RU2330882C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН aldH - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН aldH Download PDFInfo
- Publication number
- RU2330882C2 RU2330882C2 RU2006102181/13A RU2006102181A RU2330882C2 RU 2330882 C2 RU2330882 C2 RU 2330882C2 RU 2006102181/13 A RU2006102181/13 A RU 2006102181/13A RU 2006102181 A RU2006102181 A RU 2006102181A RU 2330882 C2 RU2330882 C2 RU 2330882C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- strain
- coli
- bacterium
- strains
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-треонина или L-аргинина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что ген aldH в указанной бактерии инактивирован. Изобретение позволяет получать такие L-аминокислоты, как L-треонин и L-аргинин, с высокой степенью эффективности. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена aldH в указанной бактерии ослаблена.
Описание предшествующего уровня техники
Традиционно L-аминокислоты получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов. Как правило, микроорганизмы модифицируют для увеличения продукции L-аминокислот.
Для увеличения продукции L-аминокислот используются различные методики, включая трансформацию микроорганизма рекомбинантной ДНК (смотри, например, патент США 4278765). Другие методики для увеличения выхода продукта включают увеличение активностей ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или устранение чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой по типу обратной связи (смотри, например, заявку РСТ WO 95/16042 или патенты США 4346170; 5661012 и 6040160).
Еще один путь для увеличения продукции L-аминокислот- ослабление экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в деградацию целевой L-аминокислоты, генов, обеспечивающих отклонение предшественников целевой L-аминокислоты от пути биосинтеза L-аминокислоты, генов, вовлеченных в перераспределение потоков углерода, азота и фосфата, генов, кодирующих токсины, клеточные факторы и т.д.
Белок AldH принадлежит к семейству альдегиддегидрогеназы. Недавно описан ген aldH, кодирующий AldH белок Escherichia coli. Фермент Е.coli имеет слабую, но измеряемую альдегиддегидрогеназную активность, в определенных условиях (в зависимости от субстрата) NADP+ предпочтительнее в качестве кофермента, чем NAD+, при реакции окисления альдегидов в соответствующие кислоты. Данная реакция является второй стадией в процессе утилизации этанола. Фермент проявляет широкую субстратную специфичность, включая окисление D-глюкуронолактона в D-глюкарат (Heim R., Strehler E.E., Gene, 99, 1, 15-23 (1991)).
Ранее был описан процесс получения L-аминокислот, в частности L-треонина, методом ферментации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, в которых усилен(ы) один или более из следующих генов: aldA, aldB, aldH и betB или кодирующие их нуклеотидные последовательности, в частности сверхэкспрессированы (заявка РСТ WO 03076629).
В настоящее время нет сообщений, описывающих использование инактивации гена aldH для получения L-аминокислот.
Описание изобретения
Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения L-аминокислоты с использованием этих штаммов.
Вышеупомянутые цели были достигнуты путем установления того факта, что инактивация гена aldH может привести к повышению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.
Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.
Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена aldH в указанной бактерии ослаблена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой ослабление экспрессии указанного гена aldH осуществлено путем инактивации указанного гена aldH.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматических L-аминокислот и неароматических L-аминокислот.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя:
- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде,
- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматических L-аминокислот и неароматических L-аминокислот.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.
Более детально настоящее изобретение описано ниже.
Наилучший способ осуществления настоящего изобретения
1. Бактерия согласно настоящему изобретению
Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что экспрессия гена aldH в указанной бактерии ослаблена.
Согласно настоящему изобретению "бактерия-продуцент L-аминокислоты" означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.
Используемый здесь термин "бактерия-продуцент L-аминокислоты" также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах, по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli К-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л. Термин "L-аминокислота" включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.
Термин "ароматическая L-аминокислота" включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин "неароматическая L-аминокислота" включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. Наиболее предпочтительны L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.
Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nim.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock). Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea, предпочтительна.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Pantoea" означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д.
Термин "бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена aldH ослаблена" означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белка AldH по сравнению с немодифицированной бактерией или указанная бактерия не способна синтезировать белок AldH. Термин "бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена aldH ослаблена" также включает модификацию бактерии для уменьшения активности альдегиддегидрогеназы (ЕС:1.2.1.3).
