RU2316595C1 - Method for preparing antimicrobial peptide arenicin - Google Patents
Method for preparing antimicrobial peptide arenicin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2316595C1 RU2316595C1 RU2006121111/13A RU2006121111A RU2316595C1 RU 2316595 C1 RU2316595 C1 RU 2316595C1 RU 2006121111/13 A RU2006121111/13 A RU 2006121111/13A RU 2006121111 A RU2006121111 A RU 2006121111A RU 2316595 C1 RU2316595 C1 RU 2316595C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- arenicin
- peptide
- trxl
- his8
- fusion protein
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного ареницина - антимикробного пептида кольчатого червя Arenicola marina, который может найти применение в медицинской и ветеринарной практике в качестве антибиотика широкого спектра действия.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to the production of genetically engineered arenicin, an antimicrobial peptide of the annelid worm Arenicola marina, which can be used in medical and veterinary practice as a broad-spectrum antibiotic.
Ареницин является эндогенным антибиотиком беспозвоночного Arenicola marina (пескожил морской), относящегося к классу Polychaeta (многощетинковые) типа Annelida (кольчатые черви) [пат. РФ №2261866, С07К 14/435, А61Р 31/04, 2005]. Молекула ареницина представляет собой немодифицированную пептидную цепь, содержащую 21 аминокислотный остаток и стабилизированную одной дисульфидной связью, замыкающей цикл из 18 аминокислотных остатков. Ареницин вырабатывается целомоцитами (фагоцитирующими клетками целома червя) и обладает антибактериальной и противогрибковой активностью. Механизм действия ареницина предположительно состоит в избирательном нарушении барьерной функции клеточных мембран патогенных микроорганизмов, не затрагивающем мембраны клеток организма-хозяина. Ареницин является представителем принципиально нового семейства антимикробных пептидов и может найти применение в качестве антибиотика широкого спектра действия.Arenicin is an endogenous antibiotic of the invertebrate Arenicola marina (marine peskozhil), belonging to the class Polychaeta (polychaete) type Annelida (annelids) [US Pat. RF №2261866, С07К 14/435, А61Р 31/04, 2005]. The arenicin molecule is an unmodified peptide chain containing 21 amino acid residues and stabilized by one disulfide bond, closing the cycle of 18 amino acid residues. Arenicin is produced by coelomocytes (phagocytic cells of the worm's coelom) and has antibacterial and antifungal activity. The mechanism of action of arenicin presumably consists in the selective violation of the barrier function of cell membranes of pathogenic microorganisms, which does not affect the cell membranes of the host organism. Arenicin is a representative of a fundamentally new family of antimicrobial peptides and can be used as a broad-spectrum antibiotic.
В настоящее время клиническая медицина столкнулась с проблемой устойчивости патогенов к антибиотикам из имеющегося арсенала лекарственных средств, которые в ряде случаев уже не обеспечивают эффективного контроля над возбудителем при развитии хронических и рецидивирующих инфекционных заболеваний. Антимикробные пептиды являются ведущими молекулярными факторами системы врожденного иммунитета эукариотических организмов, без которого невозможно их выживание в среде, изобилующей потенциальными патогенами. С антимикробными пептидами, обладающими широким спектром биологического действия, связан один из эволюционно древнейших механизмов экстренной защиты животных и человека от инфекции. В настоящее время показана иммуномодулирующая активность антимикробных пептидов [Kamysz W., Okroj M., Lukasiak J. // Novel properties of antimicrobial peptides. Acta Biochim. Pol., 2003, v.52(2), p.461-469]. Учитывая наличие выраженной антибиотической и иммуномодулирующей активности у природных антимикробных пептидов и их особую роль в функционировании системы врожденного иммунитета [Papagianni M. // Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnology Advances, 2003, v.21, p.465-499], многие зарубежные фармацевтические и биотехнологические компании приступили к созданию нового класса антибиотиков на их основе. В настоящее время в технологически развитых странах клинические испытания проходят пептидные антибиотики, рекомендуемые в качестве терапевтических средств при лечении сепсиса, менингита, пневмонии, легочных инфекций при муковисцидозе (кистозном фиброзе), язвенной болезни желудка, инфекций диабетической стопы, а также при лечении кандидоза слизистой оболочки полости рта, мукозита, гингивита, акне, импетиго, микозов, при заживлении ожогов и ран, осложненных вторичной инфекцией, и т.п. [Mcphee J.B., Hancock R.E.W.// Function and therapeutic potential of host defense peptides. J. Peptide Science. - 2005, vol.11, p.677-687].Currently, clinical medicine is faced with the problem of resistance of pathogens to antibiotics from the existing arsenal of drugs, which in some cases no longer provide effective control over the pathogen in the development of chronic and recurrent infectious diseases. Antimicrobial peptides are the leading molecular factors of the innate immunity system of eukaryotic organisms, without which it is impossible to survive in an environment abundant with potential pathogens. Antimicrobial peptides with a wide spectrum of biological action are associated with one of the evolutionarily oldest mechanisms of emergency protection of animals and humans from infection. Currently shown immunomodulating activity of antimicrobial peptides [Kamysz W., Okroj M., Lukasiak J. // Novel properties of antimicrobial peptides. Acta