RU2304587C2 - METHOD FOR SELECTIVE ISOLATION OF IgV ANTIBODIES FROM ANSERES ORDER BIRD EGG YOLK (VARIANTS) - Google Patents
METHOD FOR SELECTIVE ISOLATION OF IgV ANTIBODIES FROM ANSERES ORDER BIRD EGG YOLK (VARIANTS) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2304587C2 RU2304587C2 RU2002115256/13A RU2002115256A RU2304587C2 RU 2304587 C2 RU2304587 C2 RU 2304587C2 RU 2002115256/13 A RU2002115256/13 A RU 2002115256/13A RU 2002115256 A RU2002115256 A RU 2002115256A RU 2304587 C2 RU2304587 C2 RU 2304587C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- egg yolk
- igy
- aqueous
- concentration
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Данное изобретение касается способа быстрого выделения и очистки антител яичного желтка, в частности антитела IgY из яичного желтка птицы отряда гусеобразных, а также полученных таким образом антител яичного желтка. Более конкретно, данное изобретение относится к способу выделения и очистки антител яичного желтка из желтка птиц отряда гусеобразных путем адсорбционной хроматографии при использовании не растворимого в воде незаряженного абсорбента, с целью осуществления желаемого разделения антител яичного желтка, и путем процедуры высаливания, при которой происходит дифференцированное осаждение антител IgY. Данное изобретение касается также применения антител IgY в количественном или качественном анализе или для приготовления фармацевтических композиций, направленных на представляющий интерес этиологический агент.This invention relates to a method for the rapid isolation and purification of egg yolk antibodies, in particular IgY antibodies from an egg yolk of anseriformes, as well as egg yolk antibodies thus obtained. More specifically, this invention relates to a method for the isolation and purification of egg yolk antibodies from the yolk of anseriformes by adsorption chromatography using a water-insoluble, non-charged absorbent, to achieve the desired separation of egg yolk antibodies, and by a salting out procedure in which differentiation occurs IgY antibodies. The invention also relates to the use of IgY antibodies in a quantitative or qualitative assay or for the preparation of pharmaceutical compositions directed to an etiological agent of interest.
Уровень техникиState of the art
Антитела широко используют во многих биологических исследованиях и клинической практике. Сыворотки, полученные от гипериммунизированных млекопитающих, являются наиболее распространенным источником поликлональных антител. Антитела, выделенные из данных иммунных сывороток, принадлежат к группе белков, называемых "иммуноглобулинами", среди которых преобладающим является иммуноглобулин G (IgG). Молекула IgG состоит из трех доменов, а именно: двух участков Fab и одного участка Fc. Участок Fab принимает участие главным образом в связывании антигена. Участок Fc, хотя и не обладает способностью связываться с антигеном, направляет особую биологическую активность антитела, такую как фиксация комплемента и связывание Fc-рецептора.Antibodies are widely used in many biological studies and clinical practice. Sera obtained from hyperimmunized mammals are the most common source of polyclonal antibodies. Antibodies isolated from these immune sera belong to a group of proteins called “immunoglobulins”, of which immunoglobulin G (IgG) is predominant. The IgG molecule consists of three domains, namely: two Fab sites and one Fc site. The Fab region is primarily involved in antigen binding. The Fc region, although it does not have the ability to bind to the antigen, directs specific biological activity of the antibody, such as complement fixation and Fc receptor binding.
В области иммунодиагностики интактная молекула IgG не подходит для применения в системах детекции и иммунологических анализах, включающих сыворотку млекопитающих, поскольку участок Fc на молекуле IgG способен связываться с Fc-рецепторами, активирующими систему комплемента и реагирующими с ревматоидным фактором в сыворотке млекопитающих. Удаление участка Fc молекулы IgG часто приводит к снижению интерференции (см. статью Е. Lamoyi, Methods in Enzymology, 121:652-663, (1986)).In the field of immunodiagnostics, an intact IgG molecule is not suitable for use in detection systems and immunological assays, including mammalian serum, since the Fc region on the IgG molecule is able to bind to Fc receptors that activate the complement system and react with rheumatoid factor in mammalian serum. Removal of the Fc region of an IgG molecule often leads to a decrease in interference (see article E. Lamoyi, Methods in Enzymology, 121: 652-663, (1986)).
Некоторые из предлагаемых вариантов применения антитела в иммунотерапии включают лечение пациентов вызывающими интоксикацию бактериальными токсинами или змеиными ядами (см., например, Патенты США 5340923 и 5601823) и защиту новорожденных поросят против летального кишечного колибациллеза (колибактериоза) (см., например, статьи Н. Brussow и соавт., J. Clin. Microbiol., 25:982, (1987) и С.О.Tacket и соавт., New Eng. J. Med., 318:1240, (1988)). Поскольку, как известно, фрагмент Fc молекулы антитела является наиболее антигенной частью иммуноглобулина (см. статью Е.М. Akita и соавт., J. Immunol. Methods, 162:155-164, (1993)), его отщепление, которое приводит к образованию фрагмента F(ab')2, будет значительно снижать число потенциальных аллергенных центров на молекуле иммуноглобулина и является таким образом полезным для человека или животного, которым вводят иммуноглобулин.Some of the suggested uses for the antibody in immunotherapy include treating patients with toxic bacteria or snake venoms (see, for example, US Patents 5,340,923 and 5,601,823) and protecting newborn piglets against lethal intestinal colibacillosis (colibacteriosis) (see, for example, article N. Brussow et al., J. Clin. Microbiol., 25: 982, (1987) and C. O. Tacket et al., New Eng. J. Med., 318: 1240, (1988)). Since it is known that the Fc fragment of an antibody molecule is the most antigenic part of immunoglobulin (see article by E.M. Akita et al., J. Immunol. Methods, 162: 155-164, (1993)), its cleavage, which leads to the formation of the F (ab ') 2 fragment will significantly reduce the number of potential allergenic centers on the immunoglobulin molecule and is thus useful for a person or animal to whom immunoglobulin is administered.
Недавно было показано, что двухвалентный фрагмент антитела F(ab')2 является более эффективным в иммунодиагностических тестах (см. статьи М.Muratsugu и соавт., J. Colloid Interface Sci., 147:378, (1991) и J.L Ortega-Vinuesa и соавт., J. Immunol. Methods, 90:29, (1996)) и более подходящим для разработки иммуноанализов с использованием сыворотки млекопитающих, чем родительское (исходное) IgG.Recently, it has been shown that a bivalent antibody fragment F (ab ') 2 is more effective in immunodiagnostic tests (see articles by M. Muratsugu et al., J. Colloid Interface Sci., 147: 378, (1991) and JL Ortega-Vinuesa et al., J. Immunol. Methods, 90:29, (1996)) and more suitable for the development of immunoassays using mammalian serum than parent (starting) IgG.
Однако фрагмент антитела F(ab')2 не нашел широкого применения в клинических иммунодиагностических наборах, как можно было бы предположить. Это может объясняться трудностями и нерентабельностью широкомасштабной продукции фрагментов F(ab')2, которые обыкновенно получают путем разложения IgG пепсином с последующей хроматографической очисткой.However, the F (ab ') 2 antibody fragment did not find wide application in clinical immunodiagnostic kits, as might be supposed. This can be explained by the difficulties and unprofitability of large-scale production of F (ab ') 2 fragments, which are usually obtained by decomposition of IgG with pepsin followed by chromatographic purification.
Утки и их филогенетически близкие родственники, а также некоторые рептилии, такие как черепахи, имеют три вида сывороточных иммуноглобулинов: макромолекулярный иммуноглобулин IgM (у уток молекулярной массы 800 кД) и две изоформы низкомолекулярного IgG с коэффициентами седиментации 7,8 S (у уток молекулярной массы 180 кД) и 5,7 S (у уток молекулярной массы 130 кД), соответственно, (см. статьи E.R. Unanue и соавт., J. Exp. Med., 121:697-714, (1965); Н.М. Grey, J. Immunol., 98:811-819, (1967) и В. Zimmerman и соавт., Biochemistry, 10:482-488, (1971)). Птичий IgG часто называют IgY, поскольку кроме сыворотки он присутствует в яичном желтке. IgY 5,7 S, состоящий из более коротких тяжелых цепей, структурно и антигенно близок фрагменту F(ab')2 IgY 7,8 S (см. Фигуру 1), и данный факт приводит к тому, что термин IgY (эквивалент IgY 7,8 S) и IgY(ΔFc) (эквивалент IgY 5,7 S) представляет обе изоформы IgY (см. статью K.Е.Magor и соавт., J. Immunol., 149:2627-2633, (1992)).Ducks and their phylogenetically close relatives, as well as some reptiles, such as turtles, have three types of serum immunoglobulins: a macromolecular IgM immunoglobulin (800 kD in ducks) and two low molecular weight IgG isoforms with sedimentation coefficients of 7.8 S (in duck molecular weight 180 kDa) and 5.7 S (for ducks with a molecular weight of 130 kDa), respectively (see ER Unanue et al., J. Exp. Med. 121: 697-714, (1965); N.M. Gray, J. Immunol., 98: 811-819, (1967) and B. Zimmerman et al., Biochemistry, 10: 482-488, (1971)). Avian IgG is often called IgY, since it is present in egg yolk in addition to serum. IgY 5.7 S, consisting of shorter heavy chains, is structurally and antigenically close to the F (ab ') 2 IgY 7.8 S fragment (see Figure 1), and this fact leads to the term IgY (equivalent to IgY 7 8 S) and IgY (ΔFc) (equivalent to 5.7 S IgY) are both IgY isoforms (see K.E. Magor et al., J. Immunol., 149: 2627-2633, (1992)).
Исследования, проведенные на инфицированных или экспериментально иммунизированных птицах, показали, что утиные антитела являются недостаточными по числу биологических эффекторных функций, включая фиксацию комплемента и связывание Fc-рецепторов без сокращения своей активности связывания соответствующих антигенов (см. статьи G.W. Litman и соавт., Immunochemistry, 10:323, (1973) и Т.Е. Toth и соавт., Avian Dis., 25:17-28, (1981)). Это, вероятно, может быть обусловлено явным отсутствием участка, эквивалентного Fc-участку антитела IgY(ΔFc), которое содержит основной по количеству компонент ответа антител птиц отряда гусеобразных. Таким образом, полагают, что антитело IgY(ΔFc), которое, по-видимому, является структурным и функциональным аналогом фрагмента F(ab')2, обеспечивало бы значительные преимущества при иммунологическом применении, если бы можно было разработать перспективный способ получения антитела и если бы были установлены подходящие физические требования к его активности.Studies in infected or experimentally immunized birds have shown that duck antibodies are insufficient in terms of biological effector functions, including complement fixation and Fc receptor binding without reducing their binding activity of the corresponding antigens (see GW Litman et al., Immunochemistry, 10: 323, (1973) and T.E. Toth et al., Avian Dis., 25: 17-28, (1981)). This is likely to be due to the apparent absence of a site equivalent to the Fc region of an IgY antibody (ΔFc), which contains the main component of the response of an avian anseriformes. Thus, it is believed that the IgY antibody (ΔFc), which, apparently, is a structural and functional analogue of the F (ab ') 2 fragment, would provide significant advantages in immunological use, if it were possible to develop a promising method for producing antibodies and if appropriate physical requirements for its activity would be established.