Активность белка AldH может быть измерена, например, методом, описанным Heim и Strehler (Heim, R. and Strehler, E.E., Gene, 1991 Mar 1; 99(1):15-23). Снижение или отсутствие активности белка AldH в бактерии согласно настоящему изобретению может быть выявлено при сравнении с родительской немодифицированной бактерией.
Термин "инактивация гена aldH" означает, что указанный ген модифицирован таким образом, что такой модифицированный ген кодирует полностью неактивный белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции данного гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена, введения missense/nonsense мутации (мутаций) или модификации прилегающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, сайты связывания рибосомы и т.д.
Уровень экспрессии гена может оцениваться измерением количества транскрибируемой с гена мРНК с использованием различных хорошо известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную RT-ПЦР и т.п. Количество белка, кодируемого данным геном, может быть измерено хорошо известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Western blot analysis), и т.п.
Ген aldH (синонимы: ген b1300, ген puuC) кодирует белок AldH (синонимы: альдегиддегидрогеназа, альдегид-NAD+-оксидоредуктаза, В1300, PuuC). Ген aldH (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 1.360.767 по 1.362.254 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990; SEQ ID NO:1) расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами ycjC и ordL. Нуклеотидная последовательность гена aldH и аминокислотная последовательность белка AldH, кодируемого геном aldH, приведены в Списке последовательностей под номерами SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно.
Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена aldH не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Списке последовательностей под номером SEQ ID No:1, но также может включать и гомологичные ему гены. Таким образом, вариант белка, кодируемого геном aldH, может быть представлен белком с гомологией не менее 80%, предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Списке последовательностей под номером SEQ ID NO. 2, при условии, что сохраняется активность белка AldH.
Кроме того, ген aldH может быть представлен вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что указанный вариант кодирует функциональный белок AldH до инактивации.
"Жесткие условия" включают такие условия, при которых специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°C. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно она составляет от 100 п.н. до 1 т.п.н.
Примеры методов ослабления экспрессии гена aldH включают такие как мутации или делеции гена aldH, при которых внутриклеточная активность белка, кодируемого геном aldH, снижена или отсутствует по сравнению с немутированным или природным штаммом. Например, это может быть достигнуто использованием рекомбинации для того, чтобы инактивировать ген aldH на хромосоме или модифицировать экспрессию регуляторных последовательностей, таких как промотор или последовательность Shine-Dalgarno (SD) (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)). Это также может быть достигнуто введением аминокислотной замены ("миссенс"-мутация) в области хромосомы, кодирующей фермент; введением стоп-кодона ("нонсенс "-мутация); введением или делецией одного или двух оснований для создания мутации сдвига рамки считывания; делецией области гена или всего гена (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al. J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)).
Активность фермента также может быть уменьшена или удалена путем конструирования кодирующего мутантный фермент гена с неполной кодирующей областью, замены нормального гена на хромосоме на этот ген с использованием гомологичной рекомбинации, введения транспозона или IS-фактора в ген.
Например, следующие методы могут применяться для введения путем генной рекомбинации мутаций, вызывающих снижение или удаление активности вышеуказанного фермента. Часть последовательности целевого гена модифицируется, конструируется мутантный ген, с которого не синтезируется нормально функционирующий фермент, содержащая этот ген ДНК используется для трансформации бактерий семейства Enterobacteriaceae; конструируется мутантный ген для рекомбинации с геном хромосомы, производится замещение целевого гена хромосомы мутантным геном.
Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методами с использованием линейной ДНК, как, например, метод, известный как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 12, 6640-6645(2000)), и метод с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6303383 или заявка Японии 05-007491А). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием гомологичной рекомбинации, как сказано выше, может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.
Инактивация указанного гена может быть произведена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).
Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобными им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Бактерия-продуцент L-аминокислоты
В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия гена aldH ослаблена, может быть использована бактерия, способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации гена aldH в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой ген aldH уже инактивирован, способности к продукции L-аминокислот.
Бактерия-продуцент L-треонина
Примеры родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM BP-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.
Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.
В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению может также использоваться Е.coli VKPM В-5318 (европейский патент ЕР 0593792 В). Штамм В-5318 является прототрофным по изолейцину и содержит плазмиду pVIC40, в которой регуляторная область треонинового оперона замещена чувствительным к температуре С1 репрессором фага λ и PR-промотором. Штамм VKPM B-5318 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 3 мая 1990 г. с инвентарным номером VKPM B-5318.
Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:
- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I,
устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;
- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;
- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;
- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;
- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, и
- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).
Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления экспрессии треонинового оперона желательно удалить из оперона область аттенюатора, который влияет на транскрипцию (заявка РСТ WO 2005/049808, заявка РСТ WO 2003/097839).
Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC, может быть получен в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.
Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli около оперона gInHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiPF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi: 440181), расположен между генами рехВ и отрХ. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA23 представляет собой замену А-на-G в положении -1 по отношению к старт-кодону ATG (тезисы 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, тезисы 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29,1997, abstract No. 457, европейская заявка ЕР 1013765 A).
Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.
Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.
Бактерия-продуцент L-лизина
Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизином, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli АJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.
Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-5252 (патент США 5827698).
Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США. 6040160), фосфоенолпируваткарбоксилазу(ррс), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу(asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (суо) (европейская заявка ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5830716), гена ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390), или комбинации этих генов.
Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5827698) и малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).
Бактерия-продуцент L-цистеина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP 11155571 А2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307 A1) и подобные им.
Бактерия-продуцент L-лейцина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающих, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP8-70879 А2), и подобные им.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD, и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (европейская заявка ЕР 1239041 А2).
Бактерия-продуцент L-гистидина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116-В12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli Н-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобными им.
Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-гистидина, включают АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (hisI), фосфорибозил-АТФ- фосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гастидинолфосфатаминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и т.д.
Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ 2003677 и 2119536).
Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е.coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы E.coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка ЕР 1016710 А), штамм Е.coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536), и т.д.
Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислоты
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC+ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC+(ВКПМ В-8961). Этот штамм обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-глутаминовой кислоты, включают глутаматдегидрогеназу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтетазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу,пируваткарбоксилазу, пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобифосфатальдолазу, фосфофруктониназу и глюкозофосфатизомеразу.
Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР 1078989 А, ЕР 955368 А и ЕР 952221 А.
Примеры родительских штаммов для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий согласно настоящему исследованию, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, синтазу ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:
Е.coli W3110sucA::Kmr
Е.coli АJ12624 (FERM ВР-3853)
Е.coli АJ12628 (FERM BP-3854)
Е.coli АJ12949 (FERM BP-4881)
Е.coli W3110sucA::Kmr - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме Е.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.
Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например штамм АJ13199 (FERM ВР-5807) (патент США 5908768) или штамм PERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5393671); штамм Е.coli AJ13138 (PERM BP-5565) (патент США 6110714) и подобные им.
Примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишенны активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6331419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM P-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена aKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то что штамм AJ13356 был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.
Бактерия-продуцент L-фенилаланина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген рhеА34 (патент США 5354672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и подобные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как АJ12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 A1).
Бактерия-продуцент L-триптофана
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель гена serA, кодирующего фермент, не ингибируемый серином по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), лишенные активности триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO 9708333, патент США 6319696), и подобные им.
Ранее было показано, что природная аллель гена yddG, кодирующего мембранный белок, не участвующий в путях биосинтеза ни одной из L-аминокислот, амплифицированная на многокопийном векторе в микроорганизме, придает этому микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аналогам этой аминокислоты. Кроме того, введение в клетки бактерий-продуцентов L-фенилаланина или L-триптофана дополнительных копий гена yddG может положительно влиять на продукцию соответствующих аминокислот (международная заявка РСТ WO 03044192). Таким образом, желательно, чтобы бактерия-продуцент L-триптофана была далее модифицирована таким образом, что в этой бактерии усилена экспрессия открытой рамки считывания yddG.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы, и триптофансинтазы. И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Специфические примеры штаммов с такой мутацией включают Е.coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е.coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 А, заявка Японии 62-244382 А, патент США 4371614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу (trpBA). Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно. Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть увеличена усилением экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).
Бактерия-продуцент L-пролина
Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).
Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.
Бактерия-продуцент L-аргинина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (выложенная патентная заявка Японии 57-5693), и подобные им.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L- аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L- аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH) и карбамоилфосфатсинтетазу.
