RU2304145C1 - Di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid and inhibitor of human immunodeficiency virus reproduction - Google Patents

Abstract

FIELD: bioactive substances, in particular glycyrrhizic acid derivatives.

SUBSTANCE: invention relates to glycyrrhizic acid derivatives of general formula

wherein R is formula

or hydrogen atom, with the proviso that at least two of said R are

. Also disclosed is inhibitor of human immunodeficiency virus reproduction, including di- and/or trinicotinates of glycyrrhizic acid.

EFFECT: new glycyrrhizic acid derivatives with high bioactive activity; anti-HIV inhibitor of improved activity.

2 cl, 14 ex, 3 tbl

Description

Изобретение относится к биологически активным веществам, производным глицирризиновой кислоты, и может использоваться в медицине, вирусологии, фармакологии, например в качестве ингибитора репродукции вируса иммунодефицита человека.The invention relates to biologically active substances derived from glycyrrhizic acid, and can be used in medicine, virology, pharmacology, for example, as an inhibitor of the reproduction of the human immunodeficiency virus.

Известно, что глицирризиновая кислота - основной ингредиент экстракта корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra) и солодки уральской (Gl. Uralensis), обладает высокой биологической активностью и является высокоэффективным средством в лечении различных заболеваний. Так, она применяется при лечении вирусных гепатитов, входит в перечень препаратов (который насчитывает около 50 наименований), подавляющих репродукцию вируса иммунодефицита человека in vitro. Названная кислота оказывает противовирусное, противовоспалительное, противозудное и иммуномодулирующее действие, действует на разные типы ДНК и РНК вирусов in vitro и in vivo (Varicella zoster; Herpes simplex 1 и 2 типа; различные типы вируса папилломы человека, в т.ч. онкогенные), прерывает репликацию вирусов на ранних стадиях, вызывает выход вириона из капсида, тем самым не допуская его проникновение в клетки, что связано с селективным дозозависимым ингибированием фосфорилирующей киназы Р. Глицирризиновая кислота взаимодействует со структурами вируса (возможно, с белками), изменяя различные фазы вирусного цикла, что сопровождается необратимой инактивацией вирусных частиц, находящихся в свободном состоянии вне клеток, блокирует внедрение активных вирусных частиц внутрь клетки, нарушает способность вируса к индукции синтеза новых вирусных частиц, индуцирует образование интерферона, что является одним из компонентов противовирусного действия, инактивирует указанные вирусы в нетоксичных для нормально функционирующих клеток концентрациях. Мутантные штаммы вирусов, резистентные к ацикловиру и йодоуридину, также высокочувствительны к глицирризиновой кислоте, как и немутантные штаммы. Противовоспалительная активность глицирризиновой кислоты сочетается со стимулирующим влиянием на гуморальные и клеточные факторы иммунитета.It is known that glycyrrhizic acid - the main ingredient in the extract of the roots of licorice licorice (Glycyrrhiza glabra) and Ural licorice (Gl. Uralensis), has high biological activity and is highly effective in the treatment of various diseases. So, it is used in the treatment of viral hepatitis, is included in the list of drugs (which has about 50 items) that suppress the reproduction of the human immunodeficiency virus in vitro. The named acid has an antiviral, anti-inflammatory, antipruritic and immunomodulating effect, acts on different types of DNA and RNA viruses in vitro and in vivo (Varicella zoster; Herpes simplex types 1 and 2; various types of human papillomavirus, including oncogenic), interrupts the replication of viruses in the early stages, causes the virion to exit the capsid, thereby preventing its penetration into cells, which is associated with selective dose-dependent inhibition of phosphorylating kinase P. Glycyrrhizic acid interacts with the structures of the virus (possible but, with proteins), changing various phases of the viral cycle, which is accompanied by irreversible inactivation of viral particles that are in a free state outside the cells, blocks the introduction of active viral particles into the cell, disrupts the ability of the virus to induce the synthesis of new viral particles, induces the formation of interferon, which is one of the components of the antiviral effect, inactivates these viruses in concentrations that are non-toxic to normally functioning cells. Mutant strains of viruses resistant to acyclovir and iodouridine are also highly sensitive to glycyrrhizic acid, as are non-mutant strains. The anti-inflammatory activity of glycyrrhizic acid is combined with a stimulating effect on humoral and cellular factors of immunity.

Производные глицерризиновой кислоты так же, как и сама кислота, обладают высокой биологической активностью. В частности, моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты (глицирам Г) или пента-o-никотинат глицирризиновой кислоты, 3-(b-D-2,3,4-три-о-никотинилглюкуронпиранозил)1 2(a-D-3,4-ди-О-никотинилглюкуронпиранозил глицирретовой кислоты (ниглизин, НГ) используются для ингибирования репродукции вируса Марбург [Патент РФ №2088232]. Например, гликопептид глицирризиновой кислоты обладает анти-СПИД-активностью [Патент РФ №2024546]. Известны и другие производные глицирризиновой кислоты, проявляющие полезные для лечения различных заболеваний свойства, что указывает на высокую перспективность этих веществ для использования в медицине, фармакологии и биологии. По этой причине получение новых производных глицирризиновой кислоты является актуальной задачей.Derivatives of glycerrhizic acid, like the acid itself, have high biological activity. In particular, the monoammonium salt of glycyrrhizic acid (Glyciram G) or penta-o-nicotinate glycyrrhizic acid, 3- (bD-2,3,4-tri-o-nicotinyl glucuronopyranosyl) 1 2 (aD-3,4-di-O- Nicotinyl glucuronpyranosyl glycyrrhetic acid (niglizine, NG) is used to inhibit the reproduction of Marburg virus [RF Patent No. 2088232]. For example, glycyrrhizic acid glycopeptide has anti-AIDS activity [RF Patent No. 2024546]. Other derivatives of glycyrrhizic acid for the treatment of various disease properties that indicates the high potential of these substances for use in medicine, pharmacology and biology.For this reason, obtaining new derivatives of glycyrrhizic acid is an urgent task.

В рамках решения этой задачи получено новое вещество, являющееся производным глицирризиновой кислоты, а именно ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты общей формулы:In the framework of solving this problem, a new substance is obtained, which is a derivative of glycyrrhizic acid, namely di- and / or trinicotinates of glycyrrhizic acid of the general formula:

где R - это

или Н, причем два и/или три из названных R - это

.where R is

or H, and two and / or three of these R are

.

Синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты осуществляют в соответствии со следующий схемой:The synthesis of di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid is carried out in accordance with the following scheme:

Для реализации этой схемы никотиновую кислоту растворяют в органическом апротонном растворителе при нагревании реакционной смеси с образованием суспензии, в которую добавляют также при нагревании пятихлористый фосфор, затем суспензию охлаждают. В охлажденную суспензию добавляют глицирризиновую кислоту и затем ее снова нагревают. После окончания протекания реакции и охлаждения полученной реакционной смеси в нее добавляют лед и концентрированную соляную кислоту до слабокислой реакции. Ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты выпадают в виде осадка, представляющего собой их смесь. При необходимости диникотинаты могут быть отделены от триникотинатов и таким образом выделены раздельно.To implement this scheme, nicotinic acid is dissolved in an organic aprotic solvent by heating the reaction mixture to form a suspension, to which phosphorus pentachloride is also added while heating, then the suspension is cooled. Glycyrrhizic acid is added to the cooled suspension and then heated again. After the completion of the reaction and cooling of the obtained reaction mixture, ice and concentrated hydrochloric acid are added to it until a slightly acidic reaction. Glycyrrhizic acid di- and trinicotinates precipitate as a mixture of them. If necessary, dinicotinates can be separated from trinicotinates and thus separated.

На практике синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты может быть осуществлен, например, в соответствии с приведенными ниже примерами 1-3.In practice, the synthesis of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates can be carried out, for example, in accordance with examples 1-3 below.

Исследования токсичности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты показали, что они не токсичны и могут применяться в медицине, фармакологии и биологии - оценка цитотоксичности этих соединений приведена в примерах 4-6 (таблица 1).Studies of the toxicity of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates showed that they are non-toxic and can be used in medicine, pharmacology and biology - the cytotoxicity of these compounds is estimated in examples 4-6 (table 1).

Исследования биологической активности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты, проведенные в отношении вируса иммунодифицита человека, показали их высокую эффективность как ингибитора репродукции этого вируса, при том, что проблема лечения ВИЧ-инфекции остается одной из самых актуальных проблем современной медицины.Studies of the biological activity of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates in relation to the human immunodeficiency virus have shown their high efficiency as an inhibitor of the reproduction of this virus, despite the fact that the problem of treating HIV infection remains one of the most urgent problems of modern medicine.

Для лечения ВИЧ-инфекции на протяжении почти 15 лет в клинической практике широко использовался препарат азидотимидин (АЗТ), являющийся эффективным ингибитором вирусной обратной транскриптазы [Машковский М.Д. «Лекарственные средства». Т.2. Изд. 14-е, М: ООО «Новая волна» - 2000]. Однако в последние годы применение этого препарата снижается в связи с быстро развивающейся в организме ВИЧ-инфицированных пациентов резистентностью к нему вируса [Larder В.A, Kemp S.D. «Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT)». Science, 1989 - V.246, p.1155-1158], а также его высокой токсичностью, в том числе митохондриальной [Chiu D.T. & Duesberg P.H. «The toxicity of azidothymidine (AZT) on human and animal cells in culture at concentrations used for antiviral therapy». Genetica, 1995 - V.95, p.103-109 и Brinkman К., ter Hofstede J.M, Burger D.M. «Adverse effects of reverse transcriptase inhibitors: mitochondrial toxicity as common pathway». AIDS, 1998 - V.12, p.1735-1744]. Кроме того, монотерапия азидотимидином не рекомендована Всемирной Организацией Здравоохранения, поскольку приводит к появлению устойчивых к препарату мутантов вируса. В настоящее время азидотимидин применяют в основном в качестве составляющего компонента в так называемых «коктейлях» в сочетании с 2-4 другими препаратами, воздействующими на другие мишени цикла репродукции вируса [Schmit J.-C., Weber В. «Recent advances in antiretroviral therapy and HIV infection monitoring». Intervirology, 1997, V.40, №5/6, р.304-321 и Кравченко А.В. «Комбинированная антиретровирусная терапия ВИЧ-инфекции». Эпидемиология и инфекционные болезни, 2001, №1, с.59-62], как правило, ингибиторами протеазы ВИЧ, или ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ. Несмотря на эффективность некоторых таких «коктейлей», актуальным остается поиск новых сочетаний и комбинаций азидотимидина с препаратами другой природы и иного механизма действия, достаточно эффективными и дешевыми.For the treatment of HIV infection for almost 15 years, the drug azidothymidine (AZT), which is an effective inhibitor of viral reverse transcriptase, has been widely used in clinical practice [Mashkovsky M. D. "Medicines." T.2. Ed. 14th, M: New Wave LLC - 2000]. However, in recent years, the use of this drug has been reduced due to the rapidly developing virus resistance in HIV-infected patients [Larder B.A., Kemp S.D. "Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT)." Science, 1989 - V.246, p.1155-1158], as well as its high toxicity, including mitochondrial [Chiu D.T. & Duesberg P.H. "The toxicity of azidothymidine (AZT) on human and animal cells in culture at concentrations used for antiviral therapy." Genetica, 1995 - V. 95, p. 103-109 and Brinkman K., ter Hofstede J.M., Burger D.M. "Adverse effects of reverse transcriptase inhibitors: mitochondrial toxicity as common pathway." AIDS, 1998 - V.12, p.1735-1744]. In addition, azidothymidine monotherapy is not recommended by the World Health Organization, since it leads to the appearance of drug-resistant mutants of the virus. Currently, azidothymidine is mainly used as a constituent in the so-called “cocktails” in combination with 2-4 other drugs that act on other targets of the virus reproduction cycle [Schmit J.-C., Weber B. “Recent advances in antiretroviral therapy and HIV infection monitoring. " Intervirology, 1997, V.40, No. 5/6, p. 304-321 and Kravchenko A.V. "Combined antiretroviral therapy for HIV infection." Epidemiology and Infectious Diseases, 2001, No. 1, pp. 59-62], as a rule, HIV protease inhibitors, or non-nucleoside HIV reverse transcriptase inhibitors. Despite the effectiveness of some of these “cocktails,” the search for new combinations and combinations of azidothymidine with drugs of a different nature and a different mechanism of action that are quite effective and cheap remains relevant.

Одним из таких доступных и дешевых препаратов является глицирризиновая кислота, механизм действия которой до конца не ясен, так, некоторые авторы связывают его с ингибированием протеинкиназы, обеспечивающей фосфорилирование Т4 рецептора, необходимого для связывания вируса [Ito M., Sato A., Hirabayashi К., Tanabe P., Shigeta S., Baba M., De Clercq E., Nakashima H., Yamamoto N. «Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV)». Antiviral Res, 1988, V.10, p.289-298], а другие - с непосредственным блокированием связывания вируса с клеткой [Fields A.P., Bednarik P.P., Hess A., May W.S. «Human immunodeficiency virus induces phosphorylation of its cell surface receptor». Nature (London), 1988, V.333, p.278-280]. Однако очевидно, что она, в отличие от азидотимидина, ингибирует репродукцию вируса на ранних стадиях инфекции [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. «Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты». Вопросы вирусологии, 1992, №5-6, с.235-238].One of such affordable and cheap drugs is glycyrrhizic acid, the mechanism of action of which is not fully understood, for example, some authors attribute it to the inhibition of protein kinase, which provides phosphorylation of the T4 receptor necessary for virus binding [Ito M., Sato A., Hirabayashi K. , Tanabe P., Shigeta S., Baba M., De Clercq E., Nakashima H., Yamamoto N. "Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV)". Antiviral Res, 1988, V.10, p. 289-298], and others with direct blocking of the binding of the virus to the cell [Fields A.P., Bednarik P.P., Hess A., May W.S. "Human immunodeficiency virus induces phosphorylation of its cell surface receptor." Nature (London), 1988, V.333, p. 278-280]. However, it is obvious that, unlike azidothymidine, it inhibits the reproduction of the virus in the early stages of infection [Plyasunova OA, Egoricheva IN, Fedyuk NV and others. "The study of anti-HIV activity of β-glycyrrhizic acid." Questions of Virology, 1992, No. 5-6, p.235-238].

Исследования противовирусной активности целого ряда производных глицирризиновой кислоты продемонстрировали эффективность их анти-ВИЧ действия в культуре клеток [Покровский А.Г., Плясунова О.А., Ильичева Т.Н., Борисова О.А., Федюк Н.В., Петренко Н.И., Петухова В.З., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. «Синтез производных растительных тритерпенов и исследование их противовирусной и иммуностимулирующей активности». Химия в интересах устойчивого развития, 2001, №9, с.485-491. Патент РФ №2199547, и Патент РФ №2198177]. Например, моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты (глицирам) не является антагонистом по отношению к азидотимидину и в сочетании с ним эффективно блокирует репродукцию ВИЧ в культуре клеток как при острой, так и при хронической инфекции при соотношении АЗТ : глицирам, равном 1:10000 [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. «Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты». Вопросы вирусологии, 1992, №5-6, с.235-238].Studies of the antiviral activity of a number of glycyrrhizic acid derivatives have demonstrated the effectiveness of their anti-HIV action in cell culture [Pokrovsky AG, Plyasunova OA, Ilyicheva TN, Borisova OA, Fedyuk NV, Petrenko N.I., Petukhova V.Z., Schulz E.E., Tolstikov G.A. "The synthesis of derivatives of plant triterpenes and the study of their antiviral and immunostimulating activity." Chemistry for Sustainable Development, 2001, No. 9, p. 485-491. RF Patent No. 2199547, and RF Patent No. 2198177]. For example, the monoammonium salt of glycyrrhizic acid (glycyram) is not an antagonist with azidothymidine and, in combination with it, effectively blocks HIV reproduction in cell culture in both acute and chronic infections with an AZT: glycyr ratio of 1: 10000 [Plyasunova O .A., Egoricheva I.N., Fedyuk N.V. and others. "The study of anti-HIV activity of β-glycyrrhizic acid." Questions of Virology, 1992, No. 5-6, p.235-238].

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является пента-никотинат глицирризиновой кислоты, показавший самую высокую анти-ВИЧ активность по сравнению с другими производными названной кислоты [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В. и др. «Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты». Вопросы вирусологии, 1992, №5-6, с.235-238]. Однако имеется потребность в ингибиторах, анти-ВИЧ активность которых превышает активность прототипа.The closest analogue of the present invention is penta-nicotinate glycyrrhizic acid, which showed the highest anti-HIV activity compared to other derivatives of the named acid [Plyasunova OA, Egoricheva I.N., Fedyuk N.V. and others. "The study of anti-HIV activity of β-glycyrrhizic acid." Questions of Virology, 1992, No. 5-6, p.235-238]. However, there is a need for inhibitors whose anti-HIV activity exceeds that of the prototype.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание ингибиторов репродукции вируса иммунодефицита человека, имеющих высокую активность.The problem to which the invention is directed, is the creation of inhibitors of reproduction of the human immunodeficiency virus having high activity.

Поставленная задача решается тем, что предлагается ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека, включающий ди- и/или триникатинаты глицирризиновой кислоты.The problem is solved in that it is proposed an inhibitor of the reproduction of the human immunodeficiency virus, including di- and / or tricinate of glycyrrhizic acid.

Общая формула ди- и/или триникатинатов глицирризиновой кислоты приведена выше.The general formula of glycyrrhizic acid di- and / or tricinate is given above.

Как уже упоминалось, названные ди- и триникатинаты глицирризиновой кислоты находятся в смеси, которую получают при их синтезе, но они могут быть выделены и отдельно.As already mentioned, these glycyrrhizic acid di- and trinicinates are in the mixture obtained by their synthesis, but they can be isolated separately.

В результате исследований выявлено, что ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты активно влияют на репродукцию ВИЧ, что подтверждается приведенными ниже примерами 7-12 (таблица 2). Активность их существенно выше, чем у других производных глицирризиновой кислоты, включая прототип.As a result of studies, it was revealed that di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid actively influence HIV reproduction, which is confirmed by examples 7-12 below (table 2). Their activity is significantly higher than that of other derivatives of glycyrrhizic acid, including the prototype.

Исследование ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных лимфоидных клеток линии МТ-4 в присутствии названных соединений, конечные концентрации которых в культуральной среде составляют 0,0001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток. Об ингибировании репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток судят по снижению накопления вирусспецифического белка р24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования [Schmit J.-C., Weber В. «Recent advances in antiretroviral therapy and HIV infection monitoring». Intervirology, 1997, V.40, №5/6, р.304-321 и Кравченко А.В. «Комбинированная антиретровирусная терапия ВИЧ-инфекции». Эпидемиология и инфекционные болезни, 2001, №1, с.59-62] при окрашивании 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT).A study of the inhibition of HIV reproduction involves the cultivation of primary infected lymphoid cells of the MT-4 line in the presence of these compounds, the final concentrations of which in the culture medium are 0.0001-100 μg / ml, over a passage of 4 days. Inhibition of HIV reproduction in a culture of sensitive cells is judged by a decrease in the accumulation of virus-specific protein p24 (according to enzyme-linked immunosorbent assay), as well as by an increase in cell viability in the presence of the drug compared to the control determined on the 4th day of cultivation [Schmit J.-C. , Weber B. "Recent advances in antiretroviral therapy and HIV infection monitoring." Intervirology, 1997, V.40, No. 5/6, p. 304-321 and Kravchenko A.V. "Combined antiretroviral therapy for HIV infection." Epidemiology and Infectious Diseases, 2001, No. 1, pp. 59-62] when staining 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT).

Исследования противовирусной активности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в отношении АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1, полученного в культуре клеток и характеризующегося снижением чувствительности к АЗТ в 160 раз и наличием точечных мутаций в гене pol Asp67→Asn; Lys70→Arg; Leu214→Phe, ответственных за резистентность [Покровский А.Г., Плясунова О.А., Киселева Я.Ю., Гашникова Н.М., Федюк Н.В. «Сравнительное исследование возникновения резистентности ВИЧ-1 к АЗТ и Н-фосфонату АЗТ в культуре клеток». ДАН, 2002, Т.384, №2, с.259-252] приведены в примерах 13-14 (таблица 3).Studies of the antiviral activity of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates in relation to the AZT-resistant mutant HIV-1, obtained in cell culture and characterized by a 160-fold decrease in sensitivity to AZT and the presence of point mutations in the pol Asp67 → Asn gene; Lys70 → Arg; Leu214 → Phe responsible for resistance [Pokrovsky A.G., Plyasunova O.A., Kiseleva Y.Yu., Gashnikova N.M., Fedyuk N.V. "A comparative study of the occurrence of HIV-1 resistance to AZT and AZT N-phosphonate in cell culture." DAN, 2002, T.384, No. 2, p. 259-252] are given in examples 13-14 (table 3).

Ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты показали большую эффективность в отношении АЗТ-резистентного мутанта (ID₅₀=0,134 мкМ), чем «дикого» штамма (ID₅₀=0,7 мкМ). Эффективность анти-ВИЧ действия ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты как в отношении «дикого» штамма, так и АЗТ-резистентного мутанта свидетельствует о перспективности использования подобных композиций для лечения ВИЧ-инфекции.Glycyrrhizic acid di- and trinicotinates showed greater efficacy against the AZT-resistant mutant (ID ₅₀ = 0.134 μM) than the wild-strain (ID ₅₀ = 0.7 μM). The effectiveness of the anti-HIV action of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates, both in relation to the “wild” strain and the AZT-resistant mutant, indicates the promise of using such compositions for the treatment of HIV infection.

Пример 1Example 1

Синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислотыSynthesis of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates

Двугорлую колбу емкостью 5 л, снабженную эффективной механической мешалкой, помещают в баню с глицерином с термометром. В колбу наливают 3.5 л органического апротонного растворителя (ДМФА, N-метил-пирролидон, этилендиамин), предпочтительно пиридина, засыпают 500 г никотиновой кислоты и при перемешивании нагревают реакционную смесь до 40-45°С (здесь и далее указана температура бани), затем, не прекращая перемешивания, добавляют к образовавшейся суспензии 265.5 г пятихлористого фосфора. По окончании добавления смесь нагревают до 60±3°С и перемешивают при этой температуре в течение 2 ч (примерно через 30-40 мин светлый цвет реакционной смеси становится темно-коричневым).A two-necked flask with a capacity of 5 l, equipped with an effective mechanical stirrer, is placed in a glycerin bath with a thermometer. 3.5 l of an organic aprotic solvent (DMF, N-methyl-pyrrolidone, ethylenediamine), preferably pyridine, are poured into the flask, 500 g of nicotinic acid are added, and the reaction mixture is heated to 40-45 ° С with stirring (hereinafter, the bath temperature is indicated), then without stopping mixing, add to the resulting suspension 265.5 g of phosphorus pentachloride. Upon completion of the addition, the mixture is heated to 60 ± 3 ° C and stirred at this temperature for 2 hours (after about 30-40 minutes the light color of the reaction mixture becomes dark brown).

Далее колбу с реакционной смесью помещают в ледяную баню и перемешивают реакционную смесь в течение ~20 мин до ее остывания и добавляют при перемешивании 150 г глицирризиновой кислоты. После этого колбу с реакционной смесью помещают в баню с глицерином и нагревают до 55±5°С, не прекращая перемешивания, и выдерживают при этой температуре в течение 2 ч 50 мин. При нагревании значительная часть осадка растворяется.Next, the flask with the reaction mixture was placed in an ice bath and the reaction mixture was stirred for ~ 20 min until it cooled and 150 g of glycyrrhizic acid was added with stirring. After that, the flask with the reaction mixture was placed in a bath with glycerin and heated to 55 ± 5 ° С without stopping stirring, and kept at this temperature for 2 h 50 min. When heated, a significant portion of the precipitate dissolves.

По окончании реакции убирают баню и дают остыть колбе до ~30-40°С, затем полученную суспензию разливают поровну в 2 стакана емкостью 5 л и добавляют в каждый стакан по ~1.5 л измельченного льда, приготовленного из дистиллированной воды, для перенесения оставшегося на стенках колбы осадка используют дистиллированную воду. Содержимое стаканов перемешивают и добавляют в них концентрированную соляную кислоту (~1.3 л в каждый стакан) до достижения слабой кислотности (рН~6), при этом наблюдается выпадение дополнительного количества осадка. Оставляют стаканы на несколько часов для полного выпадения осадка. Выпавший в обоих стаканах коричневый осадок отфильтровывают. Объединенные с обоих стаканов осадки промывают дистиллированной водой (4×1 л) и тщательно высушивают на фильтре. В процессе сушки осадка образуются крупные конгломераты, которые измельчают для повышения эффективности осушки. Вес высушенного светло-коричневого осадка составляет ~300 г.At the end of the reaction, the bath is removed and the flask is allowed to cool to ~ 30-40 ° C, then the resulting suspension is poured equally into 2 glasses of 5 L capacity and ~ 1.5 L of crushed ice prepared from distilled water is added to each glass to transfer the remaining on the walls Sediment flasks use distilled water. The contents of the glasses are mixed and concentrated hydrochloric acid (~ 1.3 L in each glass) is added to them until a weak acidity (pH ~ 6) is achieved, while an additional precipitate is observed. Leave the glasses for several hours to completely precipitate. The brown precipitate formed in both glasses is filtered off. The precipitates combined from both glasses are washed with distilled water (4 × 1 L) and thoroughly dried on a filter. In the process of drying the precipitate, large conglomerates are formed, which are crushed to increase the drying efficiency. The weight of the dried light brown precipitate is ~ 300 g.