Было показано, что антитела яичного желтка птиц, как и антитела млекопитающих, проявляют полезные свойства как при исследовательском, так и при клиническом применении (см., например, Патенты США 5340923, 5585098, 5601823 и 5976519). Яичные желтки, полученные от самок птиц-несушек, являются недорогими и более удобными и безопасными для работы по сравнению с гипериммунизированными сыворотками млекопитающих. Более важно, что антитела яичного желтка соответствуют современным требованиям защиты животных (см. статьи A. Poison и соавт., Immunol. Commun., 9:475, (1980) и В. Gottstein и соавт.). Данные факты позволяют предположить потенциальную возможность применения яичного желтка в качестве промышленного источника антител.It has been shown that avian egg yolk antibodies, as well as mammalian antibodies, exhibit useful properties both in research and in clinical use (see, for example, US Patents 5340923, 5585098, 5601823 and 5976519). Egg yolks obtained from female laying birds are inexpensive and more convenient and safe to work compared to hyperimmunized mammalian sera. More importantly, egg yolk antibodies meet modern animal welfare requirements (see articles by A. Poison et al., Immunol. Commun., 9: 475, (1980) and B. Gottstein et al.). These facts suggest the potential use of egg yolk as an industrial source of antibodies.
Однако высокий уровень содержания липидных субстанций, таких как жирные кислоты, холестерин и лецитин, в яичном желтке делает выделение антител яичного желтка обременительной трудоемкой задачей. В этом плане было предпринято много попыток. Например, водорастворимые осаждающие агенты, включая агар, пектин (японская заявка Japanese Kokai No. 64-38098, опубликованная 8 февраля 1989), декстран сульфат (см. статью J.C. Jensenius и соавт., J. Immunol. Methods, 46:63, (1981)), природные камеди (см. статью Н.Hatta и соавт., J. Food-Science, 53:425, (1988)) и полиэтиленгликоль (ПЭГ) (см. статью A. Poison и соавт., Immunol. Invest., 14:323, (1985), см. также Патент США 4550019, выданный A.Poison) были использованы для осаждения неводных биомолекул, в основном липидов и гранул яичного желтка, чтобы таким образом собрать водорастворимую фазу, содержащую большую часть всей популяции антител яичного желтка. A. Hassl и соавт. разработали двухстадийный хроматографический способ, предусматривающий проведение хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия и вытеснительной хроматографии, для дальнейшего выделения всей популяции антител яичного желтка из фракции, очищенной с помощью ПЭГ (см. статью А. Hassl и Н. Aspock, J. Immunol. Methods, 110:225, (1988)). В работе Akita и соавт. описан усовершенствованный способ выделения IgY, согласно которому антитела яичного желтка экстрагировали из куриных яиц путем разведения яичных желтков большим объемом воды и проведения вытеснительной хроматографии и/или ионообменной хроматографии полученного супернатанта (см. статьи Е.М.Akita и соавт., J. Immunol. Methods, 160:207, (1993) и Е. М. Akita и S.Nakai, J. Food Sci., 57:629, (1993)).However, the high level of lipid substances such as fatty acids, cholesterol and lecithin in the egg yolk makes the isolation of egg yolk antibodies a burdensome and laborious task. In this regard, many attempts have been made. For example, water-soluble precipitating agents, including agar, pectin (Japanese application Japanese Kokai No. 64-38098, published February 8, 1989), dextran sulfate (see article JC Jensenius et al., J. Immunol. Methods, 46:63, ( 1981)), natural gums (see article by H. Hatta et al., J. Food-Science, 53: 425, (1988)) and polyethylene glycol (PEG) (see article A. Poison et al., Immunol. Invest ., 14: 323, (1985), see also U.S. Patent 4,500,019, issued to A.Poison) were used to precipitate non-aqueous biomolecules, mainly lipids and egg yolk granules, so as to collect a water-soluble phase containing most of the total pop lyatsii egg yolk antibodies. A. Hassl et al. developed a two-step chromatographic method involving hydrophobic interaction chromatography and size exclusion chromatography to further isolate the entire population of egg yolk antibodies from a fraction purified by PEG (see article A. Hassl and H. Aspock, J. Immunol. Methods, 110 : 225, (1988)). In the work of Akita et al. An improved method for isolating IgY is described, according to which egg yolk antibodies are extracted from chicken eggs by diluting egg yolks with large volumes of water and performing size exclusion chromatography and / or ion exchange chromatography of the obtained supernatant (see articles by E.M. Akita et al., J. Immunol. Methods, 160: 207, (1993) and E. M. Akita and S. Nakai, J. Food Sci., 57: 629, (1993)).
Однако все эти исследования и патенты сосредоточены на выделении всей популяции антител яичного желтка (которая включает в себя по меньшей мере IgY с участком Fc и/или IgY, лишенный участка Fc) из птичьих яиц, а не на избирательной очистке антител lgY(ΔFc) и IgY. Более того, поскольку антитела IgY(ΔFc) имеются только у птиц, принадлежащих к отряду Anseriformes (гусеобразных), включающему в себя уток и гусей, и поскольку описано, что содержание липидов в яичном желтке птиц отряда гусеобразных выше, чем у птиц отряда куриных, таких как курица и индейка, традиционные способы, описанные выше, не дают возможности предположить удачную очистку антитела IgY(ΔFc). Антитело IgY(ΔFc) было очищено только путем соосаждения с IgY из утиной сыворотки (см. статью D.A. Higgins и соавт., Veterinary Immunology and Immunopathology, 41:169-180, (1995)) с использованием сложных и дорогостоящих процедур, но до настоящего времени антитело IgY(ΔFc) отдельно не было селективно выделено из яичного желтка.However, all of these studies and patents focus on isolating the entire egg yolk antibody population (which includes at least IgY with an Fc and / or IgY region lacking an Fc region) from bird eggs, rather than selective purification of IgY (ΔFc) antibodies and IgY. Moreover, since IgY antibodies (ΔFc) are present only in birds belonging to the order Anseriformes (anseriformes), including ducks and geese, and since it is described that the lipid content in the egg yolk of birds of the order Anseriformes is higher than in birds of the order Detachment, such as chicken and turkey, the traditional methods described above do not suggest the successful purification of IgY antibodies (ΔFc). The IgY antibody (ΔFc) was purified only by coprecipitation with IgY from duck serum (see DA Higgins et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 41: 169-180, (1995)) using complex and expensive procedures, but until now of time, the IgY antibody (ΔFc) was not separately selectively isolated from egg yolk.
Вследствие этого, существует необходимость быстрого рентабельного и высокоэффективного способа, обеспечивающего легкое выделение желательного антитела IgY из набора антител яйца птицы отряда гусеобразных при поддержании активности антитела IgY. Практически чистое антитело IgY(ΔFc) может действовать как антитело F(ab')2 нового типа в различных вариантах применения в иммунодиагностике и иммунотерапии.As a result of this, there is a need for a quick, cost-effective and highly effective method for easily isolating the desired IgY antibody from an antibody set of anseriformes bird eggs while maintaining the activity of the IgY antibody. The almost pure IgY antibody (ΔFc) can act as a new type of antibody F (ab ') 2 in various applications in immunodiagnostics and immunotherapy.
Сущность изобретения SUMMARY OF THE INVENTION
Было предпринято широкомасштабное исследование с целью выполнения промышленных требований к антителам яичного желтка, как указано выше. Неожиданно обнаружено, что успешное выделение антител яичного желтка из яичных желтков птиц отряда гусеобразных можно легко осуществить путем адсорбционной хроматографии с использованием не растворимого в воде незаряженного абсорбента и/или путем простой процедуры высаливания, которая позволяет разделить различные изоформы антител яичного желтка. Согласно способу, соответствующему данному изобретению, высокоочищенные антитела яичного желтка, в частности высокоочищенные IgY(ΔFc), можно легко получить с высоким выходом экономически выгодным образом, и они готовы для широкого применения в иммунологии.A large-scale study has been undertaken to meet the industrial requirements for egg yolk antibodies, as described above. It has been unexpectedly discovered that the successful isolation of egg yolk antibodies from egg yolks of anseriformes can be easily accomplished by adsorption chromatography using a water-insoluble, non-charged absorbent and / or by a simple salting out procedure that allows the separation of various isoforms of egg yolk antibodies. According to the method of the invention, highly purified egg yolk antibodies, in particular highly purified IgY (ΔFc), can be easily obtained in a high yield in an economically advantageous manner and are ready for widespread use in immunology.
В соответствии с этим задачей данного изобретения является разработка способа селективного выделения антител IgY из яичного желтка птиц отряда гусеобразных, который характеризуется:In accordance with this objective of this invention is to develop a method for the selective isolation of IgY antibodies from the egg yolk of birds of the order Anseriformes, which is characterized by:
(а) абсорбцией антител яичного желтка в смешивающейся с водой фракции, полученной из яичного желтка птиц отряда гусеобразных, с помощью не растворимого в воде незаряженного абсорбента, выбранного из группы, состоящей из силиката, соединений кремния, карбоната, сульфата, фосфата, угля, целлюлозы и синтетического волокна, керамики и оксида металла, где не растворимый в воде незаряженный абсорбент находится в количестве, эффективном для отделения антител яичного желтка от смешивающейся с водой фракции, и(a) absorption of egg yolk antibodies in a water-miscible fraction obtained from the egg yolk of anseriformes using an water-insoluble, uncharged absorbent selected from the group consisting of silicate, silicon compounds, carbonate, sulfate, phosphate, coal, cellulose and synthetic fiber, ceramic, and metal oxide, wherein the water-insoluble, uncharged absorbent is in an amount effective to separate the egg yolk antibodies from the water miscible fraction, and
(b) промыванием не растворимого в воде незаряженного абсорбента буфером с получением водной фракции, содержащей антитела яичного желтка.(b) washing the water-insoluble non-charged absorbent with a buffer to obtain an aqueous fraction containing egg yolk antibodies.