Бактерия-продуцент L-валина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, модифицированные с целью сверхэкспрессии оперона ilvGMEDA (патент США 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, которая необходима для ослабления экспрессии, с тем чтобы экспрессия оперона не ослаблялась образующимся L-валином. Далее, желательно разрушить в опероне ген ilvA с тем чтобы снизить активность треониндеаминазы.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина согласно настоящему изобретению, также включают в себя мутантные штаммы, имеющие мутацию аминоацил-тРНК-синтетазы (патент США 5658766). Например, может использоваться штамм E.coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин-тРНК-синтетазу. Штамм E.coli VL1970 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд) 24 июня 1988 г. с инвентарным номером ВКПМ В-4411.
Далее, в качестве родительских штаммов также могут использоваться мутантные штаммы, для роста которых требуется липоевая кислота, и/или с недостаточным количеством H+-АТФазы (заявка РСТ WO 96/06926).
Бактерия-продуцент L-изолейцина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-изолейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, мутантные штаммы с устойчивостью к 6-диметиламинопурину (заявка Японии 5-304969А), мутантные штаммы с устойчивостью к аналогу изолейцина, такому как тиаизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантные штаммы, дополнительно имеющие устойчивость к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина (заявка Японии 5-130882 А). Кроме того, в качестве родительских штаммов также могут использоваться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (заявка Японии 2-458А, патент Франции 0356739 и патент США 5998178).
2. Способ согласно настоящему изобретению
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 изображены относительные положения праймеров aldHL и aldHR на плазмиде pACYC184, используемой для амплификации гена cat.
На Фиг.2 изображено конструирование фрагмента хромосомной ДНК, содержащего инактивированный ген aldH.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном aldH
1. Делеция гена aldH
Штамм, содержащий делецию гена aldH, был сконструирован с использованием методики, разработанной Datsenko, K.A. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой методикой были синтезированы ПЦР-праймеры aldHL (SEQ ID NO:3) и aldHR (SEQ ID NO:4), гомологичные областям, прилегающим к гену aldH и гену, сообщающему устойчивость к антибиотику, на плазмиде, используемой в качестве матрицы для ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР была использована плазмида pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (инвентарный номер Х06403 в базе данных GenBank/EMBL). Использовался следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С и последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.
Полученный продукт ПЦР длиной 1152 п.н. (Фиг.1), очищенный в агарозном геле, может быть использован для электропорации в штамм Е.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит фрагмент ДНК фага λ длиной 2154 нуклеотида (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора РaraB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.
Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), развели в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD600≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н2О. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (30 мкг/мл), и выращивали при 37°С для отбора CmR-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.
2. Подтверждение делеции гена aldH с помощью ПЦР.
Мутанты с делегированным геном aldH, содержащие ген устойчивости к Cm, были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры aldH 1 (SEQ ID NO:5) и aldH 2 (SEQ ID NO:6) использовались для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 94°С в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма aldH+ MG1655, составляет 1743 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 ΔaldH::cat, составляет 1335 п.н. (Фиг.2).
Пример 2. Продукция L-треонина штаммом Е.coli B-3996-ΔaldH
Для оценки влияния инактивации гена aldH на продукцию треонина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH::cat были перенесены в штамм-продуцент L-треонина Е.coli В-3996 (ВКПМ В-3996) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего был получен штамм В-3996-ΔaldH.
Оба штамма Е.coli В-3996 и В-3996-ΔaldH выращивали в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы выращивали при 32°С в течение 18 часов на роторной качалке (250 об/мин) в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% глюкозой. Затем в ферментационную среду были внесены по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментацию проводили в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки выращивали в течение 65 часов при 32°С с перемешиванием (250 об/мин).
После выращивания количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью бумажной хроматографии, с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол:уксусная кислота:вода =4:1:1 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-треонин, было вырезано, L-треонин был элюирован 0.5% водным раствором CdCl2, после чего количество L-треонина оценивалось спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты 8 независимых пробирочных ферментаций приведены в Таблице 1.
Использовали следующий состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза | 80.0 |
(NH4)2SO4 | 22.0 |
NaCl | 0.8 |
КН2PO4 | 2.0 |
MgSO4×7H2O | 0.8 |
FeSO4×7H2O | 0.02 |
MnSO4×5H2O | 0.02 |
Тиамин гидрохлорид | 0.0002 |
Дрожжевой экстракт | 1.0 |
СаСО3 | 30.0 |
Глюкозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. СаСО3 стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0. Антибиотик добавляли в среду после стерилизации.
