RU2312135C2 - Strain of bacterium paenibacillus campinasensis as producer of cyclodextrin glucanotransferase - Google Patents
Strain of bacterium paenibacillus campinasensis as producer of cyclodextrin glucanotransferase Download PDFInfo
- Publication number
- RU2312135C2 RU2312135C2 RU2005141624/13A RU2005141624A RU2312135C2 RU 2312135 C2 RU2312135 C2 RU 2312135C2 RU 2005141624/13 A RU2005141624/13 A RU 2005141624/13A RU 2005141624 A RU2005141624 A RU 2005141624A RU 2312135 C2 RU2312135 C2 RU 2312135C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- beta
- cyclodextrin
- strain
- cgtase
- starch
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения препаратов циклодекстринглюканотрансферазы (ЦГТаз К.Ф.2.4.1.19), фермента для получения циклодекстринов из крахмала.The invention relates to biotechnology, and in particular to a technology for the production of cyclodextringlucanotransferase preparations (TSGTaz K.F.2.4.1.19), an enzyme for producing cyclodextrins from starch.
В частности, изобретение относится к технологии бета-циклодекстринглюканотрансферазы (бета-ЦГТазы), трансформирующей крахмал преимущественно в бета-циклодекстрин. Этот циклический олигосахарид наиболее востребован в пищевой, фармакологической, текстильной промышленности, косметике и др. [1-3]In particular, the invention relates to the technology of beta-cyclodextringlucanotransferase (beta-CGTase), transforming starch mainly into beta-cyclodextrin. This cyclic oligosaccharide is most in demand in the food, pharmacological, textile industries, cosmetics, etc. [1-3]
ЦГТазы катализируют образование одновременно трех макроциклических олигосахаридов (или циклодекстринов, отличающихся своими молекулярными размерами и свойствами. Бета-циклодекстрин состоит из семи остатков альфа-D-глюкозы, в то время как альфа- и гамма- макроциклические гомологи имеют в кольцах своих молекул шесть и восемь глюкопиранозных звеньев. Из-за универсальной способности образовывать комплексы включения с целым спектром органических и неорганических соединений бета-циклодекстрин востребован на рынке и промышленно выпускается в больших объемах [4].CGTases catalyze the formation of three macrocyclic oligosaccharides (or cyclodextrins, differing in their molecular sizes and properties. Beta cyclodextrin consists of seven alpha-D-glucose residues, while alpha and gamma macrocyclic homologs have six and eight in their molecule rings glucopyranose units Due to the universal ability to form inclusion complexes with a whole range of organic and inorganic compounds, beta-cyclodextrin is in demand on the market and is commercially available in large volumes [4].
Сырьем для получения циклодекстринов является крахмал, а в результате реакции образуется смесь альфа-, бета- и гамма-циклодекстринов, а также смесь линейных и разветвленных декстринов различного молекулярного размера. Выход и соотношение количества синтезированных индивидуальных циклических олигосахаридов зависит от каталитических свойств использованной ЦГТазы.The raw material for the production of cyclodextrins is starch, and as a result of the reaction, a mixture of alpha, beta and gamma cyclodextrins is formed, as well as a mixture of linear and branched dextrins of various molecular sizes. The yield and ratio of the amount of synthesized individual cyclic oligosaccharides depends on the catalytic properties of the used CGTase.
Имеющаяся информация о продуцентах и каталитических свойствах ЦГТаз и, в частности бета-ЦГТаз, не позволяет провести их объективное сравнение потому, что эти анализы были выполнены в неидентичных условиях и разных лабораториях. Между тем, характер и глубина реакции ферментативной трансформации крахмала в циклодекстрины существенно зависят от многих составляющих: природы и источника крахмала, соотношения в нем амилопектина и амилозы, режима предобработки крахмала перед ферментативной реакцией, от рН среды, температуры, дозировок фермента и др. Объективная сравнительная информация о каталитических свойств различных препаратов ЦГТаз также не может быть получена из-за ограниченной доступности как образцов ферментов, так и их продуцентов, отсутствия методических стандартов при измерении циклизующей активности. Тем не менее, среди главных критериев, определяющих эффективность продуцентов бета-ЦГТаз, находятся: селективность ЦГТазы в отношении синтеза бета-ЦД, общий выход бета-ЦД, их термостабильность.The available information on the producers and catalytic properties of TsGTaz and, in particular, beta-TsGTaz, does not allow for their objective comparison because these analyzes were performed under non-identical conditions and in different laboratories. Meanwhile, the nature and depth of the reaction of the enzymatic transformation of starch into cyclodextrins significantly depends on many components: the nature and source of starch, the ratio of amylopectin and amylose in it, the mode of pretreatment of starch before the enzymatic reaction, pH, temperature, dosages of the enzyme, etc. Objective comparative information on the catalytic properties of various TSGTaz preparations can also not be obtained due to the limited availability of both enzyme samples and their producers, the lack of methodological x standards when measuring cyclizing activity. Nevertheless, among the main criteria that determine the effectiveness of beta-CGTase producers are: selectivity of CGTase in relation to the synthesis of beta-CD, the overall yield of beta-CD, and their thermal stability.
