RU2304166C2 - METHOD FOR PRODUCTION OF L-THREONINE USING BACTERIUM BELONGING TO GENUS Escherichia WITH INACTIVATED itaE GENE - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to method for production of L-threonine using bacterium belonging to genus Escherichia with inactivated ItaE gene.

EFFECT: high effective method for production of L-threonine.

2 cl, 2 dwg, 2 ex

Description

Описание изобретения Область техникиDescription of the invention

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ген ltaE инактивирован.The present invention relates to the microbiological industry, in particular, to a method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family in which the ltaE gene is inactivated.

Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Related Art

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.Traditionally, L-amino acids on an industrial scale can be obtained by fermentation using strains of microorganisms isolated from natural sources, or their mutants, specially modified in order to increase the production of L-amino acids.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см., например, выложенную патентную заявку Японии №56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).Many methods have been described to increase the production of L-amino acids, for example, by transforming a microorganism of recombinant DNA (see, for example, US patent 4,278,765). These methods are based on increasing the activity of enzymes involved in the biosynthesis of amino acids and / or reducing the sensitivity of the target enzyme to reverse inhibition by the produced L-amino acid (see, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 56-18596 (1981), WO 95/16042 or patents U.S. 5661012 and 6040160).

Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации. Это штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (патенты США 5175107; 5661012; 5705371; 5939307; Европейский патент 219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (заявка РСТ 0114525А1, европейская заявка 301572А2, патент США 5661012), штаммы, устойчивые к соединениям, таким как L-треонин и его аналоги (международная заявка WO 0114525 А1, Европейский патент 301572А2, патент США 5376538), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (патенты США 5175107 и 5661012), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации треонина (патенты США 5939307 и 6297031).Various strains are known to be used for the production of L-threonine by fermentation. These are strains with increased activity of enzymes involved in the biosynthesis of L-threonine (US Pat. Nos. 5,175,107; 5,661,012; 5,705,371; 5,939,307; European Patent 219027), strains resistant to certain chemicals, such as L-threonine and its analogues (PCT application 0114525A1, European application 301572A2, US patent 5661012), strains resistant to compounds such as L-threonine and its analogues (international application WO 0114525 A1, European patent 301572A2, US patent 5376538), strains in which the sensitivity of the target enzyme to the inhibition of the produced amino acid or its obochnymi products feedback type (U.S. Patents 5,175,107 and 5,661,012), strains with inactivated threonine degradation system enzyme (US patents 5,939,307 and 6,297,031).

Известный штамм-продуцент L-треонина ВКПМ В-3996 (патенты США 5175107 и 5705371) является лучшим на сегодняшний день штаммом-продуцентом L-треонина. Для создания штамма ВКПМ В-3996 несколько мутаций и плазмида, описанная ниже, были введены в родительский штамм Е.coli K-12 (ВКПМ В-7). Мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, который устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген ilvA (мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, которая выражается в пониженном уровне биосинтеза изолейцина и в фенотипе с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что дает положительный эффект на продукцию треонина. Инактивация гена tdh приводит к предотвращению деградации треонина. В указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR). Для увеличения экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, в промежуточный штамм TDH6 была введена плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA442BC. Количество треонина, накопленного в ходе ферментации этого штамма, достигало 85 г/л.Known strain producing L-threonine VKPM B-3996 (US patents 5175107 and 5705371) is the best strain producing L-threonine today. To create the VKPM B-3996 strain, several mutations and the plasmid described below were introduced into the parent E. coli K-12 strain (VKPM B-7). The mutant thrA gene (thrA442 mutation) encodes a protein aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which is resistant to threonine inhibition by feedback. The mutant ilvA gene (ilvA442 mutation) encodes a threonine deaminase protein that has reduced activity, which is expressed in a reduced level of isoleucine biosynthesis and in the leaky-type isoleucine deficient phenotype. In bacteria with the ilvA442 mutation, transcription of the thrABC operon is not repressed by isoleucine, which has a positive effect on threonine production. Inactivation of the tdh gene prevents threonine degradation. The genetic determinant of sucrose assimilation (scrKYABR genes) was introduced into this strain. To increase the expression of genes that control threonine biosynthesis, plasmid pVIC40 containing the thrA442BC mutant threonine operon was introduced into the intermediate strain TDH6. The amount of threonine accumulated during the fermentation of this strain reached 85 g / l.

Ранее авторы настоящего изобретения получили исходя из Е.coli K12 мутант, содержащий мутацию thrR (упоминаемый здесь и далее как rhtA23), придающую устойчивость к высокой концентрации треонина и гомосерина на минимальной питательной среде (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985)). Фенотипически мутация выражается в повышении продукции L-треонина (патент СССР №974817), гомосерина, и глутамата (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561,1991, Европейская патентная заявка 1013765А) соответствующим штаммом-продуцентом Е.coli, таким как штамм ВКПМ-3996. Более того, авторы настоящего изобретения показали, что ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli, рядом с опероном glnHPQ, кодирующим компоненты транспортной системы глутамина, и что ген rhtA идентичен открытой рамке считывания ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА2218541 в GenBank, gi:440181), расположенной между генами рехВ и отрХ. Ген, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Кроме того, было установлено, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении -1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457; Европейская патентная заявка 1013765).Previously, the authors of the present invention obtained, based on E. coli K12, a mutant containing the thrR mutation (referred to hereafter as rhtA23), which confers resistance to high concentrations of threonine and homoserine in a minimal nutrient medium (Astaurova, OB et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985)). Phenotypically, a mutation is expressed in an increase in the production of L-threonine (USSR patent No. 974817), homoserine, and glutamate (Astaurova, OB et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561.1991, European patent application 1013765A) corresponding E. coli producer strain, such as VKPM-3996 strain. Moreover, the authors of the present invention showed that the rhtA gene is located at 18 minutes of the E. coli chromosome, next to the glnHPQ operon encoding the components of the glutamine transport system, and that the rhtA gene is identical to the open reading frame of ORF1 (ybiF gene, nucleotide numbers 764 to 1651 in sequence with accession number AAA2218541 in GenBank, gi: 440181), located between the genes pXB and oprX. The gene expressing the protein encoded by ORF1 was called the rhtA gene (rht: resistance to homoserine and threonine - resistance to homoserin and threonine). In addition, it was found that the rhtA23 mutation is a substitution of A for G position -1 relative to the start of the ATG codon (ABSTRACTS of 17 ^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457; European Patent Application 1013765).

Один из подходов, используемых для повышения накопления L-треонина в питательной среде, - это предотвращение деградации указанной аминокислоты. L-алло-треонинальдолаза (ТА) катализирует один из возможных путей деградации L-треонина (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996, pp.369-370). L-алло-треонинальдолаза, кодируемая геном ltaA, является низкоспецифичной; она может использовать в качестве субстрата как L-треонин, так и L-алло-треонин. Этот фермент нуждается в пиридоксальфосфате в качестве кофактора; также было показано, что указанный фермент чрезвычайно термостабилен и имеет высокую оптимальную температуру. L-алло-треонинальдолаза может также функционировать в альтернативном пути биосинтеза глицина, в том случае, когда основной путь его биосинтеза неактивен (Liu J.Q. et al, Eur J Biochem.,1998, Jul 1; 255(1):220-6). Но в настоящее время нет сообщений, описывающих использование инактивации гена ltaE для получения L-аминокислот.One of the approaches used to increase the accumulation of L-threonine in a nutrient medium is to prevent the degradation of this amino acid. L-allo-threoninaldolase (TA) catalyzes one of the possible pathways for the degradation of L-threonine (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996, pp. 369-370). L-allo-threoninaldolase encoded by the ltaA gene is low specific; it can use both L-threonine and L-allo-threonine as a substrate. This enzyme needs pyridoxalphosphate as a cofactor; it was also shown that this enzyme is extremely thermostable and has a high optimum temperature. L-allo-threoninaldolase may also function in an alternative pathway for glycine biosynthesis when the main pathway for its biosynthesis is inactive (Liu J.Q. et al, Eur J Biochem., 1998, Jul 1; 255 (1): 220-6). But there are currently no reports describing the use of ltaE gene inactivation to produce L-amino acids.

Описание изобретенияDescription of the invention

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислоты с использованием указанных штаммов.The objectives of the present invention are to increase the productivity of strains producing L-amino acids and the provision of a method for producing L-amino acids using these strains.

Данная цель была достигнута путем обнаружения того факта, что инактивация гена ItaE может повысить продукцию L-аминокислоты, такой как L-треонин.This goal was achieved by discovering the fact that inactivation of the ItaE gene can increase the production of L-amino acids, such as L-threonine.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислоты, такой как L-треонин.The present invention provides a bacterium of the Enterobacteriaceae family that is capable of increased production of an amino acid, such as L-threonine.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что активность L-алло-треонинальдолазы уменьшена или полностью отсутствует.The aim of the present invention is the provision of bacteria producing L-amino acids of the Enterobacteriaceae family, wherein said bacterium is modified so that the activity of L-allo-threoninaldolase is reduced or completely absent.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, при этом указанная активность L-алло-треонинальдолазы уменьшена или отсутствует из-за инактивации гена ltaE.An object of the present invention is to provide an L-amino acid producing bacterium of the Enterobacteriaceae family, wherein said L-allo-threoninaldolase activity is reduced or absent due to inactivation of the ltaE gene.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said bacterium belongs to the genus Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанной L-аминокислота является L-треонином.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said L-amino acid is L-threonine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя:Another objective of the present invention is the provision of a method for producing L-amino acids, which includes:

- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и- growing the above bacteria in a nutrient medium for the purpose of production and accumulation of L-amino acids in a nutrient medium, and

- и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.- and the allocation of the specified L-amino acids from the culture fluid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанной L-аминокислотой является L-треонин.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said L-amino acid is L-threonine.

Более детально настоящее изобретение будет описано ниже.In more detail, the present invention will be described below.

1. Бактерия согласно настоящему изобретению.1. The bacterium according to the present invention.

Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия - продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что ген ltaE инактивирован.The bacterium of the present invention is a bacterium producing L-amino acids of the Enterobacteriaceae family, modified in such a way that the ltaE gene is inactivated.

Согласно настоящему изобретению «бактерия - продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-аминокислоты в питательной среде, когда указанная бактерия выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким, как штамм Е.coli К-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л. Термин "L-аминокислоты" включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспартат, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин. Более конкретно L-треонин предпочтителен.According to the present invention, “bacterium producing L-amino acids” means a bacterium having the ability to accumulate L-amino acids in a nutrient medium when said bacterium is grown in said nutrient medium. The ability to produce L-amino acids can be given or improved by selection. As used herein, the term “L-amino acid producing bacterium” also means a bacterium that is capable of producing an L-amino acid and causes the accumulation of an L-amino acid in a fermentation medium in large quantities compared to a natural or parent E. coli strain, such as strain E .coli K-12, and preferably means that the microorganism is able to accumulate in the medium the target L-amino acid in an amount of not less than 0.5 g / l, more preferably not less than 1.0 g / l. The term “L-amino acids” includes L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartate, L-cysteine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-valine. More specifically, L-threonine is preferred.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Erwinia, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia и т.д. В частности, могут быть использованы бактерии, классифицированные как относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (Национальный Центр Биотехнологической Информации - National Center for Biotechnology Information) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, предпочтительна.The Enterobacteriaceae family includes bacteria belonging to the genera Escherichia, Erwinia, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia, etc. In particular, bacteria classified as belonging to the Enterobacteriaceae family can be used in accordance with the taxonomy used in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) http://www.ncbi.nlm.nih.gov / htbinpost / Taxonomy / wgetorg? mode = Tree & id = 1236 & lvl = 3 & keep = 1 & srchmode = 1 & unlock). A bacterium belonging to the genus Escherichia is preferred.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia that can be used in the present invention is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1), can be included in the number of bacteria according to the present invention.

Термин "активность L-алло-треонинальдолазы" обозначает активность по катализу реакции превращения L-алло-треонина в глицин и ацетальдегид. L-треонин является альтернативным субстратом для L-алло-треонинальдолазы. Активность L-алло-треонинальдолазы может быть измерена с помощью метода, описанного, например, у Liu J.Q. et al (Eur J Biochem.,1998, Jul 1; 255(1):220-6).The term "activity of L-allo-threoninaldolase" means activity on the catalysis of the reaction of the conversion of L-allo-threonine to glycine and acetaldehyde. L-threonine is an alternative substrate for L-allo-threoninaldolase. The activity of L-allo-threoninaldolase can be measured using the method described, for example, in Liu J.Q. et al (Eur J Biochem., 1998, Jul 1; 255 (1): 220-6).

Термин "активность L-алло-треонинальдолазы снижена" означает, что указанная удельная активность ниже, чем активность этого фермента в немодифицированном штамме, например, природном. Примеры такой модификации включают уменьшение количества молекул L-алло-треонинальдолазы на бактериальную клетку, снижение специфической активности молекулы L-алло-треонинальдолазы, и так далее. Термин "активность L-алло-треонинальдолазы отсутствует" обозначает, что в модифицированном штамме указанная активность не детектируется. Отсутствие активности L-алло-треонинальдолазы является одним из примеров снижения указанной активности. Кроме того, природным штаммом, используемым для сравнения, может быть, например, штамм Escherichia coli K-12. Согласно настоящему изобретению, в результате снижения или отсутствия внутриклеточной активности L-алло-треонинальдолазы может быть повышено количество накопленного L-треонина в среде из-за предотвращения деградации накопленного L-треонина.The term "activity of L-allo-threoninaldolase is reduced" means that the specified specific activity is lower than the activity of this enzyme in an unmodified strain, for example, natural. Examples of such a modification include a decrease in the number of L-allo-threoninaldolase molecules per bacterial cell, a decrease in the specific activity of the L-allo-threoninaldolase molecule, and so on. The term “L-allo-threoninaldolase activity is absent” means that the activity is not detected in the modified strain. The lack of activity of L-allo-threoninaldolase is one example of a decrease in this activity. In addition, the natural strain used for comparison may be, for example, a strain of Escherichia coli K-12. According to the present invention, as a result of a decrease or absence of intracellular activity of L-allo-threoninaldolase, the amount of accumulated L-threonine in the medium can be increased due to the prevention of degradation of the accumulated L-threonine.

Снижение активности L-алло-треонинальдолазы в бактериальной клетке может быть достигнуто за счет ослабления экспрессии гена, кодирующего L-алло-треонинальдолазу.A decrease in the activity of L-allo-threoninaldolase in a bacterial cell can be achieved by attenuating the expression of a gene encoding L-allo-threoninaldolase.

В качестве гена, кодирующего L-алло-треонинальдолазу из Escherichia coli, известна нуклеотидная последовательность гена ltaE (номера нуклеотидов с 908517 по 907516 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16128838; SEQ ID: 3). Ген ltaE расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между открытой рамкой считывния ybjT ORF и геном рохВ. Следовательно, ген ltaE может быть получен с помощью ПЦР полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности данного гена. Ген ltaE также имеет другие названия: b0870, EG13690, G6455, ltaA и ybjU. Гены, кодирующие L-алло-треонинальдолазу в других микроорганизмах, могут быть получены сходным образом.As the gene encoding the L-allo-threoninaldolase from Escherichia coli, the nucleotide sequence of the ltaE gene is known (nucleotide numbers 908517 to 907516 in the sequence with accession number NC_000913.1 in the GenBank database, gi: 16128838; SEQ ID: 3). The ltaE gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the open reading frame of ybjT ORF and the poxB gene. Therefore, the ltaE gene can be obtained by PCR polymerase chain reaction; Link to White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) using primers synthesized based on the nucleotide sequence of this gene. The ltaE gene also has other names: b0870, EG13690, G6455, ltaA and ybjU. Genes encoding L-allo-threoninaldolase in other microorganisms can be obtained in a similar manner.

Термины "ген yafA инактивирован" означает, что целевой ген модифицирован таким образом, что такой модифицированный ген кодирует мутантный белок со сниженной активностью, или что такой модифицированный ген кодирует полностью неактивный белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции целевого гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена или введения missense/nonsense мутации или модификации прилегающей к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы), сайт(ы) связывания рибосомы, и т.д.The terms "yafA gene inactivated" means that the target gene is modified in such a way that such a modified gene encodes a mutant protein with reduced activity, or that such a modified gene encodes a completely inactive protein. It is also possible that natural expression of the modified DNA region is not possible due to deletion of the target gene or part of it, shift of the reading frame of this gene or introduction of missense / nonsense mutation or modification of regions adjacent to the gene that include sequences that control gene expression, such as a promoter ( s), enhancer (s), attenuator (s), ribosome binding site (s), etc.

Инактивация указанного гена может быть произведена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, инактивации гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83); (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".Inactivation of the indicated gene can be performed by traditional methods, such as mutagenesis using UV radiation or treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), site-directed mutagenesis, gene inactivation by homologous recombination, and / or insertion deletion mutagenesis (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83); (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), also called "Red-Dependent Integration".

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Methods for obtaining plasmid DNA, cutting and ligation of DNA, transformation, selection of oligonucleotides as primers and the like can be conventional methods well known to those skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия-продуцент L-аминокислоты.Bacteria producing L-amino acids.

Бактерии, обладающие способностью к продукции ароматических или неароматических L-аминокислот, могут быть использованы в качестве родительских штаммов, для дальнейшей модификации с инактивацией гена ltaE.Bacteria with the ability to produce aromatic or non-aromatic L-amino acids can be used as parent strains for further modification with inactivation of the ltaE gene.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации гена ltaE в бактерии, наследственно обладающей способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания способности к продукции L-аминокислот бактерии, в которой ген ItaE уже инактивирован.The bacterium of the present invention can be obtained by inactivating the ltaE gene in a bacterium that is hereditarily capable of producing L-amino acids. Alternatively, the bacterium of the present invention can be obtained by conferring the ability to produce L-amino acids of a bacterium in which the ItaE gene is already inactivated.

Бактерия-продуцент L-треонина.Bacteria producing L-threonine.

Примеры родительского штамма, используемого для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены штаммами - продуцентами треонина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli PERM ВР-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР1149911А) и подобные им.Examples of the parent strain used to produce the L-threonine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, threonine producing strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain TDH-6 / pVIC40 (VKPM B-3996) ( US patents 5175107 and 5705371), E. coli strain NRRL-21593 (US patent 5939307), E. coli strain FERM BP-3756 (US patent 5474918), E. coli strains PERM BP-3519 and FERM BP-3520 (US patent 5376538), E. coli strain MG442 (Gusyatiner et al., Genetics, 14, 947-956 (1978)), E. coli strains VL643 and VL2055 (European patent application EP1149911A) and the like.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA. Этот мутантный ген thrA кодирует аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 113105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.Strain TDH-6 is deficient in the thrC gene, is capable of assimilating glucose, and contains the ilvA gene with a leaky mutation. The specified strain contains a mutation in the rhtA gene, which causes resistance to high concentrations of threonine and homoserine. Strain B-3996 contains the plasmid pVIC40, which was obtained by introducing into the vector derived from the RSF1010 vector the thrA * BC operon including the thrA mutant gene. This mutant thrA gene encodes aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which has a significantly reduced feedback sensitivity to threonine inhibition. Strain B-3996 was deposited on November 19, 1987 at the All-Union Scientific Center for Antibiotics (RF, 113105 Moscow, Nagatinskaya St., 3-A) with inventory number RIA 1867. This strain was also deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (RF , 113545 Moscow, 1st Road passage, 1) with inventory number B-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована для того, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:Preferably, the bacterium of the present invention is further modified in order to have increased expression of one or more of the following genes:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;- mutant thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, resistant to threonine inhibition by feedback type;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;- thrB gene encoding homoserine kinase;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;- thrC gene encoding threonine synthase;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок.- rhtA gene, presumably encoding a transmembrane protein.

- гена asd, кодирующего аспартат-Р-семиальдегиддегидрогеназу; и- asd gene encoding aspartate-P-semialdehyde dehydrogenase; and

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).- aspC gene encoding aspartate aminotransferase (aspartate transaminase).

Последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е, coli K-12 между генами thrL и thrB. Последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон.The sequence of the thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 337 to 2799 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrA gene is located on the chromosome of strain E, coli K-12 between the thrL and thrB genes. The sequence of the thrB gene encoding homoserine kinase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 2801 to 3733 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrB gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrA and thrC genes. The sequence of the thrC gene encoding a threonine synthase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 3734 to 5020 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrC gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrB gene and the open uaaX reading frame. All three of these genes function as one threonine operon.

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC, могут быть получены в виде единого оперона из хорошо-известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.The mutant thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I, which is resistant to threonine inhibition by feedback, as well as the thrB and thrC genes, can be obtained as a single operon from the well-known plasmid pVIC40, which is represented in producer strain E .coli VKPM B-3996. Plasmid pVIC40 is described in detail in US Pat. No. 5,705,371.

Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli рядом с опероном glnHPQ, кодирующим компоненты транспортной системы глутамина, таким образом, ген rhtA идентичен открытой рамке считывания ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА2218541 в GenBank, gi:440181), расположенной между генами рехВ и ompX. Участок, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Кроме того, было установлено, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении - 1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457; Европейская патентная заявка 1013765).The rhtA gene is located at the 18th minute of the E. coli chromosome next to the glnHPQ operon encoding the components of the glutamine transport system, so the rhtA gene is identical to the open reading frame ORF1 (ybiF gene, nucleotide numbers 764 to 1651 in sequence with accession number AAA2218541 in GenBank, gi: 440181) located between the pXB and ompX genes. The region expressing the protein encoded by ORF1 was called the rhtA gene (rht: resistance to homoserine and threonine - resistance to homoserin and threonine). In addition, it was found that the rhtA23 mutation is a substitution of A for G position - 1 relative to the start of the ATG codon (ABSTRACTS of 17 ^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457; European Patent Application 1013765).

Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli уже известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16131307), и этот ген может быть получен с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным способом.The nucleotide sequence of the asd gene from E. coli is already known (nucleotide numbers 3572511 to 3571408 in sequence with accession number NC_000913.1 in the GenBank database, gi: 16131307), and this gene can be obtained by PCR (polymerase chain reaction; link White, TJ et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) using primers synthesized based on the nucleotide sequence of the gene. Asd genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

Также нуклеотидная последовательность гена aspC из Е.coli уже известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16128895), и этот ген может быть получен с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным способом.Also, the nucleotide sequence of the aspC gene from E. coli is already known (nucleotide numbers 983742 to 984932 in the sequence with accession number NC_000913.1 in the GenBank database, gi: 16128895), and this gene can be obtained by PCR. AspC genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

2. Способ согласно настоящему изобретению.2. The method according to the present invention.

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing an L-amino acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium for the purpose of producing and accumulating an L-amino acid in a nutrient medium and isolating the L-amino acid from the culture fluid.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.According to the present invention, the cultivation, isolation and purification of an L-amino acid from a culture or similar liquid may be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the amino acid is produced using a bacterium.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт. При необходимости в среду также могут быть добавлены дополнительные компоненты. Например, если микроорганизму для роста требуется L-аминокислота (ауксотрофность по L-аминокислоте), в питательную среду может быть добавлено необходимое количество указанной L-аминокислоты.The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives necessary for the growth of microorganisms. Carbon sources include various carbohydrates such as glucose and sucrose, as well as various organic acids. Depending on the nature of the assimilation of the microorganism used, alcohols such as ethanol and glycerin may be used. Various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. Thiamine and yeast extract can be used as vitamins. If necessary, additional components can also be added to the medium. For example, if a microorganism requires an L-amino acid for growth (L-amino acid auxotrophy), the required amount of the indicated L-amino acid can be added to the nutrient medium.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as mixing the culture fluid on a rocking chair, shaking with aeration, at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 30 to 38 ° C. The pH of the medium is maintained in the range from 5 to 9, preferably from 6.5 to 7.2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffer solutions. Typically, growing for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target L-amino acid in the culture fluid.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the L-amino acid can be isolated and purified by ion exchange chromatography, concentration and crystallization.

Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.

На Фиг.1 изображены относительные положения праймеров ltaEL и ltaER на плазмиде pACYC184, используемой для амплификации гена cat.Figure 1 shows the relative positions of the primers ltaEL and ltaER on the plasmid pACYC184 used to amplify the cat gene.

На Фиг.2 изображено конструирование фрагмента хромосомной ДНК, содержащего инактивированный ген ltaE.Figure 2 shows the construction of a chromosomal DNA fragment containing the inactivated ltaE gene.

Примеры.Examples.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.

Пример 1. Конструирование штамма с инактивированньм геном ltaE.Example 1. Construction of a strain with inactivated ltaE gene.

1. Делеция гена ltaE.1. Deletion of the ltaE gene.

Штамм с делетированным геном ltaE был получен с помощью метода, исходно разработанного Datsenko, К.А. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известного как "Red-зависимая интеграция". В соответствии с указанной методикой были синтезированы ПЦР праймеры ltaEL (SEQ ID NO: 1) и ltaER (SEQ ID NO: 2), гомологичные как областям хромосомы, прилегающих к гену ltaE, так и гену, придающему устойчивость к антибиотику на плазмиде, используемой в качестве матрицы. В качестве такой матрицы для ПЦР использовалась плазмида pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (инвентарный номер Х06403 в базе данных GenBank/EMBL). Использовался следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; и последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.The strain with the deleted ltaE gene was obtained using the method originally developed by Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12), 6640-6645), known as "Red-dependent Integration". In accordance with the indicated procedure, PCR primers ltaEL (SEQ ID NO: 1) and ltaER (SEQ ID NO: 2) were synthesized, homologous to both regions of the chromosome adjacent to the ltaE gene and the gene conferring antibiotic resistance on the plasmid used in as a matrix. Plasmid pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (accession number X06403 in the GenBank / EMBL database) was used as such a matrix for PCR. The following temperature profile for PCR was used: denaturation at 95 ° C for 3 min; the first two cycles: 1 min at 95 ° C, 30 sec at 50 ° C, 40 sec at 72 ° C; and the following 25 cycles: 30 sec at 95 ° C, 30 sec at 54 ° C, 40 sec at 72 ° C; and final polymerization: 5 min at 72 ° C.

Полученный продукт ПЦР - фрагмент длиной 936 п.о. (Фиг.1, SEQ ID NO: 5) был очищен в агарозном геле и мог быть использован для электропорации в штамм Е.coli MG1655(ATCC 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит фрагмент ДНК фага λ (инвентарный номер последовательности J02459 в базе данных GenBank) длиной 2,154 нуклеотида (31088-33241), а также содержит гены λ Red гомологичной системы рекомбинации (γ, β, ехо гены) под контролем промотора Р_araB; индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.The resulting PCR product is a fragment of 936 bp in length. (Figure 1, SEQ ID NO: 5) was purified on an agarose gel and could be used for electroporation into E. coli strain MG1655 (ATCC 700926) containing the plasmid pKD46 with a heat-sensitive replicon. Plasmid pKD46 (Datsenko, KA and Wanner, BL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 6640-45) contains a phage λ DNA fragment (sequence number J02459 in the GenBank database) of 2.154 nucleotides ( 31088-33241), and also contains the λ Red genes of a homologous recombination system (γ, β, exo genes) under the control of the promoter P _araB ; induced by arabinose. Plasmid pKD46 is required for integration of the PCR product into the chromosome of strain MG1655.

Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в LB среде с добавкой ампициллина (100 мг/л), развели в 100 раз при помощи 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрации в 100 раз трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н₂О. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали с 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром и выращивали при 37°С для отбора Cm^R рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46, проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.Electrocompetent cells were obtained as follows: an overnight culture of E. coli strain MG1655 was grown at 30 ° C in LB medium supplemented with ampicillin (100 mg / L), diluted 100 times with 5 ml of SOB medium (Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) containing ampicillin and L-arabinose (1 mM). The resulting culture was grown with stirring at 30 ° C until OD ₆₀₀ ≈0.6 was reached, after which the cells were made electrocompetent by concentrating 100 times with three times washing with ice-cold deionized H ₂ O. Electroporation was performed using 70 μl of cells and ≈100 ng of PCR product. After electroporation, the cells were incubated with 1 ml of SOC medium (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) at 37 ° C for 2.5 hours, after which they were plated on L plates agar and grown at 37 ° C to select Cm ^R recombinants. Then, to remove plasmid pKD46, 2 passages were performed on L-agar with Cm at 42 ° C and the obtained colonies were tested for sensitivity to ampicillin.

2. Подтверждение делеции гена ltaE с помощью ПЦР.2. Confirmation of deletion of the ltaE gene by PCR.

Мутанты с делетированным геном ItaE и содержащие ген устойчивости к Cm были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры ltaE1 (SEQ ID NO: 6) и ltaE2 (SEQ ID NO: 7) использовались для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР проверки: денатурация при 94°С в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма ltaE⁺ MG1655, составляет 1002 п.о. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 ΔltaE::cat, составляет 935 п.о. (Фиг.2).Mutants with a deleted ItaE gene and containing the Cm resistance gene were verified by PCR. Locus-specific primers ltaE1 (SEQ ID NO: 6) and ltaE2 (SEQ ID NO: 7) were used to verify deletion by PCR. The following temperature profile was used for PCR testing: denaturation at 94 ° C for 3 min; profile for 30 cycles: 30 sec at 94 ° C, 30 sec at 54 ° C, 1 min at 72 ° C; final step: 7 min at 72 ° C. The length of the PCR product obtained by the reaction using the parental strain ltaE ⁺ MG1655 as a matrix of cells is 1002 bp The length of the PCR product obtained by the reaction using the mutant strain MG1655 ΔltaE :: cat as a matrix of cells is 935 bp (Figure 2).

Пример 2. Продукция L-треонина штаммом Е.coli В-3996-ΔltaE.Example 2. Production of L-threonine by E. coli strain B-3996-ΔltaE.

Для проверки эффекта делеции гена ltaE на продукцию треонина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔltaE::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент треонина Е.coli VKPM В-3996 Р1 трансдукцией (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).To test the effect of the deletion of the ltaE gene on the production of threonine, DNA fragments from the chromosome of the E. coli MG1655 ΔltaE :: cat strain described above can be transferred to the E. coli VKPM B-3996 P1 threonine producing strain by transduction (Miller, JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).

Оба штамма - родительский В-3996 и полученный B-3996 ΔltaE::cat, могут выращиваться в течение 18-24 часов при 32°С на чашках с L-агаром, содержащих хлорамфеникол (30 мкг/мл). Для получения посевной культуры каждый из штаммов может быть выращен на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено 0.21 мл (10%) посевного материала. Ферментация может проводиться в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках 20×200 мм. Клетки могут выращиваться в течение 48 часов при 32°С на роторной качалке - 250 об/мин.Both strains, the parent B-3996 and the obtained B-3996 ΔltaE :: cat, can be grown for 18-24 hours at 32 ° C on L-agar plates containing chloramphenicol (30 μg / ml). To obtain a seed culture, each of the strains can be grown on a rotary shaker (250 rpm) at 32 ° C for 18 hours in 20 × 200 mm tubes containing 2 ml of L-broth with 4% sucrose. Then, 0.21 ml (10%) of seed can be added to the fermentation medium. Fermentation can be carried out in 2 ml of minimal fermentation medium in 20 × 200 mm tubes. Cells can be grown for 48 hours at 32 ° C on a rotary shaker - 250 rpm.

После выращивания количество накопленного в среде L-треонина может быть определено с помощью бумажной хроматографии, при этом используется следующий состав подвижной фазы: бутанол : уксусная кислота : вода = 4:1:1 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации. Пятна, содержащие L-треонина, могут быть вырезаны, L-треонин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-треонина может быть оценено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.After growing, the amount of L-threonine accumulated in the medium can be determined using paper chromatography, using the following composition of the mobile phase: butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). A solution (2%) of ninhydrin in acetone can be used for visualization. Stains containing L-threonine can be cut out, L-threonine can be eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl ₂ , after which the amount of L-threonine can be estimated spectrophotometrically at a wavelength of 540 nm.

Возможный состав ферментационной среды (г/л):Possible composition of the fermentation medium (g / l):

ГлюкозаGlucose 80.080.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 22.022.0 NaClNaCl 0.80.8 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 2.02.0 MgSO₄·7H₂OMgSO ₄ · 7H ₂ O 0.80.8 FeSO₄·7H₂OFeSO ₄ · 7H ₂ O 0.020.02 MnSO₄ ·5H₂OMnSO ₄ · 5H ₂ O 0.020.02 Тиамин HClThiamine HCl 0.00020.0002 Дрожжевой экстрактYeast extract 1.01.0 СаСО₃ CaCO ₃ 30.030.0

Глюкозу и сульфат марганца стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0. Антибиотик добавляют в среду после стерилизации.Glucose and manganese sulfate are sterilized separately. CaCO _{3 is} sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0. The antibiotic is added to the medium after sterilization.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to the best mode of carrying out the invention, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.

Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.Each of the above documents has a link, and all cited documents are part of the description of the present invention.

Claims (3)

1. Бактерия-продуцент L-треонина, принадлежащая к роду Escherichia, отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что в ней отсутствует активность L-алло-треонинальдолазы.1. The bacterium-producer of L-threonine, belonging to the genus Escherichia, characterized in that the bacterium is modified so that it lacks the activity of L-allo-threoninaldolase. 2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная активность L-алло-треонинальдолазы отсутствует за счет инактивации гена ltaE.2. The bacterium according to claim 1, characterized in that the indicated activity of L-allo-threoninaldolase is absent due to inactivation of the ltaE gene. 3. Способ получения L-треонина, включающий в себя выращивание бактерии по любому из пп. 1 и 2 в питательной среде, приводящее к продукции и накоплению L-треонина в культуральной жидкости, и3. A method for producing L-threonine, comprising growing a bacterium according to any one of claims. 1 and 2 in a culture medium, leading to the production and accumulation of L-threonine in the culture fluid, and выделение L-треонина из культуральной жидкости.isolation of L-threonine from the culture fluid.

Images