RU2302250C1 - Preparation of anticoagulant action and method for its obtaining - Google Patents
Preparation of anticoagulant action and method for its obtaining Download PDFInfo
- Publication number
- RU2302250C1 RU2302250C1 RU2006104772/15A RU2006104772A RU2302250C1 RU 2302250 C1 RU2302250 C1 RU 2302250C1 RU 2006104772/15 A RU2006104772/15 A RU 2006104772/15A RU 2006104772 A RU2006104772 A RU 2006104772A RU 2302250 C1 RU2302250 C1 RU 2302250C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- protein
- dissolved
- dried
- ethanol
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и касается создания антикоагулянтных средств животного происхождения.The invention relates to medicine and relates to the creation of anticoagulant agents of animal origin.
Наиболее часто в медицине в качестве антикоагулянтных средств используются препараты на основе гепарина и его производных. Гепарин является кислым мукополисахаридом с молекулярной массой около 16000 дальтон. Вырабатывается в организме человека и животных базофильными (тучными) клетками. В наибольших количествах содержится в печени и легких, меньше - в скелетных мышцах, селезенке и мышце сердца. Получают гепарин из легких крупного рогатого скота [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15-е изд. - М.: ООО "Изд. Новая Волна", 2005. 1200 с.]. Активность гепарина определяют по способности удлинять время свертывания плазмы крови и выражают в единицах действия (ЕД), 1 мг международного стандарта гепарина содержит 130 ЕД (1 ЕД=0,0077 мг). Практически препарат выпускается с активностью не менее 120 ЕД на 1 мг. Раствор гепарина для инъекций выпускается с активностью 5000, 10000 и 20000 ЕД в 1 мл [Клиническая биохимия / Под ред. В.А.Ткачука. 2-е изд., испр. и доп. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 512 с.].Most often in medicine, drugs based on heparin and its derivatives are used as anticoagulant agents. Heparin is an acidic mucopolysaccharide with a molecular weight of about 16,000 daltons. It is produced in the human and animal body by basophilic (mast) cells. The largest amount is found in the liver and lungs, less - in skeletal muscles, spleen and muscle of the heart. Get heparin from the lungs of cattle [Mashkovsky M.D. Medicines 15th ed. - M .: LLC "Publishing House. New Wave", 2005. 1200 p.]. Heparin activity is determined by the ability to extend the coagulation time of blood plasma and is expressed in units of action (U), 1 mg of the international standard of heparin contains 130 U (1 U = 0.0077 mg). In practice, the drug is available with an activity of at least 120 PIECES per 1 mg. A solution of heparin for injection is available with an activity of 5000, 10000 and 20,000 units in 1 ml [Clinical Biochemistry / Ed. V.A. Tkachuk. 2nd ed., Rev. and add. M.: GEOTAR-MED, 2004. 512 p.].
Гепарин является естественным противосвертывающим фактором и совместно с фибринолизином входит в состав физиологической антисвертывающей системы. Он относится к антикоагулянтам прямого действия, т.е. непосредственно влияет на факторы свертывания крови (XII, XI, X, IX, VII и II). Кроме того, он блокирует биосинтез тромбина и уменьшает агрегацию тромбоцитов. Противосвертывающее действие гепарина проявляется in vitro и in vivo. Гепарин обладает не только антикоагулянтным действием, но угнетает активность гиалуронидазы, активизирует в некоторой степени фибринолитические свойства крови и улучшает коронарный кровоток. Введение гепарина в организм сопровождается некоторым понижением содержания холестерина и β-липопротеидов в сыворотке крови [Клиническая биохимия / Под ред. В.А.Ткачука. 2-е изд., испр. и доп. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 512 с.].Heparin is a natural anticoagulant factor and, together with fibrinolysin, is part of the physiological anticoagulant system. It refers to direct-acting anticoagulants, i.e. directly affects blood coagulation factors (XII, XI, X, IX, VII and II). In addition, it blocks the thrombin biosynthesis and reduces platelet aggregation. The anticoagulant effect of heparin appears in vitro and in vivo. Heparin has not only an anticoagulant effect, but inhibits the activity of hyaluronidase, activates to some extent the fibrinolytic properties of blood and improves coronary blood flow. The introduction of heparin into the body is accompanied by a certain decrease in the content of cholesterol and β-lipoproteins in the blood serum [Clinical Biochemistry / Ed. V.A. Tkachuk. 2nd ed., Rev. and add. M.: GEOTAR-MED, 2004. 512 p.].
