RU2325171C1 - Method of trophoblastic beta-1-glycoprotein release and purification - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine; chemistry-pharmaceutical industry.

SUBSTANCE: trophoblastic beta-1-glycoprotein is released from serosity produced as a result of differential centrifugation of retroplacental human blood. Supernatant after first centrifugation is saturated with sodium chloride (0.1-1.0 mole/l) to prevent non-specific sorption and centrifuged once more with triton X-100 (0.01-0.05%) to virus inactivation. Then it is applied to affine sorbent that is sepharose with solid-phase monoclonal antibodies to trophoblastic beta-1-glycoprotein. Protein is eluated with 0.1 M glycine-HCI buffer solution, and after neutralization and in-depth analysis second affine chromatography is carried out on sepharose with modified protein G, released from streptococcus cell wall to prevent immunoglobulin contamination. Solution passed through column and trophoblastic beta-1-glycoprotein is been concentrating and dialyzing from saline and lyophilized.

EFFECT: increased output and purity of end product.

2 ex

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине, биотехнологии для получения препарата трофобластического β-1-гликопротеина (ТБГ), используемого в качестве компонента диагностических систем и средства для лечения онкологических, аутоиммунных и аллергических заболеваний. Способ позволяет увеличить выход и чистоту целевого продукта.The invention relates to the pharmaceutical industry and can be used in medicine, biotechnology to obtain a trophoblastic β-1-glycoprotein (TBH) preparation used as a component of diagnostic systems and means for treating cancer, autoimmune and allergic diseases. The method allows to increase the yield and purity of the target product.

Известно, что ТБГ, являясь специфическим маркером беременности, синтезируется трофобластом и выделяется в кровоток матери. По мнению большинства авторов ТБГ является гликопротеином, содержащим до 28% углеводов и имеющим молекулярную массу от 90000 Д (Bohn Н., 1974) до 113000 Д (Татаринов Ю.С. и др., 1974). Однако в литературе присутствуют данные о том, что ТБГ образует семейство, состоящее из 4 белков с молекулярной массой 72, 64, 62 и 54 кД (Plouzek C.A. и Chou J.Y, 1991). Другие же авторы полагают, что ТБГ является гетерогенным белком, гетерогенность которого обусловлена наличием двух вариантов ТБГ - альфа и бета (Pola A. et al., 1992). При этом молекулярный вес ТБГ-альфа равен 110 кД, а ТБГ-бета - 75 кД (Ito M. et al., 1981). Отсутствие достоверно подтвержденных данных о молекулярной гетерогенности ТБГ и точного описания структуры молекулы в значительной степени является причиной отсутствия эффективной системы его выделения и очистки. Источником для получения ТБГ является ретроплацентарная кровь.It is known that TBH, being a specific marker of pregnancy, is synthesized by trophoblast and secreted into the bloodstream of the mother. According to most authors, TBH is a glycoprotein containing up to 28% carbohydrates and having a molecular weight of from 90,000 D (Bohn N., 1974) to 113,000 D (Tatarinov Yu.S. et al., 1974). However, there is evidence in the literature that TBH forms a family of 4 proteins with a molecular weight of 72, 64, 62, and 54 kD (Plouzek C. A. and Chou J. Y, 1991). Other authors believe that TBH is a heterogeneous protein, the heterogeneity of which is due to the presence of two variants of TBH - alpha and beta (Pola A. et al., 1992). The molecular weight of TBH-alpha is 110 kD, and TBH-beta is 75 kD (Ito M. et al., 1981). The absence of reliably confirmed data on the molecular heterogeneity of TBH and an accurate description of the structure of the molecule is largely the reason for the lack of an effective system for its isolation and purification. The source for receiving TBH is retroplacental blood.