Как видно из Таблицы 1, штамм В-3996-ΔaldH накапливал большее количество L-треонина по сравнению со штаммом В-3996.
Пример 3. Продукция L-лизина штаммом Е.coli АJ11442-ΔaldH
Для оценки влияния инактивации гена aldH на продукцию лизина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лизина Е. coli WC196 (pCABD2) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). pCABD2 - это плазмида, содержащая ген dapA, кодирующий мутантную дигидропиколинатсинтазу, устойчивую к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ген lysC, кодирующий мутантную аспартокиназу III, устойчивую к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ген dapB, кодирующий дигидропиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (патент США 6040160).
Оба штамма Е.coli, родительский WC196(pCABD2) и полученный WC196(pCABD2) ΔaldH::cat, могут выращиваться в L-среде, содержащей 20 мг/л стрептомицина при 37°С, и 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 20 мл ферментационной среды, содержащей необходимые антибиотики, в колбы объемом 500 мл. Культивирование может производиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количества L-лизина и остаточной глюкозы в среде могут быть измерены известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель - Sakura Seiki Co.). Затем для каждого из штаммов может быть рассчитан выход L-лизина в пересчете на потребленную глюкозу.
Состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза | 40 |
(NH4)2SO4 | 24 |
К2HPO4 | 1.0 |
MgSO4×7H2O | 1.0 |
FeSO4×7Н2О | 0.01 |
MnSO4×5H2O | 0.01 |
Дрожжевой экстракт | 2.0 |
рН доводят до 7.0 в помощью КОН и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO4×7Н2О стерилизуют отдельно. Также добавляют 30 г/л CaCO3, предварительно простерилизованного сухим жаром при 180°С в течение 2 часов.
Пример 4. Продукция L-цистеина штаммом Е.coli JM15(ydeD)-ΔaldH
Для оценки влияния инактивации гена aldH на продукцию L-цистеина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-цистеина Е.coli JM15(ydeD) с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм JM15(ydeD)-ΔaldH. Штамм Е.coli JM15(ydeD) является производным штамма Е.coli JM15 (патент США 6218168), который может быть трансформирован ДНК, содержащей ген ydeD, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза ни одной из L-аминокислот (патент США 5972663).
Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина детально описаны в Примере 6 патента США 6218168.
Пример 5. Продукция L-лейцина штаммом Е.coli 57-ΔaldH
Для оценки влияния инактивации гена aldH на продукцию L-лейцина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лейцина Е.coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм 57-pMW-ΔaldH.
Оба штамма Е.coli, 57 и 57-ΔaldH, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментацию можно проводить в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут выращиваться в течение 48-72 часов при 32°С с перемешиванием (250 об/мин).
Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода =4:1:1).
Может быть использован следующий состав ферментационной среды (г/л) (рН 7.2):
Глюкоза | 60.0 |
(NH4)2SO4 | 25.0 |
К2HPO4 | 2.0 |
MgSO4×7H2O | 1.0 |
Тиамин | 0.01 |
СаСО3 | 25.0 |
Глюкозу и мел следует стерилизовать отдельно.
Пример 6. Продукция L-гистидина штаммом Е.coli 80-ΔaldH
Для оценки влияния инактавации гена aldH на продукцию L-гистидина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH:: cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-7270.
Оба штамма Е.coli, родительский 80 и полученный 80-ΔaldH, могут выращиваться в L-бульоне при 29°С в течение 6 часов. Затем 0.1 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Может быть использована подвижная фаза следующего состава: n-бутанол - уксусная кислота - вода =4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован для визуализации.
Состав ферментационной среды (рН 6.0) (г/л):
Глюкоза | 100.0 |
Мамено (гидролизат | |
соевых бобов) | 0.2 общего азота |
L-пролин | 1.0 |
(NH4)2SO4 | 25.0 |
КН2PO4 | 2.0 |
MgSO4×7H2O | 1.0 |
FeSO4×7H2O | 0.01 |
MnSO4 | 0.01 |
Тиамин | 0.001 |
Бетаин | 2.0 |
СаСО3 | 60.0 |
Глюкозу, пролин, бетаин и CaCO3 стерилизуют отдельно. рН доводят до 6.0 перед стерилизацией.