Известны штаммы бактерий вида Paenibacillus macerans (устаревшее название Bacillus macerans) и Bacillus sterothermophilus, образующие ЦГТазы, катализирующие образование, преимущественно, альфа-циклодекстрина [3]. В процессах получения бета-циклодекстринов эти ферменты могут использоваться лишь в технологии с использованием органических сольвентов, зачастую весьма токсичных, таких, например, как толуол [3, 5]. Бета-циклодекстрин, полученный в контакте с толуолом, не отвечает современным требованиям экологической безопасности конечного продукта.Bacterial strains of the species Paenibacillus macerans (obsolete name Bacillus macerans) and Bacillus sterothermophilus are known that form CGTases that catalyze the formation of, mainly, alpha-cyclodextrin [3]. In the processes of obtaining beta-cyclodextrins, these enzymes can only be used in technology using organic solvents, often very toxic, such as, for example, toluene [3, 5]. Beta-cyclodextrin obtained in contact with toluene does not meet modern environmental safety requirements of the final product.
Известны штаммы Bacillus sp., Bacillus circulans и Bacillus alkalophilus, [3, 5, 6], для которых характерно образование бета-специфичных ЦГТаз, катализирующих главным образом синтез бета-циклодекстрина в сумме трех макроциклических олигосахаридов. Бета-ЦГТазы также отличаются более глубокой степенью (по сравнению с ЦГТазами Paenibacillus macerans) транс-трансформации крахмала в циклические продукты. Названные культуры как продуценты ЦГТ-аз приемлемы для процессов получения бета-циклодекстрина по бессольвентной технологии.Known strains of Bacillus sp., Bacillus circulans and Bacillus alkalophilus, [3, 5, 6], which are characterized by the formation of beta-specific TSHTaz, catalyzing mainly the synthesis of beta-cyclodextrin in the amount of three macrocyclic oligosaccharides. Beta-TSGTazy also differ in a deeper degree (compared with the TSTazy Paenibacillus macerans) trans-transformation of starch into cyclic products. The named cultures as producers of TSHT-az are acceptable for the processes of obtaining beta-cyclodextrin by the solventless technology.
Наиболее близким аналогом по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Bacillus sp.(депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКМ Б-1793Д), образующий внеклеточную бета-ЦГТазу, основным продуктом которой при воздействии на крахмал является бета-циклодекстрин [7].The closest analogue in terms of the set of essential features and the achieved result is the Bacillus sp. Strain (deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms under the number VKM B-1793D), which forms extracellular beta-CGTase, the main product of which when exposed to starch is beta-cyclodextrin [7] .
Недостатком ЦГТазы, продуцируемой культурой, является ее сравнительно низкая термостабильность.The disadvantage of CGTase produced by the culture is its relatively low thermal stability.
Другим недостатком бета-ЦГТазы штамма Bacillus sp ВКМ Б-1793Д является то, что доля бета-циклодектрина в сумме других циклических олигосахаридов непрерывно меняется процессе ферментативной реакции. Выраженное непостоянство в соотношении между циклодекстринами в конверсионной смеси приводит к технологической нестабильности на стадии выделения и очистки конечного продукта - кристаллического бета-циклодекстрина.Another disadvantage of the beta-CGTase strain of Bacillus sp VKM B-1793D is that the proportion of beta-cyclodextrin in the sum of other cyclic oligosaccharides continuously changes during the enzymatic reaction. The pronounced inconsistency in the ratio between cyclodextrins in the conversion mixture leads to technological instability at the stage of isolation and purification of the final product - crystalline beta-cyclodextrin.
Задачей, на решение которой было направлено заявляемое изобретение, являлся поиск природного штамма, обеспечивающего синтез внеклеточной бета-ЦГТАзы, обладающей достаточной термостабильностью, катализирующий реакцию трансформации крахмала в бета-ЦД при относительном постоянстве доли этого продукта в сумме других циклических декстринов на разных стадиях реакции.The task to which the claimed invention was directed was to search for a natural strain that provides the synthesis of extracellular beta-CGTA, which has sufficient thermal stability, catalyzes the transformation of starch into beta-CD with a relatively constant proportion of this product in the sum of other cyclic dextrins at different stages of the reaction.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обнаружении культуры микроорганизмов, обладающих способностью к образованию ЦГТазы, пригодной для синтеза бета-циклодекстрина при температуре не менее 55°С и катализирующей реакцию трансформации крахмала до получения конверсионной смеси при относительном постоянстве доли бета-ЦД.The technical result that can be obtained by carrying out the invention is to detect a culture of microorganisms with the ability to form CGTase, suitable for the synthesis of beta-cyclodextrin at a temperature of at least 55 ° C and catalyzing the reaction of transformation of starch to obtain a conversion mixture with a relative constancy of the proportion of beta -CD.