Известен многоэтапный способ выделения ТБГ из ретроплацентарной крови человека [1]. Сыворотку, полученную из ретроплацентарной крови, фракционировали последовательно риванолом и сульфатом аммония, после чего подвергали гельфильтрации на сефадексе G-25. Полученный материал подвергали ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Фракции, содержащие ТБГ, объединяли, фракционировали сульфатом аммония и проводили гельфильтрацию на сефадексе G-200. После очередного сульфатаммонийного фракционирования и диализа проводили хроматографию на колонке с гидроксилапатитом и следом после осветления центрифугированием ионообменную хроматографию на микрогранулярной целлюлозе КМ-32. Завершающим этапом очистки являлось препаративное изоэлектрофокусирование на амфолинах с диапазоном 3,0-10,0. Результатом всей процедуры очистки являлось получение препарата ТБГ со степенью очистки 93%. Выход составлял 1,1%.Known multi-stage method for the allocation of TBH from human retroplacental blood [1]. Serum obtained from retro-placental blood was successively fractionated with rivanol and ammonium sulfate, and then subjected to gel filtration on Sephadex G-25. The resulting material was subjected to ion exchange chromatography on DEAE cellulose. TBH containing fractions were combined, fractionated with ammonium sulfate and gel filtration was performed on Sephadex G-200. After another ammonium sulfate fractionation and dialysis, chromatography was performed on a column of hydroxylapatite and, after clarification by centrifugation, ion-exchange chromatography on KM-32 microgranular cellulose. The final stage of purification was preparative isoelectric focusing on ampholines with a range of 3.0-10.0. The result of the entire cleaning procedure was the preparation of TBH with a degree of purification of 93%. The yield was 1.1%.

Процедура очистки, позволившая получить 1,8 мг относительно чистого искомого белка из пробы, содержащей 160 мг, предусматривает две процедуры гельфильтрационной, две ионообменной, одну гидрофобной хроматографий, три процедуры сульфатаммонийного фракционирования и изоэлектрофокусирование.The purification procedure, which made it possible to obtain 1.8 mg of the relatively pure desired protein from a sample containing 160 mg, involves two gel filtration, two ion exchange, one hydrophobic chromatography, three ammonium sulfate fractionation and isoelectrofocusing procedures.

Таким образом, явными недостатками описанного метода являются чрезвычайная громоздкость и трудоемкость, очень высокая затратность, особенно с учетом чрезвычайно низкого выхода целевого продукта равного 1,1%.Thus, the obvious disadvantages of the described method are the extreme bulkiness and complexity, very high cost, especially given the extremely low yield of the target product equal to 1.1%.

Известен способ выделения ТБГ из отходов производства гамма-глобулина из ретроплацентарной крови [2], предусматривающий суспендирование твердого осадка, содержащего ТБГ в воде, центрифугирование и последующее сульфат аммонийное фракционирование. После 4-суточного диализа и центрифугирования полученный супернатант обрабатывают гидроксилапатитом и, проинкубировав 30-60 минут, вновь центрифугируют. Супернатант подвергают концентрированию на ультрафильтрах и двухсуточному диализу, после чего центрифугируют и лиофилизируют. Лиофилизированный препарат растворяют в фосфатном буфере и подвергают колоночной хроматографии на гидроксилапатите. Элюат диализуют в течение 36 часов и лиофилизируют. Выход составляет 35,5%, чистота препарата - 95%. Описанный способ превосходит предыдущий и по чистоте получаемого препарата и по выходу, однако также весьма трудоемок, занимает существенное время и приводит к неоправданным потерям за счет многочисленных процедур диализа.There is a method of isolating TBG from waste products of gamma globulin from retro-placental blood [2], involving the suspension of a solid precipitate containing TBG in water, centrifugation and subsequent ammonium sulfate fractionation. After 4-day dialysis and centrifugation, the resulting supernatant is treated with hydroxylapatite and, after incubation for 30-60 minutes, centrifuged again. The supernatant is subjected to concentration on ultrafilters and two-day dialysis, after which it is centrifuged and lyophilized. The lyophilized preparation is dissolved in phosphate buffer and subjected to hydroxylapatite column chromatography. The eluate is dialyzed for 36 hours and lyophilized. The yield is 35.5%, the purity of the drug is 95%. The described method is superior to the previous one both in the purity of the obtained preparation and in the yield, however, it is also very laborious, takes a considerable time and leads to unjustified losses due to numerous dialysis procedures.

Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является способ получения ТБГ из сыворотки ретроплацентарной крови или осадка, полученного при производстве гамма-глобулина из сыворотки ретроплацентарной крови [3], предусматривающий сульфат аммонийное фракционирование с последующим диализом в течение 4-х суток. После центрифугирования супернатант подвергают ионообменной хроматографии. Элюат концентрируют и диализуют в течение 72 часов. Отдиализованный препарат центрифугируют и пропускают через сорбент, содержащий лектин (конканавалин А). Элюированную фракцию, содержащую ТБГ, диализуют и лиофилизируют. Выход препарата при чистоте 96% составляет 20%.The closest analogue of the claimed invention is a method for producing TBG from serum of retro-placental blood or sediment obtained in the production of gamma globulin from serum of retro-placental blood [3], involving ammonium sulfate fractionation, followed by dialysis for 4 days. After centrifugation, the supernatant is subjected to ion exchange chromatography. The eluate is concentrated and dialyzed for 72 hours. The dialyzed preparation is centrifuged and passed through a sorbent containing lectin (concanavalin A). The eluted fraction containing TBH is dialyzed and lyophilized. The yield of the drug with a purity of 96% is 20%.

В самой процедуре так называемого байч варианта описанной ионообменной хроматографии на гексилсефарозе заложены высокие количественные потери белка. Длительность осуществления способа, а также низкий выход целевого продукта не позволяют рассматривать описанный способ как решение проблемы выделения и очистки такого сложного белка как трофобластический бета-1-гликопротеин.The procedure of the so-called bich variant of the described ion-exchange chromatography on hexyl sepharose contains high quantitative losses of protein. The duration of the method and the low yield of the target product do not allow us to consider the described method as a solution to the problem of isolation and purification of such a complex protein as trophoblastic beta-1-glycoprotein.

Технической задачей изобретения является увеличение выхода и чистоты выделяемого ТБГ. Поставленная задача достигается следующим образом.An object of the invention is to increase the yield and purity of released TBH. The task is achieved as follows.

Проверенную на отсутствие вируса гепатита В антител к ВИЧ, гепатиту С ретроплацентарную кровь центрифугируют, добавляют в нее натрия хлорид (0,1-1,0 моль/л) и тритон Х-100 (0,01-0,05%) для блокирования неспецифической сорбции и инактивации вирусов, вновь центрифугируют. Подготовленную таким образом сыворотку насыщают сульфатом аммония до 30%, инкубируют в течение ночи при +4°С и перемешивании и центрифугируют. Осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорида натрия, и диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буфера. Полученный препарат наносят на первый аффинный сорбент с иммобилизованными моноклональными антителами к ТБГ. Неспецифически сорбировавшиеся компоненты сыворотки вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами 0,15 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,0-7,5, содержащего 0,5 М хлорида натрия, и таким же объемом 0,15 М раствора хлорида натрия. Аффинно-связанный ТБГ элюируют 0,1 М глицин-HCl буферным раствором.Tested for the absence of hepatitis B virus antibodies to HIV, hepatitis C, retro-placental blood is centrifuged, sodium chloride (0.1-1.0 mol / L) and triton X-100 (0.01-0.05%) are added to it to block non-specific sorption and inactivation of viruses, again centrifuged. Serum thus prepared is saturated with ammonium sulfate to 30%, incubated overnight at + 4 ° C and stirring and centrifuged. The precipitate is washed three times with 30% ammonium sulfate, suspended in 0.15 M phosphate-buffered saline pH 7.0-7.5 containing 0.5 M sodium chloride, and dialyzed in an ultrafiltration cell, passing a 10-fold volume of buffer. The resulting preparation is applied to the first affinity sorbent with immobilized monoclonal antibodies to TBH. Non-specifically adsorbed serum components are washed from the sorbent sequentially with 4-5 volumes of 0.15 M phosphate-buffered saline pH 7.0-7.5 containing 0.5 M sodium chloride and the same volume of 0.15 M sodium chloride solution. Affinity-bound TBH is eluted with 0.1 M glycine-HCl buffer solution.