Другим аспектом изобретения является разработка способа селективного выделения антител IgY из яичного желтка птиц отряда гусеобразных, который характеризуется проведением первого высаливания путем высаливания водной фракции, содержащей антитела яичного желтка, с использованием (NH4)2SO4 в первой концентрации, лежащей в интервале от приблизительно 15% (мас./об.) до приблизительно 24% (мас./об.), причем не более чем приблизительно 21% (мас./об.) от объема водной фракции, и затем проводят второе высаливание путем высаливания водной фракции, содержащей антитела яичного желтка, обработанной при первом высаливании, с помощью (NH4)2SO4 второй концентрации, лежащей в интервале от приблизительно 25% (мас./об.) до приблизительно 40% (мас./об.), предпочтительно не более чем приблизительно 31% (мас./об.) от объема водной фракции, обработанной при первом высаливании.Another aspect of the invention is the development of a method for selectively isolating IgY antibodies from the egg yolk of anseriformes, which is characterized by performing a first salting out by salting out an aqueous fraction containing egg yolk antibodies using (NH 4 ) 2 SO 4 in a first concentration ranging from approximately 15% (w / v) to about 24% (w / v), not more than about 21% (w / v) of the volume of the aqueous fraction, and then a second salting out is carried out by salting out the aqueous fraction, containing her egg yolk antibodies, processed during the first salting out, using (NH 4 ) 2 SO 4 a second concentration lying in the range from about 25% (wt./about.) to about 40% (wt./about.), preferably not more than approximately 31% (w / v) of the volume of the aqueous fraction processed during the first salting out.
Еще одним аспектом изобретения является разработка способа селективного выделения антител IgY из яичного желтка птиц отряда гусеобразных, который характеризуется:Another aspect of the invention is the development of a method for the selective isolation of IgY antibodies from the egg yolk of birds of the order Anseriformes, which is characterized by:
(а) абсорбцией антител яичного желтка в смешивающейся с водой фракции, полученной из яичного желтка птиц отряда гусеобразных, с помощью не растворимого в воде незаряженного абсорбента, выбранного из группы, состоящей из силиката, соединений кремния, карбоната, сульфата, фосфата, угля, целлюлозы и синтетического волокна, керамики и оксида металла, где не растворимый в воде незаряженный абсорбент находится в количестве, эффективном для отделения антител яичного желтка от смешивающейся с водой фракции,(a) absorption of egg yolk antibodies in a water-miscible fraction obtained from the egg yolk of anseriformes using an water-insoluble, uncharged absorbent selected from the group consisting of silicate, silicon compounds, carbonate, sulfate, phosphate, coal, cellulose and synthetic fiber, ceramics, and metal oxide, wherein the water-insoluble, uncharged absorbent is in an amount effective to separate the egg yolk antibodies from the water miscible fraction,
(b) промыванием не растворимого в воде незаряженного абсорбента буфером с получением водной фракции, содержащей антитела яичного желтка,(b) washing the water-insoluble non-charged absorbent with a buffer to obtain an aqueous fraction containing egg yolk antibodies,
(c) высаливанием водной фракции, содержащей антитела яичного желтка, полученной на стадии (b), с использованием (NH4)2SO4 в первой концентрации, лежащей в интервале от приблизительно 15% (мас./об.) до приблизительно 24% (мас./об.), и предпочтительно не более чем приблизительно 21% (мас./об.) от объема водной фракции, и(c) salting out the aqueous fraction containing the egg yolk antibodies obtained in step (b) using (NH 4 ) 2 SO 4 in a first concentration ranging from about 15% (w / v) to about 24% (wt./about.), and preferably not more than approximately 21% (wt./about.) of the volume of the aqueous fraction, and
(d) высаливание водной фракции, содержащей антитела яичного желтка, обработанной на стадии (с), с помощью (NH4)2SO4 второй концентрации, лежащей в интервале от приблизительно 25% (мас./об.) до приблизительно 40% (мас./об.), предпочтительно не более чем приблизительно 31% (мас./об.) от объема водной фракции, обработанной на стадии (с).(d) salting out the aqueous fraction containing the egg yolk antibodies treated in step (c) with (NH 4 ) 2 SO 4 of a second concentration ranging from about 25% (w / v) to about 40% ( wt./about.), preferably not more than approximately 31% (wt./about.) of the volume of the aqueous fraction processed in step (c).
Согласно способу, соответствующему данному изобретению, значительное количество выбранной изоформы антител яичного желтка, в частности антитела IgY(ΔFc), пригодной для различных вариантов промышленного применения, можно получить экономически выгодным, эффективным и сберегающим время способом.According to the method of this invention, a significant amount of the selected egg yolk antibody isoform, in particular IgY antibody (ΔFc), suitable for various industrial applications, can be obtained in a cost-effective, efficient and time-saving manner.
Еще одним объектом, соответствующим изобретению, является клиническое применение и применение в исследовательских целях полученного таким образом антитела IgY. Кроме рентабельности и простоты получения антитело IgY(ΔFc), соответствующее данному изобретению, имеет преимущество в том, что оно является неактивным в отношении системы комплемента и ревматоидных факторов в сыворотке млекопитающих и обладает низкой перекрестной реактивностью с IgG млекопитающих, являясь таким образом особенно подходящим для применения в иммунологических анализах, включающих сыворотку млекопитающих при минимальной интерференции. Компетентными специалистами в данной области было бы оценено, что антитело IgY может присутствовать в форме отдельного реагента для клинических, исследовательских и других целей или может быть включено в коммерческий набор в качестве активного компонента.Another object corresponding to the invention is the clinical use and research use of the thus obtained IgY antibody. In addition to the cost-effectiveness and ease of preparation, the IgY antibody (ΔFc) of the invention has the advantage that it is inactive with the complement system and rheumatoid factors in mammalian serum and has low cross-reactivity with mammalian IgG, thus being particularly suitable for use in immunological assays, including mammalian serum with minimal interference. Competent specialists in this field would be appreciated that the IgY antibody may be present in the form of a separate reagent for clinical, research and other purposes, or may be included in the commercial kit as an active component.
Другим специфическим объектом изобретения является реагент для иммуноанализа представляющего интерес этиологического агента, который содержит антитело IgY, полученное с помощью способа, соответствующего данному изобретению.Another specific subject of the invention is a reagent for immunoassay of an etiological agent of interest, which contains an IgY antibody obtained by the method of the invention.
Перечень фигур чертежей и иных материаловList of figures of drawings and other materials
Вышеописанные и иные объекты и признаки данного изобретения станут очевидными со ссылкой на последующее описание предпочтительных вариантов осуществления, взятых в сочетании в сопровождающими рисунками, среди которых Фиг.1 иллюстрирует анализ с помощью SDS-PAGE (элекрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) способности захвата антител четырьмя абсорбентами: на дорожке 1 представлен частично очищенный экстракт антител; на дорожке 2 представлен раствор, проходящий через 2% вспененный кремнезем; на дорожке 3 представлен раствор, проходящий через 3% диоксид кремния; на дорожке 4 представлен раствор, проходящий через 3% Celite diatomite (целит диатомит); на дорожке 5 представлен раствор, проходящий через 3% Celite diatomite hyflo-Cel; и на дорожке 6 представлен раствор, проходящий через 5% Celite diatomite hyflo-Cel.The above and other objects and features of the present invention will become apparent with reference to the following description of preferred embodiments taken in conjunction with the accompanying drawings, among which Figure 1 illustrates the capture ability of SDS-PAGE (electrophoresis in polyacrylamide gel using sodium dodecyl sulfate) antibodies with four absorbents:
Фиг.2 иллюстрирует результаты электрофореза очищенных антител яичного желтка с использованием вспененного кремния в качестве абсорбента, который проводят в 8% SDS-полиакриламидном геле: на дорожке 1 представлен частично очищенный экстракт антител; на дорожке 2 представлен раствор, проходящий через 2% вспененный кремнезем; на дорожке 3 представлен элюат, полученный из остатка вспененного кремния; на дорожке 4 представлен продукт антител, осажденный 21% (мас./об.) сульфатом аммония на первой стадии осаждения; и на дорожке 5 представлен продукт антител, осажденный 31% (мас./об.) сульфатом аммония на второй стадии осаждения.Figure 2 illustrates the results of electrophoresis of purified egg yolk antibodies using foamed silicon as absorbent, which is carried out on an 8% SDS-polyacrylamide gel:
Фиг.3 иллюстрирует результаты электрофореза очищенных антител яичного желтка с использованием Celite diatomite в качестве абсорбента, который проводят в 8% SDS-полиакриламидном геле: на дорожке 1 представлен частично очищенный экстрактантител; на дорожке 2 представлен фильтрат, полученный при использовании Celite diatomite; на дорожке 3 представлен продукт антител, осажденный 21% (мас./об.) сульфатом аммония на первой стадии осаждения; на дорожке 4 представлен продукт антител, осажденный 31% (мас./об.) сульфатом аммония на второй стадии осаждения; и на дорожке 5 представлен продукт антител, осажденный 16% (мас./об.) сульфатом натрия на второй стадии осаждения, иFigure 3 illustrates the results of electrophoresis of purified egg yolk antibodies using Celite diatomite as absorbent, which is carried out on an 8% SDS-polyacrylamide gel:
Фиг.4 иллюстрирует результаты электрофореза очищенных антител яичного желтка с использованием вспененного кремния в качестве абсорбента, который проводят в 8% SDS-полиакриламидном геле: М - маркер молекулярной массы; на дорожке 1 представлен частично очищенный экстракт антител; на дорожке 2 представлен раствор, проходящий через 2% вспененный кремнезем; на дорожке 3 представлен элюат, полученный из остатка вспененного кремния; на дорожке 4 представлен продукт антител, осажденный 21% (мас./об.) сульфатом аммония; и на дорожке 5 представлен продукт антител, очищенный с помощью аффинной хроматографии.Figure 4 illustrates the results of electrophoresis of purified egg yolk antibodies using foamed silicon as absorbent, which is carried out in 8% SDS-polyacrylamide gel: M is a molecular weight marker;
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияInformation confirming the possibility of carrying out the invention
Антитела яичного желтка преобладают в птичьей сыворотке и яйцах, откладываемых птицей. Однако, как описано выше, накопление антител из яиц обычно является предпочтительным в плане стоимости. Самки птиц-несушки переносят обе изоформы, IgY и IgY(ΔFc), из сыворотки в яичный желток. В принципе в желтке каждого утиного яйца содержится от приблизительно 1 до приблизительно 4 мг IgY/мл и от приблизительно 3 до приблизительно 12 мг IgY (ΔFc)/мл, и поэтому общее количество антител, содержащихся в одном яйце, оценивается как составляющее 15-80 мг IgY и 45-240 мг IgY(ΔFc). Большой объем полученного яичного желтка значительно превышает объем сыворотки, который можно безопасно получить у птиц в течение любого взятого периода времени. Кроме того, крупномасштабная экстракция антител яичного желтка может быть проведена без больших инвестиций. Предпочтительно, когда антитела, соответствующие данному изобретению, получают из яиц птиц отряда гусеобразных, иммунизированных специфическим антигеном.Egg yolk antibodies predominate in bird serum and eggs laid by the bird. However, as described above, the accumulation of antibodies from eggs is usually preferred in terms of cost. Female laying birds transfer both isoforms, IgY and IgY (ΔFc), from serum to egg yolk. In principle, the yolk of each duck egg contains from about 1 to about 4 mg IgY / ml and from about 3 to about 12 mg IgY (ΔFc) / ml, and therefore the total number of antibodies contained in one egg is estimated to be 15-80 mg IgY and 45-240 mg IgY (ΔFc). The large volume of obtained egg yolk significantly exceeds the volume of serum that can be safely obtained from birds during any given time period. In addition, large-scale extraction of egg yolk antibodies can be carried out without large investments. Preferably, when the antibodies corresponding to this invention are obtained from birds of the order anseriformes immunized with a specific antigen.
В соответствии с данным изобретением представлен способ эффективного выделения антител из яичного желтка, в котором так называемая "адсорбционная хроматография" или "дифференцированное высаливание", которые могут быть использованы отдельно или в комбинации друг с другом, представляют собой важные стадии выделения.According to the present invention, there is provided a method for efficiently isolating antibodies from an egg yolk, in which so-called “adsorption chromatography” or “differential salting out,” which can be used alone or in combination with each other, are important isolation steps.
Как используют в данном контексте, термин "адсорбционная хроматография" относится к типу способов разделения, включающих использование стационарной фазы для избирательного поглощения и концентрирования желаемых растворенных веществ из подвижной фазы. Согласно одному из аспектов данного изобретения не растворимый в воде незаряженный абсорбент действует как активный компонент стационарной фазы при отделении антител яичного желтка путем абсорбции антител яичного желтка не растворимым в воде незаряженным абсорбентом, сопровождающейся захватом смешивающихся с водой липидных примесей, в норме присутствующих в яичном желтке.As used in this context, the term "adsorption chromatography" refers to the type of separation methods, including the use of a stationary phase for the selective absorption and concentration of the desired dissolved substances from the mobile phase. According to one aspect of the invention, a water-insoluble non-charged absorbent acts as an active component of the stationary phase in the separation of egg yolk antibodies by absorption of the egg yolk antibodies by a water-insoluble non-charged absorbent, accompanied by the capture of water-miscible lipid impurities normally present in egg yolk.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения яичный желток сначала отделяют от яичного белка, а затем промывают дистиллированной водой с целью удаления максимально возможного количества альбумина. Желточную оболочку, инкапсулирующую яичный желток, протыкают и выделенную фракцию яичного желтка разводят эффективным количеством водного буфера или воды с образованием суспензии яичного желтка. Предпочтительно, когда собранный яичный желток разводят водным буферным раствором или дистиллированной водой в интервале от приблизительно 2 частей до приблизительно 40 частей по объему, более предпочтительно от приблизительно 5 частей до приблизительно 30 частей по объему/1 часть яичного желтка. Показано, что значение рН является решающим фактором на стадии частичной очистки (см. статью Е.М.Akita и S.Nakai, J. Food Sci., 57: 629. (1993)). Для наилучшего выделения антител яичного желтка предпочтительно, когда рН находится в интервале от приблизительно 5 до приблизительно 7. Желательно, чтобы температура на данной стадии находилась в интервале от приблизительно 0°С до приблизительно 60°С. Суспензию яичного желтка осторожно встряхивают для образования гомогенной смеси, а затем дают ей постоять в течение времени, которое достаточно для образования водной и неводной фаз. Затем не растворимые в воде материалы, включая неводные биомолекулы, такие каклипопротеины, фосфолипиды, стерины и т.п., удаляют из водной суспензии яичного желтка путем центрифугирования. Затем полученный содержащий антитело супернатант можно отделить от вязкого осадка путем декантации, отсасывания или другими подобными способами, известными в области техники.In a preferred embodiment of the invention, the egg yolk is first separated from the egg white and then washed with distilled water to remove as much albumin as possible. The yolk shell encapsulating the egg yolk is pierced and the extracted egg yolk fraction is diluted with an effective amount of aqueous buffer or water to form an egg yolk suspension. Preferably, the collected egg yolk is diluted with an aqueous buffer or distilled water in the range of from about 2 parts to about 40 parts by volume, more preferably from about 5 parts to about 30 parts by volume / 1 part of egg yolk. It has been shown that the pH value is a decisive factor in the partial purification step (see article by E.M. Akita and S. Nakai, J. Food Sci., 57: 629. (1993)). For the best isolation of egg yolk antibodies, it is preferred that the pH is in the range of from about 5 to about 7. It is desirable that the temperature in this step is in the range of from about 0 ° C. to about 60 ° C. The egg yolk suspension is gently shaken to form a homogeneous mixture, and then allowed to stand for a time that is sufficient for the formation of an aqueous and non-aqueous phase. Then, water-insoluble materials, including non-aqueous biomolecules, such as lipoproteins, phospholipids, sterols, etc., are removed from the aqueous suspension of egg yolk by centrifugation. The resulting antibody-containing supernatant can then be separated from the viscous precipitate by decantation, suction, or other similar methods known in the art.
Вообще содержание липидов в полученной таким образом фракции еще остается настолько высоким, чтобы оказывать вредное воздействие на последующие манипуляции. Согласно данному изобретению стационарную фазу, содержащую не растворимый в воде незаряженный абсорбент, инкубируют со смешивающейся в воде фракцией в достаточном количестве для того, чтобы абсорбировать антитела яичного желтка и адсорбировать большую часть смешивающихся с водой липидных субстанций, остающихся в смешивающейся в воде фракции. Подходящие абсорбенты включают, без ограничения перечисленным, силикат, соединение кремния, карбонат, сульфат, фосфат, уголь, целлюлозу и синтетическое волокно, керамику и оксид металла, где силикат включает в себя синтетические или природные глины, каолин, тальк и силикат кальция; соединение кремния включает в себя вспененный кремнезем, аморфный кремнезем, диоксид кремния, силикагель, силикаты, диатомовую землю и землю Фуллера (Fuller); карбонат включает в себя карбонат кальция и карбонат бария; сульфат включает в себя сульфат кальция; фосфат включает в себя фосфат кальция; уголь включает в себя активированный уголь и угольное волокно, целлюлоза и синтетическое волокно включают в себя порошок целлюлозы; керамика включает в себя пористую керамику, а оксид металла включает в себя оксид алюминия и оксид титана. Особенно предпочтительными абсорбентами являются вспененный кремнезем, диоксид кремния и диатомовая земля. Рабочее соотношение абсорбента и смешивающейся с водой фракции может варьировать в широком диапазоне в зависимости от свойств выбранного абсорбента. При использовании в данном способе вспененного кремнезема предпочтительно, когда его добавляют до получения концентрации, равной или превышающей приблизительно 0,1 мас.% и, что более предпочтительно, находящейся в интервале от приблизительно 0,3 до приблизительно 5,0 мас.% от объема обрабатываемой не смешивающейся с водой фракции. Если абсорбент представлен диоксидом кремния или диатомовой землей, предпочтительно, когда адсорбционную хроматографию, соответствующую данному изобретению, проводят при использовании более чем приблизительно 1 мас.% и, что более предпочтительно, в интервале от приблизительно 3 до приблизительно 20 мас.% абсорбента от объема обрабатываемой не смешивающейся с водой фракции.In general, the lipid content in the fraction thus obtained still remains so high as to have a detrimental effect on subsequent manipulations. According to the invention, a stationary phase containing a water-insoluble non-charged absorbent is incubated with a water-miscible fraction in sufficient quantity to absorb egg yolk antibodies and adsorb most of the water-miscible lipid substances remaining in the water-miscible fraction. Suitable absorbents include, but are not limited to, silicate, a silicon compound, carbonate, sulfate, phosphate, coal, cellulose and synthetic fiber, ceramics and metal oxide, where the silicate includes synthetic or natural clays, kaolin, talc and calcium silicate; the silicon compound includes foamed silica, amorphous silica, silica, silica gel, silicates, diatomaceous earth and Fuller earth; carbonate includes calcium carbonate and barium carbonate; sulfate includes calcium sulfate; phosphate includes calcium phosphate; carbon includes activated carbon and carbon fiber; cellulose and synthetic fiber include cellulose powder; ceramics include porous ceramics, and metal oxide includes alumina and titanium oxide. Particularly preferred absorbents are foamed silica, silica and diatomaceous earth. The working ratio of absorbent and water-miscible fraction can vary over a wide range depending on the properties of the absorbent selected. When using foamed silica in this method, it is preferable when it is added to obtain a concentration equal to or greater than about 0.1 wt.% And, more preferably, in the range from about 0.3 to about 5.0 wt.% processed not miscible with water fractions. If the absorbent is represented by silica or diatomaceous earth, it is preferable that the adsorption chromatography according to this invention is carried out using more than about 1 wt.% And, more preferably, in the range from about 3 to about 20 wt.% Of the absorbent from the volume of the processed not miscible with water fractions.
Адсорбционную хроматографию в соответствии с данным изобретением осуществляют любым из традиционных способов, таких как обработка порции смешивающейся с водой фракции абсорбентом или пропускание потока смешивающейся с водой фракции через хроматографическую колонку, заполненную абсорбентом до тех пор, пока количество антител яичного желтка, удержанное на поверхностях абсорбента, станет удовлетворительным. Время реакции и температура при обработке не являются решающими для результатов, и обычно процесс осуществляют при температуре реакции от приблизительно 4 до приблизительно 30°С и времени реакции от приблизительно 10 до приблизительно 60 минут. Хотя процедуру адсорбции при необходимости можно повторить несколько раз, каждый раз со свежей загрузкой абсорбента, одной операции обычно бывает достаточно. С помощью данной процедуры липиды и большая часть нелипидных субстанций могут быть успешно разделены на две несмешивающиеся фазы, тогда как антитела яичного желтка также могут быть абсорбированы.Adsorption chromatography in accordance with this invention is carried out by any of the traditional methods, such as treating a portion of a water-miscible fraction with an absorbent or passing a stream of a water-miscible fraction through a chromatographic column filled with absorbent material until the amount of egg yolk antibodies retained on the surfaces of the absorbent will become satisfactory. The reaction time and temperature during processing are not critical to the results, and usually the process is carried out at a reaction temperature of from about 4 to about 30 ° C and a reaction time of from about 10 to about 60 minutes. Although the adsorption procedure can be repeated several times if necessary, each time with a fresh load of absorbent material, a single operation is usually sufficient. Using this procedure, lipids and most non-lipid substances can be successfully divided into two immiscible phases, while egg yolk antibodies can also be absorbed.
В зависимости от способности выбранного абсорбента улавливать иммуноглобулины, антитела яичного желтка могут быть выделены либо из элюата, полученного при элюции стационарной фазы, либо из "пропускаемого раствора" (термин, который, как используют в данном контексте, предназначен для обозначения раствора, проходящего через стационарную фазу). Как показано в предпочтительных вариантах осуществления, приведенных в тексте, антитела яичного желтка присутствуют главным образом в стационарной фазе при использовании вспененного кремнзема или диоксида кремния в качестве абсорбента, тогда как при использовании диатомовой земли больше, чем приблизительно 60% антител находится в пропускаемом растворе.Depending on the ability of the chosen absorbent to capture immunoglobulins, egg yolk antibodies can be isolated either from the eluate obtained by elution of the stationary phase, or from a "pass solution" (the term used in this context is intended to mean a solution passing through a stationary phase). As shown in the preferred embodiments provided herein, egg yolk antibodies are mainly present in the stationary phase using foamed silica or silica as an absorbent, while when using diatomaceous earth, more than about 60% of the antibodies are in a passable solution.
Выбор определенного способа получения антител яичного желтка может определяться компетентным специалистом. Как правило, антитела яичного желтка получают в водной фракции путем пропускания буфера через не растворимый в воде незаряженный абсорбент, при этом в данном изобретении может быть использован буфер с рН ниже приблизительно 4 или выше приблизительно 8 или содержащий разобщающий агент для получения антител яичного желтка из стационарной фазы без существенной диссоциации липидных субстанций из стационарной фазы так, что образуется элюат, содержащий антитело.The choice of a particular method for producing egg yolk antibodies may be determined by a competent person. Typically, egg yolk antibodies are obtained in the aqueous fraction by passing a buffer through a water-insoluble, non-charged absorbent, and a buffer with a pH below about 4 or above about 8 or containing a release agent to produce egg yolk antibodies from a stationary can be used in this invention phase without significant dissociation of lipid substances from the stationary phase so that an eluate containing the antibody is formed.
Как используют в данном контексте, термин "элюат" относится к раствору, содержащему желательные субстанции, отделенные элюентом от стационарной фазы. Термин "разобщающий агент" или "хаотроп" относится к химическому агенту, способному вызывать конформационное изменение в молекуле белка, такой как молекула антитела, который вследствие этого зачастую известен как денатуратор белка. Согласно изобретению большинство из связанных антител можно успешно элюировать любым нейтральным буфером, содержащим среднюю концентрацию (больше 1М) разобщающего агента. В большинстве случаев при удалении хаотропа после элюции нативная структура белка восстанавливается.As used in this context, the term "eluate" refers to a solution containing the desired substance, separated by an eluent from the stationary phase. The term “uncoupling agent” or “chaotropic” refers to a chemical agent capable of causing a conformational change in a protein molecule, such as an antibody molecule, which is therefore often known as a protein denaturant. According to the invention, most of the bound antibodies can be successfully eluted with any neutral buffer containing an average concentration (greater than 1 M) of uncoupling agent. In most cases, when the chaotrop is removed after elution, the native protein structure is restored.
Пригодный буфер включает в себя, без ограничения перечисленным, 0,1 М глицин-HCl, рН 2,3; 0,1 М глицин-HCl, рН 10,0; 3 М - 6 М гуанидин-HCl, рН 3,0; 3,0 М хлорид калия; 5 М иодид калия; 3,5 М хлорид магния; 1-3 М тиоцианат аммония/натрия/калия и 6 М мочевину. Однако в плане активности выделенных антител более подходящим для реализации изобретения является буфер средней ионной силы, содержащий хаотроп и имеющий нейтральное значение рН, такой как 3 М тиоцианат натрия, забуференный в 20 мМ буфере MES (рН 5,8) или 20 мМ Трис(гидроксиметил)аминометане (рН 7,5). Активное состояние собранных антител можно легко восстановить, например, обширным диализом против слабокислого буфера низкой ионной силы, не содержащего хаотроп.A suitable buffer includes, but is not limited to, 0.1 M glycine-HCl, pH 2.3; 0.1 M glycine-HCl, pH 10.0; 3 M - 6 M guanidine-HCl, pH 3.0; 3.0 M potassium chloride; 5 M potassium iodide; 3.5 M magnesium chloride; 1-3 M ammonium / sodium / potassium thiocyanate and 6 M urea. However, in terms of the activity of the isolated antibodies, a medium ion strength buffer containing a chaotropic and having a neutral pH value such as 3 M sodium thiocyanate buffered in 20 mM MES buffer (pH 5.8) or 20 mM Tris (hydroxymethyl) is more suitable for implementing the invention. ) aminomethane (pH 7.5). The active state of the collected antibodies can be easily restored, for example, by extensive dialysis against a weakly acidic buffer of low ionic strength that does not contain chaotropic.
Согласно одному из аспектов данного изобретения водная фракция, включающая в себя элюат или пропускаемый раствор, который обогащен антителами, может быть впоследствии подвергнута процедуре дифференцированного высаливания с целью разделения изоформ антитела яичного желтка.According to one aspect of the present invention, an aqueous fraction comprising an eluate or a pass solution that is enriched with antibodies can subsequently be subjected to a differential salting out procedure to separate egg yolk antibody isoforms.
Термин "высаливание", как используют в данном контексте, имеет свое обычное значение в области белковой химии и относится к добавлению неденатурирующей соли или солей к смеси или порции продукта реакции с целью снижения растворимости белков, что приводит к осаждению или коагуляции белков. Термин "дифференцированное высаливание" означает процесс высаливания, при котором происходит дифференцированное осаждение или коагуляция двух или более белков из смеси путем изменения концентрации добавляемой соли или солей. В данном изобретении белки, предназначенные для дифференцированного осаждения, представляют собой изоформы антител яичного белка, т.е. IgY и IgY(ΔFc). Примеры неденатурирующих солей, применяемых для осаждения антител яичного желтка, включают в себя, без ограничения перечисленным, NaCl, Na2SO4, (NH4)2SO4, KCl, CaCl2 и MgSO4. Предпочтительно, когда неденатурирующая соль представлена Na2SO4 или (NH4)2SO4, и (NH4)2SO4 является наиболее предпочтительной. Концентрация соли для дифференцированного осаждения изоформ антитела яичного белка зависит от типа соли и может быть определена компетентным специалистом путем простых экспериментов. Согласно предпочтительному варианту осуществления данного изобретения, в котором используют (NH4)2SO4. сначала высаливают IgY при концентрации, лежащей в интервале от приблизительно 15% (мас./об.) до приблизительно 24% (мас./об.), и которая предпочтительно является равной или более низкой, чем приблизительно 21% (мас./об.) от обрабатываемого объема водной фракции, тогда как IgY(ΔFc) осаждается при концентрации соли, лежащей в интервале от приблизительно 25% (мас./об.) до приблизительно 40% (мас./об.), и которая предпочтительно составляет приблизительно 31% (мас./об.) от обрабатываемого объема водной фракции. Для специалиста будет понятно, что последовательность осаждения двух изоформ антитела также могла бы меняться в зависимости от выбранной соли. Комбинированное использование двух или более солей в данной процедуре, например, вначале осаждение первой изоформы одной солью с последующим осаждением второй изоформы другой солью, также является возможным. Процедура дифференцированного высаливания в соответствии с данным изобретением в значительной степени способствует достижению главной цели данного изобретения, т.е. необходимого селективного разделения желаемого IgY, содержащего антитела IgY и IgY(ΔFc), из целой популяции антител яичного желтка, содержащей как IgY, так и IgY(ΔFc).The term "salting out," as used in this context, has its usual meaning in the field of protein chemistry and refers to the addition of a non-denaturing salt or salts to a mixture or portion of the reaction product in order to reduce the solubility of proteins, which leads to precipitation or coagulation of proteins. The term "differential salting out" means a salting out process in which the differential precipitation or coagulation of two or more proteins from a mixture occurs by changing the concentration of the added salt or salts. In the present invention, proteins intended for differential precipitation are isoforms of egg white antibodies, i.e. IgY and IgY (ΔFc). Examples of non-denaturing salts used to precipitate egg yolk antibodies include, but are not limited to, NaCl, Na 2 SO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , KCl, CaCl 2, and MgSO 4 . Preferably, the non-denaturing salt is Na 2 SO 4 or (NH 4 ) 2 SO 4 , and (NH 4 ) 2 SO 4 is most preferred. The salt concentration for the differential precipitation of egg protein antibody isoforms depends on the type of salt and can be determined by a competent person through simple experiments. According to a preferred embodiment of the present invention, in which (NH 4 ) 2 SO 4 is used . IgY is first salted out at a concentration ranging from about 15% (w / v) to about 24% (w / v), and which is preferably equal to or lower than about 21% (w / v) .) from the treated volume of the aqueous fraction, whereas IgY (ΔFc) precipitates at a salt concentration in the range from about 25% (w / v) to about 40% (w / v), and which is preferably approximately 31% (w / v) of the treated volume of the aqueous fraction. It will be understood by one skilled in the art that the sequence of precipitation of two antibody isoforms could also vary depending on the salt selected. The combined use of two or more salts in this procedure, for example, first precipitating the first isoform with one salt and then precipitating the second isoform with another salt, is also possible. The differential salting out procedure in accordance with this invention greatly contributes to the achievement of the main objective of this invention, i.e. the necessary selective separation of the desired IgY containing IgY and IgY antibodies (ΔFc) from a whole population of egg yolk antibodies containing both IgY and IgY (ΔFc).