Противосвертывающее действие гепарина осуществляется при его введении в вену, мышцы или под кожу. Гепарин действует быстро, но относительно кратковременно. При однократном введении в вену угнетение свертывания крови наступает почти сразу и продолжается в течение 4-5 часов. Гепарин применяют при профилактике и терапии различных тромбоэмболических заболеваний и их осложнений, например, для предотвращения или ограничения тромбообразования при остром инфаркте миокарда, тромбозах и эмболиях магистральных вен и артерий, сосудов мозга и глаз. Кроме того, его используют при операциях на сердце и кровеносных сосудах для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах искусственного кровообращения и гемодиализа, а также для предотвращения свертывания крови в лабораторных исследованиях. Гепарин часто назначают в сочетании с ферментными фибринолитическими препаратами. Применение гепарина обеспечивает улучшение состояния не только за счет непосредственного действия на тромб, но и вследствие развития коллатерального кровообращения, ограничения дальнейшего развития тромба и антиспастического-действия [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15-е изд. М.: OOO "Изд. Новая Волна", 2005. 1200 с.].The anticoagulant effect of heparin is carried out when it is injected into a vein, muscle or under the skin. Heparin acts quickly, but relatively briefly. With a single injection into a vein, inhibition of blood coagulation occurs almost immediately and lasts for 4-5 hours. Heparin is used in the prevention and treatment of various thromboembolic diseases and their complications, for example, to prevent or limit thrombosis in acute myocardial infarction, thrombosis and embolism of the main veins and arteries, brain vessels and eyes. In addition, it is used in operations on the heart and blood vessels to maintain the liquid state of blood in the apparatus of cardiopulmonary bypass and hemodialysis, as well as to prevent blood coagulation in laboratory studies. Heparin is often prescribed in combination with enzymatic fibrinolytic drugs. The use of heparin provides an improvement not only due to the direct effect on the thrombus, but also due to the development of collateral circulation, limitation of the further development of the thrombus and antispastic action [Mashkovsky MD Medicines 15th ed. M .: OOO "Publishing house. New Wave", 2005. 1200 p.].
Кроме гепарина в последнее десятилетие в медицине вновь стали использоваться антикоагулянтные препараты на основе биологически активных веществ, выделенных из пиявок, и в первую очередь препарат гирудин. Препарат был впервые получен из слюнных желез пиявок Hirudo medicinalis. Для медицинского применения удалось получить рекомбинантный гирудин. Созданы также некоторые его аналоги - препараты "Ревакс" (десульфатогирудин), "Гиролог" (бавилирудин), "Аргатробан". Предложен отечественный препарат "Пиявит", выпускаемый в виде капсул, содержащих гирудин, ингибитор калликреина, трипсин, химотрипсин, липазу и гиалоронидазу [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15-е изд. М.: OOO "Изд. Новая Волна", 2005. 200 с.].In addition to heparin, in the last decade, anticoagulant drugs based on biologically active substances isolated from leeches, and first of all the hirudin preparation, have again been used in medicine. The drug was first obtained from the salivary glands of leech Hirudo medicinalis. For medical use, it was possible to obtain recombinant hirudin. Some of its analogues have also been created - the preparations Revaks (desulfatogirudin), Gyrologist (bavilirudin), Argatroban. A domestic preparation “Piyavit” is proposed, which is available in the form of capsules containing hirudin, a kallikrein inhibitor, trypsin, chymotrypsin, lipase and hyaloronidase [Mashkovsky M. D. Medicines 15th ed. M .: OOO "Publishing house. New Wave", 2005. 200 p.].
Гирудин(65-членный пептид) - прямой ингибитор тромбина, блокирующий свертывание фибриногена, замедляющий активацию факторов свертывания V, VIII, XIII тромбином и препятствующий агрегации тромбоцитов. Гирудин и его аналоги связываются с тромбином в двух различных участках - в каталитическом центре и в фибриноген-связывающей области, что определяет его высокое сродство и специфичность к тромбину. При различных формах острой коронарной недостаточности гирудин обладает несколько большей эффективностью, чем гепарин, в основном, за счет снижения частоты несмертельных инфарктов миокарда. Относительная эффективность гирудина наиболее выражена в первые сутки и со временем нивелируется. Гирудин в оптимальной дозе не увеличивает существенно риск тяжелых геморрагических осложнений. К недостаткам гирудина следует отнести иммуногенность и преимущественно почечную экскрецию, [Warkentin Т.Е. Bivalent direct thrombin inhibitors: hirudin and bivalirudin // Best Practice Res. Clinic. Haemat. 2004. V.17. P.105-125].Hirudin (a 65-membered peptide) is a direct thrombin inhibitor that blocks fibrinogen coagulation, slows down the activation of coagulation factors V, VIII, XIII by thrombin and prevents platelet aggregation. Hirudin and its analogues bind to thrombin in two different sites - in the catalytic center and in the fibrinogen-binding region, which determines its high affinity and specificity for thrombin. In various forms of acute coronary insufficiency, hirudin is slightly more effective than heparin, mainly due to a decrease in the frequency of non-fatal myocardial infarction. The relative effectiveness of hirudin is most pronounced on the first day and levels over time. Hirudin in the optimal dose does not significantly increase the risk of severe hemorrhagic complications. The disadvantages of hirudin include immunogenicity and mainly renal excretion, [Warkentin T.E. Bivalent direct thrombin inhibitors: hirudin and bivalirudin // Best Practice Res. Clinic. Haemat. 2004. V.17. P.105-125].