Сущность объекта изобретения - штамм Paenibacillus campinasensis ИБ-10155.The essence of the invention is a strain of Paenibacillus campinasensis IB-10155.
Новый штамм ИБ-10155 выделен из образца почвы, отобранного в Кармаскалинском районе (д.Старо-Мусино) Республики Башкортостан, путем микроаэрофильной накопительной культуры на элективной питательной среде, содержавшей минеральные буферные компоненты и циклодекстрин в качестве единственного источника углерода и энергии.The new IB-10155 strain was isolated from a soil sample taken in the Karmaskalinsky district (village of Staro-Musino) of the Republic of Bashkortostan by a microaerophilic accumulative culture on an elective nutrient medium containing mineral buffer components and cyclodextrin as the sole source of carbon and energy.
Морфологические признаки штамма. Клетки палочковидные, размером 0,3-0,6·2-3,5 мкм через 24 ч инкубации при 37°С подвижные, грамвариабельные. Образуют эндоспоры. Спорообразование терминальное и субтерминальное, споры эллиптические, спорангий раздувающий.Morphological features of the strain. The cells are rod-shaped, 0.3-0.6 · 2-3.5 μm in size, after 24 hours of incubation at 37 ° C, mobile, gram-variable. Form endospores. Spore formation is terminal and subterminal, spores are elliptical, swelling sporangium.
Штамм при росте на мясопептонном агаре (МПА) через сутки при 37°С образует плоские полупрозрачные колонии размером в диаметре 3-5 мм с ровным краем и гладкой поверхностью, с консистенцией сливочного масла. На влажном картофельно-глюкозном агаре при упомянутых выше условиях штамм формирует плоские, неправильной формы и размером 5-10 мм, прозрачные, беловатого цвета мигрирующие колонии, большинство из которых обладает нечетко оформленным центром с радиально мигрирующими микроколониями. Описанный характер роста колоний нарушается при использовании подсушенного агара или при температуре выше 45°С. В жидком мясопептонном бульоне культура образует слизь. Как в жидкой, так и на плотной среде культура не образует пигментов.The strain during growth on meat and peptone agar (MPA) every other day at 37 ° C forms flat translucent colonies with a diameter of 3-5 mm with a smooth edge and smooth surface, with the consistency of butter. On wet potato-glucose agar under the conditions mentioned above, the strain forms flat, irregular in shape and 5-10 mm in size, transparent, whitish-colored migrating colonies, most of which have a fuzzy center with radially migrating microcolonies. The described nature of the growth of the colonies is violated when using dried agar or at a temperature above 45 ° C. In liquid meat and peptone broth, the culture forms mucus. Both in a liquid and in a dense medium, the culture does not form pigments.
Биохимические признаки штаммаBiochemical characteristics of the strain
Аэроб, но способен к аноксическому росту в присутствии нитратов.Aerob, but capable of anoxic growth in the presence of nitrates.
Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) отрицательная, рН в бульоне Фогес-Проскауэра после роста <6 (5,95).The Voges-Proskauer reaction (formation of acetylmethylcarbinol) is negative, the pH in the Voges-Proskauer broth after growth <6 (5.95).
Реакция на каталазу суточной культуры положительная.The response to catalase daily culture is positive.
Штамм образует кислоту (но не газ) из глюкозы, ксилозы, арабинозы и маннита. Способен к сбраживанию этих сахаров при посеве уколом в столбике агара.The strain forms acid (but not gas) from glucose, xylose, arabinose and mannitol. It is capable of fermenting these sugars when inoculated with an injection in an agar column.
Гидролизует (вызывает деполимеризацию) крахмал, казеин и слабо желатин.Hydrolyzes (causes depolymerization) starch, casein and weakly gelatin.
Не утилизирует цитрат, тирозин и фенилаланин.Does not utilize citrate, tyrosine, and phenylalanine.
Мочевину не разлагает, индол не образует. Восстанавливает нитраты до нитритов.Urea does not decompose, indole does not form. Restores nitrates to nitrites.
Штамм способен к росту в питательном бульоне с 7% NaCl. Хорошо растет в интервале рН 7,4-10,0 с оптимумом 9-9,5.The strain is capable of growth in a nutrient broth with 7% NaCl. It grows well in the pH range of 7.4-10.0 with an optimum of 9-9.5.
Температурный интервал для роста 20-46°С с оптимумом 38-40°С.The temperature range for growth is 20-46 ° C with an optimum of 38-40 ° C.
Штамм может храниться без потери полезных свойств при температуре 5-10°С на картофельно-глюкозном (или картофельном) агаре не менее 6 месяцев с обязательным пересевом не реже 1 раза в 3 месяца.The strain can be stored without loss of useful properties at a temperature of 5-10 ° C on potato-glucose (or potato) agar for at least 6 months with mandatory reseeding at least 1 time in 3 months.
Филогенетические характеристики штамма.Phylogenetic characteristics of the strain.
Сравнение последовательности 1484 нуклеотидов участка гена, кодирующего 16S рРНК, штамма ИБ-10155 выявило 99,7% сходство с участком аналогичной последовательности (номер последовательности в Генбанке AF021924), обнаруженной ранее у типового штамма Paenibacillus campinasensis, депонированного в Корейской коллекции типовых культур КСТС под номером 0364BPT.Comparison of the 1484 nucleotide sequence of the portion of the gene encoding 16S rRNA of IB-10155 strain revealed a 99.7% similarity to the portion of the same sequence (sequence number in Genebank AF021924), previously found in the type strain Paenibacillus campinasensis, deposited in the Korean collection of type CCST cultures under number 0364BP T.
На основании изучения совокупности морфологических, биохимических и филогенетических характеристик описываемой культуры новый штамм, продуцирующий бета-ЦГТазу, был идентифицирован как Paenibacillus campinasensis ИБ-10155.Based on the study of the combination of morphological, biochemical and phylogenetic characteristics of the described culture, a new strain producing beta-CGTase was identified as Paenibacillus campinasensis IB-10155.
Для роста культуры и биосинтеза бета-циклодекстринглюканотрансферазы источником углерода могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, кукурузная и другая зерновая мука, отходы производства кукурузы, картофель, или же их экстракты. Источниками азота могут служить пептон, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, дрожжевые клетки, аммонийный азот. В качестве минеральных добавок может использоваться двузамещенный фосфат калия, сода, карбонат кальция.For the growth of culture and the biosynthesis of beta-cyclodextrin-glucanotransferase, starch, hydrolyzed starch, corn and other grain flour, corn wastes, potatoes, or their extracts can serve as a carbon source. Sources of nitrogen include peptone, yeast extract, corn extract, yeast cells, ammonia nitrogen. As mineral additives can be used disubstituted potassium phosphate, soda, calcium carbonate.
Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в ферментере или колбах при температуре 40°С в течение 64-72 часов, рН среды 8-9,5. В процессе культивирования осуществляется контроль за активностью бета-ЦГТазы в культуральной жидкости.The cultivation of the strain is carried out under aerobic conditions in a fermenter or flasks at a temperature of 40 ° C for 64-72 hours, the pH of the medium is 8-9.5. In the process of cultivation, the activity of beta-CGTase in the culture fluid is monitored.
Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.The possibility of using the invention is illustrated by examples, which do not limit the scope and essence of the claims associated with them.
Пример 1. Иллюстрируется возможность получения жидкого ферментного препарата бета-ЦГТазы путем культивирования патентуемого штамма в колбах на качалках с последующим сгущением ферментационной жидкости на модуле ультрафильтрации.Example 1. Illustrates the possibility of obtaining a liquid enzyme preparation of beta-CGTase by cultivating the patented strain in flasks on a rocking chair, followed by thickening of the fermentation liquid on the ultrafiltration module.
Посевной материал получают выращиванием штамма на твердой питательной среде состава: крахмал растворимый 1%; пептон 0,4%, дрожжевой экстракт 0,5%, фосфат калия двузамещенный 0,2, карбонат натрия 0,3% агар 1,6%, рН среды 8,6-9,0. Колбы с жидкой средой того же состава, но не содержащей агара, инокулируют биомассой отдельных колоний. Культивирование проводят в 250 мл колбах, содержащих 60 мл стерильной среды, на качалке с 240 об/мин при 40°С в течение 64-72 часов.Inoculum is obtained by growing the strain on a solid nutrient medium composition: soluble starch 1%; peptone 0.4%, yeast extract 0.5%, potassium phosphate disubstituted 0.2, sodium carbonate 0.3% agar 1.6%, pH 8.6-9.0. Flasks with a liquid medium of the same composition but not containing agar were inoculated with the biomass of individual colonies. Cultivation is carried out in 250 ml flasks containing 60 ml of sterile medium, on a shaker with 240 rpm at 40 ° C for 64-72 hours.