Смешивают 2 л хлороформа и 0.4 л метанола (хлороформ: метанол = 5:1) и растворяют в этой смеси полученный ранее осадок. Растворение протекает достаточно медленно и требует выдержки в течение 1-2 ч при интенсивном перемешивании. Полученный раствор отфильтровывают, оставшийся осадок промывают 100 мл смеси хлороформа с метанолом в соотношении 5:1 (дважды по 50 мл), осадок (~10-15 г) удаляют. К фильтрату добавляют 2.3 л диэтилового эфира, при этом наблюдается интенсивное выпадение осадка. Полученную смесь перемешивают и оставляют на 1 ч для полного формирования осадка. Выпавший осадок отфильтровывают. Осадок промывают 150 мл диэтилового эфира (трижды по 50 мл), высушивают на фильтре. Вес осадка ~165 г. К полученному осадку добавляют 150 мл этилового спирта, перемешивают, отфильтровывают, высушивают на фильтре.2 L of chloroform and 0.4 L of methanol are mixed (chloroform: methanol = 5: 1) and the previously obtained precipitate is dissolved in this mixture. Dissolution proceeds rather slowly and requires exposure for 1-2 hours with vigorous stirring. The resulting solution was filtered, the remaining precipitate was washed with 100 ml of a mixture of chloroform with methanol in a ratio of 5: 1 (twice 50 ml), and the precipitate (~ 10-15 g) was removed. 2.3 L of diethyl ether was added to the filtrate, with intense precipitation being observed. The resulting mixture was stirred and left for 1 h to completely form a precipitate. The precipitate formed is filtered off. The precipitate is washed with 150 ml of diethyl ether (three times 50 ml), dried on a filter. The weight of the precipitate was ~ 165 g. 150 ml of ethanol was added to the obtained precipitate, stirred, filtered, dried on a filter.

Вес высушенного светло-коричневого осадка составляет ~150 г (выход ~60%). Полученная субстанция представляет собой смесь ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношении 20:80, соответственно.The weight of the dried light brown precipitate is ~ 150 g (yield ~ 60%). The resulting substance is a mixture of di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid in a ratio of 20:80, respectively.

Аналитический контроль качества получаемого продукта осуществляют с помощью элементного анализа, ВЭЖХ и ВЭЖХ-хроматомасс-спектрометрии.Analytical quality control of the resulting product is carried out using elemental analysis, HPLC and HPLC chromatomass mass spectrometry.

Пример 2Example 2

Синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислотыSynthesis of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates

Двугорлую колбу емкостью 5 л, снабженную эффективной механической мешалкой, помещают в баню с глицерином с термометром. В колбу наливают 3.5 л органического апротонного растворителя (ДМФА, N-метил-пирролидон, этилендиамин), предпочтительно пиридина, засыпают 500 г никотиновой кислоты и при перемешивании нагревают полученную реакционную смесь до 40-45°С (здесь и далее указана температура бани), затем, не прекращая перемешивания, добавляют к образовавшейся суспензии 265.5 г пятихлористого фосфора. После этого смесь нагревают до 50±3°С и перемешивают при этой температуре в течение 1.5 ч (примерно через 40-50 мин цвет реакционной смеси из светлого становится темно-коричневым).A two-necked flask with a capacity of 5 l, equipped with an effective mechanical stirrer, is placed in a glycerin bath with a thermometer. 3.5 l of an organic aprotic solvent (DMF, N-methyl-pyrrolidone, ethylenediamine), preferably pyridine, are poured into the flask, 500 g of nicotinic acid are added, and the resulting reaction mixture is heated to 40-45 ° С with stirring (hereinafter, the bath temperature is indicated), then, without stopping mixing, 265.5 g of phosphorus pentachloride are added to the resulting suspension. After this, the mixture is heated to 50 ± 3 ° C and stirred at this temperature for 1.5 hours (after about 40-50 minutes the color of the reaction mixture from light becomes dark brown).

Убирают баню, а колбу с реакционной смесью помещают в ледяную баню, перемешивают реакционную смесь в течение ~20 мин до остывания и добавляют при перемешивании 120 г глицирризиновой кислоты. Убирают охлаждающую баню, а колбу с реакционной смесью помещают в баню с глицерином и нагревают до 50±5°С, не прекращая перемешивания, и выдерживают при этой температуре в течение 2 ч. При нагревании значительная часть осадка растворяется.The bath was removed, and the flask with the reaction mixture was placed in an ice bath, the reaction mixture was stirred for ~ 20 min to cool and 120 g of glycyrrhizic acid was added with stirring. The cooling bath is removed, and the flask with the reaction mixture is placed in a glycerin bath and heated to 50 ± 5 ° С without stopping stirring and kept at this temperature for 2 hours. When heated, a significant part of the precipitate dissolves.

Дальнейшую обработку реакционной смеси проводят так же, как в примере 1. Вес высушенного светло-коричневого осадка составляет ~160 г (выход ~65%). Полученная субстанция представляет собой смесь ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношениии 50:50, соответственно.Further processing of the reaction mixture is carried out as in example 1. The weight of the dried light brown precipitate is ~ 160 g (yield ~ 65%). The resulting substance is a mixture of di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid in a ratio of 50:50, respectively.

Аналитический контроль качества получаемого продукта осуществляют с помощью элементного анализа, ВЭЖХ и ВЭЖХ-хроматомасс-спектрометрии.Analytical quality control of the resulting product is carried out using elemental analysis, HPLC and HPLC chromatomass mass spectrometry.

Пример 3Example 3

Синтез ди- и триникотинатов глицирризиновой кислотыSynthesis of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates

Двугорлую колбу емкостью 5 л, снабженную эффективной механической мешалкой, помещают в баню с глицерином с термометром. В колбу наливают 3.5 л органического апротонного растворителя (ДМФА, N-метил-пирролидон, этилендиамин), предпочтительно пиридина, засыпают 400 г никотиновой кислоты и при перемешивании нагревают реакционную смесь до 40-45°С (здесь и далее указана температура бани), затем, не прекращая перемешивания, добавляют к образовавшейся суспензии 205 г пятихлористого фосфора. После этого смесь нагревают до 40±3°С и перемешивают при этой температуре в течение 2.5 ч (примерно через 50-55 мин цвет реакционной смеси из светлого становится темно-коричневым).A two-necked flask with a capacity of 5 l, equipped with an effective mechanical stirrer, is placed in a glycerin bath with a thermometer. 3.5 L of an organic aprotic solvent (DMF, N-methyl-pyrrolidone, ethylenediamine), preferably pyridine, is poured into a flask, 400 g of nicotinic acid are added, and the reaction mixture is heated to 40-45 ° С with stirring (hereinafter, the bath temperature is indicated), then without stopping mixing, add to the resulting suspension 205 g of phosphorus pentachloride. After this, the mixture is heated to 40 ± 3 ° C and stirred at this temperature for 2.5 hours (after about 50-55 minutes the color of the reaction mixture from light becomes dark brown).

Убирают баню, а колбу с реакционной смесью помещают в ледяную баню, и перемешивают реакционную смесь в течение ~ 20 мин до остывания и добавляют при перемешивании 100 г глицирризиновой кислоты. Убирают охлаждающую баню, а колбу с реакционной смесью помещают в баню с глицерином и нагревают до 40±5°С, не прекращая перемешивания, и выдерживают при этой температуре в течение 3 ч 50 мин. При нагревании часть осадка растворяется.The bath is removed, and the flask with the reaction mixture is placed in an ice bath, and the reaction mixture is stirred for ~ 20 min until cooling, and 100 g of glycyrrhizic acid are added with stirring. The cooling bath was removed, and the flask with the reaction mixture was placed in a glycerin bath and heated to 40 ± 5 ° С without stopping stirring and kept at this temperature for 3 h 50 min. When heated, part of the precipitate dissolves.

Дальнейшую обработку реакционной смеси проводят так же, как в примере 1. Вес высушенного светло-коричневого осадка составляет ~120 г (выход ~45%). Полученная субстанция представляет собой смесь ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношениии 70:30 соответственно.Further processing of the reaction mixture is carried out as in example 1. The weight of the dried light brown precipitate is ~ 120 g (yield ~ 45%). The resulting substance is a mixture of di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid in a ratio of 70:30, respectively.

Аналитический контроль качества получаемого продукта осуществляют с помощью элементного анализа, ВЭЖХ и ВЭЖХ-хроматомасс-спектрометрии.Analytical quality control of the resulting product is carried out using elemental analysis, HPLC and HPLC chromatomass mass spectrometry.

Пример 4Example 4

Оценка цитотоксичности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислотыAssessment of cytotoxicity of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates

Цитотоксичность ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/80 оценивают путем добавления его разведении в бессывороточной среде RPMI-1640 к клеточной суспензии МТ-4, помещенной в лунки 96-луночного планшета ("Cel-Cult", England), до конечных концентраций 0,001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в течение 4 суток [Ito M., Sato A., Hirabayashi К., Tanabe F., Shigeta S., Baba M., De Clercq E., Nakashima H., Yamamoto N. «Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV)». Antiviral Res., 1988, V.10, p.289-298]. Посевная концентрация составляет 0,5×10⁶ клеточных частиц в миллилитре. Контролем служат клетки без добавления препарата, вместо которого вносят такое же количество бессывороточной среды. Жизнеспособность клеток подсчитывают на 4 сутки культивирования, пользуясь формазановым методом (прижизненным окрашиванием клеток 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Токсичность различных доз препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контрольных, а по полученным результатам строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD₅₀).The cytotoxicity of 20/80 glycyrrhizic acid di- and trinicotinates is assessed by adding dilution in serum-free RPMI-1640 medium to a MT-4 cell suspension placed in wells of a 96-well plate (Cel-Cult, England) to final concentrations 0.001-100 μg / ml (three wells per dose), followed by cultivation at 37 ° C for 4 days [Ito M., Sato A., Hirabayashi K., Tanabe F., Shigeta S., Baba M., De Clercq E., Nakashima H., Yamamoto N. “Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV)”. Antiviral Res., 1988, V.10, p. 289-298]. The inoculum concentration is 0.5 × 10 ⁶ cell particles per milliliter. Cells are used as control without the addition of a drug, instead of which the same amount of serum free medium is added. Cell viability is calculated on the 4th day of cultivation using the formazan method (intravital staining of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) cells. Toxicity of various doses of the drug is determined by cell viability relative to the control, and according to the results obtained, a dose-dependent curve is built and a concentration is determined that reduces cell viability by 50% (CD ₅₀ ).

Показатель токсичности исследуемого препарата CD₅₀ - 2600 мкг/мл.The toxicity index of the studied drug CD ₅₀ - 2600 mcg / ml.

Пример 5Example 5

Оценка цитотоксичности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислотыAssessment of cytotoxicity of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates

То же, что в примере 4, но оценку проводят ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношении 50/50.The same as in example 4, but the assessment is carried out di - and trinicotinate glycyrrhizic acid in a ratio of 50/50.

Показатель токсичности исследуемого препарата CD₅₀ - 2100 мкг/мл.The toxicity index of the studied drug CD ₅₀ - 2100 μg / ml.

Пример 6Example 6

Оценка цитотоксичности ди- и триникотинатов глицирризиновой кислотыAssessment of cytotoxicity of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates

То же, что в примере 4, но оценку проводят ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты в соотношении 80/20.The same as in example 4, but the assessment is carried out di - and trinicotinate glycyrrhizic acid in a ratio of 80/20.

Показатель токсичности исследуемого препарата CD₅₀ - 1500 мкг/мл.The toxicity index of the studied drug CD ₅₀ - 1500 μg / ml.

Таким образом, ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты не оказывают токсического воздействия на клетки МТ-4 в эффективных концентрациях: 50% токсичные дозы на 5-6 порядков превышают эффективные в отношении ВИЧ-1 дозы.Thus, glycyrrhizic acid di- and trinicotinates do not have toxic effects on MT-4 cells in effective concentrations: 50% toxic doses are 5-6 orders of magnitude higher than those effective for HIV-1.

Пример 7Example 7

Определение влияния ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4Determination of the effect of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates on HIV-1 reproduction in MT-4 cell culture

Исследование противовирусной активности соединений в отношении ВИЧ-1 проводят на перевиваемой линии чувствительных клеток МТ-4. Для заражения используют супернатант инфицированных клеток, хранящийся в жидком азоте, множественность заражения составляет 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку.A study of the antiviral activity of compounds against HIV-1 is carried out on the transplantable line of sensitive cells MT-4. For infection, the supernatant of infected cells stored in liquid nitrogen is used, the multiplicity of infection is 0.2-0.5 infectious units per cell.

Суспензию клеток МТ-4 с концентрацией 2,0×10⁶ клеточных частиц в миллилитре и жизнеспособностью не менее 90% помещают в лунки 96-луночного планшета ("Orange") непосредственно после внесения вируссодержащего материала и добавляют ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/80, разведенные в среде RPMI-1640 без сыворотки, до конечных концентраций 0,0001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу). Контролями служат инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4 без добавления препарата (вместо препарата вносят такое же количество среды RPMI-1640 без добавок) и неинфицированные клетки.A suspension of MT-4 cells with a concentration of 2.0 × 10 ⁶ cell particles per milliliter and a viability of at least 90% is placed in the wells of a 96-well plate ("Orange") immediately after application of the virus-containing material and glycyrrhizic acid di- and trinicotinates are added in the ratio 20/80, diluted in serum-free RPMI-1640 medium, to final concentrations of 0.0001-100 μg / ml (three wells per dose). The controls are HIV-1 infected MT-4 cells without drug addition (instead of the drug, the same amount of RPMI-1640 medium without additives is added) and uninfected cells.

Планшет инкубируют в течение часа при 37°С для адсорбции вируса, затем клетки разводят до посевной концентрации (0,5×10⁶ в миллилитре) питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина и 100 мкг/мл гентамицина. Затем планшет помещают в термостат на 37°С в атмосфере 5% CO₂. На 4-е сутки культивирования подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток формазановым методом. По полученным данным строят графики зависимости прироста жизнеспособности клеток относительно контроля под действием возрастающих доз препаратов, т.е. определяют способность препаратов защищать инфицированные клетки от цитопатогенного действия вируса.The plate is incubated for one hour at 37 ° C to adsorb the virus, then the cells are diluted to a seed concentration (0.5 × 10 ⁶ per milliliter) with RPMI-1640 nutrient medium supplemented with 10% fetal bovine serum pre-inactivated by heating at 56 ° C in for 30 minutes, 300 mg / ml L-glutamine and 100 μg / ml gentamicin. Then the tablet is placed in a thermostat at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ . On the 4th day of cultivation, the concentration and viability of the cells are calculated by the formazan method. According to the data obtained, graphs of the dependence of the growth of cell viability relative to control under the influence of increasing doses of drugs are constructed, i.e. determine the ability of drugs to protect infected cells from the cytopathogenic effect of the virus.

Оценку анти-ВИЧ активности соединений проводят с использованием количественного определения вирусспецифического белка р24 методом прямого иммуноферментного анализа, как описано в работе Fields A.P., Bednarik P.P., Hess A., May W.S. «Human immunodeficiency virus induces phosphorylation of its cell surface receptor». Nature (London), 1988, V.333, p.278-280, и строят дозозависимые кривые, по которым рассчитывают концентрации, на 50 и 90% подавляющие прирост вирусного антигена (ID₅₀ и ID₉₀). Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-ной токсической концентрации соединения к его 50%-ной эффективной дозе.Evaluation of the anti-HIV activity of the compounds is carried out using the quantification of virus-specific protein p24 by direct enzyme immunoassay, as described in Fields AP, Bednarik PP, Hess A., May WS "Human immunodeficiency virus induces phosphorylation of its cell surface receptor". Nature (London), 1988, V.333, p. 278-280, and dose-response curves are plotted from which concentrations are calculated that inhibit the growth of the viral antigen by 50 and 90% (ID ₅₀ and ID ₉₀ ). The therapeutic index, or selectivity index (IS) is considered as the ratio of a 50% toxic concentration of a compound to its 50% effective dose.

Полученные результаты: CD₅₀ - 2600 мкМ, ID₅₀ - 1.2 мкМ, IS - 2166/.7The results obtained: CD ₅₀ - 2600 μM, ID ₅₀ - 1.2 μM, IS - 2166 / .7

Пример 8Example 8

Определение влияния ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4Determination of the effect of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates on HIV-1 reproduction in MT-4 cell culture

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 50/50.The same as in example 7, but in the wells of a 96-well plate ("Orange") immediately after adding virus-containing material add di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid in a ratio of 50/50.

Полученные результаты: CD₅₀ - 2100 мкМ, ID₅₀ - 2.2 мкМ, IS - 954.54.The results obtained: CD ₅₀ - 2100 μM, ID ₅₀ - 2.2 μM, IS - 954.54.

Пример 9Example 9

Определение влияния ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4Determination of the effect of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates on HIV-1 reproduction in MT-4 cell culture

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 80/20.The same as in example 7, but in the wells of a 96-well plate ("Orange") immediately after adding virus-containing material add di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid in a ratio of 80/20.

Полученные результаты: CD₅₀ - 1500 мкМ, ID₅₀ - 4.1 мкМ, IS - 365.9.The results obtained: CD ₅₀ - 1500 μM, ID ₅₀ - 4.1 μM, IS - 365.9.

Пример 10Example 10

Определение влияния глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4Determination of the effect of glycyrrhizic acid on HIV-1 reproduction in MT-4 cell culture

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют глицирризиновую кислоту.The same as in example 7, but glycyrrhizic acid is added to the wells of a 96-well plate (“Orange”) immediately after the introduction of the virus-containing material.

Полученные результаты: CD₅₀ - 2040 мкМ, ID₅₀ - 212.5 мкМ, IS - 9.6.The results obtained: CD ₅₀ - 2040 μM, ID ₅₀ - 212.5 μM, IS - 9.6.

Пример 11Example 11

Определение влияния моноаммонийной соли глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4Determination of the effect of monoammonium salt of glycyrrhizic acid on HIV-1 reproduction in MT-4 cell culture

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют моноаммонийную соль глицирризиновой кислоты.The same as in example 7, but in the wells of a 96-well plate ("Orange") immediately after the introduction of the virus-containing material add monoammonium salt of glycyrrhizic acid.

Полученные результаты: CD₅₀ - 2065 мкМ, ID₅₀ - 46.3 мкМ, IS - 44.6.The results obtained: CD ₅₀ - 2065 μM, ID ₅₀ - 46.3 μM, IS - 44.6.

Пример 12Example 12

Определение влияния пента-никотината глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4Determination of the effect of glycyrrhizic acid penta-nicotinate on HIV-1 reproduction in MT-4 cell culture

То же, что в примере 7, но в лунки 96-луночного планшета («Orange») непосредственно после внесения вируссодержащего материала добавляют пента-никотинат глицирризиновой кислоты.Same as in Example 7, but penta-nicotinate glycyrrhizic acid was added to the wells of a 96-well plate (“Orange”) immediately after the virus-containing material was added.

Полученные результаты: CD₅₀ - 863 мкМ, ID₅₀ - 15.1 мкМ, IS - 57.0.The results obtained: CD ₅₀ - 863 μM, ID ₅₀ - 15.1 μM, IS - 57.0.

Таким образом, полученные количественные показатели ингибирования подтверждают высокую степень подавления репликации ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 ди- и триникотинатами глицирризиновой кислоты, превышающую, например, тот же показатель у прототипа - пента-никотината глицирризиновой кислоты в 5-15 раз.Thus, the obtained quantitative indicators of inhibition confirm the high degree of suppression of HIV-1 replication in MT-4 cell culture with glycyrrhizic acid di- and trinicotinates, which is, for example, 5-15 times higher than that of the prototype, glycyrrhizic acid penta-nicotinate.

Из приведенных примеров видно, что ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях (50%-е токсические дозы на 5-6 порядков превышают 50%-е ингибирующие дозы), помимо способности защищать клетки от гибели в результате цитопатогенного действия вируса (>50% в дозах 0,1-1,5 мкг/мл), в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1-го типа в культуре клеток МТ-4. Терапевтические индексы ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты (IS) в 10-100 раз больше, чем для других производных глицирризиновой кислоты.It can be seen from the above examples that di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid, without exerting toxic effects on cells in effective concentrations (50% toxic doses are 5-6 orders of magnitude higher than 50% inhibitory doses), in addition to the ability to protect cells from death in as a result of the cytopathogenic effect of the virus (> 50% in doses of 0.1-1.5 μg / ml), the reproduction of type 1 immunodeficiency virus in the MT-4 cell culture is highly suppressed. The therapeutic indices of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates (IS) are 10-100 times greater than for other glycyrrhizic acid derivatives.

Пример 13Example 13

Определение влияния ди- и триникотинатов глицирризиновой кислоты на репродукцию мутанта ВИЧ-1, устойчивого к действию АЗТ в культуре клеток МТ-4.Determination of the effect of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates on the reproduction of an HIV-1 mutant resistant to the action of AZT in MT-4 cell culture.

То же, что в примере 7, но вместо суспензии клеток МТ-4 используют суспензию клеток мутанта ВИЧ-1, устойчивого к действию АЗТ в культуре клеток МТ-4.The same as in example 7, but instead of the suspension of MT-4 cells, a suspension of HIV-1 mutant cells is used, which is resistant to the action of AZT in the MT-4 cell culture.

Полученные результаты: Для АЗТ-резистентного мутанта ID₅₀ - 0,15 мкг/мл, а для исходного штамм вируса ID₅₀ - 1.2 мкг/мл.The results: For the AZT-resistant mutant ID ₅₀ - 0.15 μg / ml, and for the initial strain of the ID ₅₀ virus - 1.2 μg / ml.

Пример 14Example 14

Определение влияния пента-никотината глицирризиновой кислоты на репродукцию мутанта ВИЧ-1, устойчивого к действию АЗТ в культуре клеток МТ-4Determination of the effect of glycyrrhizic acid penta-nicotinate on the reproduction of an HIV-1 mutant resistant to the action of AZT in MT-4 cell culture

То же, что в примере 12, но вместо суспензии клеток МТ-4 используют суспензию клеток мутанта ВИЧ-1, устойчивого к действию АЗТ в культуре клеток МТ-4.The same as in example 12, but instead of the suspension of MT-4 cells, a suspension of HIV-1 mutant cells is used, which is resistant to the action of AZT in the MT-4 cell culture.

Полученные результаты: Для АЗТ-резистентного мутанта ID₅₀ - 0,11 мкг/мл, а для исходного штамм вируса ID₅₀ - 15.1 мкг/мл.The results obtained: For the AZT-resistant mutant ID ₅₀ , 0.11 μg / ml, and for the initial ID ₅₀ virus strain, 15.1 μg / ml.

Таким образом, новые химические соединения - ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты имеют высокую биологическую активность, которая проявляется по меньшей мере в том, что они являются высокоактивными ингибиторами репродукции вируса иммунодефицита человека и могут использоваться в чистом виде или в качестве основы новых высокоэффективных лекарственных форм для лечения СПИДа.Thus, new chemical compounds, glycyrrhizic acid di- and trinicotinates, have high biological activity, which manifests itself at least in that they are highly active inhibitors of the reproduction of the human immunodeficiency virus and can be used in pure form or as the basis for new highly effective dosage forms for AIDS treatment.

Таблица 1.Table 1. Цитотоксичность ди- и триникотинатов глицирризиновой кислотыCytotoxicity of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates № примераExample No. ПрепаратA drug CD₅₀, мкг/млCD ₅₀ μg / ml 4four ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/80di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid in a ratio of 20/80 2600,02600.0 55 ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 50/5050/50 di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid 2100,02100.0 66 ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 80/2080/20 di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid 1500,01,500.0 Таблица 2.Table 2. Анти-ВИЧ активность ди- и триникотинатов глицирризиновой кислотыAnti-HIV activity of glycyrrhizic acid di- and trinicotinates № примераExample No. СоединениеCompound CD₅₀, мкМCD ₅₀ μm ID₅₀, МКМID ₅₀ , MKM ISIS 77 ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/80di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid in a ratio of 20/80 26002600 1,21,2 2166,72166.7 88 ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 50/5050/50 di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid 21002100 2,22.2 954,54954.54 99 ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 80/2080/20 di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid 15001500 4,14.1 365,9365.9 1010 Глицирризиновая кислотаGlycyrrhizic acid 20402040 212,5212.5 9,69.6 11eleven Моноаммонийная соль глицирризиновой кислотыMonoammonium salt of glycyrrhizic acid 20652065 46,346.3 44,644.6 1212 Пента-никотинат глицирризиновой кислотыGlycyrrhizic acid penta-nicotinate 863863 15,115.1 57,057.0

Таблица 3.Table 3. Количественные характеристики ингибирования АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1 ди- и триникотинатами глицирризиновой кислотыQuantitative characteristics of the inhibition of the AZT-resistant mutant HIV-1 with glycyrrhizic acid di- and trinicotinates   ПрепаратA drug ID₅₀, мкг/млID ₅₀ , mcg / ml АЗТ-резистентный мутантAZT-resistant mutant Исходный штамм вирусаThe original strain of the virus   АЗТAZT 1,121.12 0,0070.007 1313 ди- и триникотинаты глицирризиновой кислоты в соотношении 20/80di- and trinicotinates of glycyrrhizic acid in a ratio of 20/80 0,150.15 1,21,2 14fourteen пента-никотинат глицирризиновой кислотыglycyrrhizic acid penta-nicotinate 0,110.11 15,115.1

Claims (2)

1. Ди- и/или триникотинаты глицирризиновой кислоты общей формулы1. Di- and / or trinicotinates of glycyrrhizic acid of the general formula

где R -

или Н, причем два и/или три из названных R -

.where R is

or H, and two and / or three of these R -

. 2. Ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека, включающий соединение глицирризиновой кислоты, отличающийся тем, что названое соединение является ди- и/или триникотинатом глицирризиновой кислоты.2. Inhibitor of the reproduction of the human immunodeficiency virus, comprising a compound of glycyrrhizic acid, characterized in that the named compound is di- and / or trinicotinate of glycyrrhizic acid.