Элюат быстро нейтрализуют до рН 6,5-7,5, диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на сорбент с иммобилизованным белком G, где происходит избирательная аффинная сорбция (негативная хроматография) контаминирующих иммуноглобулинов. Контаминация препарата иммуноглобулинами G человека после первой аффинной очистки верифицирована исследованием методом LC-MS/MS спектроскопии. Эффективность использования указанного сорбента обусловлена способностью белка G, выделенного из клеточной стенки стрептококка, чрезвычайно эффективно связываться с Fc-фрагментами иммуноглобулинов G большинства млекопитающих и в первую очередь со всеми типами IgG человека.The eluate is quickly neutralized to a pH of 6.5-7.5, dialyzed against phosphate-buffered saline and applied to a sorbent with immobilized protein G, where selective affinity sorption (negative chromatography) of contaminating immunoglobulins occurs. The contamination of the drug with human G immunoglobulins after the first affinity purification was verified by LC-MS / MS spectroscopy. The effectiveness of the use of this sorbent is due to the ability of protein G isolated from the cell wall of streptococcus to bind extremely effectively to Fc fragments of immunoglobulins G of most mammals, and primarily to all types of human IgG.

Определяющим преимуществом предлагаемого способа является возможность двухстадийного получения препарата ТБГ с высокой степенью чистоты и эффективным выходом целевого продукта.The determining advantage of the proposed method is the possibility of a two-stage preparation of TBH with a high degree of purity and effective yield of the target product.

Аффинный сорбент с моноклональными антителами получают следующим образом. 200 мг моноклональных антител к трофобластическому бета-1-гликопротеину) инкубируют с суспензией 50 мл BrCN-сефарозы FF, предварительно уравновешенной в 0,1М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 8,3 с 0,5М хлорида натрия (КББ) в течение ночи на шейкере при +4°С. После отмывки 15 объемами КББ сорбент инкубируют с 1,0 М раствором этаноламина 2 часа при комнатной температуре и перемешивании. Завершается синтез сорбента пятью циклами отмывки поочередно 0,1 М ацететным буфером с 0,5 М NaCl рН 3,5 и 0,1 М ТрисHCl буфером с 0,5 М NaCl рН 8,5. Хранится сорбент в забуференном физрастворе с 0,1% азида натрия.Monoclonal antibody affinity sorbent is prepared as follows. 200 mg of monoclonal antibodies to trophoblastic beta-1-glycoprotein) are incubated with a suspension of 50 ml BrCN-Sepharose FF, previously equilibrated in 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer pH 8.3 with 0.5 M sodium chloride (KBB) overnight on a shaker at + 4 ° С. After washing with 15 volumes of CBB, the sorbent is incubated with a 1.0 M ethanolamine solution for 2 hours at room temperature with stirring. The sorbent synthesis is completed by five washing cycles alternately with 0.1 M acetate buffer with 0.5 M NaCl pH 3.5 and 0.1 M Tris HCl buffer with 0.5 M NaCl pH 8.5. The sorbent is stored in buffered saline with 0.1% sodium azide.

Способ иллюстрируется следующими примерами.The method is illustrated by the following examples.

