RU2320718C2 - METHOD FOR PREPARING L-THREONINE USING MICROORGANISM BELONGING TO ESCHERICHIA GENUS WHEREIN hipA GENE IS INACTIVATED - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, microbiology, amino acids.

SUBSTANCE: invention represents a method for preparing L-threonine. Method involves culturing a modified microorganism belonging to Escherichia genus wherein hipA gene is inactivated, and isolation of L-threonine from cultural fluid. Invention provides preparing L-threonine with the high degree of effectiveness.

EFFECT: improved preparing method of amino acid.

3 cl, 2 tbl, 3 dwg, 13 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена hipA в указанной бактерии ослаблена.The present invention relates to the microbiological industry, in particular to a method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family, modified in such a way that expression of the hipA gene in said bacterium is weakened.

Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Related Art

Способность клеток бактерии Escherichia coli к выживанию в условиях длительного воздействия антибиотиков группы пенициллина, называемая высокой устойчивостью [high persistence (hip)], связана с мутациями гена hipA. Оперон hip состоит из двух генов, hipA и hipB. Ген hipA кодирует токсин HipA, тогда как ген hipB кодирует ДНК-связывающий белок, который регулирует экспрессию оперона hipBA и, связываясь с HipA, нейтрализует его токсичное действие (Korch, S.B., Henderson, T.A., and Hill, T.M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Mol. Microbiol., 2003, 50(4):1199-1213).The ability of Escherichia coli bacteria to survive under prolonged exposure to penicillin antibiotics, called high persistence (hip), is associated with mutations in the hipA gene. The hip operon consists of two genes, hipA and hipB. The hipA gene encodes a HipA toxin, while the hipB gene encodes a DNA-binding protein that regulates the expression of the hipBA operon and, by binding to HipA, neutralizes its toxic effect (Korch, SB, Henderson, TA, and Hill, TM Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p) ppGpp synthesis. Mol. Microbiol., 2003, 50 (4): 1199-1213).

В популяциях бактерий появляются клетки, обладающие высокой устойчивостью, которые не погибают в присутствии бактерицидных веществ, но также и не растут, и, таким образом, проявляют множественную устойчивость к лекарствам [multidrug tolerance (MDT)]. Делеция оперона hipBA приводит к резкому уменьшению числа клеток, обладающих высокой устойчивостью, как в стационарных, так и пленочных популяциях. Таким образом, ген hipA является первым геном, для которого были получены доказательства его участия в механизме множественной устойчивости к лекарствам (Keren, I. et al. Specialized persister cells and the mechanism of multidrug tolerance in Escherichia coli. J. Bacteriol, 2004, 186(24):8172-8180).Highly resistant cells appear in bacterial populations that do not die in the presence of bactericidal substances, but also do not grow, and thus exhibit multiple drug resistance [multidrug tolerance (MDT)]. The deletion of the hipBA operon leads to a sharp decrease in the number of cells with high resistance, both in stationary and film populations. Thus, the hipA gene is the first gene for which evidence has been obtained of its participation in the mechanism of multiple drug resistance (Keren, I. et al. Specialized persister cells and the mechanism of multidrug tolerance in Escherichia coli. J. Bacteriol, 2004, 186 (24): 8172-8180).

Было установлено, что в штамме К-12 бактерии Escherichia coli мутации гена hipA значительно снижают гибель клеток вследствие избирательного ингибирования синтеза пептидогликана. Данные мутации снижают гибель клеток, которая сопровождается или избирательным ингибированием синтеза ДНК, или тепловым шоком в штаммах с поврежденным геном htpR. Кроме того, мутантные аллели гена hipA ответственны за обратимое блокирование клеточного деления, чувствительное к холоду, а также синтез макромолекул, в частности, пептидогликана (Scherrer, R. and Moyed, H.S. Conditional impairment of cell division and altered lethality in hipA mutants of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1988, 170(8):3321-3326).In Escherichia coli strain K-12, hipA gene mutations were found to significantly reduce cell death due to selective inhibition of peptidoglycan synthesis. These mutations reduce cell death, which is accompanied by either selective inhibition of DNA synthesis or heat shock in strains with a damaged htpR gene. In addition, mutant alleles of the hipA gene are responsible for the reversible blocking of cell division, sensitive to cold, as well as the synthesis of macromolecules, in particular peptidoglycan (Scherrer, R. and Moyed, HS Conditional impairment of cell division and altered lethality in hipA mutants of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1988, 170 (8): 3321-3326).

Также было показано, что повышенная экспрессия гена hipA приводит к устойчивости к антибиотикам в условиях, которые не влияют на скорость роста клеток. Повышенная экспрессия гена hipA, вероятно, приводит к уменьшению периода, в течение которого бактерии восприимчивы к действию антибиотиков, временно воздействуя на репликацию хромосомы или клеточное деление (Falla, T.J. and Chopra I. Joint tolerance to beta-lactam and fluoroquinolone antibiotics in Escherichia coli results from overexpression of hipA. Antimicrob Agents Chemother., 1998, 42(12):3282-3284).It has also been shown that increased hipA gene expression leads to antibiotic resistance under conditions that do not affect cell growth rate. Overexpression of the hipA gene probably leads to a decrease in the period during which bacteria are susceptible to antibiotics, temporarily affecting chromosome replication or cell division (Falla, TJ and Chopra I. Joint tolerance to beta-lactam and fluoroquinolone antibiotics in Escherichia coli results from overexpression of hip A. Antimicrob Agents Chemother., 1998, 42 (12): 3282-3284).

Но в настоящее время нет сообщений, описывающих использование инактивации гена hipA для получения L-аминокислот.But there are currently no reports describing the use of hipA gene inactivation to produce L-amino acids.

Описание изобретенияDescription of the invention

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения L-аминокислоты с использованием этих штаммов.The objectives of the present invention are to increase the productivity of strains producing L-amino acids and provide a method for producing L-amino acids using these strains.

Вышеупомянутые цели были достигнуты путем установления того факта, что инактивация гена hipA может привести к повышению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.The above goals were achieved by establishing the fact that inactivation of the hipA gene can lead to increased production of L-amino acids such as L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-leucine, L-histidine, L-glutamic acid, L -phenylalanine, L-tryptophan, L-proline and L-arginine.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.The present invention provides a bacterium of the Enterobacteriaceae family that is capable of increased production of amino acids such as L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-leucine, L-histidine, L-glutamic acid, L-phenylalanine, L-tryptophan, L Proline and L-Arginine.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена hipA в указанной бактерии ослаблена.The aim of the present invention is the provision of bacteria producing L-amino acids of the Enterobacteriaceae family, modified so that the expression of the hipA gene in the specified bacteria is weakened.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой ослабление экспрессии указанного гена hipA осуществлено путем инактивации указанного гена hipA.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above, wherein expression of said hipA gene is attenuated by inactivation of said hipA gene.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said bacterium belongs to the genus Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said bacterium belongs to the genus Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said L-amino acid is selected from the group consisting of an aromatic L-amino acid and a non-aromatic L-amino acid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein the aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.Another objective of the present invention is the provision of the bacteria described above, while the non-aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, L-glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartate, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline and L-arginine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя:Another objective of the present invention is the provision of a method for producing L-amino acids, which includes:

- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде и- growing the above bacteria in a nutrient medium for the purpose of production and accumulation of L-amino acids in a nutrient medium and

- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.- the allocation of the specified L-amino acids from the culture fluid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said L-amino acid is selected from the group consisting of an aromatic L-amino acid and a non-aromatic L-amino acid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said non-aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine , L-histidine, L-glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartate, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline and L-arginine.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.In more detail, the present invention is described below.

Подробное описание наилучшего способа осуществления изобретенияDetailed Description of the Best Mode for Carrying Out the Invention

1. Бактерия согласно настоящему изобретению1. The bacterium according to the present invention

Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что экспрессия гена hipA в указанной бактерии ослаблена.The bacterium of the present invention is an L-amino acid producing bacterium of the Enterobacteriaceae family, modified in such a way that the expression of the hipA gene in said bacterium is weakened.

Согласно настоящему изобретению «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.According to the present invention, “L-amino acid producing bacterium” means a bacterium capable of producing and secreting an L-amino acid into a culture medium when the bacterium of the present invention is grown in said culture medium.

Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах, по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким, как штамм Е.coli К-12, и, предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее, чем 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее, чем 1.0 г/л. Термин «L-аминокислота» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.As used herein, the term “L-amino acid producing bacterium” also means a bacterium that is capable of producing L-amino acid and causes the accumulation of L-amino acid in a fermentation medium in large quantities, compared to a natural or parent E. coli strain, such as a strain E. coli K-12, and preferably means that the microorganism is capable of accumulating in the medium the target L-amino acid in an amount of not less than 0.5 g / l, more preferably not less than 1.0 g / l. The term “L-amino acid” includes L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine, L-histidine, L-isoleucine , L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-valine.

Термин «ароматическая L-аминокислота» включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. Наиболее предпочтительны L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.The term “aromatic L-amino acid” includes L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan. The term “non-aromatic L-amino acid” includes L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, L-glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartate, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline and L-arginine. Most preferred are L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-leucine, L-histidine, L-glutamic acid, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-proline and L-arginine.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Бактерия, принадлежащая к родам Escherichia или Pantoea, предпочтительна.The Enterobacteriaceae family includes bacteria belonging to the genera Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, etc. More specifically, bacteria classified as belonging to the Enterobacteriaceae family according to the taxonomy used in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/ can be used. wgetorg? mode = Tree & id = 1236 & lvl = 3 & keep = 1 & srchmode = 1 & unlock). A bacterium belonging to the genera Escherichia or Pantoea is preferred.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia that can be used in the present invention is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1), can be included in the number of bacteria according to the present invention.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43:162-173).The term "bacterium belonging to the genus Pantoea" means that the bacterium belongs to the genus Pantoea in accordance with the classification known to the specialist in the field of microbiology. Recently, several Enterobacter agglomerans species have been classified as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii or the like based on analysis of the 16S rRNA nucleotide sequence, etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 162-173).

Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена hipA ослаблена» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белка Hip А по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белок Hip A.The term “bacterium is modified in such a way that the expression of the hipA gene is weakened” means that the bacterium has been modified so that, as a result of the modification, the bacterium contains a reduced amount of Hip A protein compared to an unmodified bacterium, or the specified bacterium is not able to synthesize Hip A protein .

Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена hipA ослаблена» также означает, что целевой ген модифицирован таким образом, что кодирует мутантный белок (белки), обладающие пониженной активностью.The term “bacterium is modified in such a way that the expression of the hipA gene is weakened” also means that the target gene is modified in such a way that it encodes a mutant protein (s) with reduced activity.

Термин «инактивация гена hipA» означает, что указанный ген модифицирован таким образом, что такой модифицированный ген кодирует полностью неактивный белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции целевого гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена, введения missense/nonsense мутации (мутаций) или модификации прилегающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы), сайт(ы) связывания рибосомы, и т.д.The term "inactivation of the hipA gene" means that the specified gene is modified in such a way that such a modified gene encodes a completely inactive protein. It is also possible that natural expression of the modified DNA region is not possible due to deletion of the target gene or part of it, shift of the reading frame of this gene, introduction of missense / nonsense mutations (mutations), or modification of regions adjacent to the gene that include sequences that control gene expression, such like promoter (s), enhancer (s), attenuator (s), ribosome binding site (s), etc.

Ген hipA кодирует белок Hip А, токсин (синонимы - b1507, G7995). Ген hipA (номера нуклеотидов с 1590200 по 1588878 в нуклеотидной последовательности с инвентарньм номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990; SEQ ID NO: 1) расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами yneL и hipB. Нуклеотидная последовательность гена hipA и соответствующая ей аминокислотная последовательность белка Hip А, кодируемого геном hipA, приведены в Списке последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO: 1) и 2 (SEQ ID NO: 2), соответственно.The hipA gene encodes a Hip A protein, a toxin (synonyms - b1507, G7995). The hipA gene (nucleotide numbers from 1590200 to 1588878 in the nucleotide sequence with inventory number NC_000913.2 in the GenBank database; gi: 49175990; SEQ ID NO: 1) is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the yneL and hipB genes. The nucleotide sequence of the hipA gene and the corresponding amino acid sequence of the Hip A protein encoded by the hipA gene are shown in the Sequence Listing Numbers 1 (SEQ ID NO: 1) and 2 (SEQ ID NO: 2), respectively.

Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена hipA не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID No:1), но также может включать и гены, гомологичные последовательности, приведенной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID No:1). Таким образом, вариант белка, кодируемого геном hipA, может быть представлен белком с гомологией не менее 80%, предпочтительно, не менее 90%, и, наиболее предпочтительно, не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO.2), при условии, что до инактивации сохраняется способность белка HipA проявлять токсичный эффект.Since representatives of various genera and strains of the Enterobacteriaceae family may experience some variations in the nucleotide sequences, the concept of the inactivated hipA gene is not limited to the gene shown in the Sequence Listing No. 1 (SEQ ID No: 1), but may also include genes homologous to the sequence shown in the List of sequences under the number 1 (SEQ ID No: 1). Thus, a variant of the protein encoded by the hipA gene can be represented by a protein with a homology of at least 80%, preferably at least 90%, and most preferably at least 95%, relative to the complete amino acid sequence shown in the List of sequences under number 2 (SEQ ID NO.2), provided that prior to inactivation, the ability of the HipA protein to exhibit a toxic effect is maintained.

Кроме того, ген hipA может быть представлен вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что указанный вариант до инактивации кодирует функциональный белок HipA. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно она составляет от 100 п.н. до 1 т.п.н.In addition, the hipA gene can be represented by a variant that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence shown in Sequence Listing number 1 (SEQ ID NO: 1), or with a probe that can be synthesized based on the specified nucleotide sequence, provided that the indicated variant encodes a functional HipA protein before inactivation. "Stringent conditions" include those conditions under which specific hybrids are formed, and non-specific hybrids are not formed. A practical example of harsh conditions is a one-time washing, preferably two or three times, at a salt concentration corresponding to standard washing conditions for Southern hybridization, for example, 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, at 60 ° C . The length of the probe can be selected depending on the hybridization conditions, usually it is from 100 bp up to 1 kb

Инактивация указанного гена может быть произведена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, инактивация гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 и Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45), так же называемого «Red-зависимой интеграцией».Inactivation of the indicated gene can be performed by conventional methods, such as mutagenesis using UV radiation or treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), site-directed mutagenesis, inactivation of the gene by homologous recombination, and / or insertion-deletion mutagenesis (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 and Datsenko KA and Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000 , 97: 12: 6640-45), also called “Red-Dependent Integration”.

Наличие активности белка HipA может быть определено путем комплементации мутации hipA^-, к примеру, с помощью метода, описанного Moyed, H.S. and Broderick S.H. (Molecular cloning and expression of hipA, a gene of Escherichia coli K-12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis. J. Bacteriol., 1986, 166(2):399-403). Таким образом, снижение или отсутствие активности белка HipA в бактерии согласно настоящему изобретению может быть определено путем сравнения указанной бактерии с родительской немодифицированной бактерией. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить путем измерения количества мРНК, транскрибируемой с целевого гена, с использованием различных известных методик, включая гибридизацию по Нозерну (Northern blotting), количественный метод ОТ-ПЦР (RT-PCR) и подобные им. Количество белка, кодируемого данным геном, может быть измерено с помощью известных методов, включающих метод SDS-PAGE с последующим иммуноблотингом (Western blotting) и подобные им.The presence of HipA protein activity can be determined by complementing the hipA mutation ^- for example, using the method described by Moyed, HS and Broderick SH (Molecular cloning and expression of hipA, a gene of Escherichia coli K-12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis. J. Bacteriol., 1986, 166 (2): 399-403). Thus, a decrease or absence of HipA protein activity in bacteria according to the present invention can be determined by comparing said bacterium with a parent unmodified bacterium. In addition, the level of gene expression can be estimated by measuring the amount of mRNA transcribed from the target gene using various known techniques, including Northern blotting, quantitative RT-PCR and the like. The amount of protein encoded by this gene can be measured using known methods, including the SDS-PAGE method followed by Western blotting and the like.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и дотирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобными им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Methods for obtaining plasmid DNA, cutting and donating DNA, transformation, selection of oligonucleotides as primers and the like can be conventional methods well known to those skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия-продуцент L-аминокислотыL-amino acid producing bacterium

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия гена hipA ослаблена, может быть использована бактерия, способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.As a bacterium according to the present invention, modified so that the expression of the hipA gene is impaired, a bacterium capable of producing an aromatic or non-aromatic L-amino acid can be used.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации гена hipA в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой ген hipA уже инактивирован, способности к продукции L-аминокислот.The bacterium of the present invention can be obtained by inactivating the hipA gene in a bacterium already possessing the ability to produce L-amino acids. On the other hand, the bacterium of the present invention can be obtained by giving the bacterium in which the hipA gene is already inactivated, the ability to produce L-amino acids.

Бактерия-продуцент L-треонинаL-threonine producing bacterium

Примеры родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM BP-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобные им.Examples of the parent strain for producing the L-threonine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain TDH-6 / pVIC40 (VKPM B-3996) (US Pat. Nos. 5,175,107 and 5,705,737) , E. coli strain NRRL-21593 (US patent 5939307), E. coli strain FERM BP-3756 (US patent 5474918), E. coli strains FERM BP-3519 and FERM BP-3520 (US patent 5376538), strain E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetics, 14, 947-956 (1978)), strains of E. coli VL643 and VL2055 (European patent application EP 1149911 A) and the like.

Штамм TDH-6 является дефектным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.The TDH-6 strain is defective in the thrC gene, is capable of assimilating sucrose, and contains the ilvA gene with a leaky mutation. The specified strain contains a mutation in the rhtA gene, which causes resistance to high concentrations of threonine and homoserine. Strain B-3996 contains the plasmid pVIC40, which was obtained by introducing into the vector derived from the RSF1010 vector the thrA * BC operon including the thrA mutant gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which has a significantly reduced feedback sensitivity to threonine inhibition. Strain B-3996 was deposited on November 19, 1987 at the All-Union Scientific Center for Antibiotics (RF, 117105 Moscow, Nagatinskaya St., 3-A) with inventory number RIA 1867. The strain was also deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (RF , 117545 Moscow, 1st Road passage, 1) with inventory number B-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:Preferably, the bacterium of the present invention is further modified so as to have increased expression of one or more of the following genes:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;- mutant thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, resistant to threonine inhibition by feedback type;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;- thrB gene encoding homoserine kinase;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;- thrC gene encoding threonine synthase;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;- rhtA gene, presumably encoding a transmembrane protein;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, иthe asd gene encoding aspartate β-semialdehyde dehydrogenase, and

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).- aspC gene encoding aspartate aminotransferase (aspartate transaminase).

Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарньм номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон.The nucleotide sequence of the thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 337 to 2799 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrA gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrL and thrB genes. The nucleotide sequence of the thrB gene encoding homoserine kinase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 2801 to 3733 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrB gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrA and thrC genes. The nucleotide sequence of the thrC gene encoding a threonine synthase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 3734 to 5020 in the sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrC gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrB gene and the open uaaX reading frame. All three of these genes function as one threonine operon.

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC могут быть получены в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.The mutant thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I resistant to threonine inhibition by feedback type, as well as the thrB and thrC genes, can be obtained as a single operon from the well-known plasmid pVIC40, which is represented in the E. coli producer strain VKPM B-3996. Plasmid pVIC40 is described in detail in US Pat. No. 5,705,371.

Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli около оперона glnHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi: 440181), расположен между генами рехВ и ompX. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserme and threonine). Также было показано, что мутация rhtA13 представляет собой замену А-на-G в положении - 1 по отношению к старт кодону ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract №457, EP 1013765 A).The rhtA gene is located 18 minutes from the E. coli chromosome near the glnHPQ operon, which encodes the components of the glutamine transport system, the rhtA gene is identical to ORF1 (ybiF gene, nucleotide numbers 764 to 1651 in sequence with accession number AAA218541 in the GenBank database, gi: 440181) , located between the genes pXB and ompX. A region of DNA expressed to form the protein encoded by the ORF1 reading frame was named the rhtA gene (rht: resistance to homoserme and threonine). It has also been shown that the rhtA13 mutation is an A-to-G substitution at position-1 with respect to the start of the ATG codon (ABSTRACTS of 17 ^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).

Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.The nucleotide sequence of the asd gene from E. coli is known (nucleotide numbers 3572511 to 3571408 in sequence with accession number NC_000913.1 in the GenBank database, gi: 16131307) and can be obtained using PCR (polymerase chain reaction; link to White, TJ et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) using primers synthesized based on the nucleotide sequence of the gene. Asd genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.Also, the nucleotide sequence of the aspC gene from E. coli is known (nucleotide numbers 983742 to 984932 in the sequence with accession number NC_000913.1 in the GenBank database, gi: 16128895) and can be obtained by PCR. AspC genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

Бактерия-продуцент L-лизинаL-lysine producing bacterium

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli АJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.Examples of bacteria producing L-lysine belonging to the genus Escherichia include mutants that are resistant to the L-lysine analogue. The L-lysine analogue inhibits the growth of bacteria belonging to the genus Escherichia, but this inhibition is completely or partially removed when L-lysine is also present in the medium. Examples of the L-lysine analogue include, but are not limited to, oxalysine, lysine hydroxyamate, S- (2-aminoethyl) -L-cysteine (AEC), γ-methyllysis, α-chlorocaprolactam, and so on. Mutants that are resistant to these lysine analogues can be obtained by treating bacteria belonging to the genus Escherichia with traditional mutagens. Specific examples of bacterial strains used to produce L-lysine include Escherichia coli strain AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; see US Pat. No. 4,346,170) and Escherichia coli strain VL611. In these microorganisms, aspartokinase is resistant to feedback inhibition by L-lysine.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM ВР-5252 (смотри патент США 5827698).Strain WC196 can be used as a bacterium producer of L-lysine Escherichia coli. This bacterial strain was obtained by selection of the phenotype of resistance to AEC in strain W3110, derived from strain Escherichia coli K-12. The resulting strain was named Escherichia coli AJ13069 and was deposited at the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, currently called the National Institute of Progressive Industrial Science and Technology, International Organizational Depository for Patenting, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary , Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibara ki-ken, 305-8566, Japan), December 6, 1994 and received the FERM P-14690 inventory number. Then, the strain was internationally deposited in accordance with the terms of the Budapest Treaty on September 29, 1995, and the strain received accession number FERM BP-5252 (see US Patent 5827698).

Бактерия-продуцент L-цистеинаL-cysteine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий гены с повышенной экспрессией, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP11155571А2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307 A1), и подобные им.Examples of parental strains used to produce L-cysteine-producing bacteria according to the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain JM15 transformed with various cysE alleles encoding inhibition resistant cysE feedback type serine acetyltransferase (US patent 6218168, patent application of the Russian Federation 2003121601); E. coli strain W3110 containing genes with increased expression encoding a protein capable of secretion of compounds toxic to the cell (US patent 5972663); E. coli strains containing cysteine desulfohydrase with reduced activity (Japanese patent JP11155571A2); E. coli strain W3110 with increased activity of the positive transcriptional regulator of the cysteine regulon encoded by the cysB gene (international application PCT WO 0127307 A1), and the like.

Бактерия-продуцент L-лейцинаL-Leucine Producer Bacteria

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающие, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP 08-70879А), и подобные им.Examples of parental strains used to produce the L-leucine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strains resistant to leucine analogs, including, for example, β-2 -thienylalanine, 3-hydroxyleucine, 4-azaleucine and 5,5,5-trifluoroleucine (Japanese Patent Laid-open 62-34397 and 8-70879), E. coli strains obtained using the genetic engineering methods described in PCT 96 / 06926; E. coli strain H-9068 (JP 08-70879A), and the like.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD, и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки.The bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes involved in the biosynthesis of L-leucine. Examples of such genes include the leuABCD operon genes, and are preferably represented by the mutant leuA gene encoding feedback feedback depleted L-leucine isopropyl malate synthase (US Pat. No. 6,333,342). In addition, the bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes encoding proteins that export the L-amino acid from a bacterial cell.

Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (патентная заявка РФ 2001117632).Examples of such genes include the b2682 and b2683 genes (ygaZH genes) (RF patent application 2001117632).

Бактерия-продуцент L-гистидинаL-histidine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобные им.Examples of parent strains used to produce L-histidine producing bacteria of the present invention include, but are not limited to, L-histidine producing bacteria belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 24 (VKPM B-5945, patent RF 2003677); E. coli strain 80 (VKPM B-7270, RF patent 2119536); E. coli strains NRRL B-12116 - B12121 (US Pat. No. 4,388,405); E. coli strains H-9342 (FERM BP-6675) and H-9343 (FERM BP-6676) (US patent 6344347); E. coli strain H-9341 (FERM BP-6674) (European Patent 1085087); E. coli strain AI80 / pFM201 (US patent 6258554) and the like.

Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислотыL-glutamic acid producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC⁺ (ВКПМ В-8961). Этот штамм обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.Examples of parental strains used to produce the L-glutamic acid producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain VL334thrC ⁺ (European patent EP 1172433). Strain E. coli VL334 (VKPM B-1641) is an auxotroph of L-isoleucine and L-threonine with mutations in the thrC and ilvA genes (US patent 4278765). The natural allele of the thrC gene was transferred to this strain by the general transduction method using bacteriophage P1 grown on cells of the natural E. coli K12 strain (VKPM B-7). The result was a strain, auxotroph for L-isoleucine, VL334thrC ⁺ (VKPM B-8961). This strain has the ability to produce L-glutamic acid.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя мутантные штаммы, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:Examples of parental strains used to produce the L-glutamic acid producing bacterium of the present invention include mutant strains lacking α-ketoglutarate dehydrogenase activity or having reduced α-ketoglutarate dehydrogenase activity. Bacteria belonging to the genus Escherichia, lacking the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase or having reduced activity of α-ketoglutarate dehydrogenase, and methods for their preparation are described in US patents 5378616 and 5573945. Specifically, examples of such strains include the following strains:

Е.coli W3110sucA::KmrE. coli W3110sucA :: Kmr

E.coli AJ12624 (FERM BP-3853)E.coli AJ12624 (FERM BP-3853)

E.coli AJ12628 (FERM BP-3854)E.coli AJ12628 (FERM BP-3854)

E.coli AJ12949 (FERM BP-4881)E.coli AJ12949 (FERM BP-4881)

Штамм E.coli W3110sucA::Kmr был получен в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме E.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.The E. coli strain W3110sucA :: Kmr was obtained by disrupting the α-ketoglutarate dehydrogenase gene (hereinafter referred to as the “sucA gene”) in the E. coli strain W3110. In this strain, the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase is completely absent.

Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6331419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6,1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 19 февраля 1998 года и получивший инвентарный номер FERM P-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. В штамме Pantoea ananatis AJ13356 отсутствует активность α-KGDH в результате разрушения гена субъединицы αKGDH-E1 (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13355. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств (смотри раздел Примеры). Несмотря на то, что оба штамма - АJ13355 и полученный из него штамм AJ13356 были депонированы в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания они будут упоминаться как Pantoea ananatis.Other examples of bacteria producing L-glutamic acid include bacteria belonging to the genus Pantoea, which are devoid of α-ketoglutarate dehydrogenase activity or have reduced α-ketoglutarate dehydrogenase activity, and can be obtained as described above. Examples of such strains are Pantoea ananatis AJ13356 strain (US Pat. No. 6,331,419), Pantoea ananatis AJ13356 strain deposited at the National Institute of Biological Sciences and Human Technologies, Agency for Industrial Science and Technology, Department of International Trade and Industry (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), currently called the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Organizational Depository for Patenting Purposes, Central 6.1-1, Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), February 19, 1998 and received FERM P-16645. Then, the international deposit of this strain was made according to the conditions of the Budapest Treaty of January 11, 1999, and the strain received accession number FERM BP-6615. In the Pantoea ananatis strain AJ13356, α-KGDH activity is absent due to the destruction of the αKGDH-E1 subunit gene (sucA). The above strain, when isolated, was identified as Enterobacter agglomerans and deposited as Enterobacter agglomerans AJ13355 strain. However, it was later classified as Pantoea ananatis based on the nucleotide sequence of 16S rRNA and other evidence (see the Examples section). Although both strains — AJ13355 and the strain AJ13356 obtained from it — were deposited as Enterobacter agglomerans in the above depository, for the purposes of this description they will be referred to as Pantoea ananatis.

Бактерия-продуцент L-фенилаланинаL-phenylalanine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм E.coli HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген рhеА34 (патент США 5354672); мутантный штамм E.coli MWEC101-b (KR8903681); штаммы E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и подобные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как AJ12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР 488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном уеаА или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).Examples of parental strains used to produce the L-phenylalanine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain AJ12739 (tyrA :: Tn10, tyrR) (VKMP B- 8197); E. coli strain HW1089 (ATCC-55371) containing the gene pheA34 (US patent 5354672); mutant E. coli strain MWEC101-b (KR8903681); E. coli strains NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 and NRRL B-12147 (US 4407952) and the like. Also, bacteria belonging to the genus Escherichia, producers of L-phenylalanine, such as E. coli K-12 strain [W3110 (tyrA) / pPHAB] (FERM BP-3566), E. coli K strain, can be used as parent strains. -12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 strain [W3110 (tyrA) / pPHATerm] (FERM BP-12662) and E. coli K-12 strain [W3110 (tyrA ) / pBR-aroG4, pACMAB], named as AJ12604 (FERM BP-3579) (European patent EP 488424 B1). In addition, L-phenylalanine producing bacteria belonging to the genus Escherichia with increased activity of the proteins encoded by the yeaA gene or yddG gene can also be used (US patent applications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 A1).

Бактерия-продуцент L-триптофанаL-tryptophan producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель гена serA, кодирующего фермент, не ингибируемый серином по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), лишенные активности триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (международная заявка 9708333, патент США 6319696), и подобные им.Examples of parent strains used to produce L-tryptophan producing bacteria of the present invention include, but are not limited to, L-tryptophan producing bacteria belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strains JP4735 / pMU3028 (DSM10122) and JP6015 / pMU91 (DSM10123) lacking the activity of tryptophanyl tRNA synthetase encoded by the mutant trpS gene (US patent 5756345); E. coli strain SV164 (pGH5) containing an allele of the serA gene encoding an enzyme not inhibited by serine in a feedback manner (US Pat. No. 6,180,373); E. coli strains AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) and AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) lacking tryptophanase activity (US patent 4371614); E. coli strain AGX17 / pGX50, pACKG4-pps, which enhances the ability to synthesize phosphoenolpyruvate (international application 9708333, US patent 6319696), and the like.

Ранее было показано, что природная аллель гена yddG, кодирующего мембранный белок, не участвующий в путях биосинтеза ни одной из L-аминокислот, амплифицированная на многокопийном векторе в микроорганизме, придает этому микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аналогам этой аминокислоты. Кроме того, введение в клетки бактерий-продуцентов L-фенилаланина или L-триптофана дополнительных копий гена yddG может положительно влиять на продукцию соответствующих аминокислот (международная заявка РСТ WO 03044192). Таким образом, желательно, чтобы бактерия-продуцент L-триптофана была далее модифицирована таким образом, что в этой бактерии усилена экспрессия открытой рамки считывания yddG.It was previously shown that the natural allele of the yddG gene, which encodes a membrane protein that is not involved in the biosynthesis of any of the L-amino acids, amplified on a multi-copy vector in a microorganism, gives this microorganism resistance to L-phenylalanine and several analogues of this amino acid. In addition, the introduction of additional copies of the yddG gene into the cells of bacteria producing L-phenylalanine or L-tryptophan can positively affect the production of the corresponding amino acids (PCT international application WO 03044192). Thus, it is desirable that the bacterium producing L-tryptophan be further modified so that expression of the open reading frame yddG is enhanced in this bacterium.

Бактерия-продуцент L-пролинаL-proline producing bacterium

Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно, примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).Examples of L-proline producing bacteria used as the parent strain of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 702ilvA (VKPM B-8012) deficient in the ilvA gene and capable of producing L-proline (European patent EP 1172433). The bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes involved in the biosynthesis of L-proline. Preferably, examples of such genes for bacteria producing L-proline include the proB gene encoding glutamate kinase with desensitized feedback regulation of L-proline (German patent 3127361). In addition, the bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes encoding proteins that secrete the L-amino acid from a bacterial cell. Examples of such genes are the b2682 and b2683 genes (ygaZH genes) (European Patent Application EP 1239041 A2).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia and having the ability to produce L-proline include the following E. coli strains: NRRL B-12403 and NRRL B-12404 (UK patent GB 2075056), VKPM B-8012 (RF patent application 2000124295), plasmid mutants described in German patent DE 3127361, plasmid mutants described in Bloom FR et al (The 15 ^th Miami winter symposium, 1983, p. 34), and the like.

Бактерия-продуцент L-аргининаL-arginine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США US2002058315) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР1170358), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (выложенная патентная заявка Японии 57-5693А), и подобные им.Examples of parent strains used to produce the L-arginine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 237 (VKPM B-7925) (US patent application US2002058315) and its derivatives containing mutant N-acetylglutamate synthase (RF patent application 2001112869), E. coli 382 strain (VKPM B-7926) (European patent application EP1170358), arginine producing strain into which the argA gene encoding N-acetylglutamate synthetase has been introduced Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-569 3A), and the like.

2. Способ согласно настоящему изобретению.2. The method according to the present invention.

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing an L-amino acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium for the purpose of producing and accumulating an L-amino acid in a nutrient medium and isolating the L-amino acid from the culture fluid.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.According to the present invention, the cultivation, isolation and purification of an L-amino acid from a culture or similar liquid may be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the amino acid is produced using a bacterium.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им соединения.The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives necessary for the growth of microorganisms. Carbon sources include various carbohydrates such as glucose and sucrose, as well as various organic acids. Depending on the nature of the assimilation of the microorganism used, alcohols such as ethanol and glycerin may be used. Various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. As vitamins, thiamine, yeast extract and the like can be used.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as mixing the culture fluid on a rocking chair, shaking with aeration, at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 30 to 38 ° C. The pH of the medium is maintained in the range from 5 to 9, preferably from 6.5 to 7.2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffer solutions. Typically, growing for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target L-amino acid in the culture fluid.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the L-amino acid can be isolated and purified by ion exchange chromatography, concentration and / or crystallization.

Краткое описание фигур.A brief description of the figures.

На Фиг.1 изображено конструирование плазмиды рМW118-attL-Cm-attR, используемой в качестве матрицы для ПЦР.Figure 1 shows the construction of the plasmid pMW118-attL-Cm-attR used as a template for PCR.

На Фиг.2 изображены относительные положения праймеров Р17 и Р18 на плазмиде pMWl 18-attL-Cm-attR, используемой для ПЦР-амплификации гена cat.Figure 2 shows the relative positions of the primers P17 and P18 on the plasmid pMWl 18-attL-Cm-attR used for PCR amplification of the cat gene.

На Фиг.3 изображено конструирование фрагмента хромосомной ДНК, содержащего инактивированный ген hipA.Figure 3 shows the construction of a chromosomal DNA fragment containing the inactivated hipA gene.

ПримерыExamples

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие неограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.

Пример 1. Конструирование ПЦР-матрицы и хелперных плазмидExample 1. Construction of a PCR matrix and helper plasmids

Плазмида pMW118-attL-Cm-attR, используемая в качестве матрицы для ПЦР, и хелперная плазмида pMW-intxis-ts были получены как описано ниже.Plasmid pMW118-attL-Cm-attR, used as a template for PCR, and helper plasmid pMW-intxis-ts were obtained as described below.

(1) pMW118-attL-Cm-attR(1) pMW118-attL-Cm-attR

Плазмида pMW118-attL-Cm-attR была сконструирована на основе плазмиды pMW118-attL-Tc-attR, полученной путем сшивки следующих четырех фрагментов ДНК:Plasmid pMW118-attL-Cm-attR was constructed on the basis of plasmid pMW118-attL-Tc-attR obtained by crosslinking the following four DNA fragments:

1) фрагмента BglII-EcoRI (114 п.н.), несущего attL (SEQ ID NO:3), который был получен путем ПЦР-амплификации соответствующего участка хромосомы штамма Е.coli W3350 (содержащего профаг λ) с использованием олигонуклеотидов Р1 и Р2 (SEQ ID NOS: 4 и 5) в качестве праймеров (данные праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для рестриктаз BglII и EcoRI);1) a BglII-EcoRI fragment (114 bp) carrying attL (SEQ ID NO: 3), which was obtained by PCR amplification of the corresponding chromosome region of E. coli strain W3350 (containing prophage λ) using oligonucleotides P1 and P2 (SEQ ID NOS: 4 and 5) as primers (these primers contained additional recognition sites for BglII and EcoRI restriction enzymes);

2) фрагмента PstI-HindIII (182 п.н.), несущего attR (SEQ ID NO: 6), который был получен путем ПЦР-амплификации соответствующего участка хромосомы штамма Е.coli W3350 (содержащего профаг λ) с использованием олигонуклеотидов Р3 и Р4 (SEQ ID NOS: 7 и 8) в качестве праймеров (данные праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для рестриктаз PstI и HindIII);2) a PstI-HindIII fragment (182 bp) carrying attR (SEQ ID NO: 6), which was obtained by PCR amplification of the corresponding chromosome region of E. coli strain W3350 (containing prophage λ) using P3 and P4 oligonucleotides (SEQ ID NOS: 7 and 8) as primers (these primers contained additional recognition sites for the restriction enzymes PstI and HindIII);

3) большого фрагмента BglII-HindIII (3916 п.н.) плазмиды pMW118-ter_rrnB. Плазмида pMW118-ter_rrnB была получена путем сшивки следующих трех фрагментов ДНК:3) a large fragment of BglII-HindIII (3916 bp) of the plasmid pMW118-ter_rrnB. Plasmid pMW118-ter_rrnB was obtained by crosslinking the following three DNA fragments:

- большого ДНК-фрагмента (2359 п.н.), несущего фрагмент AatII-EcoRI плазмиды pMW118, полученный следующим способом: pMW118 расщепляли с помощью рестриктазы EcoRI, обрабатывали с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (Klenow fragment of DNA polymerase I), а затем расщепляли с помощью рестриктазы AatII;- a large DNA fragment (2359 bp) carrying the AatII-EcoRI fragment of plasmid pMW118 obtained by the following method: pMW118 was digested with restriction enzyme EcoRI, processed using a Klenow fragment of DNA polymerase I), and then digested with restriction enzyme AatII;

- малого фрагмента AatII-BglII (1194 п.н.) плазмиды pUC19, несущего ген устойчивости к ампициллину bla (Ар^R), который был получен путем ПЦР-амплификации соответствующего участка плазмиды pUC19 с использованием олигонуклеотидов Р5 и Р6 (SEQ ID NOS: 9 и 10) в качестве праймеров (данные праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для рестриктаз AatII и BglII);- a small fragment of AatII-BglII (1194 bp) of pUC19 plasmid carrying the bla ampicillin resistance gene (Ap ^R ), which was obtained by PCR amplification of the corresponding region of pUC19 plasmid using P5 and P6 oligonucleotides (SEQ ID NOS: 9 and 10) as primers (these primers contained additional recognition sites for the restriction enzymes AatII and BglII);

- малого фрагмента BglII-PstIpol (363 п.н.) терминатора транскрипции ter_rrnB, полученного ПЦР-амплификацией соответствующего участка хромосомы штамма Е.coli MG1655, используя олигонуклеотиды Р7 и Р8 (SEQ ID NOS: 11 и 12) в качестве праймеров (данные праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для рестриктаз BglII и PstI);- a small fragment of BglII-PstIpol (363 bp) of the ter_rrnB transcription terminator obtained by PCR amplification of the corresponding chromosome region of E. coli strain MG1655 using oligonucleotides P7 and P8 (SEQ ID NOS: 11 and 12) as primers (data primers contained additional recognition sites for the restriction enzymes BglII and PstI);

4) малого фрагмента EcoRI-PstI (1388 п.н.) (SEQ ID NO: 13) плазмиды pML-Тс-ter_thrL, несущей ген устойчивости к тетрациклину и терминатор транскрипции ter_thrL; плазмида pML-Tc-ter_thrL была получена в два этапа:4) a small fragment of EcoRI-PstI (1388 bp) (SEQ ID NO: 13) of the plasmid pML-Tc-ter_thrL carrying the tetracycline resistance gene and ter_thrL transcription terminator; plasmid pML-Tc-ter_thrL was obtained in two stages:

- плазмида pML-ter_thrL была получена путем расщепления плазмиды pML-MCS (Mashko, S.V. et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2001, no.5, 3-20) с помощью рестриктаз XbaI and BamHI и последующей сшивки большого фрагмента (3342 п.н.) и фрагмента XbaI-BamHI (68 п.н.), несущего терминатор ter_thrL и полученного путем ПЦР-амплификации соответствующего участка хромосомы штамма Е.coli MG1655 с использованием олигонуклеотидов Р9 и Р10 (SEQ ID NOS: 14 и 15) в качестве праймеров (данные праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для рестриктаз XbaI и BamHI);- the plasmid pML-ter_thrL was obtained by cleavage of the plasmid pML-MCS (Mashko, SV et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2001, no.5, 3-20) using restriction enzymes XbaI and BamHI and subsequent crosslinking of a large fragment (3342 bp) and XbaI-BamHI fragment (68 bp) carrying the ter_thrL terminator and obtained by PCR amplification of the corresponding chromosome region of E. coli strain MG1655 using oligonucleotides P9 and P10 (SEQ ID NOS: 14 and 15) as primers (these primers contained additional recognition sites for the restriction enzymes XbaI and BamHI);

- плазмида pML-Tc-ter_thrL была получена путем расщепления плазмиды pML-ter_thrL с помощью рестриктаз KpnI и XbaI и последующей обработки с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (Klenow fragment of DNA polymerase I) и сшивки с малым фрагментом EcoRI-Van91I (1317 п.н.) плазмиды pBR322, несущей ген устойчивости к тетрациклину (pBR322 расщепляли с помощью рестриктаз EcoRI и Van91I и затем обрабатывали с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I);- the plasmid pML-Tc-ter_thrL was obtained by cleavage of the plasmid pML-ter_thrL using restriction enzymes KpnI and XbaI and subsequent processing using a Klenow fragment of DNA polymerase I and cross-linking with a small fragment of EcoRI-Van91I (1317 bp) of the plasmid pBR322 carrying the tetracycline resistance gene (pBR322 was digested with restriction enzymes EcoRI and Van91I and then treated with the Klenov fragment of DNA polymerase I);

Плазмида pMW118-attL-Cm-attR была сконструирована путем сшивки большого фрагмента BamHI-XbaI (4413 п.н.) плазмиды pMW118-attL-Tc-attR и синтетического DNA-фрагмента BglII-XbaI (1162 п.н.), содержащего промотор Р_A2 (ранний промотор фага Т7), ген устойчивости к хлорамфениколу cat (Cm^R), терминатор транскрипции ter_thrL и участок attR. Синтетический DNA-фрагмент (SEQ ID NO: 16) был получен следующим образом:Plasmid pMW118-attL-Cm-attR was constructed by crosslinking a large BamHI-XbaI fragment (4413 bp) of the plasmid pMW118-attL-Tc-attR and a synthetic BglII-XbaI DNA fragment (1162 bp) containing the promoter P _A2 (early T7 phage promoter), cat chloramphenicol resistance gene (Cm ^R ), ter_thrL transcription terminator, and attR region. A synthetic DNA fragment (SEQ ID NO: 16) was obtained as follows:

1. Плазмиду pML-MCS расщепляли при помощи рестриктаз KpnI и XbaI и сшивали с малым фрагментом KpnI-XbaI (120 п.н.), содержащим промотор Р_A2 (ранний промотор фага Т7) и полученным путем ПЦР-амплификации соответствующего участка ДНК фага Т7 с использованием олигонуклеотидов Р11 и Р12 (SEQ ID NOS: 17 и 18, соответственно) в качестве праймеров (данные праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для рестриктаз KpnI и XbaI). В результате была получена плазмида pML-P_A2-MCS.1. The plasmid pML-MCS was digested with restriction enzymes KpnI and XbaI and crosslinked with a small fragment of KpnI-XbaI (120 bp) containing the P _A2 promoter (early promoter of phage T7) and obtained by PCR amplification of the corresponding DNA fragment of phage T7 using oligonucleotides P11 and P12 (SEQ ID NOS: 17 and 18, respectively) as primers (these primers contained additional recognition sites for KpnI and XbaI restriction enzymes). As a result, the plasmid pML-P _A2 -MCS was obtained.

2. Cam XbaI был удален из плазмиды pML-P_A2-MCS, в результате чего была получена плазмида pML-P_A2-MCS (XbaI^-).2. Cam XbaI was removed from the plasmid pML-P _A2 -MCS, resulting in the obtained plasmid pML-P _A2 -MCS (XbaI ^- ).

3. Малый фрагмент BglII-HmdIII (928 п.н.) плазмиды pML-P_A2-MCS(XbaI^-), содержащий промотор P_A2 (ранний промотор фага Т7) и ген устойчивости к хлорамфениколу cat (Cm^R), был сшит с малым фрагментом HindIII-HindIII (234 п.н.) плазмиды pMW118-attL-Tc-attR, содержащим терминатор транскрипции ter_thrL и участок attR.3. A small fragment of BglII-HmdIII (928 bp) of the plasmid pML-P _A2 -MCS (XbaI ^- ) containing the P _A2 promoter (early T7 phage promoter) and the chloramphenicol resistance gene cat (Cm ^R ) was crosslinked with a small fragment of HindIII-HindIII (234 bp) of the plasmid pMW118-attL-Tc-attR containing the transcription terminator ter_thrL and the attR region.

4. Синтетический DNA-фрагмент (1156 п.н.) был получен путем ПЦР-амплификации лигированной смеси с использованием олигонуклеотидов Р9 и Р4 (SEQ ID NOS:14 и 8) в качестве праймеров (данные праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для рестриктаз HindIII и XbaI).4. A synthetic DNA fragment (1156 bp) was obtained by PCR amplification of the ligation mixture using oligonucleotides P9 and P4 (SEQ ID NOS: 14 and 8) as primers (these primers contained additional recognition sites for HindIII and XbaI).

(2) pMW-intxis-ts(2) pMW-intxis-ts

Рекомбинантная плазмида pMW-intxis-ts, содержащая ген-репрессор cI и гены int-xis фага λ под контролем промотора P_R, была сконструирована на основе вектора pMWP_laclacI-ts. Вектор pMWP_laclacI-ts был получен путем замещения фрагмента AatII-EcoRV плазмиды pMWP_laclacI (Skorokhodova, A.Yu. et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2004, no.5, 3-21) на фрагмент AatII-EcoRV плазмиды pMAN997 (Tanaka, К. et al., J. Bacteriol., 2001, 183(22): 6538-6542), несущий локусы par и ori, а также ген repA^ts репликона pSC101.The recombinant plasmid pMW-intxis-ts containing the cI repressor gene and int-xis genes of phage λ under the control of the P _R promoter was constructed on the basis of the pMWP _lac lacI-ts vector. The pMWP _lac lacI-ts vector was obtained by replacing the AatII-EcoRV fragment of the plasmid pMWP _lac lacI (Skorokhodova, A. Yu. Et al., Biotekhnologiya (in Russian), 2004, no.5, 3-21) with the AatII-EcoRV fragment plasmids pMAN997 (Tanaka, K. et al., J. Bacteriol., 2001, 183 (22): 6538-6542) carrying par and ori loci, as well as repA ^ts replicon gene pSC101.

Два ДНК-фрагмента были амплифицированы с использованием ДНК фага λ ("Fermentas") в качестве матрицы. Первый ДНК-фрагмент содержал последовательность ДНК с 37168 по 38046 нуклеотид, ген-репрессор cI, промоторы P_RM и P_R и лидерную последовательность гена cro. Данный ДНК-фрагмент был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов Р13 и Р14 (SEQ ID NOS: 19 и 20) в качестве праймеров. Второй ДНК-фрагмент, содержащий гены xis-int фага λ и последовательность DNA с 27801 по 29100 нуклеотид, был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов Р15 и Р16 (SEQ ID NOS: 21 и 22) в качестве праймеров. Все праймеры содержали соответствующие рестрикционные сайты.Two DNA fragments were amplified using phage λ DNA ("Fermentas") as a template. The first DNA fragment contained a DNA sequence from 37168 to 38046 nucleotides, a cI repressor gene, P _RM and P _R promoters, and a cro gene leader sequence. This DNA fragment was amplified by PCR using oligonucleotides P13 and P14 (SEQ ID NOS: 19 and 20) as primers. The second DNA fragment containing the xis-int phage λ genes and the DNA sequence from 27801 to 29100 nucleotides was amplified by PCR using oligonucleotides P15 and P16 (SEQ ID NOS: 21 and 22) as primers. All primers contained the corresponding restriction sites.

Первый ДНК-фрагмент, полученный с помощью ПЦР-амплификации и несущий ген-репрессор cI, был расщеплен с помощью рестриктазы ClaI, обработан с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (Klenow fragment of DNA polymerase I) и затем расщеплен с помощью рестриктазы EcoRI. Второй ДНК-фрагмент, полученный с помощью ПЦР-амплификации, был расщеплен с помощью EcoRI и PstI. Плазмида pMWP_laclacI-ts была расщеплена с помощью рестриктазы BglII, обработана с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (Klenow fragment of DNA polymerase I) и затем расщеплена с помощью рестриктазы PstI. Векторный фрагмент плазмиды pMWP_laclacI-ts был элюирован из агарозного геля и сшит с двумя вышеупомянутыми ДНК-фрагментами, в результате чего была получена рекомбинантная плазмида pMW-intxis-ts.The first DNA fragment obtained by PCR amplification and carrying the cI repressor gene was digested with the restriction enzyme ClaI, processed with the Klenow fragment of DNA polymerase I, and then digested with the restriction enzyme EcoRI. The second DNA fragment obtained by PCR amplification was digested with EcoRI and PstI. Plasmid pMWP _lac lacI-ts was digested with the restriction enzyme BglII, processed with the Klenow fragment of DNA polymerase I, and then digested with the restriction enzyme PstI. Vector plasmid fragment pMWP _lac lacI-ts was eluted from agarose gel and ligated to the above two DNA fragments, whereby there was obtained a recombinant plasmid pMW-intxis-ts.