Пример 7. Продукция L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli VL334thrC+-ΔaldH
Для оценки влияния инактивации гена aldH на продукцию L-глутаминовой кислоты ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-глутаминовой кислоты Е. VL334thrC+(ЕР 1172433) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм VL334thrC+-ΔaldH. Штамм VL334thrC+ депонирован 11 мая 1978 г. во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-1641, а затем 15 мая 1987 г. депонирован в соответствии с Будапештским Договором.
Оба штамма, родительский VL334thrC+ и полученный VL334thrC+-ΔaldH, могут быть выращены на чашках с L-агаром при 37°С в течение 18-24 часов. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда должна содержать глюкозу - 60 г/л, сульфат аммония - 25 г/л, КН2PO4 - 2 г/л, MgSO4 -1 г/л, тиамин - 0.1 мг/мл, L-изолейцин - 70 мкг/мл и мел - 25 г/л (рН 7.2). Глюкозу и мел следует стерилизовать отдельно. Выращивание может производиться при 30°С в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученной L-глутаминовой кислоты может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол-уксусная кислота-вода =4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl2.
Пример 8. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ12739-ΔaldH
Для оценки влияния инактивации гена aldH на продукцию L-фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli АJ12739 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм AJ12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197.
Оба штамма, родительский AJ12739 и полученный AJ12739-ΔaldH, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут экспонироваться в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол:этилацетат:25% водного аммиака:вода =40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.
Состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза | 40.0 |
(NH4)2SO4 | 16.0 |
К2HPO4 | 0.1 |
MgSO4×7H2O | 1.0 |
FeSO4×7H2O | 0.01 |
MnSO4×5H2O | 0.01 |
Тиамин HCl | 0.0002 |
Дрожжевой экстракт | 2.0 |
Тирозин | 0.125 |
CaCO3 | 20.0 |
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. CaCO3 стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.
Пример 9. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (pGH5)-ΔaldH
Для оценки влияния инактивации гена aldH на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-триптофана Е.coli SV164 (pGH5) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм SV164 (pGH5) подробно описан в патенте США 6180373 или Европейском патенте 0662143.
Оба штамма, полученный SV164(pGH5)-ΔaldH и родительский SV164(pGH5), могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5) (20 мг/мл), 0.3 мл полученных культур могут быть внесены в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (20 мг/мл) в пробирках размером 20×200 мм, и могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 8. Компоненты ферментационной среды представлены в Таблице 2, но группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н следует стерилизовать отдельно, как и показано в Таблице, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.
Пример 10. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA-ΔaldH
Для оценки влияния инактивации гена aldH на продукцию L-пролина ДНК-фрагменты из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-пролина Е.coli 702ilvA с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-8012.
Оба штамма Е.coli 702ilvA и 702ilvA-ΔaldH могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Затем ферментация с использованием этих штаммов может производиться в тех же условиях, как описано в Примере 7.
Пример 11. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382-ΔaldH
Для оценки влияния инактивации гена aldH на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔaldH::cat перенесли в штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926.
Оба штамма, полученный 382-ΔaldH и родительский 382, выращивали при 32°С в течение 18 часов в 2 мл LB-бульона, 0.3 мл полученных культур вносили в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм и культуры выращивали при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.
После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода =4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали, L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl2, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты 10 независимых пробирочных ферментаций приведены в Таблице 3.
Состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза | 48.0 |
(NH4)2SO4 | 35.0 |
КН2PO4 | 2.0 |
MgSO4×7H2O | 1.0 |
Тиамин HCl | 0.0002 |
Дрожжевой экстракт | 1.0 |
L-изолейцин | 0.1 |
СаСО3 | 5.0 |
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. CaCO3 стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.
Как видно из Таблицы 3, штамм 382-ΔaldH накапливал большее количество L-аргинина по сравнению со штаммом 382.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.