Пример 1. Все процедуры проводят при +4°С. 1,0 л ретроплацентарной крови центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа, осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют натрия хлорид до конечной концентрации 0,5 М и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,02%. Центрифугирование повторяют. Сыворотку, содержащую 52 мг ТБГ, подготовленную таким образом, насыщают сульфатом аммония до 30%, инкубируют в течение ночи при перемешивании и центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа. Осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорида натрия, и диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буфера. Полученный препарат объединяют с 50 мл сефарозы FF, модифицированной моноклональными антителами к ТБГ. Инкубацию осуществляют в течение 12 ч при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере.Example 1. All procedures are carried out at + 4 ° C. 1.0 L of retro-placental blood is centrifuged at a speed of 10,000 rpm for 1 hour, the precipitate is discarded, and sodium chloride is added to the supernatant to a final concentration of 0.5 M and Triton X-100 to a final concentration of 0.02%. Centrifugation is repeated. Serum containing 52 mg of TBH, thus prepared, is saturated with ammonium sulfate to 30%, incubated overnight with stirring, and centrifuged at 10,000 rpm for 1 hour. The precipitate is washed three times with 30% ammonium sulfate, suspended in 0.15 M phosphate-buffered saline pH 7.0-7.5 containing 0.5 M sodium chloride, and dialyzed in an ultrafiltration cell, passing a 10-fold volume of buffer. The resulting preparation is combined with 50 ml of Sepharose FF modified with monoclonal antibodies to TBH. Incubation is carried out for 12 hours with constant stirring on an orbital shaker.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты сыворотки вымывают с сорбента последовательно 4-5 объемами фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида и таким же количеством 0,15 М раствора натрия хлорида. Сорбент помещают в хроматографическую колонку 2,5×8,0 см. После отмывки сорбента раствором натрия хлорида проводят элюцию 0,1 М глицин-HCl буферным раствором с рН 2,55 со скоростью 80 мл/час, контролируя процесс по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюцию проводят до достижения нулевых значений оптической плотности. Фракции элюата, содержащие целевой продукт, объединяют, немедленно нейтрализуют до рН 6,5-7,5, диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на колонку с сефарозой с белком G. Скорость нанесения 60 мл/ч.Non-specifically adsorbed serum components are washed out from the sorbent sequentially with 4-5 volumes of phosphate-saline buffer solution containing 0.5 M sodium chloride and the same amount of 0.15 M sodium chloride solution. The sorbent is placed in a chromatographic column 2.5 × 8.0 cm. After washing the sorbent with a sodium chloride solution, an elution with 0.1 M glycine-HCl buffer solution with a pH of 2.55 at a rate of 80 ml / hour is carried out, controlling the process by optical density at a length of waves of 280 nm. Elution is carried out until zero optical density is reached. The eluate fractions containing the desired product are combined, immediately neutralized to a pH of 6.5-7.5, dialyzed against phosphate-buffered saline and applied to a column of Sepharose with protein G. Application rate 60 ml / h.

Полученный препарат, содержащий ТБГ, очищенный от примесных белков, концентрируют и диализуют в ультрафильтрационной ячейке относительно физиологического раствора и лиофилизируют.The resulting preparation containing TBG, purified from impurity proteins, is concentrated and dialyzed in an ultrafiltration cell relative to physiological saline and lyophilized.

Чистота полученного препарата, анализируемая методом электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля, составляет 98%. Выход препарата по данным иммуноферментного анализа составляет 35,9 мг (69%). Полученный препарат тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.The purity of the obtained preparation, analyzed by electrophoresis in a density gradient of polyacrylamide gel, is 98%. The output of the drug according to enzyme immunoassay is 35.9 mg (69%). The resulting preparation is tested for the absence of antibodies to HIV, hepatitis B virus and antibodies to hepatitis C.