Если желательно получение антител более высокой чистоты, осажденные антитела можно повторно растворить в подходящей буферной системе и подвергнуть дополнительным процедурам очистки, таким как вытеснительная хроматография, хроматография на основе гидрофобного взаимодействия, ионообменная хроматография и иммуноаффинная хроматография.If higher purity antibodies are desired, precipitated antibodies can be redissolved in a suitable buffer system and subjected to additional purification procedures such as size exclusion chromatography, hydrophobic interaction chromatography, ion exchange chromatography and immunoaffinity chromatography.
Как используют в данном контексте, термин "иммуноаффинная очистка" или "иммуноаффинная хроматография" относится к типу методов разделения, базирующихся на характеристиках связывания антител со специфическим антигеном. Это означает, что антитела, которые связываются со специфическим антигеном, в определенных условиях отделяют от несвязанных антител при данных условиях. Данное изобретение предусматривает применение иммуноаффинной очистки с целью удаления посторонних белков, в частности, не связывающего антиген иммуноглобулина.As used in this context, the term "immunoaffinity purification" or "immunoaffinity chromatography" refers to a type of separation methods based on the characteristics of binding of antibodies to a specific antigen. This means that antibodies that bind to a specific antigen are, under certain conditions, separated from unbound antibodies under given conditions. The present invention provides for the use of immunoaffinity purification in order to remove foreign proteins, in particular, non-binding immunoglobulin antigen.
Согласно данному изобретению иммуноаффинную очистку проводят с использованием "антигенного носителя", содержащего антиген, иммобилизованный на нерастворимой основе. Тип основы не является решающим для иммуноаффинной очистки, соответствующей изобретению. Подходящим является любой обычный материал основы, пригодный для ковалентного присоединения антигена и инертный в плане взаимодействия между желаемым антителом и иммобилизованным на нем антигеном. Обычно основу делают из перекрестно-сшитой агарозы или перекрестно-сшитого декстрана, например, CNBr-активированная сефароза 4В, поставляемая в продажу фирмой Pharmacia.According to the present invention, immunoaffinity purification is carried out using an “antigenic carrier” containing an antigen immobilized on an insoluble basis. The type of base is not critical for immunoaffinity purification according to the invention. Any conventional base material suitable for covalently attaching an antigen and inert in terms of the interaction between the desired antibody and the antigen immobilized on it is suitable. Typically, the base is made from cross-linked agarose or cross-linked dextran, for example, CNBr-activated Sepharose 4B sold by Pharmacia.
Антитела, очищенные посредством дифференцированного высаливания, растворяют в "связывающем буфере" и наносят на носитель с антигеном так, что образуются иммунокомплексы иммобилизованного антигена и антител яичного желтка. В данном изобретении используют буферную систему, инертную в отношении взаимодействия антигена и антитела и эффективную для поддержания желательных условий связывания. Предпочтительно, когда связывающий буфер выбирают из группы, состоящей из фосфатного буфера, буфера на основе MES (2-[N-морфолино]этансульфоновой кислоты) и бис-Трис-буфера, среди которых буфер MES в концентрации 20 мМ является наиболее предпочтительным.Antibodies purified by differential salting out are dissolved in a “binding buffer” and applied to a carrier with antigen so that immunocomplexes of immobilized antigen and egg yolk antibodies are formed. The present invention uses a buffer system that is inert with respect to the interaction of antigen and antibody and effective to maintain the desired binding conditions. Preferably, the binding buffer is selected from the group consisting of a phosphate buffer, a buffer based on MES (2- [N-morpholino] ethanesulfonic acid) and a bis-Tris buffer, among which a 20 mM MES buffer is most preferred.
Предпочтительно, когда иммуноаффинную очистку проводят в среде слабой кислоты при низкой ионной силе, т.е. при значении рН, лежащем в интервале от приблизительно 4 до приблизительно 7 и при ионной силе ниже, чем приблизительно 50 мМ. Более предпочтительно, когда антителам позволяют взаимодействовать с иммобилизованным антигеном при значении рН, лежащем в интервале от приблизительно 5 до приблизительно 6 и наиболее предпочтительно в интервале от приблизительно 5,6 до приблизительно 5,8. Антитела яичного желтка можно диссоциировать с носителя, содержащего антиген, с помощью разобщающей (хаотропной) соли или при рН ниже, чем приблизительно 4 или выше, чем приблизительно 8. Активность собранных антител может быть восстановлена, например, путем обширного диализа против слабокислого буфера низкой ионной силы, не содержащего хаотроп.Preferably, the immunoaffinity purification is carried out in a weak acid medium at low ionic strength, i.e. at a pH ranging from about 4 to about 7 and with an ionic strength lower than about 50 mM. More preferably, the antibodies are allowed to interact with the immobilized antigen at a pH in the range of from about 5 to about 6, and most preferably in the range of from about 5.6 to about 5.8. Egg yolk antibodies can be dissociated from a carrier containing the antigen using a decoupling (chaotropic) salt or at a pH lower than about 4 or higher than about 8. The activity of the collected antibodies can be restored, for example, by extensive dialysis against a weakly acidic low-ionic buffer chaotropic-free force.
IgY(ΔFc), очищенные согласно способу, соответствующему изобретению, не активируют систему комплемента и не связываются с ревматоидным фактором сыворотки млекопитающих. Иммунологическая перекрестная реактивность между (IgGΔFc) и IgG млекопитающих является незначительной. Таким образом, изобретение представляет также новый тип антитела, пригодный для применения в клинических и исследовательских целях.IgY (ΔFc), purified according to the method of the invention, do not activate the complement system and do not bind to mammalian serum rheumatoid factor. Immunological cross-reactivity between (IgGΔFc) and mammalian IgG is negligible. Thus, the invention also provides a new type of antibody suitable for use in clinical and research purposes.
Изобретение представляет также широкий круг применения для клинических и исследовательских нужд антител IgY, приготовленных согласно изобретению.The invention also provides a wide range of uses for clinical and research needs of IgY antibodies prepared according to the invention.
Например, данное изобретение представляет фармацевтическую композицию для лечения или профилактики пациентов животных (включая домашнюю птицу, скот и домашних животных типа друзей) или человека, содержащую терапевтическое количество антитела IgY, соответствующего данному изобретению, для их защиты или профилактики у них различных этиологических агентов, включая микроорганизмы, такие как бактерии, нативные, рекомбинантные или пептидные синтетические вирусы, грибы, простейшие, нематоды и т.п., а также белковые и небелковые субстанции, такие как нативные, рекомбинантные или пептидные синтетические аллергены, токсины, яды, гормоны и любые другие иммуногены, способные вызывать иммунный ответ. Предпочтительно, когда очищенные антитела IgY применяют в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как вода, физиологический раствор и т.п. Фармацевтическая композиция может быть доставлена путями, содержащими пероральную доставку, инъекцию, наружное применение и иммунизирующее лечение.For example, the invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prophylaxis of animal patients (including poultry, livestock and companion animals such as friends) or humans, containing a therapeutic amount of an IgY antibody of the invention, for protecting or preventing various etiological agents, including microorganisms, such as bacteria, native, recombinant or peptide synthetic viruses, fungi, protozoa, nematodes, etc., as well as protein and non-protein substances, as native, recombinant or peptide synthetic allergens, toxins, poisons, hormones and any other immunogens that can cause an immune response. Preferably, the purified IgY antibodies are used in combination with a pharmaceutically acceptable carrier such as water, saline and the like. The pharmaceutical composition can be delivered by routes containing oral delivery, injection, external use and immunizing treatment.
Антитело IgY, соответствующее данному изобретению, используют также для детекции представляющего интерес этиологического агента, включая, например, патогенный или непатогеный организм, такой как Escherichia coli, Salmonella enterititis и другие бактериальные организмы, нативный, рекомбинантный или пептидный синтетический гормон, такой как эстроген, прогестерон, тироксин и т.п., антиген главного комплекса гистосовместимости и т.п., нативный, рекомбинантный или пептидный синтетический маркер опухоли, такой как α-фетопротеин, простата-специфический антиген и т.п.; маркер болезненного состояния, такой как С-реактивный белок, ферритин и т.п.; накопление или остаток чужеродных материалов, таких как лекарственные препараты Теофиллин и дигоксин, в образце тела, таком как жидкость, ткань, экстракт клеток и т.п., который получают от человека или животного. Для получения антител, специфических только в отношении этиологических агентов, этиологический агент может быть инъецирован уткам в качестве антигенов, с целью индуцирования выработки желаемых антител, где антигены включают в себя природные очищенные антигены, рекомбинантные антигены, пептидные синтетические антигены и плазмидную ДНК. Используя антитело IgY, полученное в соответствии с данным изобретением, представляющий интерес этиологический агент можно качественно или количественно определить с помощью любого традиционного метода, известного в области техники, такого как методы Ouchterlony (МО), метод простой (одномерной) радиальной диффузии (SRID), метод иммуноэлектрофореза (IEP), метод радиоиммуноанализа (RIA), метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), метод вестернблоттинга (WB), метод турбодиметрического иммуноанализа (TIA), метод турбодиметрического иммуноанализа с латексным усилением, иммуноферментный анализ, нефелометрический иммуноанализ, хемолюминесцентный иммуноанализ, иммуноанализ с использованием золота или иммунохроматографический анализ.The IgY antibody of the invention is also used to detect an etiological agent of interest, including, for example, a pathogenic or non-pathogenic organism, such as Escherichia coli, Salmonella enterititis and other bacterial organisms, native, recombinant or peptide synthetic hormone, such as estrogen, progesterone , thyroxine and the like, a major histocompatibility complex antigen and the like, a native, recombinant or peptide synthetic tumor marker, such as α-fetoprotein, prostate-specific antigen and etc .; a marker of a disease state such as C-reactive protein, ferritin, and the like; the accumulation or residue of foreign materials, such as theophylline and digoxin drugs, in a body sample, such as a liquid, tissue, cell extract, and the like, which is obtained from a human or animal. To produce antibodies specific for etiological agents only, the etiological agent can be injected into ducks as antigens, with the goal of inducing the production of the desired antibodies, where the antigens include naturally purified antigens, recombinant antigens, peptide synthetic antigens and plasmid DNA. Using an IgY antibody obtained in accordance with this invention, an etiological agent of interest can be qualitatively or quantitatively determined using any conventional method known in the art, such as Ouchterlony (MO) methods, simple (one-dimensional) radial diffusion (SRID) methods, immunoelectrophoresis (IEP) method, radioimmunoassay method (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blot analysis (WB), turbodimetric immunoassay (TIA), turbodimetric immunoassay with latex amplification, enzyme immunoassay, nephelometric immunoassay, chemoluminescent immunoassay, immunoassay using gold or immunochromatographic analysis.
Антитело IgY, соответствующее данному изобретению, также адаптировано для применения в биочипах и биосенсорах.The IgY antibody of the invention is also adapted for use in biochips and biosensors.
Следующие Примеры приведены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний данного изобретения.The following Examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the claims of this invention.
Пример 1: Процедура иммунизации для стимуляции выработки специфических антител.Example 1: An immunization procedure to stimulate the production of specific antibodies.
Двенадцать домашних уток (Anas platyrhynchos van domestica) в возрасте 16 недель помещают отдельно для получения антител и яиц. Уткам делают начальную подкожную инъекцию 1-5 мг/мл человеческого С-реактивного белка (CRP; очищен из асцитов человека) в фосфатном буфере, рН 7,5, эмульгированного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Используемая концентрация антигена обычно находится в интервале 1-5 мг/мл. После начальной инъекции молодым уткам делают три дополнительных инъекции 1-5 мг антигена через каждые две недели. Через одну неделю начинают сбор яиц, которые метят и хранят при 4°С до обработки с целью экстракции и очистки антитела. Процедуру бустерной инъекции повторяют каждые четыре недели в течение эксперимента. Образцы крови берут на седьмые сутки после каждой бустерной инъекции. Каждый образец крови центрифугируют и собирают полученную сыворотку.Twelve domestic ducks (Anas platyrhynchos van domestica) at the age of 16 weeks are placed separately to produce antibodies and eggs. The ducks are given an initial subcutaneous injection of 1-5 mg / ml of human C-reactive protein (CRP; purified from human ascites) in phosphate buffer, pH 7.5, emulsified with an equal volume of Freund's complete adjuvant. The antigen concentration used is usually in the range of 1-5 mg / ml. After the initial injection, young ducks receive three additional injections of 1-5 mg of antigen every two weeks. One week later, the collection of eggs begins, which are labeled and stored at 4 ° C until processing to extract and purify the antibody. The booster injection procedure is repeated every four weeks during the experiment. Blood samples are taken on the seventh day after each booster injection. Each blood sample is centrifuged and the resulting serum is collected.
Пример 2: Экстракция антител из желтков утиных яиц.Example 2: Extraction of antibodies from the yolks of duck eggs.
Желтки, собранные из яиц, снесенных гипериммунизированными утками, соответствующими Примеру 1, тщательно промывают слабой струей дистиллированной воды для удаления таким образом альбумина. Объем яичного желтка измеряют, а затем тщательно перемешивают с дистиллированной водой в количестве, которое в десять раз превышает измеренный объем яичного желтка. Затем смесь выдерживают в течение по меньшей мере двух часов при 4°С с последующим центрифугированием при 10000 об/мин на центрифуге Hitachi CR-22F в течение одного часа. В пробирках центрифуги образуется бледный слой супернатанта и полутвердый подвижный слой.The yolks collected from eggs laid by hyperimmunized ducks corresponding to Example 1 are thoroughly washed with a weak stream of distilled water to thereby remove albumin. The volume of the egg yolk is measured, and then thoroughly mixed with distilled water in an amount that is ten times the measured volume of the egg yolk. The mixture is then kept for at least two hours at 4 ° C, followed by centrifugation at 10,000 rpm on a Hitachi CR-22F centrifuge for one hour. A pale supernatant layer and a semi-solid moving layer are formed in centrifuge tubes.
Пример 3: Обработка абсорбентами.Example 3: Treatment with absorbents.
К неочищенному экстракту, приготовленному в Примере 2, добавляют один из абсорбентов: 2% (мас./об.) вспененного кремнезема (приобретенного в фирме Sigma), 3% (мас./об.) диоксида кремния (Sigma), 3% (мас./об.) Celite diatomite (приобретенного в фирме Celite Corporation), и 3 или 5% (мас./об.) Celite diatomite hyflo-Cel (Celite Corporation). Полученные суспензии инкубируют при 4°С в течение 60 минут при осторожном перемешивании. После завершения инкубирования абсорбенты осаждают при 4°С и 20000 об./мин на центрифуге Hitachi CR-22F и раздельно собирают супернатанты и осадки. Образцы по 10 мкл, взятые из каждого супернатанта, подвергают невосстанавливающему гель-электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).One of the absorbents is added to the crude extract prepared in Example 2: 2% (w / v) foamed silica (purchased from Sigma), 3% (w / v) silica (Sigma), 3% ( w / v) Celite diatomite (purchased from Celite Corporation), and 3 or 5% (w / v) Celite diatomite hyflo-Cel (Celite Corporation). The resulting suspensions are incubated at 4 ° C for 60 minutes with gentle stirring. After incubation is complete, absorbents are precipitated at 4 ° C and 20,000 rpm on a Hitachi CR-22F centrifuge and the supernatants and sediments are separately collected. Samples of 10 μl, taken from each supernatant, are subjected to non-reducing gel electrophoresis in polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE).
Как показано на Фиг.1, в плане количества антител, поглощенных абсорбентами, вспененный кремнезем обладает наилучшей адсорбирующей активностью, и в проходящем через него растворе почти не остается антител.As shown in figure 1, in terms of the number of antibodies absorbed by absorbents, foamed silica has the best adsorbing activity, and almost no antibodies remain in the solution passing through it.
Диоксид кремния проявляет несколько более слабую аффинность к иммуноглобулинам, которая, возможно, обусловлена его более низкой пористостью (и таким образом уменьшенной площадью поверхности), чем у вспененного кремнезема. С другой стороны, диатомовые земли любого типа захватывают меньше, чем 10% антител яичного желтка.Silicon dioxide exhibits a slightly weaker affinity for immunoglobulins, which is probably due to its lower porosity (and thus reduced surface area) than foamed silica. On the other hand, diatomaceous earths of any type capture less than 10% of the egg yolk antibodies.
Пример 4: Дифференцированное высаливание антител яичного желтка.Example 4: Differentiated salting out of egg yolk antibodies.
Осадок вспененного кремнезема, полученный в Примере 3, обрабатывают 2,5 М тиоцианатом натрия (рН 7,5), с целью элюции связанных с ним антител. Полученный элюат сначала осаждают сульфатом аммония в концентрации приблизительно 21% (мас./об.) от объема элюата с последующим вторым осаждением путем добавления сульфата аммония до приблизительно 31% (мас./об.). Осажденные продукты антител повторно растворяют в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Аналитический SDS-PAGE проводят через 8% невосстанавливающий акриламидный гель, нагруженный 2237 мкг неочищенного экстракта, соответствующего Примеру 2 (дорожка 1), 10 мкл проведенного через абсорбент раствора, собранного в Примере 3 (дорожка 2), 1122,25 мкг элюата, полученного из осадка вспененного кремнезема (дорожка 3), и 153 мкг и 372,85 мкг продуктов антител, полученных на первой и второй стадиях осаждения (дорожка 4 и дорожка 5 соответственно). Результат показан на Фиг.2. Процент выделения и чистоту определяют путем сканирующей денситометрии геля и суммируют в Таблице 1.The foamed silica precipitate obtained in Example 3 was treated with 2.5 M sodium thiocyanate (pH 7.5) to elute the antibodies bound thereto. The resulting eluate is first precipitated with ammonium sulfate at a concentration of about 21% (w / v) of the volume of the eluate, followed by a second precipitation by adding ammonium sulfate to about 31% (w / v). Precipitated antibody products are redissolved in phosphate buffered saline (PBS). Analytical SDS-PAGE was performed through an 8% non-reducing acrylamide gel loaded with 2237 μg of the crude extract corresponding to Example 2 (lane 1), 10 μl of the solution taken through the absorbent collected in Example 3 (lane 2), 1122.25 μg of the eluate obtained from sediment foamed silica (lane 3), and 153 μg and 372.85 μg of antibody products obtained in the first and second stages of deposition (
Как показано в Таблице 1, полученные в результате антитела IgY(ΔFc) выделяют с выходом приблизительно 76% (72,05 мг/119,86 мг × 100%) при чистоте более 96%. Более важно то, что данная схема очистки является перспективной для существенного разделения желаемых антител IgY(ΔFc) из целой популяции антител яичного желтка, состоящей главным образом из обоих антител, IgY и IgY(ΔFc).As shown in Table 1, the resulting IgY antibodies (ΔFc) were isolated in approximately 76% yield (72.05 mg / 119.86 mg × 100%) with a purity of more than 96%. More importantly, this purification scheme is promising for a substantial separation of the desired IgY antibodies (ΔFc) from a whole population of egg yolk antibodies, consisting mainly of both antibodies, IgY and IgY (ΔFc).
Пример 5: IgY(ΔFc). частично очищенные с использованием Celite Diatomite.Example 5: IgY (ΔFc). partially peeled using Celite Diatomite.
Учитывая преимущество диатомовой земли в плане способности притягивать липиды и отталкивать антитела, неочищенный экстракт, приготовленный в Примере 2, выливают в фильтрационную колонку, наполненную 10 мас.% Celite diatomite от объема выливаемого экстракта. Раствор, проходящий через колонку, собирают и подвергают первому осаждению 21% (мас./об.) сульфатом аммония от объема потока, прошедшего через колонку. Осажденные антитела собирают, а супернатант делят на две части. Одну часть супернатанта осаждают сульфатом аммония в концентрации приблизительно 31% (мас./об.), тогда как другую часть осаждают 16% (мас./об.) сульфата натрия. Осажденные продукты антител повторно растворяют в PBS. Аналитический SDS-PAGE проводят через 8% невосстанавливающий акриламидный гель, нагруженный 2012,5 мкг неочищенного экстракта, соответствующего Примеру 2 (дорожка 1), 1678 мкг раствора, собранного после фильтрации через Celite diatomite (дорожка 2), 94,9 мкг элюата, полученного на первой стадии осаждения (дорожка 3) и 169,65 мкг и 357,75 мкг продуктов антител, полученных на второй стадии осаждения 31%-ным сульфатом аммония и 16%-ным сульфатом натрия (дорожки 4-5). Результат представлен на Фиг.3. Процент выделения и чистоту определяют путем сканирующей денситометрии геля и суммируют в Таблице 2.Given the advantage of diatomaceous earth in terms of its ability to attract lipids and repel antibodies, the crude extract prepared in Example 2 is poured into a filter column filled with 10 wt.% Celite diatomite from the volume of the poured extract. The solution passing through the column is collected and subjected to a first precipitation of 21% (w / v) ammonium sulfate of the volume of the stream passing through the column. Precipitated antibodies are collected, and the supernatant is divided into two parts. One part of the supernatant is precipitated with ammonium sulfate at a concentration of approximately 31% (w / v), while the other part is precipitated with 16% (w / v) sodium sulfate. Precipitated antibody products are redissolved in PBS. Analytical SDS-PAGE was performed through an 8% non-reducing acrylamide gel loaded with 2012.5 μg of the crude extract corresponding to Example 2 (lane 1), 1678 μg of the solution collected after filtration through Celite diatomite (lane 2), 94.9 μg of the eluate obtained in the first stage of precipitation (lane 3) and 169.65 μg and 357.75 μg of antibody products obtained in the second stage of precipitation with 31% ammonium sulfate and 16% sodium sulfate (lanes 4-5). The result is shown in FIG. 3. The percent isolation and purity are determined by scanning densitometry of the gel and are summarized in Table 2.
Как показано в Таблице 2, полученные в результате антитела IgY(ΔFc) выделяют с чистотой приблизительно 77% (при использовании сульфата натрия на второй стадии осаждения) и 69% (при использовании сульфата аммония на второй стадии осаждения), соответственно, при высоких выходах.As shown in Table 2, the resulting IgY antibodies (ΔFc) are isolated with a purity of approximately 77% (when using sodium sulfate in the second stage of precipitation) and 69% (when using ammonium sulfate in the second stage of precipitation), respectively, in high yields.
Пример 6: Иммуноаффинная очистка антител яичного желтка.Example 6: Immunoaffinity purification of egg yolk antibodies.
Раствор С-реактивного белка (CRP) готовят в 0,1 М карбонатном буфере, рН 8,5 в концентрации 5 мг/мл. CNBr-активированную сефарозу 4В, приобретенную в фирме Pharmacia, изначально промывают 1 мМ холодной HCl, взятой в количестве 10 объемов носителя, и проводят реакцию с раствором CRP, взятом в количестве двух объемов носителя, при 4°С в течение ночи. Носитель с антигеном суспендируют в растворе 0,5 М этаноламина в 20 мМ Трис-HCl (рН 8,5) в соотношении 1:1 (об/об) в течение 2 часов при 4°С, чтобы блокировать оставшиеся реакционные в отношении белка центры. Носитель с антигеном промывают PBS, содержащим 0,02% азида натрия, и хранят при 4°С.A solution of C-reactive protein (CRP) is prepared in 0.1 M carbonate buffer, pH 8.5 at a concentration of 5 mg / ml. The CNBr-activated Sepharose 4B purchased from Pharmacia was initially washed with 1 mM cold HCl taken in an amount of 10 volumes of a carrier and reacted with a CRP solution taken in an amount of two volumes of a carrier at 4 ° C. overnight. The antigen carrier is suspended in a solution of 0.5 M ethanolamine in 20 mM Tris-HCl (pH 8.5) in a 1: 1 ratio (v / v) for 2 hours at 4 ° C to block the remaining protein-reactive centers . The antigen carrier is washed with PBS containing 0.02% sodium azide and stored at 4 ° C.
Используют утиные антитела, осажденные 21% (мас./об.) сульфата аммония в Примере 4, и носитель с антигеном, приготовленный, как указано выше. Один мл носителя с антигеном упаковывают в обычную колонку и пропитывают 20 мМ буфера MES (2-[N-морфолино]этансульфоновая кислота) (рН 5,8). Проводят реакцию носителя с антигеном и 0,25 мл антител, приготовленных в таком же буфере для связывания. Носитель с антигеном промывают буфером для связывания до тех пор, пока вытекающий раствор не станет практически свободным от белка. Связанные антитела немедленно элюируют 6 М гуанидином-HCl и измеряют их оптическую плотность при 280 нм после завершения диализа. Результат анализа SDS-PAGE, приведенный на Фиг.4, показывает, что аффинно очищенные антитела состоят в основном из антитела IgY(ΔFc), которое представлено одной полосой в геле.Use duck antibodies precipitated with 21% (w / v) ammonium sulfate in Example 4, and an antigen carrier prepared as described above. One ml of antigen carrier is packaged in a conventional column and soaked in 20 mM MES buffer (2- [N-morpholino] ethanesulfonic acid) (pH 5.8). Carrier is reacted with antigen and 0.25 ml of antibodies prepared in the same binding buffer. The antigen carrier is washed with binding buffer until the effluent is substantially protein free. Bound antibodies immediately elute with 6 M guanidine-HCl and measure their optical density at 280 nm after completion of dialysis. The result of the SDS-PAGE analysis shown in FIG. 4 shows that the affinity purified antibodies consist mainly of an IgY antibody (ΔFc), which is represented by a single band in the gel.
Все патенты и ссылки на литературные источники, приведенные в данном описании, включены в него таким образом в виде ссылки во всей их полноте. В случае конфликта данное описание, включая определения, будет учитываться в первую очередь. Хотя варианты осуществления данного изобретения были проиллюстрированы и описаны, компетентными специалистами в данной области могут быть сделаны различные модификации и усовершенствования. Варианты осуществления данного изобретения вследствие этого описаны в плане иллюстрации, но не в целях ограничения. Предусмотрено, что данное изобретение не ограничено определенными формами, как оно проиллюстрировано, и все модификации, не выходящие за рамки сущности и объема притязаний, входят в объем притязаний, определенный в прилагаемых пунктах формулы изобретения.All patents and references to literature cited in this specification are hereby incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, this description, including definitions, will be taken into account first. Although embodiments of the present invention have been illustrated and described, various modifications and improvements can be made by those skilled in the art. Embodiments of the present invention are therefore described in terms of illustration, but not for purposes of limitation. It is envisaged that this invention is not limited to certain forms, as it is illustrated, and all modifications that do not go beyond the essence and scope of claims are included in the scope of claims defined in the attached claims.
Claims (23)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002115256/13A RU2304587C2 (en) | 2002-06-10 | 2002-06-10 | METHOD FOR SELECTIVE ISOLATION OF IgV ANTIBODIES FROM ANSERES ORDER BIRD EGG YOLK (VARIANTS) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002115256/13A RU2304587C2 (en) | 2002-06-10 | 2002-06-10 | METHOD FOR SELECTIVE ISOLATION OF IgV ANTIBODIES FROM ANSERES ORDER BIRD EGG YOLK (VARIANTS) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002115256A RU2002115256A (en) | 2003-12-27 |
| RU2304587C2 true RU2304587C2 (en) | 2007-08-20 |
Family
ID=38512047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002115256/13A RU2304587C2 (en) | 2002-06-10 | 2002-06-10 | METHOD FOR SELECTIVE ISOLATION OF IgV ANTIBODIES FROM ANSERES ORDER BIRD EGG YOLK (VARIANTS) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2304587C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520838C2 (en) * | 2008-10-20 | 2014-06-27 | Эббви Инк | Separation and purification of antibodies with application of protein a-based affinity chromatography |
| US12022847B2 (en) | 2018-06-24 | 2024-07-02 | Michael Foods, Inc. | Methods of egg yolk fractionation |
-
2002
- 2002-06-10 RU RU2002115256/13A patent/RU2304587C2/en active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520838C2 (en) * | 2008-10-20 | 2014-06-27 | Эббви Инк | Separation and purification of antibodies with application of protein a-based affinity chromatography |
| US12022847B2 (en) | 2018-06-24 | 2024-07-02 | Michael Foods, Inc. | Methods of egg yolk fractionation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6680376B2 (en) | Process for selectively isolating avian immunoglobulins | |
| US5420253A (en) | Method for purifying egg yolk immunoglobulins | |
| US8173783B2 (en) | Process for selectively isolating IgY antibodies from egg yolk of an anseriform bird and IgY antibodies obtained thereby | |
| US6608172B1 (en) | Isolation of IgY (ΔFc) antibodies | |
| EP1371665B1 (en) | Process for selectively isolating IgY antibodies from egg yolk of an anseriform bird | |
| US5605691A (en) | Immunologically active proteins from inclusion bodies | |
| FI60875B (en) | PROOF OF SOLUTION WITHOUT VIDEO RENING AV PLACENTASPECIFIKT PP5 GLYCOPROTEIN | |
| EP0211001A1 (en) | Liver fluke antigens. | |
| RU2304587C2 (en) | METHOD FOR SELECTIVE ISOLATION OF IgV ANTIBODIES FROM ANSERES ORDER BIRD EGG YOLK (VARIANTS) | |
| JP3689888B2 (en) | Method for selectively separating lgY and lgY (ΔFc) antibody isoforms from egg yolk | |
| JP3610551B2 (en) | Production of IgY (ΔFc) antibody and use thereof | |
| CN100355785C (en) | Process for selectively separating IgY antibody from anseriforme birds eggs and IgY antibody produced therefrom | |
| KR100924523B1 (en) | Process for selectively isolating ??? antibodies from egg yolk of an anseriform bird and ??? antibodies obtained thereby | |
| AU784900B2 (en) | Process for selectively isolating IgY antibodies from egg yolk of an anseriform bird and IgY antibodies obtained thereby | |
| JP3747322B2 (en) | A method of selectively separating antibody isoforms from egg yolk. | |
| CA2389897C (en) | Process for selectively isolating igy antibodies from egg yolk of an anseriform bird and igy antibodies obtained thereby | |
| IL150194A (en) | PROCESS FOR SELECTIVELY ISOLATING IgY ANTIBODIES FROM EGG YOLK OF AN ANSERIFORM BIRD AND IgY ANTIBODIES OBTAINED THEREBY | |
| NZ519506A (en) | Process for selectively isolating IGY antibodies from egg yolk of an anseriform bird by adsorption chromatography and salting each method separately or combination of | |
| DE10065227A1 (en) | Separating antibody isotypes from egg yolk, useful for immunization and immunoassay, comprises fractional salting out from aqueous yolk fraction | |
| BRPI0203246B1 (en) | A process for selectively isolating egg yolk igy antibodies from an anseriform bird and obtained igy antibodies | |
| CA2171317C (en) | Method for purifying egg yolk immunoglobulins | |
| TW587941B (en) | Manufacture of IgY(DeltaFc) antibodies and uses thereof | |
| JPH08127600A (en) | Antibody against protein a and its production | |
| US20030158391A1 (en) | Anitbodies and method for producing same, the use thereof and immunisation cocktails, immunoassays-sets and peptides | |
| Cohen | Physiochemical and immunological studies on subunits of antibody molecules. |