Таблица 1 | |||
Штамм | OD540 | Количество L-треонина, г/л | |
В-3996 | 24.8±0.7 | 22.4±0.9 | |
В-3996-ΔaldH | 22.1±1.1 | 24.3±0.7 | |
Таблица 2 | |||
Растворы | Компонент | Конечная концентрация, г/л | |
А | КН2PO4 | 1.5 | |
NaCl | 0.5 | ||
(NH4)2SO4 | 1.5 | ||
L-метионин | 0.05 | ||
L-фенилаланин | 0.1 | ||
L-тирозин | 0.1 | ||
Mameno (общий N) | 0.07 | ||
В | Глюкоза | 40.0 | |
MgSO4×7H2O | 0.3 | ||
С | CaCl2 | 0.011 | |
D | FeSO4×7Н2О | 0.075 | |
Цитрат натрия | 1.0 | ||
Е | Na2MoO4×2H2O | 0.00015 | |
Н3ВО3 | 0.0025 | ||
CoCl2×6Н2О | 0.00007 | ||
CuSO4×5H2O | 0.00025 | ||
MnCl2×4H2O | 0.0016 | ||
ZnSO4×7H2O | 0.0003 | ||
F | Тиамин HCl | 0.005 | |
G | CaCO3 | 30.0 | |
Н | Пиридоксин | 0.03 | |
рН раствора А доводили до значения 7.1 при помощи NH4OH |
Таблица 3 | ||
Штамм | OD540 | Количество L-аргинина, г/л |
382 | 18.6±5.0 | 9.4±0.8 |
382-ΔaldH | 18.1±3.7 | 10.0±1.0 |
Claims (3)
1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-треонина или L-аргинина, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии инактивирован ген aldH.
2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген aldH инактивирован за счет делеции гена aldH в хромосоме бактерии.
3. Способ получения L-треонина или L-аргинина, включающий:
выращивание бактерии по любому из пп.1 и 2 в питательной среде, вызывающее продукцию и накопление указанной L-аминокислоты в культуральной жидкости; и
выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006102181/13A RU2330882C2 (ru) | 2006-01-26 | 2006-01-26 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН aldH |
EP07707570A EP1976994A1 (en) | 2006-01-26 | 2007-01-23 | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene |
PCT/JP2007/051339 WO2007086546A1 (en) | 2006-01-26 | 2007-01-23 | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene |
US12/125,988 US20100143982A1 (en) | 2006-01-26 | 2008-05-23 | METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE aldH GENE |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006102181/13A RU2330882C2 (ru) | 2006-01-26 | 2006-01-26 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН aldH |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2006102181A RU2006102181A (ru) | 2007-08-20 |
RU2330882C2 true RU2330882C2 (ru) | 2008-08-10 |
Family
ID=38511469
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006102181/13A RU2330882C2 (ru) | 2006-01-26 | 2006-01-26 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН aldH |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2330882C2 (ru) |
-
2006
- 2006-01-26 RU RU2006102181/13A patent/RU2330882C2/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HEMPEL J. et. al. Aldehyde dehydrogenase. Maintaining critical active site geometry at motif 8 in the class 3 enzyme. Eur J Biochem. 2001 Feb; 268(3):722-6. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2006102181A (ru) | 2007-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1848811B1 (en) | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family | |
US7919283B2 (en) | Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of any of the cynT, cynS, cynX or cynR gene or combination thereof | |
US7888077B2 (en) | Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of the kefB gene | |
RU2501858C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae | |
US7794988B2 (en) | Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of the rspAB operon | |
EP1929027B1 (en) | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE ybiV GENE | |
EP1856243B1 (en) | Process for producing an l-amino acid employing a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated leuo expression | |
RU2366703C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН tolC | |
RU2337959C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yfeH | |
RU2337956C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН lrhA | |
RU2497943C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae | |
RU2359029C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН rcsA | |
EP1856242B1 (en) | Process for producing a l-amino acid employing a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated nac expression | |
WO2006123763A1 (en) | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the dicb and/or dicf gene | |
WO2007086546A1 (en) | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene | |
RU2330882C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН aldH | |
RU2337957C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН fdrA | |
RU2337958C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН bisC | |
RU2330881C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yrbG | |
RU2333954C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА И L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ybdA | |
RU2333951C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕАРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН kefB | |
RU2351646C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-треонина С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia | |
RU2333952C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН b2383 | |
RU2501856C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae | |
RU2482188C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE |