RU2318875C1 - Kit of primer oligonucleotides, bioarray and method for specific identification of pathogenic for human orthopox- and herpesviruses - Google Patents

Abstract

FIELD: molecular biology, gene engineering, medicine.

SUBSTANCE: disclosed is method for determination of different orthopoxviruses based on one-step PCR followed by hybridization of obtained fluorescence labeled amplicones with DNA microarray containing discriminating orthopox- and herpesvirus-hybridization probes.

EFFECT: method for express-diagnosis of orthopoxviruses and discrimination thereof from herpesviruses.

3 cl, 14 dwg, 3 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к молекулярной биологии, генетической инженерии, медицине и предназначено для экспресс-диагностики отопоксвирусов, патогенных для человека и дискриминации их от герпесвирусов, вызывающих сходные клинические проявления. Предлагаемый способ позволяет определять различные типы ортопоксвирусов и основан на проведении одноэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей гибридизацией полученных флуоресцентно меченых ампликонов с ДНК-микрочипом, содержащим дискриминирующие ортопокс- и герпесвирус-гибридизационные зонды.The invention relates to molecular biology, genetic engineering, medicine, and is intended for rapid diagnosis of otopoxviruses pathogenic to humans and their discrimination against herpes viruses that cause similar clinical manifestations. The proposed method allows to determine various types of orthopoxviruses and is based on a one-stage polymerase chain reaction (PCR) followed by hybridization of the obtained fluorescently labeled amplicons with a DNA microarray containing discriminatory orthopox and herpes virus hybridization probes.

Использование этого способа позволяет определять патогенный для человека тип ортопоквируса и дискриминировать его от герпесвирусов 1, 2 и 3 типов.Using this method allows to determine the pathogenic type of orthopocvirus for a person and to discriminate against herpes viruses of types 1, 2 and 3.

Из девяти видов вирусов рода Orthopoxvirus семейства Poxviridae четыре - вирус натуральной оспы (VARV), вирус оспы обезьян (MPXV), вирус оспы коров (CPXV) и вирус осповакцины (VACV) - являются патогенными для человека, вызывая заболевания различной степени тяжести. Натуральная оспа, характеризовавшаяся ранее массовыми эпидемиями с высоким процентом летальных исходов среди заболевших людей в ходе кампании, проведенной Всемирной Организацией здравоохранения (ВОЗ), была ликвидирована к 1977 г. В последующий период массовая вакцинация против натуральной оспы была прекращена, и к настоящему моменту огромная часть населения земного шара оказалась полностью не защищена как от вируса натуральной оспы, так и от других патогенных ортопоксвирусов.Of the nine types of viruses of the genus Orthopoxvirus of the family Poxviridae, four - variola virus (VARV), monkeypox virus (MPXV), cowpox virus (CPXV) and vaccinia virus (VACV) - are pathogenic for humans, causing diseases of varying severity. Natural smallpox, which had previously been characterized by mass epidemics with a high death rate among sick people during the campaign conducted by the World Health Organization (WHO), was eradicated by 1977. In the following period, mass vaccination against smallpox was discontinued, and so far a huge part The world's population turned out to be completely unprotected against smallpox virus and other pathogenic orthopoxviruses.

Несмотря на то, что по данным ВОЗ лишь две лаборатории в мире официально владеют образцами вируса натуральной оспы, полностью нет уверенности в отсутствии неучтенных образцов, а высокая вероятность передачи от человека к человеку и большой процент летальных исходов при заражении позволяют рассматривать VARV как потенциальное оружие биотеррористов. Периодические вспышки заболеваний, вызванных MPXV, заставляют разрабатывать и совершенствовать надежные методы лабораторной диагностики ортопоксвирусов.Despite the fact that, according to WHO data, only two laboratories in the world officially possess smallpox virus samples, there is no confidence in the absence of unaccounted samples, and the high probability of human-to-human transmission and a high percentage of deaths from infection allow us to consider VARV as a potential weapon of bioterrorists . Periodic outbreaks of diseases caused by MPXV force the development and improvement of reliable methods for laboratory diagnosis of orthopoxviruses.

В настоящее время для видовой идентификации ортопоксвирусов применяется ряд методов, среди которых можно указать следующие.Currently, a number of methods are used for the species identification of orthopoxviruses, among which the following can be indicated.

Классическим способом лабораторной диагностики ортопоксвирусных инфекций является реакция торможения гемагглютинации (РТГА) [1]. Способ обладает низкой чувствительностью. Для получения окончательного ответа требуется повторное взятие крови у больного через 5-6 суток. Следует учесть, что в зависимости от качества материала кожных поражений и срока болезни, отрицательный результат (низкие титры гемагглютинина) не исключает наличия инфекции.A classic method for laboratory diagnosis of orthopoxvirus infections is the hemagglutination inhibition test (HSCA) [1]. The method has a low sensitivity. To obtain a final answer, repeated blood sampling from the patient is required after 5-6 days. It should be noted that depending on the quality of the material of skin lesions and the duration of the disease, a negative result (low titers of hemagglutinin) does not exclude the presence of infection.

Другим классическим приемом лабораторной диагностики является метод выделения вируса на хорионаллантоисной оболочке развивающихся куриных эмбрионов. С помощью данного подхода возможно осуществлять дифференциацию ортопоксвирусов между собой [2, 3]. Способ обладает высокой чувствительностью, но, несмотря на это, недостатком его является необходимость работы с высокопатогенным вирусным материалом. Кроме того, время исследования составляет от 3 до 6 суток.Another classic laboratory diagnostic technique is the method of isolating the virus on the chorionallantoic membrane of developing chicken embryos. Using this approach, it is possible to differentiate orthopoxviruses among themselves [2, 3]. The method has high sensitivity, but, despite this, its disadvantage is the need to work with highly pathogenic viral material. In addition, the study time is from 3 to 6 days.

Известен способ обнаружения оспенного антигена методом иммунофлуоресценции [4, 5], эффективность которого зависит от вида исследуемого материала. Достоверность результатов исследования материала из пустул и корок с использованием этого способа не велика, поскольку в анализируемых пробах присутствует примесь лейкоцитов, обладающих аутофлуоресценцией.There is a method of detecting smallpox antigen by immunofluorescence [4, 5], the effectiveness of which depends on the type of material being studied. The reliability of the results of the study of material from pustules and crusts using this method is not great, because in the analyzed samples there is an admixture of leukocytes with autofluorescence.

Применение методов иммунной электронной микроскопии [6, 7] и иммуноферментного анализа для видовой идентификации ортопоксвирусов [5, 8] требует наличия видоспецифичных моноклональных антител для каждого вида ортопоксвирусов. Возможность их применения показана лишь на весьма ограниченном количестве ортопоксвирусов. К тому же, применение таких методов для видовой диагностики ограничено ввиду близкого антигенного родства представителей Orthopoxvirus.The use of methods of immune electron microscopy [6, 7] and enzyme immunoassay for the species identification of orthopoxviruses [5, 8] requires species-specific monoclonal antibodies for each type of orthopoxviruses. The possibility of their use is shown only on a very limited number of orthopoxviruses. In addition, the use of such methods for species diagnosis is limited due to the close antigenic relationship of representatives of Orthopoxvirus.

Метод амплификации фрагментов ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет извлекать специфические фрагменты ДНК из следовых количеств анализируемого генетического материала в течение короткого времени. Методы, основанные на ПЦР, с последующим анализом длины амплифицированного фрагмента [9] или с последующим рестрикционным анализом [10] в применении к идентификации ортопоксвирусов позволяют проводить детекцию генетического материала указанных вирусов непосредственно в клинических материалах, для которой не требуется наработки тестируемого вируса, что особенно важно в случае высокопатогенных штаммов.The method of amplification of DNA fragments in the polymerase chain reaction (PCR) allows you to extract specific DNA fragments from trace amounts of the analyzed genetic material in a short time. Methods based on PCR, followed by analysis of the length of the amplified fragment [9] or followed by restriction analysis [10] as applied to the identification of orthopoxviruses, allow the detection of the genetic material of these viruses directly in clinical materials, which do not require the production of the test virus, which is especially important in the case of highly pathogenic strains.

В настоящее время наиболее перспективным является метод микрочипового анализа с использованием олигонуклеотидных зондов.Currently, the most promising method is microarray analysis using oligonucleotide probes.

Известен ускоренный способ видовой идентификации шести видов (и двух подвидов) вирусов рода Orthopoxvirus [11, 12, прототип]. В качестве мишени для дифференциальной диагностики в данном тесте выбран ген CrmB, кодирующий вирусный аналог клеточного рецептора фактора некроза опухолей. Метод основан на двустадийной ПЦР с получением флуоресцентно меченных красителем TexasRed фрагментов ДНК с последующей гибридизацией на микрочипе, содержащем набор из 14 видоспецифичных олигонуклеотидных зондов. Другими объектами этого же изобретения являются биочип, используемый в способе видовой идентификации ортопоксвирусов, представляющий собой акриламидную гелевую микроматрицу на стеклянной подложке, на которой иммобилизованы типирующие олигонуклеотиды, и собственно набор дискриминирующих олигонуклеотидов, предназначенных для иммобилизации на биочипе и характеризующихся комплементарностью к видам орпопоксвирусов.There is an accelerated method for the species identification of six species (and two subspecies) of the viruses of the genus Orthopoxvirus [11, 12, prototype]. In this test, the CrmB gene encoding the viral analogue of the tumor receptor factor cell receptor was selected as a target for differential diagnosis. The method is based on two-stage PCR to obtain DNA fragments fluorescently labeled with TexasRed dye, followed by hybridization on a microchip containing a set of 14 species-specific oligonucleotide probes. Other objects of the same invention are a biochip used in a method for the species identification of orthopoxviruses, which is an acrylamide gel microarray on a glass substrate on which typing oligonucleotides are immobilized, and a set of discriminating oligonucleotides intended for immobilization on a biochip and characterized by complementarity.

Недостатком описанного способа является то, что используемый в этом случае микрочип способен работать с ограниченными по длине амплифицируемыми фрагментами (~100 нуклеотидов), что вызвано затрудненностью проникновения больших ампликонов в гелевые ячейки чипа. Это значительно ограничивает длину вариабельных участков генома ортопоксвирусов, пригодных для выбора видоспецифичных зондов. Кроме того, этот способ и биочип с набором типирующих олигонуклеотидов не позволяет диагностировать герпесвирусы, вызывающие схожие с ортопоксвирусами клинические проявления.The disadvantage of the described method is that the microchip used in this case is capable of working with amplified fragments of limited length (~ 100 nucleotides), which is caused by the difficulty of penetration of large amplicons into the gel cells of the chip. This significantly limits the length of the variable regions of the genome of orthopoxviruses suitable for the selection of species-specific probes. In addition, this method and the biochip with a set of typing oligonucleotides do not allow to diagnose herpes viruses that cause clinical manifestations similar to orthopoxviruses.

Известен также способ диагностики [13], основанный на использовании микрочипа, представляющего собой стеклянную подложку с ковалентно присоединенными к ней гибридизационными зондами. Гибридизационные зонды выбраны из последовательности гена B29R, кодирующего вирусный ингибитор СС-хемокинов. Этот способ диагностики также не способен диагностировать герпесвирусы, вызывающие схожие с ортопоксвирусами клинические проявления, и дискриминировать их от последних.There is also a known diagnostic method [13], based on the use of a microchip, which is a glass substrate with hybridization probes covalently attached to it. Hybridization probes are selected from the sequence of the B29R gene encoding a viral CC chemokine inhibitor. This diagnostic method is also not able to diagnose herpes viruses that cause clinical manifestations similar to orthopoxviruses and to discriminate against them from the latter.

В настоящее время не описаны биочипы с иммобилизованными на них типирующими олигонуклеотидами, обеспечивающими видовую идентификацию ортопоксвирусов, патогенных для человека, и одновременно дискриминацию их от герпесвирусов, вызывающих сходные клинические проявления.At present, biochips with typing oligonucleotides immobilized on them, providing species identification of orthopoxviruses pathogenic for humans, and at the same time discrimination against herpes viruses that cause similar clinical manifestations, have not been described.

Технической задачей изобретения является создание олигонуклеотидного микрочипа, позволяющего с высокой точностью (специфичностью) определить как наличие ортопоксвируса, осуществить его видовую идентификацию, так и диагностировать наличие герпесвирусов 1, 2 и 3 типов, а также создание способа экспресс-диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, и дискриминации их от герпесвирусов, вызывающих сходные клинические проявления.An object of the invention is the creation of an oligonucleotide microchip that allows with high accuracy (specificity) to determine both the presence of orthopoxvirus, to carry out its species identification, and to diagnose the presence of herpes viruses 1, 2 and 3 types, as well as the creation of a method for the rapid diagnosis of orthopoxviruses pathogenic for humans, and discrimination against herpes viruses that cause similar clinical manifestations.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является определение типа ортопоксвируса либо герпесвируса при проведении одноэтапной ПЦР с последующей гибридизацией флуоресцентно меченых ампликонов с ДНК-микрочипом, содержащим дискриминирующие ортопокс- и герпесвирус-гибридизационные зонды.The technical result achieved by the present invention is to determine the type of orthopoxvirus or herpes virus during one-stage PCR followed by hybridization of fluorescently labeled amplicons with a DNA microarray containing discriminatory orthopox and herpes virus hybridization probes.

Поставленная задача решается путем дизайна гибридизационных зондов для микрочипа к двум генам-мишеням, кодирующим хемокин (ген B29R)- и α/β-интерферонсвязывающий белок (ген B19R). Дизайн проведен при анализе существенно большего набора ДНК-последовательностей штаммов ортопоксвирусов по сравнению с подходом, описанным в [12, 13], - 86 последовательностей для первого гена и 72 последовательности для второго. Отбор видоспецифичных зондов для HSV-1 выполнен по последовательностям генов US4 и US5, кодирующих гликопротеины «G» (192 штамма и изолята); гена US4 (гликопротеин «G-2») для HSV-2 (17 штаммов и изолятов); гена ORF31 (гликопротеин «B») для VZV (20 штаммов и изолятов).The problem is solved by designing hybridization probes for a microchip to two target genes encoding a chemokine (B29R gene) and an α / β interferon binding protein (B19R gene). The design was carried out in the analysis of a significantly larger set of DNA sequences of strains of orthopoxviruses compared with the approach described in [12, 13], 86 sequences for the first gene and 72 sequences for the second. The selection of species-specific probes for HSV-1 was performed according to the sequences of genes US4 and US5 encoding glycoproteins “G” (192 strains and isolate); US4 gene (G-2 glycoprotein) for HSV-2 (17 strains and isolates); gene ORF31 (glycoprotein "B") for VZV (20 strains and isolates).

Виды и штаммы ортопоксвирусов, последовательности ДНК которых были использованы при дизайне микрочипа, приведены в Таблице 1. Выполненный филогенетический анализ генов B29R и B19R обнаружил весьма хорошую видовую кластеризацию проанализированных ортопоксвирусов и указал на возможность нахождения нуклеотидных последовательностей, пригодных для их видовой дискриминации.The types and strains of orthopoxviruses whose DNA sequences were used in the design of the microchip are shown in Table 1. The performed phylogenetic analysis of the B29R and B19R genes revealed a very good species clustering of the analyzed orthopoxviruses and indicated the possibility of finding nucleotide sequences suitable for their species discrimination.

Анализ последовательностей ДНК штаммов ортопоксвирусов, представленных в Таблице 1, показал, что число родоспецифичных зондов (общих для всех рассмотренных штаммов данного вида) ограничено, но они существуют для обоих генов (см. Табл.2).Analysis of the DNA sequences of the strains of orthopoxviruses presented in Table 1 showed that the number of genus-specific probes (common for all considered strains of this species) is limited, but they exist for both genes (see Table 2).

Для определения видовой принадлежности вируса оспы отбирались два типа зондов. Отбор олигонуклеотидных зондов выполнен по специально разработанной авторами компьютерной программе, согласно которой первый тип олигонуклеотидных последовательностей должен быть общим для данного вида и иметь комплементарный сайт в другом виде только при введении двух замен в любом месте олигонуклеотидного зонда; второй тип может иметь комплементарный сайт связывания при введении одной замены, но такая замена должна находиться не ближе, чем 5 оснований с 3′- или 5′-конца зонда. Длины используемых зондов варьируются от 13 до 21 нуклеотида и имеют теоретическую температуру плавления (T_m) в диапазоне 44-48°С, которая рассчитана по методу «ближайших соседей» для концентрации олигонуклеотида 1.5×10^-6 M и [Na⁺]=50 mM.To determine the species of smallpox virus, two types of probes were selected. The selection of oligonucleotide probes was performed according to a computer program specially developed by the authors, according to which the first type of oligonucleotide sequences should be common for this species and have a complementary site in another form only when two substitutions are introduced anywhere in the oligonucleotide probe; the second type may have a complementary binding site when one substitution is introduced, but such a substitution should be no closer than 5 bases from the 3′- or 5′-end of the probe. The lengths of the probes used vary from 13 to 21 nucleotides and have a theoretical melting temperature (T _m ) in the range 44-48 ° C, which was calculated by the “nearest neighbors” method for an oligonucleotide concentration of 1.5 × 10 ^-6 M and [Na ⁺ ] = 50 mM.

Выбранные зонды однозначно определяют все виды ортопоксвирусов, патогенных для человека - VARV, MPXV, CMLV, VACV.The selected probes uniquely determine all types of orthopoxviruses pathogenic for humans - VARV, MPXV, CMLV, VACV.

Анализ набора последовательностей показал, что для VACV общие зонды, полностью дискриминирующие этот вид по гену B29R, отсутствуют (Табл.2). Задача по диагностике VACV решается с помощью использования набора зондов, специфичных к известным последовательностям VACV.The analysis of the sequence set showed that for VACV, common probes that completely discriminate against this species according to the B29R gene are absent (Table 2). The task of diagnosing VACV is accomplished by using a set of probes specific to known VACV sequences.

Использование в качестве гена-мишени B19R позволяет избежать недостатков микрочипа, разработанного ранее только по данным для гена B29R [13], и повысить достоверность результатов определения. Во-первых, повышается количество родоспецифичных зондов (в дополнение к 7 зондам по гену B29R добавляется 7 зондов по гену B19R), а также набор видоспецифичных зондов для VARV, MPXV, CMLV, ECTV. Вместе с тем, общие для всех штаммов CPXV зонды не удается найти по обоим генам. Тем не менее, олигонуклеотидные последовательности по гену B19R позволяют идентифицировать видовую принадлежность CPXV более полно (см. Табл.2). Это достигается за счет разбиения вида CPXV на 2 группы - «CPXV-A» и «CPXV-B». Группа «CPXV-A» разбивается на две подгруппы «CPXV-A1» и «CPXV-A2». Первая подгруппа включает в себя 3 штамма (С/BRI, C/GRU, C/TUR) и определяется зондами Cpv_B19_1, Cpv_B19_2, Cpv_B19_3, Cpv_B19_4 (Табл. 2). Вторая подгруппа состоит из девяти штаммов (С/BRI, C/GRU, C/TUR, C/EP267, C/EP3 С/EP2, C/EXP, C/RP9, OPV-88) и дискриминируется тремя зондами (Cpv_B19_5, Cpv_B19_6, Cpv_B19_7). Зонды Cpv_B19_4 и Cpv_B19_5 позволяют определить штамм С/OPV-88, а определение штамма С/EP2 возможно только по зонду Cpv_B19_5. Группа «CPXV-B» содержит 9 штаммов (C/HAM, C/PUM, C/REV, C/EP1, C/EP4, C/EP6, C/EP7, C/EP8, C/RP1) и определяется зондами Cpv_B19_6 и Cpv_B19_7 (Табл.2).The use of the B19R target gene allows one to avoid the disadvantages of the microchip, previously developed only according to the data for the B29R gene [13], and to increase the reliability of the determination results. Firstly, the number of genus-specific probes is increasing (in addition to 7 probes for the B29R gene, 7 probes for the B19R gene are added), as well as a set of species-specific probes for VARV, MPXV, CMLV, ECTV. However, the probes common to all CPXV strains cannot be found for both genes. Nevertheless, the oligonucleotide sequences of the B19R gene allow us to identify the species affiliation of CPXV more fully (see Table 2). This is achieved by splitting the CPXV type into 2 groups - “CPXV-A” and “CPXV-B”. The CPXV-A group is divided into two subgroups, CPXV-A1 and CPXV-A2. The first subgroup includes 3 strains (C / BRI, C / GRU, C / TUR) and is determined by the probes Cpv_B19_1, Cpv_B19_2, Cpv_B19_3, Cpv_B19_4 (Table 2). The second subgroup consists of nine strains (C / BRI, C / GRU, C / TUR, C / EP267, C / EP3 C / EP2, C / EXP, C / RP9, OPV-88) and is discriminated by three probes (Cpv_B19_5, Cpv_B19_6 , Cpv_B19_7). The probes Cpv_B19_4 and Cpv_B19_5 make it possible to determine strain C / OPV-88, and the determination of strain C / EP2 is possible only by probe Cpv_B19_5. The CPXV-B group contains 9 strains (C / HAM, C / PUM, C / REV, C / EP1, C / EP4, C / EP6, C / EP7, C / EP8, C / RP1) and is determined by probes Cpv_B19_6 and Cpv_B19_7 (Table 2).

Типирующие олигонуклеотиды в количестве 110 для дифференциальной диагностики ортопоксвирусов и дискриминации от них герпесвирусов 1, 2 и 3 типов на биологическом микрочипе приведены в Таблице 2.110 typing oligonucleotides for the differential diagnosis of orthopoxviruses and their discrimination against herpes viruses of types 1, 2 and 3 on a biological microchip are shown in Table 2.

Принципиальная схема дифференциальной диагностики ортопоксвирусов на биочипе включает следующие стадии:The schematic diagram of the differential diagnosis of orthopoxviruses on a biochip includes the following stages:

1. Из природного образца (ткани животных или человека) выделяют суммарную ДНК.1. From a natural sample (animal or human tissue) total DNA is isolated.

2. С помощью праймеров, специфичных к B29R и B19R генам различных видов ортопоксвирусов и генам US4, US5 и ORF31 для герпесвирусов, получают преимущественно одноцепочечную ДНК путем проведения ПЦР в асимметричном режиме.2. Using primers specific for the B29R and B19R genes of various types of orthopoxviruses and the US4, US5 and ORF31 genes for herpes viruses, predominantly single-stranded DNA is obtained by performing PCR in asymmetric mode.

3. Полученные ампликоны метят путем введения флуоресцентной метки в их состав.3. The resulting amplicons are labeled by introducing a fluorescent label into their composition.

4. На следующей стадии проводят гибридизацию полученных ампликонов с дискриминирующими зондами, входящими в состав разработанного микрочипа.4. At the next stage, the resulting amplicons are hybridized with discriminating probes that are part of the developed microchip.

5. Анализ результатов гибридизации проводят с помощью сканера микрочипов и программы Scanarray Express.5. Analysis of the results of hybridization is carried out using a microchip scanner and Scanarray Express.

6. Определение видовой принадлежности ортопокс- и герпесвирусов проводится путем сравнения экспериментальной и теоретической картин гибридизации.6. The determination of the species affiliation of orthopox and herpes viruses is carried out by comparing the experimental and theoretical hybridization patterns.

Последовательности олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации участков обоих генов ортопоксвирусов и генов герпесвирусов, приведены в Таблице 3.The sequences of oligonucleotide primers used to amplify regions of both orthopoxvirus and herpes virus genes are shown in Table 3.

Праймеры выбраны таким образом, чтобы либо амплифицировать все виды поксвирусов (универсальные праймеры), либо только один из их видов (видоспецифичные праймеры).Primers are selected in such a way as to either amplify all types of poxviruses (universal primers), or only one of their species (species-specific primers).

В случае ортопоксвирусов длина нарабатываемых ампликонов составляет ~1100 нуклеотидов для гена В29R и ~1300 нуклеотидов для гена В19R, а для герпесвирусов HSV-1, HSV-2, VZV соответственно 275, 335 и 310 нуклеотидов.In the case of orthopoxviruses, the length of the generated amplicons is ~ 1100 nucleotides for the B29R gene and ~ 1300 nucleotides for the B19R gene, and for the herpes viruses HSV-1, HSV-2, VZV, respectively, 275, 335 and 310 nucleotides.

Преимуществом разработанного микрочипа является возможность использования при гибридизации ампликонов большого размера, поскольку в отличие от гелевых микрочипов прототипа дискриминирующие олигонуклеотиды пришиты непосредственно к стеклянной поверхности микрочипа. Поэтому в этом случае нет никаких затруднений, связанных с диффузией крупных ампликонов внутрь гелевой ячейки микрочипа.The advantage of the developed microchip is the possibility of using large amplicons in hybridization, since, unlike the gel microchips of the prototype, discriminating oligonucleotides are sewn directly to the glass surface of the microchip. Therefore, in this case, there are no difficulties associated with the diffusion of large amplicons into the gel cell of the microchip.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.The invention is illustrated by the following graphic materials.

Фиг.1. Структура микрочипа для диагностики ортопокс- и герпесвирусов.Figure 1. Microchip structure for the diagnosis of orthopox and herpes viruses.

Фиг.2. Результаты анализа ортопокс- и герпесвирусов с помощью микрочипа.Figure 2. The results of the analysis of orthopox and herpes viruses using a microchip.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже приведены примеры его конкретного выполненния.For a better understanding of the invention, the following are examples of its specific implementation.

Пример 1. Изготовление микрочипов для диагностики ортопокс- и герпесвирусов.Example 1. The manufacture of microchips for the diagnosis of orthopox and herpes viruses.

Печать микрочипов осуществляют на стеклянных альдегидных слайдах методом контактной печати на споттере SpotArray^TM («Perkin Elmer») одновременно четырьмя пинами №7 («Perkin Elmer») со стандартизованным расстоянием между ними 9 мм. В итоге каждый слайд содержит 8 эквивалентных микромассивов зондов, пригодных для одновременной гибридизации 8 образцов. Средний диаметр спотов (ячеек микрочипа с иммобилизованными зондами) составляет ~280 μm, расстояние между спотами - 380 μm. Логический размер итогового микромассива, включающего все 110 зондов, составляет 10 colomns×11 rows, геометрический размер - 5.9×6.3 мм. Дизайн микрочипа представлен на Фиг.1, а в Таблице 2 показаны позиции соответствующих зондов. Зонды располагаются на микрочипе без повторов, последовательно согласно перечню, приведенному в Таблице 2, и сгруппированы в подмножества соответствующей специфичности. Состав смеси для печатания чипа включает: 70 мкМ олигонуклеотидного зонда, 10 мкМ «нормировочного» олигонуклеотида (QC) с последовательностью: 5′-H₂N(CH₂)₆-TTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGG-3′ (Tm=58°C), индифферентной по отношению ко всем последовательностям ОПВ, HSV и зондов, приведенных в Таблицах 1 и 2. Раствор олигонуклеотидных зондов для печатания чипа готовится в смеси ДМСО:H₂O (1:1). Ковалентную иммобилизацию олигонуклеотидов на альдегидном стекле осуществляют путем восстановления образовавшегося на стадии печатания основания Шиффа.Microchips are printed on glass aldehyde slides by contact printing on a SpotArray ^™ spotter (Perkin Elmer) simultaneously with four pins No. 7 (Perkin Elmer) with a standardized 9 mm spacing between them. As a result, each slide contains 8 equivalent microarrays of probes suitable for the simultaneous hybridization of 8 samples. The average diameter of spots (microchip cells with immobilized probes) is ~ 280 μm, the distance between spots is 380 μm. The logical size of the resulting microarray, including all 110 probes, is 10 colomns × 11 rows, and the geometric size is 5.9 × 6.3 mm. The microchip design is shown in FIG. 1, and Table 2 shows the positions of the respective probes. The probes are located on the microchip without repetitions, sequentially according to the list shown in Table 2, and are grouped into subsets of the corresponding specificity. The composition of the mixture for printing a chip includes: 70 μM oligonucleotide probe, 10 μM normalization oligonucleotide (QC) with the sequence: 5′-H ₂ N (CH ₂ ) ₆ -TTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGG-3 ′ (Tm = 58 ° C), indifferent in with respect to all sequences of OPV, HSV and probes shown in Tables 1 and 2. A solution of oligonucleotide probes for printing a chip is prepared in a mixture of DMSO: H ₂ O (1: 1). Covalent immobilization of oligonucleotides on aldehyde glass is carried out by restoring the Schiff base formed during the printing step.

Пример 2. Получение флуоресцентных ампликонов для анализаExample 2. Obtaining fluorescent amplicons for analysis

Для получения преимущественно одноцепочечной ДНК проводят ПЦР в асимметричном режиме. Состав реакционной смеси (50 мкл): буфер для ПЦР «Qiagen» (1.5 мМ MgCl₂, KCl, (NH₄)₂SO₄, Трис-HCl, pH 8.7), MgCl₂ - 1.5 мМ, 0.2 мМ каждого dNTP, 80 нМ прямого праймера, 800 нМ обратного праймера, 1.25 ед. Hot Start Taq-полимеразы («Qiagen») и 1 мкл раствора вирусной ДНК. ПЦР проводят в термоциклере TGradient («Biometra»), используя следующий протокол: 95°C - 15 мин, затем 35 циклов: 94°C - 30 с, 52-56°C - 30 с, 72°C - 1 мин 30 с, заключительная инкубация 72°C - 10 мин. Контроль за наработкой ампликона осуществляют электрофорезом в 1% агарозном геле с окрашиванием этидий бромидом. Введение флуоресцентной метки осуществляют с помощью цианинового красителя «Micromax^TM ASAP Cy3 labeling reagent» («Perkin Elmer»).To obtain predominantly single-stranded DNA, PCR is performed in asymmetric mode. The composition of the reaction mixture (50 μl): Qiagen PCR buffer (1.5 mM MgCl ₂ , KCl, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , Tris-HCl, pH 8.7), MgCl ₂ - 1.5 mM, 0.2 mM each dNTP, 80 nM forward primer, 800 nM reverse primer, 1.25 units Hot Start Taq polymerase ("Qiagen") and 1 μl of viral DNA solution. PCR is carried out in a TGradient thermal cycler (Biometra) using the following protocol: 95 ° C for 15 min, then 35 cycles: 94 ° C for 30 s, 52-56 ° C for 30 s, 72 ° C for 1 min 30 s final incubation 72 ° C - 10 min. Amplicon production is monitored by electrophoresis on a 1% agarose gel stained with ethidium bromide. The introduction of the fluorescent label is carried out using the cyanine dye "Micromax ^™ ASAP Cy3 labeling reagent"("PerkinElmer").

Образцы одноцепочечной ДНК, полученной в ходе асимметричной ПЦР, предварительно очищают на колонке QIAquick («Qiagen») по протоколу производителя, добавляют по 1 мкл 1 мМ раствора цианинового красителя «Micromax^TM ASAP Cy3 labeling reagent» («Perkin Elmer») и выдерживают 1 час при 85°С. Флуоресцентно-меченые ампликоны очищают от избытка красителя на колонках Sentrisep, высушивают досуха на вакуумной центрифуге при 60°С и используют для гибридизации.Samples of single-stranded DNA obtained by asymmetric PCR are pre-purified on a QIAquick column (Qiagen) according to the manufacturer's protocol, 1 μl of 1 mM Micromax ^™ ASAP Cy3 labeling reagent (Perkin Elmer) cyanine dye solution is added and kept for 1 hour at 85 ° C. Fluorescently-labeled amplicons are purified from excess dye on Sentrisep columns, dried to dryness in a vacuum centrifuge at 60 ° C and used for hybridization.

Пример 3. Гибридизация анализируемых ампликонов.Example 3. Hybridization of the analyzed amplicons.

Гибридизацию флуоресцентно-меченых ампликонов проводят в гибридизационной камере фирмы ArrayIt, Sunnyvale. Высушенный образец ампликона растворяют в 2.5 мкл воды, добавляют 2.5 мкл 2x гибридизационного буфера (6×SSC, 5(раствор Денхардта, 0.1% SDS и 0.3 мкл 10 мкМ раствора модифицированного олигонуклеотида, меченого цианиновым красителем Cy5 по 5′ концу с последовательностью, комплементарной QC: 5′-Cy5-CONH(CH₂)₆-CCCATATCGTTTCATAGCTTCTGCC-3′ (QC-Cy5, T_m=56°C). Гибридизацию осуществляют при температуре 45°С в течение 40 мин.Hybridization of fluorescently labeled amplicons is carried out in a hybridization chamber of ArrayIt, Sunnyvale. The dried amplicon sample is dissolved in 2.5 μl of water, 2.5 μl of 2x hybridization buffer (6 × SSC, 5 (Denhardt's solution, 0.1% SDS and 0.3 μl of a 10 μM solution of the modified oligonucleotide labeled with Cy5 cyanine dye at the 5 ′ end with a sequence complementary to QC) is added : 5′-Cy5-CONH (CH ₂ ) ₆ -CCCATATCGTTTCATAGCTTCTGCC-3 ′ (QC-Cy5, T _m = 56 ° C.) Hybridization was carried out at a temperature of 45 ° C. for 40 minutes.

Пример 4. Анализ результатов гибридизации.Example 4. Analysis of the results of hybridization.

Сканирование слайда проводят на сканере ScanArray Express 2.0 (Perkin Elmer) последовательно с использованием двух возбуждающих лазеров с длинами волн λ₁=543 нм для Cy3 и λ₂=633 нм для Cy5. В последнем случае наблюдают флуоресцентное свечение всех спотов вследствие гибридизации QC и QC-Cy5 (Фиг.1). Изображение, полученное по каналу возбуждения флуоресценции с длиной волны λ₂, служит показателем качества печати чипа, а интегральная величина флуоресценции каждого спота рассматривается в качестве нормировочной для флуоресценции того же спота, измеренной по каналу возбуждения с λ₁. Анализ изображения осуществляют с использованием программы Scanarray Express, входящих в математическое обеспечение сканера. Для i-го спота нормированную флуоресценцию рассчитывают по формуле:The slide is scanned on a ScanArray Express 2.0 scanner (Perkin Elmer) sequentially using two exciting lasers with wavelengths λ ₁ = 543 nm for Cy3 and λ ₂ = 633 nm for Cy5. In the latter case, the fluorescent glow of all spots is observed due to the hybridization of QC and QC-Cy5 (Figure 1). The image obtained through the fluorescence excitation channel with a wavelength of λ ₂ serves as an indicator of the print quality of the chip, and the integral fluorescence value of each spot is considered as normal for fluorescence of the same spot measured along the excitation channel with λ ₁ . Image analysis is carried out using the Scanarray Express program included in the scanner software. For the i-th spot, normalized fluorescence is calculated by the formula:

I_i=I_i(Cy3)/I_i(Cy5),I _i = I _i (Cy3) / I _i (Cy5),

где I_i(Cy3)=F_i(Cy3)-B_i(Cy3), F_i(Cy3) - интегральная интенсивность флуоресценции в пределах спота, B_i(Cy3) - средняя фоновая интенсивность флуоресценции в окружении спота. Аналогичным образом рассчитывают величину I_i(Cy5). Величины F_i и B_i рассчитываются в вариантах "median spot» и «mean spot". Последний вариант расчета оказался более удобным для количественной обработки изображения, полученного по каналу λ₂ при повышенной интенсивности фона.where I _i (Cy3) = F _i (Cy3) -B _i (Cy3), F _i (Cy3) is the integrated fluorescence intensity within the spot, and B _i (Cy3) is the average background fluorescence intensity in the spot environment. Similarly calculate the value of I _i (Cy5). The values of F _i and B _{i are} calculated in the variants "median spot" and "mean spot". The latter version of the calculation turned out to be more convenient for quantitative processing of the image obtained via the λ ₂ channel with increased background intensity.

Определение видовой принадлежности ортопокс- и герпесвирусов проводится путем сравнения экспериментальной и теоретической картин гибридизации.The species affiliation of orthopox and herpes viruses is determined by comparing the experimental and theoretical hybridization patterns.

Результаты анализа различных ортопокс- и герпесвирусов приведены на Фиг.2.The results of the analysis of various orthopox and herpes viruses are shown in Figure 2.

Источники информацииInformation sources

1. Марцевич Г.Р., Радюк С.Н., Рыжов К.А. и др. // Вопр. вирусол. - 1996 - №5 - стр.195-197.1. Martsevich G.R., Radyuk S.N., Ryzhov K.A. and others // Issues. virusol. - 1996 - No. 5 - p. 195-197.

2. Downie, A.W., Dumbell, K.R. // J.Path. Bact. - 1947 - v.59 - №1-2 - p.189-198.2. Downie, A.W., Dumbell, K.R. // J.Path. Bact. - 1947 - v. 59 - No. 1-2 - p. 189-198.

3. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. // Патогенные для человека ортопоксвирусы. // КМК Scientific Press Ltd - Москва - 1998 - стр.386.3. Marennikova S. S., Schelkunov S. N. // Pathogenic for humans orthopoxviruses. // KMK Scientific Press Ltd - Moscow - 1998 - p. 386.

4. Авакян А.А., Альтштейн А.Д., Кириллова Ф.М., Быковский А.Ф. // Вопр. вирусол. - 1981 - №2 - стр.196-203.4. Avakyan A.A., Altstein A.D., Kirillova F.M., Bykovsky A.F. // Q. virusol. - 1981 - No. 2 - p. 196-203.

5. Мальцева Н.Н. // Экспресс-диагностика заболеваний, вызванных ортопокс - и некоторыми герпес вирусами // 1980 - Дисс.Докт. - М.5. Maltseva N.N. // Express diagnostics of diseases caused by orthopox - and some herpes viruses // 1980 - Diss.Doc. - M.

6. Маренникова С.С., Янова Н.Н., Жукова О.А. // Ж. Микробиол. - 1990 - вып.8 - стр.57-62.6. Marennikova S.S., Yanova N.N., Zhukova O.A. // J. Microbiol. - 1990 - issue 8 - p. 57-62.

7. Marennikova, S.S., Nagieva, F.G., Matsevich, G.R., Shelulhina, E.M. and all. // Acta Virol. - 1988 - v.32 - p.19-26.7. Marennikova, S.S., Nagieva, F.G., Matsevich, G.R., Shelulhina, E.M. and all. // Acta Virol. - 1988 - v.32 - p.19-26.

8. Маренникова С.С., Мацевич Г.Р., Хабахпашева Н.А. и др. // Вопр. Вирусол. - 1986 - №6 - стр.689-690.8. Marennikova S.S., Matsevich G.R., Khabakhpasheva N.A. and others // Issues. Virusol. - 1986 - No. 6 - p. 689-690.

9. Патент РФ №2230791 // кл. С12Q 1/68, опубл. 2004 г.9. RF patent No. 2230791 // cl. C12Q 1/68, publ. 2004 year

10. Roop, S.L., Jin, Q., Knight, J.C., Massung, R.F. & Esposito, J.J. // Journal of Clinical Microbiology - 1995 - v.33 - p.2069-2076.10. Roop, S.L., Jin, Q., Knight, J.C., Massung, R.F. & Esposito, J.J. // Journal of Clinical Microbiology - 1995 - v. 33 - p.2069-2076.

11. Lapa S., Mikheev M., Shchelkunov S., Mikhailovich V., Sobolev A., Blinov V., Babkin I., Guskov A., Sokunova E., Zasedatelev A., Sandakhchiev L., Mirzabekov A. // J. Clin. Microbiol. - 2002. Vol.-40. - P.753-757.11. Lapa S., Mikheev M., Shchelkunov S., Mikhailovich V., Sobolev A., Blinov V., Babkin I., Guskov A., Sokunova E., Zasedatelev A., Sandakhchiev L., Mirzabekov A. / / J. Clin. Microbiol. - 2002. Vol.-40. - P.753-757.

12. Международная заявка WO №03046221, кл. С07Н 21/00, опубл. 2003 г.12. International application WO No. 03046221, cl. С07Н 21/00, publ. 2003 year

13. Laassri M., Chizhikov V., Mikheev M., Shchelkunov S., Chumakov K. // J. Virol. Methods. - 2003. - Vol.112. - P.67-78.13. Laassri M., Chizhikov V., Mikheev M., Shchelkunov S., Chumakov K. // J. Virol. Methods - 2003. - Vol. 112. - P.67-78.

Claims (3)

1. Набор универсальных и видоспецифичных олигонуклеотидов-праймеров, используемых для амплификации участков генов C23L/B29R и B19R ортопоксвирусов и генов OPV, US4, US5 герпесвирусов 1, 2, 3 типов при осуществлении способа видовой идентификации ортопокс- и герпесвирусов, патогенных для человека, на биочипе, имеющих нуклеотидные последовательности, приведенные в Таблице 3.1. A set of universal and species-specific primer oligonucleotides used to amplify portions of the C23L / B29R and B19R genes of orthopoxviruses and the OPV, US4, US5 genes of herpes viruses 1, 2, 3 types when implementing the method of species identification of orthopox and herpes viruses that are pathogenic for humans, on biochip having the nucleotide sequence shown in Table 3. 2. Биочип для видовой идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, и дискриминации их от герпесвирусов 1, 2 и 3 типов, содержащий типирующие гибридизационные зонды, ковалентно присоединенные непосредственно к стеклянной микроматрице, имеющие структуру дискриминирующих ДНК-полинуклеотидов, приведенных в Таблице 2.2. A biochip for the species identification of orthopoxviruses pathogenic for humans and their discrimination against types 1, 2 and 3 herpes viruses, containing typing hybridization probes covalently attached directly to a glass microarray having the structure of discriminating DNA polynucleotides shown in Table 2. 3. Способ видовой идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, и дискриминации их от герпесвирусов 1, 2 и 3 типов на биочипе, включающий выделение суммарной ДНК из природного образца, амплификацию фрагментов генов, пригодных для видовой дискриминации, путем проведения ПЦР в асимметричном режиме с использованием специфичных олигонуклеотидов-праймеров для получения флуоресцентно меченых преимущественно одноцепочечных ДНК, проведение ДНК-ДНК гибридизации полученных ампликонов с дискриминирующими зондами, входящими в состав биочипа, регистрацию флуоресцентного сигнала меченого образца с помощью регистрирующего устройства и интерпретацию полученных результатов путем сравнения экспериментальной и теоретической картин гибридизации, отличающийся тем, что при амплификации используют набор олигонуклеотидов-праймеров, охарактеризованный в п.1, а в качестве биочипа - микроматрицу, охарактеризованную в п.2.3. A method for the species identification of orthopoxviruses pathogenic for humans and their discrimination against herpes viruses of types 1, 2 and 3 on a biochip, including isolation of total DNA from a natural sample, amplification of gene fragments suitable for species discrimination, by PCR in asymmetric mode using specific oligonucleotides-primers for obtaining fluorescently labeled predominantly single-stranded DNA, DNA-DNA hybridization of the resulting amplicons with discriminating probes that are part of bi arrays, registering the fluorescent signal of the labeled sample using a recording device and interpreting the results by comparing the experimental and theoretical hybridization patterns, characterized in that the amplification uses a set of oligonucleotides-primers, described in paragraph 1, and as a biochip - microarray, characterized in item 2.

Images