В отечественной и зарубежной литературе имеется информация о голотуриях, ткани которых богаты биологически активными веществами, обладающими широким спектром фармакологических эффектов. В частности, опубликован ряд работ о противоопухолевой, иммуномодулирующей и антифунгальной активности тритерпеновых гликозидов из различных видов-голотурий, в том числе из трепанга. Известно, что мышечная ткань голотурий содержит большое количество коллагена, который участвует в регенерации клеток и поддержании структуры и функции соединительных тканей [Саватеева Л.Ю. и др. Дальневосточные голотурии и асцидии как ценное пищевое сырье // Владивосток. Изд. Дальневост. ун-т. 1983. 184 с.; Попов А.М. и др. Характеристика медико-биологических свойств голотоксинов из дальневосточного трепанга // Материалы V-го Международного съезда "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения". Россия. Санкт-Петербург, 2001. С.135-139].In domestic and foreign literature there is information about holothuria, the tissues of which are rich in biologically active substances with a wide range of pharmacological effects. In particular, a number of works on the antitumor, immunomodulating and antifungal activity of triterpene glycosides from various holothuria species, including trepang, were published. It is known that the muscle tissue of holothuria contains a large amount of collagen, which is involved in the regeneration of cells and the maintenance of the structure and function of connective tissues [Savateeva L.Yu. and other Far Eastern holothurians and ascidians as valuable food raw materials // Vladivostok. Ed. Far East. un-t 1983. 184 p .; Popov A.M. et al. Characterization of the biomedical properties of holotoxins from Far Eastern trepang // Materials of the Vth International Congress "Actual Problems of Creating New Medicines of Natural Origin". Russia. St. Petersburg, 2001. S.135-139].
Однако в доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено сведений о средствах, обладающих антикоагулянтной активностью, выделенных из голотурий.However, in the patent and other scientific and technical literature, no information was found on agents with anticoagulant activity isolated from holothurians.
В качестве прототипа выбран гепарин, т.к. он является широко используемым лекарственным препаратом и близок к заявляемому средству по фармакологическому действию. Однако ему присущ ряд отрицательных свойств таких, как тромбоцитопения и аллергические реакции немедленного типа (крапивница, ангионевротический отек или бронхоспазм). После введения гепарина наблюдается значительное замедление рекальцификации плазмы, понижение толерантности и удлинение тромбинового времени. Применяя гепарин, необходимо учитывать возможность развития геморрагии. Для предупреждения осложнений препарат вводят только в условиях стационара, ограничивая количество инъекций других лекарств. Дополнительное внутривенное введение гепарина, который традиционно назначают после тромболитической терапии больным с острым инфарктом миокарда, не позволяет значительно снизить показатели смертности. Гепарин также не снижает частоту возникновения повторного инфаркта или рецидива ишемии и склонен повышать частоту кровотечений [Mahaffey K.W., Granger C.B., Collins R., et al. Overview of randomized trials of intravenous heparin in patients with acute myocardial infarction treated with thrombolytic therapy // Am. J. Cardiol. 1996. V.77. P.551-556].Heparin was chosen as a prototype, as it is a widely used drug and is close to the claimed pharmacological action. However, it has a number of negative properties, such as thrombocytopenia and immediate allergic reactions (urticaria, angioedema or bronchospasm). After the introduction of heparin, a significant slowdown in plasma recalcification is observed, a decrease in tolerance and an extension of thrombin time. Using heparin, it is necessary to consider the possibility of developing hemorrhage. To prevent complications, the drug is administered only in a hospital setting, limiting the number of injections of other drugs. Additional intravenous administration of heparin, which is traditionally prescribed after thrombolytic therapy for patients with acute myocardial infarction, does not significantly reduce mortality rates. Heparin also does not reduce the incidence of recurrent heart attack or recurrence of ischemia and tends to increase the frequency of bleeding [Mahaffey K.W., Granger C. B., Collins R., et al. Overview of randomized trials of intravenous heparin in patients with acute myocardial infarction treated with thrombolytic therapy // Am. J. Cardiol. 1996. V.77. P.551-556].
Имеются данные о наличии у гепарина иммуносупрессивных свойств. Одним из механизмов иммуносупрессивного действия является, по-видимому, подавление кооперативного взаимодействия Т- и В-клеток. Применение гепарина противопоказано при заболеваниях, сопровождающихся замедлением процесса свертывания крови, а также при повышенной проницаемости сосудов, кровотечениях любой локализации (за исключением геморрагии при эмболическом инфаркте легкого или почек), подостром бактериальном эндокардите, тяжелых нарушениях функции печени и почек, острых и хронических лейкозах, апластических и гипопластических анемиях, остро развившейся аневризме сердца и венозной гангрене [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15-е изд. М.: ООО "Изд. Новая Волна", 2005. 1200 с.].There is evidence of the presence of immunosuppressive properties in heparin. One of the mechanisms of the immunosuppressive action is, apparently, the suppression of the cooperative interaction of T and B cells. The use of heparin is contraindicated in diseases accompanied by a slowdown in the blood coagulation process, as well as with increased vascular permeability, bleeding of any localization (except hemorrhage with embolic lung or kidney infarction), subacute bacterial endocarditis, severe liver and kidney function, acute and chronic leukemia, aplastic and hypoplastic anemia, acute aneurysm of the heart and venous gangrene [Mashkovsky MD Medicines 15th ed. M.: LLC. Publishing New Wave, 2005. 1200 S.].
Поэтому поиск новых эффективных и безопасных антикоагулянтов остается до настоящего времени чрезвычайно актуальным.Therefore, the search for new effective and safe anticoagulants remains extremely relevant to date.
В основу настоящего изобретения положена задача создания средства, обладающего антикоагулянтной активностью, и разработка способа его получения из голотурий.The basis of the present invention is the creation of funds with anticoagulant activity, and the development of a method for its preparation from holothuria.
Поставленная задача решена новым средством, обладающим антикоагулянтным действием, характеризующимся тем, что оно представляет собой фрагмент коллагена, полученный путем ферментативного гидролиза тела голотурии Apostichopus japonicus, с молекулярной массой около 12000 дальтон, содержащий углеводы, сульфаты, а также микро- и макроэлементы, и сохраняющий структуру нативного коллагена.The problem is solved by a new tool with anticoagulant action, characterized in that it is a collagen fragment obtained by enzymatic hydrolysis of the body of the holothurium Apostichopus japonicus, with a molecular weight of about 12,000 daltons, containing carbohydrates, sulfates, as well as micro and macro elements, and preserving the structure of native collagen.
Новое средство получило название Апотромбостатин (АТС).The new drug is called Apotrombostatin (ATS).
В доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено сведений о способах получения веществ белковой природы из голотурий.In available patent and other scientific and technical literature, no information was found on methods for producing protein substances from holothuria.
Задача решена также разработкой способа получения средства белковой природы, обладающего антикоагулянтным действием, из голотурии. Сущность способа получения заявляемого средства заключается в следующем: тело голотурии Apostichopus japonicus гомогенизируют, экстрагируют дистиллированной водой при рН 8,0-8,5, затем экстракт обрабатывают ферментным препаратом при 35-37°С, при рН 7,5-8,5 в течение 3,5-4,5 ч, далее к охлажденной до комнатной температуры смеси добавляют этанол до содержания его в экстракте 40%. Сформировавшийся нитевидный осадок отделяют, отжимают белковые волокна на фильтре, затем последовательно промывают 40% и 96% этанолом и сушат, далее продукт растворяют в 0,05-0,1 М растворе бикарбоната натрия, затем осуществляют повторный ферментолиз, осаждение и очистку белкового продукта. Далее продукт растворяют в воде и осаждают кислотой, затем осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 0,05-0,1 М растворе бикарбоната натрия. Затем раствор, содержащий белок, подвергают диализу или ультрафильтрации на мембране, пропускающей вещества с молекулярной массой 15 кДа с целью удаления низкомолекулярных примесей и солей. После этого обессоленный раствор белка пропускают через стерилизующую мембрану с размером пор 0,2 мкм и собирают белковую фракцию, проходящую через мембрану. Целевой продукт высушивают.The problem was also solved by the development of a method for producing a proteinaceous agent with anticoagulant effect from holothuria. The essence of the method for producing the claimed agent is as follows: the body of the holothuria Apostichopus japonicus is homogenized, extracted with distilled water at a pH of 8.0-8.5, then the extract is treated with an enzyme preparation at 35-37 ° C, at a pH of 7.5-8.5 V for 3.5-4.5 hours, then ethanol is added to the mixture cooled to room temperature until it is 40% in the extract. The formed filamentary precipitate is separated, the protein fibers are squeezed out on the filter, then washed successively with 40% and 96% ethanol and dried, then the product is dissolved in a 0.05-0.1 M sodium bicarbonate solution, then fermentolysis, precipitation and purification of the protein product are carried out. Then the product is dissolved in water and precipitated with acid, then the precipitate is separated by centrifugation and dissolved in a 0.05-0.1 M sodium bicarbonate solution. Then, the protein-containing solution is subjected to dialysis or ultrafiltration on a membrane that passes substances with a molecular weight of 15 kDa in order to remove low molecular weight impurities and salts. After that, the desalted protein solution is passed through a sterilizing membrane with a pore size of 0.2 μm and the protein fraction passing through the membrane is collected. The target product is dried.
В качестве ферментного препарата используют препарат, выбранный из ряда: комплекс коллагенолитических протеиназ, трипсин, проназа, субтилизин, коллализин.As an enzyme preparation, a drug selected from the series is used: a complex of collagenolytic proteinases, trypsin, pronase, subtilisin, collalysin.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в расширении спектра веществ иного механизма антикоагулянтного действия, чем механизм действия гепарина, а также в уменьшении количества побочных эффектов.The technical result provided by the invention is to expand the spectrum of substances of a different mechanism of anticoagulant action than the mechanism of action of heparin, as well as to reduce the number of side effects.
