RU2296130C2 - Variants of gamma-interferon polypeptide - Google Patents
Variants of gamma-interferon polypeptide Download PDFInfo
- Publication number
- RU2296130C2 RU2296130C2 RU2003132454/13A RU2003132454A RU2296130C2 RU 2296130 C2 RU2296130 C2 RU 2296130C2 RU 2003132454/13 A RU2003132454/13 A RU 2003132454/13A RU 2003132454 A RU2003132454 A RU 2003132454A RU 2296130 C2 RU2296130 C2 RU 2296130C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- ifng
- amino acid
- variant
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение касается новых вариантов полипептида γ-интерферона, обладающих активностью γ-интерферона (IFNG), способов их получения, фармацевтических композиций, включающих варианты полипептида, и их применения при лечении заболеваний, в частности, при лечении интерстициальных легочных заболеваний, таких как идиопатический фиброз легких.The present invention relates to new variants of the γ-interferon polypeptide having γ-interferon activity (IFNG), methods for their preparation, pharmaceutical compositions including variants of the polypeptide, and their use in the treatment of diseases, in particular in the treatment of interstitial pulmonary diseases such as idiopathic fibrosis lungs.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND
γ-Интерферон (IFNG) - это цитокин, вырабатываемый Т-лимфоцитами и естественными клетками-киллерами, который существует в виде гомодимера из двух нековалентно связанных полипептидных субъединиц. Зрелая форма каждого димера содержит 143 аминокислотных остатка (приведены в SEQ ID No:17), а их предшественник включает 166 аминокислотных остатков (приведены в SEQ ID No:18).Interferon-γ (IFNG) is a cytokine produced by T-lymphocytes and natural killer cells that exists as a homodimer of two non-covalently linked polypeptide subunits. The mature form of each dimer contains 143 amino acid residues (shown in SEQ ID No: 17), and their predecessor includes 166 amino acid residues (shown in SEQ ID No: 18).
Каждая субъединица содержит два потенциальных сайта N-гликозилирования (Aggarwal et al., Human Cytokines, Blackwell Scientific Publications, 1992) в положении 25 и 97. В зависимости от степени гликозилирования молекулярный вес IFNG в виде димера составляет 34-50 кДа (Farrar et al., Ann. Rev. Immunol. 1993, 11: 571-611).Each subunit contains two potential N-glycosylation sites (Aggarwal et al., Human Cytokines, Blackwell Scientific Publications, 1992) at
Первичная последовательность IFNG дикого типа человека (huIFNG) представлена в Gray et al. (Nature 298: 859-863, 1982), Taya et al. (EMBO J. 1: 953-958, 1982), Devos et al. (Nucleic Acids Res. 10: 2487-2501, 1982) и Rinderknecht et al. (J.Biol. Chem. 259: 6790-6797, 1984), а также в ЕР 0077670, ЕР 0089676 и ЕР 0110044. Трехмерная структура hulFNG приведена в Ealick et al. (Science 252: 698-701, 1991).The primary sequence of wild-type human IFNG (huIFNG) is presented in Gray et al. (Nature 298: 859-863, 1982), Taya et al. (EMBO J. 1: 953-958, 1982), Devos et al. (Nucleic Acids Res. 10: 2487-2501, 1982) and Rinderknecht et al. (J. Biol. Chem. 259: 6790-6797, 1984), as well as in EP 0077670, EP 0089676 and EP 0110044. The three-dimensional structure of hulFNG is given in Ealick et al. (Science 252: 698-701, 1991).
Сообщалось о различных естественных или мутированных формах полипептидов субъединиц IFNG, включая форму, содержащую N-концевую последовательность из аминокислот Cys-Tyr-Cys в положениях (-3)-(-1) относительно SEQ ID No:17, форму, содержащую N-концевой метионин (в положении - 1 относительно SEQ ID No:17) и различные укороченные с С-конца формы, содержащие 127-134 аминокислотных остатка. Известно, что удаление 1-15 аминокислотных остатков с С-конца не вызывает потери активности молекулы IFNG. К тому же Pan et al. (Eur. J. Biochem. 166: 145-149, 1987) сообщали о гетерогенности С-конца huIFNG.Various naturally occurring or mutated forms of IFNG subunit polypeptides have been reported, including a form containing an N-terminal sequence of Cys-Tyr-Cys amino acids at positions (-3) - (- 1) relative to SEQ ID No: 17, a form containing an N-terminal methionine (at
О мутеинах huIFNG сообщали Slodowski et al. (Eur. J. Biochem. 202: 1133-1140, 1991), Luk et al. (J. Biol. Chem 265: 13314-13319, 1990), Seelig et al. (Biochemistry 27: 1981-1987, 1988), Trousdale et al. (Invest. Ophtalmol. Vis. Sci 26: 1244-1251, 1985), а также в ЕР 146354. О природном варианте huIFNG сообщали Nishi et al. (J. Biochem. 97: 153-159, 1985).HuIFNG muteins have been reported by Slodowski et al. (Eur. J. Biochem. 202: 1133-1140, 1991), Luk et al. (J. Biol. Chem 265: 13314-13319, 1990), Seelig et al. (Biochemistry 27: 1981-1987, 1988), Trousdale et al. (Invest. Ophtalmol. Vis. Sci 26: 1244-1251, 1985), as well as in EP 146354. A natural variant of huIFNG was reported by Nishi et al. (J. Biochem. 97: 153-159, 1985).
В US 6046034 раскрыты термостабильные рекомбинантные варианты huIFNG (rhuIFNG), в которые включено до 4 пар остатков цистеина для обеспечения образования дисульфидных мостиков и, таким образом, стабилизации варианта hulFNG в гомодимерной форме.No. 6,046,034 discloses thermostable recombinant variants of huIFNG (rhuIFNG), which include up to 4 pairs of cysteine residues to ensure the formation of disulfide bridges and thus stabilize the hulFNG variant in homodimeric form.
В WO 92/08737 раскрыты варианты IFNG, содержащие добавочный метионин на N-конце полной (остатки 1-143) или укороченной (остатки 1-132) аминокислотной последовательности IFNG дикого типа человека. В ЕР 0219781 раскрыта частичная последовательность huIFNG, содержащая аминокислотные остатки 3-124 (SEQ ID No:17). В US 4832959 раскрыты частичные последовательность hulFNG, содержащие остатки 1-127, 5-146 и 5-127 из аминокислотной последовательности, которая по сравнению с SEQ ID No:17 имеет три дополнительных N-концевых аминокислотных остатка (Cys-Tyr-Cys). В US 5004689 раскрыта последовательность ДНК, кодирующая huIFNG без трех аминокислотных остатков на N-конце (Cys-Tyr-Cys), и ее экспрессия в Е.coli. В ЕР О 446582 раскрыт полученный в Е.coli rhuIFNG, лишенный N-концевого метионина. В US 6120762 раскрыт пептидный фрагмент huIFNG, содержащий остатки 95-134 (относительно SEQ ID No:18).WO 92/08737 discloses IFNG variants containing additional methionine at the N-terminus of the complete (residues 1-143) or truncated (residues 1-132) amino acid sequence of wild-type human. EP 0219781 discloses a partial huIFNG sequence containing amino acid residues 3-124 (SEQ ID No: 17). US 4,832,959 discloses a partial hulFNG sequence containing residues 1-127, 5-146 and 5-127 from an amino acid sequence which, compared to SEQ ID No: 17, has three additional N-terminal amino acid residues (Cys-Tyr-Cys). US 5004689 discloses a DNA sequence encoding huIFNG without three amino acid residues at the N-terminus (Cys-Tyr-Cys), and its expression in E. coli.
Wang et al. (Sci. Sin. В 24: 1076-1084,1994) сообщали о высоком уровне экспрессии rhuIFNG.Wang et al. (Sci. Sin. B 24: 1076-1084,1994) reported a high level of expression of rhuIFNG.
Curling et al. (Biochem. J. 272: 333-337, 1990) и Hooker et al. (J. of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18: 287-295) сообщали о гликозилированных вариантах rhuIFNG.Curling et al. (Biochem. J. 272: 333-337, 1990) and Hooker et al. (J. of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18: 287-295) reported glycosylated variants of rhuIFNG.
О модификации rhuIFNG полимерами сообщали Kita et al. (Drug Des. Deliv. 6: 157-167, 1990) и в ЕР 236987 и US 5109120.Modification of rhuIFNG polymers was reported by Kita et al. (Drug Des. Deliv. 6: 157-167, 1990) and in EP 236987 and US 5109120.
В WO 92/22310 раскрыты асиалогликопротеиновые конъюгаты интерферонов, в том числе и huIFNG.WO 92/22310 discloses asialoglycoprotein conjugates of interferons, including huIFNG.
Были описаны и слитые белки IFNG. Например, в ЕР 0237019 раскрыт одноцепочечный полипептид, у которого один участок обладает активностью β-интерферона, а другой участок - активностью IFNG.IFNG fusion proteins have been described. For example, EP 0237019 discloses a single chain polypeptide in which one region has β-interferon activity and the other region has IFNG activity.
В ЕР 0158198 раскрыт одноцепочечный полипептид, у которого один участок обладает активностью IFNG, а другой участок - активностью IL-2. В нескольких работах описаны одноцепочечные димерные белки IFNG, например Landar et al. (J. Mol. Biol. 2000, 299: 169-179).EP 0158198 discloses a single chain polypeptide in which one region has IFNG activity and the other region has IL-2 activity. Several works have described single chain dimeric IFNG proteins, for example, Landar et al. (J. Mol. Biol. 2000, 299: 169-179).
В WO 99/02710 раскрыты одноцепочечные полипептиды, среди которых один из многих представляет собой IFNG.WO 99/02710 discloses single chain polypeptides, among which one of many is IFNG.
В WO 99/03887 раскрыты модифицированные PEG варианты полипептидов, принадлежащих к суперсемейству гормонов роста, в которых несущественный аминокислотный остаток, расположенный в определенном участке полипептида, был заменен остатком цистеина. IFNG упоминается как один из представителей суперсемейства гормонов роста, но о его модификации не приводится никаких подробностей.WO 99/03887 discloses PEG-modified variants of polypeptides belonging to the superfamily of growth hormones in which the non-essential amino acid residue located in a specific region of the polypeptide has been replaced by a cysteine residue. IFNG is mentioned as one of the representatives of the superfamily of growth hormones, but no details are given about its modification.
IFNG предлагали для лечения интерстициальных легочных заболеваний (также известных как интерстициальный фиброз легких (IPF) (Ziesche et al., N. Engl. J. Med. 341: 1264-1269, 1999; Chest 110: Suppi: 25S, 1996) и в ЕР 0795332, для этих целей IFNG может применяться в сочетании с преднизолоном. Помимо IPF, с помощью IFNG можно лечить грануломатозные заболевания (Bolinger et al., Clinical Pharmacy, 1992, 11: 834-850), некоторые микобактериальные инфекции (N. Engl. J. Med. 330: 1348-1355, 1994), рак почек (J. Urol. 152: 841-845, 1994), остеопетроз (N. Engl. J. Med. 332: 1594-1599, 1995), склеродермию (J. Rheumatol. 23: 654-658, 1996), гепатит В (Hepatogastroenterology 45: 2282-2294, 1998), гепатит С (Int. Hepatol. Communic. 6: 264-273, 1997), септический шок (Nature Medicine 3: 678-681, 1997) и ревматоидный артрит.IFNGs have been proposed for the treatment of interstitial pulmonary diseases (also known as interstitial pulmonary fibrosis (IPF) (Ziesche et al., N. Engl. J. Med. 341: 1264-1269, 1999; Chest 110: Suppi: 25S, 1996) and EP 0795332, for these purposes IFNG can be used in combination with prednisone.In addition to IPF, granulomatous diseases can be treated with IFNG (Bolinger et al., Clinical Pharmacy, 1992, 11: 834-850), some mycobacterial infections (N. Engl. J. Med. 330: 1348-1355, 1994), kidney cancer (J. Urol. 152: 841-845, 1994), osteopetrosis (N. Engl. J. Med. 332: 1594-1599, 1995), scleroderma ( J. Rheumatol. 23: 654-658, 1996), hepatitis B (Hepatogastroenterology 45: 2282-2294, 1998), hepatitis C (Int. Hep atol. Communic. 6: 264-273, 1997), septic shock (Nature Medicine 3: 678-681, 1997) and rheumatoid arthritis.
В качестве фармацевтического соединения rhuIFNG применяется с определенным успехом, прежде всего, против некоторых вирусных инфекций и опухолей. rhuIFNG обычно применяется в виде парентеральных, предпочтительно подкожных, инъекций. Максимальная концентрация в сыворотке обнаруживается через 7 часов. Период полужизни в плазме составляет 30 минут после внутривенного введения. По этой причине эффективное лечение при помощи rhuIFNG подразумевает частые инъекции. Основные неблагоприятные побочные эффекты заключаются в жаре, ознобе, потливости, головной боли, миалгии и сонливости. Такие эффекты связаны с введением rhuIFNG и наблюдаются в первые часы после инъекции. К редко встречающимся побочным эффектам относятся боль и эритема в месте инъекции, повышение печеночных ферментов, обратимая грануло- и тромбопения и кардиотоксичность.As a pharmaceutical compound, rhuIFNG is used with certain success, especially against certain viral infections and tumors. rhuIFNG is usually used as parenteral, preferably subcutaneous, injection. The maximum concentration in serum is detected after 7 hours. The plasma half-life is 30 minutes after intravenous administration. For this reason, effective treatment with rhuIFNG involves frequent injections. The main adverse side effects are fever, chills, sweating, headache, myalgia, and drowsiness. Such effects are associated with the introduction of rhuIFNG and are observed in the first hours after injection. Rarely reported side effects include pain and erythema at the injection site, increased liver enzymes, reversible granulo- and thrombopenia, and cardiotoxicity.
В WO 01/36001 раскрыты новые конъюгаты IFNG, содержащие неполипептидный компонент, присоединенный к полипептиду IFNG, который был модифицирован путем введения и/или удаления сайтов для присоединения таких неполипептидных компонентов, например, сайтов для PEG и сайтов гликозилирования.WO 01/36001 discloses novel IFNG conjugates containing a non-polypeptide component attached to an IFNG polypeptide that has been modified by introducing and / or removing sites to attach such non-polypeptide components, for example, PEG sites and glycosylation sites.
Хорошо известно, что когда N-гликозилированные молекулы, такие как IFNG, продуцируются в гликозилирующем хозяине, не все потенциальные сайты N-гликозилирования полностью утилизируются. Это означает, что достаточно часто получается смесь белков с различной степенью N-гликозилирования in vivo, что в свою очередь приводит к необходимости последующей очистки. К тому же зачастую разделение идентичных белков с различной степенью гликозилирования требует времени и представляется затруднительным. Однако неожиданно оказалось, что замещение одного или нескольких аминокислотных остатков, расположенных вблизи от сайта N-гликозилирования in vivo (независимо от того, присутствует ли сайт N-гликозилирования in vivo естественным образом в IFNG или он был введен, к примеру, как описано в WO 01/36001), дает возможность повысить долю полностью гликозилированных молекул IFNG. В частности, было обнаружено, что замена естественных сайтов N-гликозилирования N-Y-S в положениях 97, 98 и 99 в huIFNG на N-Y-T приводит к резкому увеличению доли полностью гликозилированных молекул IFNG.It is well known that when N-glycosylated molecules, such as IFNGs, are produced in a glycosylating host, not all potential N-glycosylation sites are completely utilized. This means that quite often a mixture of proteins with different degrees of N-glycosylation in vivo is obtained, which in turn leads to the need for further purification. In addition, the separation of identical proteins with different degrees of glycosylation is often time-consuming and difficult. However, it unexpectedly turned out that the substitution of one or more amino acid residues located close to the in vivo N-glycosylation site (regardless of whether the in vivo N-glycosylation site is naturally present in IFNG or it was introduced, for example, as described in WO 01/36001), makes it possible to increase the proportion of fully glycosylated IFNG molecules. In particular, it was found that the replacement of the natural N-glycosylation sites of N-Y-S at positions 97, 98 and 99 in huIFNG with N-Y-T leads to a sharp increase in the proportion of fully glycosylated IFNG molecules.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Итак, первый аспект изобретения касается варианта полипептида γ-интерферона (IFNG), обладающего активностью IFNG и имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No:1 ([S99T]huIFNG), или его фрагмента, обладающего активностью IFNG.So, the first aspect of the invention relates to a variant of a γ-interferon polypeptide (IFNG) having IFNG activity and having the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1 ([S99T] huIFNG), or a fragment thereof having IFNG activity.
Следующий аспект изобретения касается варианта SEQ ID No:1, включая вариант фрагментов SEQ ID No:1 (таких как SEQ ID No:2-16), при этом данный вариант включает по меньшей мере одну дополнительную модификацию и обладает активностью IFNG.A further aspect of the invention relates to a variant of SEQ ID No: 1, including a variant of fragments of SEQ ID No: 1 (such as SEQ ID No: 2-16), wherein this variant includes at least one additional modification and has IFNG activity.
Другие аспекты настоящего изобретение касаются нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида по изобретению.Other aspects of the present invention relate to a nucleotide sequence encoding a variant polypeptide of the invention.
Следующие аспекты настоящего изобретения касаются экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидные последовательности по изобретению, и гликозилирующих клеток-хозяев, содержащих нуклеотидную последовательность по изобретению или экспрессионный вектор по изобретению.The following aspects of the present invention relate to an expression vector containing the nucleotide sequences of the invention and glycosylating host cells containing the nucleotide sequence of the invention or expression vector of the invention.
Настоящее изобретение также касается фармацевтической композиции, содержащей вариант полипептида по изобретению, и варианта полипептида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a variant of a polypeptide of the invention, and a variant of a polypeptide of the invention or a pharmaceutical composition of the invention for use as a medicine.
Следующие аспекты изобретения касаются применения варианта полипептида по изобретению или применения фармацевтической композиции по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения интерстициальных легочных заболеваний.The following aspects of the invention relate to the use of a variant polypeptide according to the invention or the use of a pharmaceutical composition according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of interstitial pulmonary diseases.
Аналогичным образом, настоящее изобретение также касается способа лечения или профилактики интерстициальных легочных заболеваний, при этом способ заключается во введении млекопитающему, в частности человеку, нуждающемуся в этом, эффективного количества варианта полипептида по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.Similarly, the present invention also relates to a method for treating or preventing interstitial pulmonary diseases, the method comprising administering to a mammal, in particular a human in need thereof, an effective amount of a variant polypeptide of the invention or a pharmaceutical composition of the invention.
Следующий аспект изобретения касается популяции вариантов полипептида IFNG или композиции, содержащей популяцию вариантов полипептида IFNG, при этом популяция содержит по меньшей мере 70% варианта полипептида IFNG по изобретению.A further aspect of the invention relates to a population of variants of an IFNG polypeptide or composition comprising a population of variants of an IFNG polypeptide, the population comprising at least 70% of a variant of the IFNG polypeptide of the invention.
Следующий аспект настоящего изобретения касается способа повышения степени N-гликозилирования in vivo исходного полипептида IFNG, содержащего по меньшей мере один сайт N-гликозилирования in vivo с аминокислотной последовательностью N-X-S, где Х - любой аминокислотный остаток, за исключением пролина, причем способ включает замену остатка серина в указанной аминокислотной последовательности N-X-S остатком треонина для получения варианта IFNG.A further aspect of the present invention relates to a method for increasing the in vivo N-glycosylation level of a parent IFNG polypeptide comprising at least one in vivo N-glycosylation site with the NXS amino acid sequence, where X is any amino acid residue except proline, the method comprising replacing the serine residue in the indicated amino acid sequence of NXS with a threonine residue to produce an IFNG variant.
Следующий аспект настоящего изобретения касается способа получения варианта полипептида IFNG по изобретению, при этом способ включает:A further aspect of the present invention relates to a method for producing a variant IFNG polypeptide of the invention, the method comprising:
(a) культивирование гликозилирующей клетки-хозяина, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида IFNG по изобретению, в условиях, способствующих экспрессии этого варианта полипептида;(a) culturing a glycosylating host cell containing a nucleotide sequence encoding a variant of the IFNG polypeptide of the invention, under conditions conducive to the expression of this variant polypeptide;
(b) необязательно проведение реакции указанного варианта полипептида с неполипептидным компонентом in vitro в условиях, способствующих осуществлению конъюгации; и(b) optionally carrying out a reaction of said polypeptide variant with a non-polypeptide component in vitro under conditions conducive to conjugation; and
(c) извлечение варианта полипептида.(c) recovering a variant polypeptide.
Другие аспекты настоящего изобретения станут понятными из нижеследующего описания.Other aspects of the present invention will become apparent from the following description.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
На фиг.1 представлены результаты Вестерн блоттинга оптимизированных по гликозилированию вариантов rhuIFNG. Левый блот: дорожка 1 - стандарт, 2 - Actimmune®, 3 - rhuIFNG, 4 - [E38N]rhuIFNG. Средний блот: дорожка 1 - стандарт, 2 - rhuIFNG, 3 - [E38N+S40T]rhuIFNG. Правый блот: дорожка 1 - стандарт, 2 - rhuIFNG, 3 - [S99T]rhuIFNG, 4 - [E38N+S40T+S99T]rhuIFNG.Figure 1 shows the results of Western blotting glycosylation-optimized rhuIFNG variants. Left blot: lane 1 - standard, 2 - Actimmune®, 3 - rhuIFNG, 4 - [E38N] rhuIFNG. Middle blot: lane 1 - standard, 2 - rhuIFNG, 3 - [E38N + S40T] rhuIFNG. Right blot: track 1 - standard, 2 - rhuIFNG, 3 - [S99T] rhuIFNG, 4 - [E38N + S40T + S99T] rhuIFNG.
На фиг.2 представлена кривая активность IFNG в сыворотке-время после подкожного введения крысам. • - Actimmune®, 
На фиг.3 представлена кривая активность IFNG в сыворотке-время после подкожного введения крысам. • - [N16C+S99T]rhuIFNG (присоединен mPEG размером в 5 кДа),
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
ОпределенияDefinitions
В контексте настоящей заявки и изобретения применимы следующие определения.In the context of this application and invention, the following definitions apply.
Термин "конъюгат" (или взаимозаменяемо "конъюгированный полипептид" или "конъюгированный вариант") служит для обозначения гетерогенной (в смысле состава или химерной) молекулы, образованной при ковалентном присоединении одного или нескольких вариантов полипептида к одному или нескольким неполипептидным компонентам. Термин ковалентное присоединение означает, что вариант полипептида и неполипептидный компонент ковалентно связаны друг с другом либо непосредственно, либо непрямо через промежуточный компонент или компоненты, такие как мостики, спейсеры или молекулы линкера. Предпочтительно конъюгированный вариант полипептида растворим при релевантной концентрации и условиях, то есть растворим в физиологических средах типа крови. Примеры конъюгированных вариантов полипептида по изобретению включают гликозилированные и/или модифицированные PEG варианты полипептида. Термин "неконъюгированный вариант полипептида" может применяться к полипептидному компоненту конъюгированного варианта полипептида.The term “conjugate” (or interchangeably “conjugated polypeptide” or “conjugated variant”) refers to a heterogeneous (in terms of composition or chimeric) molecule formed by covalently attaching one or more variants of a polypeptide to one or more non-polypeptide components. The term covalent attachment means that a polypeptide variant and a non-polypeptide component are covalently linked to each other either directly or indirectly through an intermediate component or components, such as bridges, spacers or linker molecules. Preferably, the conjugated variant of the polypeptide is soluble at the relevant concentration and conditions, that is, soluble in physiological media such as blood. Examples of conjugated variants of the polypeptide of the invention include glycosylated and / or PEG-modified polypeptide variants. The term “unconjugated polypeptide variant” can be applied to the polypeptide component of a conjugated polypeptide variant.
Термин "неполипептидный компонент" служит для обозначения молекулы, способной к конъюгированию со связующей группой варианта полипептида IFNG. Предпочтительные примеры таких молекул включают молекулы полимеров, липофильные соединения, сахара и органические модифицирующие агенты. Подразумевается, что неполипептидный компонент связан с полипептидом через связующую группу варианта полипептида. За исключением случаев, когда число неполипептидных компонентов типа молекул полимеров, присоединенных к варианту полипептида IFNG, указано точно, всякое упоминание "неполипептидного компонента", присоединенного к варианту полипептида IFNG или иным образом используемого в настоящем изобретении, следует понимать как одну или несколько "неполипептидных компонентов", присоединенных к варианту полипептида IFNG.The term "non-polypeptide component" refers to a molecule capable of conjugating to a linking group of a variant IFNG polypeptide. Preferred examples of such molecules include polymer molecules, lipophilic compounds, sugars, and organic modifying agents. It is understood that the non-polypeptide component is linked to the polypeptide via a linking group of a variant polypeptide. Unless the number of non-polypeptide components such as polymer molecules attached to an IFNG polypeptide variant is indicated, any reference to a “non-polypeptide component” attached to an IFNG polypeptide variant or otherwise used in the present invention should be understood as one or more “non-polypeptide components "attached to a variant of the IFNG polypeptide.
Термин "молекула полимера" означает молекулу, образованную путем ковалентной связи между двумя и более мономерами, причем ни один из мономеров не является остатком аминокислоты. Термин "полимер" может применяться взаимозаменяемо с термином "молекула полимера".The term "polymer molecule" means a molecule formed by a covalent bond between two or more monomers, wherein none of the monomers is an amino acid residue. The term “polymer” may be used interchangeably with the term “polymer molecule”.
Термин "остаток сахара" служит для обозначения молекулы углевода, присоединенной путем гликозилирования in vivo или in vitro, например N- или О-гликозилирования.The term “sugar residue” refers to a carbohydrate molecule attached by in vivo or in vitro glycosylation, for example N- or O-glycosylation.
"Сайт N-гликозилирования" имеет последовательность N-X-S/T/C, где Х - любая аминокислота за исключением пролина, N - аспарагин и S/T/C - серин, треонин или цистеин, предпочтительно серии или треонин, наиболее предпочтительно - треонин. "Сайт О-гликозилирования" представляет собой ОН-группу остатка серина или треонина.An "N-glycosylation site" has the sequence N-X-S / T / C, where X is any amino acid except proline, N is asparagine and S / T / C is serine, threonine or cysteine, preferably a series or threonine, most preferably threonine. An “O-glycosylation site” is an OH group of a serine or threonine residue.
Термин "связующая группа" служит для обозначения группы аминокислотного остатка, способной к конъюгированию с релевантным неполипептидным компонентом, таким как молекула полимера или остаток сахара. Подходящие связующие группы и соответствующие им неполипептидные компоненты приведены ниже в таблице.The term “linking group” is intended to mean an amino acid residue group capable of conjugating to a relevant non-polypeptide component, such as a polymer molecule or a sugar residue. Suitable linking groups and their corresponding non-polypeptide components are shown in the table below.
В отношении N-гликозилирования in vivo термин "связующая группа" применяется нестандартным образом для обозначения аминокислотных остатков, составляющих сайт N-гликозилирования (имеющий последовательность N-X-S/T/S, где Х - любой аминокислотный остаток, кроме пролина, N - аспарагин и S/T/C - серин, треонин или цистеин, предпочтительно серин или треонин, наиболее предпочтительно - треонин). Несмотря на то что именно остаток аспарагина в сайте N-гликозилирования служит для присоединения остатка сахара при гликозилировании, такое присоединение не происходит, если отсутствуют другие аминокислотные остатки сайта N-гликозилирования. Соответственно, когда неполипептидный компонент представлен остатком сахара, а конъюгация происходит путем N-гликозилирования, термин "аминокислотный остаток, содержащий связующую группу для неполипептидного компонента" в применении к изменениям аминокислотной последовательности полипептида IFNG следует понимать как то, что один, два или все аминокислотные остатки, составляющие сайт N-гликозилирования, подвергаются такому изменению, при котором функциональный сайт N-гликозилирования вводится в аминокислотную последовательность либо удаляется из нее, или же функциональный сайт N-гликозилирования сохраняется в аминокислотной последовательности (например, при замещении остатка серина, уже входящего в состав сайта N-гликозилирования, остатком треонина и наоборот).For in vivo N-glycosylation, the term “linking group” is used in a non-standard way to refer to the amino acid residues that make up the N-glycosylation site (having the sequence NXS / T / S, where X is any amino acid residue except proline, N is asparagine and S / T / C is serine, threonine or cysteine, preferably serine or threonine, most preferably threonine). Despite the fact that it is the asparagine residue at the N-glycosylation site that serves to attach the sugar residue during glycosylation, such attachment does not occur if other amino acid residues of the N-glycosylation site are absent. Accordingly, when the non-polypeptide component is represented by a sugar residue, and conjugation occurs by N-glycosylation, the term “amino acid residue containing a linking group for the non-polypeptide component” as applied to changes in the amino acid sequence of the IFNG polypeptide should be understood as one, two or all amino acid residues constituting the N-glycosylation site undergo such a change in which the functional N-glycosylation site is introduced into the amino acid sequence or Dahl thereof, or a functional N-glycosylation site is retained in the amino acid sequence (e.g., by substituting a serine residue, already is part of the N-glycosylation site, a threonine residue and vice versa).
В настоящей заявке названия и обозначения аминокислот и атомов (к примеру, CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C и т.д.) применяются согласно определениям Базы Данных по Белкам (Protein DataBank, PDB) (www.pdb.org), которые основаны на номенклатуре IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984) вместе с поправками в Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). СА иногда обозначается как Сα, СВ - как Сβ. Термин "аминокислотный остаток" служит для обозначения аминокислотных остатков, входящих в группу, состоящую из остатков аланина (Ala или А), цистеина (Cys или С), аспарагиновой кислоты (Asp или D), глутаминовой кислоты (Glu или Е), фенилаланина (Phe или F), глицина (Gly или G), гистидина (His или Н), изолейцина (Ile или I), лизина (Lys или К), лейцина (Leu или L), метионина (Met или М), аспарагина (Asn или N), пролина (Pro или Р), глутамина (Gln или Q), аргинина (Arg или R), серина (Ser или S), треонина (Thr или Т), валина (Val или V), триптофана (Trp или W) и тирозина (Tyr или Y).In this application, the names and designations of amino acids and atoms (for example, CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C, etc.) are used according to the definitions of the Protein DataBank (PDB) ( www.pdb.org), which are based on the IUPAC nomenclature (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (remainder names, atom names etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984), as amended in Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). CA is sometimes referred to as Cα, CB as Cβ. The term “amino acid residue” is used to refer to amino acid residues belonging to the group consisting of alanine residues (Ala or A) , cysteine (Cys or C), aspartic acid you (Asp or D), glutamic acid (Glu or E), phenylalanine (Phe or F), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), lysine (Lys or K), leucine (Leu or L), methionine (Met or M), asparagine (Asn or N), proline (Pro or P), glutamine (Gln or Q), arginine (Arg or R), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), valine (Val or V), tryptophan (Trp or W) and tyrosine (Tyr or Y).
Нумерация аминокислотных остатков в настоящем документе начинается с N-конца [S99T]huIFNG без сигнального пептида (то есть SEQ ID No:1) или, где уместно, с N-конца huIFNG без сигнального пептида (то есть SEQ ID No:17).The numbering of amino acid residues herein begins with the N-terminus of [S99T] huIFNG without a signal peptide (i.e. SEQ ID No: 1) or, where appropriate, from the N-terminus of huIFNG without a signal peptide (i.e. SEQ ID No: 17).
Терминология, используемая для обозначения положения/замены аминокислот, иллюстрируется следующим образом: G18 означает положение 18, занятое глицином в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No:17 G18N означает, что остаток Gly в положении 18 был заменен на Asn. Множественные замены обозначаются через "+", например G18N+S20T означает аминокислотную последовательность, содержащую замену остатка Gly в положении 18 на Asn и замену остатка Ser в положении 20 на Thr. Альтернативные замены обозначаются через "/". Например, G18S/T охватывает следующие индивидуальные замены: G18S и G18T. Делеции обозначаются звездочкой. Например, G18* означает, что остаток Gly в положении 18 был удален. Инсерции обозначаются следующим образом: инсерция дополнительного остатка Ser после остатка Gly, находящегося в положении 18, обозначается как G18GS. Комбинированные замены и инсерции обозначаются следующим образом: замена остатка Gly в положении 18 остатком Ser и инсерция остатка Ala после аминокислоты в положении 18 обозначается как G18SА.The terminology used to indicate amino acid position / substitution is illustrated as follows: G18 means
Термин "нуклеотидная последовательность" служит для обозначения непрерывной цепочки из двух и более молекул нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность может происходить из генома, кДНК, РНК, иметь полусинтетическое или синтетическое происхождение либо представлять собой любую их комбинацию.The term "nucleotide sequence" is used to denote a continuous chain of two or more nucleotide molecules. The nucleotide sequence can occur from the genome, cDNA, RNA, have a semisynthetic or synthetic origin, or can be any combination of them.
Термин "полимеразная цепная реакция" или "ПЦР" в общем относится к методу амплификации требуемой нуклеотидной последовательности in vitro, как описано, к примеру, в US 4683195. В общем случае метод ПЦР заключается в многократном повторении цикла реакций удлинения праймера с использованием олигонуклеотидных праймеров, способных предпочтительно гибридизоваться с матричной нуклеиновой кислотой.The term "polymerase chain reaction" or "PCR" generally refers to the method of amplification of the desired nucleotide sequence in vitro, as described, for example, in US 4683195. In general, the PCR method consists in repeating the cycle of primer extension reactions using oligonucleotide primers, capable of preferably hybridizing with template nucleic acid.
Термины "клетка", "клетка-хозяин", "линия клеток" и "культура клеток" в настоящем изобретении применяются взаимозаменяемо и следует иметь в виду, что все они включают потомство, образующееся в результате роста или культивирования клетки.The terms "cell", "host cell", "cell line" and "cell culture" in the present invention are used interchangeably and it should be borne in mind that they all include offspring resulting from cell growth or cultivation.
Термины "трансформация" и "трансфекция" в настоящем изобретении применяются взаимозаменяемо для обозначения процесса введения ДНК в клетку.The terms "transformation" and "transfection" in the present invention are used interchangeably to refer to the process of introducing DNA into a cell.
"Функционально связанный" относится к ковалентному соединению двух и более нуклеотидных последовательностей путем ферментативного лигирования или иным способом, в такой конфигурации друг относительно друга, чтобы могло осуществляться нормальное функционирование этих последовательностей. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность предшественника или лидера секреции, функционально связана с нуклеотидной последовательностью полипептида, если она экспрессируется в виде белка-предшественника, участвующего в секреции этого полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой последовательности; сайт связывания с рибосомой функционально связан с кодирующей последовательностью, если он располагается в таком положении, что способствует трансляции. В общем случае "функционально связанный" означает, что соединяемые нуклеотидные последовательности - смежные, а в случае лидера секреции - смежные и находятся в одной рамке считывания. Соединение осуществляется путем лигирования в соответствующих сайтах рестрикции. Если таких сайтов нет, то применяются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии со стандартными методами рекомбинантной ДНК."Functionally linked" refers to the covalent joining of two or more nucleotide sequences by enzymatic ligation or otherwise, in such a configuration relative to each other that normal functioning of these sequences can be carried out. For example, a nucleotide sequence encoding a sequence of a precursor or secretion leader is operably linked to the nucleotide sequence of a polypeptide if it is expressed as a precursor protein involved in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of this sequence; the ribosome binding site is functionally linked to the coding sequence, if it is located in such a position that promotes translation. In the general case, “functionally linked” means that the nucleotide sequences to be joined are adjacent, and in the case of a secretion leader, they are adjacent and are in the same reading frame. The connection is carried out by ligation at the corresponding restriction sites. If there are no such sites, then synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with standard recombinant DNA methods.
Термин "модификация" в применении к настоящему изобретению охватывает замены, инсерции и делеции.The term "modification" as applied to the present invention covers substitutions, insertions and deletions.
Термины "мутация" и "замена" применяются здесь взаимозаменяемо.The terms “mutation” and “substitution” are used interchangeably herein.
Термин "ввести" главным образом означает замещение существующего аминокислотного остатка, но может означать и вставку дополнительного аминокислотного остатка.The term “introduce” mainly means replacing an existing amino acid residue, but may also mean inserting an additional amino acid residue.
Термин "удалить" главным образом означает замещение аминокислотного остатка, подлежащего удалению, другим аминокислотным остатком, но может означать и делецию (без замещения) аминокислотного остатка, подлежащего удалению.The term “remove” mainly means replacing the amino acid residue to be removed with another amino acid residue, but may also mean a deletion (without substitution) of the amino acid residue to be removed.
Выражение "аминокислотный остаток, содержащий связующую группу для неполипептидного компонента" служит для обозначения именного того аминокислотного остатка, с которым связывается неполипептидный компонент (в случае введения аминокислотного остатка) или с которым он мог бы связаться (в случае удаления аминокислотного остатка).The expression "amino acid residue containing a linking group for a non-polypeptide component" is used to denote the name of the amino acid residue to which the non-polypeptide component binds (in the case of introducing an amino acid residue) or with which it could be contacted (in the case of removal of the amino acid residue).
Выражение "одно отличие" или "отличается от" в применении к конкретным модификациям служит для обозначения дополнительных отличий, присутствующих помимо уже указанного различия по аминокислотам. Так, в дополнение к описанным изменениям аминокислотных остатков, имеющих целью оптимизацию использования сайтов гликозилирования или удаление и/или введение аминокислотных остатков, содержащих связующую группу для неполипептидного компонента, вариант полипептида IFNG может, если нужно, содержать другие модификации, не связанные с такими изменениями. Они могут включать, к примеру, укорочение С-конца на одну или несколько аминокислот, добавление одного и более дополнительных остатков на N- и/или С-конце, например, добавление остатка Met на N-конце, добавление аминокислотной последовательности Cys-Tyr-Cys на N-конце, а также "консервативные замены аминокислот", то есть замены, осуществляемые в пределах группы аминокислот с близкими характеристиками, например, малых аминокислот, кислых аминокислот, полярных аминокислот, основных аминокислот, гидрофобных аминокислот и ароматических аминокислот. Примеры консервативных замен в настоящем изобретении, в частности, можно выбрать из групп, перечисленных в нижеследующей таблице.The expression “one difference” or “differs from” as applied to specific modifications is used to denote additional differences that are present in addition to the amino acid difference already indicated. So, in addition to the described changes in amino acid residues with the goal of optimizing the use of glycosylation sites or removing and / or introducing amino acid residues containing a linking group for the non-polypeptide component, the IFNG variant polypeptide may, if necessary, contain other modifications not associated with such changes. These may include, for example, shortening the C-terminus by one or more amino acids, adding one or more additional residues at the N- and / or C-terminus, for example, adding a Met residue at the N-terminus, adding the Cys-Tyr- amino acid sequence Cys at the N-terminus, as well as “conservative amino acid substitutions”, that is, substitutions carried out within a group of amino acids with similar characteristics, for example, small amino acids, acidic amino acids, polar amino acids, basic amino acids, hydrophobic amino acids and aromatic amino acids. Examples of conservative substitutions in the present invention, in particular, can be selected from the groups listed in the following table.
Выражение "по меньшей мере" в применении к неполипептидному компоненту, аминокислотному остатку, замене и т.д. означает один или более.The expression “at least” as applied to a non-polypeptide component, amino acid residue, substitution, etc. means one or more.
Термин "AUCsc", или "площадь под кривой при подкожном введении" применяется в его обычном значении, а именно как площадь под кривой активность IFGN в сыворотке/время после подкожного введения варианта полипептида IFGN, в частности при подкожном введении его крысам. После определения экспериментальных точек активности IFGN в зависимости от времени можно без труда рассчитать AUCsc с помощью компьютерной программы типа GraphPad Prism 3.01.The term “AUC sc, ” or “area under the curve when administered subcutaneously,” is used in its usual meaning, namely, the area under the curve, serum IFGN activity / time after subcutaneous administration of a variant IFGN polypeptide, in particular when administered to rats subcutaneously. After determining the experimental points of IFGN activity as a function of time, AUC sc can be easily calculated using a computer program such as GraphPad Prism 3.01.
Термин "функциональный период полужизни in vivo" применяется в его обычном значении, как время, по прошествии которого в организме/органе-мишени остается 50% биологической активности полипептида, или как время, по прошествии которого активность полипептида составляет 50% от первоначального значения.The term “in vivo functional half-life” is used in its usual meaning as the time after which 50% of the biological activity of the polypeptide remains in the target organism or organ, or the time after which the activity of the polypeptide is 50% of the initial value.
В качестве альтернативы определению функционального периода полужизни in vivo можно определять "время полужизни в сыворотке", то есть время, по прошествии которого в плазме или кровотоке циркулирует 50% полипептида до полного выведения. Определение времени полужизни в сыворотке часто бывает проще, чем определение функционального периода полужизни in vivo, и величина полужизни в сыворотке обычно является хорошим показателем величины функционального периода полужизни in vivo. Термины, альтернативные времени полужизни в сыворотке - это "время полужизни в плазме", "время полужизни в кровотоке", "сывороточный клиренс", "плазменный клиренс" и "период полувыведения". Время полужизни в сыворотке можно без труда определить у крыс, см. раздел Материалы и Методы. Важно иметь в виду, что "время полужизни в сыворотке", когда оно применяется в настоящем изобретении для данного варианта полипептида IFNG, необходимо определять для образца, который был введен внутривенно.As an alternative to determining the functional half-life in vivo, the “half-life in serum” can be determined, that is, the time after which 50% of the polypeptide circulates in the plasma or bloodstream until complete elimination. Determining serum half-lives is often easier than determining in vivo half-lives, and serum half-lives are usually a good indicator of the in vivo half-lives. The terms alternative to serum half-life are “plasma half-life,” “blood half-life,” “serum clearance,” “plasma clearance,” and “half-life.” Serum half-lives can be easily determined in rats, see Materials and Methods. It is important to keep in mind that the “serum half-life” when used in the present invention for a given IFNG polypeptide variant must be determined for a sample that has been administered intravenously.
Термин "сыворотка" применяется в его обычном значении, как плазма крови без фибриногена и других факторов свертываемости.The term "serum" is used in its usual meaning as blood plasma without fibrinogen and other coagulation factors.
Полипептид обычно выводится под действием одной или более ретикулоэндотелиальных систем (RES), почек, селезенки или печени, либо путем специфического или неспецифического протеолиза. Термин "почечный клиренс" применяется в его обычном значении для обозначения любого типа выведения через почки, например, посредством клубочковой фильтрации, выделения с мочой или элиминации в трубочках. Обычно выведение через почки зависит от физических характеристик полипептида, таких как молекулярный вес, размер (относительно предела исключения для клубочковой фильтрации), симметрия, форма/ упругость, заряд, присоединенные углеводные цепи и наличие клеточных рецепторов для полипептида. Молекулярный вес примерно в 67 кДа обычно считается пределом исключения при почечном клиренсе. Почечный клиренс можно определить любым подходящим методом, например одним из принятых методов in vivo. Например, почечный клиренс можно определить путем введения пациенту меченного (радиоактивной или флуоресцентной меткой) конъюгированного полипептида и измерения активности метки в собранной у пациента моче. Снижение почечного клиренса определяется относительно контрольной молекулы, такой как huIFNG, [S99T]huIFNG или Actimmune®. Функциональность, которая должна сохраняться, обычно выбирается из антивирусной, антипролиферативной, иммуномодуляторной активности или связывания с рецептором IFNG.The polypeptide is usually excreted by one or more reticuloendothelial systems (RES), kidneys, spleen or liver, or by specific or non-specific proteolysis. The term "renal clearance" is used in its usual meaning to mean any type of excretion through the kidneys, for example, by glomerular filtration, excretion in the urine or elimination in the tubules. Usually, excretion through the kidneys depends on the physical characteristics of the polypeptide, such as molecular weight, size (relative to the exclusion limit for glomerular filtration), symmetry, shape / elasticity, charge, attached carbohydrate chains, and the presence of cellular receptors for the polypeptide. A molecular weight of approximately 67 kDa is usually considered the exclusion limit for renal clearance. Renal clearance can be determined by any suitable method, for example, one of the accepted in vivo methods. For example, renal clearance can be determined by administering to the patient a labeled (radioactive or fluorescent label) conjugated polypeptide and measuring label activity in the patient's urine collected. Reduced renal clearance is relative to a control molecule such as huIFNG, [S99T] huIFNG or Actimmune®. The functionality to be maintained is usually selected from antiviral, antiproliferative, immunomodulatory activity, or binding to the IFNG receptor.
Термин "увеличение (повышение)" в применении к функциональному времени полужизни in vivo или в сыворотке означает, что соответствующее время полужизни варианта IFNG статистически достоверно увеличивается по сравнению с таковым для контрольной молекулы, такой как гликозилированный nuIFNG (SEQ ID No:17), гликозилированный [S99T]huIFNG (SEQ ID No:1) или Actimmune® (SEQ ID No:34 - продуцируемый в Е.coli), при внутривенном введении и при измерении в сравнимых условиях. Так, представляют интерес такие варианты полипептида IFNG, которые обладают увеличенным функциональным временем полужизни in vivo или в сыворотке по сравнению с любой из контрольных молекул, указанных выше.The term "increase (increase)" as applied to the functional half-life in vivo or in serum means that the corresponding half-life of the IFNG variant is statistically significantly increased compared to that for the control molecule, such as glycosylated nuIFNG (SEQ ID No: 17), glycosylated [S99T] huIFNG (SEQ ID No: 1) or Actimmune® (SEQ ID No: 34 - produced in E. coli), when administered intravenously and when measured under comparable conditions. Thus, such variants of the IFNG polypeptide that have an increased functional half-life in vivo or in serum compared to any of the control molecules mentioned above are of interest.
В частности, представляют интерес такие варианты полипептида IFNG, для которых соотношение между временем полужизни в сыворотке (или функциональным периодом полужизни in vivo) данного варианта и временем полужизни в сыворотке (или функциональным периодом полужизни in vivo) huIFNG или [S99T]huIFNG в их гликозилированных формах составляет по меньшей мере 1,25, более предпочтительно по меньшей мере 1,50, например, по меньшей мере 1,75, например, по меньшей мере 2, еще более предпочтительно по меньшей мере 3, типа по меньшей мере 4, например, по меньшей мере 5, при внутривенном введении, в частности при внутривенном введении крысам.In particular, such IFNG polypeptide variants are of interest for which the ratio between the serum half-life (or in vivo functional half-life) of this variant and the serum half-life (or in vivo functional half-life) huIFNG or [S99T] huIFNG in their glycosylated forms is at least 1.25, more preferably at least 1.50, for example at least 1.75, for example at least 2, even more preferably at least 3, such as at least 4, for example at least 5, with int vennom introduction, in particular when administered intravenously in rats.
Другими примерами представляющих интерес вариантов IFNG являются такие варианты, для которых соотношение между временем полужизни в сыворотке (или функциональным периодом полужизни in vivo) данного варианта и временем полужизни в сыворотке (или функциональным периодом полужизни in vivo) Actimmune® (SEQ ID No:34 - продуцируемый в Е.coli) составляет по меньшей мере 2, более предпочтительно по меньшей мере 3, типа по меньшей мере 4, например, по меньшей мере 5, еще более предпочтительно по меньшей мере 6, типа по меньшей мере 7, например, по меньшей мере 8, наиболее предпочтительно по меньшей мере 9, например, по меньшей мере 10, при внутривенном введении, в частности при внутривенном введении крысам.Other examples of IFNG variants of interest are those for which the ratio between the serum half-life (or in vivo functional half-life) of this option and the Actimmune® serum half-life (or in vivo functional half-life) (SEQ ID No: 34 - produced in E. coli) is at least 2, more preferably at least 3, type at least 4, for example at least 5, even more preferably at least 6, type at least 7, for example at least least 8 most respectfully at least 9, e.g., at least 10, when administered intravenously, in particular when administered intravenously in rats.
Термин "повышение (увеличение)" в применении к AUCsc означает, что площадь под кривой для варианта IFNG по изобретению, при подкожном введении, статистически достоверно повышается по сравнению с таковой для контрольной молекулы, такой как гликозилированный huIFNG (SEQ ID No:17), гликозилированный [S99T]huIFNG (SEQ ID No:1) или Actimmune® (SEQ ID No:34 - продуцируемый в Е.coli), при определении в сравнимых условиях. Так, предпочтительны такие варианты IFNG, у которых AUCsc повышается по сравнению с любой из контрольных молекул, указанных выше. Конечно, следует вводить одинаковое количество активности варианта IFNG по изобретению и контрольной молекулы. Впоследствии, для проведения прямых сравнений между различными молекулами IFNG значение AUCsc можно нормализировать, то есть их можно выражать в виде AUCsc/введенная доза.The term “increase (increase)” as applied to AUC sc means that the area under the curve for the IFNG variant of the invention, when administered subcutaneously, is statistically significantly increased compared to that for the control molecule, such as glycosylated huIFNG (SEQ ID No: 17) glycosylated [S99T] huIFNG (SEQ ID No: 1) or Actimmune® (SEQ ID No: 34 produced in E. coli), as determined under comparable conditions. Thus, IFNG variants are preferred in which AUC sc is increased compared to any of the control molecules mentioned above. Of course, the same amount of activity of the IFNG variant of the invention and the control molecule should be administered. Subsequently, for direct comparisons between different IFNG molecules, the AUC sc value can be normalized, that is, they can be expressed as AUC sc / dose administered.
Особенно предпочтительны такие варианты IFNG, для которых соотношение между AUCsc данного варианта и AUCsc гликозилированного huIFNG или гликозилированного [S99T]huIFNG составляет по меньшей мере 1,25, типа по меньшей мере 1,5, например, по меньшей мере 2, более предпочтительно по меньшей мере 3, типа по меньшей мере 4, например, по меньшей мере 5 или 6, еще более предпочтительно по меньшей мере 7, типа по меньшей мере 8, например, по меньшей мере 9 или 10, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12, типа по меньшей мере 14, например, по меньшей мере 16, 18 или 20, в частности при (подкожном) введении крысам.Especially preferred are IFNG variants for which the ratio between the AUC sc of this variant and the AUC sc of glycosylated huIFNG or glycosylated [S99T] huIFNG is at least 1.25, such as at least 1.5, for example at least 2, more preferably at least 3, type at least 4, for example at least 5 or 6, even more preferably at least 7, type at least 8, for example at least 9 or 10, most preferably at least 12, type of at least 14, for example at least 16, 18 or 20, in particular and with (subcutaneous) administration to rats.
Другими примерами особенно предпочтительных вариантов IFNG являются такие варианты, для которых соотношение между AUCsc данного варианта и AUCsc Actimmune® составляет по меньшей мере 100, более предпочтительно по меньшей мере 150, типа по меньшей мере 200, например, по меньшей мере 250, еще более предпочтительно по меньшей мере 300, типа по меньшей мере 400, например, по меньшей мере 500, наиболее предпочтительно по меньшей мере 750, типа по меньшей мере 1000, например, по меньшей мере 1500 или 2000, в частности при (подкожном) введении крысам.Other examples of particularly preferred IFNG variants are those for which the ratio between the AUC sc of this variant and AUC sc Actimmune® is at least 100, more preferably at least 150, such as at least 200, for example at least 250, still more preferably at least 300, such as at least 400, for example at least 500, most preferably at least 750, such as at least 1000, for example at least 1500 or 2000, in particular when administered (subcutaneously) to rats .
Термин "Tmax,sc" относится к тому времени на кривой активность IFNG в сыворотке-время, когда наблюдается максимальная активность IFNG в сыворотке. Предпочтительными вариантами IFNG по изобретению являются такие варианты, у которых Тmax,sc повышается по сравнению с Actimmune® и/или по сравнению с гликозилированным huIFNG. В частности, у таких предпочтительных вариантов Tmax,sc (при определении после подкожного введения крысам) составляет по меньшей мере 200 мин, типа по меньшей мере 250 мин, например, по меньшей мере 300 мин, более предпочтительно по меньшей мере 350 мин, например, по меньшей мере 400 мин.The term "T max, sc " refers to the time on the serum IFNG activity-time curve when the maximum serum IFNG activity is observed. Preferred IFNG variants of the invention are those in which T max, sc is increased compared to Actimmune® and / or compared to glycosylated huIFNG. In particular, in such preferred embodiments, T max, sc (as determined after subcutaneous administration to rats) is at least 200 minutes, such as at least 250 minutes, for example at least 300 minutes, more preferably at least 350 minutes, for example at least 400 minutes
Термин "пониженная иммуногенность" означает, что вариант полипептида IFNG вызывает измеримо меньший иммунный ответ, чем контрольная молекула, к примеру, huIFNG или Actimmune®, при определении в сравнимых условиях. Иммунный ответ может быть клеточным или антительным (развернутое определение иммуногенности см., к примеру, в Roitt: Essential Immunology (8th edition, Blackwell). Обычно снижение антительной реакции является показателем пониженной иммуногенности. Пониженная иммуногенность может быть определена любым подходящим способом, известным в этой области, например, in vivo или in vitro.The term "reduced immunogenicity" means that an IFNG polypeptide variant elicits a measurably lower immune response than a control molecule, for example, huIFNG or Actimmune®, when determined under comparable conditions. The immune response can be cellular or antibody-based (for a detailed definition of immunogenicity see, for example, Roitt: Essential Immunology (8th edition, Blackwell). Typically, a decrease in antibody response is an indicator of reduced immunogenicity. Reduced immunogenicity can be determined by any suitable method known in this areas, for example, in vivo or in vitro.
В контексте настоящего изобретения термин "повышенное гликозилирование", "повышение степени N-гликозилирования in vivo" или "повышение степени N-гликозилирования" служит для обозначения повышенного содержания присоединенных углеводных молекул, что обычно происходит вследствие более высокого (или лучшего) использования сайта/ов гликозилирования. Хорошо известно (Hooker et al., 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287-295 и Sarenva et al., 1995, Biochem J., 308, 9-14), что при экспрессии huIFNG в клетках СНО только у 50% молекул IFNG используются оба сайта гликозилирования, у 40% - используется один сайт гликозилирования (1N) и около 10% не гликозилированы (0N). Повышение степени N-гликозилирования in vivo можно определить любым подходящим способом, известным в этой области, например электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Один из удобных методов определения повышенного гликозилирования описан в Материалах и Методах, в разделе под названием "Определение повышенной степени гликозилирования".In the context of the present invention, the term “increased glycosylation”, “increased in vivo N-glycosylation”, or “increased N-glycosylation” is used to indicate an increased content of attached carbohydrate molecules, which is usually due to higher (or better) use of the site / s glycosylation. It is well known (Hooker et al., 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287-295 and Sarenva et al., 1995, Biochem J., 308, 9-14) that only huIFNG is expressed in
Применяемый в настоящем изобретении термин "популяция вариантов полипептида IFNG" или "композиция, содержащая популяцию вариантов полипептида IFNG" служит для обозначения композиции, содержащей по меньшей мере два полипептида IFNG, в разной степени гликозилированных. Как это станет ясно, настоящее изобретение обеспечивает способы получения популяции полипептидов IFNG, в которой содержится повышенное количество полностью гликозилированных молекул IFNG.As used in the present invention, the term “IFNG polypeptide variant population” or “composition comprising a IFNG polypeptide variant population” is used to mean a composition containing at least two IFNG polypeptides, to different degrees of glycosylation. As it becomes clear, the present invention provides methods for producing a population of IFNG polypeptides that contain an increased amount of fully glycosylated IFNG molecules.
Таким образом, настоящее изобретение также касается гомогенной популяции полипептидов IFNG по изобретению (то есть популяции, в которой большинство полипептидов IFNG полностью гликозилировано) или композиций, содержащих гомогенную популяцию полипептидов IFNG по изобретению. Например, популяция полипептидов IFNG может содержать по меньшей мере 70% полипептида IFNG по изобретению, предпочтительно по меньшей мере 75%, типа по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, типа по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, еще более предпочтительно 97%, типа по меньшей мере 98%, например, по меньшей мере 99%.Thus, the present invention also relates to a homogeneous population of IFNG polypeptides of the invention (i.e., a population in which most IFNG polypeptides are fully glycosylated) or compositions comprising a homogeneous population of IFNG polypeptides of the invention. For example, a population of IFNG polypeptides may contain at least 70% of the IFNG polypeptide of the invention, preferably at least 75%, such as at least 80%, for example at least 85%, more preferably at least 90%, such as at least at least 95%, for example at least 96%, even more preferably 97%, such as at least 98%, for example at least 99%.
Термин "обладающий активностью IFNG" означает то, что вариант полипептида обладает одной или более функциями нативного huIFNG или rhuIFNG, включая его способность связываться с рецептором IFNG и вызывать передачу сигнала при связывании hulFNG со своим рецептором при определении in vitro или in vivo (то есть биоактивность in vitro или in vivo). Рецептор IFNG был описан Aguet et al. (Cell 55: 273-280, 1988) и Calderon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4837-4841, 1988). Подходящим способом измерения активности IFNG является способ, раскрытый в настоящем изобретении под названием "Первичный анализ". При применении описанного здесь "первичного анализа" удельная активность вариантов полипептида, "обладающих активностью IFNG", составляет по меньшей мере 5% по сравнению с rhuIFNG. Следует иметь в виду, что в зависимости от того, какая проводилась конкретная модификация, например, модифицирован PEG этот вариант или нет, активность может варьировать в широком диапазоне. Так, примеры удельных активностей могут варьировать от таких низких значений, как 5%, до таких высоких, как 150% по сравнению с rhuIFNG. Например, удельная активность может составлять по меньшей мере 10% (например, 10-125%), по меньшей мере 15% (например, 15-125%), по меньшей мере 20% (например, 20-125%), по меньшей мере 25% (например, 25-125%), по меньшей мере 30% (например, 30-125%), по меньшей мере 35% (например, 35-125%), по меньшей мере 40% (например, 40-125%), по меньшей мере 45% (например, 45-125%), по меньшей мере 50% (например, 50-125%), по меньшей мере 55% (например, 55-125%), по меньшей мере 60% (например, 60-125%), по меньшей мере 65% (например, 65-125%), по меньшей мере 70% (например, 70-125%), по меньшей мере 75% (например, 75-125%), по меньшей мере 80% (например, 80-125%), или по меньшей мере 90% (например, 90-110%) по сравнению с удельной активностью rhuIFNG.The term “having IFNG activity” means that a variant polypeptide has one or more functions of a native huIFNG or rhuIFNG, including its ability to bind to the IFNG receptor and induce signal transmission upon binding of hulFNG to its receptor when determined in vitro or in vivo (i.e. bioactivity in vitro or in vivo). The IFNG receptor has been described by Aguet et al. (Cell 55: 273-280, 1988) and Calderon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4837-4841, 1988). A suitable method for measuring IFNG activity is the method disclosed in the present invention under the title "Primary Assay". When applying the “primary analysis” described herein, the specific activity of the polypeptide variants “having IFNG activity” is at least 5% compared to rhuIFNG. It should be borne in mind that depending on what specific modification was carried out, for example, whether this variant was modified by PEG or not, activity can vary over a wide range. So, examples of specific activities can vary from as low as 5% to as high as 150% compared to rhuIFNG. For example, the specific activity may be at least 10% (e.g., 10-125%), at least 15% (e.g., 15-125%), at least 20% (e.g., 20-125%), at least at least 25% (e.g. 25-125%), at least 30% (e.g. 30-125%), at least 35% (e.g. 35-125%), at least 40% (e.g. 40- 125%), at least 45% (e.g. 45-125%), at least 50% (e.g. 50-125%), at least 55% (e.g. 55-125%), at least 60 % (e.g. 60-125%), at least 65% (e.g. 65-125%), at least 70% (e.g. 70-125%), at least 75% (e.g. 75-125% ) at least 80% (for example mer, 80-125%), or at least 90% (for example, 90-110%) compared with the specific activity of rhuIFNG.
"Полипептид IFNG" - это полипептид, обладающий активностью IFNG, то есть термин "полипептид IFNG" относится к любой молекуле IFNG (независимо от того, является ли она huIFNG, укороченной его формой или вариантом), если указанная молекула IFNG обладает активностью IFNG согласно данному определению. Термин "полипептид IFNG" относится и к полипептиду в форме мономера или димера, по ситуации. Например, при обозначении конкретных замен их обычно указывают относительно мономерного полипептида huIFNG. В случае, когда указана молекула IFNG по изобретению, то обычно это означает димер (она при этом содержит два мономера полипептида IFNG, модифицированных, как описано). Димерная форма полипептидов IFNG может быть получена при нормальной ассоциации двух мономеров или находиться в форме одноцепочечного димера полипептида IFNG.An “IFNG polypeptide” is a polypeptide having IFNG activity, that is, the term “IFNG polypeptide” refers to any IFNG molecule (regardless of whether it is huIFNG, shortened by its form or variant) if said IFNG molecule has IFNG activity according to this definition. The term "IFNG polypeptide" refers to a polypeptide in the form of a monomer or dimer, as appropriate. For example, when designating specific substitutions, they are usually indicated relative to the monomeric huIFNG polypeptide. In the case where the IFNG molecule of the invention is indicated, this usually means a dimer (it also contains two monomers of the IFNG polypeptide modified as described). The dimeric form of IFNG polypeptides can be obtained by normal association of two monomers or be in the form of a single chain dimer of an IFNG polypeptide.
Термин "исходный" служит для обозначения того, что полипептид IFNG содержит сайт(ы) гликозилирования, улучшенные в соответствии с настоящим изобретением. Хотя исходный полипептид, подлежащий модификации в соответствии с настоящим изобретением, может быть любым полипептидом, обладающим активностью IFNG, и, таким образом, он может быть любого происхождения, например из любого млекопитающего (не человека), однако предпочтительно, чтобы исходным полипептидом был huIFNG с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID No:17, или его фрагмент.The term “parent” is intended to mean that the IFNG polypeptide contains glycosylation site (s) improved in accordance with the present invention. Although the parent polypeptide to be modified in accordance with the present invention can be any polypeptide having IFNG activity, and thus it can be of any origin, for example from any mammal (not human), it is preferred that the parent polypeptide is huIFNG with the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 17, or a fragment thereof.
"Фрагмент" - это часть полноразмерной последовательности полипептида IFNG (например, фрагмент полноразмерного полипептида huIFNG, приведенного в SEQ ID No:17, или фрагмент полноразмерного варианта полипептида [S99T]huIFNG, приведенного в SEQ ID No:1), обладающий активностью IFNG, например, укороченный с С- или N-конца вариант. Конкретные примеры фрагментов варианта полипептида IFNG включают фрагменты [S99T]huIFNG, укороченные с С-конца на 1-15 аминокислотных остатков, например, на 1 аминокислотный остаток (SEQ ID No:2), на 2 аминокислотных остатка (SEQ ID No:3), на 3 аминокислотных остатка (SEQ ID No:4), на 4 аминокислотных остатка (SEQ ID No:5), на 5 аминокислотных остатков (SEQ ID No:6), на 6 аминокислотных остатков (SEQ ID No:7), на 7 аминокислотных остатков (SEQ ID No:8), на 8 аминокислотных остатков (SEQ ID No:9), на 9 аминокислотных остатков (SEQ ID No:10), на 10 аминокислотных остатков (SEQ ID No:11), на 11 аминокислотных остатков (SEQ ID No:12), на 12 аминокислотных остатков (SEQ ID No:13), на 13 аминокислотных остатков (SEQ ID No:14), на 14 аминокислотных остатков (SEQ ID No:15) или 15 аминокислотных остатков (SEQ ID No:16), и/или укороченные с N-конца на 1-3 аминокислотных остатка. Конкретные примеры фрагментов huIFNG включают huIFNG, укороченные с С-конца на 1-15 аминокислотных остатков, например, на 1 аминокислотный остаток (SEQ ID No:19), на 2 аминокислотных остатка (SEQ ID No:20), на 3 аминокислотных остатка (SEQ ID No:21), на 4 аминокислотных остатка (SEQ ID No:22), на 5 аминокислотных остатков (SEQ ID No:23), на 6 аминокислотных остатков (SEQ ID No:24), на 7 аминокислотных остатков (SEQ ID No:25), на 8 аминокислотных остатков (SEQ ID No:26), на 9 аминокислотных остатков (SEQ ID No:27), на 10 аминокислотных остатков (SEQ ID No:28), на 11 аминокислотных остатков (SEQ ID No:29), на 12 аминокислотных остатков (SEQ ID No:30), на 13 аминокислотных остатков (SEQ ID No:31), на 14 аминокислотных остатков (SEQ ID No:32) или 15 аминокислотных остатков (SEQ ID No:33), и/или укороченные с N-конца на 1-3 аминокислотных остатка.A “fragment” is a part of the full-length sequence of an IFNG polypeptide (for example, a fragment of the full-sized huIFNG polypeptide shown in SEQ ID No: 17, or a fragment of a full-sized variant of the [S99T] huIFNG polypeptide shown in SEQ ID No: 1) having IFNG activity, for example shortened from the C- or N-terminus. Specific examples of fragments of an IFNG polypeptide variant include [S99T] huIFNG fragments shortened from the C-terminus by 1-15 amino acid residues, for example, 1 amino acid residue (SEQ ID No: 2), 2 amino acid residues (SEQ ID No: 3) 3 amino acid residues (SEQ ID No: 4), 4 amino acid residues (SEQ ID No: 5), 5 amino acid residues (SEQ ID No: 6), 6 amino acid residues (SEQ ID No: 7), 7 amino acid residues (SEQ ID No: 8), 8 amino acid residues (SEQ ID No: 9), 9 amino acid residues (SEQ ID No: 10), 10 amino acid residues (SEQ ID No: 11), 11 amino acid residues residues (SEQ ID No: 12), for 12 amino acid residues (SEQ ID No: 13), for 13 amino acid residues (SEQ ID No: 14), for 14 amino acid residues (SEQ ID No: 15) or 15 amino acid residues (SEQ ID No: 16), and / or 1-3 amino acid residues shortened from the N-terminus. Specific examples of huIFNG fragments include huIFNG, shortened from the C-terminus by 1-15 amino acid residues, for example, by 1 amino acid residue (SEQ ID No: 19), by 2 amino acid residues (SEQ ID No: 20), by 3 amino acid residues ( SEQ ID No: 21), for 4 amino acid residues (SEQ ID No: 22), for 5 amino acid residues (SEQ ID No: 23), for 6 amino acid residues (SEQ ID No: 24), for 7 amino acid residues (SEQ ID No: 25), for 8 amino acid residues (SEQ ID No: 26), for 9 amino acid residues (SEQ ID No: 27), for 10 amino acid residues (SEQ ID No: 28), for 11 amino acid residues (SEQ ID No: 29), at 12 amino acid residues attacks (SEQ ID No: 30), by 13 amino acid residues (SEQ ID No: 31), by 14 amino acid residues (SEQ ID No: 32) or 15 amino acid residues (SEQ ID No: 33), and / or shortened with N -end to 1-3 amino acid residues.