Biochim. Pol., 2003, v. 52 (2), p. 461-469]. Given the presence of pronounced antibiotic and immunomodulating activity in natural antimicrobial peptides and their special role in the functioning of the innate immunity system [Papagianni M. // Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnology Advances, 2003, v.21, p.465-499], many foreign pharmaceutical and biotechnological companies have begun to create a new class of antibiotics based on them. Peptide antibiotics are currently undergoing clinical trials in technologically developed countries, which are recommended as therapeutic agents in the treatment of sepsis, meningitis, pneumonia, pulmonary infections in cystic fibrosis (cystic fibrosis), gastric ulcer, diabetic foot infections, and also in the treatment of candidiasis of the mucous membrane oral cavity, mucositis, gingivitis, acne, impetigo, mycosis, when healing burns and wounds complicated by a secondary infection, etc. [Mcphee J.B., Hancock R.E.W. // Function and therapeutic potential of host defense peptides. J. Peptide Science. - 2005, vol. 11, p. 677-687].
Известен способ получения антимикробного пептида индолицидина, включающий культивирование штамма E.coli BL21 (DЕ3), трансформированного плазмидой pET32a:Ind3, химический лизис клеток в буфере, содержащем 6 М гуанидин-хлорид, очистку гибридного белка с помощью метало-хелатной хроматографии, расщепление бромцианом в кислой среде по остаткам метионина, разделение продуктов реакции и очистку индолицидина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ [Morin K.M., Arcidiacono S., Beckwitt R., Mello C.M. // Recombinant expression of indolicidin concatamers in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006, v.70, p.698-704]. Главным недостатком способа является низкий выход рекомбинантного пептида, составляющий 150 мкг с 1 л клеточной культуры.A known method for producing the antimicrobial peptide of indolicidin, including culturing the E. coli strain BL21 (DE3) transformed with the plasmid pET32a: Ind3, chemical lysis of cells in a buffer containing 6 M guanidine chloride, purification of the hybrid protein using metal chelate chromatography, cleavage with bromocyanine acidic medium according to methionine residues, separation of reaction products and purification of indolicidin by reverse phase HPLC [Morin KM, Arcidiacono S., Beckwitt R., Mello CM // Recombinant expression of indolicidin concatamers in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006, v. 70, p.698-704]. The main disadvantage of this method is the low yield of the recombinant peptide of 150 μg with 1 l of cell culture.
Известен наиболее близкий к заявленному способ получения антимикробного пептида аденорегулина, включающий культивирование штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/pET32a-adr, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение растворимой фракции клеточного белка с помощью центрифугирования, очистку гибридного белка с помощью металло-хелатной хроматографии, расщепление бромцианом в кислой среде по остаткам метионина, разделение продуктов реакции и окончательной очистки аденорегулина методами обращенно-фазовой и эксклюзионной ВЭЖХ [Zhou Y.X., Cao W., Luo Q.P., Ma Y.S., Wang J.Z., Wei D.Z. // Production and purification of a novel antibiotic peptide, adenoregulin, from a recombinant Escherichia coli. Biotechnology Letters, 2005, v.27(10), p.725-730]. Недостатком системы являются трудности, возникающие при хроматографической очистке целевого пептида после расщепления гибридного белка бромцианом. Исходная плазмида рЕТ32а кодирует остаток метионина в составе природной последовательности тиоредоксина А и четыре остатка метионина в линкере, отделяющем тиоредоксин А от последовательности целевого полипептида. Вследствие этого при расщеплении бромцианом гибридного белка наряду с основным продуктом образуется пять дополнительных коротких полипептидных фрагментов, затрудняющих дальнейшую очистку целевого пептида.Known closest to the claimed method for producing the antimicrobial peptide of adenoregulin, including culturing the producer strain E. coli BL21 (DE3) / pET32a-adr, destroying bacterial cells by disintegration, separating the soluble fraction of the cell protein by centrifugation, purification of the hybrid protein using metal chelate chromatography, splitting with bromine cyan in an acidic medium according to methionine residues, separation of the reaction products and final purification of adenoregulin by reverse phase and exclusion HPLC [Zhou YX, Cao W., Luo Q.P., Ma Y.S., Wang J.Z., Wei D.Z. // Production and purification of a novel antibiotic peptide, adenoregulin, from a recombinant Escherichia coli. Biotechnology Letters, 2005, v. 27 (10), p. 725-730]. The disadvantage of the system is the difficulties encountered during chromatographic purification of the target peptide after cleavage of the hybrid protein with cyanogen bromide. The original plasmid pET32a encodes a methionine residue in the natural sequence of thioredoxin A and four methionine residues in the linker that separates thioredoxin A from the sequence of the target polypeptide. As a result, when bromide is cleaved by a hybrid protein, five additional short polypeptide fragments are formed along with the main product, making it difficult to further purify the target peptide.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента антимикробных пептидов и получения антимикробного пептида ареницина.The invention solves the problem of expanding the assortment of antimicrobial peptides and obtaining the antimicrobial peptide of arenicin.
Поставленная задача решается за счет культивирования штамма-продуцента, индукции синтеза рекомбинантного белка, разрушения клеток, отделения нерастворимой фракции клеточного белка, аффинной очистки гибридного белка His8-TrxL-Ar2 с помощью металло-хелатной хроматографии, его солюбилизации и расщепления бромцианом в кислой среде по остатку метионина, разделения продуктов реакции и окончательной очистки ареницина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.The problem is solved by cultivating the producer strain, inducing the synthesis of recombinant protein, destroying cells, separating the insoluble fraction of the cell protein, affinity purification of the His8-TrxL-Ar2 fusion protein using metal chelate chromatography, solubilizing it, and splitting the residue with bromine in an acidic medium methionine, the separation of reaction products and the final purification of arenicin by reverse-phase HPLC.
Для получения гибридного белка, содержащего ареницин, используют новый штамм бактерии Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2. Данный штамм-продуцент получают путем трансформации компетентных клеток Escherichia coli штамма BL-21(DE3) плазмидой pE-His8-TrxL-Ar2, состоящей из BglII/XhoI-фрагмента ДНК, содержащего промотор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, участок связывания рибосомы и последовательность гибридного полипептида His8-TrxL-Ar2, содержащего гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин A (M37L) и ареницин, и BglII/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды рЕТ20b(+), содержащего терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, сайт инициации репликации и ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pE-His8-TrxL-Ar2 клеток Escherichia coli к ампициллину. Биосинтез продукта проводят следующим образом: клетки штамма BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 выращивают в богатой среде (например, LB) с добавлением 100-200 мкг/мл ампициллина до достижения культурой оптической плотности OD600 0,5-1,0 при температуре 37°С, ступенчато увеличивая объем культуральной жидкости путем последовательных пересевов материала, после чего индуцируют синтез белка изопропил-β-D-галактозидом в концентрации 0,1-1,0 мМ или лактозой и растят еще 5-6 часов при температуре 25-30°С. Увеличение выхода рекомбинантного белка может быть достигнуто с помощью принудительной аэрации культуральной жидкости и использования обогащенных питательных сред (например, с добавлением глюкозы).To obtain a hybrid protein containing arsenicin, a new strain of the bacterium Escherichia coli BL21 (DE3) / pE-His8-TrxL-Ar2 is used. This producer strain is obtained by transforming competent cells of Escherichia coli strain BL-21 (DE3) with the plasmid pE-His8-TrxL-Ar2, consisting of a BglII / XhoI DNA fragment containing a T7 RNA polymerase transcription promoter, a ribosome binding site and a sequence a His8-TrxL-Ar2 hybrid polypeptide containing a histidine octamer, a modified thioredoxin A (M37L) and arenicin, and a BglII / XhoI DNA fragment of plasmid pET20b (+) containing a T7-RNA polymerase transcription terminator, a replication initiation site and a β- gene lactamase determining transf resistance rmirovannyh plasmid pE-His8-TrxL-Ar2 Escherichia coli cells to ampicillin resistance. The biosynthesis of the product is carried out as follows: cells of strain BL21 (DE3) / pE-His8-TrxL-Ar2 are grown in a rich medium (for example, LB) with the addition of 100-200 μg / ml ampicillin until the culture reaches an optical density of OD 600 0.5-1 , 0 at a temperature of 37 ° C, stepwise increasing the volume of the culture fluid by successive reseeding of the material, after which protein synthesis is induced with isopropyl-β-D-galactoside at a concentration of 0.1-1.0 mM or lactose and grow for another 5-6 hours at temperature 25-30 ° С. An increase in the yield of recombinant protein can be achieved by forced aeration of the culture fluid and the use of enriched culture media (for example, with the addition of glucose).
Получение из клеток продуцента гибридного белка His8-TrxL-Ar2 включает следующие стадии: отделение бактерий от культуральной среды с помощью центрифугирования, их разрушение одним из обычно применяемых способов (ультразвуковой дезинтеграцией, химическим лизисом с использованием детергентов и хаотропных агентов), отмывку буферными растворами телец включения от водорастворимых компонентов клетки, солюбилизацию телец включения и очистку гибридного белка с помощью металло-хелатной хроматографии в денатурирующих условиях.Obtaining His8-TrxL-Ar2 fusion protein from producer cells involves the following stages: separation of bacteria from the culture medium by centrifugation, their destruction by one of the commonly used methods (ultrasonic disintegration, chemical lysis using detergents and chaotropic agents), washing with inclusion bodies buffered solutions from water-soluble cell components, solubilization of inclusion bodies and purification of the hybrid protein using metal chelate chromatography under denaturing conditions.
Тельца включения, полученные после дезинтеграции биомассы, обрабатывают по следующей схеме:Inclusion bodies obtained after biomass disintegration are processed according to the following scheme:
1. Тельца включения подвергают двукратной отмывке 50 мМ фосфатным буфером (рН 7,8) или 25 мМ трис-HCl буфером (рН 8,1).1. Inclusion bodies are washed twice with 50 mM phosphate buffer (pH 7.8) or 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.1).
2. Отмытые тельца включения растворяют в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,8) или 50 мМ трис-HCl буфере (рН 8,1), содержащем 6 М гуанидин-HCl и 10 мМ имидазол. Осадок отделяют центрифугированием.2. The washed inclusion bodies are dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.8) or 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.1) containing 6 M guanidine-HCl and 10 mM imidazole. The precipitate was separated by centrifugation.
3. Раствор, содержащий целевой гибридный белок, подвергают аффинной хроматографии на смоле с хелатированными ионами Ni2+ или Со2+. В качестве промывочного раствора используют 100 мМ фосфатный буфер (рН 7,8) или 50 мМ трисовый буфер (рН 8,1), содержащий 6 М гуанидин-HCl и 10 мМ имидазол. В качестве элюирующего раствора используют буфер, содержащий 6 М гуанидин-HCl и 0,5 М имидазол.3. A solution containing the desired fusion protein is subjected to affinity chromatography on a resin with chelated Ni 2+ or Co 2+ ions . As a washing solution, 100 mM phosphate buffer (pH 7.8) or 50 mM Tris buffer (pH 8.1) containing 6 M guanidine-HCl and 10 mM imidazole are used. As an eluting solution, a buffer containing 6 M guanidine-HCl and 0.5 M imidazole is used.
4. Фракцию элюата, содержащую гибридный белок His8-TrxL-Ar2, подвергают диализу против деионизированной воды при температуре 4°С в течение 12-18 ч. Выпавший осадок собирают и лиофильно высушивают.4. The eluate fraction containing the His8-TrxL-Ar2 fusion protein is dialyzed against deionized water at 4 ° C for 12-18 hours. The precipitate formed is collected and lyophilized.
5. Навеску очищенного His8-TrxL-Ar2 растворяют в 80% трифторуксусной кислоте, либо в 70% муравьиной кислоте, либо в 6 М гуанидине-HCl с добавлением 0.1 М HCl и добавляют равную массу бромциана. Реакционную смесь инкубируют в темноте 16-20 ч при температуре 20-25°С. Реакцию останавливают добавлением трех-пятикратного объема воды, после чего упаривают образец под вакуумом при температуре 37°С. Процедуру добавления воды и упаривания повторяют не менее трех раз.5. A portion of purified His8-TrxL-Ar2 is dissolved in 80% trifluoroacetic acid, or in 70% formic acid, or in 6 M guanidine-HCl with the addition of 0.1 M HCl and an equal mass of bromine is added. The reaction mixture is incubated in the dark for 16-20 hours at a temperature of 20-25 ° C. The reaction is stopped by adding three to five times the volume of water, after which the sample is evaporated under vacuum at a temperature of 37 ° C. The procedure for adding water and evaporation is repeated at least three times.
6. Навеску продуктов реакции растворяют в 10% ацетонитриле с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты и подвергают очистке методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте концентрации ацетонитрила. Фракцию, содержащую ареницин, лиофильно высушивают.6. A portion of the reaction products is dissolved in 10% acetonitrile with the addition of 0.1% trifluoroacetic acid and purified by reverse-phase HPLC in a concentration gradient of acetonitrile. The fraction containing arsenicin is freeze-dried.
7. При необходимости может быть проведена дополнительная очистка целевого продукта методом ВЭЖХ.7. If necessary, additional purification of the target product by HPLC can be carried out.
8. Идентичность рекомбинантного ареницина природному пептиду устанавливают методами ПААГ-электрофореза в трис-трициновой системе, MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии, секвенированием N-концевой аминокислотной последовательности по методу Эдмана, а также сравнительным тестированием антимикробной активности методом серийных разведении в жидкой питательной среде. Степень очистки ареницина определяют методами ПААГ-электрофореза в трис-трициновой системе и MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии.8. The identity of the recombinant arecinicin to the natural peptide is established by the methods of SDS-PAGE electrophoresis in the Tris-Tricin system, MALDI time-of-flight mass spectrometry, sequencing of the N-terminal amino acid sequence by the Edman method, as well as comparative testing of antimicrobial activity by serial dilution in a liquid nutrient medium. The degree of purification of arenicin is determined by the methods of PAGE-electrophoresis in Tris-tricin system and MALDI time-of-flight mass spectrometry.
Изобретение иллюстрирует пример.The invention illustrates an example.
Пример.Example.
Получение ареницина.Obtaining arenicin.
Культивирование клеток штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Аr2 проводят следующим образом.The cultivation of cells of the producer strain of Escherichia coli BL21 (DE3) / pE-His8-TrxL-Ar2 is carried out as follows.
Клетки штамма BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 выращивают в жидкой среде LB с добавлением 150 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы до достижения культурой оптической плотности OD600 1,0 при температуре 37°С. Индукцию синтеза белка проводят с помощью изопропил-β-D-галактозида в концентрации 1,0 мМ, после чего инкубируют 5 часов при температуре 30°С.Cells of strain BL21 (DE3) / pE-His8-TrxL-Ar2 are grown in LB liquid medium with the addition of 150 μg / ml ampicillin and 1% glucose until the culture reaches an optical density of OD 600 1.0 at 37 ° C. Protein synthesis is induced using isopropyl-β-D-galactoside at a concentration of 1.0 mM, after which it is incubated for 5 hours at a temperature of 30 ° C.
После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин, ресуспендируют в лизирующем буфере (100 мМ Na2HPO4/NaH2PO4 (рН 7,8), 0,5 М NaCl, 1% Triton X-100) и разрушают с помощью ультразвукового гомогенизатора. Все работы по выделению гибридного белка проводят при температуре 4°С. Нерастворимую фракцию клеточного белка (тельца включения), содержащую гибридный белок, отделяют центрифугированием. Тельца включения дважды ресуспендируют в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,8) и центрифугируют.After fermentation, the cells of the hybrid protein producer (biomass) are separated by centrifugation at 4000 g for 10 min, resuspended in lysis buffer (100 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 (pH 7.8), 0.5 M NaCl, 1 % Triton X-100) and destroyed using an ultrasonic homogenizer. All work on the isolation of the hybrid protein is carried out at a temperature of 4 ° C. The insoluble fraction of the cell protein (inclusion body) containing the fusion protein is separated by centrifugation. Inclusion bodies are resuspended twice in 50 mM phosphate buffer (pH 7.8) and centrifuged.
Отмытые тельца включения растворяют в концентрации 20 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,8), содержащем 6 М гуанидин-HCl и 10 мМ имидазол. Осадок отделяют центрифугированием. Супернатант наносят на предварительно уравновешенную колонку с Ni-NTA агарозой (Qiagen) из расчета 1 г суммарного белка на 100 мл смолы. Колонку промывают 100 мМ фосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 6 М гуанидин-HCl и 10 мМ имидазол. Фракцию, обогащенную рекомбинантным белком, элюируют 100 мМ фосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 6 М гуанидин-HCl и 0,5 мМ имидазол, и подвергают диализу против 100 объемов деионизированной воды при температуре 4°С в течение 18 ч через диализную мембрану, удерживающую молекулы с массой более 1 кДа. Выпавший осадок собирают и лиофильно высушивают.The washed inclusion bodies are dissolved at a concentration of 20 mg / ml in 100 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 6 M guanidine-HCl and 10 mM imidazole. The precipitate was separated by centrifugation. The supernatant is applied to a pre-balanced column with Ni-NTA agarose (Qiagen) at the rate of 1 g of total protein per 100 ml of resin. The column is washed with 100 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 6 M guanidine-HCl and 10 mM imidazole. The recombinant protein enriched fraction was eluted with 100 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 6 M guanidine-HCl and 0.5 mM imidazole and dialyzed against 100 volumes of deionized water at 4 ° C. for 18 hours through dialysis membrane retaining molecules with a mass of more than 1 kDa. The precipitate is collected and freeze-dried.
Анализ фракций, а также степень чистоты гибридного белка на разных стадиях выделения определяют с помощью ПААГ-электрофореза в трис-трициновой буферной системе и методом MALDI-времяпролетной масс-спектрометрии.The analysis of fractions, as well as the degree of purity of the hybrid protein at different stages of isolation, is determined by means of PAGE electrophoresis in a Tris-Tricin buffer system and by MALDI time-of-flight mass spectrometry.
Навеску очищенного гибридного белка растворяют в 80% трифторуксусной кислоте в концентрации 2%, добавляют равную массу бромциана (1 г бромциана на 1 г белка) и выдерживают при температуре 25°С в защищенном от света месте при постоянном встряхивании в течение 20 ч. Реакцию останавливают добавлением пятикратного объема деионизированной воды, после чего упаривают образец при 37°С. Процедуру добавления воды и упаривания повторяют трижды.A portion of the purified fusion protein is dissolved in 80% trifluoroacetic acid at a concentration of 2%, an equal mass of bromine cyan (1 g bromine cyan per 1 g protein) is added and kept at 25 ° C in a dark place with constant shaking for 20 hours. The reaction is stopped adding five times the volume of deionized water, after which the sample is evaporated at 37 ° C. The procedure for adding water and evaporation is repeated three times.
Навеску продуктов реакции растворяют в концентрации 10 мг/мл в 10% ацетонитриле с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты. В данных условиях полностью растворяются как искомый пептид, так и нерасщепленный гибридный белок и белок-носитель. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Разделение продуктов реакции расщепления и очистку ареницина проводят с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на препаративных колонках в системе, состоящей из буфера А (5% ацетонитрил, 0,1% ТФУ) и буфера В (80% ацетонитрил, 0,1% ТФУ). Ареницин элюируют линейным градиентом буфера В от 10 до 40%. Детектирование ведут при длине волны 214 нм. Фракцию элюата, соответствующую ареницину, собирают и лиофильно упаривают. Выход ареницина с чистотой не менее 99%, полученного заявленным способом (без использования ферментера), составляет не менее 5 мг/л культуры.A portion of the reaction products is dissolved in a concentration of 10 mg / ml in 10% acetonitrile with the addition of 0.1% trifluoroacetic acid. Under these conditions, both the desired peptide and the unsplit fusion protein and the carrier protein are completely dissolved. Insoluble precipitate was separated by centrifugation and discarded. Separation of the cleavage reaction products and purification of arenitsin is carried out using reverse phase HPLC on preparative columns in a system consisting of buffer A (5% acetonitrile, 0.1% TFA) and buffer B (80% acetonitrile, 0.1% TFA). Arenicin is eluted with a linear gradient of buffer B from 10 to 40%. Detection is carried out at a wavelength of 214 nm. The eluate fraction corresponding to arsenicin was collected and evaporated lyophilically. The yield of arenicin with a purity of not less than 99% obtained by the claimed method (without using a fermenter) is at least 5 mg / l of culture.
Аминокислотная последовательность полученного пептида идентична природному ареницину (Arg1-Trp2-Cys3-Val4-Tyr5-Ala6-Tyr7-Val8-Arg9-Ile10-Arg11-Gly12-Val13-Leu14-Val15-Arg16-Tyr17-Arg18-Arg19-Cys20-Trp21). Для определения N-концевой аминокислотной последовательности ареницина применяют автоматическое микросеквенирование на приборе Precise 491 cLC Protein Sequencing System (Applied Biosystems, США). Идентификацию фенилтиогидантоин-производных аминокислот проводят на анализаторе 120А РТН Analyzer (Applied Biosystems, США). В основе методики автоматического определения аминокислотной последовательности пептидов и белков лежит метод химической деградации полипептидной цепи по методу Эдмана, позволяющему последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенилтиогидантоинов и идентифицировать отщепленные производные аминокислот методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате автоматического микросеквенирования установлена полная идентичность аминокислотных последовательностей генно-инженерного и природного ареницина.The amino acid sequence of the obtained peptide is identical to natural arsenicin (Arg 1 -Trp 2 -Cys 3 -Val 4 -Tyr 5 -Ala 6 -Tyr 7 -Val 8 -Arg 9 -Ile 10 -Arg 11 -Gly 12 -Val 13 -Leu 14 - Val 15 -Arg 16 -Tyr 17 -Arg 18 -Arg 19 -Cys 20 -Trp 21 ). Automatic microsequencing on a Precise 491 cLC Protein Sequencing System (Applied Biosystems, USA) is used to determine the N-terminal amino acid sequence of arenicin. The identification of phenylthiohydantoin derivatives of amino acids is carried out on a 120A PTH Analyzer (Applied Biosystems, USA). The method for the automatic determination of the amino acid sequence of peptides and proteins is based on the method of chemical degradation of the polypeptide chain according to the Edman method, which allows sequentially cleaving N-terminal amino acid residues in the form of phenylthiohydantoins and identifying cleaved amino acid derivatives by reverse-phase high-performance liquid chromatography. As a result of automatic microsequencing, the complete identity of the amino acid sequences of genetic engineering and natural arenicin was established.
Для определения молекулярной массы ареницина используют MALDI (matrix-assisted lazer desorption ionization) масс-спектрометрический анализ на приборе VISION 2000 (ThermoBioAnalysis, OK). В качестве матрицы используют 0,15 М 2,5-дигидроксибензойную кислоту в смеси, содержащей 25% метанол и 0,1% трифторуксусную кислоту. Образец облучают УФ-лазером с длиной волны 337 нм и максимальной энергией 250 мкДж в импульсном режиме с частотой 3 нс. При масс-спектрометрическом исследовании ареницина (мощность лазера - 45%, число лазерных ударов - 69) получен пик с m/z 2772 (см. чертеж), соответствующий молекулярному иону природного ареницина (расчетная молекулярная масса составляет 2772,35 Да).MALDI (matrix-assisted lazer desorption ionization) mass spectrometric analysis using a VISION 2000 instrument (ThermoBioAnalysis, OK) is used to determine the molecular weight of arenicin. As a matrix using 0.15 M 2,5-dihydroxybenzoic acid in a mixture containing 25% methanol and 0.1% trifluoroacetic acid. The sample is irradiated with a UV laser with a wavelength of 337 nm and a maximum energy of 250 μJ in a pulsed mode with a frequency of 3 ns. In a mass spectrometric study of arenicin (laser power - 45%, the number of laser strokes - 69), a peak was obtained with m / z 2772 (see drawing), corresponding to the molecular ion of natural arsenicin (calculated molecular weight is 2772.35 Da).
Антимикробную активность ареницина определяют методом радиальной диффузии пептидов в агарозном геле с тест-культурой микроорганизма, позволяющим оценивать микробицидную активность, расходуя минимальное количество препарата. Для определения антимикробной активности отдельных фракций полипептидов используют культуры следующих микроорганизмов: Escherichia coli, штамм ML-35p (грамотрицательная бактерия); Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамположительная бактерия); Candida albicans (гриб класса аскомицетов). Антимикробное действие выделенных пептидов фиксируют через 24 часа по наличию зон ингибирования роста тест-культуры (таблица 1). Показано, что генно-инженерный и природный ареницины в количестве ~1 мкг проявляют микробицидную активность в отношении всех трех микробов. Действие обоих пептидов в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также их противогрибковая активность практически одинаковы. Так, например, минимальная ингибирующая концентрация как природного, так и рекомбинантного пептида в отношении E.coli составляет 25 мкг/мл.The antimicrobial activity of arenicin is determined by the method of radial diffusion of peptides in an agarose gel with a test culture of the microorganism, which allows to evaluate the microbicidal activity, spending the minimum amount of the drug. To determine the antimicrobial activity of individual fractions of the polypeptides, cultures of the following microorganisms are used: Escherichia coli, strain ML-35p (gram-negative bacterium); Listeria monocytogenes, strain EGD (gram-positive bacterium); Candida albicans (Ascomycetes class mushroom). The antimicrobial effect of the selected peptides is fixed after 24 hours by the presence of zones of growth inhibition of the test culture (table 1). It was shown that genetically engineered and natural arenicins in the amount of ~ 1 μg exhibit microbicidal activity against all three microbes. The action of both peptides against gram-positive and gram-negative bacteria, as well as their antifungal activity, are almost identical. Thus, for example, the minimum inhibitory concentration of both natural and recombinant peptides with respect to E. coli is 25 μg / ml.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006121111/13A RU2316595C1 (en) | 2006-06-16 | 2006-06-16 | Method for preparing antimicrobial peptide arenicin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006121111/13A RU2316595C1 (en) | 2006-06-16 | 2006-06-16 | Method for preparing antimicrobial peptide arenicin |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2316595C1 true RU2316595C1 (en) | 2008-02-10 |
Family
ID=39266253
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006121111/13A RU2316595C1 (en) | 2006-06-16 | 2006-06-16 | Method for preparing antimicrobial peptide arenicin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2316595C1 (en) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7745576B2 (en) * | 2005-08-26 | 2010-06-29 | Novozymes Adenium Biotech A/S | Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same |
RU2559537C2 (en) * | 2009-07-03 | 2015-08-10 | Лос-Анджелес Биомедикал Ресерч Институт Эт Харбор-Укла Медикал Центер | Hyr1 as target for active and passive immunisation against candida |
RU2645070C2 (en) * | 2016-06-06 | 2018-02-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук | Method for antimicrobial peptides production from domestic chicken platelets |
RU2710377C1 (en) * | 2019-02-20 | 2019-12-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе" | Method of producing an antifibic antibacterial emericillipsin a |
-
2006
- 2006-06-16 RU RU2006121111/13A patent/RU2316595C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
. * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7745576B2 (en) * | 2005-08-26 | 2010-06-29 | Novozymes Adenium Biotech A/S | Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same |
RU2559537C2 (en) * | 2009-07-03 | 2015-08-10 | Лос-Анджелес Биомедикал Ресерч Институт Эт Харбор-Укла Медикал Центер | Hyr1 as target for active and passive immunisation against candida |
RU2645070C2 (en) * | 2016-06-06 | 2018-02-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук | Method for antimicrobial peptides production from domestic chicken platelets |
RU2710377C1 (en) * | 2019-02-20 | 2019-12-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе" | Method of producing an antifibic antibacterial emericillipsin a |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5032574A (en) | Novel antimicrobial peptide | |
US7482328B2 (en) | Antimicrobial polypeptide and utilization thereof | |
KR100356140B1 (en) | Modified Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor and Process for Producing Same | |
CA1340841C (en) | Cecropin-like polypeptides with activity against gram-positive and gram-negative bacteria | |
CN113980112A (en) | Expression vector and expression product of king cobra antimicrobial peptide OH-CATH30 and construction and preparation method thereof | |
RU2316595C1 (en) | Method for preparing antimicrobial peptide arenicin | |
Zhou et al. | TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli | |
US20030219854A1 (en) | Methods for producing modified anti-infective peptides | |
US8003348B2 (en) | Method for the mass expression of an antimicrobial peptide by co-expression of a basic antimicrobial peptide and an acidic peptide using a translational coupling system | |
RU2580031C2 (en) | PLASMID VECTOR pET-His8-TrxL-Acip1 STRAIN OF BACTERIA Escherichia coli BL21(DE3)/pET-His8-TrxL-Acip1 FOR EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE ACIPENSINA-1 AND METHOD OF PRODUCING SAID PEPTIDE | |
RU2316590C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pE-His8-TrxL-Ar2 ENCODING FUSION PROTEIN COMPRISING ANTIMICROBIAL SEA ANNELID WORM Arenicola marina PEPTIDE ARENICIN AND STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 AS PRODUCER OF ARENICIN-CONTAINING FUSION PROTEIN | |
CN108864273B (en) | Simulated human-derived antibacterial peptide and preparation method thereof | |
RU2618850C2 (en) | pET-mChBac75Na PLASMID VECTOR, ESCHRICHIA COLI BL21(DE3/ pET-mChBac75Na BACTERIA STRAINS FOR CHBAC7NA MINIBACTENECIN ANTIMICROBIAL PEPTIDE EXPRESSION AND METHODS FOR PRODUCTION OF THESE PEPTIDES | |
RU2347811C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pET-KSI-Buf2, CODING HYBRID PROTEIN, CONTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE BUFORIN-2, STRAIN OF Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2-PRODUCER OF INDICATED PROTEIN AND METHOD OF OBTAINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE BUFORIN-2 | |
RU2415940C1 (en) | PLASMID VECTOR pE-Lc-LTP, Escherichia coli BACTERIUM STRAIN FOR EXPRESSION OF LIPID-TRANSPORTING LENTIL PROTEINS Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PROTEINS | |
RU2456345C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pЕ-Trx-Lc-def, Escherichia coli STRAIN FOR EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE OF LENTIL DEFENSIN Lens culinaris AND METHOD FOR PRODUCING SAID PEPTIDE | |
RU2698037C1 (en) | METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT ANTIMICROBIAL PEPTIDE UBI18-35, RECOMBINANT PLASMID DNA pET31b-2xUBI18-35 AND PRODUCER-PRODUCER OF ESCHERICHIA COLI BL21 ROSETTA DE3 pLusS/pET31b-2HUBI18-35 ANTIMICROBIAL PEPTIDE UBI18-35 | |
US5210027A (en) | DNA encoding novel antimicrobial polypeptide and methods for obtaining such polypeptide | |
CN112778424B (en) | Chimeric peptide R7 and application thereof | |
Bolosov et al. | Structural and Functional Characteristics of the Proline-Rich Antimicrobial Peptide Minibactenecin from Leukocytes of Domestic Goat Capra Hircus | |
CN115850427B (en) | Conus double-alpha helix antibacterial peptide, preparation method and application thereof | |
RU2412999C1 (en) | PLASMID VECTOR pE-Trx-Aur, STRAIN ESCHERICHIA COLI FOR EXPRESSION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE AURELIN AND METHOD OF SAID PEPTIDE OBTAINING | |
KR20120062504A (en) | Multimeric antimicrobial peptide expressed on cell surface | |
RU2694044C2 (en) | Genetic construct based on two inducible expression vectors for expression of thiazole/oxazole modified peptide in cells of bacteria e. coli; method for producing recombinant strain of bacteria e. coli and method for producing modified peptide based thereof | |
Dolashki et al. | Antimicrobial compounds from the mucus of garden snail Cornu aspersa |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200617 |