Пример 2. Все процедуры проводят при +4°С. 1,0 л ретроплацентарной крови центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа, осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют натрия хлорид до конечной концентрации 0,5 М и тритон Х-100 до конечной концентрации 0,02%. Центрифугирование повторяют. Сыворотку, содержащую 52 мг ТБГ, подготовленную таким образом, насыщают сульфатом аммония до 30%, инкубируют в течение ночи при перемешивании и центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 1 часа. Осадок трижды отмывают 30% сульфатом аммония, суспендируют в 0,15 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,5, содержащем 0,5 М хлорида натрия, и диализуют в ультрафильтрационной ячейке, пропуская 10-кратный объем буфера. Препарат наносят на хроматографическую колонку 2,5×8,0, заполненную 50 мл сефарозы FF с иммобилизованными моноклональными антителами к ТБГ, эквилибрированную фосфатно-солевым буферным раствором. Скорость нанесения 40 мл/ч. Нанесение осуществляют трехкратным прохождением наносимого объема через колонку.Example 2. All procedures are carried out at + 4 ° C. 1.0 L of retro-placental blood is centrifuged at a speed of 10,000 rpm for 1 hour, the precipitate is discarded, and sodium chloride is added to the supernatant to a final concentration of 0.5 M and Triton X-100 to a final concentration of 0.02%. Centrifugation is repeated. Serum containing 52 mg of TBH, thus prepared, is saturated with ammonium sulfate to 30%, incubated overnight with stirring, and centrifuged at 10,000 rpm for 1 hour. The precipitate is washed three times with 30% ammonium sulfate, suspended in 0.15 M phosphate-buffered saline pH 7.0-7.5 containing 0.5 M sodium chloride, and dialyzed in an ultrafiltration cell, passing a 10-fold volume of buffer. The preparation is applied to a chromatographic column 2.5 × 8.0, filled with 50 ml of Sepharose FF with immobilized monoclonal antibodies to TBH, equilibrated with phosphate-buffered saline. Application rate 40 ml / h. Application is carried out by triple passage of the applied volume through the column.

Неспецифически сорбировавшиеся компоненты крови вымывают с сорбента последовательно фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,5 М натрия хлорида и 0,15 М раствором натрия хлорида, со скоростью 80 мл/ч до достижения нулевых значений оптической плотности.Non-specifically adsorbed blood components are washed out of the sorbent sequentially with a phosphate-saline buffer solution containing 0.5 M sodium chloride and 0.15 M sodium chloride solution at a rate of 80 ml / h until the optical density reaches zero.

После отмывки сорбента проводят элюцию 0,1 М глицин-НС буферным раствором с рН 2,55 и скоростью 40 мл/ч. Процесс элюции контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюция проводится до достижения нулевых значений оптической плотности. Элюируемые фракции, содержащий целевой продукт, объединяют, немедленно нейтрализуют до рН 6,5-7,5, диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на колонку с сефарозой с белком G. Скорость нанесения 60 мл/ч.After washing the sorbent, an elution with 0.1 M glycine-HC buffer solution with a pH of 2.55 and a speed of 40 ml / h is carried out. The elution process is controlled by optical density at a wavelength of 280 nm. Elution is performed until the optical density reaches zero. The eluted fractions containing the target product are combined, immediately neutralized to a pH of 6.5-7.5, dialyzed against phosphate-buffered saline and applied to a column of Sepharose with protein G. Application rate 60 ml / h.

Весь прошедший через колонку раствор, содержащий ТБГ, концентрируют и диализуют относительно физиологического раствора и лиофилизируют.The entire TBH solution passing through the column is concentrated and dialyzed relative to saline and lyophilized.

Чистота полученного препарата, анализируемая методом электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля, составляет 98%. Выход препарата по данным иммуноферментного анализа составляет 39,5 мг (76%). Полученный препарат тестируют на отсутствие антител к ВИЧ, вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С.The purity of the obtained preparation, analyzed by electrophoresis in a density gradient of polyacrylamide gel, is 98%. The output of the drug according to enzyme immunoassay is 39.5 mg (76%). The resulting preparation is tested for the absence of antibodies to HIV, hepatitis B virus and antibodies to hepatitis C.

Использование предлагаемого способа позволяет получать целевой продукт с высокой степенью чистоты (не менее 98%) и высоким - 69-76% выходом. Полученные результаты достигаются за счет применения двух высокоаффинных сорбентов, эксплуатирующих уникальные свойства моноклональных антител и белка G стрептококка.Using the proposed method allows to obtain the target product with a high degree of purity (not less than 98%) and high - 69-76% yield. The results are achieved through the use of two high-affinity sorbents that exploit the unique properties of monoclonal antibodies and streptococcus G protein.