Как указано выше, вариант полипептида IFNG может содержать по меньшей мере еще одну модификацию в дополнение к замене S99T, до тех пор, пока этот вариант обладает активностью IFNG, то есть он может быть вариантом [S99T]huIFNG или вариантом фрагмента [S99T]huIFNG. Конкретными примерами таких вариантов являются варианты со введенными и/или удаленными аминокислотными остатками, содержащими связующую группу для неполипептидного компонента. Другие примеры вариантов [S99T]huIFNG (и его фрагментов) описаны в предыдущем разделе "Уровень техники" и включают, к примеру, [S99T]huIFNG с добавлением Cys-Tyr-Cys или Met на N-конце, а также варианты с модификациями по цистеину, раскрытые в US 6046034.As indicated above, an IFNG polypeptide variant may contain at least one more modification in addition to replacing S99T, as long as this variant has IFNG activity, that is, it may be a variant of [S99T] huIFNG or a variant of the [S99T] huIFNG fragment. Specific examples of such options are those with introduced and / or deleted amino acid residues containing a linking group for the non-polypeptide component. Other examples of [S99T] huIFNG variants (and fragments thereof) are described in the previous section of the prior art and include, for example, [S99T] huIFNG with the addition of Cys-Tyr-Cys or Met at the N-terminus, as well as variants with modifications to cysteine disclosed in US 6046034.
В норме вариант согласно изобретению кодируется нуклеотидной последовательностью, которая, по сравнению с нуклеотидной последовательностью, кодирующей исходный полипептид IFNG, подвергалась модификации в соответствии с настоящим изобретением.Normally, an embodiment of the invention is encoded by a nucleotide sequence that, compared to the nucleotide sequence encoding the parent IFNG polypeptide, has been modified in accordance with the present invention.
Однако это не всегда верно, так как вариант полипептида может подвергаться укорочению с С- или N-конца во время посттрансляционного процессинга, например, при С- или N-концевом расщеплении протеазами в клетке, в экспрессионной среде, во время очистки и т.д., так что конечный вариант полипептида будет укороченной версией первоначально полученного варианта полипептида (например, хотя сначала образуется полноразмерный вариант, однако в результате его посттрансляционного процессинга может быть получен укороченный с С-конца вариант полипептида). В этом случае под термином "исходный (родительский)" следует понимать укороченную форму, которая подвергается модификации согласно настоящему изобретению.However, this is not always true, since the polypeptide variant can be shortened from the C- or N-terminus during post-translational processing, for example, at the C- or N-terminal cleavage of proteases in the cell, in the expression medium, during purification, etc. ., so that the final version of the polypeptide will be a shortened version of the originally obtained version of the polypeptide (for example, although a full-sized version is first formed, however, as a result of its post-translational processing, a polypeptide shortened from the C-terminus can be obtained but). In this case, the term "source (parent)" should be understood as a shortened form, which is modified according to the present invention.
Термин "вариант" служит для обозначения полипептида, отличающегося по одному или более аминокислотным остаткам от родительского полипептида (обычно это SEQ ID No:17 или любая укороченная его форма, приведенная в SEQ ID No:19-33), обычно по 1-15 аминокислотным остаткам (к примеру, по 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотным остаткам), например, по 1-10 аминокислотным остаткам, по 1-5 аминокислотным остаткам или по 1-3 аминокислотным остаткам.The term "variant" refers to a polypeptide that differs in one or more amino acid residues from the parent polypeptide (usually SEQ ID No: 17 or any shortened form thereof given in SEQ ID No: 19-33), usually 1-15 amino acid residues (for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acid residues), for example, 1-10 amino acid residues, 1 -5 amino acid residues or 1-3 amino acid residues.
Термин "функциональный сайт" служит для обозначения одного или нескольких аминокислотных остатков, необходимых для функционирования или работы IFNG или иным образом участвующих в этом. Такие аминокислотные остатки "располагаются" в функциональном сайте. Функциональный сайт можно определить способами, известными в этой области, но предпочтительно его идентифицируют путем анализа структуры полипептида в комплексе с соответствующим рецептором, таким как рецептор IFNG.The term “functional site” is intended to mean one or more amino acid residues necessary for the functioning or functioning of IFNG or otherwise involved. Such amino acid residues are "located" in a functional site. A functional site can be determined by methods known in the art, but is preferably identified by analysis of the structure of the polypeptide in complex with an appropriate receptor, such as an IFNG receptor.
Термин "huIFNG" служит для обозначения зрелой формы IFNG дикого типа человека с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID No:17.The term "huIFNG" refers to the mature form of wild-type human IFNG with the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 17.
Термин "rhuIFNG" служит для обозначения зрелой формы IFNG дикого типа человека с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID No:17, которая была получена рекомбинантным путем.The term "rhuIFNG" is used to denote the mature form of wild-type human IFNG with the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 17, which was obtained recombinantly.
Термин "[S99T]huIFNG" служит для обозначения зрелой формы IFNG дикого типа человека, в которой остаток серина в положении 99 был заменен остатком треонина (приведена в SEQ ID No:1).The term "[S99T] huIFNG" is used to denote the mature form of wild-type human IFNG in which the serine residue at position 99 has been replaced by a threonine residue (given in SEQ ID No: 1).
Применяемый в настоящем изобретении термин "гликозилированный huIFNG" означает, что полипептид huIFNG был получен в клетке, способной к гликозилированию полипептида, таким образом, полипептид huIFNG гликозилирован по природным сайтам N-гликозилирования (положения 25 и 97 в SEQ ID No:17).The term “glycosylated huIFNG” as used in the present invention means that the huIFNG polypeptide was obtained in a cell capable of glycosylating a polypeptide, thus the huIFNG polypeptide is glycosylated at natural N-glycosylation sites (
Аналогичным образом "гликозилированный вариант huIFNG" означает, что этот вариант полипептида huIFNG был получен в клетке, способной к гликозилированию варианта полипептида.Similarly, “glycosylated variant of huIFNG” means that this variant of the huIFNG polypeptide was obtained in a cell capable of glycosylation of a variant of the polypeptide.
Применяемый в настоящем изобретении термин "Actimmune®" относится к форме IFNG из 140 аминокислот (Actimmune® укорочен с С-конца на 4 аминокислотных остатка и включает один N-концевой остаток Met) (приведена в SEQ ID No:34), полученной при ферментации созданных методами генетической инженерии бактерий Е. coli. Дополнительную информацию об Actimmune® можно получить на сайте www.actimmune.com.As used herein, the term “Actimmune®” refers to a 140 amino acid IFNG form (Actimmune® is shortened from the C-terminus to 4 amino acid residues and includes one N-terminal Met residue) (shown in SEQ ID No: 34) obtained by fermentation created by genetic engineering of bacteria E. coli. For more information about Actimmune®, go to www.actimmune.com.
Варианты полипептида г-интерферона по настоящему изобретениюVariants of the g-interferon polypeptide of the present invention
Варианты IFNG по изобретению с оптимизированными сайтами гликозилирования in vivoIFNG variants of the invention with optimized in vivo glycosylation sites
Как указывалась ранее, неожиданно было обнаружено, что гликозилирование природного сайта N-гликозилирования, находящегося в положении 97 huIFNG, может быть повышено, то есть может быть увеличена доля полностью или практически полностью гликозилированных молекул IFNG, при замещении остатка серина в положении 99 huIFNG (или его фрагментов) остатком треонина. Анализ фиг.1 показывает, что можно добиться значительного повышения доли полностью гликозилированного полипептида IFNG. В случае варианта полипептида [S99T]huIFNG (SEQ ID No:1) можно видеть, что примерно в 90% полипептидных вариантов в собранной культуральной среде использованы оба сайта N-гликозилирования, тогда как лишь около 60% находящегося в собранной среде полипептидов rhuIFNG было полностью гликозилировано.As indicated earlier, it was unexpectedly found that the glycosylation of the natural N-glycosylation site located at position 97 of huIFNG can be increased, i.e., the proportion of fully or almost completely glycosylated IFNG molecules can be increased by replacing the serine residue at position 99 of huIFNG (or fragments thereof) with a threonine residue. The analysis of figure 1 shows that it is possible to achieve a significant increase in the proportion of fully glycosylated IFNG polypeptide. In the case of the [S99T] huIFNG polypeptide variant (SEQ ID No: 1), it can be seen that approximately 90% of the polypeptide variants in the collected culture medium used both N-glycosylation sites, while only about 60% of the rhuIFNG polypeptides present in the collected medium were completely glycosylated.
Соответственно, первый аспект настоящего изобретения касается варианта полипептида IFNG, обладающего активностью IPNG и имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID No:1 (то есть [S99T]huIFNG), или его фрагментов, обладающих активностью IFNG.Accordingly, a first aspect of the present invention relates to a variant of an IFNG polypeptide having IPNG activity and having the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1 (ie [S99T] huIFNG), or fragments thereof having IFNG activity.
Как уже обсуждалось выше, известно, что укороченные с С-конца формы huIFNG сохраняют активность, а в некоторых случаях даже обладают повышенной активностью по сравнению с huIFNG. Так, представляет интерес воплощение изобретения, в котором вариант полипептида IFNG по изобретению представлен фрагментом SEQ ID No:1, укороченным с С-конца на 1-15 аминокислотных остатков, в типичном случае на 1-10 аминокислотных остатков. Конкретные примеры таких укороченных с С-конца форм SEQ ID No:1 раскрыты в SEQ ID No:2-16. Фрагмент полипептида IFNG согласно этому воплощению настоящего изобретения обладает активностью IFNG.As discussed above, it is known that forms of huIFNG shortened from the C-terminus remain active, and in some cases even have increased activity compared to huIFNG. Thus, an embodiment of the invention is of interest in which the variant IFNG polypeptide of the invention is represented by a fragment of SEQ ID No: 1, shortened from the C-terminus by 1-15 amino acid residues, typically by 1-10 amino acid residues. Specific examples of such C-terminated forms of SEQ ID No: 1 are disclosed in SEQ ID No: 2-16. A fragment of the IFNG polypeptide according to this embodiment of the present invention has IFNG activity.
Следует иметь в виду, что гликозилированные варианты полипептида IFNG по этому аспекту следует экспрессировать рекомбинантным путем в гликозилирующей клетке-хозяине, предпочтительно клетке млекопитающего, из числа тех, что перечислены в разделе "Конъюгирование с сахаридным компонентом".It should be borne in mind that glycosylated variants of the IFNG polypeptide of this aspect should be expressed recombinantly in a glycosylating host cell, preferably a mammalian cell, from those listed in the section “Conjugation with a saccharide component”.
Как объяснялось выше, лишь около 50-60% из всей популяции экспрессированных полипептидов IFNG полностью гликозилировано при экспрессии rhuIFNG в клетках СНО. Таким образом, одно из главных преимуществ вариантов полипептида IFNG настоящего изобретения состоит в повышении использования сайта N-гликозилирования in vivo в положении 97, что в свою очередь ведет к получению более гомогенной популяции по сравнению с huIFNG. Вследствие большей гомогенности популяции очистка композиций (к примеру, собранной среды), содержащих такую популяцию вариантов полипептида IFNG, не столь обременительна и не требует таких затрат времени, как в случае rhuIFNG.As explained above, only about 50-60% of the total population of expressed IFNG polypeptides are fully glycosylated when rhuIFNG is expressed in CHO cells. Thus, one of the main advantages of the IFNG polypeptide variants of the present invention is the increased use of the in vivo N-glycosylation site at position 97, which in turn leads to a more homogeneous population compared to huIFNG. Due to the greater homogeneity of the population, purification of compositions (for example, collected medium) containing such a population of IFNG polypeptide variants is not so burdensome and does not require such time consuming as in the case of rhuIFNG.
Таким образом, следующий аспект настоящего изобретения касается популяции вариантов полипептида IFNG или композиции, включающей популяцию вариантов полипептида IFNG, причем указанная популяция содержит по меньшей мере 70% варианта полипептида IFNG по изобретению. Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%, например, около 90% варианта полипептида IFNG по изобретению.Thus, a further aspect of the present invention relates to a population of variants of an IFNG polypeptide or composition comprising a population of variants of an IFNG polypeptide, said population comprising at least 70% of a variant of an IFNG polypeptide of the invention. Preferably, the composition contains at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, for example, about 90% of the variant IFNG polypeptide of the invention.
В частности, изобретение касается популяции вариантов полипептида IFNG или композиции, включающей популяцию вариантов полипептида IFNG, причем указанная популяция содержит по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%, например, около 90% варианта полипептида IFNG, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID No:1.In particular, the invention relates to a population of variants of an IFNG polypeptide or composition comprising a population of variants of an IFNG polypeptide, said population comprising at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85 %, for example, about 90% of the variant IFNG polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1.
Аналогичным образом, изобретение также касается популяции вариантов полипептида IFNG или композиции, включающей популяцию вариантов полипептида IFNG, причем указанная популяция содержит по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%, например, около 90% фрагмента варианта полипептида IFNG, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, SEQ ID No:5, SEQ ID No:6, SEQ ID No:7, SEQ ID No:8, SEQ ID No:9, SEQ ID No:10, SEQ ID No:11, SEQ ID No:12, SEQ ID No:13, SEQ ID No:14, SEQ ID No:15 и SEQ ID No:16.Similarly, the invention also relates to a population of variants of an IFNG polypeptide or composition comprising a population of variants of an IFNG polypeptide, said population comprising at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, for example, about 90% of a fragment of an IFNG polypeptide variant having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No : 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 1 3, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15 and SEQ ID No: 16.
Наряду с уже указанной мутацией S99T, необходимой для оптимизации сайта N-гликозилирования in vivo в положении 97 в rhuIFNG, можно оптимизировать и другие сайты гликозилирования in vivo, введенные в SEQ ID No:1 или его фрагменты (к примеру, для увеличения времени полужизни в сыворотке и/или для повышения AUCsc). Обычно сайтом гликозилирования in vivo является сайт N-гликозилирования, но сайт O-гликозилирования также предусматривается как относящийся к настоящему изобретению. Такая оптимизация может быть достигнута проведением модификации, предпочтительно замены, в положении, находящемся вблизи от сайта гликозилирования, в частности вблизи от сайта N-гликозилирования in vivo. Обычно таким сайтом N-гликозилирования in vivo является введенный сайт N-гликозилирования in vivo. Конкретные примеры положений подходящих для введения сайтов N-гликозилирования in vivo, раскрыты в WO 01/36001 и далее в тексте.Along with the already mentioned S99T mutation, necessary to optimize the in vivo N-glycosylation site at position 97 in rhuIFNG, other in vivo glycosylation sites introduced in SEQ ID No: 1 or its fragments can be optimized (for example, to increase the half-life in serum and / or to increase AUC sc ). Typically, an in vivo glycosylation site is an N-glycosylation site, but an O-glycosylation site is also contemplated as being relevant to the present invention. Such optimization can be achieved by modifying, preferably replacing, at a position close to the glycosylation site, in particular close to the in vivo N-glycosylation site. Typically, such an in vivo N-glycosylation site is an in vivo introduced N-glycosylation site. Specific examples of provisions suitable for the introduction of N-glycosylation sites in vivo are disclosed in WO 01/36001 and hereinafter.
Аминокислотный остаток, "расположенный вблизи от" сайта гликозилирования, обычно находится в положении -4, -3, -2, -1, +1, +2, +3 или +4 относительно того аминокислотного остатка сайта гликозилирования, к которому присоединен углевод, предпочтительно в положении -1, +1 или +3, особенно в положении +1 или +3. Так, аминокислотный остаток, расположенный вблизи от сайта N-гликозилирования in vivo (имеющего последовательность N-X-S/T/C), может находиться в положении -4, -3, -2, -1, +1, +2, +3 или +4 относительно остатка N.Amino acid residue "located close to" the glycosylation site is usually located at position -4, -3, -2, -1, +1, +2, +3 or +4 relative to the amino acid residue of the glycosylation site to which the carbohydrate is attached, preferably at position -1, +1 or +3, especially at position +1 or +3. Thus, an amino acid residue located close to the in vivo N-glycosylation site (having the sequence NXS / T / C) may be in the position -4, -3, -2, -1, +1, +2, +3 or + 4 relative to the remainder N.
Когда модификация проводится в положении +2 относительно остатка N, то следует иметь в виду, что возможно лишь ограниченное число модификаций, так как для сохранения/введения сайта N-гликозилирования in vivo аминокислотный остаток в указанном положении должен быть представлен Ser, Thr или Cys.When the modification is carried out at the +2 position relative to the N residue, it should be borne in mind that only a limited number of modifications are possible, since in order to save / introduce the N-glycosylation site in vivo, the amino acid residue at the indicated position must be Ser, Thr or Cys.
В отдельном предпочтительном воплощении изобретения модификация аминокислотного остатка в положении +2 относительно сайта N-гликозилировании in vivo представляет собой замену, при которой данный аминокислотный остаток замещается остатком Thr. С другой стороны, если данный аминокислотный остаток уже представлен Thr, то обычно не является предпочтительным или необходимым осуществлять какие-либо замены в этом положении. Когда Х подвергается модификации, Х не должен быть Pro, и предпочтительно не Trp, Asp, Glu или Leu. Кроме того, вводимый аминокислотный остаток предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Phe, Asn, Gln, Tyr, Val, Ala, Met, Ile, Lys, Gly, Arg, Thr, His, Cys и Ser, более предпочтительно Ala, Met, He, Lys, Gly, Arg, Thr, His, Cys и Ser, в особенности Ala или Ser.In a separate preferred embodiment of the invention, the modification of the amino acid residue at position +2 relative to the in vivo N-glycosylation site is a substitution in which the amino acid residue is replaced by a Thr residue. On the other hand, if a given amino acid residue is already represented by Thr, then it is usually not preferable or necessary to make any substitutions at this position. When X is modified, X should not be Pro, and preferably not Trp, Asp, Glu, or Leu. In addition, the introduced amino acid residue is preferably selected from the group consisting of Phe, Asn, Gln, Tyr, Val, Ala, Met, Ile, Lys, Gly, Arg, Thr, His, Cys and Ser, more preferably Ala, Met, He , Lys, Gly, Arg, Thr, His, Cys and Ser, especially Ala or Ser.
Когда модификация проводится в положении +3 относительно остатка N, то вводимый аминокислотный остаток предпочтительно выбирают из группы, состоящей из His, Asp, Ala, Met, Asn, Thr, Arg, Ser и Cys, более предпочтительно Thr, Arg, Ser и Cys. Такие модификации особенно важны, если остаток Х представлен остатком Ser.When the modification is carried out at position +3 relative to the N residue, the introduced amino acid residue is preferably selected from the group consisting of His, Asp, Ala, Met, Asn, Thr, Arg, Ser and Cys, more preferably Thr, Arg, Ser and Cys. Such modifications are especially important if residue X is represented by residue Ser.
Таким образом, в отношении природного сайта N-гликозилирования in vivo предусматривается, что сайт N-гликозилирования в положении 97 может быть еще более оптимизирован проведением модификации типа замены в положении, выбранном из группы, состоящей из Е93, К94, L95, Т96, Y98, V100 и Т101 (то есть в положении -4, -3, -2, -1, +1, +3 или +4 относительно N97). Конкретные примеры замен, проводимых в положении 98 SEQ ID No:1 (или его фрагментов), включают Y98F, Y98N, Y98Q, Y98V, Y98A, Y98M, Y98I, Y98K, Y98G. Y98R, Y98T, Y98H, Y98C и Y98S, предпочтительно Y98A, Y98M, Y98I, Y98K, Y98G, Y98R, Y98T, Y98H, Y98C и Y98S, в особенности Y98S. Конкретные примеры замен, проводимых в положении 100 SEQ ID No:1 (или его фрагментов), включают V100H, V100D, V100A, V100M, V100N, V100T, V100R, V100S или V100C, в особенности V100T, V100R, V100S или V100C.Thus, with respect to the natural in vivo N-glycosylation site, it is contemplated that the N-glycosylation site at position 97 can be further optimized by modifying the type of substitution at a position selected from the group consisting of E93, K94, L95, T96, Y98, V100 and T101 (i.e., at -4, -3, -2, -1, +1, +3 or +4 with respect to N97). Specific examples of substitutions carried out at position 98 of SEQ ID No: 1 (or fragments thereof) include Y98F, Y98N, Y98Q, Y98V, Y98A, Y98M, Y98I, Y98K, Y98G. Y98R, Y98T, Y98H, Y98C and Y98S, preferably Y98A, Y98M, Y98I, Y98K, Y98G, Y98R, Y98T, Y98H, Y98C and Y98S, in particular Y98S. Specific examples of substitutions carried out at
Аналогичным образом, в отношении сайта N-гликозилирования in vivo в положении 25 предусматривается, что этот сайт может быть еще более оптимизирован проведением модификации типа замены в положении, выбранном из числа D21, V22, А23, D24, G26, L28 и F29 (то есть в положении -4, -3, -2, -1, +1, +3 или +4 относительно N25). Конкретные примеры замен, проводимых в положении 26 SEQ ID No:1 (или его фрагментов) включают G26F, G26N, G26Y, G26Q, G26V, G26A, G26M, G26I, G26K, G26R, G26T, G26H, G26C и G26S, предпочтительно G26A, G26M, G26I, G26K, G26R, G26T, G26H, G26C и G26S, более предпочтительно G26A и G26S, в особенности G26A. Конкретные примеры замен, проводимых в положении 28 SEQ ID No:1 (или его фрагментов) включают G28H, G28D, G28A, G28M, G28N, G28T, G28R, G28S или G28C, в особенности G28A, G28T, G28R, G28S или G28C.Similarly, with respect to the in vivo N-glycosylation site at
Очевидно, что любая из модификаций, указанных в связи с оптимизацией гликозилирования в положении 97, может сочетаться с любой из указанных выше модификаций, проводимых в связи с оптимизацией гликозилирования в положении 25.Obviously, any of the modifications indicated in connection with the optimization of glycosylation at position 97 can be combined with any of the above modifications carried out in connection with the optimization of glycosylation at
Варианты IFNG по изобретению с повышенным AUCsc и/или увеличенным временем полужизни в сывороткеIFNG variants of the invention with increased AUC sc and / or increased serum half-life
Следующий аспект настоящего изобретения касается варианта полипептида IFNG, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID No:1, при этом данный вариант обладает активностью IFNG.A further aspect of the present invention relates to a variant of an IFNG polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1, wherein this variant has IFNG activity.
Кроме того, настоящее изобретение также касается варианта фрагмента полипептида IFNG, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, SEQ ID No:5, SEQ ID No:6, SEQ ID No:7, SEQ ID No:8, SEQ ID No:9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No:11, SEQ ID No:12, SEQ ID No:13, SEQ ID No:14, SEQ ID No:15 и SEQ ID No:16, при этом данный вариант обладает активностью IFNG.In addition, the present invention also relates to a variant fragment of an IFNG polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15 and SEQ ID No: 16, while this option has IFNG activity.
Таким образом, этот вариант содержит по меньшей мере еще одну дополнительную модификацию по сравнению с SEQ ГО No:1-16.Thus, this option contains at least one additional modification compared to SEQ GO No: 1-16.
Для того чтобы избежать слишком сильного нарушения структуры и функции варианта полипептида [S99T]huIFNG (или его фрагментов), общее число аминокислотных остатков, подлежащих модификации в соответствии с настоящим изобретением, в типичном случае не превышает 15. Обычно вариант полипептида IFNG содержит 1-10 модификаций относительно аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No:1, например, 1-8, 2-8, 1-5, 1-3 или 2-5 модификаций относительно аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No:1. Предпочтительно модификация/и представляет/ют собой замену/ы. Следует иметь в виду, что такие же соображения справедливы и для вариантов фрагментов варианта полипептида IFNG, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID No:1. Так, если вариант является вариантом любой из последовательностей, представленных в SEQ ID No:2-16, такой вариант обычно содержит менее 15 модификаций, в типичном случае 1-10 модификаций относительно соответствующей аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No:2-16, например, 1-8, 2-8, 1-5, 1-3 или 2-5 модификаций относительно соответствующей аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID No:2-16. Предпочтительно модификация/и представляет/ют собой замену/ы.In order to avoid too much disruption in the structure and function of the [S99T] huIFNG polypeptide variant (or fragments thereof), the total number of amino acid residues to be modified in accordance with the present invention typically does not exceed 15. Typically, the IFNG polypeptide variant contains 1-10 modifications relative to the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1, for example, 1-8, 2-8, 1-5, 1-3 or 2-5 modifications relative to the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1. Preferably, the modification of / and is / are a replacement / s. It should be borne in mind that the same considerations apply to variant fragments of the variant IFNG polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1. So, if a variant is a variant of any of the sequences shown in SEQ ID No: 2-16, this variant usually contains less than 15 modifications, typically 1-10 modifications relative to the corresponding amino acid sequence shown in SEQ ID No: 2-16, for example, 1-8, 2-8, 1-5, 1-3, or 2-5 modifications relative to the corresponding amino acid sequence represented by SEQ ID No: 2-16. Preferably, the modification of / and is / are a replacement / s.
Таким образом, в норме такой вариант полипептида IFNG (то есть вариант, содержащий по меньшей мере еще одну дополнительную модификацию вдобавок к замене S99T) имеет аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 (или ее фрагментов) по 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотным остаткам.Thus, normally, such a variant of the IFNG polypeptide (i.e., a variant containing at least one additional modification in addition to replacing S99T) has an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or fragments thereof) by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acid residues.
В предпочтительном воплощении изобретения вариант IFNG (дополнительно) содержит по меньшей мере один введенный и/или один удаленный аминокислотный остаток, содержащий связующую группу для неполипептидного компонента.In a preferred embodiment of the invention, the IFNG variant (further) comprises at least one introduced and / or one deleted amino acid residue containing a linking group for the non-polypeptide component.
Путем удаления или введения аминокислотного остатка, содержащего связующую группу для неполипептидного компонента, становится возможным специфически адаптировать полипептид так, чтобы молекула стала более подверженной конъюгации с выбранным неполипептидным компонентом, оптимизировать профиль конъюгации (например, обеспечить оптимальное распределение неполипептидных компонентов на поверхности варианта полипептида IFNG) и при этом получить новую молекулу конъюгата, обладающего активностью IFNG, наряду с улучшением одного или нескольких свойств по сравнению с молекулами на основе huIFNG или rhuIFNG, доступными на сегодняшний день. Например, при введении связующих групп у варианта полипептида IFNG увеличивается или иным образом изменяется содержание специфических аминокислотных остатков, с которыми связывается соответствующий неполипептидный компонент, вследствие чего достигается более эффективная, специфичная и/или полная конъюгация. При удалении одной или нескольких связующих групп можно избежать конъюгации с неполипептидным компонентом в тех частях полипептида, с которыми такая конъюгация невыгодна, например, с аминокислотным остатком, расположенным в функциональном сайте полипептида или вблизи от него (так как конъюгация в таком сайте может привести к инактивации или снижению активности IFNG у полученного при этом конъюгированного полипептида вследствие нарушения узнавания рецептором). Далее, может быть полезным удаление связующей группы, находящейся вблизи от другой связующей группы, чтобы избежать гетерогенной конъюгации с такими группами. Представляют интерес воплощения, в которых происходит изменение более чем одного аминокислотного остатка полипептида IFNG, например, изменение охватывает как удаление, так и введение аминокислотных остатков, содержащих сайты для присоединения выбранного неполипептидного компонента. Такие воплощения представляют особенный интерес тем, что они дают возможность целенаправленно конструировать варианты полипептида IFNG с тем, чтобы достичь оптимальной конъюгации неполипептидного компонента.By removing or introducing an amino acid residue containing a linking group for the non-polypeptide component, it becomes possible to specifically adapt the polypeptide so that the molecule is more susceptible to conjugation with the selected non-polypeptide component, to optimize the conjugation profile (for example, to ensure optimal distribution of non-polypeptide components on the surface of the IFNG variant polypeptide) and in this case, to obtain a new conjugate molecule with IFNG activity, along with the improvement of one or more their properties compared to huIFNG or rhuIFNG-based molecules available today. For example, with the introduction of linking groups, the variant IFNG polypeptide increases or otherwise changes the content of specific amino acid residues to which the corresponding non-polypeptide component binds, resulting in a more effective, specific and / or complete conjugation. When one or more linking groups are removed, conjugation with a non-polypeptide component in those parts of the polypeptide with which such conjugation is disadvantageous, for example, with an amino acid residue located at or near the functional site of the polypeptide, can be avoided (since conjugation at such a site can lead to inactivation or a decrease in IFNG activity in the resulting conjugated polypeptide due to impaired recognition by the receptor). Further, it may be useful to remove a linking group located close to another linking group in order to avoid heterogeneous conjugation with such groups. Of interest are embodiments in which there is a change in more than one amino acid residue of the IFNG polypeptide, for example, the change encompasses both the removal and introduction of amino acid residues containing sites for attachment of the selected non-polypeptide component. Such embodiments are of particular interest in that they enable the purposeful construction of variants of the IFNG polypeptide in order to achieve optimal conjugation of the non-polypeptide component.
Наряду с удалением и/или введением аминокислотных остатков вариант полипептида может включать и другие модификации, например замены, которые не связаны со введением и/или удалением аминокислотных остатков, содержащих связующую группу для неполипептидного компонента. Примеры таких модификаций включают консервативные замены аминокислот и/или введение Cys-Tyr-Cys или Met на N-конце.Along with the removal and / or introduction of amino acid residues, the variant polypeptide may include other modifications, for example, substitutions that are not associated with the introduction and / or removal of amino acid residues containing a linking group for the non-polypeptide component. Examples of such modifications include conservative amino acid substitutions and / or the introduction of Cys-Tyr-Cys or Met at the N-terminus.
Точное число связующих групп, доступных для конъюгации и присутствующих в димерной форме варианта полипептида IFNG, зависит от того эффекта, которого нужно достичь при конъюгации. Получаемый эффект зависит, к примеру, от природы и степени конъюгации (природы неполипептидного компонента, числа неполипептидных компонентов, которые нужно или можно конъюгировать с полипептидом, места, в котором их следует конъюгировать или избежать конъюгации, и т.д.).The exact number of linking groups available for conjugation and present in the dimeric form of a variant IFNG polypeptide depends on the effect that should be achieved upon conjugation. The effect obtained depends, for example, on the nature and degree of conjugation (the nature of the non-polypeptide component, the number of non-polypeptide components that need or can be conjugated to the polypeptide, the place where they should be conjugated or to avoid conjugation, etc.).
Следует иметь в виду, что аминокислотный остаток, содержащий связующую группу для неполипептидного компонента и подлежащий удалению или введению, выбирается на основании природы выбранного неполипептидного компонента и, в большинстве случаев, на основании метода, применяемого для конъюгации. Например, когда неполипептидный компонент представлена молекулой полимера типа молекул - производных полиэтиленгликоля или полиалкиленоксида, то аминокислотные остатки, способные функционировать в качестве связующей группы, можно выбрать из числа цистеина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и аргинина. Особенно предпочтителен цистеин. Когда неполипептидный компонент представлен остатком сахара, то связующей группой служит, к примеру, сайт гликозилирования in vivo, предпочтительно сайт N-гликозилирования.It should be borne in mind that the amino acid residue containing a linking group for a non-polypeptide component and to be removed or introduced is selected based on the nature of the selected non-polypeptide component and, in most cases, on the basis of the method used for conjugation. For example, when a non-polypeptide component is represented by a polymer molecule such as molecules derived from polyethylene glycol or polyalkylene oxide, amino acid residues capable of functioning as a linking group can be selected from cysteine, lysine, aspartic acid, glutamic acid and arginine. Cysteine is particularly preferred. When the non-polypeptide component is represented by a sugar residue, the linking group is, for example, an in vivo glycosylation site, preferably an N-glycosylation site.
Когда связующую группу для неполипептидного компонента нужно ввести в полипептид IFNG с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID No:1 (или его фрагмент), либо удалить из него, то подлежащее модификации положение в полипептиде обычно выбирают следующим образом.When a linking group for a non-polypeptide component needs to be introduced into an IFNG polypeptide with the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1 (or a fragment thereof), or removed from it, then the position in the polypeptide to be modified is usually chosen as follows.
Такое положение предпочтительно находится на поверхности полипептида IFNG, более предпочтительно оно занято аминокислотным остатком, у которого более 25% боковой цепи экспонировано на поверхности, предпочтительно более 50% боковой цепи экспонировано на поверхности, что установлено на основании трехмерной структуры или модели IFNG в димерной форме, причем структура или модель необязательно дополнительно содержит одну или две молекулы рецептора IFNG. Такие положения перечислены далее в Примере 1.This position is preferably located on the surface of the IFNG polypeptide, more preferably it is occupied by an amino acid residue in which more than 25% of the side chain is exposed on the surface, preferably more than 50% of the side chain is exposed on the surface, which is established on the basis of a three-dimensional structure or IFNG model in dimeric form, moreover, the structure or model optionally further comprises one or two molecules of the IFNG receptor. Such provisions are listed below in Example 1.
Также представляет интерес модификация любого из 23 С-концевых аминокислотных остатков исходного полипептида IFNG (в частности, путем введения аминокислотных остатков, содержащих связующую группу для неполипептидного компонента, например, остатков Cys), так как считается, что эти остатки располагаются на поверхности полипептида IFNG.It is also of interest to modify any of the 23 C-terminal amino acid residues of the original IFNG polypeptide (in particular, by introducing amino acid residues containing a linking group for the non-polypeptide component, for example, Cys residues), since these residues are believed to be located on the surface of the IFNG polypeptide.
Кроме того, может представлять интерес модификация одного и более аминокислотных остатков, расположенных в областях петель полипептида IFNG, так как большинство аминокислотных остатков в этих областях петель экспонированы на поверхности и находятся достаточно далеко от функциональных сайтов, так что можно вводить неполипептидные компоненты типа молекул полимеров, особенно PEG, и/или сайтов N-гликозилирования, не нарушая функции молекулы. Такие области петель можно идентифицировать путем анализа трехмерной структуры huIFNG. Аминокислотные остатки, образующие области петель, - это остатки N16-K37 (петля "А-В"), F60-S65 (петля "В-С"), N83-S84 (петля "C-D") и Y98-L103 (петля "D-E").In addition, it may be of interest to modify one or more amino acid residues located in the loop regions of the IFNG polypeptide, since most amino acid residues in these loop regions are exposed on the surface and are quite far from the functional sites, so that non-polypeptide components such as polymer molecules can be introduced, especially PEG and / or N-glycosylation sites without impairing the function of the molecule. Such loop regions can be identified by analysis of the three-dimensional structure of huIFNG. The amino acid residues forming the loop regions are residues N16-K37 (loop AB), F60-S65 (loop BC), N83-S84 (loop CD) and Y98-L103 (loop " DE ").
Аминокислотные остатки, входящие в состав сайта связывания с рецептором IFNG, - это Q1, D2, Y4, V5, Е9, К12, G18, Н19, S20, D21, V22, А23, D24, N25, G26, Т27, L30, К34, К37, К108, H111, E112, I114, Q115, A118, E119 (см. далее Пример 2). В общем, в этот сайт молекулы предпочтительно не вводятся связующие группы для неполипептидного компонента (такие, как дополнительные сайты N-гликозилирования и/или остатки цистеина).The amino acid residues that make up the IFNG receptor binding site are Q1, D2, Y4, V5, E9, K12, G18, H19, S20, D21, V22, A23, D24, N25, G26, T27, L30, K34, K37, K108, H111, E112, I114, Q115, A118, E119 (see Example 2 below). In general, linking groups for the non-polypeptide component (such as additional N-glycosylation sites and / or cysteine residues) are preferably not introduced into this site of the molecule.
Для того чтобы установить оптимальное распределение связующих групп, рассчитывают расстояния между аминокислотными остатками, расположенными на поверхности полипептида IFNG, исходя из трехмерной структуры димера полипептида IFNG. В частности, определяют расстояния между атомами СВ аминокислотных остатков, содержащих такие связующие группы, или рассчитывают расстояния между функциональной группой (NZ у лизина, CG у аспарагиновой кислоты, CD у глутаминовой кислоты, SG у цистеина) одного и атомом СВ другого аминокислотного остатка, содержащего связующую группу. В случае глицина используют СА вместо СВ. В полипептиде IFNG по изобретению все такие расстояния предпочтительно составляют более 8 Å, в особенности более 10 Å, чтобы избежать гетерогенной конъюгации или уменьшить ее.In order to establish the optimal distribution of the linking groups, the distances between amino acid residues located on the surface of the IFNG polypeptide are calculated based on the three-dimensional structure of the dimer of the IFNG polypeptide. In particular, the distances between the CB atoms of amino acid residues containing such linking groups are determined, or the distances between the functional group (NZ for lysine, CG for aspartic acid, CD for glutamic acid, SG for cysteine) of one and the CB atom of the other amino acid residue containing linking group. In the case of glycine, CA is used instead of CB. In the IFNG polypeptide of the invention, all such distances are preferably greater than 8 Å, in particular more than 10 Å, to avoid heterogeneous conjugation or to reduce it.
Кроме того, аминокислотная последовательность варианта полипептида IFNG может отличаться от SEQ ID No:1 (или ее фрагментов) тем, что один или несколько аминокислотных остатков, входящих в состав эпитопа, были удалены, предпочтительно путем замены аминокислотного остатка, содержащего связующую группу для неполипептидного компонента, с тем, чтобы разрушить или инактивировать эпитоп. Эпитопы [S99T]huIFNG, huIFNG или rhuIFNG можно идентифицировать известными в этой области методами, также известными как эпитопное картирование, например, см. Romagnoli et al., Biol Chem, 1999, 380 (5): 553-9; DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96: 11-20; Van de Water et al., Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85 (3): 229-35; Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119 (1): 77-81; Lane DP and Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5 (2): 268-71. Один из методов заключается в создании библиотеки фагового дисплея, экспрессирующей случайные олигопептиды, состоящие, к примеру, из 9 аминокислотных остатков. Антитела IgG1 очищают из антисывороток, специфичных к [S99T]huIFNG, huIFNG или rhuIFNG, методом иммунопреципитации, и идентифицируют реактивные фаги методом иммуноблоттинга. Секвенируя ДНК очищенных реактивных фагов, можно установить последовательность олигопептида, а затем локализировать эту последовательность на трехмерной структуре IFNG. Идентифицированный таким образом участок на структуре составляет эпитоп, который затем можно выбрать в качестве мишени для введения связующей группы для неполипептидного компонента.In addition, the amino acid sequence of a variant IFNG polypeptide may differ from SEQ ID No: 1 (or fragments thereof) in that one or more amino acid residues included in the epitope are removed, preferably by replacing an amino acid residue containing a linking group for the non-polypeptide component in order to destroy or inactivate the epitope. Epitopes of [S99T] huIFNG, huIFNG or rhuIFNG can be identified by methods known in the art, also known as epitope mapping, for example, see Romagnoli et al., Biol Chem, 1999, 380 (5): 553-9; DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96: 11-20; Van de Water et al., Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85 (3): 229-35; Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119 (1): 77-81; Lane DP and Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5 (2): 268-71. One of the methods is to create a phage display library expressing random oligopeptides consisting, for example, of 9 amino acid residues. IgG1 antibodies are purified from antisera specific for [S99T] huIFNG, huIFNG or rhuIFNG by immunoprecipitation and the reactive phages are identified by immunoblotting. By sequencing the DNA of purified reactive phages, the oligopeptide sequence can be established and then localized to the three-dimensional IFNG structure. The region thus identified on the structure constitutes an epitope, which can then be selected as a target for introducing a linking group for the non-polypeptide component.
Функциональный период полужизни in vivo и время полужизни в сыворотке зависят от молекулярного веса варианта полипептида, а число связующих групп, необходимых для увеличения времени полужизни, может зависеть от молекулярного веса данного неполипептидного компонента. В одном из воплощений вариант полипептида IFNG имеет молекулярный вес по меньшей мере 67 кДа, в особенности по меньшей мере 70 кДа, при измерении методом SDS-PAGE согласно Laemmli U.K., Nature Vol.227 (1970), 680-85. Молекулярный вес IFNG находится в пределах 34-50 кДа, поэтому нужны дополнительные 20-40 кДа для достижения требуемого эффекта. Это могут обеспечить, к примеру, 2-4 молекулы PEG по 10 кДа или комбинация из дополнительных сайтов гликозилирования in vivo и дополнительных молекул PEG, а также иным образом, как описано далее.The in vivo functional half-life and serum half-life depend on the molecular weight of the polypeptide variant, and the number of linking groups required to increase the half-life may depend on the molecular weight of the non-polypeptide component. In one embodiment, the IFNG polypeptide variant has a molecular weight of at least 67 kDa, in particular at least 70 kDa, as measured by SDS-PAGE according to Laemmli U.K., Nature Vol.227 (1970), 680-85. The molecular weight of IFNG is in the range of 34-50 kDa, so an additional 20-40 kDa is needed to achieve the desired effect. This can be provided, for example, by 2-4 PEG molecules of 10 kDa or a combination of additional in vivo glycosylation sites and additional PEG molecules, as well as otherwise, as described below.
Предпочтительно конъюгированный вариант полипептида IFNG по изобретению содержит 1-10 (дополнительных) неполипептидных компонентов, например, 1-8, 2-8, 1-5, 1-3 или 2-5 (дополнительных) неполипептидных компонентов. Обычно конъюгированный вариант содержит 1-3 (дополнительные) неполипептидных компонента, например, 1, 2 или 3 (дополнительные) неполипептидных компонента.Preferably, the conjugated variant of the IFNG polypeptide according to the invention contains 1-10 (additional) non-polypeptide components, for example, 1-8, 2-8, 1-5, 1-3 or 2-5 (additional) non-polypeptide components. Typically, the conjugated variant contains 1-3 (additional) non-polypeptide components, for example, 1, 2 or 3 (additional) non-polypeptide components.
Как указывалось выше, в физиологических условиях huIFNG существует в виде димерного полипептида. Обычно полипептид находится в виде гомодимера (к примеру, полученный путем ассоциации двух молекул полипептида IFNG, полученного как описано в настоящем изобретении). Однако при желании вариант полипептида IFNG может быть получен в одноцепочечной форме, когда два мономера полипептида IFNG соединены пептидной связью или через пептидный линкер. Получение варианта полипептида IFNG в одноцепочечной форме имеет то преимущество, что составляющие его два полипептида IFNG могут быть разными, что может быть выгодным, например, это создает возможность асимметричного мутагенеза этих полипептидов. Например, можно удалить сайты модификации PEG из рецептор-связывающего сайта одного из мономеров, но сохранить их в другом. При этом после модификации PEG у одного мономера будет интактный рецептор-связывающий сайт, тогда как другой может быть полностью модифицирован PEG (и таким образом обеспечит значительное повышение молекулярного веса).As indicated above, under physiological conditions, huIFNG exists as a dimeric polypeptide. Typically, the polypeptide is in the form of a homodimer (for example, obtained by the association of two molecules of the IFNG polypeptide obtained as described in the present invention). However, if desired, a variant of the IFNG polypeptide can be obtained in single-chain form, when two monomers of the IFNG polypeptide are connected by a peptide bond or via a peptide linker. Obtaining a variant of the IFNG polypeptide in single chain form has the advantage that the two IFNG polypeptides comprising it may be different, which may be advantageous, for example, this creates the possibility of asymmetric mutagenesis of these polypeptides. For example, you can remove PEG modification sites from the receptor binding site of one of the monomers, but save them in another. Moreover, after PEG modification, one monomer will have an intact receptor-binding site, while the other can be completely modified by PEG (and thus provide a significant increase in molecular weight).
Варианты IFNG по изобретению, у которых неполипептидный компонент представлен остатком сахараIFNG variants of the invention in which the non-polypeptide component is a sugar residue
В предпочтительном воплощении изобретения вариант IFNG с последовательностью SEQ ID No:1 (или его фрагменты) включает по меньшей мере один введенный сайт гликозилирования и/или по меньшей мере один удаленный сайт гликозилирования. Предпочтительно сайт гликозилирования представляет собой сайт N-гликозилирования in vivo, то есть неполипептидный компонент представлен остатком сахара, например, O-связанным или N-связанным остатком сахара, предпочтительно N-связанным остатком сахара.In a preferred embodiment of the invention, the IFNG variant with the sequence of SEQ ID No: 1 (or fragments thereof) includes at least one introduced glycosylation site and / or at least one remote glycosylation site. Preferably, the glycosylation site is an in vivo N-glycosylation site, that is, the non-polypeptide component is represented by a sugar residue, for example, an O-linked or N-linked sugar residue, preferably an N-linked sugar residue.
В одном представляющем интерес воплощении изобретения данный вариант включает по меньшей мере один введенный сайт гликозилирования, в частности введенный сайт N-гликозилирования in vivo. Предпочтительно введенный сайт гликозилирования вводится путем замещения.In one embodiment of interest of the invention, this embodiment includes at least one introduced glycosylation site, in particular an in vivo introduced N-glycosylation site. Preferably, the introduced glycosylation site is introduced by substitution.
Например, сайт N-гликозилирования in vivo можно ввести в положение полипептида IFNG с последовательностью SEQ ID No:1 (или его фрагмента), занятое аминокислотным остатком, экспонированным на поверхности. Предпочтительно у такого экспонированного на поверхности аминокислотного остатка не менее 25% боковой цепи экспонировано на поверхности, в особенности не менее 50% боковой цепи экспонировано на поверхности. Подробности об определении таких положений приводятся далее в Примере 1.For example, an in vivo N-glycosylation site can be introduced at the position of an IFNG polypeptide with the sequence SEQ ID No: 1 (or a fragment thereof) occupied by an amino acid residue exposed on the surface. Preferably, in such an amino acid residue exposed on the surface, at least 25% of the side chain is exposed on the surface, in particular at least 50% of the side chain is exposed on the surface. Details of the definition of such provisions are given below in Example 1.
Сайт N-гликозилирования вводится таким образом, чтобы остаток N этого сайта находился в указанном положении. Аналогичным образом вводится и сайт O-гликозилирования так, чтобы остаток S или Т, входящий в этот сайт, находился в указанном положении. Следует иметь в виду, что когда выражение "не менее 25% (или 50%) боковой цепи экспонировано на поверхности" применяется в связи со введением сайта N-гликозилирования in vivo, это выражение относится к поверхностной доступности боковой цепи аминокислоты именно в том положении, в котором происходит присоединение остатка сахара. Во многих случаях необходимо вводить остаток серина или треонина в положение +2 относительно именно того остатка аспарагина, к которому в действительности присоединяется остаток сахара, и те положения, в которые вводятся остатки серина или треонина, могут быть утоплены, то есть иметь экспонированными на поверхности молекулы менее 25% (или 50%) боковой цепи.The N-glycosylation site is introduced so that the N residue of this site is in the indicated position. The O-glycosylation site is introduced in a similar manner so that the S or T residue entering this site is in the indicated position. It should be borne in mind that when the expression “at least 25% (or 50%) of the side chain is exposed on the surface” is used in connection with the introduction of the N-glycosylation site in vivo, this expression refers to the surface accessibility of the amino acid side chain in that position in which the addition of the sugar residue occurs. In many cases, it is necessary to introduce the serine or threonine residue at the +2 position relative to the particular asparagine residue to which the sugar residue actually attaches, and those positions at which the serine or threonine residues are introduced can be drowned, i.e., have molecules exposed on the surface less than 25% (or 50%) of the side chain.
Кроме того, чтобы обеспечить эффективное гликозилирование, сайт гликозилирования in vivo, в частности остаток N сайта N-гликозилирования или остаток S или Т сайта O-гликозилирования предпочтительно должен находиться в пределах 118 N-концевых аминокислотных остатков полипептида IFNG, более предпочтительно в пределах 97 N-концевых аминокислотных остатков. Еще более предпочтительно сайт гликозилирования in vivo вводится в такое положение, в котором для создания этого сайта требуется лишь одна мутация (то есть туда, где все другие аминокислотные остатки, необходимые для создания функционального сайта гликозилирования, уже представлены в молекуле).In addition, in order to provide effective glycosylation, the in vivo glycosylation site, in particular the N residue of the N-glycosylation site or the S or T residue of the O-glycosylation site, should preferably be within the 118 N-terminal amino acid residues of the IFNG polypeptide, more preferably within 97 N -terminal amino acid residues. Even more preferably, the in vivo glycosylation site is introduced in a position in which only one mutation is required to create this site (that is, where all other amino acid residues necessary to create the functional glycosylation site are already present in the molecule).
Так, замены, ведущие к введению дополнительного сайта N-гликозилирования в положения, экспонированные на поверхности полипептида IFNG и занятые аминокислотными остатками, у которых не менее 25% боковой цепи экспонировано на поверхности (в структуре с молекулой рецептора), включают: Q1N+P3S/T, P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N+L11S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, Y14N+N16S/T, G18S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41S/T, S40N+R42S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, K61N+D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, Q67N, Q67N+S69T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N+M77S/T, K80S/T, V79N+F81S/T, K80N+F82S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K87S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, D90N+F92S/T, E93N+L95S/T, K94N, K94N+T96S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, E119N, E119N+S121T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N и R140N+S142T, при этом замены указаны относительно [S99T]huIFNG с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID No:1 (или относительно соответствующих фрагментов с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID No:2-16). S/T означает замену на остаток серина или треонина, предпочтительно остаток треонина.So, substitutions leading to the introduction of an additional N-glycosylation site at the positions exposed on the surface of the IFNG polypeptide and occupied by amino acid residues in which at least 25% of the side chain is exposed on the surface (in the structure with the receptor molecule) include: Q1N + P3S / T, P3N + V5S / T, K6N + A8S / T, E9N + L11S / T, K12S / T, K13N + F15S / T, Y14N + N16S / T, G18S / T, G18N, G18N + S20T, H19N + D21S / T, D21N + A23S / T, G26N + L28S / T, G31N + L33S / T, K34N + W36S / T, K37S / T, K37N + E39S / T, E38N, E38N + S40T, E39N + D41S / T, S40N + R42S / T, K55N + F57S / T, K58N + F60S / T, K61S / T, K61N + D63S / T, D62N + Q64S / T, D63N, D63N + S65T, Q64N + I66S / T, S65N + Q67S / T, Q67N, Q67N + S69T, K68N + V70S / T, E71N + I73S / T, T72N + K74S / T, K74N + D76S / T, E75N + M77S / T, K80S / T, V79N + F81S / T, K80N + F82S / T, N85S / T, S84N + K86S / T, K87S / T, K86N + K88S / T, K87N + R89S / T, D90N + F92S / T, E93N + L95S / T, K94N, K94N + T96S, T101N + L103S / T, D102N + N104S / T, L103N + V105S / T, Q106S / T, E119N, E119N + S121T, P122N + A124S / T, A123N + K125S / T, A124N, A124N + T126S, K125N + G127S / T, T126N + K128S / T, G127N + R129S / T, K128N + R30 R131S / T, K130N, K130N + S132T, R131N + Q133S / T, S132N + M134S / T, Q133N + L135S / T, M134N + F136S / T, L135N + R137S / T, F136N + G138S / T, R137N + G138S / T, R137N T, G138N + R140S / T, R139N + A141S / T, R140N and R140N + S142T, with the substitutions indicated for [S99T] huIFNG with the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1 (or relative to the corresponding fragments with the amino acid sequences shown in SEQ ID No: 2-16). S / T means replacement with a serine or threonine residue, preferably a threonine residue.
Замены, ведущие к введению дополнительного сайта N-гликозилирования в положения, экспонированные на поверхности полипептида IFNG, в которых не менее 50% боковой цепи экспонировано на поверхности (в структуре с молекулой рецептора), включают:Substitutions leading to the introduction of an additional N-glycosylation site at positions exposed on the surface of the IFNG polypeptide in which at least 50% of the side chain is exposed on the surface (in a structure with a receptor molecule) include:
P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, G18S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, D62N+Q64S/T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, E75N+M77S/T, N85SA, S84N+K86S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, K94N, K94N+T96S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T. R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+P136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N и R140N+S142T, при этом замены указаны относительно [S99T]huIFNG с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID No:1 (или относительно соответствующих фрагментов с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID No:2-16). S/T означает замену на остаток серина или треонина, предпочтительно остаток треонина.P3N + V5S / T, K6N + A8S / T, K12S / T, K13N + F15S / T, G18S / T, D21N + A23S / T, G26N + L28S / T, G31N + L33S / T, K34N + W36S / T, K37N + E39S / T, E38N, E38N + S40T, E39N + D41S / T, K55N + F57S / T, K58N + F60S / T, K61S / T, D62N + Q64S / T, Q64N + I66S / T, S65N + Q67S / T, K68N + V70S / T, E71N + I73S / T, E75N + M77S / T, N85SA, S84N + K86S / T, K86N + K88S / T, K87N + R89S / T, K94N, K94N + T96S, T101N + L103S / T, D102N + N104S / T, L103N + V105S / T, Q106S / T, P122N + A124S / T, A123N + K125S / T, A124N, A124N + T126S, K125N + G127S / T, T126N + K128S / T, G R129S / T, K128N + K130S / T, R129N + R131S / T, K130N, K130N + S132T. R131N + Q133S / T, S132N + M134S / T, Q133N + L135S / T, M134N + P136S / T, L135N + R137S / T, F136N + G138S / T, R137N + R139S / T, G138N + R140S / T, A141S / T, R140N and R140N + S142T, with substitutions indicated for [S99T] huIFNG with the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1 (or relative to the corresponding fragments with the amino acid sequences given in SEQ ID No: 2-16). S / T means replacement with a serine or threonine residue, preferably a threonine residue.
Замены, при которых для введения сайта N-гликозилирования требуется замена лишь одной аминокислоты, включают: K12S/T, G18S/T, G18N, K37S/T, E38N, M45N, I49N, K61S/T, D63N, Q67N, V70N, K80S/T, F82N, N85S/T, K87S/T, K94N, Q106S/T, E119N, A124N, K130N и R140N, в особенности K12S/T, G18N, G18S/T, K37S/T, E38N, K61S/T, D63N, Q67N, K80S/T, N85S/T, K94N, Q106S/T, A124N, K130N и R140N (положения, в которых более 25% боковой цепи экспонировано на поверхности, в структуре без молекулы рецептора), более предпочтительно G18N, E38N, D63N, Q67N, K94N, S99N, A124N, K130N и R140N (положения, в которых более 50% боковой цепи экспонировано на поверхности, в структуре без молекулы рецептора).Substitutions in which only one amino acid is required for the introduction of the N-glycosylation site include: K12S / T, G18S / T, G18N, K37S / T, E38N, M45N, I49N, K61S / T, D63N, Q67N, V70N, K80S / T, F82N, N85S / T, K87S / T, K94N, Q106S / T, E119N, A124N, K130N and R140N, in particular K12S / T, G18N, G18S / T, K37S / T, E38N, K61S / T, D63N, Q67N, K80S / T, N85S / T, K94N, Q106S / T, A124N, K130N and R140N (positions in which more than 25% of the side chain is exposed on the surface, in a structure without a receptor molecule), more preferably G18N, E38N, D63N, Q67N, K94N, S99N, A124N, K130N and R140N (positions in which more than 50% of the side chain is exposed on the surface, in a structure without a receptor molecule).
Обычно сайт N-гликозилирования предпочтительно не вводится в участок, составляющий сайт связывания с рецептором (за исключением особых случаев, как в разделе "Варианты с пониженным сродством к рецептору"). Соответственно, в норме не следует проводить мутации Q1N+P3S/T, E9N+L11S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, E119N и E119N+S121T, если только не требуется понизить сродство к рецептору.Typically, the N-glycosylation site is preferably not introduced into the site constituting the receptor binding site (except in special cases, as in the "Options with reduced receptor affinity" section). Accordingly, normal mutations Q1N + P3S / T, E9N + L11S / T, G18N, G18N + S20T, H19N + D21S / T, D21N + A23S / T, G26N + L28S / T, K34N + W36S / T, K37N + E39S / T, E119N and E119N + S121T, unless it is necessary to lower the affinity for the receptor.
К особенно предпочтительным вариантам по настоящему изобретению относится вариант SEQ ID No:1 (или его фрагментов с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID No:2-16), обладающий активностью IFNG и содержащий по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из K12S, К12Т, G18T, E38N, E38N+S40T, K61S, К61Т, N85S, N85T, K94N, Q106S и Q106T, более предпочтительно выбранную из группы, состоящей из К12Т, G18T, E38N+S40T, К61Т, N85T, K94N и Q106T, еще более предпочтительно выбранную из группы, состоящей из К12Т, G18T, E38N+S40T, К61Т и N85T, особенно E38N+S40T.Particularly preferred variants of the present invention include a variant of SEQ ID No: 1 (or fragments thereof with the amino acid sequences shown in SEQ ID No: 2-16) having IFNG activity and containing at least one substitution selected from the group consisting of K12S, K12T, G18T, E38N, E38N + S40T, K61S, K61T, N85S, N85T, K94N, Q106S and Q106T, more preferably selected from the group consisting of K12T, G18T, E38N + S40T, K61T, N85T, K94N and Q106T even more preferably selected from the group consisting of K12T, G18T, E38N + S40T, K61T and N85T, especially E38N + S40T.
В другом представляющем интерес воплощении изобретения вариант SEQ ID No:1 (или его фрагментов с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID No:2-16) содержит по меньшей мере два введенных сайта гликозилирования, в частности, по меньшей мере два введенных сайта N-гликозилирования. Эти по меньшей мере две модификации, в частности замены, ведущие к введению по меньшей мере двух введенных сайтов N-гликозилирования, можно предпочтительно выбрать из группы, состоящей из K12S, К12Т, G18S, G18T, E38N, E38N+S40T, K61S, К61Т, N85S, N85T, K94N, Q106S и Q106T, более предпочтительно из группы, состоящей из К12Т, G18T, E38N+S40T, К61Т, N85T, K94N и Q106T, еще более предпочтительно выбрать из группы, состоящей из К12Т, G18T, E38N+S40T, К61Т и N85T. Конкретные примеры таких замен, ведущих к появлению варианта, содержащего по меньшей мере два дополнительных сайта N-гликозилирования, включают K12T+G18T, K12T+E38N+S40T, К12Т+К61Т, K12T+N85T, G18T+E38N+S40T, G18T+K61T, G18T+N85T, E38N+S40T+ Кб IT, E38N+S40T+N85T и K61T+N85T.In another embodiment of interest of the invention, a variant of SEQ ID No: 1 (or fragments thereof with the amino acid sequences shown in SEQ ID No: 2-16) contains at least two introduced glycosylation sites, in particular at least two introduced N- sites glycosylation. These at least two modifications, in particular substitutions leading to the introduction of at least two introduced N-glycosylation sites, can preferably be selected from the group consisting of K12S, K12T, G18S, G18T, E38N, E38N + S40T, K61S, K61T, N85S, N85T, K94N, Q106S and Q106T, more preferably from the group consisting of K12T, G18T, E38N + S40T, K61T, N85T, K94N and Q106T, it is even more preferable to choose from the group consisting of K12T, G18T, E38N + S40T, K61T and N85T. Specific examples of such substitutions leading to the appearance of a variant containing at least two additional N-glycosylation sites include K12T + G18T, K12T + E38N + S40T, K12T + K61T, K12T + N85T, G18T + E38N + S40T, G18T + K61T, G18T + N85T, E38N + S40T + Kb IT, E38N + S40T + N85T and K61T + N85T.
Из представленных выше списков замен следует предпочтительно выбирать замены, находящиеся в пределах 118 N-концевых аминокислотных остатков, в особенности в пределах 97 N-концевых аминокислотных остатков.From the above substitution lists, it is preferable to select substitutions within 118 N-terminal amino acid residues, in particular within 97 N-terminal amino acid residues.
Вариант полипептида IFNG по изобретению может содержать один дополнительный сайт гликозилирования in vivo на мономер (по сравнению с SEQ ID No:1 или его фрагментами). Однако для того, чтобы достичь размера, достаточного для увеличения времени полужизни в сыворотке, зачастую необходимо, чтобы полипептид содержал более одного сайта N-гликозилирования in vivo, в частности 2-7 или 2-5 дополнительных сайтов N-гликозилирования in vivo, например, 2, 3, 4 или 5 сайтов N-гликозилирования in vivo. Такие сайты N-гликозилирования in vivo предпочтительно вводят путем одной и более замен, описанных в любом из вышеприведенных списков.A variant of the IFNG polypeptide of the invention may contain one additional in vivo glycosylation site per monomer (compared to SEQ ID No: 1 or fragments thereof). However, in order to achieve a size sufficient to increase serum half-life, it is often necessary that the polypeptide contains more than one in vivo N-glycosylation site, in particular 2-7 or 2-5 additional in vivo N-glycosylation sites, for example, 2, 3, 4, or 5 in vivo N-glycosylation sites. Such in vivo N-glycosylation sites are preferably administered by one or more of the substitutions described in any of the above lists.
Кроме того, следует иметь в виду, что любые из вышеприведенных модификаций могут сочетаться с любыми из модификаций, описанных в разделе "Варианты IFNG по изобретению с оптимизированными сайтами гликозилирования", в особенности с заменой G26A.In addition, it should be borne in mind that any of the above modifications can be combined with any of the modifications described in the section "IFNG variants of the invention with optimized glycosylation sites", in particular with the replacement of G26A.
Варианты IFNG по изобретению, у которых связующей группой для неполипептидного компонента служит цистеинIFNG variants of the invention in which cysteine serves as a linking group for the non-polypeptide component
В следующем предпочтительном воплощении изобретения вариант IFNG с последовательностью SEQ ID No:1 (или его фрагментов) содержит по меньшей мере один введенный остаток цистеина. Например, остаток цистеина может быть введен в положение полипептида IFNG с последовательностью ID No:1 (или его фрагментов), содержащее аминокислотный остаток, экспонированный на поверхности. Предпочтительно у такого экспонированного на поверхности аминокислотного остатка не менее 25% боковой цепи экспонировано на поверхности, в особенности не менее 50% боковой цепи экспонировано на поверхности. Подробности об определении таких положений приводятся далее в Примере 1.In a further preferred embodiment of the invention, the IFNG variant with the sequence of SEQ ID No: 1 (or fragments thereof) contains at least one cysteine residue introduced. For example, a cysteine residue can be introduced into the position of the IFNG polypeptide with the sequence ID No: 1 (or fragments thereof) containing the amino acid residue exposed on the surface. Preferably, in such an amino acid residue exposed on the surface, at least 25% of the side chain is exposed on the surface, in particular at least 50% of the side chain is exposed on the surface. Details of the definition of such provisions are given below in Example 1.
Так, замены, ведущие к введению остатка цистеина в положения, экспонированные на поверхности полипептида IFNG и занятые аминокислотными остатками, у которых не менее 25% боковой цепи экспонировано на поверхности (в структуре с молекулой рецептора), включают: Q1C, D2C, Р3С, К6С, Е9С, N10C, К13С, Y14C, N16C, G18C, Н19С, D21C, N25C, G26C, G31C, К34С, N35C, К37С, Е38С, Е39С, S40C, К55С, К58С, N59C, К61С, D62C, D63C, Q64C, S65C, Q67C, К68С, Е71С, Т72С, К74С, Е75С, N78C, V79C, К80С, N83C, S84C, N85C, К86С, К87С, D90C, Е93С, К94С, Т101С, D102C, L103C, N104C и Е119С, при этом замены указаны относительно [S99T]huIFNG с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID No:1 (или относительно соответствующих фрагментов с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID No:2-16).So, substitutions leading to the introduction of a cysteine residue at the positions exposed on the surface of the IFNG polypeptide and occupied by amino acid residues in which at least 25% of the side chain is exposed on the surface (in the structure with the receptor molecule) include: Q1C, D2C, P3C, K6C , E9C, N10C, K13C, Y14C, N16C, G18C, H19C, D21C, N25C, G26C, G31C, K34C, N35C, K37C, E38C, E39C, S40C, K55C, K58C, N59C, K61C, D62C, D63C, Q64C, , Q67C, K68C, E71C, T72C, K74C, E75C, N78C, V79C, K80C, N83C, S84C, N85C, K86C, K87C, D90C, E93C, K94C, T101C, D102C, L103C, N104C and E119C, with the replacement indicated with respect to [S99T] huIFNG with the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1 (or relative to the corresponding fragments of the amino acid sequences given in SEQ ID No: 2-16).
Замены, ведущие к введению остатка цистеина в положения, экспонированные на поверхности полипептида IFNG и занятые аминокислотными остатками, у которых не менее 50% боковой цепи экспонировано на поверхности (в структуре с молекулой рецептора), включают: Р3С, К6С, N10C, К13С, N16C, D21C, N25C, G26C, G31C, К34С, К37С, Е38С, Е39С, К55С, К58С, N59C, D62C, Q64C, S65C, К68С, Е71С, Е75С, N83C, S84C, К86С, К87С, К94С, Т101С, D102C, L103C и N104C, при этом замены указаны относительно [S99T]huIFNG с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID No:1 (или относительно соответствующих фрагментов с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID No:2-16).Substitutions leading to the introduction of a cysteine residue at positions exposed on the surface of the IFNG polypeptide and occupied by amino acid residues in which at least 50% of the side chain is exposed on the surface (in the structure with the receptor molecule) include: P3C, K6C, N10C, K13C, N16C , D21C, N25C, G26C, G31C, K34C, K37C, E38C, E39C, K55C, K58C, N59C, D62C, Q64C, S65C, K68C, E71C, E75C, N83C, S84C, K86C, K87C, K94C, T101C, D10C and N104C, with the substitutions indicated for [S99T] huIFNG with the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1 (or relative to the corresponding fragments with amino acid pos the investigations given in SEQ ID No: 2-16).
Обычно остаток цистеина предпочтительно не вводится (и впоследствии к этому остатку цистеина не присоединяется неполипептидный компонент) в участок, составляющий сайт связывания с рецептором (за исключением особых случаев, как в разделе "Варианты с пониженным сродством к рецептору"). Соответственно, в норме не следует проводить мутации Q1C, Е9С, G18C, Н19С, D21C, G26C, К34С, К37С и Е119С, если только не требуется понизить сродство к рецептору.Typically, a cysteine residue is preferably not introduced (and subsequently a non-polypeptide component is not attached to this cysteine residue) to the site constituting the receptor binding site (except in special cases, as in the “Receptor Reduced Affinity Options” section). Accordingly, normal mutations Q1C, E9C, G18C, H19C, D21C, G26C, K34C, K37C and E119C should not be carried out unless it is necessary to lower the affinity for the receptor.
Более предпочтительно остаток цистеина вводится путем замены, выбираемой из группы, состоящей из N10C, N16C, Е38С, N59C, N83C, К94С, N104C и А124С.More preferably, the cysteine residue is introduced by substitution selected from the group consisting of N10C, N16C, E38C, N59C, N83C, K94C, N104C and A124C.
В другом представляющем интерес воплощении изобретения вариант SEQ ID No:1 (или его фрагментов с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID No:2-16) содержит по меньшей мере два введенных остатка цистеина. Эти по меньшей мере две модификации, в частности замены, ведущие к введению по меньшей мере двух введенных остатков цистеина, предпочтительно можно выбрать из группы, состоящей из N10C, N16C, Е38С, N59C, N83C, К94С, N104C и А124С. Конкретные примеры таких замен, ведущих к появлению варианта, содержащего по меньшей мере два введенных остатка цистеина, включают N10C+N16C, N10C+E38C, N10C+N59C, N10C+N83C, N10C+K94C, N10C+N104C, N10C+A124C, N16C+E38C, N16C+N59C, N16C+N83C, N16C+K94C, N16C+N104C, N16C+A124C, E38C+N59C, E38C+N83C, Е38С+К94С, E38C+N104C, E38N+A124C, N59C+N83C, N59C+K94C, N59C+N104C, N59C+A124C, N83C+K94C, N83C+K94C, N83C+N104C, N83C+A124C, K94C+N104C, К94С+А124С и N104C+A124C.In another embodiment of interest of the invention, a variant of SEQ ID No: 1 (or fragments thereof with the amino acid sequences shown in SEQ ID No: 2-16) contains at least two introduced cysteine residues. These at least two modifications, in particular substitutions leading to the introduction of at least two introduced cysteine residues, can preferably be selected from the group consisting of N10C, N16C, E38C, N59C, N83C, K94C, N104C and A124C. Specific examples of such substitutions leading to the appearance of a variant containing at least two introduced cysteine residues include N10C + N16C, N10C + E38C, N10C + N59C, N10C + N83C, N10C + K94C, N10C + N104C, N10C + A124C, N16C + E38C, N16C + N59C, N16C + N83C, N16C + K94C, N16C + N104C, N16C + A124C, E38C + N59C, E38C + N83C, E38C + K94C, E38C + N104C, E38N + A124C, N59C + N83C, N59C + N104C, N59C + A124C, N83C + K94C, N83C + K94C, N83C + N104C, N83C + A124C, K94C + N104C, K94C + A124C and N104C + A124C.
Предусматривается, что введенные остатки цистеина можно предпочтительно конъюгировать с неполипептидным компонентом типа PEG, более предпочтительно mPEG. Конъюгирование между содержащим цистеин вариантом полипептида и молекулой полимера может осуществляться любым удобным способом, к примеру, как описано в разделе "Конъюгирование с молекулой полимера", например, в одну стадию или в несколько стадий, как указано в этом разделе. Предпочтительный метод получения PEG-производного варианта полипептида IFNG заключается в ковалентном присоединении PEG к остаткам цистеина с помощью реагирующих с цистеином разновидностей PEG. Коммерчески доступны целый ряд высокоспецифичных, реагирующих с цистеином разновидностей PEG с различными группами (как-то: ортопиридилдисульфид, малеимид и винилсульфон) и разного размера (от 2 до 20 кДа, к примеру, 5 кДа, 10 кДа, 12 кДа или 15 кДа), например, от фирмы Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA.It is contemplated that the introduced cysteine residues can preferably be conjugated to a non-polypeptide component of the PEG type, more preferably mPEG. The conjugation between the cysteine-containing variant of the polypeptide and the polymer molecule can be carried out in any convenient way, for example, as described in the section "Conjugation with a polymer molecule", for example, in one stage or in several stages, as described in this section. A preferred method for preparing the PEG-derived variant of the IFNG polypeptide is to covalently attach PEG to cysteine residues using cysteine-reactive PEG species. A number of highly specific, cysteine-reactive PEG species with various groups (such as orthopyridyldisulfide, maleimide and vinyl sulfone) and different sizes (from 2 to 20 kDa, for example, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa or 15 kDa) are commercially available. , for example, from Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA.
Следует иметь в виду, что любые из вышеприведенных модификаций могут сочетаться с любыми из модификаций, описанных в разделе "Варианты IFNG по изобретению с оптимизированными сайтами гликозилирования", в особенности с заменой G26A.It should be borne in mind that any of the above modifications can be combined with any of the modifications described in the section "IFNG variants of the invention with optimized glycosylation sites", in particular with the replacement of G26A.
Варианты IFNG по изобретению, у которых первый неполипептидный компонент представлен остатком сахара, а вторым неполипептидным компонентом служит молекула, имеющая цистеин в качестве связующей группыIFNG variants of the invention in which the first non-polypeptide component is a sugar residue and the second non-polypeptide component is a molecule having cysteine as a linking group
В следующем предпочтительном воплощении изобретения вариант IFNG с последовательностью SEQ ID No:1 (или его фрагментов) содержит по меньшей мере один введенный сайт N-гликозилирования и по меньшей мере один введенный остаток цистеина. Такие варианты можно получить, выбирая остатки, описанные в двух предыдущих разделах, где описаны подходящие положения для введения сайтов N-гликозилирования и остатков цистеина, соответственно. Однако в предпочтительном воплощении изобретения такой вариант включает замены, выбранные группы, состоящей из K12T+N16C, К12Т+Е38С, K12T+N59C, K12T+N83C, К12Т+К94С, K12T+N104C, К12Т+А124С, G18T+N10C, G18T+E38C, G18T+N59C, G18T+N83C, G18T+K94C, G18T+N104C, G18T+A124C, E38N+S40T+N10C, E38N+S40T+N16C, E38N+S40T+N59C, E38N+S40T+N83C, E38N+S40T+K94C, E38N+S40T+N104C, E38N+S40T+A124C, K61T+N10C, K61T+N16C, К61Т+Е38С, K61T+N83C, К61Т+К94С, K61T+N104C, К61Т+А124С, N85T+N10C, N85T+N16C, N85T+E38C, N85T+N59C, N85T+K94C, N85T+N104C, N85T+A124C, K94N+N10C, K94N+N16C, K94N+E38C, K94N+N59C, K94N+N83C, K94N+N104C, K94N+A124C, Q106T+N10C, Q106T+N16C, Q106T+E38C, Q106T+N59C, Q106T+N83C, Q106T+K94C и Q106T4-A124C, более предпочтительно из группы, состоящей из E38N+S40T+N10C, E38N+S40T+N16C, E38N+S40T+N59C, E38N+S40T+N83C, E38N+S40T+K94C и E38N+S40T+N104C.In a further preferred embodiment of the invention, the IFNG variant with the sequence of SEQ ID No: 1 (or fragments thereof) contains at least one introduced N-glycosylation site and at least one introduced cysteine residue. Such options can be obtained by selecting the residues described in the previous two sections, which describe the appropriate provisions for the introduction of N-glycosylation sites and cysteine residues, respectively. However, in a preferred embodiment of the invention, such an option includes substitutions selected from the group consisting of K12T + N16C, K12T + E38C, K12T + N59C, K12T + N83C, K12T + K94C, K12T + N104C, K12T + A124C, G18T + N10C, G18T + E38C , G18T + N59C, G18T + N83C, G18T + K94C, G18T + N104C, G18T + A124C, E38N + S40T + N10C, E38N + S40T + N16C, E38N + S40T + N59C, E38N + S40T + N83C, E38N + S40 , E38N + S40T + N104C, E38N + S40T + A124C, K61T + N10C, K61T + N16C, K61T + E38C, K61T + N83C, K61T + K94C, K61T + N104C, K61T + A124C, N85T + N10C, N85T + N16T + E38C, N85T + N59C, N85T + K94C, N85T + N104C, N85T + A124C, K94N + N10C, K94N + N16C, K94N + E38C, K94N + N59C, K94N + N83C, K94N + N104C, K94N + A124C, , Q106T + N16C, Q106T + E38C, Q106T + N59C, Q106T + N83C, Q106T + K94C and Q106T4-A124C, more preferably from the group consisting of E38N + S40T + N10C, E38N + S40T + N16C, E38N + S40T + E38N + S40T + N83C, E38N + S40T + K94C and E38N + S40T + N104C.
Предусматривается, что введенные остатки цистеина можно предпочтительно конъюгировать с неполипептидным компонентом типа PEG, более предпочтительно mPEG. Конъюгирование между содержащим цистеин вариантом полипептида и полимером может осуществляться любым удобным способом, к примеру, как описано в разделе "Конъюгирование с молекулой полимера", например, в одну стадию или в несколько стадий, как указано в этом разделе. Подходящим полимером является VS-mPEG или OPSS-mPEG.It is contemplated that the introduced cysteine residues can preferably be conjugated to a non-polypeptide component of the PEG type, more preferably mPEG. The conjugation between the cysteine-containing variant of the polypeptide and the polymer can be carried out in any convenient way, for example, as described in the section "Conjugation with a polymer molecule", for example, in one stage or in several stages, as described in this section. A suitable polymer is VS-mPEG or OPSS-mPEG.
Кроме того, следует иметь в виду, что любые из вышеприведенных модификаций могут сочетаться с любыми из модификаций, описанных в разделе "Варианты IFNG по изобретению с оптимизированными сайтами гликозилирования", в особенности с заменой G26A.In addition, it should be borne in mind that any of the above modifications can be combined with any of the modifications described in the section "IFNG variants of the invention with optimized glycosylation sites", in particular with the replacement of G26A.
Варианты IFNG с пониженным сродством к рецепторуReceptor Affinity IFNG Options
Одним из путей увеличения времени полужизни в сыворотке полипептида IFNG может быть уменьшение опосредованной рецептором интернализации и тем самым снижение опосредованного рецептором клиренса.One way to increase the serum half-life of an IFNG polypeptide is to decrease receptor-mediated internalization and thereby decrease receptor-mediated clearance.
Опосредованная рецептором интернализация зависит от сродства димера IFNG к IFNG-рецепторному комплексу, соответственно, вариант IFNG с пониженным сродством к IFNG-рецепторному комплексу должен интернализоваться, а тем самым и подвергаться клиренсу, в меньшей степени.Receptor-mediated internalization depends on the affinity of the IFNG dimer for the IFNG receptor complex; accordingly, an IFNG variant with a reduced affinity for the IFNG receptor complex should be internalized, and thereby undergo clearance to a lesser extent.
Сродство димера IFNG с своему рецепторному комплексу можно понизить путем одной или нескольких модификаций, в частности замен, в сайте связывания с рецептором полипептида IFNG. Аминокислотные остатки, образующие сайт связывания с рецептором, определены далее в Примере 2. Один из классов замен, которые можно проводить, - это консервативные замены аминокислот. В другом воплощении проводимые модификации ведут к появлению сайта N-гликозилирования.The affinity of the IFNG dimer with its receptor complex can be reduced by one or more modifications, in particular substitutions, at the binding site of the IFNG polypeptide receptor. Amino acid residues forming the receptor binding site are defined further in Example 2. One of the classes of substitutions that can be made is conservative amino acid substitutions. In another embodiment, ongoing modifications result in an N-glycosylation site.
Таким образом, в следующем отдельном предпочтительном воплощении изобретения вариант IFNG с последовательностью SEQ ID No:1 (или его фрагментов) включает по меньшей мере одну модификацию, такую как замена, в сайте связывания с рецептором (как он определен в настоящем изобретении). В частности, полипептид IFNG включает по меньшей мере одну модификацию, предпочтительно замену, создающую сайт N-гликозилирования, в сайте связывания с рецептором. Например, такие замены можно выбрать из числа Q1N+P3S/T, D2N+Y4S/T, Y4N+K6S/T, V5N+E7S/T, E9N+L11S/T, K12N+Y14S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, S20N+V22S/T, D21N+A23S/T, V22N+D24S/T, D24N+G26S/T, G26N+L28S/T, L30N+I32S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, K108N+I110S/T, H111N+L113S/T, E112N+I114S/T, I114N+V116S/T, Q115N+M117S/T, A118N+L120S/T, E119N и E119N+S121T, предпочтительно из группы, состоящей из Q1N+P3S/T, D2N+Y4S/T, E9N+L11S/T, K12N+Y14S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, S20N+V22S/T, D21N+A23S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, H111N+L113S/T, Q115N+M117S/T, A118N+L120S/T, E119N и E119N+S121T (введение сайта N-гликозилирования в положения, содержащие аминокислотный остаток, у которого не менее 25% боковой цепи экспонировано на поверхности), более предпочтительно из числа Q1N+P3S/T, D2N+Y4S/T, E9N+L11S/T, G18N, G18N+S20T, H19N+D21S/T, S20N+V22S/T, D21N+A23S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, Q115N+M117S/T, A118N+L120S/T, E119N и E119N+S121T (введение сайта N-гликозилирования в положения, содержащие аминокислотный остаток, у которого не менее 50% боковой цепи экспонировано на поверхности), еще более предпочтительно из группы, состоящей из Q1N+P3T, D2N+Y4T, E9N+L11T, G18N+S20T, H19N+D21T, S20N+V22T, D21N+A23T, K34N+W36T, K37N+E39T, Q115N+M117T, A118N+L120T и E119N+S121T, наиболее предпочтительно из группы, состоящей из G18N+S20T, H19N+D21T, D21N+A23T и El 19N+S121T, в особенности D21N+A23T.Thus, in a further separate preferred embodiment of the invention, the IFNG variant with the sequence SEQ ID No: 1 (or fragments thereof) includes at least one modification, such as a substitution, at the receptor binding site (as defined in the present invention). In particular, the IFNG polypeptide includes at least one modification, preferably a substitution, creating an N-glycosylation site at the receptor binding site. For example, such substitutions can be selected from among Q1N + P3S / T, D2N + Y4S / T, Y4N + K6S / T, V5N + E7S / T, E9N + L11S / T, K12N + Y14S / T, G18N, G18N + S20T, H19N + D21S / T, S20N + V22S / T, D21N + A23S / T, V22N + D24S / T, D24N + G26S / T, G26N + L28S / T, L30N + I32S / T, K34N + W36S / T, K37N + E39S / T, K108N + I110S / T, H111N + L113S / T, E112N + I114S / T, I114N + V116S / T, Q115N + M117S / T, A118N + L120S / T, E119N and E119N + S121T, preferably from the group consisting of Q1N + P3S / T, D2N + Y4S / T, E9N + L11S / T, K12N + Y14S / T, G18N, G18N + S20T, H19N + D21S / T, S20N + V22S / T, D21N + A23S / T, K34N + W36S / T, K37N + E39S / T, H111N + L113S / T, Q115N + M117S / T, A118N + L120S / T, E119N and E119N + S121T (introduction of the N-glycosylation site at positions containing an amino acid residue in which at least 25% of the side chain exposed on the surface), more preferably from Q1N + P3S / T, D2N + Y4S / T, E9N + L11S / T, G18N, G18N + S20T, H19N + D21S / T, S20N + V22S / T, D21N + A23S / T, K34N + W36S / T, K37N + E39S / T, Q115N + M117S / T, A118N + L120S / T, E119N and E119N + S121T (introduction of the N-glycosylation site at positions containing an amino acid residue with at least 50% of the side chain exposed on the surface), even more preferably from the group consisting of Q1N + P3T, D2N + Y4T, E9N + L11T, G18N + S20T, H19N + D21T, S20N + V22T, D21N + A23T, K34N + W36T, K37N + E39T, Q115N + M117T, A118N + L120T + S121T, most preferably from the group consisting of G18N + S20T, H19N + D21T, D21N + A23T and El 19N + S121T, in particular D21N + A23T.
Предусматривается, что такие варианты будут обладать пониженным сродством к рецептору по сравнению с huIFNG или Actimmune®. Сродство к рецептору можно измерить любым удобным методом, известным специалистам в этой области. Один из примеров подходящего метода определения сродства связывания с рецептором - метод BIAcore®, описанный в Michiels et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 30: 505-516 (1998). С применением этого метода пригодными для целей настоящего изобретения считаются такие варианты IFNG, у которых константа связывания (Кd) составляет 1-95% от значения Kd гликозилированного [S99T]huIFNG или Actimmune®. Например, значение Кd полипептида IFNG может составлять 1-75% или 1-50%, например 1-25%, например 1-20%, и даже 1-15%, 1-10% или 1-5% от значения Кd гликозилированного [S99T]huIFNG или Actimmune®.It is contemplated that such variants will have reduced receptor affinity compared to huIFNG or Actimmune®. Receptor affinity can be measured by any convenient method known to those skilled in the art. One example of a suitable method for determining receptor binding affinity is the BIAcore® method described in Michiels et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 30: 505-516 (1998). Using this method, IFNG variants in which the binding constant (K d ) is 1-95% of the K d value of the glycosylated [S99T] huIFNG or Actimmune® are considered suitable for the purposes of the present invention. For example, the K d value of the IFNG polypeptide may be 1-75% or 1-50%, for example 1-25%, for example 1-20%, and even 1-15%, 1-10% or 1-5% of the K value d glycosylated [S99T] huIFNG or Actimmune®.
Обычно такие варианты IFNG с пониженным сродством к рецептору обладают и пониженной активностью IFNG, например, при тестировании методом, описанным в разделе "Первичный анализ". Так, вариант полипептида IFNG может обладать 1-95% удельной активности Actimmune® или rhuIFNG, например, 1-75% или 1-50%, 1-20% или 1-10% от удельной активности Actimmune® или rhuIFNG.Typically, such IFNG variants with reduced affinity for the receptor also have reduced IFNG activity, for example, when tested by the method described in the section "Initial analysis". Thus, a variant IFNG polypeptide may have 1-95% of the specific activity of Actimmune® or rhuIFNG, for example, 1-75% or 1-50%, 1-20% or 1-10% of the specific activity of Actimmune® or rhuIFNG.
Как указано выше, предусматривается, что такие варианты IFNG будут обладать увеличенным временем полужизни в сыворотке вследствие снижения опосредованного рецептором клиренса. Поэтому предусматривается, что варианты полипептида IFNG согласно этому аспекту изобретения будут соответствовать требованиям по увеличению времени полужизни в сыворотке, описанным ранее в настоящем изобретении в связи с определением понятия "увеличение времени полужизни в сыворотке".As indicated above, it is contemplated that such IFNG variants will have an increased serum half-life due to a decrease in receptor-mediated clearance. Therefore, it is contemplated that variants of the IFNG polypeptide according to this aspect of the invention will meet the requirements for increasing serum half-life described earlier in the present invention in connection with the definition of “increasing serum half-life”.
Конечно, любые из вышеприведенных модификаций, ведущих к понижению сродства связывания с рецептором, могут сочетаться с любыми из других модификаций, описанных в настоящем изобретении, в частности, в разделах "Варианты IFNG по изобретению с оптимизированными сайтами N-гликозилирования", "Варианты IFNG по изобретению, у которых неполипептидный компонент представлен остатком сахара", "Варианты IFNG по изобретению, у которых связующей группой для неполипептидного компонента служит цистеин" и "Варианты IFNG по изобретению, у которых первый неполипептидный компонент представлен остатком сахара, а вторым неполипептидным компонентом служит молекула, имеющая цистеин" в качестве связующей группы, например, G26A, E38N+S40T и их комбинации.Of course, any of the above modifications leading to a decrease in the binding affinity for the receptor can be combined with any of the other modifications described in the present invention, in particular in the sections "IFNG variants of the invention with optimized N-glycosylation sites", "IFNG variants for invention, in which the non-polypeptide component is represented by a sugar residue "," IFNG variants of the invention, in which cysteine is the connecting group for the non-polypeptide component "and" IFNG variants of the invention, in which the first non-polypeptide idny component is a sugar moiety, and the second component is a non-polypeptide molecule having cysteine "as a linking group, e.g., G26A, E38N + S40T and combinations thereof.
Способы конъюгированияConjugation Methods
Неполипептидный компонентNon-polypeptide component
Как указывалось выше, неполипептидный компонент предпочтительно выбирается из группы, состоящей из молекул полимеров, липофильных соединений, остатков сахаров (путем гликозилирования in vivo) и органических модифицирующих агентов. Все эти агенты могут придавать желательные свойства варианту полипептида IFNG, в частности, повышенную AUCsc, увеличенное время полужизни в сыворотке и/или сниженную иммуногенность. Обычно вариант полипептида конъюгируют с неполипептидными компонентами только одного типа, но можно конъюгировать и с неполипептидными компонентами двух и более разных типов, например, с молекулой полимера и остатком сахара, с липофильной группой и остатком сахара, с органическим модифицирующим агентом и остатком сахара, с липофильной группой и молекулой полимера и т.д. При конъюгировании с неполипептидными компонентами двух разных типов они предпочтительно представлены остатком сахара и полимером. Конъюгирование с двумя или несколькими различными неполипептидными компонентами может осуществляться одновременно или поочередно. В последующих разделах "Конъюгирование с липофильным соединением", "Конъюгирование с молекулой полимера", "Конъюгирование с остатком сахара" и "Конъюгирование с органическим модифицирующим агентом" описывается Конъюгирование с неполипептидными компонентами конкретных типов.As indicated above, the non-polypeptide component is preferably selected from the group consisting of polymer molecules, lipophilic compounds, sugar residues (by in vivo glycosylation) and organic modifying agents. All of these agents can confer desirable properties to an IFNG polypeptide variant, in particular, increased AUC sc , increased serum half-life, and / or reduced immunogenicity. Typically, a polypeptide variant is conjugated to non-polypeptide components of only one type, but it can also be conjugated to non-polypeptide components of two or more different types, for example, a polymer molecule and a sugar residue, a lipophilic group and a sugar residue, an organic modifying agent and a sugar residue, and a lipophilic group and polymer molecule, etc. When conjugated to non-polypeptide components of two different types, they are preferably represented by a sugar residue and a polymer. Conjugation with two or more different non-polypeptide components can be carried out simultaneously or alternately. The following sections, Conjugation with a Lipophilic Compound, Conjugation with a Polymer Molecule, Conjugation with a Sugar Residue, and Conjugation with an Organic Modifying Agent, describe Conjugation with specific types of non-polypeptide components.
Конъюгирование с липофильным соединениемLipophilic conjugation
Вариант полипептида и липофильное соединение можно конъюгировать друг с другом либо непосредственно, или с помощью линкера. Липофильное соединение может быть природным соединением, таким как насыщенная или ненасыщенная жирная кислота, дикетон жирной кислоты, терпен, простагландин, витамин, каротиноид или стероид, либо синтетическим соединением, таким как карбоновая кислота, спирт, амин или сульфоновая кислота с одной или несколькими алкил-, арил-, алкенильными группами, или же другими многочисленными ненасыщенными соединениями. Конъюгация между вариантом полипептида и липофильным соединением, необязательно через линкер, может осуществляться методами, известными в этой области, например, как описано Bodanszky в Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 и в WO 96/12505.The polypeptide variant and lipophilic compound can be conjugated to each other either directly or using a linker. The lipophilic compound may be a natural compound, such as saturated or unsaturated fatty acid, fatty acid diketone, terpene, prostaglandin, vitamin, carotenoid or steroid, or a synthetic compound, such as carboxylic acid, alcohol, amine or sulfonic acid with one or more alkyl- , aryl, alkenyl groups, or other numerous unsaturated compounds. Conjugation between a polypeptide variant and a lipophilic compound, optionally via a linker, can be carried out by methods known in the art, for example as described by Bodanszky in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 and WO 96/12505.
Конъюгирование с молекулой полимераConjugation with a polymer molecule
Для конъюгирования с вариантом полипептида можно использовать любые подходящие молекулы полимеров, например, природные и синтетические гомополимеры или гетерополимеры, обычно с молекулярным весом в интервале 300-100000 Да или 1000-50000 Да, например, в интервале 2000-40000 Да или 2000-30000 Да, к примеру, в интервале 2000-20000 Да, 2000-10000 Да или 1000-5000 Да. В частности, молекула полимера типа PEG, в особенности mPEG, обычно имеет молекулярный вес примерно 2, 5, 10, 12, 15, 20, 30, 40 или 50 кДа, особенно молекулярный вес около 5 кДа, около 10 кДа, около 12 кДа, около 15 кДа или около 20 кДа.For conjugation with a variant polypeptide, any suitable polymer molecule can be used, for example, natural and synthetic homopolymers or heteropolymers, usually with a molecular weight in the range of 300-100000 Da or 1000-50000 Yes, for example, in the range of 2000-40000 Yes or 2000-30000 Yes , for example, in the range of 2000-20000 Yes, 2000-10000 Yes or 1000-5000 Yes. In particular, a PEG type polymer molecule, in particular mPEG, typically has a molecular weight of about 2, 5, 10, 12, 15, 20, 30, 40, or 50 kDa, especially a molecular weight of about 5 kDa, about 10 kDa, about 12 kDa , about 15 kDa or about 20 kDa.
В применении к молекулам полимеров слово "около" означает приблизительный средний молекулярный вес и отражает тот факт, что обычно существует определенное распределение молекулярных весов в данном препарате полимера.As applied to polymer molecules, the word "about" means an approximate average molecular weight and reflects the fact that there is usually a certain distribution of molecular weights in a given polymer preparation.
Примеры гомополимеров включают полиолы (то есть поли-ОН), полиамины (поли-NH2), поликарбоновые кислоты (поли-СООН). Гетерополимер - это полимер, содержащий одну и более различных конъюгируемых групп, например, гидроксильную группу и аминогруппу.Examples of homopolymers include polyols (i.e., poly-OH), polyamines (poly-NH 2 ), polycarboxylic acids (poly-COOH). A heteropolymer is a polymer containing one or more different conjugated groups, for example, a hydroxyl group and an amino group.
Примеры подходящих молекул полимеров включают полимерные молекулы, выбранные из группы, состоящей из полиалкиленоксидов (РАО), включая полиалкиленгликоли (PAG) типа полиэтиленгликоля (PEG) и полипропиленгликоля (PPG), разветвленных PEG, поливинилового спирта (PVA), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, сополимера этилена и ангидрида малеиновой кислоты, сополимера стирола и ангидрида малеиновой кислоты, декстрана, включая карбоксиметилдекстран, или любые другие биополимеры, подходящие для уменьшения иммуногенности и/или увеличения функционального периода полужизни in vivo и/или времени полужизни в сыворотке. Другие примеры молекул полимеров - альбумин человека или другие распространенные белки плазмы. Обычно полимеры на основе полиалкиленгликолей биосовместимы, нетоксичны, неантигенны, неиммуногенны, обладают разнообразием в отношении водорастворимости и легко выводятся из живого организма.Examples of suitable polymer molecules include polymer molecules selected from the group consisting of polyalkylene oxides (PAO), including polyalkylene glycols (PAGs) such as polyethylene glycol (PEG) and polypropylene glycol (PPG), branched PEG, polyvinyl alcohol (PVA), polycarboxylate, polyvinylpyrrolidone and maleic anhydride, a copolymer of styrene and maleic anhydride, dextran, including carboxymethyldextran, or any other biopolymers suitable to reduce immunogenicity and / or increase the functional in vivo half-life and / or serum half-life. Other examples of polymer molecules are human albumin or other common plasma proteins. Typically, polyalkylene glycol-based polymers are biocompatible, non-toxic, non-antigenic, non-immunogenic, have a variety of water solubility and are readily excreted from a living organism.
Предпочтительно в качестве полимерной молекулы используют PEG, так как он обладает весьма малым количеством групп, способных к образованию перекрестных сшивок, по сравнению с полисахаридами, например декстраном и т.п. Особый интерес представляет монофункциональный PEG, например, монометоксиполиэтиленгликоль (mPEG), так как он обладает относительно простым механизмом реакции конъюгирования (только одна реакционно-способная группа доступна для конъюгации со связующими группами на полипептиде). Вследствие этого устраняется риск перекрестных сшивок, образующиеся конъюгированные варианты полипептида более гомогенны, и реакция молекул полимера с полипептидом легче поддается контролю.Preferably, PEG is used as the polymer molecule, since it has a very small number of groups capable of crosslinking compared to polysaccharides, for example dextran and the like. Of particular interest is monofunctional PEG, for example, monomethoxypolyethylene glycol (mPEG), since it has a relatively simple conjugation reaction mechanism (only one reactive group is available for conjugation with linking groups on the polypeptide). As a result, the risk of cross-linking is eliminated, the resulting conjugated variants of the polypeptide are more homogeneous, and the reaction of the polymer molecules with the polypeptide is easier to control.
Для ковалентного присоединения молекул полимера к варианту полипептида концевые гидроксильные группы молекулы полимера должны находиться в активированной форме, то есть иметь реакционноспособные функциональные группы, примеры которых включают первичные аминогруппы, гидразид (HZ), тиол, сукцинат (SUC), сукцинимидилсукцинат (SS), сукцинимидилсукцинамид (SSA), сукцинимидилпропионат (SPA), сукцинимидилкарбоксиметилат (SCM), бензотриазолкарбонат (ВТС), N-гидроксисукцинимид (NHS), альдегид, нитрофенилкарбонат (NPC) и тресилат (TRES). Активированные соответствующим образом молекулы полимеров доступны коммерчески, например, от фирмы Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA. Альтернативно молекулы полимеров можно активировать стандартными методами, известными в этой области, к примеру, раскрытыми в WO 90/13540. Конкретные примеры активированных линейных или разветвленных полимерных молекул, пригодных для применения в настоящем изобретении, описаны в каталогах Shearwater Polymers, Inc., за 1997 и 2000 г.г. (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and Pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivates, включены в настоящее изобретение путем отсылки). Конкретные примеры активированных PEG-полимеров включают следующие линейные полиэтиленгликоли: NHS-PEG (например, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG и SCM-PEG), NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG и MAL-PEG; разветвленные полиэтиленгликоли типа PEG2-NHS и тех, что описаны в US 5932462 и US 5643575, которые оба включены путем отсылки. Кроме того, в следующих публикациях, включенных путем отсылки, раскрыты полезные полимерные молекулы и/или механизмы получения PEG-производных: US 5824778, US 5476653, WO 97/32607, ЕР 229 108, ЕР 402378, US 4902502, US 5281698, US 5122614, US 5219564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, ЕР 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, ЕР 921 131, US 5736625, WO 98/05363, ЕР 809996, US 5629384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5473034, US 5516673, ЕР 605963, US 5382657, ЕР 510356, ЕР 400472, ЕР 183503 и ЕР 154316.For covalent attachment of polymer molecules to a variant polypeptide, the terminal hydroxyl groups of the polymer molecule must be in an activated form, i.e., have reactive functional groups, examples of which include primary amino groups, hydrazide (HZ), thiol, succinate (SUC), succinimidyl succinate (SS), succinimidyl succinate (SSA), succinimidyl propionate (SPA), succinimidyl carboxymethylate (SCM), benzotriazole carbonate (BTC), N-hydroxysuccinimide (NHS), aldehyde, nitrophenyl carbonate (NPC) and tresylate (TRES). Appropriately activated polymer molecules are commercially available, for example, from Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA. Alternatively, polymer molecules can be activated by standard methods known in the art, for example, disclosed in WO 90/13540. Specific examples of activated linear or branched polymer molecules suitable for use in the present invention are described in the catalogs of Shearwater Polymers, Inc., for 1997 and 2000. (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and Pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivates, incorporated herein by reference.) Specific examples of activated PEG polymers include the following linear polyethylene glycols: NHS-PEG (e.g. SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG and SCM-PEG), NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG and MAL-PEG; branched polyethylene glycols of the type PEG2-NHS and those described in US 5932462 and US 5643575, which are both incorporated by reference. In addition, the following publications, incorporated by reference, disclose useful polymer molecules and / or mechanisms for the preparation of PEG derivatives: US 5824778, US 5476653, WO 97/32607, EP 229 108, EP 402378, US 4902502, US 5281698, US 5122614 , US 5219564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US 5736625, WO 98/05363, EP 809996, US 5629384, WO 96/41813, WO 96/07670 , US 5473034, US 5516673, EP 605963, US 5382657, EP 510356, EP 400472, EP 183503 and EP 154316.
Конкретные примеры активированных полимеров PEG, особенно предпочтительных для конъюгации с остатками цистеина, включают следующие линейные полиэтиленгликоли: винилсульфон-PEG (VS-PEG), предпочтительно винилсульфон-mPEG (VS-mPEG), малеимид-PEG (MAL-PEG), предпочтительно малеимид-mPEG (MAL-mPEG), и ортопиридилдисульфид-PEG (OPSS-PEG), предпочтительно ортопиридилдисульфид-mPEG (OPSS-mPEG). Обычно такие полимеры PEG или mPEG имеют размер около 5 кДа, около 10 кДа, около 12 кДа или около 20 кДа.Specific examples of activated PEG polymers, especially preferred for conjugation with cysteine residues, include the following linear polyethylene glycols: vinyl sulfone-PEG (VS-PEG), preferably vinyl sulfone-mPEG (VS-mPEG), maleimide-PEG (MAL-PEG), preferably maleimide- mPEG (MAL-mPEG), and orthopyridyldisulfide-PEG (OPSS-PEG), preferably orthopyridyldisulfide-mPEG (OPSS-mPEG). Typically, such PEG or mPEG polymers have a size of about 5 kDa, about 10 kDa, about 12 kDa, or about 20 kDa.
Конъюгация варианта полипептида с активированными молекулами полимеров проводится любым стандартным методом, например, как описано в следующих ссылках (в которых также описаны удобные методы активации полимерных молекул): Harris and Zaiipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F.Taylor (1991) "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S.Wong (1992) "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T.Hermanson et al. (1993) "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). Для получения PEG-производных по остаткам цистеина (см. выше) вариант IFNG обычно обрабатывают восстановителем типа дитиотреитола (DTT) перед модификацией ПЭГ. После этого восстановитель удаляют любым стандартным методом, например, обессоливанием. Конъюгирование PEG с остатком цистеина обычно происходит в соответствующем буфере при рН 6-9 при температуре от 4°С до 25°С на протяжении до 16 часов.The conjugation of a variant polypeptide with activated polymer molecules is carried out by any standard method, for example, as described in the following links (which also describe convenient methods for activating polymer molecules): Harris and Zaiipsky, eds., Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R.F. Taylor (1991) "Protein immobilization. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y .; S. S. Wong (1992) "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al. (1993) "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.). To obtain PEG derivatives for cysteine residues (see above), the IFNG variant is usually treated with a dithiothreitol-type reducing agent (DTT) before PEG modification. After this, the reducing agent is removed by any standard method, for example, desalination. Conjugation of PEG with a cysteine residue usually occurs in an appropriate buffer at pH 6-9 at a temperature of 4 ° C to 25 ° C for up to 16 hours.
Специалисту известно, что применяемый метод активации и/или механизм конъюгации зависят от связующих групп варианта полипептида, а также от функциональных групп полимера (например, представлены они амином, гидроксилом, карбоксилом, альдегидом или сульфгидрилом). Модификация PEG может быть направлена на конъюгирование со всеми доступными связующими группами на варианте полипептида (то есть с теми связующими группами, которые экспонированы на поверхности полипептида) или может быть направлено на специфические связующие группы, например, N-концевую аминогруппу (US 5985265). Кроме того, конъюгация может осуществляться в одну стадию или поэтапно (например, как описано в WO 99/55377).The specialist knows that the activation method used and / or the conjugation mechanism depend on the linking groups of the variant polypeptide, as well as on the functional groups of the polymer (for example, they are represented by amine, hydroxyl, carboxyl, aldehyde or sulfhydryl). The PEG modification can be directed to conjugation with all available linking groups on the polypeptide variant (i.e., to those linking groups that are exposed on the surface of the polypeptide) or it can be directed to specific linking groups, for example, the N-terminal amino group (US 5985265). In addition, conjugation can be carried out in one stage or in stages (for example, as described in WO 99/55377).
Следует иметь в виду, что модификацию PEG нужно планировать таким образом, чтобы получить оптимальную молекулу в отношении числа присоединенных молекул PEG, размера и формы таких молекул (например, линейные или разветвленные), и того, в каком месте варианта полипептида присоединяются такие молекулы. Например, молекулярный вес используемого полимера выбран на основании того эффекта, которого требуется достичь. Так, если главная цель конъюгации заключается в получении конъюгата с высоким молекулярным весом (например, чтобы уменьшить почечный клиренс), то обычно желательно конъюгировать как можно меньше молекул высокомолекулярного полимера, чтобы достичь требуемого молекулярного веса. Когда же нужно получить высокую степень экранирования эпитопов, то это достигается использованием достаточно большого числа молекул низкомолекулярного полимера (к примеру, с молекулярным весом около 5000 Да) для эффективного экранирования всех или большинства эпитопов полипептида. Например, можно использовать 2-8, например, 3-6 таких молекул полимера.It should be borne in mind that the modification of PEG must be planned in such a way as to obtain the optimal molecule in terms of the number of attached PEG molecules, the size and shape of such molecules (for example, linear or branched), and where in the polypeptide variant such molecules are attached. For example, the molecular weight of the polymer used is selected based on the effect to be achieved. So, if the main goal of conjugation is to obtain a conjugate with a high molecular weight (for example, to reduce renal clearance), it is usually desirable to conjugate as few molecules of a high molecular weight polymer as possible to achieve the desired molecular weight. When it is necessary to obtain a high degree of epitope screening, this is achieved by using a sufficiently large number of molecules of a low molecular weight polymer (for example, with a molecular weight of about 5000 Da) to effectively screen all or most of the epitopes of the polypeptide. For example, you can use 2-8, for example, 3-6 such polymer molecules.
При конъюгировании с единственной связующей группой на белке (как описано в US 5985265) лучше всего, чтобы молекула полимера, который может быть линейным или разветвленным, имела высокий молекулярный вес, к примеру, около 20 кДа.When conjugated to a single linking group on a protein (as described in US Pat. No. 5,985,265), it is best for the polymer molecule, which may be linear or branched, to have a high molecular weight, for example, about 20 kDa.
Обычно конъюгация с полимером проводится в условиях, направленных на то, чтобы все имеющие связующие группы для полимера прореагировали с молекулами полимера. Как правило, молярное отношение активированных молекул полимера к варианту полипептида составляет 1000-1, в частности 200-1, например, 100-1, 10-1 или 5-1, для достижения оптимальной реакции. Однако можно использовать и эквимолярные соотношения.Typically, conjugation with the polymer is carried out under conditions designed to ensure that all those having linking groups for the polymer react with the polymer molecules. Typically, the molar ratio of the activated polymer molecules to the polypeptide variant is 1000-1, in particular 200-1, for example 100-1, 10-1 or 5-1, to achieve an optimal reaction. However, equimolar ratios can also be used.
По изобретению также предусматривается присоединение полимерных молекул к варианту полипептида через линкер. Соответствующие линкеры хорошо известны специалистам. Предпочтительным примером служит цианурхлорид (Abuchowski et al. (1977) J.Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al. (1986) J.Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378).The invention also provides for the attachment of polymer molecules to a variant polypeptide via a linker. Suitable linkers are well known in the art. A preferred example is cyanuric chloride (Abuchowski et al. (1977) J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al. (1986) J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378).
После конъюгации оставшиеся активированные молекулы полимера блокируют методами, известными в этой области, например, добавлением первичного амина в реакционную смесь, после чего образовавшиеся инактивированные молекулы полимера удаляют подходящим способом.After conjugation, the remaining activated polymer molecules are blocked by methods known in the art, for example, by adding a primary amine to the reaction mixture, after which the resulting inactivated polymer molecules are removed in a suitable manner.
Конъюгирование с остатком сахараSugar Conjugation
Присоединение остатков сахара может происходить in vivo или in vitro. Для того, чтобы осуществить гликозилирование in vivo полипептида с активностью IFNG, который был модифицирован путем введения одного или нескольких сайтов гликозилирования in vivo (см. раздел "Варианты IFNG по изобретению, у которых неполипептидный компонент представлен остатком сахара"), нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, необходимо ввести в гликозилирующего эукариотического хозяина для экспрессии. Экспрессирующая клетка-хозяин может быть выбрана из клеток грибов (нитчатых грибов или дрожжей), насекомых или животных либо трансгенных растений. Кроме того, гликозилирование может осуществляться в организме человека при использовании нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида по изобретению, в генной терапии. В одном из воплощений клеткой хозяином служит клетка млекопитающего типа клеток СНО, ВНК или НЕК, например, клетки НЕК 293, или клетка насекомого типа клеток SF9, или клетка дрожжей, к примеру, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris или любой другой подходящий гликозилирующий хозяин, описанный далее. Необязательно остатки сахара, присоединенные к варианту полипептида IFNG посредством гликозилирования in vivo, подвергаются дальнейшей модификации с помощью гликозилтрансфераз, например, по технологии glycoAdvance™ фирмы Neose, Horsham, PA, USA. Это дает возможность, например, повысить сиалилирование гликозилированного варианта полипептида IFNG после экспрессии и гликозилирования in vivo в клетках СНО.The addition of sugar residues can occur in vivo or in vitro. In order to glycosylate an in vivo polypeptide with IFNG activity that has been modified by introducing one or more in vivo glycosylation sites (see "IFNG variants of the invention in which the non-polypeptide component is represented by a sugar residue"), the nucleotide sequence encoding the polypeptide must be introduced into the glycosylating eukaryotic host for expression. The expressing host cell may be selected from cells of fungi (filamentous fungi or yeast), insects or animals, or transgenic plants. In addition, glycosylation can be carried out in the human body using the nucleotide sequence encoding a variant of the polypeptide of the invention in gene therapy. In one embodiment, the host cell is a mammalian cell such as CHO, BHK or HEK cells, for example HEK 293 cells, or an insect cell such as SF9 cells, or a yeast cell, for example, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, or any other suitable glycosylating host described Further. Optionally, sugar residues attached to the IFNG polypeptide variant via in vivo glycosylation are further modified by glycosyl transferases, for example, by glycoAdvance ™ technology from Neose, Horsham, PA, USA. This makes it possible, for example, to increase the sialylation of a glycosylated variant of the IFNG polypeptide after expression and in vivo glycosylation in CHO cells.
Ковалентное конъюгирование in vitro гликозидов с аминокислотными остатками полипептидов IFNG может применяться для модификации или увеличения числа или профиля углеводных заместителей. В зависимости от способа конъюгирования сахар/сахара могут присоединяться к: a) аргинину и гистидину, b) свободным карбоксильным группам, c) свободным сульфгидрильным группам типа групп цистеина, d) свободным карбоксильным группам типа групп серина, треонина, тирозина или гидроксипролина, е) ароматическим остаткам типа остатков фенилаланина или триптофана, f) амидной группе глутамина. Эти аминокислотные остатки представляют примеры связующих групп для остатков сахаров, которые могут быть введены в полипептид IFNG и/или удалены из него. Подходящие методы конъюгирования in vitro описаны, к примеру, в WO 87/05330 и в Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306, 1981. Присоединение остатков сахаров или PEG in vitro к остаткам Gin белка или пептида также может проводиться с помощью трансглутаминаз (ТГаз), например, как описано Sato et al., 1996, Biochemistry 35,13072-13080 или в ЕР 725145.In vitro covalent conjugation of glycosides with amino acid residues of IFNG polypeptides can be used to modify or increase the number or profile of carbohydrate substituents. Depending on the conjugation method, sugar / sugars can be attached to: a) arginine and histidine, b) free carboxyl groups, c) free sulfhydryl groups such as cysteine groups, d) free carboxyl groups such as serine, threonine, tyrosine or hydroxyproline groups, e) aromatic residues such as phenylalanine or tryptophan residues, f) the glutamine amide group. These amino acid residues represent examples of linking groups for sugar residues that can be introduced into and / or removed from the IFNG polypeptide. Suitable in vitro conjugation methods are described, for example, in WO 87/05330 and in Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306, 1981. In vitro attachment of sugar or PEG residues to Gin protein or peptide residues can also be carried out using transglutaminases (Tgases), for example, as described by Sato et al., 1996, Biochemistry 35.13072- 13080 or in EP 725145.
Конъюгирование с органическим модифицирующим агентомConjugation with an Organic Modifying Agent
Ковалентная модификация варианта полипептида IFNG может осуществляться путем реакции одной или нескольких связующих групп варианта полипептида с органическим модифицирующим агентом. Соответствующие реагенты и методы хорошо известны в этой области. Например, остатки цистеинила чаще всего подвергают реакции с α-галоацетатами (и соответствующими аминами) типа хлоруксусной кислоты или хлорацетамида, получая карбоксиметильные или карбоксиамидометильные производные. Остатки цистеинила также модифицируют путем реакции с бромотрифторацетоном, α-бром-β-(4-имидазоил)-пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, n-хлормеркурибензоатом, 2-хлоромеркури-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом. Остатки гистидила модифицируют путем реакции с диэтилпирокарбонатом при pH 5,5-7,0, так как этот реагент относительно специфичен к боковой цепи гистидила. Применяется также пара-бромфенацилбромид, а реакцию предпочтительно проводят в 0,1 М какодилате натрия при pH 6,0. Остатки лизинила и концевые аминогруппы подвергают реакции с ангидридом янтарной или другой карбоновой кислоты. Модификация с помощью таких реагентов вызывает обращение заряда остатков лизинила. Другие подходящие реагенты для модификации содержащих α-аминогруппу остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлороборгидрид, тринитробензолсульфоновую кислоту, О-метилизомочевину, 2,4-пентандион, а также катализируемую трансаминазами реакцию с глиоксилатом. Остатки аргинила модифицируют путем реакции с одним или несколькими стандартными реагентами, в числе которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. При модификации остатков аргинина необходимо проводить реакцию в щелочных условиях из-за высокого значения рКа гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, эти реагенты могут реагировать с группами лизина, а также с гуанидиновой группировкой аргинина. Боковые карбоксильные группы (аспартила или глутамила) избирательно модифицируют при реакции с карбодиимидами (R-N=C=N-R′), где R и R′ - различные алкильные группы, такие как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, остатки аспартила и глутамила превращают в остатки аспарагинила и глутаминила реакцией с ионами аммония.Covalent modification of an IFNG polypeptide variant can be accomplished by reacting one or more linking groups of the polypeptide variant with an organic modifying agent. Suitable reagents and methods are well known in the art. For example, cysteinyl residues are most often reacted with α-haloacetates (and corresponding amines) such as chloroacetic acid or chloroacetamide to give carboxymethyl or carboxyamidomethyl derivatives. Cysteinyl residues are also modified by reaction with bromotrifluoroacetone, α-bromo-β- (4-imidazoyl) -propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkyl maleimides, 3-nitro-2-pyridyl disulfide, methyl-2-pyridyl disulfide, n-chloro-mermer chloromermer-4-nitrophenol or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole. The histidyl residues are modified by reaction with diethyl pyrocarbonate at a pH of 5.5-7.0, since this reagent is relatively specific for the side chain of histidyl. Para-bromophenacyl bromide is also used, and the reaction is preferably carried out in 0.1 M sodium cacodilate at pH 6.0. Residues of lysinyl and terminal amino groups are reacted with succinic or other carboxylic acid anhydride. Modification using such reagents causes a reversal of the charge of lysinyl residues. Other suitable reagents for modifying the α-amino group-containing residues include imido esters such as methyl picolinimidate, pyridoxalphosphate, pyridoxal, chloroborohydride, trinitrobenzenesulfonic acid, O-methylisourea, 2,4-pentanedione, as well as a transaminase-catalyzed reaction with glyoxylase. Arginyl residues are modified by reaction with one or more standard reagents, including phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione and ninhydrin. When modification of arginine residues is necessary to conduct the reaction in alkaline conditions because of the high pKa of the guanidine functional group. In addition, these reagents can react with lysine groups, as well as with the guanidine group of arginine. Lateral carboxyl groups (aspartyl or glutamyl) are selectively modified by reaction with carbodiimides (RN = C = NR ′), where R and R ′ are various alkyl groups such as 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinyl-4-ethyl) carbodiimide or 1-ethyl-3- (4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide. In addition, aspartyl and glutamyl residues are converted to asparaginyl and glutaminyl residues by reaction with ammonium ions.
Блокирование функционального сайтаFunctional site blocking
Были сообщения, что чрезмерная конъюгация с полимерами может привести к потере активности того полипептида, с которым конъюгирован полимер. Эту проблему можно устранить, к примеру, удалением связующих групп, находящихся в функциональном сайте, или блокированием функционального сайта перед конъюгацией. Такие стратегии составляют дальнейшие воплощения изобретения, причем первая стратегия была проиллюстрирована выше, например, путем удаления остатков лизина, находящихся вблизи от функционального сайта, и/или введения остатков цистеина и/или сайтов гликозилирования in vivo в положения, не мешающие функциональным сайтам.There have been reports that excessive conjugation with polymers can lead to loss of activity of the polypeptide with which the polymer is conjugated. This problem can be eliminated, for example, by removing the linking groups located in the functional site, or by blocking the functional site before conjugation. Such strategies constitute further embodiments of the invention, the first strategy being illustrated above, for example, by removing lysine residues close to the functional site and / or introducing cysteine residues and / or in vivo glycosylation sites at positions that do not interfere with the functional sites.
В частности, согласно второй стратегии конъюгация между вариантом полипептида и неполипептидным компонентом проводится в условиях, когда функциональный сайт варианта полипептида IFNG блокирован с помощью вспомогательной молекулы, способной к связыванию с функциональным сайтом варианта полипептида. Предпочтительно вспомогательная молекула является такой молекулой, которая специфически распознает функциональный сайт варианта полипептида, например, рецептором. С другой стороны, вспомогательная молекула может представлять собой антитело, в частности моноклональное антитело, распознающее вариант полипептида. В частности, вспомогательная молекула может представлять собой нейтрализующее моноклональное антитело.In particular, according to the second strategy, conjugation between a polypeptide variant and a non-polypeptide component is carried out under conditions when the functional site of the IFNG polypeptide variant is blocked by an auxiliary molecule capable of binding to the functional site of the polypeptide variant. Preferably, the auxiliary molecule is one that specifically recognizes the functional site of a variant polypeptide, for example, a receptor. Alternatively, the auxiliary molecule may be an antibody, in particular a monoclonal antibody that recognizes a variant polypeptide. In particular, the auxiliary molecule may be a neutralizing monoclonal antibody.
Вариант полипептида подвергают реакции со вспомогательной молекулой перед проведением конъюгации. Это обеспечивает экранирование или защиту функционального сайта варианта полипептида, который вследствие этого становится недоступным для реакции с неполипептидным компонентом типа полимера. После отделения от вспомогательной молекулы можно выделить конъюгат неполипептидного компонента и варианта полипептида с сохранившимся, по крайней мере частично, функциональным сайтом.A variant of the polypeptide is reacted with an auxiliary molecule before conjugation. This provides shielding or protection of the functional site of the variant polypeptide, which therefore becomes inaccessible for reaction with a non-polypeptide component such as a polymer. After separation from the auxiliary molecule, a conjugate of a non-polypeptide component and a variant of a polypeptide with a preserved, at least partially functional site, can be isolated.
Последующая конъюгация варианта полипептида с заблокированным функциональным сайтом с полимером, липофильным соединением, остатком сахара, органическим модифицирующим агентом или любым другим соединением проводится обычным образом, например, как описано выше в разделах, озаглавленных "Конъюгирование с...".Subsequent conjugation of a variant polypeptide with a blocked functional site with a polymer, lipophilic compound, sugar residue, organic modifying agent or any other compound is carried out in the usual manner, for example, as described above in the sections entitled "Conjugation with ...".
В следующем воплощении вспомогательные молекулы сначала ковалентно пришивают к твердой фазе типа носителей для колоночной хроматографии, например, шарикам Сефадекса или агарозы, или к поверхности, например, реакционного сосуда. После этого вариант полипептида наносят на колонку со вспомогательной молекулой и проводят конъюгацию в соответствии с методами, известными в этой области, например, как описано выше в разделах, озаглавленных "Конъюгирование с...". Эта процедура позволяет отделять конъюгированный вариант полипептида от вспомогательной молекулы путем элюирования. Конъюгированный вариант полипептида элюируют стандартными методами в таких физико-химических условиях, которые не приводят к существенной деградации конъюгированного варианта полипептида. Жидкую фазу, содержащую конъюгированный вариант полипептида, отделяют от твердой фазы, с которой вспомогательные молекулы остаются ковалентно связанными. Разделение может осуществляться и другими способами. Так, вспомогательные молекулы можно подвергнуть реакции со второй молекулой (например, биотином), которая распознается специфически связывающимся с ней веществом (например, стрептавидином). Специфически связывающееся вещество можно пришить к твердой фазе, что позволит отделить конъюгированный вариант полипептида от комплекса вспомогательная молекула-вторая молекула при пропускании через колонку со второй вспомогательной молекулой на твердой фазе, на которой при последующей элюции будет удерживаться комплекс вспомогательная молекула-вторая молекула, но не конъюгированный вариант полипептида. Конъюгированный вариант полипептида можно отделить от вспомогательной молекулы любым подходящим способом. Деблокирование может осуществляться обеспечением условий, в которых вспомогательная молекула диссоциирует из функционального сайта варианта полипептида, с которым она связана. Например, комплекс между антителом, с которым конъюгирован полимер, и антиидиотипическим антителом можно диссоциировать путем изменения pH в сторону кислых или щелочных значений.In a further embodiment, the auxiliary molecules are first covalently attached to a solid phase, such as column chromatography support, for example Sephadex or agarose beads, or to the surface of, for example, a reaction vessel. After that, a variant of the polypeptide is applied to a column with an auxiliary molecule and conjugation is carried out in accordance with methods known in this field, for example, as described above in the sections entitled "Conjugation with ...". This procedure allows you to separate the conjugated version of the polypeptide from the auxiliary molecule by elution. The conjugated variant of the polypeptide is eluted by standard methods under such physicochemical conditions that do not lead to significant degradation of the conjugated variant of the polypeptide. The liquid phase containing the conjugated variant of the polypeptide is separated from the solid phase with which the auxiliary molecules remain covalently bound. Separation can be carried out in other ways. So, auxiliary molecules can be reacted with a second molecule (for example, biotin), which is recognized by a substance that specifically binds to it (for example, streptavidin). A specifically binding substance can be attached to the solid phase, which will allow to separate the conjugated version of the polypeptide from the auxiliary molecule-second molecule complex by passing through the column with the second auxiliary molecule on the solid phase, on which the auxiliary molecule-second molecule complex will be retained, but not conjugated version of the polypeptide. The conjugated variant of the polypeptide can be separated from the auxiliary molecule by any suitable method. The release can be carried out by providing conditions in which the auxiliary molecule dissociates from the functional site of the variant polypeptide with which it is associated. For example, the complex between the antibody with which the polymer is conjugated and the anti-idiotypic antibody can be dissociated by changing the pH to acidic or alkaline values.
Конъюгация несущего метку варианта полипептидаConjugation of a Labeled Polypeptide Variant
В альтернативном воплощении вариант полипептида IFNG экспрессируется в виде слитого с меткой белка, то есть с аминокислотной последовательностью или отрезком пептида, как правило состоящим из 1-30, например, 1-20 аминокислотных остатков. Помимо того, что метка дает возможность быстрой и легкой очистки, она является удобным инструментом для осуществления конъюгации между несущим метку вариантом полипептида IFNG и неполипептидным компонентом. В частности, метка может применяться для осуществления конъюгации в микропланшетах или на носителях типа магнитных шариков, на которых несущий метку полипептид можно иммобилизовать через метку. Конъюгация несущего метку варианта полипептида IFNG, например, в микропланшетах имеет то преимущество, что несущий метку вариант полипептида может быть иммобилизован в микропланшетах прямо из культуральной жидкости (в принципе, без какой-либо очистки) и подвергнут конъюгации. При этом уменьшается общее число стадий процесса (от экспрессии до конъюгации). Кроме того, метка может функционировать в качестве молекулы спейсера, обеспечивая лучший доступ к иммобилизованному варианту полипептида при конъюгации. Несущий метку вариант полипептида можно конъюгировать с любым из описанных здесь неполипептидных компонентов, например, с молекулой полимера типа PEG.In an alternative embodiment, the IFNG polypeptide variant is expressed as a fusion protein with a label, i.e. with an amino acid sequence or a fragment of a peptide, typically consisting of 1-30, for example, 1-20 amino acid residues. Besides the fact that the label allows quick and easy cleaning, it is a convenient tool for conjugation between the label-bearing variant of the IFNG polypeptide and the non-polypeptide component. In particular, the label can be used to conjugate in microplates or on media such as magnetic beads on which the label-bearing polypeptide can be immobilized through the label. The conjugation of the label-bearing variant of the IFNG polypeptide, for example, in microplates, has the advantage that the label-bearing variant of the polypeptide can be immobilized in the microplates directly from the culture fluid (in principle, without any purification) and conjugated. This reduces the total number of stages of the process (from expression to conjugation). In addition, the label can function as a spacer molecule, providing better access to the immobilized variant of the polypeptide during conjugation. A labeled version of the polypeptide can be conjugated to any of the non-polypeptide components described herein, for example, a PEG type polymer molecule.
Природа конкретной используемой метки не является критической, если только метка способна экспрессироваться вместе с вариантом полипептида и способна иммобилизоваться на подходящей поверхности или носителе. Целый ряд таких меток доступны коммерчески, например, у фирмы Unizyme Laboratories, Дания. Например, метка может представлять собой любую из следующих последовательностей:The nature of the particular label used is not critical, as long as the label is able to be expressed with a variant polypeptide and is capable of immobilizing on a suitable surface or carrier. A number of such tags are commercially available, for example, from Unizyme Laboratories, Denmark. For example, a label may be any of the following sequences:
His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO:35),His-His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO: 35),
Met-Lys-His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO:36),Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO: 36),
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His (SEQ ID NO:37),Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His (SEQ ID NO: 37),
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln (SEQ ID NO:38),Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln (SEQ ID NO: 38),
(все от фирмы Unizyme Laboratories, Дания)(all from Unizyme Laboratories, Denmark)
или любую из следующих:or any of the following:
EQKLISEEDL (SEQ ID NO:39) (С-концевая метка, описанная в Mol. Cell. Biol. 5: 3610-16, 1985),EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 39) (C-terminal label described in Mol. Cell. Biol. 5: 3610-16, 1985),
DYKDDDDK(SEQ ID NO:40) (С- или N-концевая метка),DYKDDDDK (SEQ ID NO: 40) (C- or N-terminal label),
YPYDVPDYA (SEQ ID NO:41).YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 41).
Антитела к вышеуказанным меткам коммерчески доступны, например, от фирм ADI, Aves Lab и Research Diagnostics.Antibodies to the above labels are commercially available, for example, from ADI, Aves Lab and Research Diagnostics.
Последующее отщепление метки от полипептида может осуществляться с помощью коммерчески доступных ферментов.Subsequent cleavage of the label from the polypeptide can be carried out using commercially available enzymes.
Способы получения варианта полипептида IFNG по изобретениюMethods for producing an IFNG variant polypeptide of the invention
Вариант полипептида IFNG можно получить любым подходящим способом, известным в этой области. Такие способы включают конструирование нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида, и экспрессирование этой последовательности в соответствующем трансформированном или трансфицированном хозяине. Однако варианты полипептида по изобретению могут быть получены, хотя и с меньшей эффективностью, путем химического синтеза или комбинации химического синтеза и технологии рекомбинантной ДНК.A variant of the IFNG polypeptide can be obtained by any suitable method known in this field. Such methods include constructing a nucleotide sequence encoding a variant of a polypeptide, and expressing the sequence in an appropriate transformed or transfected host. However, variants of the polypeptide according to the invention can be obtained, albeit with less efficiency, by chemical synthesis or a combination of chemical synthesis and recombinant DNA technology.
Нуклеотидная последовательность по изобретению, кодирующая вариант полипептида IFNG (мономера или одноцепочечной формы), может быть сконструирована путем выделения или синтеза нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный IFNG, например, huIFNG с аминокислотной последовательностью SEQ ID No.17 или его фрагмент, с последующим изменением нуклеотидной последовательности так, чтобы обеспечить введение (то есть вставку или замену) или удаление (то есть делению или замену) соответствующего/их аминокислотного/ых остатка/ов.The nucleotide sequence of the invention encoding a variant of the IFNG polypeptide (monomer or single chain form) can be constructed by isolating or synthesizing a nucleotide sequence encoding the original IFNG, for example, huIFNG with the amino acid sequence of SEQ ID No.17 or a fragment thereof, followed by a change in the nucleotide sequence so as to provide for the introduction (i.e., insertion or replacement) or removal (i.e., division or replacement) of the corresponding amino acid residue (s).
Нуклеотидную последовательность удобно модифицировать методом направленного мутагенеза в соответствии со стандартными методами, например, см. Mark et al., "Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984), и US 4588585.The nucleotide sequence is conveniently modified by directed mutagenesis in accordance with standard methods, for example, see Mark et al., "Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984), and US 4,588,585.
В качестве альтернативы нуклеотидную последовательность можно получить химическим синтезом, например, с помощью синтезатора олигонуклеотидов, при этом олигонуклеотиды конструируют на основе аминокислотной последовательности желаемого варианта полипептида и предпочтительно выбирают кодоны, которым отдается предпочтение в тех клетках-хозяевах, которые будут вырабатывать рекомбинантный полипептид. Например, можно синтезировать несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих отдельные части желаемого варианта полипептида, и собрать их вместе с помощью ПЦР, лигирования или цепной реакции лигирования (LCR). Индивидуальные олигонуклеотиды, как правило, содержат выступающие 5′- или 3′-концы для комплементарной сборки.Alternatively, the nucleotide sequence can be obtained by chemical synthesis, for example, using an oligonucleotide synthesizer, the oligonucleotides being constructed based on the amino acid sequence of the desired polypeptide variant, and codons are preferred that are preferred in those host cells that will produce the recombinant polypeptide. For example, you can synthesize several small oligonucleotides encoding the individual parts of a desired variant polypeptide and assemble them together by PCR, ligation, or chain ligation reaction (LCR). Individual oligonucleotides typically contain protruding 5′- or 3′-ends for complementary assembly.
После сборки (путем синтеза, направленного мутагенеза или другим способом) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида, встраивают в рекомбинантный вектор и функционально связывают с контрольными последовательностями, необходимыми для экспрессии варианта полипептида IFNG в требуемых транформированных клетках-хозяевах.After assembly (by synthesis, directed mutagenesis, or another method), the nucleotide sequence encoding the polypeptide variant is inserted into the recombinant vector and functionally linked to the control sequences necessary for expression of the IFNG polypeptide variant in the desired transformed host cells.
Конечно, следует иметь в виду, что не все векторы и контролирующие экспрессию последовательности функционируют одинаково хорошо при экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей описанный вариант полипептида IFNG. Также не все клетки-хозяева функционируют одинаково хорошо с одной и той же экспрессионной системой. Однако специалист в этой области имеет возможность сделать выбор из этих векторов, контролирующих экспрессию последовательностей и клеток-хозяев без излишнего экспериментирования. Например, при выборе вектора следует учитывать клетку-хозяина, так как вектор должен реплицироваться в нем или быть способным встраиваться в хромосому. Следует также учитывать число копий вектора, способность контролировать это число копий и экспрессию любых других белков, кодируемых вектором, таких как антибиотические маркеры. При выборе контролирующей экспрессию последовательности также следует учитывать целый ряд факторов. К ним относятся, к примеру, относительная сила последовательности, ее контролируемость и совместимость с нуклеотидной последовательностью, кодирующей вариант полипептида, особенно в отношении возможных вторичных структур. Хозяев следует выбирать с учетом их совместимости с выбранным вектором, токсичности продукта, кодируемого нуклеотидной последовательностью, особенностей секреции, способности к правильной укладке полипептида, требований к ферментации и культивированию, а также легкости очистки продуктов, кодируемых нуклеотидной последовательностью.Of course, it should be borne in mind that not all vectors and expression control sequences function equally well when expressing a nucleotide sequence encoding the described variant of the IFNG polypeptide. Also, not all host cells function equally well with the same expression system. However, one skilled in the art can choose from these vectors that control the expression of sequences and host cells without undue experimentation. For example, when choosing a vector, the host cell should be considered, since the vector must replicate in it or be able to integrate into the chromosome. You should also consider the number of copies of the vector, the ability to control this number of copies, and the expression of any other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers. In choosing an expression control sequence, a number of factors should also be considered. These include, for example, the relative strength of the sequence, its controllability and compatibility with the nucleotide sequence encoding a variant of the polypeptide, especially with respect to possible secondary structures. Hosts should be selected taking into account their compatibility with the selected vector, the toxicity of the product encoded by the nucleotide sequence, the characteristics of secretion, the ability to properly fold the polypeptide, the requirements for fermentation and cultivation, and the ease of cleaning products encoded by the nucleotide sequence.
Рекомбинантный вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, то есть вектором, существующим в виде внехромосомной единицы, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, представляя собой, к примеру, плазмиду. В качестве альтернативы вектором может быть такой вектор, который при введении в клетку хозяина встраивается в ее геном и реплицируется вместе с хромосомой/ами, в которую/ые он встроился.The recombinant vector can be an autonomously replicating vector, that is, a vector existing as an extrachromosomal unit, the replication of which is independent of chromosomal replication, representing, for example, a plasmid. Alternatively, the vector can be a vector that, when introduced into a host cell, integrates into its genome and replicates along with the chromosome (s) into which it is embedded.
Вектором предпочтительно служит экспрессионный вектор, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант полипептида IFNG, функционально связана с дополнительными сегментами, необходимыми для транскрипции этой нуклеотидной последовательности. Как правило, вектор происходит из плазмиды или вирусной ДНК. Целый ряд экспрессионных векторов, подходящих для экспрессии в указанных клетках, коммерчески доступны или описаны в литературе. К числу полезных экспрессионных векторов для эукариотических клеток относятся векторы, содержащие контролирующие экспрессию последовательности из SV40, вируса бычьей папилломы, аденовируса и цитомегаловируса. Конкретно, такими векторами являются, к примеру, pCDNA3.1(+)/Hyg (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA) и pCI-Neo (Stratagene, La Jolla, CA, USA). К числу полезных экспрессионных векторов для бактериальных клеток относятся известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из Е.coli, включая pBR322, рЕТ3а и рЕТ12а (оба фирмы Novagen Inc., WI, USA), плазмиды для более широкого круга хозяев типа RP4, фаговые ДНК, например, многочисленные производные фага лямбда типа NM989 и других ДНК-содержащих фагов типа М13 и нитчатых фагов с одноцепочечной ДНК. К числу полезных экспрессионных векторов для дрожжевых клеток относятся плазмида 2(t и ее производные, вектор РОТ1 (US 4931373), вектор pJS037, описанный Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996, и pPICZ А, В или С (InVitrogen). К числу полезных векторов для клеток насекомых относятся pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells", Cell, 45, pp.685-98 (1986)), pBlueBac 4.5 и pMelbac (оба фирмы In Vitrogen).The vector is preferably an expression vector in which the nucleotide sequence encoding a variant of the IFNG polypeptide is operably linked to additional segments necessary for transcription of this nucleotide sequence. Typically, the vector is derived from a plasmid or viral DNA. A variety of expression vectors suitable for expression in these cells are commercially available or described in the literature. Useful expression vectors for eukaryotic cells include vectors containing expression control sequences from SV40, bovine papilloma virus, adenovirus and cytomegalovirus. Specifically, such vectors are, for example, pCDNA3.1 (+) / Hyg (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA) and pCI-Neo (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Useful expression vectors for bacterial cells include known bacterial plasmids, such as those from E. coli, including pBR322, pET3a and pET12a (both from Novagen Inc., WI, USA), plasmids for a wider range of RP4 host types, phage DNA for example, numerous derivatives of phage lambda type NM989 and other DNA-containing phages type M13 and filamentous phages with single-stranded DNA. Useful expression vectors for yeast cells include plasmid 2 (t and its derivatives, vector POT1 (US 4931373), vector pJS037 described by Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996, and pPICZ A, B or C (InVitrogen). Useful vectors for insect cells include pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells", Cell, 45 , pp. 685-98 (1986)), pBlueBac 4.5 and pMelbac (both from In Vitrogen).
Другие векторы для применения в настоящем изобретении включают векторы, позволяющие амплифицировать число копий нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида IFNG. Такие амплификационные векторы хорошо известны в этой области. Так, к ним относятся векторы, способные амплифицироваться путем DHFR-амплификации (например, см. Kaufman, U.S.Pat. No.4470461, Kaufinan and Sharp, "Construction of a Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression", Mol. Cell. BioL, 2, pp. 1304-19 (1982) и глутаминсинтетазной амплификации ("CS"-амплификации) (например, см. US 5122464 и ЕР 338841).Other vectors for use in the present invention include vectors that amplify the number of copies of the nucleotide sequence encoding a variant of the IFNG polypeptide. Such amplification vectors are well known in the art. So, these include vectors that can amplify by DHFR amplification (for example, see Kaufman, USPat. No.4470461, Kaufinan and Sharp, "Construction of a Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression", Mol. Cell. BioL, 2, pp. 1304-19 (1982) and glutamine synthetase amplification ("CS" amplification) (e.g. see US 5122464 and EP 338841).
Рекомбинантный вектор также может дополнительно содержать и последовательность ДНК, дающую вектору способность реплицироваться в данных клетках-хозяевах. Примером такой последовательности (когда клетка-хозяин представлена клеткой млекопитающего) является ориджин репликации (origin) SV40. Когда клетка-хозяин представлена клеткой дрожжей, то подходящими последовательностями, дающими вектору способность к репликации, являются гены репликации REP 1-3 и ориджин репликации дрожжевой плазмиды 2μ.The recombinant vector may also optionally contain a DNA sequence that gives the vector the ability to replicate in these host cells. An example of such a sequence (when the host cell is a mammalian cell) is the origin of SV40 replication. When the host cell is represented by a yeast cell, the replication genes REP 1-3 and the origin of replication of the yeast plasmid 2μ are suitable sequences giving the vector the ability to replicate.
Вектор также может содержать и селективный маркер, скажем, ген, продукт которого комплементирует дефект в клетке-хозяине, например, ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (DHFR), или ген TPI Schizosaccharomyces pombe (описаны в P.R.Russel, Gene 40, 1985, pp.125-130), либо ген, придающий устойчивость к лекарственному препарату - ампициллину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу, неомицину, гигромицину или метотрексату. К селективным маркерам для нитчатых грибов относятся amdS, pyrG, arcB, niaD и sC.The vector may also contain a selective marker, say, a gene whose product complements the defect in the host cell, for example, the gene encoding dihydrofolate reductase (DHFR), or the TPI gene Schizosaccharomyces pombe (described in PRRussel,
Термин "контролирующая последовательность" в настоящем изобретении относится ко всем компонентам, необходимым или полезным для экспрессии варианта полипептида IFNG. Каждая контролирующая последовательность может быть природной или чужеродной для последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида. К таким контролирующим последовательностям относятся лидерные последовательности, последовательности полиаденилирования, последовательности пропептидов, промоторы, энхансеры или вышерасположенные (upstream) активирующие последовательности, последовательности сигнальных пептидов и терминаторы транскрипции, но не ограничиваются ими. Как минимум, контролирующая последовательность включает промотор.The term "control sequence" in the present invention refers to all components necessary or useful for expression of a variant IFNG polypeptide. Each control sequence may be natural or foreign to a nucleic acid sequence encoding a variant polypeptide. Such control sequences include, but are not limited to, leader sequences, polyadenylation sequences, propeptide sequences, promoters, enhancers, or upstream activating sequences, signal peptide sequences, and transcription terminators. At a minimum, the control sequence includes a promoter.
В настоящем изобретении может применяться широкий набор контролирующих последовательностей экспрессии. К таким полезным последовательностям относятся контролирующие экспрессию последовательности, связанные со структурными генами вышеописанных экспрессионных векторов, а также любые последовательности, которые известны как контролирующие экспрессию генов прокариотических и эукариотических клеток или их вирусов, а также различные их сочетания.A wide variety of expression control sequences may be used in the present invention. Such useful sequences include expression control sequences associated with the structural genes of the above expression vectors, as well as any sequences that are known as expression control genes of prokaryotic and eukaryotic cells or their viruses, as well as various combinations thereof.
Примеры подходящих контролирующих последовательностей, управляющих транскрипцией в клетках млекопитающих, включают ранние и поздние промоторы SV40 и аденовирусов, например, основной поздний промотор аденовируса 2, промотор МТ-1 (гена металлотионеина), промотор немедленноранних генов цитомегаловируса человека (CMV), промотор фактора элонгации человека 1α (EF-1α), минимальный промотор белка теплового шока 70 Drosophila, промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промотор убиквитина С (UbC) человека, терминатор гормона роста человека, сигналы полиаденилирования SV40 или области Elb аденовирусов и консенсусные последовательности Козака (Kozak M., J. Mol. Biol. 1987, Aug. 20, 196 (4): 947-50).Examples of suitable transcriptional control sequences for mammalian cells include the early and late promoters of SV40 and adenoviruses, for example, the main late promoter of
Для того чтобы усилить экспрессию в клетках млекопитающих, можно встроить синтетический интрон в 5′-нетраслируемый участок нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида IFNG. Пример синтетического интрона представлен искусственным интроном из плазмиды pCI-Neo (фирмы Promega Corporation, WI, USA).In order to enhance expression in mammalian cells, a synthetic intron can be inserted into a 5′-untranslated region of the nucleotide sequence encoding a variant of the IFNG polypeptide. An example of a synthetic intron is represented by an artificial intron from the pCI-Neo plasmid (Promega Corporation, WI, USA).
Примеры подходящих контролирующих последовательностей, управляющих транскрипцией в клетках насекомых, включают промотор полиэдрина, промотор Р10, промотор основного белка вируса полиэдроза Autographa califomica, промотор немедленно-раннего гена 1 бакуловируса, промотор задержанно-раннего гена 39К бакуловируса и последовательность полиаденилирования SV40.Examples of suitable transcriptional control sequences for insect cells include the polyhedrin promoter, the P10 promoter, the Autographa califomica polyhedrosis virus main protein promoter, the baculovirus immediate-1 gene promoter, the baculovirus delayed-early gene promoter 39K, and the SV40 polyadenylation sequence.
Примеры подходящих контролирующих последовательностей для дрожжевых клеток включают промоторы α-системы спаривания дрожжей, промотор дрожжевой триозофосфатизомеразы (TPI), промоторы гликолитических генов или генов алкогольдегидрогеназы дрожжей, промотор ADH2-4c и индуцибельный промотор GAL.Examples of suitable control sequences for yeast cells include the promoters of the α-yeast pairing system, the yeast triosophosphatisomerase (TPI) promoter, the promoters of glycolytic or yeast alcohol dehydrogenase genes, the ADH2-4c promoter, and the inducible GAL promoter.
Примеры подходящих контролирующих последовательностей для клеток-хозяев нитчатых грибов включают промотор и терминатор ADH3, промоторы из генов, кодирующих ТАКА-амилазу, триозофосфатизомеразу или щелочную протеазу Aspergillus oryzae, α-амилазу A. niger, глюкоамилазу A. niger или A. nidulans, ацетамидазу A. nidulans, аспартатную протеиназу или липазу Rhizomucor miehei, терминатор ТРI1 и терминатор ADH3.Examples of suitable control sequences for filamentous host cells include the ADH3 promoter and terminator, promoters from genes encoding TAKA amylase, triosophosphatisomerase or alkaline protease Aspergillus oryzae, A. niger α-amylase, A. niger glucose amylase or A. nidulans, acetamidase nidulans, aspartic proteinase or Rhizomucor miehei lipase, TPI1 terminator and ADH3 terminator.
Примеры подходящих контрольных последовательностей для бактериальных клеток-хозяев включают промоторы системы lac, системы trp, системы ТАС или TRC и основные промоторные участки фага λ.Examples of suitable control sequences for bacterial host cells include lac system promoters, trp systems, TAC or TRC systems, and the main promoter regions of phage λ.
Нуклеотидная последовательность по изобретению, получена ли она путем направленного мутагенеза, синтеза или другим методом, может необязательно включать нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид. Сигнальный пептид имеется в случае, когда полипептид должен секретироваться из клеток, в которых он экспрессируется. Такой сигнальный пептид, если он есть, должен быть узнаваемым клетками, выбранными для экспрессии варианта полипептида. Сигнальный пептид может быть гомологичным (то есть в норме связанным с huIFNG) или гетерологичным (то есть происходить из другого источника, чем huIFNG) полипептиду, или может быть гомологичным или гетерологичным клетке-хозяину, то есть либо представлять собой сигнальный пептид, который в норме экспрессируется в клетке-хозяине, либо в норме не экспрессируется в клетке-хозяине. Соответственно, сигнальный пептид может быть прокариотическим, например, из таких бактерий, как Е.coli, или эукариотическим, к примеру, из клеток млекопитающих, насекомых или дрожжей.The nucleotide sequence of the invention, whether obtained by targeted mutagenesis, synthesis, or another method, may optionally include a nucleotide sequence encoding a signal peptide. A signal peptide is present when the polypeptide must be secreted from the cells in which it is expressed. Such a signal peptide, if any, should be recognizable by cells selected for expression of the polypeptide variant. The signal peptide may be homologous (i.e., normally linked to huIFNG) or heterologous (i.e., come from a different source than huIFNG) to the polypeptide, or it may be homologous or heterologous to the host cell, i.e., either be a signal peptide that is normal expressed in the host cell, or normally not expressed in the host cell. Accordingly, the signal peptide can be prokaryotic, for example, from bacteria such as E. coli, or eukaryotic, for example, from mammalian, insect or yeast cells.
Присутствие или отсутствие сигнального пептида зависит от экспрессирующей клетки-хозяина, используемой для получения варианта полипептида, подлежащего экспрессии белка (является он внутриклеточным или внеклеточным белком) и того, желательна ли его секреция. Для нитчатых грибов сигнальный пептид можно легко получить из гена, кодирующего амилазу или глюкоамилазу Aspergillus sp., из гена, кодирующего липазу или протеазу Rhizomucor miehei или липазу Humicola lanuginosa. Сигнальный пептид предпочтительно получают из гена, кодирующего ТАКА-амилазу А.oryzae, нейтральную α-амилазу A.niger, кислотоустойчивую амилазу A.niger или глюкоамилазу А.niger. Для клеток насекомых сигнальный пептид можно легко получить из таких генов насекомых (см. WO 90/05783), как предшественник адипокинетического гормона бабочки Manduca sexta (см. US 5023328), мелиттин пчел (In Vitrogen), UDP-глюкозилтрансфераза экдистероидов (egt) (Murphy et al., Protein Expression and Purification 4, 349-357 (1993) или панкреатическая липаза человека (hpl) (Methods in Enzymology 284, pp.262-272, 1997).The presence or absence of a signal peptide depends on the expressing host cell used to produce the variant polypeptide to be expressed (it is an intracellular or extracellular protein) and whether secretion is desired. For filamentous fungi, the signal peptide can be easily obtained from the gene encoding Aspergillus sp. Amylase or glucoamylase, from the gene encoding the Rhizomucor miehei lipase or protease or Humicola lanuginosa lipase. The signal peptide is preferably derived from a gene encoding A.oryzae TAKA amylase, A.niger neutral α-amylase, A.niger acid-resistant amylase, or A.niger glucoamylase. For insect cells, a signal peptide can be easily obtained from insect genes (see WO 90/05783) such as the precursor of the adipokinetic hormone Butterfly Manduca sexta (see US 5023328), bee melittin (In Vitrogen), ecdysteroid UDP-glucosyl transferase (egt) ( Murphy et al., Protein Expression and
Предпочтительным сигнальным пептидом для клеток млекопитающих является таковой huTFNG или сигнальный пептид легкой цепи каппа Ig мышей (Coloma M. (1992) J.Imm. Methods 152: 89-104). Для дрожжевых клеток подходящим сигнальным пептидом оказался сигнальный пептид α-фактора S. cerevisiae (см. US 4870008), сигнальный пептид амилазы слюны мышей (см. О.Hagen buchle et. al., Nature 289, 1981, pp.643-646), модифицированный сигнальный пептид карбоксипептидазы (см. L.A.Vails et al., Cell 48, 1987, pp.887-897), сигнальный пептид BAR1 дрожжей (см. WO 87/02670), сигнальный пептид аспартатной протеазы-3 (YAP3) дрожжей (см. M.Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp.127-137).A preferred mammalian cell signal peptide is that of huTFNG or mouse Kappa light chain signal peptide (Coloma M. (1992) J. Imm. Methods 152: 89-104). For yeast cells, the signal peptide of S. cerevisiae α-factor was found to be a suitable signal peptide (see US 4870008), mouse saliva amylase signal peptide (see O. Hagen buchle et. Al., Nature 289, 1981, pp.643-646) , a modified signal peptide of carboxypeptidase (see LAVails et al.,
Для получения варианта полипептида IFNG можно использовать любого подходящего хозяина, включая бактерии, грибы (включая дрожжи), растения, насекомых, млекопитающих, или другие подходящие клетки или клеточные линии животных, а также трансгенных животных или растений. Примеры бактериальных клеток-хозяев включают такие грам-положительные бактерии, как штаммы Bacillus, к примеру, В.brevis или В.subtilis, или Streptomyces, или такие грам-отрицательные бактерии, как штаммы Е.coli или Pseudomonas. Введение вектора в бактериальные клетки может осуществляться, к примеру, путем трансформации протопластов (например, см. Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), с помощью компетентных клеток (например, см. Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221), электропорации (например, см. Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) или конъюгации (например, см. Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).Any suitable host can be used to produce the IFNG polypeptide variant, including bacteria, fungi (including yeast), plants, insects, mammals, or other suitable cells or cell lines of animals, as well as transgenic animals or plants. Examples of bacterial host cells include gram-positive bacteria such as Bacillus strains, for example B. brevis or B. subtilis, or Streptomyces, or gram-negative bacteria such as E. coli or Pseudomonas strains. The vector can be introduced into bacterial cells, for example, by transforming protoplasts (e.g. see Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), using competent cells (e.g., see Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporation (e.g. see Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) or conjugation ( for example, see Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).
Примеры подходящих клеток нитчатых грибов включают штаммы Aspergillus, например A.oryzae, А.niger или A.nidulans, Fusarium или Trichoderma. Клетки грибов можно трансформировать способом, включающим образование протопластов, трансформацию протопластов и регенерацию клеточной стенки известными методами. Подходящие способы трансформации клеток Aspergillus описаны в ЕР 238 021 и US 5679543. Подходящие способы трансформации штаммов Fusarium описаны Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, и WO 96/00787. Дрожжи можно трансформировать способами, описанными Becker and Guarente, In: Abelson J.N. and Simon M.I., editors. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp.182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.Examples of suitable filamentous fungal cells include Aspergillus strains, for example A.oryzae, A.niger or A.nidulans, Fusarium or Trichoderma. Fungal cells can be transformed by a method including the formation of protoplasts, transformation of protoplasts and regeneration of the cell wall by known methods. Suitable methods for transforming Aspergillus cells are described in EP 238 021 and US 5679543. Suitable methods for transforming Fusarium strains are described by Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, and WO 96/00787. Yeast can be transformed by the methods described by Becker and Guarente, In: Abelson J.N. and Simon M.I., editors. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.
Примеры подходящих дрожжевых клеток включают штаммы Saccharomyces, например, S.cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, как Р.pastoris или Р.methanolica, Hansenula, как H.polymorpha, или Yarrowia. Методы трансформации дрожжевых клеток гетерологичной ДНК и получения из них гетерологичных полипептидов раскрыты фирмой Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA (в методических рекомендациях для продукта Yeastmaker™ Yeast Transformation System Kit), и Reeves et al., FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198; Manivasakam and Schiesti, Nucleic Acids Research, 1993, Vol.21, No.18, pp.4414-4415; Ganeva et al., FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164.Examples of suitable yeast cells include strains of Saccharomyces, for example S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, like P. pastoris or P. methanolica, Hansenula, like H. polymorpha, or Yarrowia. Methods for transforming yeast cells of heterologous DNA and preparing heterologous polypeptides from them are disclosed by Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA (in the guidelines for Yeastmaker ™ Yeast Transformation System Kit), and Reeves et al., FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198; Manivasakam and Schiesti, Nucleic Acids Research, 1993, Vol.21, No.18, pp. 4414-4415; Ganeva et al., FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164.
Примеры подходящих клеток насекомых включают клеточные линии бабочек, таких как Spodoptera frugiperda (Sf9 или Sf21), или клетки Trichoplusia ni (High Five) (US 5,077,214). Трансформация клеток насекомых и продукция в них гетерологичных полипептидов может проводиться как описано In Vitrogen.Examples of suitable insect cells include butterfly cell lines, such as Spodoptera frugiperda (Sf9 or Sf21), or Trichoplusia ni (High Five) cells (US 5,077,214). Transformation of insect cells and production of heterologous polypeptides therein can be carried out as described in vitrogen.
Примеры подходящих клеток млекопитающих включают клеточные линии из яичников китайского хомячка (СНО), например, СНО-К1 (АТСС CCL-61); клеточные линии зеленой мартышки (COS), например, COS 1 (АТСС CRL-1650), COS 7 (АТСС CRL-1651); клетки мышей (например, NS/O); клеточные линии из почек новорожденных хомячков (ВНК), например, АТСС CRL-1632 или АТСС CCL-10, и клетки человека, например, НЕК 293 (АТСС CRL-1573), а также клетки растений в культуре ткани. В этой области известны и другие подходящие клеточные линии из таких общедоступных депозитариев, как American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Кроме того, клетки млекопитающих, к примеру, клетки СНО, можно модифицировать таким образом, чтобы они экспрессировали сиалилтрансферазу, например, 1,6-сиалилтрансферазу, как описано в US 5,047,335, чтобы обеспечить улучшенное гликозилирование варианта полипептида IFNG.Examples of suitable mammalian cells include Chinese Hamster Ovary (CHO) cell lines, for example CHO-K1 (ATCC CCL-61); green monkey cell lines (COS), for example, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651); mouse cells (e.g., NS / O); cell lines from the kidneys of newborn hamsters (KSS), for example, ATCC CRL-1632 or ATCC CCL-10, and human cells, for example, HEK 293 (ATCC CRL-1573), as well as plant cells in tissue culture. Other suitable cell lines from such commonly available depositories as the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland are also known in the art. In addition, mammalian cells, for example CHO cells, can be modified to express sialyl transferase, for example, 1,6-sialyl transferase, as described in US 5,047,335, to provide improved glycosylation of the IFNG polypeptide variant.
Методы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих включают трансфекцию с помощью фосфата кальция, электропорацию, трансфекцию с помощью DEAE-декстрана, трансфекцию с помощью липосом, вирусные векторы и метод трансфекции с помощью Lipofectamine 2000, описанный Life Technologies Ltd, Paisley, UK. Эти методы хорошо известны в данной области и описаны, к примеру, в Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA. Культивирование клеток млекопитающих проводят согласно общепринятым методам, например, как описано в Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USA, и Harrison MA and Rae IF, General Technologies of Cell Culture, Cambridge University Press, 1997.Methods for introducing exogenous DNA into mammalian host cells include calcium phosphate transfection, electroporation, DEAE-dextran transfection, liposome transfection, viral vectors, and
Для того чтобы получить гликозилированный полипептид, используют эукариотические клетки типа тех, что указаны выше.In order to obtain a glycosylated polypeptide, eukaryotic cells such as those described above are used.
В способах получения по настоящему изобретению клетки культивируют в питательной среде, пригодной для продукции варианта полипептида способами, известными в этой области. Например, клетки можно культивировать в колбах со встряхиванием либо в лабораторных или промышленных ферментерах на большие или малые объемы (включая непрерывную, периодическую, периодическую с подпиткой или ферментацию или ферментацию на твердых средах), в соответствующей среде и в условиях, способствующих экспрессии и/или выделению варианта полипептида. Культивирование проводят в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, применяя методы, известные в этой области. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть приготовлены согласно опубликованным составам (например, в каталогах American Type Culture Collection). Если вариант полипептида секретируется в питательную среду, его можно извлечь прямо из этой среды. Если вариант полипептида не секретируется, его можно извлечь из клеточных лизатов.In the preparation methods of the present invention, cells are cultured in a growth medium suitable for producing a variant polypeptide by methods known in the art. For example, cells can be cultured in flasks with shaking or in laboratory or industrial fermenters for large or small volumes (including continuous, batch, batch fed or fermentation or fermentation on solid media), in an appropriate medium and under conditions conducive to expression and / or the selection of a variant polypeptide. The cultivation is carried out in a suitable nutrient medium containing sources of carbon and nitrogen and inorganic salts, using methods known in this field. Suitable media are available from commercial suppliers or may be prepared according to published formulations (e.g., in the American Type Culture Collection catalogs). If a variant polypeptide is secreted into the culture medium, it can be extracted directly from this medium. If the variant polypeptide is not secreted, it can be extracted from cell lysates.
Полученный вариант полипептида может быть извлечен способами, известными в этой области. Так, вариант полипептида может быть извлечен из питательной среды стандартными методами, которые включают центрифугирование, фильтрование, экстракцию, распылительную сушку, упаривание или осаждение, но не ограничиваются ими.The resulting version of the polypeptide can be extracted by methods known in this field. Thus, a variant of the polypeptide can be extracted from the culture medium by standard methods, which include, but are not limited to, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation or precipitation.
Варианты полипептида могут быть очищены при помощи ряда методов, известных в этой области, включая хроматографию (например, ионообменную хроматографию, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирование и эксклюзионную), электрофоретические методы (например, препаративное изофокусирование), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония), ВЭЖХ или экстракцию (например, см. Protein Purification, J. - C.Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989), но не ограничиваясь ими. Специфические методы очистки полипептидов, обладающих активностью IFNG, раскрыты в ЕР 0110044 и Japanese patent application No.186995/84, не законченную в производстве.Polypeptide variants can be purified using a variety of methods known in the art, including chromatography (e.g., ion exchange chromatography, affinity, hydrophobic, chromatofocusing and exclusion), electrophoretic methods (e.g. preparative isofocusing), differential solubility (e.g., ammonium sulfate precipitation) HPLC or extraction (e.g., see, but not limited to, Protein Purification, J. - C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York). Specific methods for purifying polypeptides with IFNG activity are disclosed in EP 0110044 and Japanese patent application No.186995 / 84, not finished in production.
Биологическую активность варианта полипептида IFNG можно определить любым удобным методом, известным в этой области. К таким методам относятся нейтрализация антителами антивирусной активности, индукция протеинкиназной, олигоаденилат-2,5-А-синтетазной или фосфодиэстеразной активностей, как описано в ЕР 0041313 В1. К таким методам анализа также относятся иммуномодуляторные методы (например, см. US 4753795), анализ ингибирования роста и измерение связывания с клетками, экспрессирующими рецепторы интерферона. Конкретные методы описаны в разделе описания Материалы и Методы.The biological activity of an IFNG polypeptide variant can be determined by any convenient method known in the art. Such methods include neutralization by antibodies of antiviral activity, induction of protein kinase, oligoadenylate-2,5-A synthetase or phosphodiesterase activity, as described in EP 0041313 B1. Such assay methods also include immunomodulatory methods (e.g., see US 4,753,795), growth inhibition assays, and measurement of binding to cells expressing interferon receptors. Specific methods are described in the section on Materials and Methods.
Фармацевтические композиции и их применениеPharmaceutical compositions and their use
Кроме того, настоящее изобретение касается улучшенных способов лечения или профилактики, в частности, воспалительных заболеваний, например, интерстициальных легочных заболеваний, таких как идиопатический фиброз легких, а также грануломатозных заболеваний; рака, в частности рака яичников; инфекций, таких как атипичные легочные микобактериальные инфекции; костных заболеваний (нарушений метаболизма костной ткани типа злокачественного остеопетроза); аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит; а также других заболеваний, таких как туберкулез со множественной устойчивостью к лекарствам; криптококковый менингит; кистозный фиброз и фиброз печени, в частности вторичный фиброз печени после гепатита С; при этом способ включает введение нуждающемуся в этом млекопитающему, в частности человеку, эффективного количества варианта полипептида по изобретению или композиции по изобретению, а главное преимущество заключается в менее частом и/или менее агрессивном применении более эффективной терапии, и необязательно меньшем риске иммунных реакций на терапевтически активное/ые соединение/я.In addition, the present invention relates to improved methods of treating or preventing, in particular, inflammatory diseases, for example, interstitial pulmonary diseases, such as idiopathic pulmonary fibrosis, as well as granulomatous diseases; cancer, in particular ovarian cancer; infections, such as atypical pulmonary mycobacterial infections; bone diseases (disorders of bone metabolism such as malignant osteopetrosis); autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis; as well as other diseases, such as multi-drug resistant tuberculosis; cryptococcal meningitis; cystic fibrosis and liver fibrosis, in particular secondary liver fibrosis after hepatitis C; the method comprises administering to a mammal in need thereof, in particular a human, an effective amount of a variant of a polypeptide according to the invention or a composition according to the invention, and the main advantage is the less frequent and / or less aggressive use of more effective therapy, and not necessarily less risk of immune responses to therapeutically active connection / s.
Молекулы по изобретению предпочтительно вводятся в составе композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. "Фармацевтически приемлемый" означает, что носитель или наполнитель не вызывает никаких неблагоприятных эффектов у тех пациентов, которым он вводится. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны в этой области (Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R.Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L.Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A.Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).The molecules of the invention are preferably administered in a composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. "Pharmaceutically acceptable" means that the carrier or excipient does not cause any adverse effects in those patients to whom it is administered. Such pharmaceutically acceptable carriers and excipients are well known in the art (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, ARGennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).
Молекулы по изобретению могут применяться "как есть" и/или в форме соли. Приемлемые соли включают соли щелочных или щелочноземельных металлов - натрия, калия, кальция и магния, а также соли цинка, но не ограничиваются ими. Эти соли или комплексы могут находиться в кристаллическом и/или аморфном состоянии.The molecules of the invention may be used “as is” and / or in salt form. Suitable salts include, but are not limited to, alkali or alkaline earth metal salts of sodium, potassium, calcium, and magnesium, as well as zinc salts. These salts or complexes may be in crystalline and / or amorphous state.
Варианты по изобретению вводятся в дозах, приблизительно равных тем, что применяются в терапии известными коммерческими препаратами IFNG типа Actimmune® или как указано в ЕР 0795332. Точная доза для введения зависит от обстоятельств. Как правило, доза должна быть способна предупреждать или уменьшать тяжесть или развитие подлежащего лечению состояния или показания. Специалисты знают, что эффективное количество варианта или композиции по изобретению зависит, среди прочего, от заболевания, дозировки, схемы применения, от того, вводится ли вариант полипептида или композиция сама по себе или в сочетании с другими терапевтическими средствами, времени полужизни композиции в сыворотке и общего состояния пациента.Variants of the invention are administered in doses approximately equal to those used in therapy with known commercial IFNG preparations of the Actimmune® type or as indicated in EP 0795332. The exact dose for administration depends on the circumstances. In general, the dose should be able to prevent or reduce the severity or development of the condition or condition to be treated. Those skilled in the art will recognize that an effective amount of a variant or composition of the invention depends, inter alia, on the disease, dosage, schedule of administration, on whether the variant polypeptide or composition is administered alone or in combination with other therapeutic agents, the half-life of the composition in serum and general condition of the patient.
Настоящее изобретение также касается применения варианта полипептида IFNG по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в качестве лекарственного средства.The present invention also relates to the use of a variant IFNG polypeptide of the present invention or a pharmaceutical composition of the present invention as a medicament.
Кроме того, изобретение также касается применения i) варианта IFNG по настоящему изобретению или ii) фармацевтической композиции по изобретению для изготовления лекарственого средства, фармацевтической композиции или набора компонентов для лечения заболеваний, входящих в группу, состоящую из воспалительных заболеваний, таких как интерстициальные легочные заболевания, в частности идиопатическего фиброза легких; рака, в частности рака яичников; инфекций, таких как атипичные легочные микобактериальные инфекции; костных заболеваний (нарушений метаболизма костной ткани типа злокачественного остеопетроза); грануломатозных заболеваний; аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит; туберкулеза со множественной устойчивостью к лекарствам; криптококкового менингита; кистозного фиброза и фиброза печени, в частности вторичного фиброза печени после гепатита С. Наиболее предпочтительно заболевание представляет собой интерстициальное легочное заболевание, в особенности идиопатический фиброз легких.In addition, the invention also relates to the use of i) an IFNG variant of the present invention or ii) a pharmaceutical composition of the invention for the manufacture of a medicament, pharmaceutical composition or kit of components for treating diseases in the group consisting of inflammatory diseases such as interstitial pulmonary diseases, in particular idiopathic pulmonary fibrosis; cancer, in particular ovarian cancer; infections, such as atypical pulmonary mycobacterial infections; bone diseases (disorders of bone metabolism such as malignant osteopetrosis); granulomatous diseases; autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis; multidrug resistant tuberculosis; cryptococcal meningitis; cystic fibrosis and liver fibrosis, in particular secondary liver fibrosis after hepatitis C. Most preferably, the disease is an interstitial pulmonary disease, especially idiopathic pulmonary fibrosis.
Также раскрыты усовершенствованные средства доставки молекул или препаратов, необязательно дополнительно включающих глюкокортикоиды.Improved delivery vehicles for molecules or drugs are also disclosed, optionally further comprising glucocorticoids.
Предпочтительная дозировка составляет 1-4, более предпочтительно 2-3 мкг полипептидного компонента на 1 кг веса пациента на 1 дозу. Предпочтительная дозировка составляет 100-350, более предпочтительно 100-150 мкг глюкокортикоида на 1 кг веса пациента на 1 дозу.The preferred dosage is 1-4, more preferably 2-3 μg of the polypeptide component per 1 kg of patient weight per dose. The preferred dosage is 100-350, more preferably 100-150 μg of glucocorticoid per 1 kg of patient weight per dose.