Активность бета-ЦГТазы в культуральной жидкости и количество единиц фермента при дозировании определяют по способности исследуемого препарата катализировать образование бета-циклодекстрина из 2% раствора крахмала. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при 50°С катализирует образование 1 мкМ бета-ЦД из 2% картофельного крахмала. Ферментативную реакцию осуществляют смешиванием двух объемов 3%-го свежеприготовленного растворимого картофельного крахмала в 0,1 М ацетатном буфере при рН 5,7 с одним объемом раствора фермента (КЖ), разбавленным ацетатным буфером в 50-400 раз. Пробирку с реакционной смесью термостатируют в течение 60 минут при 50°С в твердотельном термостате. Порцию реакционной смеси в объеме 500 мкл добавляют к 3000 мкл измерительного раствора, приготовленного на основе 0,1 М углекислого калия и 0,4% спиртового фенолфталеина. Полученный раствор перемешивают и определяют поглощение полученной смеси D1 при 553 нм в стеклянной кювете с длиной оптического пути 1 см. Концентрацию фенолфталеина в измерительном растворе подбирают таким образом, чтобы в момент определения активности оптическая плотность этой жидкости составляла величину E553=1,00±0,1. Контролем служит проба смеси фермента с крахмалом, идентичная той, что была использована в опыте, но не прошедшая 1 часовую термическую обработку при 50°С. Порцию жидкости контрольного образца смешивают с измерительным раствором, аналогично тому, как это было сделано с реакционной смесью, после чего проводят измерение оптической плотности полученной контрольной смеси D2 при 553 нм. Активность фермента определяют по формуле (I):The activity of beta-CGTase in the culture fluid and the number of enzyme units during dosing are determined by the ability of the test drug to catalyze the formation of beta-cyclodextrin from a 2% starch solution. The unit of activity is taken to be such an amount of enzyme that within 1 minute at 50 ° C catalyzes the formation of 1 μM beta-CD from 2% potato starch. The enzymatic reaction is carried out by mixing two volumes of 3% freshly prepared soluble potato starch in 0.1 M acetate buffer at pH 5.7 with one volume of the enzyme solution (QL) diluted with acetate buffer 50-400 times. The tube with the reaction mixture is thermostated for 60 minutes at 50 ° C in a solid state thermostat. A portion of the reaction mixture in a volume of 500 μl is added to 3000 μl of a measuring solution prepared on the basis of 0.1 M potassium carbonate and 0.4% alcohol phenolphthalein. The resulting solution was mixed and the absorption of the resulting mixture D 1 was determined at 553 nm in a glass cuvette with an optical path length of 1 cm. The concentration of phenolphthalein in the measuring solution was selected so that at the time of determining the activity, the optical density of this liquid was E 553 = 1.00 ± 0.1. The control is a sample of a mixture of the enzyme with starch, identical to that which was used in the experiment, but which did not pass 1 hour heat treatment at 50 ° C. A portion of the liquid of the control sample is mixed with the measuring solution, similar to how it was done with the reaction mixture, after which the optical density of the obtained control mixture D 2 is measured at 553 nm. The enzyme activity is determined by the formula (I):
где ΔD553=(D2-D1) - разность оптической плотности между измеряемым и контрольным растворами;where ΔD 553 = (D 2 -D 1 ) is the difference in optical density between the measured and control solutions;
N - степень разбавления фермента.N is the degree of dilution of the enzyme.
Средние величины бета-ЦГТазной активности патентуемого штамма и других циклодекстриногенных микроорганизмов, использованных с целью сравнения, измеренные в культуральной жидкости через 70 часов роста, даны в таблице 1.The average beta-CHTase activity of the patented strain and other cyclodextrinogenic microorganisms used for comparison, measured in the culture fluid after 70 hours of growth, are given in table 1.
Средняя активность бета-ЦГТазы Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 в бесклеточной культуральной жидкости составляет величину 5,8±1,0 ед/мл.The average activity of beta-CGTase Paenibacillus campinasensis IB-10155 in the cell-free culture fluid is 5.8 ± 1.0 units / ml.
Пример 2. В сопоставимых условиях измерений, демонстрируются каталитические особенности бета-ЦГТазы Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 в сравнении с действием бета-циклизующих ферментов из других продуцентов (таблица 1).Example 2. Under comparable measurement conditions, the catalytic features of the beta-CGTase Paenibacillus campinasensis IB-10155 are demonstrated in comparison with the action of beta-cyclizing enzymes from other producers (table 1).
Опыт выполняют следующим образом. В пластиковые пробирки объемом 5 мл помещают по 2 мл 4% картофельного крахмала в 50 мМ ацетатном буфере рН 6,0, подвергнутого 30 минутному автоклавированию при 120°С. В эти же пробирки дозируют порции растворов бета-ЦГТаз, полученных из различных источников, чтобы достичь соотношения 1, 2, 4, 8, 15, 30 ед. бета-ЦГТазы на 1 г АСВ крахмала в пробирке. Туда же также вводят порции консерванта, предотвращающего микробный рост. Для выравнивания концентрации субстрата (крахмала) до 2,75% по АСВ во все пробирки добавляют расчетные порции 50 мМ ацетатного буфера рН 6,0. Через 24 часа экспозиции при 50°С из полученных растворов отбирают по 900 мкл жидкости, которую смешивают со 90 мкл 10 мас.% ксилозы (внутреннего стандарта), с 990 мкл ацетонитрила. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и далее супернатант анализируют методом ВЭЖХ на колонке с аминированным силикагелем. В качестве элюэнта используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 60:40. Концентрацию циклодекстринов в пробах рассчитывают методом внутреннего стандарта по площадям пиков программно-аппаратными средствами. Выход ЦД в опытах, характеризовавшихся максимальным выходом суммы циклических продуктов, а также другие расчетные параметры, определенные в этом примере, также представлены в таблице 1.The experience is as follows. In 5 ml plastic tubes, 2 ml of 4% potato starch are placed in 50 mM acetate buffer pH 6.0, autoclaved for 30 minutes at 120 ° C. Portions of solutions of beta-CGTase obtained from various sources are metered into these tubes to achieve a ratio of 1, 2, 4, 8, 15, 30 units. beta-CGTase per 1 g of ACB starch in vitro. Portions of a preservative to prevent microbial growth are also introduced there. To equalize the concentration of substrate (starch) to 2.75% according to ASB, calculated portions of 50 mM acetate buffer pH 6.0 are added to all tubes. After 24 hours of exposure at 50 ° C, 900 μl of liquid are taken from the obtained solutions, which are mixed with 90 μl of 10 wt.% Xylose (internal standard), with 990 μl of acetonitrile. The precipitate formed is separated by centrifugation, and then the supernatant is analyzed by HPLC on an aminated silica gel column. A mixture of acetonitrile-water in a ratio of 60:40 is used as an eluent. The concentration of cyclodextrins in the samples is calculated by the internal standard method according to the peak areas using software and hardware. The yield of CD in experiments characterized by the maximum yield of the sum of cyclic products, as well as other design parameters defined in this example, are also presented in table 1.
Пример 3. Демонстрируется устойчивость ЦГТазы Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 к термическому воздействию в сравнении с ферментами других продуцентов.Example 3. Demonstrates the resistance of CTG Paenibacillus campinasensis IB-10155 to thermal effects in comparison with enzymes of other producers.
Опыт выполняют с использованием образцов препаратов ЦГТаз, разбавленных 50 мМ ацетатным буфером при рН 6,0 до удельной активности 1,0 ед/мл, без добавления стабилизаторов (солей кальция). Пробирки с одинаковыми объемами разведении исследуемого фермента 1000 мкл помещают в твердотельный термостат и инкубируют при 55°С. Через определенные интервалы времени термообработанные образцы извлекают и измеряют в них остаточную бета-ЦГТазную активность согласно процедуре, описанной в примере 1. Время инактивации 50% активности ферментных препаратов различных продуцентов в условиях настоящего опыта, измеренное методом графической экстраполяции и интерполяции, представлено в таблице 1.The experiment is performed using samples of CGTaz preparations diluted with 50 mM acetate buffer at pH 6.0 to a specific activity of 1.0 u / ml, without the addition of stabilizers (calcium salts). Tubes with the same dilution volumes of the studied enzyme 1000 μl are placed in a solid state thermostat and incubated at 55 ° C. At certain time intervals, the heat-treated samples are removed and the residual beta-CGTase activity is measured in them according to the procedure described in Example 1. The inactivation time of 50% of the activity of enzyme preparations of various producers under the conditions of this experiment, as measured by graphical extrapolation and interpolation, is presented in table 1.
Пример 4. Демонстрируется относительное постоянство доли бета-циклодекстрина на разных стадиях ферментативного воздействия при обработке крахмала ферментом в сравнении с ЦГТазой Bacillus sp. BKM Б-1793Д в условиях избыточных дозировок ферментов.Example 4. The relative constancy of the proportion of beta-cyclodextrin at different stages of the enzymatic action during treatment of starch with an enzyme is demonstrated in comparison with the Bacillus sp. BKM B-1793D under conditions of excessive dosages of enzymes.
В два стеклянных реактора объемом 200 мл, снабженных устройствами перемешивания и термостатирования, вносят раствор картофельного крахмала, подвергнутого 30 минутной обработке при 120°С, и ацетат натрия. В реакторы добавляют образцы лиофильно высушенных ферментных препаратов бета-ЦГАаз Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 и Bacillus sp. BKM Б-1793Д. Дозировку ферментов подбирают по количеству субстрата, внесенного в реактор, при этом она составляет 30 ед. бета-ЦГТазы на 1 грамм АСВ крахмала. В реактор также добавляют 50 мМ ацетатный буфер для достижения требуемых концентраций ингредиентов, которые составляют: по крахмалу 2,75 мас.% (по АСВ), по ацетату натрия - 50 мМ. Стартовое значение рН смеси должно составлять величину 6,00±0,05. Через определенные промежутки времени из реактора извлекают объемы жидкости, останавливают в них ферментативную реакцию добавлением 50 об.% ацетонитрила и измеряют концентрацию циклодекстринов методом ВЭЖХ, как это описано в примере 2. Результаты определения, показанные в таблице 2, свидетельствуют о том, что при использовании ЦГТазы патентуемого штамма Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 (в сравнении с циклизующим ферментом штамма-прототипа Bacillus sp. BKM Б-1793Д) наблюдается более высокий выход суммы циклических продуктов по отношению к крахмалу при относительном постоянстве доли бета циклодекстрина в продуктах конверсии.Two glass reactors with a volume of 200 ml, equipped with stirring and temperature control devices, add a solution of potato starch, subjected to 30 minutes processing at 120 ° C, and sodium acetate. Samples of lyophilized enzyme preparations beta-CAA Paenibacillus campinasensis IB-10155 and Bacillus sp. BKM B-1793D. The dosage of enzymes is selected according to the amount of substrate introduced into the reactor, while it is 30 units. beta-CGTase per 1 gram of ACB starch. 50 mM acetate buffer is also added to the reactor to achieve the required concentrations of ingredients, which are: 2.75 wt.% For starch (according to ASB), 50 mM for sodium acetate. The starting pH of the mixture should be 6.00 ± 0.05. At certain intervals, volumes of liquid are removed from the reactor, the enzymatic reaction is stopped in them by adding 50 vol.% Acetonitrile, and the concentration of cyclodextrins is measured by HPLC, as described in example 2. The determination results shown in table 2 indicate that when using TSHTazy of the patented strain Paenibacillus campinasensis IB-10155 (in comparison with the cyclizing enzyme of the prototype strain Bacillus sp. BKM B-1793D) there is a higher yield of the sum of cyclic products in relation to starch when The constant constancy of the proportion of beta cyclodextrin in the conversion products.
Результаты конверсии раствора 2,75% (АСВ) картофельного крахмала препаратами бета-ЦГТаз в сопоставимых условиях.Table 1
The results of the conversion of a solution of 2.75% (ASV) of potato starch with beta-CGTaz preparations under comparable conditions.
Конверсия крахмала по действием ЦГТазы Paenibacillus campinasensis ИБ-10155 и Bacillus sp. BKM Б-1793Д в бета-циклодекстрин.table 2
Conversion of starch by the action of TSHTaza Paenibacillus campinasensis IB-10155 and Bacillus sp. BKM B-1793D in beta cyclodextrin.
Источники информацииInformation sources
1. Szente L., Szejtli J. Cyclodextrins as food ingredients. Trends in Food Science & Technology (2004), v15, p.137-142.1. Szente L., Szejtli J. Cyclodextrins as food ingredients. Trends in Food Science & Technology (2004), v15, p. 137-142.
2. Szeitli J. Cyclodextrins in the Textile Industry. Starch/Starke (2003) v.55 p.191-196.2. Szeitli J. Cyclodextrins in the Textile Industry. Starch / Starke (2003) v. 55 p. 191-196.
3. Циклодекстрины // Под ред. Егорова Н.С. - Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия Микробиология. - 1988-1989. - Т.20-21.3. Cyclodextrins // Ed. Egorova N.S. - The results of science and technology. VINITI. Microbiology Series. - 1988-1989. - T.20-21.
4. Абелян В.А. Циклодекстрины: Получение и применение. Изд. Дом "Ван-Арьян", Ереван, 2001, 519 с.4. Abelyan V.A. Cyclodextrins: Preparation and use. Ed. House "Van Aryan", Yerevan, 2001, 519 p.
5. Szeitli J. Cyclodextrin technology. Kluwer academic publishers, 1989. 450 p.5. Szeitli J. Cyclodextrin technology. Kluwer academic publishers, 1989.450 p.
6. Патент России N2244742, кл. С12N 1/20, 2000.6. Patent of Russia N2244742, cl. C12N 1/20, 2000.
7. Авторское свидетельство SU 1738852 A1, кл. С12N 9/10, 1990.7. Copyright certificate SU 1738852 A1, cl. C12N 9/10, 1990.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005141624/13A RU2312135C2 (en) | 2005-12-19 | 2005-12-19 | Strain of bacterium paenibacillus campinasensis as producer of cyclodextrin glucanotransferase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005141624/13A RU2312135C2 (en) | 2005-12-19 | 2005-12-19 | Strain of bacterium paenibacillus campinasensis as producer of cyclodextrin glucanotransferase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005141624A RU2005141624A (en) | 2007-06-27 |
| RU2312135C2 true RU2312135C2 (en) | 2007-12-10 |
Family
ID=38315289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005141624/13A RU2312135C2 (en) | 2005-12-19 | 2005-12-19 | Strain of bacterium paenibacillus campinasensis as producer of cyclodextrin glucanotransferase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2312135C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104923069A (en) * | 2015-05-15 | 2015-09-23 | 中国科学院生态环境研究中心 | Microbial active filler containing paenibacillus sp., and application thereof |
| RU2745671C2 (en) * | 2014-08-04 | 2021-03-30 | Басф Се | Antifungal strains of paenibacillus, fusaricidin-type compounds and their application |
| RU2799074C1 (en) * | 2016-02-09 | 2023-07-03 | Басф Се | Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or fusaricidins and chemical pesticides |
-
2005
- 2005-12-19 RU RU2005141624/13A patent/RU2312135C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2745671C2 (en) * | 2014-08-04 | 2021-03-30 | Басф Се | Antifungal strains of paenibacillus, fusaricidin-type compounds and their application |
| US11064703B2 (en) | 2014-08-04 | 2021-07-20 | Basf Se | Antifungal Paenibacillus strains, fusaricidin-type compounds, and their use |
| CN104923069A (en) * | 2015-05-15 | 2015-09-23 | 中国科学院生态环境研究中心 | Microbial active filler containing paenibacillus sp., and application thereof |
| RU2799074C1 (en) * | 2016-02-09 | 2023-07-03 | Басф Се | Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or fusaricidins and chemical pesticides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005141624A (en) | 2007-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| El-Enshasy et al. | Improvement of erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea in molasses based medium through cultivation medium optimization | |
| JPS6143994A (en) | Branching enzyme product | |
| Blanco et al. | Bacillus lehensis—an alkali-tolerant bacterium isolated from cassava starch wastewater: optimization of parameters for cyclodextrin glycosyltransferase production | |
| Cortezi et al. | Temperature effect on dextransucrase production by Leuconostoc mesenteroides FT 045 B isolated from Alcohol and Sugar Mill Plant | |
| CN112574920B (en) | Fibro-cellulose microbacterium PX02, method for producing dextranase by using fibro-cellulose microbacterium PX02 and application of method | |
| Sabioni et al. | Production and characterization of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus lentus | |
| RU2312135C2 (en) | Strain of bacterium paenibacillus campinasensis as producer of cyclodextrin glucanotransferase | |
| CN107118980A (en) | Solution keratan microbacterium MCDA02 and its enzyme producing method and product from ocean | |
| Ahmed et al. | Cyclodextrin glucosyltransferase production by Bacillus megaterium NCR: evaluation and optimization of culture conditions using factorial design | |
| Ekka et al. | Screening, isolation and characterization of amylase producing bacteria and optimization for production of amylase | |
| Burhan et al. | Mathematical modelling of cyclodextrin-glucanotransferase production by batch cultivation | |
| JP3691875B2 (en) | Thermostable maltose phosphorylase, method for producing the same, fungus used for the production, and method for using the enzyme | |
| JP5314955B2 (en) | Novel microorganism, inulinase, inulin degrading agent, method for producing inulooligosaccharide, and method for producing inulinase | |
| Kamble et al. | Cyclodextrin glycosyltransferase production by alkaliphilic bacillus sp. Isolated from rice cultivated soil and media optimization using taguchi method | |
| JP2023538160A (en) | Bacillus xiaoxiensis and its use | |
| US3804718A (en) | Method of producing beta-amylase by bacterial fermentation | |
| JP6621549B2 (en) | Bacillus aerolacticus for producing L-lactic acid or a salt thereof from various carbon sources | |
| JP2006223268A (en) | Method for producing galactosyl disaccharides | |
| Kitcha et al. | Cyclodextrin glycosyltransferase from a newly isolated alkalophilic Bacillus sp. C26. | |
| SU1738852A1 (en) | Strain of bacteria bacillus sp - a producer of @@@-cyclodextrintransferase | |
| Mulay et al. | Production of amylase from indigenously isolated strain of Aureobasidium pullulans and its hyper producing mutant. | |
| Iizuka et al. | Synthesis of Fructan and Oligosaccharides by Microbial and Plant Fructosyltransf erasest | |
| KR920006397B1 (en) | Method for preparation of cyclomalto dextrin glucano transferase | |
| RU2455352C1 (en) | Bacillus amyloliquefaciens STRAIN - ALPHA AMYLASE PRODUCER FROM Bacillus amyloliquefaciens | |
| Vala et al. | Isolation and Optimization of Alkaline Amylase from Marine Bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081220 |