Пример 2. Конструирование штамма с инактивированным геном hipAExample 2. Construction of a strain with inactivated hipA gene

1. Деления гена hipA1. The division of the hipA gene

Штамм, содержащий делецию гена hipA, был сконструирован с использованием методики, разработанной Datsenko, K.A. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р17 (SEQ ID NO: 23) и P18 (SEQ ID NO: 24) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR в качестве матрицы (конструирование плазмиды описано в Примере 1). Праймер Р17 содержит участок ДНК размером в 36 н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 5'-конце гена hipA, а также участок ДНК, комплементарный участку attL. Праймер Р18 содержит участок ДНК размером в 35 н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце гена hipA, а также участок ДНК, комплементарный участку attR. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.The strain containing the hipA gene deletion was constructed using a technique developed by Datsenko, KA and Wanner, BL (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12), 6640-6645), known as "Red-Dependent"integration". The DNA fragment containing the Cm ^R marker encoded by the cat gene was obtained by PCR using primers P17 (SEQ ID NO: 23) and P18 (SEQ ID NO: 24) and plasmid pMW118-attL-Cm-attR as a matrix ( the construction of the plasmid is described in Example 1). Primer P17 contains a 36N DNA region complementary to the DNA region located at the 5'-end of the hipA gene, as well as a DNA region complementary to the attL region. Primer P18 contains a 35 N DNA region complementary to the DNA region located at the 3'-end of the hipA gene, as well as a DNA region complementary to the attR region. The following temperature profile for PCR was used: denaturation at 95 ° C for 3 min; the first two cycles: 1 min at 95 ° C, 30 sec at 50 ° C, 40 sec at 72 ° C; subsequent 25 cycles: 30 sec at 95 ° C, 30 sec at 54 ° C, 40 sec at 72 ° C; and final polymerization: 5 min at 72 ° C.

Полученный ПЦР-продукт длиной 1699 п.н. (Фиг.2), очищенный в агарозном геле, был использован для электропорации в штамм Е.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага А, длиной 2154 п.н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора Р_araB; индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.The resulting PCR product with a length of 1699 bp (Figure 2), purified by agarose gel, was used for electroporation into E. coli strain MG1655 (ATCC 700926) containing plasmid pKD46 with a heat-sensitive replicon. Plasmid pKD46 (Datsenko, KA and Wanner, BL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12): 6640-6645) contains a 2154 bp DNA fragment of phage A. (positions 31088 through 33241 of the nucleotide sequence with accession number J02459 in the GenBank database), and also contains the λ genes of the Red homologous recombination system (γ, β, exo genes) under the control of the P _araB promoter; induced by arabinose. Plasmid pKD46 is required for integration of the PCR product into the chromosome of strain MG1655.

Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н₂O. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром и выращивали при 37°С для отбора Cm^R-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С, и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.Electrocompetent cells were obtained as follows: an overnight culture of E. coli strain MG1655 was grown at 30 ° C in LB medium supplemented with ampicillin (100 mg / L), diluted 100 times by adding 5 ml of SOB medium (Sambrook et al, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) containing ampicillin and L-arabinose (1 mM). The resulting culture was grown with stirring at 30 ° С until OD ₆₀₀ ≈0.6 was reached, after which the cells were made electrocompetent by 100-fold concentration and three times washing with ice-cold deionized Н ₂ O. Electroporation was performed using 70 μl of cells and ≈100 ng of PCR product. After electroporation, the cells were incubated in 1 ml of SOC medium (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) at 37 ° C for 2.5 hours, after which they were plated on L plates. agar and grown at 37 ° C to select Cm ^R recombinants. Then, to remove plasmid pKD46, 2 passages were performed on L-agar with Cm at 42 ° C, and the obtained colonies were tested for sensitivity to ampicillin.

2. Подтверждение делении гена hipA с помощью ПЦР.2. Confirmation of hipA gene fission using PCR.

Мутанты с делегированным геном hipA, содержащие ген устойчивости Cm, были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р19 (SEQ ID NO: 25) и Р20 (SEQ ID NO: 26) были использованы для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 94°С в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма hipA⁺ MG1655, составляет 1564 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 ΔhipA::cat, составляет 1941 п.н. (Фиг.3).Mutants with a delegated hipA gene containing the Cm resistance gene were verified by PCR. Locus-specific primers P19 (SEQ ID NO: 25) and P20 (SEQ ID NO: 26) were used to verify deletion by PCR. The following temperature profile was used for PCR testing: denaturation at 94 ° C for 3 min; profile for 30 cycles: 30 sec at 94 ° C, 30 sec at 54 ° C, 1 min at 72 ° C; final step: 7 min at 72 ° C. The length of the PCR product obtained by the reaction using the parental hipA ⁺ MG1655 strain as a matrix of cells is 1564 bp The length of the PCR product obtained by the reaction using the mutant strain MG1655 ΔhipA :: cat as a matrix of cells is 1941 bp (Figure 3).

Пример 3. Продукция L-треонина штаммом Е.coli В-3996-ΔhipA.Example 3. Production of L-threonine by E. coli strain B-3996-ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию треонина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat были перенесены в штамм-продуцент L-треонина Е.coli В-3996 (ВКПМ В-3996) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).To assess the effect of hipA gene inactivation on the production of threonine, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔhipA :: cat described above were transferred to the E. coli L-threonine producer strain B-3996 (VKPM B-3996) using P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).

Оба штамма Е.Coli, В-3996 и В-3996-ΔhipA, были выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (30 мкг/мл). Для получения посевной культуры указанные штаммы были выращены при 32°С в течение 18 часов на роторной качалке (250 об/мин) в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозой. Затем в ферментационную среду было внесено по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментация была проведена в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки были выращены в течение 65 часов при 32°С с перемешиванием (250 об/мин).Both strains of E. coli, B-3996 and B-3996-ΔhipA, were grown for 18-24 hours at 37 ° C on plates with L-agar containing chloramphenicol (30 μg / ml). To obtain a seed culture, these strains were grown at 32 ° C for 18 hours on a rotary shaker (250 rpm) in 20 × 200 mm test tubes containing 2 ml of L-broth with 4% sucrose. Then, 0.21 ml (10%) of the inoculum was added to the fermentation medium. Fermentation was carried out in 2 ml of minimal fermentation medium in test tubes measuring 20 × 200 mm. Cells were grown for 65 hours at 32 ° C with stirring (250 rpm).

После выращивания количество накопленного в среде L-треонина было определено с помощью бумажной хроматографии, с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне был использован для визуализации. Пятно, содержащее L-треонин, было вырезано; L-треонин был элюирован 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-треонина было оценено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты десяти независимых пробирочных ферментации приведены в Таблице 1. Как следует из Таблицы 1, штамм В-3996-ΔhipA накапливал большее количество L-треонина по сравнению со штаммом В-3996.After growing, the amount of L-threonine accumulated in the medium was determined by paper chromatography using the mobile phase of the following composition: butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). A solution (2%) of ninhydrin in acetone was used for visualization. A stain containing L-threonine was excised; L-threonine was eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl ₂ , after which the amount of L-threonine was estimated spectrophotometrically at a wavelength of 540 nm. The results of ten independent in vitro fermentations are shown in Table 1. As follows from Table 1, strain B-3996-ΔhipA accumulated a greater amount of L-threonine compared to strain B-3996.

Была использована ферментационная среда следующего состава (г/л):The fermentation medium of the following composition was used (g / l):

ГлюкозаGlucose 80.080.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 22.022.0 NaClNaCl 0.80.8 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄×7Н₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 0.80.8 FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.020.02 MnSO₄×5H₂OMnSO ₄ × 5H ₂ O 0.020.02 Тиамин гидрохлоридThiamine hydrochloride 0.00020.0002 Дрожжевой экстрактYeast extract 1.01.0 СаСО₃ CaCO ₃ 30.030.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0. Антибиотик добавляли в среду после стерилизации.Glucose and magnesium sulfate were sterilized separately. CaCO _{3 was} dry heat sterilized at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0. The antibiotic was added to the medium after sterilization.

Пример 4. Продукция L-лизина штаммом Е.coli АJ1442-ΔhipA.Example 4. Production of L-lysine by E. coli strain AJ1442-ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию лизина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лизина Е.coli WC196 (pCABD2) с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). pCABD2 - это плазмида, содержащая ген dapA, кодирующий мутантную дигидропиколинатсинтазу, устойчивую к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ген lysC, кодирующий мутантную аспартокиназу III, устойчивую к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ген dapB, кодирующий дигидропиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (патент США 6040160).To assess the effect of inactivation of the hipA gene on lysine production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔhipA :: cat described above can be transferred to E. coli WC196 L-lysine producer strain (pCABD2) using P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). pCABD2 is a plasmid containing the dapA gene encoding a mutant dihydropicolinate synthase that is resistant to feedback inhibition by L-lysine, the lysC gene encoding mutant aspartokinase III, resistant to feedback by L-lysine inhibition, the dapB gene encoding digiducidase ddh gene encoding diaminopimelate dehydrogenase (US patent 6040160).

Оба штамма Е.coli, WC196(pCABD2) и WC196(pCABD2)-ΔhipA, могут быть выращены в L-среде, содержащей 50 мг/л хлорамфеникола и 20 мг/л стрептомицина, при 37°С; и 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 20 мл ферментационной среды, содержащей необходимые антибиотики, в колбы объемом 500 мл. Культивирование может производиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде может быть измерено известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель-Sakura Seiki Co.). Затем, для каждого из штаммов может быть рассчитан выход L-лизина в пересчете на потребленную глюкозу.Both strains of E. coli, WC196 (pCABD2) and WC196 (pCABD2) -ΔhipA, can be grown in L medium containing 50 mg / l chloramphenicol and 20 mg / l streptomycin, at 37 ° C; and 0.3 ml of the obtained cultures can be introduced into 20 ml of a fermentation medium containing the necessary antibiotics into 500 ml flasks. Cultivation can be carried out at 37 ° C for 16 hours using a reciprocating rocking chair with a stirring speed of 115 rpm. After growing, the amount of L-lysine and residual glucose in the medium can be measured in a known manner (Biotech-analyzer AS210, manufacturer-Sakura Seiki Co.). Then, for each of the strains, the yield of L-lysine can be calculated in terms of glucose consumed.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):Can be used in a fermentation medium of the following composition (g / l):

ГлюкозаGlucose 4040 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 2424 К₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 1.01.0 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄×5Н₂ОMnSO ₄ × 5H ₂ O 0.010.01 Дрожжевой экстрактYeast extract 2.02.0

рН доводят до 7.0 с помощью КОН и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO₄×7Н₂О стерилизуют отдельно. Также добавляют СаСО₃ до концентрации 30 г/л, предварительно простерилизованного сухим жаром при 180°С в течение 2 часов.The pH was adjusted to 7.0 with KOH and the medium was autoclaved at 115 ° C for 10 minutes. Glucose and MgSO ₄ × 7H ₂ O are sterilized separately. CaCO _{3 is} also added to a concentration of 30 g / l, previously sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours.

Пример 5. Продукция L-цистеина штаммом Е.coli JM15(ydeD)-ΔhipA.Example 5. Production of L-cysteine by E. coli strain JM15 (ydeD) -ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию L-цистеина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-цистеина Е.coli JM15(ydeD) с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм JM15(ydeD)-ΔhipA.To assess the effect of hipA gene inactivation on L-cysteine production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔhipA :: cat described above can be transferred to the E. coli JM15 L-cysteine producer strain (ydeD) using P1 transduction (Miller , JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), whereby the strain JM15 (ydeD) -ΔhipA can be obtained.

Штамм Е.coli JM15(ydeD) является производным штамма Е.coli JM15 (патент США 6218168), который может быть трансформирован ДНК, содержащей ген ydeD, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза ни одной из L-аминокислот (патент США 5972663).The E. coli strain JM15 (ydeD) is a derivative of the E. coli strain JM15 (US patent 6218168), which can be transformed with DNA containing the ydeD gene encoding a membrane protein not involved in the biosynthesis of any of the L-amino acids (US patent 5972663 )

Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина детально описаны в Примере 6 патента США 6218168.Fermentation conditions for evaluating L-cysteine production are described in detail in Example 6 of US Pat. No. 6,218,168.

Пример 6. Продукция L-лейцина штаммом Е.coli 57-ΔhipA.Example 6. Production of L-leucine by E. coli strain 57-ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию L-лейцина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лейцина Е.coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм 57-pMW-ΔhipA.To assess the effect of inactivation of the hipA gene on L-leucine production, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 ΔhipA :: cat can be transferred to the E. coli 57 L-leucine producer strain (VKPM B-7386, US patent 6124121) by P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), whereby 57-pMW-ΔhipA strain can be obtained.

Оба штамма Е.coli, 57 и 57-ΔhipA, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (30 мкг/мл). Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментацию можно проводить в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 48-72 часов при 32°С с перемешиванием (250 об/мин). Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1).Both strains of E. coli, 57 and 57-ΔhipA, can be grown for 18-24 hours at 37 ° C on plates with L-agar containing chloramphenicol (30 μg / ml). To obtain a seed culture, these strains can be grown on a rotary shaker (250 rpm) at 32 ° C for 18 hours in 20 × 200 mm test tubes containing 2 ml of L-broth with 4% sucrose. Then, 0.21 ml (10%) of the seed culture can be added to the fermentation medium. Fermentation can be carried out in 2 ml of minimal fermentation medium in test tubes measuring 20 × 200 mm. Cells can be grown for 48-72 hours at 32 ° C with stirring (250 rpm). The amount of L-leucine can be measured using paper chromatography (mobile phase composition: butanol - acetic acid - water = 4: 1: 1).

Может быть использована ферментационная среда (рН 7.2) следующего состава (г/л):A fermentation medium (pH 7.2) of the following composition (g / l) can be used:

ГлюкозаGlucose 60.060.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 25.025.0 К₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 2.02.0 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 ТиаминThiamine 0.010.01 СаСО₃ CaCO ₃ 25.025.0

Глюкозу и мел стерилизуют отдельно.Glucose and chalk are sterilized separately.

Пример 7. Продукция L-гистидина штаммом Е.coli 80-ΔhipA.Example 7. Production of L-histidine by E. coli strain 80-ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию L-гистидина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-7270.To assess the effect of inactivation of the hipA gene on L-histidine production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔhipA :: cat described above can be transferred to the E. coli 80 L-histidine producing strain using P1 transduction (Miller, JH ( 1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain 80 is described in RF patent 2119536 and deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy passage, 1) with accession number VKPM B-7270.

Оба штамма Е.coli, 80 и 80-ΔhipA, могут быть выращены в L-бульоне, содержащем хлорамфеникол (30 мг/мл), при 29°С в течение 6 часов. Затем 0.1 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Может быть использована подвижная фаза следующего состава: n-бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован для визуализации.Both strains of E. coli, 80 and 80-ΔhipA, can be grown in L-broth containing chloramphenicol (30 mg / ml) at 29 ° C for 6 hours. Then 0.1 ml of the obtained cultures can be introduced into 2 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm tubes, and the cultures can be grown at 29 ° C for 65 hours on a rotary shaker (350 rpm). After growing, the amount of histidine accumulated in the medium can be determined by paper chromatography. The mobile phase of the following composition can be used: n-butanol - acetic acid - water = 4: 1: 1 (v / v). A solution of ninhydrin (0.5%) in acetone can be used for visualization.

Может быть использована ферментационная среда (рН 6.0) следующего состава (г/л):A fermentation medium (pH 6.0) of the following composition (g / l) can be used:

ГлюкозаGlucose 100.0100.0 МаменоMemeno 0.2 общего азота0.2 total nitrogen L-пролинL-proline 1.01.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 25.025.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄ MnSO ₄ 0.010.01 ТиаминThiamine 0.0010.001 БетаинBetaine 2.02.0 СаСО₃ CaCO ₃ 60.060.0

Глюкозу, пролин, бетаин и СаСО₃ стерилизуют отдельно. рН доводят до 6.0 перед стерилизацией.Glucose, proline, betaine and CaCO _{3 are} sterilized separately. The pH is adjusted to 6.0 before sterilization.

Пример 8. Продукция L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli VL334thrC⁺-ΔhipA.Example 8. The production of L-glutamic acid strain E. coli VL334thrC ⁺ -ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию L-глутаминовой кислоты ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-глутаминовой кислоты Е. VL334thrC⁺ (ЕР 1172433) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм VL334thrC⁺-ΔhipA.To assess the effect of inactivation of the hipA gene on the production of L-glutamic acid, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 ΔhipA :: cat can be transferred to the L-glutamic acid producing strain E. VL334thrC ⁺ (EP 1172433) using P1- transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), whereby strain VL334thrC ⁺ -ΔhipA can be obtained.

Оба штамма, VL334thrC⁺ и VL334thrC⁺-ΔhipA, могут быть выращены на чашках с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (30 мкг/мл), при 37°С в течение 18-24 часов. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда может содержать глюкозу - 60 г/л, сульфат аммония - 25 г/л, КН₂PO₄ - 2 г/л, MgSO₄ - 1 г/л, тиамин - 0.1 мг/мл, L-изолейцин - 70 мкг/мл и мел - 25 г/л (рН 7.2). Глюкозу и мел стерилизуют отдельно. Выращивание может производиться при 30°С в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученной L-глутаминовой кислоты может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl₂.Both strains, VL334thrC ⁺ and VL334thrC ⁺ -ΔhipA, can be grown on L-agar plates containing chloramphenicol (30 μg / ml) at 37 ° C for 18-24 hours. Further, one loop of cells can be transferred to tubes containing 2 ml of fermentation medium. The fermentation medium may contain glucose - 60 g / l, ammonium sulfate - 25 g / l, KH ₂ PO ₄ - 2 g / l, MgSO ₄ - 1 g / l, thiamine - 0.1 mg / ml, L-isoleucine - 70 μg / ml and chalk - 25 g / l (pH 7.2). Glucose and chalk are sterilized separately. Cultivation can be carried out at 30 ° C for 3 days with stirring. After growing, the amount of L-glutamic acid obtained can be determined using paper chromatography (composition of the mobile phase: butanol - acetic acid - water = 4: 1: 1), followed by staining with ninhydrin (1% solution in acetone) and further eluting the obtained compounds in 50% ethanol with 0.5% CdCl ₂ .

Пример 9. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli АJ2739-ΔhipA.Example 9. Production of L-phenylalanine by E. coli strain AJ2739-ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию L-фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli AJ12739 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм AJ12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1^ый Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197.To assess the effect of inactivation of the hipA gene on L-phenylalanine production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔhipA :: cat described above can be transferred to the E. coli L-phenylalanine producing strain AJ12739 using P1 transduction (Miller, JH ( 1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain AJ12739 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, ^1st Dorozhniy proezd, 1) November 6, 2001 with accession number VKPM B-8197.

Оба штамма, AJ12739 и АJ2739-ΔhipA, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, содержащем хлорамфеникол (30 мкг/мл); 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водного аммиака: вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.Both strains, AJ12739 and AJ2739-ΔhipA, can be grown at 37 ° C for 18 hours in a nutrient broth containing chloramphenicol (30 μg / ml); 0.3 ml of the obtained cultures can be introduced into 3 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm tubes, and the cultures can be grown at 37 ° C for 48 hours on a rotary shaker. At the end of the fermentation, the amount of phenylalanine accumulated in the medium can be determined by thin layer chromatography (TLC). For this purpose, 10 × 15 cm TLC plates coated with a 0.11 mm layer of Sorbfil silica gel without a fluorescent indicator can be used (Sorbpolymer Joint-Stock Company, Krasnodar, Russia). Sorbfil plates can be exposed in the mobile phase of the following composition: propan-2-ol: ethyl acetate: 25% aqueous ammonia: water = 40: 40: 7: 16 (v / v). A solution (2%) of ninhydrin in acetone can be used for visualization.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):Can be used in a fermentation medium of the following composition (g / l):

ГлюкозаGlucose 40.040.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 16.016.0 К₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 0.10.1 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄×7Н₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄×5H₂OMnSO ₄ × 5H ₂ O 0.010.01 Тиамин HClThiamine HCl 0.00020.0002 Дрожжевой экстрактYeast extract 2.02.0 ТирозинTyrosine 0.1250.125 СаСО₃ CaCO ₃ 20.020.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.Glucose and magnesium sulfate are sterilized separately. CaCO _{3 is} sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0.

Пример 10. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (рGН5)-ΔhipA.Example 10. Production of L-tryptophan by E. coli strain SV164 (pGH5) -ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-триптофана Е.coli SV164 (pGH5) с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм SV164 (pGH5) подробно описан в патенте США 6180373 или Европейском патенте 0662143.To evaluate the effect of inactivation of the hipA gene on L-tryptophan production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔhipA :: cat described above can be transferred to the E. coli L-tryptophan producing strain SV164 (pGH5) using P1 transduction (Miller , JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain SV164 (pGH5) is described in detail in US Pat. No. 6,180,373 or European Patent No. 0,662,143.

Оба штамма, SV164(pGH5) и SV164(pGH5)-ΔhipA, могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5, 20 мг/мл) и хлорамфеникола (30 мкг/мл). По 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (20 мг/мл), в пробирках размером 20×200 мм; и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 8. Компоненты ферментационной среды, которая может быть использована, представлены в Таблице 2; группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н стерилизуют отдельно, как и показано в Таблице 2, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.Both strains, SV164 (pGH5) and SV164 (pGH5) -ΔhipA, can be grown with stirring at 37 ° C for 18 hours in 3 ml of nutrient broth with tetracycline (plasmid marker pGH5, 20 mg / ml) and chloramphenicol (30 μg / ml). 0.3 ml of the obtained cultures can be introduced into 3 ml of a fermentation medium containing tetracycline (20 mg / ml) in 20 × 200 mm test tubes; and cultures can be grown at 37 ° C. for 48 hours on a rotary shaker at 250 rpm. After growing, the amount of tryptophan accumulated in the medium can be determined using TLC, as described in Example 8. The components of the fermentation medium that can be used are shown in Table 2; the groups of components A, B, C, D, E, F and H are sterilized separately, as shown in Table 2, in order to avoid unwanted interactions during sterilization.

Пример 11. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA-ΔhipA.Example 11. Production of L-Proline by E. coli strain 702ilvA-ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию L-пролина ДНК-фрагменты из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-пролина Е.coli 702ilvA с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1^ый Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-8012.To assess the effect of inactivation of the hipA gene on L-proline production, DNA fragments from the chromosome of the E. coli MG1655 ΔhipA :: cat strain described above can be transferred to the E. coli 702ilvA L-proline producer strain using P1 transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain 702ilvA was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, ^1st Road passage, 1) with accession number VKPM V-8012.

Оба штамма Е.Coli, 702ilvA и 702ilvA-ΔhipA, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (30 мкг/мл). Затем ферментация с использованием этих штаммов может производиться в тех же условиях, как описано в Примере 8.Both strains of E. coli, 702ilvA and 702ilvA-ΔhipA, can be grown for 18-24 hours at 37 ° C on plates with L-agar containing chloramphenicol (30 μg / ml). Then fermentation using these strains can be carried out under the same conditions as described in Example 8.

Пример 12. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382-ΔhipA.Example 12. The production of L-arginine strain E. coli 382-ΔhipA.

Для оценки влияния инактивации гена hipA на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1^ый Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926.To assess the effect of inactivation of the hipA gene on L-arginine production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔhipA :: cat described above can be transferred to the E. coli 382 L-arginine producing strain using P1 transduction (Miller, JH ( 1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain 382 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, ^1st Dorozhniy proezd, 1) on April 10, 2000 with accession number VKPM V-7926.

Оба штамма, 382 и 382-ΔhipA, могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, содержащего хлорамфеникол (30 мг/мл); по 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм и культуры могут быть выращены при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.Both strains, 382 and 382-ΔhipA, can be grown with stirring at 37 ° C for 18 hours in 3 ml of nutrient broth containing chloramphenicol (30 mg / ml); 0.3 ml of the resulting cultures can be introduced into 3 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm tubes and cultures can be grown at 32 ° C for 48 hours on a rotary shaker.

После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина может быть определено с помощью бумажной хроматографии, при этом может быть использован следующий состав подвижной фазы: бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне может быть использован для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, может быть вырезано; L-аргинин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-аргинина может быть определено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.After growing, the amount of L-arginine accumulated in the medium can be determined by paper chromatography, and the following composition of the mobile phase can be used: butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). A solution of ninhydrin (2%) in acetone can be used for visualization. A stain containing L-arginine can be excised; L-arginine can be eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl ₂ , after which the amount of L-arginine can be determined spectrophotometrically at a wavelength of 540 nm.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):Can be used in a fermentation medium of the following composition (g / l):

ГлюкозаGlucose 48.048.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 35.035.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 Тиамин HClThiamine HCl 0.00020.0002 Дрожжевой экстрактYeast extract 1.01.0 L-изолейцинL-isoleucine 0.10.1 СаСО₃ CaCO ₃ 5.05.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют раздельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.Glucose and magnesium sulfate are sterilized separately. CaCO _{3 is} sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0.

Пример 13. Удаление гена устойчивости Cm (гена cat) из хромосомы штаммов-продуцентов L-аминокислот бактерии Е.coli.Example 13. Removal of the resistance gene Cm (cat gene) from the chromosome of strains producing L-amino acids of the bacterium E. coli.

Ген устойчивости Cm (ген cat) может быть удален из хромосомы штаммов-продуцентов L-аминокислот путем использования системы int-xis. С этой целью штамм-продуцент L-аминокислоты, в который были перенесены ДНК-фрагменты из вышеописанного штамма Е.coli MG1655 ΔhipA::cat при помощи Pl-трансдукции (см. Примеры 3-12), может быть трансформирован плазмидой pMWts-Int/Xis. Селекция трансформированных клонов может быть произведена с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Клетки могут быть инкубированы при 30°С в течение ночи. Ген cat может быть удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SАр^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов может быть подтверждено при помощи ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р21 (SEQ ID NO: 27) и Р22 (SEQ ID NO: 28) могут быть использованы для такого подтверждения путем ПЦР. Условия проведения ПЦР могут быть такими же, как описано выше. Продукт ПЦР, полученный в случае клеток с удаленным геном cat, должен быть длиной в 0,2 т.п.н. Таким образом, может быть получен штамм-продуцент L-аминокислот, в котором инактивирован ген hipA и из которого удален ген cat.The Cm resistance gene (cat gene) can be removed from the chromosome of strains producing L-amino acids by using the int-xis system. To this end, the L-amino acid producing strain into which DNA fragments from the above E. coli MG1655 ΔhipA :: cat strain were transferred using Pl transduction (see Examples 3-12) can be transformed with the plasmid pMWts-Int / Xis. Selection of transformed clones can be performed using LB medium containing ampicillin (100 μg / ml). Cells can be incubated at 30 ° C overnight. The cat gene can be removed from transformed clones by growing individual colonies at 37 ° C (at this temperature, the CIts repressor is inactivated to some extent, while the int / xis genes are activated), followed by selection of Cm ^S Ap ^R variants. Removal of the cat gene from the chromosome of strains can be confirmed by PCR. Locus-specific primers P21 (SEQ ID NO: 27) and P22 (SEQ ID NO: 28) can be used for this confirmation by PCR. PCR conditions may be the same as described above. The PCR product obtained in the case of cells with the deleted cat gene should be 0.2 kb in length. Thus, an L-amino acid producing strain can be obtained in which the hipA gene is inactivated and from which the cat gene is deleted.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to the best mode of carrying out the invention, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.

Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.Each of the above documents has a link and all cited documents are part of the description of the present invention.

Таблица 1Table 1 ШтаммStrain OD₅₄₀ OD ₅₄₀ L-треонин, г/лL-threonine, g / l В-3996B-3996 32.1±0.632.1 ± 0.6 21.3±0.221.3 ± 0.2 B-3996-ΔhipAB-3996-ΔhipA 31.6±0.331.6 ± 0.3 22.4±0.422.4 ± 0.4

Таблица 2table 2 РастворыSolutions КомпонентComponent Конечная концентрация, г/лFinal concentration, g / l АBUT КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 1.51.5   NaClNaCl 0.50.5   (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 1.51.5   L-метионинL-methionine 0.050.05   L-фенилаланинL-phenylalanine 0.10.1   L-тирозинL-tyrosine 0.10.1   Mameno (общий N)Mameno (total N) 0.070.07 ВAT ГлюкозаGlucose 40.040.0   MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 0.30.3 СFROM CaCl₂ CaCl ₂ 0.0110.011 DD FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.0750.075   Цитрат натрияSodium citrate 1.01.0 ЕE Na₂MoO₄×2H₂ONa ₂ MoO ₄ × 2H ₂ O 0.000150.00015   Н₃ВО₃ H ₃ IN ₃ 0.00250.0025   CoCl₂×6Н₂OCoCl ₂ × 6H ₂ O 0.000070.00007   CuSO₄×5H₂OCuSO ₄ × 5H ₂ O 0.000250.00025   MnCl₂×4H₂OMnCl ₂ × 4H ₂ O 0.00160.0016   ZnSO₄×7H₂OZnSO ₄ × 7H ₂ O 0.00030.0003 FF Тиамин HClThiamine HCl 0.0050.005 GG СаСО₃ CaCO ₃ 30.030.0 HH ПиридоксинPyridoxine 0.030.03 pH раствора А доводят до значения 7.1 при помощи NH₄OH.The pH of solution A was adjusted to 7.1 with NH ₄ OH.

Claims (3)

1. Бактерия-продуцент L-треонина, принадлежащая к роду Escherichia, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии инактивирован ген hipA.1. The bacterium-producer of L-threonine, belonging to the genus Escherichia, modified so that the hipA gene is inactivated in this bacterium. 2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген hipA инактивирован за счет делеции гена hipA в хромосоме бактерии.2. The bacterium according to claim 1, characterized in that said hipA gene is inactivated due to deletion of the hipA gene in the bacterial chromosome. 3. Способ получения L-треонина, включающий выращивание бактерии по любому из пп.1 и 2 в питательной среде, вызывающее продукцию и накопление указанной L-треонина в культуральной жидкости; и3. A method of producing L-threonine, comprising growing a bacterium according to any one of claims 1 and 2 in a nutrient medium, causing production and accumulation of said L-threonine in the culture fluid; and выделение указанного L-треонина из культуральной жидкости.the allocation of the specified L-threonine from the culture fluid.

Images