Заявляемое средство АТС обладает антикоагулянтной активностью, которая носит выраженный дозозависимый характер, нетоксично, обладает высокой растворимостью в биосовместимых жидкостях и растворах. АТС обладает сравнительно умеренной антикоагулянтной активностью, являясь преимущественно ингибитором начального звена системы свертывания крови, инициируемого внешними или внутренними факторами коагуляционного процесса. АТС не влияет на активность тромбина в фазе полимеризации фибринового сгустка. Механизм антикоагулянтного действия АТС на систему коагуляционного звена гемостаза отличается от такового для гепарина. Вышеперечисленные свойства заявляемого средства приведут к тому, что в отличие от гепарина при применении АТС не будут возникать такие побочные эффекты, как кровотечения, геморрагии, нежелательные иммуннологические реакции и др.The inventive vehicle ATS has anticoagulant activity, which is of a pronounced dose-dependent nature, non-toxic, has high solubility in biocompatible liquids and solutions. ATS has a relatively moderate anticoagulant activity, being mainly an inhibitor of the initial link of the blood coagulation system, initiated by external or internal factors of the coagulation process. ATS does not affect the activity of thrombin in the polymerization phase of a fibrin clot. The mechanism of anticoagulant action of ATS on the coagulation hemostasis system is different from that for heparin. The above properties of the claimed funds will lead to the fact that, unlike heparin, the use of ATS will not cause such side effects as bleeding, hemorrhage, unwanted immunological reactions, etc.
Технический результат заключается в расширении сырьевой базы для получения средств, обладающих антикоагулянтной активностью. Дальневосточный трепанг Apostichopus japonicus является широко распространенным промысловым видом голотурий.The technical result consists in expanding the raw material base to obtain funds with anticoagulant activity. The Far Eastern trepang Apostichopus japonicus is a widespread commercial species of holothurians.
По данным физико-химического анализа АТС представляет собой полипептид с молекулярной массой 12212 дальтон (метод масс-спектрометрии). Аминокислотный состав, определенный на аминокислотном анализаторе "Биохром 30" (Англия), показал, что АТС относится к коллагенам, на что указывает присутствие характерных для данной группы белков аминокислот: пролина, глицина, гидроксипролина и гидроксилизина. Аминокислотный состав АТС представлен в таблице 1.According to the physicochemical analysis, ATS is a polypeptide with a molecular weight of 12212 daltons (mass spectrometry method). The amino acid composition determined on the
Как показал сравнительный анализ аминокислотного состава АТС и коллагенов, выделенных из других источников, для него характерно повышенное содержание отрицательно заряженных аминокислот - аспарагиновой и, особенно, глутаминовой, оксикислот - серина, треонина и, особенно, тирозина, а также валина. По содержанию глицина гидроксипролина и пролина выделенный белок соответствует классическому коллагену.As a comparative analysis of the amino acid composition of ATS and collagens isolated from other sources showed, it is characterized by an increased content of negatively charged amino acids - aspartic and, especially, glutamic, hydroxy acids - serine, threonine, and especially tyrosine, as well as valine. According to the glycine content of hydroxyproline and proline, the isolated protein corresponds to classical collagen.
По данным химического анализа АТС содержит в своем составе 10,0-12,0% углеводов, что характерно для нативного природного гидроксилированного и гликозилированного коллагена. АТС сохраняет структуру нативного коллагена, что доказано спектральными методами (УФ-, ИК-, КД- спектроскопии и флюоресценции). Содержание микро- и макроэлементов (S, К, Са, Fe, Zn, Br) в нем определено методом рентгеновской флюоресценции. Наличие в АТС 6,0-7,5% сульфатных групп подтверждено присутствием серы как методом рентгеновской флюоресценции, так и прямым определением сульфатов (Кошелева Л.П., Глебко Л.И. ХПС, 1997, №4, с.500-502).According to chemical analysis, ATS contains 10.0-12.0% carbohydrates, which is typical for native natural hydroxylated and glycosylated collagen. ATS preserves the structure of native collagen, which is proved by spectral methods (UV, IR, CD spectroscopy and fluorescence). The content of micro and macro elements (S, K, Ca, Fe, Zn, Br) in it was determined by X-ray fluorescence. The presence in the ATS of 6.0-7.5% sulfate groups is confirmed by the presence of sulfur both by X-ray fluorescence and the direct determination of sulfates (Kosheleva L.P., Glebko L.I. KhPS, 1997, No. 4, pp. 500-502 )
В таблице 2 представлены данные по определению химического состава образца АТС.Table 2 presents data on the determination of the chemical composition of the ATC sample.
На фиг.1 представлен масс-спектр АТС.Figure 1 presents the mass spectrum of the ATS.
На фиг.2 представлены УФ-, ИК-, КД-спектры АТС.Figure 2 presents the UV, IR, CD spectra of ATS.
На фиг.3 представлено изображение рентгеновской флюоресценции АТС.Figure 3 presents the image of x-ray fluorescence of the ATS.
На фиг.4 представлена данные по определению тромбопластинового времени.Figure 4 presents data on the determination of thromboplastin time.
На фиг.5 представлены данные по определению активированного парциального тромбопластинового времени.Figure 5 presents the data for the determination of activated partial thromboplastin time.
На фиг.6 представлены данные по определению тромбинового времени.Figure 6 presents data on the determination of thrombin time.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1. Получение апотромбостатина (АТС).Example 1. Obtaining apotrombostatin (ATS).
1 кг мелкоизмельченной голотурии Apostichopus japonicus без внутренностей измельчают на гомогенизаторе, заливают 3 литрами дистиллированной воды и доводят рН до 8,2 сухим NaHCO3. К гомогенату добавляют 2 г сухого комплекса коллагенолитических протеиназ, выделенного из гепатопанкреаса камчатского краба. Процесс ферментолиза проводят при температуре 36°С, постоянно поддерживая рН смеси около 8,0. Через 4 часа к охлажденной до 20°С смеси добавляют этанол до его конечной концентрации 40%. В течение 1 часа формируется нитевидный осадок, который отделяют на тканевом фильтре от растворимых продуктов ферментолиза. Отжатые на фильтре белковые волокна промывают 40%-ным раствором этанолом, затем 96%-ным этанолом, отжимают от следов растворителя и сушат.1 kg of finely divided holothurium Apostichopus japonicus without entrails is ground on a homogenizer, poured with 3 liters of distilled water and the pH is adjusted to 8.2 with dry NaHCO 3 . 2 g of a dry complex of collagenolytic proteinases isolated from hepatopancreas of the king crab are added to the homogenate. The process of fermentolysis is carried out at a temperature of 36 ° C, constantly maintaining the pH of the mixture at about 8.0. After 4 hours, ethanol was added to the mixture cooled to 20 ° C to a final concentration of 40%. Within 1 hour, a filamentous precipitate forms, which is separated on a tissue filter from soluble products of fermentolysis. The protein fibers pressed on the filter are washed with a 40% ethanol solution, then with 96% ethanol, squeezed from traces of the solvent and dried.
Сухой остаток растворяют в 1 л 0,07 М раствора NaHCO3, рН 8,3 и добавляют 1 г высокоочищенного комплекса коллагенолитических протеиназ. Исчерпывающий ферментолиз белка проводят в тех же условиях. К полученному раствору добавляют 96%-ный этанол до его конечной концентрации 50%. Осадок отжимают на тканевом фильтре, промывают 50% раствором этилового спирта в дистиллированной воде, а затем 96%-ным этиловым спиртом и сушат на воздухе.The dry residue is dissolved in 1 l of a 0.07 M NaHCO 3 solution, pH 8.3, and 1 g of a highly purified complex of collagenolytic proteinases is added. Exhaustive protein fermentolysis is carried out under the same conditions. To the resulting solution was added 96% ethanol to a final concentration of 50%. The precipitate is squeezed out on a fabric filter, washed with a 50% solution of ethyl alcohol in distilled water, and then with 96% ethyl alcohol and dried in air.
Полученный белковый продукт растворяют в дистиллированной воде и осаждают добавлением 0,1 н. HCl. Осадок белка отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин и снова растворяют в 0,07 М растворе NaHCO3. Низкомолекулярные примеси и соли удаляют диализом или ультрафильтрацией, используя мембраны, пропускающие вещества с молекулярной массой менее 15 кДа. Отмытый дистиллированной водой раствор белка помещают в установку со стерилизующей мембраной (поры 0,2 мкм) и белок разделяют на две фракции: проходящую через мембрану и полимерную, остающуюся над мембраной. Полученные белковые фракции высушивают и анализируют. Как показали анализы фракция, проходящая через мембрану, является АТС. Выход АТС - 300 мг.The resulting protein product is dissolved in distilled water and precipitated by the addition of 0.1 N. HCl. The protein precipitate was separated by centrifugation at 3000 rpm for 30 minutes and redissolved in a 0.07 M NaHCO 3 solution. Low molecular weight impurities and salts are removed by dialysis or ultrafiltration using membranes that allow substances with a molecular weight of less than 15 kDa. The protein solution washed with distilled water is placed in a device with a sterilizing membrane (0.2 μm pores) and the protein is divided into two fractions: passing through the membrane and polymer remaining over the membrane. The resulting protein fractions are dried and analyzed. As shown by analyzes, the fraction passing through the membrane is ATS. The output of ATS is 300 mg.
Пример 2.Example 2
Средство получают, как в примере 1, но для протеолиза используют трипсин. Выход АТС - 150 мг.The tool is obtained, as in example 1, but trypsin is used for proteolysis. The output of ATS is 150 mg.
Пример 3.Example 3
Средство получают, как в примере 1, но для протеолиза используют проназу. Выход АТС - 295 мг.The agent is obtained as in example 1, but pronase is used for proteolysis. The output of the ATS is 295 mg.
Пример 4.Example 4
Средство получают, как в примере 1, но для протеолиза используют субтилизин. Выход АТС - 285 мг.The tool is obtained, as in example 1, but subtilisin is used for proteolysis. The output of the ATS is 285 mg.
Пример 5.Example 5
Средство получают, как в примере 1, но для протеолиза используют коллализин. Выход АТС - 300 мг.The tool is obtained, as in example 1, but for proteolysis using collalysin. The output of ATS is 300 mg.
Пример 6.Example 6
Изучение фармакологической активности апотромбостатина (АТС).The study of the pharmacological activity of apotrombostatin (ATS).
Токсичность. АТС хорошо растворим в воде, в водно-солевых и буферных растворах. Препарат обладает низкой токсичностью - LD50>3000 мг/кг массы крысы или мыши при пероральном введении и LD50>1000 мг/кг при внутрибрюшинном и подкожном введении.Toxicity. ATS is readily soluble in water, in water-salt and buffer solutions. The drug has low toxicity - LD 50 > 3000 mg / kg of rat or mouse mass when administered orally and LD 50 > 1000 mg / kg when administered intraperitoneally and subcutaneously.
Определение геополитической активности. При определении гемолитической активности АТС использовали суспензию эритроцитов, полученную из дефибринированной крови барана. Как показал эксперимент, апостатин в дозах до 5 мг/мл не проявлял гемолитического действия в отношении эритроцитов мыши в условиях in vitro.Definition of geopolitical activity. When determining the hemolytic activity of ATS, a suspension of red blood cells obtained from defibrinated blood of a ram was used. As shown by the experiment, apostatin in doses up to 5 mg / ml did not show a hemolytic effect against mouse red blood cells in vitro.
Таким образом, АТС относится к малотоксичным соединениям, не обладающим гемолитической активностью даже в очень высоких концентрациях.Thus, ATS refers to low-toxic compounds that do not have hemolytic activity even in very high concentrations.
Пример 7. Изучение антикоагулянтной активности АТС. Определение влияния АТС на различные звенья коагуляционного гемостаза оценивали в условиях in vitro: (а) по времени свертывания человеческой плазмы после добавлении к ней тканевого тромбопластина; (б) по времени свертывания плазмы в условиях стандартной контактной активации процесса свертывания; (с) по времени свертывания плазмы под влиянием тромбина. Полученные результаты сравнивали с действием гепарина в аналогичных дозах: 0,1 и 0,4 мг/мл. В контрольные пробы вместо изучаемого препарата добавляли дистиллированную воду.Example 7. The study of the anticoagulant activity of ATS. The determination of the effect of ATS on various parts of coagulation hemostasis was evaluated in vitro: (a) by the clotting time of human plasma after addition of tissue thromboplastin to it; (b) plasma clotting time under standard contact activation of the coagulation process; (c) the coagulation time of plasma under the influence of thrombin. The results were compared with the action of heparin in similar doses: 0.1 and 0.4 mg / ml. Instead of the study drug, distilled water was added to the control samples.
а. Определение тромбопластинового времени. Время свертывания контрольной плазмы при добавлении к ней тканевого тромбопластина, запускающего коагуляцию крови по внешнему пути, находилось в норме (ПТИ 100-120%) (фиг.4). В тесте протромбинового времени АТС после добавления к нормальной плазме вызывает незначительное увеличение времени свертывания в дозе 0,1 мг/мл, которое, однако, растет с увеличением концентрации белка до 0,4 мг/мл (ПТИ 60%). Используемый в качестве препарата сравнения гепарин обладает значительно более высокой противосвертывающей активностью (ПТИ 10-18%).but. Determination of thromboplastin time. The clotting time of the control plasma when tissue thromboplastin was added to it, starting blood coagulation along the external path, was normal (PTI 100-120%) (figure 4). In the prothrombin time test, ATS after adding to normal plasma causes a slight increase in clotting time at a dose of 0.1 mg / ml, which, however, increases with an increase in protein concentration to 0.4 mg / ml (
б. Определение активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ). Влияние исследуемых соединений на внутренний механизм активации процесса свертывания оценивали в условиях стандартной контактной активации процесса свертывания плазмы в тесте АПТВ. В дозе 0,4 мг/мл все соединения, включая АТС, ингибировали свертывание плазмы более чем на 3 мин (фиг.5). Четырехкратное уменьшение дозы АТС вызывает снижение его антикоагулянтной активности. Тем не менее, время свертывание рекальцифицированной плазмы после добавления АТС в этой дозе в 2,7 раз больше по сравнению с нормальной плазмой.b. Determination of activated partial thromboplastin time (APTT). The effect of the studied compounds on the internal mechanism of activation of the coagulation process was evaluated under standard contact activation of the plasma coagulation process in the APTT test. At a dose of 0.4 mg / ml, all compounds, including ATS, inhibited plasma coagulation for more than 3 min (Fig. 5). A four-fold reduction in the dose of ATS causes a decrease in its anticoagulant activity. Nevertheless, the coagulation time of recalcified plasma after the addition of ATS at this dose is 2.7 times longer compared to normal plasma.
в. Определение тромбинового времени. В тесте определения тромбинового времени, воспроизводящего в лабораторных условиях конечный этап свертывания плазмы, было показано, что АТС в дозе 0,4 мг/мл не предотвращал образование фибринового сгустка (фиг.6). Следовательно, заявляемый препарат не влияет на ферментативную активность тромбина и не ингибирует самосборку мономеров фибрина в фазе полимеризации промежуточного продукта. Напротив, при добавлении гепарина в указанной дозе наблюдалась полная несвертываемость по тромбиновому времени, что связано со способностью гепарина ингибировать ферментативную фазу превращения фибриногена в фибрин. Известно, что основой антикоагуляционного эффекта гепарина является значительное увеличение активности антитромбина и блокирование целого ряда реакций, которые стимулируются тромбином.at. Determination of thrombin time. In the test for determining thrombin time, reproducing in laboratory conditions the final stage of plasma coagulation, it was shown that ATS at a dose of 0.4 mg / ml did not prevent the formation of a fibrin clot (Fig.6). Therefore, the claimed drug does not affect the enzymatic activity of thrombin and does not inhibit the self-assembly of fibrin monomers in the polymerization phase of the intermediate product. In contrast, with the addition of heparin at the indicated dose, complete thrombin time clotting was observed, which is associated with the ability of heparin to inhibit the enzymatic phase of the conversion of fibrinogen to fibrin. It is known that the basis of the anticoagulant effect of heparin is a significant increase in antithrombin activity and blocking a number of reactions that are stimulated by thrombin.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006104772/15A RU2302250C1 (en) | 2006-02-15 | 2006-02-15 | Preparation of anticoagulant action and method for its obtaining |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006104772/15A RU2302250C1 (en) | 2006-02-15 | 2006-02-15 | Preparation of anticoagulant action and method for its obtaining |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2302250C1 true RU2302250C1 (en) | 2007-07-10 |
Family
ID=38316589
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006104772/15A RU2302250C1 (en) | 2006-02-15 | 2006-02-15 | Preparation of anticoagulant action and method for its obtaining |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2302250C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2509775C1 (en) * | 2012-08-15 | 2014-03-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) | Agent, having antitumour, anticoagulant, wound-healing, anti-inflammatory and antioxidant activity, capacity to inhibit collagenase and angiotensin converting enzyme, and method for production thereof |
-
2006
- 2006-02-15 RU RU2006104772/15A patent/RU2302250C1/en active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2509775C1 (en) * | 2012-08-15 | 2014-03-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) | Agent, having antitumour, anticoagulant, wound-healing, anti-inflammatory and antioxidant activity, capacity to inhibit collagenase and angiotensin converting enzyme, and method for production thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4588587A (en) | Method of treatment to inhibit metastasis | |
| Cheng et al. | Identification and inhibitory activity against α-thrombin of a novel anticoagulant peptide derived from oyster (Crassostrea gigas) protein | |
| JPS62174023A (en) | Anticoagulant substance, production thereof and anticoagulant agent containing said substance as active ingredient | |
| JPS6030291B2 (en) | HGI glycoprotein that promotes differentiation and proliferation of human granulocytes, method for producing HGI glycoprotein, and therapeutic agent for leukopenia containing HGI glycoprotein | |
| EP1691827B1 (en) | Use of peptides derived from the b beta chain of human fibronogen for the treatment of shock | |
| Bazilinski et al. | Inhibition of platelet function by uremic middle molecules | |
| US5922358A (en) | Antithrombotic and non-hemorrhagic heparin-based compositions, process for their preparation and therapeutic applications | |
| US20230381289A1 (en) | Preparing and use of glu-plasminogen from blood fractions | |
| SU581872A3 (en) | Method of preparing fermentative preparation possessing hemostatic and anticoagulant effect | |
| JPH0240681B2 (en) | ||
| Menon et al. | Complications of hemotoxic snakebite in India | |
| Vermylen et al. | Platelet‐Aggregating Activity in Neuraminidase‐Treated Human Cryoprecipitates: Its Correlation with Factor‐VIII‐Related Antigen | |
| RU2138275C1 (en) | Thrombin inhibitors, method of their producing and pharmaceutical composition on said | |
| RU2302250C1 (en) | Preparation of anticoagulant action and method for its obtaining | |
| JPS6351335A (en) | Degranulation inhibitor for mast cell | |
| MAMMEN | Physiology and biochemistry of blood coagulation | |
| US4177262A (en) | Plasminogen compositions containing preactivated plasminogens with or without native plasminogens, process for making same, pharmaceutical compositions and control of blood clots | |
| Bruning et al. | Prothrombal: a new concentrate of human prothrombin complex for clinical use | |
| CN108660126A (en) | A kind of preparation process of freeze dried human zymoplasm | |
| KR101780643B1 (en) | Method for purifying heparin using enzymolysis | |
| EP0239644A1 (en) | Novel physiologically active substance having blood coagulation controlling activity | |
| KR20130049043A (en) | Pharmaceutical composition comprising the extract of betel nut of areca catechu l. for prevention and control of thrombosis | |
| CN116987181B (en) | High biological activity natural hirudin and method for preparing same in high yield | |
| RU2749424C1 (en) | Method for obtaining drug with anti-coagulant activity | |
| WO2017103949A1 (en) | Anticoagulant actives and synergistic anticoagulant composition and method for producing the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20121004 |