/мин в течение 5 минут, супернатант разводили в 100 раз водой и анализировали с помощью ВЭЖХ.After growing, the amount of inosine and guanosine accumulated in the medium was determined by HPLC. A sample of the culture medium (500 μl) was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was diluted 100 times with water and analyzed by HPLC.

Условия анализа с помощью ВЭЖХ:HPLC analysis conditions:

Колонка: Luna С18(2) 250×3 мм, 5u (Phenomenex, США). Буфер: 2% (v/v) C₂H₅OH; 0.8% (v/v) триэтиламин, 0.55% (v/v) уксусная кислота (ледяная), pH 4.5. Температура: 30°С. Скорость потока: 0.3 мл/мин. Объем пробы: 5 мкл. УФ-детектор: UV 250 нм.Column: Luna С18 (2) 250 × 3 mm, 5u (Phenomenex, USA). Buffer: 2% (v / v) C ₂ H ₅ OH; 0.8% (v / v) triethylamine, 0.55% (v / v) acetic acid (glacial), pH 4.5. Temperature: 30 ° C. Flow rate: 0.3 ml / min. Sample volume: 5 μl. UV detector: UV 250 nm.

Время удерживания (мин):Retention Time (min):

КсантозинXanthosine 13.713.7 ИнозинInosine 9.69.6 ГипоксантинHypoxanthine 5.25.2 ГуанозинGuanosine 11.411.4 АденозинAdenosine 28.228.2

Результаты представлены в Таблице 2.The results are presented in Table 2.

Таблица 2.Table 2. Штамм В. subtilisStrain B. subtilis OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Инозин, г/лInosine, g / l KMBS16KMBS16 12.512.5 1.81.8 43-142 К43-142 K 12.812.8 2.32.3

Как видно из Таблицы 2, штамм В. subtilis 43-142 накапливал больше инозина, чем родительский штамм.As can be seen from Table 2, the strain B. subtilis 43-142 accumulated more inosine than the parent strain.

Пример 3. Селекция и проверка мутантного штамма Bacillus amyloliquefaciens - продуцента инозина, устойчивого к 3,4-дегидро-DL-пролину.Example 3. Selection and verification of a mutant strain of Bacillus amyloliquefaciens, a producer of inosine resistant to 3,4-dehydro-DL-proline.

Клетки штамма Bacillus amyloliquefaciens AS 115-7 в количестве приблизительно 10⁸ были помещены в чашки с агаризованной средой М9, как в Примере 1, содержащей 0.1, 0,2 или 0.4 мг/л 3,4-дегидро-DL-пролина. Инокулированные чашки инкубировали при 34°С в течение 5 дней. Из числа появившихся колоний спонтанных мутантов был выбран штамм Bacillus amyloliquefaciens 36-59H (VKPM В-8995).Cells of the Bacillus amyloliquefaciens AS 115-7 strain in an amount of approximately 10 ⁸ were placed in plates with M9 agar medium, as in Example 1, containing 0.1, 0.2, or 0.4 mg / L 3,4-dehydro-DL-proline. Inoculated plates were incubated at 34 ° C for 5 days. From the number of colonies of spontaneous mutants that appeared, the Bacillus amyloliquefaciens 36-59H strain (VKPM B-8995) was selected.

Штамм В. amyloliquefaciens 36-59H и родительский штамм В. amyloliquefaciens AS 115-7 каждый культивировали при температуре 34°С в течение 18 часов в L-бульоне. Затем 0.3 мл полученной культуры переносили в 3 мл среды для ферментации из Примера 2, содержащей 0.04 г/л гистидина и 0.04 г/л тирозина вместо триптофана, в пробирки размером 20×200 мм и культивировали при температуре 31°С в течение 72 часов на роторной качалке. После культивирования накопленное количество инозина в среде определяли с помощью ВЭЖХ как в Примере 2.The strain B. amyloliquefaciens 36-59H and the parent strain B. amyloliquefaciens AS 115-7 were each cultured at 34 ° C for 18 hours in L-broth. Then, 0.3 ml of the obtained culture was transferred into 3 ml of fermentation medium from Example 2, containing 0.04 g / l of histidine and 0.04 g / l of tyrosine instead of tryptophan, into 20 × 200 mm test tubes and cultured at 31 ° C for 72 hours rotary rocking chair. After cultivation, the accumulated amount of inosine in the medium was determined using HPLC as in Example 2.

Состав среды для ферментации, г/л:The composition of the medium for fermentation, g / l:

ГлюкозаGlucose 80.080.0 NH₄ClNH ₄ Cl 15.015.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 1.01.0 MgSO₄ MgSO ₄ 0.40.4 FeSO₄·7H₂OFeSO ₄ · 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄·5H₂OMnSO ₄ · 5H ₂ O 0.010.01 Mameno-TNMameno-tn 0.80.8 АденинAdenine 0.30.3 СаСО₃ CaCO ₃ 25.025.0

Глюкоза и сульфат магния стерилизовались раздельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром в режиме 180°С в течение 2 часов, рН доводили до 7.0.Glucose and magnesium sulfate were sterilized separately. CaCO _{3 was} sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours, the pH was adjusted to 7.0.

Результаты представлены в Таблице 3.The results are presented in Table 3.

Таблица 3.Table 3. Штамм В. amyloliquefaciensStrain B. amyloliquefaciens OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Инозин, г/лInosine, g / l AS117-7AS117-7 12.412.4 6.26.2 36-59Н36-59H 11.911.9 7.27.2

Как видно из Таблицы 3, штамм В. amyloliquefaciens 36-59H, устойчивый к 3,4-дегидро-DL-пролину, накапливает больше инозина, чем родительский штамм.As can be seen from Table 3, the strain B. amyloliquefaciens 36-59H, resistant to 3,4-dehydro-DL-proline, accumulates more inosine than the parent strain.

Claims (3)

1. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-8998 - продуцент инозина.1. The bacterial strain Bacillus subtilis VKPM B-8998 - producer of inosine. 2. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-9789 - продуцент инозина.2. The bacterial strain Bacillus amyloliquefaciens VKPM B-9789 - producer of inosine. 3. Способ получения инозина, включающий стадии: культивирования штамма-продуцента, полученного путем селекции на устойчивость к ингибированию роста 3,4-дегидро-DL-пролином, в питательной среде с применением в качестве продуцента штамма по п.1 или 2; и выделения инозина из культуральной жидкости.3. A method for producing inosine, comprising the steps of: cultivating a producer strain obtained by selection for resistance to growth inhibition of 3,4-dehydro-DL-proline in a nutrient medium using the strain according to claim 1 or 2 as a producer; and isolation of inosine from the culture fluid.