Источники информацииInformation sources

1. А.В.Соколов, Г.А.Козляев, Н.В.Меснянкин, Ю.С.Татаринов. Выделение и очистка специфичного β1-г-глобулина. «Вопросы медицинской химии», 1978, №24, с.с.240-244.1. A.V. Sokolov, G.A. Kozlyaev, N.V. Mesnyankin, and Yu.S. Tatarinov. Isolation and purification of specific β1-g-globulin. "Questions of medical chemistry", 1978, No. 24, pp. 240-244.

2. С.В.Мороз, С.К.Кривоносов, А.Ф.Павленко, Ю.С.Оводов, Ю.С.Татаринов. Способ получения трофобластического бета-1-гликопротеина из отходов ретроплацентарной крови при производстве гамма-глобулина. А.с. №1341736, приоритет 28.03.85.2. S.V. Moroz, S.K. Krivonosov, A.F. Pavlenko, Yu.S. Ovodov, Yu.S. Tatarinov. A method of obtaining trophoblastic beta-1-glycoprotein from waste retroplacental blood in the production of gamma globulin. A.S. No. 1341736, priority 03/28/85.

3. С.К.Кривоносов, А.А.Терентьев, И.И.Коптева, И.В.Москвичева, П.П.Хохлов, А.К.Барсуков, Ю.С.Татаринов. Способ получения трофобластического бетаргликопротеина. А.с. №1783644, приоритет 04.12.89.3. S.K. Krivonosov, A.A. Terentyev, I.I. Kopteva, I.V. Moskvicheva, P.P. Khokhlov, A.K. Barsukov, Yu.S. Tatarinov. A method of obtaining a trophoblastic betarglycoprotein. A.S. No. 1783644, priority 04.12.89.

Claims (1)

Способ выделения и очистки трофобластического бета-1-гликопротеина из сыворотки ретроплацентарной крови путем фракционирования сульфатом аммония, отмывки и центрифугирования растворенного осадка, диализа и хроматографии, отличающийся тем, что сыворотку после центрифугирования при 10000 об/мин и насыщения хлоридом натрия до конечной концентрации 0,1-1,0 моль/л и тритоном Х-100 до конечной концентрации 0,01-0,05%, обработанную сульфатом аммония до 30% насыщения и отдиализованную в ультрафильтрационной ячейке, подвергают двойной аффинной хроматографии, а именно: нанасят на первый аффинный сорбент, представляющий собой сефарозу с иммобилизированными моноклональными антителами к трофобластическому бета-1-гликопротеину, аффинносвязанный ТБГ элюируют 0,1М глицин-HCl буферным раствором рН 2,55, элюат немедленно нейтрализуют, диализуют против фосфатно-солевого буферного раствора и наносят на второй аффинный сорбент, представляющий собой сефарозу, модифицированную белком G, выделенным из клеточной стенки стрептококка, раствор, прошедший через колонку и содержащий ТБГ, концентрируют, диализуют против физраствора и лиофилизируют.The method of isolation and purification of trophoblastic beta-1-glycoprotein from serum retroplacental blood by fractionation of ammonium sulfate, washing and centrifugation of the dissolved precipitate, dialysis and chromatography, characterized in that the serum after centrifugation at 10000 rpm and saturation with sodium chloride to a final concentration of 0, 1-1.0 mol / L and triton X-100 to a final concentration of 0.01-0.05%, treated with ammonium sulfate to 30% saturation and dialyzed in an ultrafiltration cell, subjected to double affinity chromatography phase, namely, it is applied to the first affinity sorbent, which is sepharose with immobilized monoclonal antibodies to trophoblastic beta-1-glycoprotein, affinity-bound TBH is eluted with 0.1 M glycine-HCl buffer solution, pH 2.55, the eluate is immediately neutralized, dialyzed against phosphate saline buffer solution and applied to the second affinity sorbent, which is sepharose, modified with protein G isolated from the cell wall of streptococcus, the solution passing through the column and containing TBH is concentrated, dialy they are called against saline and lyophilized.