Изобретение также касается набора из компонентов, пригодного для лечения интерстициальных легочных заболеваний, включающего первую фармацевтическую композицию, содержащую активные компоненты i) и ii), указанные выше, и вторую фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один глюкокортикоид, причем каждая необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем и/или наполнителем.The invention also relates to a kit of components suitable for treating interstitial pulmonary diseases, comprising a first pharmaceutical composition containing the active components i) and ii) above and a second pharmaceutical composition containing at least one glucocorticoid, each optionally together with a pharmaceutically acceptable carrier and / or filler.
Рецептура фармацевтической композиции может быть разработана для варианта по изобретению хорошо известными методами. Подходящие рецептуры описаны в Remington′s Pharmaceutical Sciences, E.W.Martin и US 5183746.The formulation of a pharmaceutical composition may be developed for a variant of the invention by well-known methods. Suitable formulations are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin and US 5183746.
Фармацевтическая композиция может быть составлена в различных формах, включая жидкие, гелеобразные, лиофилизованные, порошкообразные, в виде спрессованного твердого вещества или любой другой подходящей форме. Предпочтительная форма зависит от конкретного показания, подвергающегося лечению, и специалисту в этой области она будет очевидной.The pharmaceutical composition may be formulated in various forms, including liquid, gel, lyophilized, powdered, in the form of a compressed solid or any other suitable form. The preferred form depends on the particular indication being treated, and it will be apparent to a person skilled in the art.
Фармацевтическую композицию можно вводить перорально, подкожно, внутривенно, интрацеребрально, интраназально, чрезкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрилегочно, вагинально, ректально, интраокулярно или любым другим приемлемым способом, например, с применением технологии Powder Ject или ProLease. Композиции можно вводить непрерывно путем инфузии, хотя приемлемы и болюсные инъекции, пользуясь методами, хорошо известными в этой области, такими как насосы или имплантантация. В некоторых случаях композиции можно наносить прямо в виде раствора или аэрозоля. Предпочтительный способ применения зависит от конкретного показания, подвергающегося лечению, и специалист в этой области сможет его определить.The pharmaceutical composition can be administered orally, subcutaneously, intravenously, intracerebrally, intranasally, percutaneously, intraperitoneally, intramuscularly, intrapulmonary, vaginally, rectally, intraocularly or in any other suitable manner, for example, using Powder Ject or ProLease technology. The compositions can be administered continuously by infusion, although bolus injections are acceptable using methods well known in the art, such as pumps or implantation. In some cases, the composition can be applied directly in the form of a solution or aerosol. The preferred method of use depends on the particular indication being treated, and one skilled in the art will be able to determine it.
Фармацевтическую композицию изобретения можно вводить саму по себе или в сочетании с другими терапевтическими средствами. Эти средства могут входить в состав одной и той же фармацевтической композиции или могут вводиться отдельно от варианта полипептида по изобретению, как одновременно, так и в соответствии с любым другим приемлемым режимом лечения. Кроме того, вариант полипептида или фармацевтическая композиция изобретения может применяться как вспомогательное средство при другом лечении. В частности, предусматриваются комбинации с глюкокортикоидами, как описано в ЕР 0795332.The pharmaceutical composition of the invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents. These agents may be part of the same pharmaceutical composition, or may be administered separately from a variant polypeptide of the invention, both simultaneously and in accordance with any other suitable treatment regimen. In addition, a variant polypeptide or pharmaceutical composition of the invention can be used as an adjuvant in other treatments. In particular, combinations with glucocorticoids are provided as described in EP 0795332.
Следующий аспект изобретения касается способа лечения млекопитающих с циркулирующими антителами к huIFNG или rhuIFNG, причем способ включает введение варианта IFNG, обладающего биоактивностью IFNG и не реагирующего с данными антителами. Соединение предпочтительно представляет собой описанный в настоящем изобретении вариант, а млекопитающее предпочтительно представляет собой человека. Подлежащие лечению млекопитающие могут страдать любым из заболеваний, перечисленных выше, для которых IFNG является полезным средством лечения. Кроме того, изобретение касается способа изготовления фармацевтического препарата для лечения млекопитающих с циркулирующими антителами к huIFNG или rhuIFNG, при этом вариант IFNG, обладающий биоактивностью IFNG и не реагирующий с такими антителами, включен в состав предназначенной для инъекций или другой подходящей композиции. Термин "циркулирующие антитела" служит для обозначения аутоантител, образующихся у млекопитающего в ответ на лечение его любым из коммерчески доступных препаратов IFNG.A further aspect of the invention relates to a method for treating mammals with circulating antibodies to huIFNG or rhuIFNG, the method comprising administering an IFNG variant having IFNG bioactivity and not reacting with these antibodies. The compound is preferably a variant described in the present invention, and the mammal is preferably a human. The mammals to be treated may suffer from any of the diseases listed above for which IFNG is a useful treatment. The invention further relates to a method for the manufacture of a pharmaceutical preparation for the treatment of mammals with circulating antibodies to huIFNG or rhuIFNG, wherein an IFNG variant having IFNG bioactivity and not reacting with such antibodies is formulated for injection or other suitable composition. The term "circulating antibodies" is used to refer to autoantibodies formed in a mammal in response to treatment with any of the commercially available IFNG preparations.
Также предусматривается применение нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида IFNG по изобретению, для генной терапии. В частности, может представлять интерес применение нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант полипептида IFNG, описанный в разделе "Варианты IFNG по изобретению, у которых неполипептидный компонент представлен остатком сахара". При этом гликозилирование варианта полипептида происходит во время курса генной терапии, то есть после экспрессии нуклеотидной последовательности в организме человека.The use of a nucleotide sequence encoding a variant IFNG polypeptide of the invention for gene therapy is also contemplated. In particular, it may be of interest to use a nucleotide sequence encoding a variant of the IFNG polypeptide described in the section "IFNG variants of the invention in which the non-polypeptide component is a sugar residue." In this case, the glycosylation of the polypeptide variant occurs during the course of gene therapy, that is, after expression of the nucleotide sequence in the human body.
Предусматриваемые применения в генной терапии включают лечение тех заболеваний, при которых ожидается, что вариант полипептида обеспечит эффективную терапию.Intended applications in gene therapy include the treatment of those diseases in which the polypeptide variant is expected to provide effective therapy.
Местная доставка варианта IFNG при генной терапии может обеспечить доставку терапевтического средства в область мишени и при этом избежать возможных проблем с токсичностью, связанных с неспецифическим введением.Local delivery of the IFNG variant during gene therapy can ensure the delivery of the therapeutic agent to the target area while avoiding possible toxicity problems associated with non-specific administration.
Предусматриваются методики генной терапии как in vitro, так и in vivo.Gene therapy techniques are envisaged both in vitro and in vivo.
Известно несколько методов переноса потенциально терапевтических генов в определенные популяции клеток. Дополнительно см. Mulligan, "The Basic Science of Gene Therapy", Science, 260, pp.926-31 (1993). Эти методы включают:Several methods are known for transferring potentially therapeutic genes to specific cell populations. Additionally see Mulligan, "The Basic Science of Gene Therapy", Science, 260, pp. 926-31 (1993). These methods include:
прямой перенос генов, как описано Wolff et al., "Direct Gene Transfer into Mouse Muscle in vivo", Science, 247, pp.1465-68 (1990);direct gene transfer, as described by Wolff et al., "Direct Gene Transfer into Mouse Muscle in vivo", Science, 247, pp. 1465-68 (1990);
перенос ДНК с помощью липосом, как описано Caplen et al., "Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium of Patients with Cystic Fibrosis", Nature Med., 3, pp.39-46 (1995); Crystal, "The Gene as a Drug", Nature Med., 1, pp.15-17 (1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent for Efficient Transfection of Mammalian Cells", Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, pp.280-85 (1991);DNA transfer using liposomes as described by Caplen et al., "Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium of Patients with Cystic Fibrosis", Nature Med., 3, pp. 39-46 (1995); Crystal, "The Gene as a Drug", Nature Med., 1, pp. 15-17 (1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent for Efficient Transfection of Mammalian Cells", Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, pp. 280-85 (1991);
перенос ДНК с помощью ретровируса, как описано Kay et al., "In vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained Partial Correction in Factor IX-deficient Dogs", Science, 262, pp.117-19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256, pp.808-13 (1992);DNA transfer using a retrovirus as described by Kay et al., "In vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained Partial Correction in Factor IX-deficient Dogs", Science, 262, pp. 117-19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256, pp. 808-13 (1992);
перенос ДНК с помощью ДНК-содержащего вируса. К таким ДНК-содержащим вирусам относятся аденовирусы (предпочтительны векторы на основе Ad-2 или Ad-5), герпесвирусы (предпочтительны векторы на основе вируса Herpes simplex) и парвовирусы (предпочтительны векторы на основе "дефектных" или неавтономных парвовирусов, более предпочтительны векторы на основе аденоассоциированных вирусов, наиболее предпочтительны векторы на основе AAV-2). Например, см. Alt et al., "The Use of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy", Gene Therapy, 1, pp.367-84 (1994); US 4797368 и US 5139941.DNA transfer using a DNA-containing virus. Such DNA viruses include adenoviruses (preferred vectors based on Ad-2 or Ad-5), herpes viruses (preferred vectors based on Herpes simplex virus) and parvoviruses (preferred vectors based on defective or non-autonomous parvoviruses, more preferred vectors on based on adeno-associated viruses, AAV-2 based vectors are most preferred). For example, see Alt et al., "The Use of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy", Gene Therapy, 1, pp. 367-84 (1994); US 4797368 and US 5139941.
Парентеральные препаратыParenteral drugs
Примером фармацевтической композиции является раствор, предназначенный для парентерального введения. Несмотря на то что во многих случаях растворы фармацевтических композиций находятся в жидкой форме, удобной для немедленного применения, такие парентеральные составы могут находиться и в замороженном или лиофилизованном виде. Замороженную композицию необходимо оттаять перед употреблением. Лиофилизация часто применяется для увеличения стабильности содержащегося в композиции активного соединения при хранении в широком диапазоне условий хранения, поскольку, как известно специалистам в этой области, лиофилизованные препараты обычно более стабильны, чем их жидкие аналоги. Такие лиофилизованные препараты восстанавливают перед употреблением, добавляя один или несколько подходящих фармацевтически приемлемых растворителей, таких как стерильная вода для инъекций или стерильный физраствор.An example of a pharmaceutical composition is a solution intended for parenteral administration. Despite the fact that in many cases the solutions of the pharmaceutical compositions are in liquid form suitable for immediate use, such parenteral formulations may also be present in frozen or lyophilized form. The frozen composition must be thawed before use. Lyophilization is often used to increase the stability of the active compound contained in the composition during storage over a wide range of storage conditions, since, as is known to those skilled in the art, lyophilized preparations are usually more stable than their liquid counterparts. Such lyophilized preparations are reconstituted before use by adding one or more suitable pharmaceutically acceptable solvents, such as sterile water for injection or sterile saline.
Парентеральные препараты готовят для хранения в виде лиофилизованных композиций или водных растворов, смешивая надлежащим образом вариант полипептида требуемой степени чистоты с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами, обычно применяющимися в данной области (все они именуются "наполнители"), например, буферными веществами, стабилизирующими веществами, консервантами, поддерживающими изотоничность веществами, неионными детергентами, антиоксидантами и/или другими разнообразными добавками.Parenteral preparations are prepared for storage in the form of lyophilized compositions or aqueous solutions, by properly mixing a variant of the polypeptide of the desired purity with one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers commonly used in the art (all are referred to as “excipients”), for example, buffered substances, stabilizing agents, preservatives, isotonic agents, non-ionic detergents, antioxidants and / or various other additives kami.
Буферные вещества способствуют поддержанию pH в диапазоне, близком к физиологическим условиям. Как правило, они присутствуют в концентрациях от 2 мМ до 50 мМ. К числу пригодных для применения в настоящем изобретении буферных веществ относятся как органические, так и неорганические кислоты и их соли, например, цитратные буферы (смесь однозамещенного цитрата натрия и двузамещенного цитрата натрия, смесь лимонной кислоты и трехзамещенного цитрата натрия, смесь лимонной кислоты и однозамещеного цитрата натрия и т.д.), сукцинатные буферы (смесь янтарной кислоты и однозамещенного сукцината натрия, смесь янтарной кислоты и гидроокиси натрия, смесь янтарной кислоты и двузамещенного сукцината натрия и т.д.), тартратные буферы (смесь виннокаменной кислоты и тартрата натрия, смесь виннокаменной кислоты и тартрата калия, смесь виннокаменной кислоты и гидроокиси натрия и т.д.), фумаратные буферы (смесь фумаровой кислоты и однозамещенного фумарата натрия, смесь фумаровой кислоты и двузамещенного фумарата натрия, смесь однозамещенного фумарата натрия и двузамещенного фумарата натрия и т.д.), глюконатные буферы (смесь глюконовой кислоты и глюконата натрия, смесь глюконовой кислоты и гидроокиси натрия, смесь глюконовой кислоты и глюконата калия и т.д.), оксалатные буферы (смесь щавелевой кислоты и оксалата натрия, смесь щавелевой кислоты и гидроокиси натрия, смесь щавелевой кислоты и оксалата калия и т.д.), лактатные буферы (смесь молочной кислоты и лактата натрия, смесь молочной кислоты и гидроокиси натрия, смесь молочной кислоты и лактата калия и т.д.) и ацетатные буферы (смесь уксусной кислоты и ацетата натрия, смесь уксусной кислоты и гидроокси натрия и т.д.). Дополнительно к этому могут применяться фосфатные буферы, гистидиновые буферы и такие триметиламиновые соли, как Трис.Buffer substances help maintain the pH in a range close to physiological conditions. As a rule, they are present in concentrations from 2 mm to 50 mm. Suitable buffers for use in the present invention include both organic and inorganic acids and their salts, for example, citrate buffers (a mixture of monosubstituted sodium citrate and disubstituted sodium citrate, a mixture of citric acid and trisubstituted sodium citrate, a mixture of citric acid and monosubstituted citrate sodium, etc.), succinate buffers (a mixture of succinic acid and disubstituted sodium succinate, a mixture of succinic acid and sodium hydroxide, a mixture of succinic acid and disubstituted sodium succinate etc.), tartrate buffers (a mixture of tartaric acid and sodium tartrate, a mixture of tartaric acid and potassium tartrate, a mixture of tartaric acid and sodium hydroxide, etc.), fumarate buffers (a mixture of fumaric acid and monosubstituted sodium fumarate, a mixture of fumaric acid and disubstituted sodium fumarate, a mixture of monosubstituted sodium fumarate and disubstituted sodium fumarate, etc.), gluconate buffers (a mixture of gluconic acid and sodium gluconate, a mixture of gluconic acid and sodium hydroxide, a mixture of fecal gluconic acid and gluconate ia, etc.), oxalate buffers (a mixture of oxalic acid and sodium oxalate, a mixture of oxalic acid and sodium hydroxide, a mixture of oxalic acid and potassium oxalate, etc.), lactate buffers (a mixture of lactic acid and sodium lactate, a mixture of lactic acids and sodium hydroxide, a mixture of lactic acid and potassium lactate, etc.) and acetate buffers (a mixture of acetic acid and sodium acetate, a mixture of acetic acid and sodium hydroxy, etc.). In addition, phosphate buffers, histidine buffers, and trimethylamine salts such as Tris may be used.
Консерванты могут быть добавлены для сдерживания роста микробов, и обычно их добавляют в количестве 0,2%-1% (вес/об). К числу подходящих консервантов для применения в настоящем изобретении относятся фенол, бензиловый спирт, мета-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид октадецилдиметилбензиламмония, галогениды бензалкония (например, хлорид, бромид или иодид бензалкония), гексаметония хлорид, такие алкилпарабены, как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол и 3-пентанол.Preservatives can be added to inhibit the growth of microbes, and usually they are added in an amount of 0.2% -1% (w / v). Suitable preservatives for use in the present invention include phenol, benzyl alcohol, meta-cresol, methylparaben, propylparaben, octadecyldimethylbenzylammonium chloride, benzalkonium halides (e.g., benzalkonium bromide or benzalkonium iodide), hexamethonium chloride, such as methylphenylparabenes , catechol, resorcinol, cyclohexanol and 3-pentanol.
Вещества, поддерживающие изотоничность, добавляются для обеспечения изотоничности жидких композиций и включают многоатомные сахароспирты, предпочтительно трехатомные и выше, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит. Многоатомные спирты могут присутствовать в количестве от 0,1% до 25% по весу, обычно от 1% до 5%, с учетом относительных количеств других ингредиентов.Substances that maintain isotonicity are added to ensure the isotonicity of liquid compositions and include polyhydric sugar alcohols, preferably trihydric and higher, such as glycerol, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol. Polyhydric alcohols may be present in an amount of from 0.1% to 25% by weight, usually from 1% to 5%, taking into account the relative amounts of other ingredients.
Под стабилизаторами подразумевается обширная категория наполнителей с разнообразными функциями, от увеличения объема до солюбилизации лекарственного средства, либо предотвращения денатурации или прилипания к стенкам посуды. К типичным стабилизаторам относятся многоатомные сахароспирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д.; органические сахара или сахароспирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннит, сорбит, ксилит, рибит, миоинозит, галактит, глицерин и им подобные, включая циклиты типа инозита; полиэтиленгликоль; аминокислотные полимеры; мочевина; серосодержащие восстановители, такие как глутатион, липоевая кислота, тиогликолат натрия, тиоглицерин, α-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные полипептиды (<10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин человека, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры типа поливинилпирролидона; моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза и глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза и сахароза; трисахариды, такие как раффиноза, и такие полисахариды, как декстран. Как правило, стабилизаторы присутствуют в пределах от 0,1 до 10 000 весовых частей относительно веса активного белка.Under the stabilizers is meant an extensive category of fillers with a variety of functions, from increasing the volume to solubilizing the drug, or preventing denaturation or sticking to the walls of the dishes. Typical stabilizers include polyhydric sugar alcohols (listed above); amino acids such as arginine, lysine, glycine, glutamine, asparagine, histidine, alanine, ornithine, L-leucine, 2-phenylalanine, glutamic acid, threonine, etc .; organic sugars or sugar alcohols such as lactose, trehalose, stachyose, mannitol, sorbitol, xylitol, ribite, myoinositol, galactite, glycerin and the like, including cyclites such as inositol; polyethylene glycol; amino acid polymers; urea; sulfur-containing reducing agents such as glutathione, lipoic acid, sodium thioglycolate, thioglycerol, α-monothioglycerol and sodium thiosulfate; low molecular weight polypeptides (<10 residues); proteins, such as human serum albumin, bovine serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; monosaccharides such as xylose, mannose, fructose and glucose; disaccharides such as lactose, maltose and sucrose; trisaccharides such as raffinose and polysaccharides such as dextran. As a rule, stabilizers are present in the range from 0.1 to 10,000 parts by weight relative to the weight of the active protein.
Неионные поверхностно-активные вещества, или детергенты (также известны как "смачивающие вещества"), могут присутствовать для обеспечения солюбилизации лекарственного средства, а также для защиты терапевтического полипептида от агрегации, вызванной взбалтыванием, что также позволяет подвергать композицию поверхностному напряжению сдвига, не вызывая денатурации полипептида. К числу подходящих неионных детергентов относятся полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188 и т.д.), полиолы Pluronic®, моноэфиры полиоксиэтиленсорбитана (Tween®-20, Tween®-80 и т.д.).Non-ionic surfactants, or detergents (also known as "wetting agents"), may be present to ensure the solubilization of the drug, as well as to protect the therapeutic polypeptide from aggregation caused by agitation, which also allows the composition to be subjected to surface shear stress without causing denaturation polypeptide. Suitable nonionic detergents include polysorbates (20, 80, etc.), polyoxamers (184, 188, etc.), Pluronic® polyols, polyoxyethylene sorbitan monoesters (Tween®-20, Tween®-80, etc. .).
К дополнительным разнообразным добавкам относятся вещества, увеличивающие объем, или заполнители (например, крахмал), хелатирующие вещества (например, ЭДТА), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метионин, витамин Е) и вспомогательные растворители.A variety of additional additives include bulking agents or bulking agents (e.g. starch), chelating agents (e.g. EDTA), antioxidants (e.g. ascorbic acid, methionine, vitamin E) and excipients.
Активный ингредиент также может быть заключен в микрокапсулы, полученные, к примеру, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы, желатина или полиметилметакрилата, в коллоидные системы доставки лекарств (например, липосомы, микросферы из альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы изложены в Remington′s Pharmaceutical Sciences, supra.The active ingredient can also be enclosed in microcapsules obtained, for example, by coacervation or interfacial polymerization, for example, microcapsules from hydroxymethyl cellulose, gelatin or polymethyl methacrylate, into colloidal drug delivery systems (e.g. liposomes, microspheres from albumin, microemulsions, nanoparticles and nanoparticles) and or in a macroemulsion. Such methods are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Препараты для парентерального введения in vivo должны быть стерильными. Это легко осуществляется, к примеру, фильтрованием через стерильные фильтровальные мембраны.Preparations for parenteral administration in vivo must be sterile. This is easily done, for example, by filtration through sterile filter membranes.
В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает: i) вариант IFNG по изобретению; ii) буферное вещество, в частности соль органической кислоты, способную поддерживать pH между 5,0 и 6,5; iii) стабилизатор, в частности органический сахар или сахароспирт; iv) неионный детергент; v) стерильную воду. В частности, буферное вещество выбирают из группы, состоящей из ацетата, сукцината и цитрата, стабилизатор представлен маннитом или сорбитом, неионный детергент представлен Tween®-20 или Tween®-80. Предпочтительно фармацевтическая композиция не содержит никаких консервантов.In a preferred embodiment of the invention, the pharmaceutical composition includes: i) an IFNG variant of the invention; ii) a buffering agent, in particular an organic acid salt capable of maintaining a pH between 5.0 and 6.5; iii) a stabilizer, in particular organic sugar or sugar alcohol; iv) non-ionic detergent; v) sterile water. In particular, the buffer substance is selected from the group consisting of acetate, succinate and citrate, the stabilizer is mannitol or sorbitol, the non-ionic detergent is Tween®-20 or Tween®-80. Preferably, the pharmaceutical composition does not contain any preservatives.
Препараты с замедленным высвобождениемSlow Release Drugs
Примеры подходящих препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие вариант полипептида, причем эти матрицы находятся в удобном виде типа пленки или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды, сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, недеградируемый этилен-винилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как технология ProLease или Lupron Depot® (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. В то время как полимеры типа этилен-винилацетата и сополимеров молочной и гликолевой кислоты обеспечивают высвобождение молекул в течение длительного времени, вплоть до 100 дней и больше, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более короткого времени. Когда инкапсулированные полипептиды находятся в организме долгое время, они могут денатурировать или агрегировать под влиянием влажности при 37°С, что ведет к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. Можно разработать рациональные способы стабилизации в зависимости от действующих механизмов. Так, если окажется, что механизм агрегации состоит в образовании межмолекулярных S-S-связей через тиол-дисульфидный обмен, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контролирования степени влажности с помощью соответствующих добавок и разработки специфических составов полимерного матрикса.Examples of suitable sustained release formulations include semi-permeable matrices of solid hydrophobic polymers containing a variant polypeptide, which matrices are conveniently in the form of a film or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (e.g., poly (2-hydroxyethyl methacrylate) or polyvinyl alcohol), polylactides, copolymers of L-glutamic acid and ethyl L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate, degradable copolymers of lactic acid, and glycol such as ProLease or Lupron Depot® technology (injection microspheres consisting of a copolymer of lactic and glycolic acid and leuprolide acetate), and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and copolymers of lactic and glycolic acid provide release of molecules for a long time, up to 100 days or more, some hydrogels release proteins for a shorter time. When the encapsulated polypeptides are in the body for a long time, they can denature or aggregate under the influence of humidity at 37 ° C, which leads to a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. Rational stabilization methods can be developed depending on the mechanisms in place. So, if it turns out that the aggregation mechanism consists in the formation of intermolecular S-S bonds via thiol disulfide exchange, stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, controlling the degree of moisture with the help of appropriate additives, and developing specific polymer matrix compositions.
Пероральное применениеOral administration
Фармацевтическая композиция для перорального применения может находиться в твердом или жидком виде, например в виде капсул, таблеток, суспензий, эмульсий или растворов. Фармацевтическая композиция предпочтительно готовится в виде дозированной единицы, содержащей заданное количество активного ингредиента. Подходящая ежедневная доза для человека или другого млекопитающего может колебаться в широких пределах, в зависимости от состояния пациента и других факторов, но специалист в этой области может ее определить рутинными методами.The pharmaceutical composition for oral administration may be in solid or liquid form, for example, in the form of capsules, tablets, suspensions, emulsions or solutions. The pharmaceutical composition is preferably prepared in the form of a dosage unit containing a predetermined amount of the active ingredient. A suitable daily dose for a human or other mammal can vary widely, depending on the condition of the patient and other factors, but one skilled in the art can determine it by routine methods.
К твердым дозированным формам для перорального применения можно отнести капсулы, таблетки, свечи, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах активное соединение может находиться в смеси с по меньшей мере одним инертным разбавителем типа сахарозы, лактозы или крахмала. Такие дозированные формы могут содержать, как это обычно бывает, и другие вещества, к примеру, смазывающие вещества типа стеарата магния. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированные формы могут включать и буферные вещества. Кроме того, таблетки и пилюли могут быть изготовлены с энтеросолюбильным покрытием.Solid dosage forms for oral administration include capsules, tablets, suppositories, powders and granules. In such solid dosage forms, the active compound may be in a mixture with at least one inert diluent such as sucrose, lactose or starch. Such dosage forms may contain, as is usually the case, other substances, for example, lubricants such as magnesium stearate. In the case of capsules, tablets and pills, dosage forms may include buffering agents. In addition, tablets and pills can be made with an enteric coating.
Варианты полипептида могут быть смешаны со вспомогательными веществами, такими как лактоза, сахароза, крахмал, эфиры целлюлозы и алкановых кислот, стеариновая кислота, тальк, стеарат магния, окись магния, натриевые и кальциевые соли фосфорной и серной кислот, гуммиарабик, желатин, альгинат натрия, поливинилпирролидон и/или поливиниловый спирт, а затем подвергнуты таблетированию или капсулированию для обычного применения. Альтернативно, они могут быть растворены в физрастворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, масле (к примеру, кукурузном, арахисовом, хлопковом или кунжутном масле), трагакантовой камеди и/или различных буферах. Другие вспомогательные вещества и способы их применения хорошо известны в области фармацевтики. Наполнитель или разбавитель может включать замедлитель, например, глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, один или вместе с воском, а также другие материалы, хорошо известные в этой области.Variants of the polypeptide may be mixed with excipients such as lactose, sucrose, starch, cellulose and alkanoic acid esters, stearic acid, talc, magnesium stearate, magnesium oxide, sodium and calcium salts of phosphoric and sulfuric acids, gum arabic, gelatin, sodium alginate, polyvinylpyrrolidone and / or polyvinyl alcohol, and then subjected to tabletting or encapsulation for normal use. Alternatively, they can be dissolved in saline, water, polyethylene glycol, propylene glycol, ethanol, oil (for example, corn, peanut, cotton or sesame oil), tragacanth gum and / or various buffers. Other excipients and methods of their use are well known in the pharmaceutical field. The filler or diluent may include a moderator, for example, glyceryl monostearate or glyceryl distearate, alone or together with wax, as well as other materials well known in the art.
Фармацевтические композиции могут подвергаться стандартной фармацевтической обработке типа стерилизации и/или содержать обычные вспомогательные вещества, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, буферы, заполнители и т.д., как описано в других частях настоящего изобретения.The pharmaceutical compositions may undergo standard pharmaceutical processing such as sterilization and / or contain conventional excipients, such as preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, buffers, excipients, etc., as described in other parts of the present invention.
К жидким дозированным формам для перорального применения можно отнести фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, обычно применяемые в этой области, например воду. Такие композиции могут содержать и вспомогательные вещества - смачивающие вещества, подсластители, ароматизаторы и отдушки.Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups and elixirs containing inert diluents commonly used in the art, such as water. Such compositions may also contain auxiliary substances - wetting agents, sweeteners, flavorings and perfumes.
Местное применениеTopical application
К лекарственным формам, пригодным для местного применения, относятся жидкие или полужидкие препараты, пригодные для проникновения через кожу (жидкие мази, лосьоны, притирания, кремы, пасты), и капли, пригодные для введения в глаза, уши или нос.Dosage forms suitable for topical use include liquid or semi-liquid preparations suitable for penetration through the skin (liquid ointments, lotions, rubbing, creams, pastes), and drops suitable for administration to the eyes, ears or nose.
Легочное введениеPulmonary administration
Композиции, пригодные для применения с распылителем, струйным или ультразвуковым, как правило включают вариант полипептида, растворенный в воде, к примеру, в концентрации от около 0,01 до около 25 мг варианта на 1 мл раствора, предпочтительно от около 0,1 до около 10 мг/мл. Композиция может также включать буфер и простой сахар (для стабилизации белка и регуляции осмотического давления), и/или сывороточный альбумин человека в концентрации от 0,1 до 10 мг/мл. Примеры буферов, которые можно использовать, - ацетат натрия, цитрат и глицин. Предпочтительно буфер имеет состав и молярность, позволяющие доводить рН в пределах от 3 до 9. Обычно для этой цели подходит молярность буфера от 1 мМ до 50 мМ. Примеры сахаров, которые можно использовать, - лактоза, мальтоза, маннит, сорбит, трегалоза и ксилоза, обычно в количестве от 1% до 10% от веса композиции.Compositions suitable for use with a nebulizer, inkjet or ultrasound typically include a variant polypeptide dissolved in water, for example, in a concentration of from about 0.01 to about 25 mg of the variant per 1 ml of solution, preferably from about 0.1 to about 10 mg / ml. The composition may also include a buffer and simple sugar (to stabilize the protein and regulate the osmotic pressure), and / or human serum albumin in a concentration of from 0.1 to 10 mg / ml. Examples of buffers that can be used are sodium acetate, citrate, and glycine. Preferably, the buffer has a composition and a molarity that allows the pH to be adjusted between 3 and 9. Typically, a buffer molarity of 1 mM to 50 mM is suitable for this purpose. Examples of sugars that can be used are lactose, maltose, mannitol, sorbitol, trehalose and xylose, usually in an amount of 1% to 10% by weight of the composition.
Композиция для распылителя также может содержать детергент для снижения или предотвращения поверхностной агрегации белка, вызванной пульверизацией раствора при образовании аэрозоля. Можно использовать различные традиционные детергенты, такие как полиоксиэтиленовые эфиры жирных кислот и спиртов и эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот. Количества обычно колеблются от 0,001% до 4% от веса композиции. Особенно предпочтительный детергент для настоящего изобретения - полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.The nebulizer composition may also contain a detergent to reduce or prevent surface protein aggregation caused by spraying the solution during aerosol formation. Various conventional detergents can be used, such as polyoxyethylene esters of fatty acids and alcohols and esters of polyoxyethylene sorbitan and fatty acids. Amounts typically range from 0.001% to 4% by weight of the composition. A particularly preferred detergent for the present invention is polyoxyethylene sorbitan monooleate.
Конкретные композиции и способы получения подходящих дисперсий жидких частиц настоящего изобретения описаны в WO 94/20069, US 5915378, US 5960792, US 5957124, US 5934272, US 5915378, US 5855564, US 5826570 и US 5522385, которые включены в настоящее изобретение путем отсылки.Specific compositions and methods for preparing suitable dispersions of liquid particles of the present invention are described in WO 94/20069, US 5915378, US 5960792, US 5957124, US 5934272, US 5915378, US 5855564, US 5826570 and US 5522385, which are incorporated herein by reference.
Композиции для применения с дозирующим ингалятором обычно включают тонко измельченный порошок. Такой порошок может быть получен путем лиофилизации и последующего измельчения жидкой композиции и может также содержать стабилизатор типа сывороточного альбумина человека (HSA). Как правило, добавляют более 0,5% (вес/вес) HSA. Кроме того, при необходимости в препарат можно добавить один или несколько Сахаров или сахароспиртов. Примеры включают лактозу, мальтозу, маннит, сорбит, сорбитозу, трегалозу, ксилит и ксилозу. Добавляемое в препарат количество может колебаться от 0,01 до 200% (вес/вес), предпочтительно от 1 до 50% от содержания варианта. Затем такие композиции лиофилизируют и измельчают до нужного размера частиц.Compositions for use with a metered-dose inhaler typically include finely divided powder. Such a powder can be obtained by lyophilization and subsequent grinding of a liquid composition and may also contain a stabilizer such as human serum albumin (HSA). Typically, more than 0.5% (w / w) HSA is added. In addition, if necessary, one or more Sugars or sugar alcohols can be added to the preparation. Examples include lactose, maltose, mannitol, sorbitol, sorbitol, trehalose, xylitol and xylose. The amount added to the preparation can range from 0.01 to 200% (weight / weight), preferably from 1 to 50% of the content of the variant. Then such compositions are lyophilized and ground to the desired particle size.
Частицы нужного размера затем суспендируют в пропелленте с помощью детергента. Пропеллентом может быть любой стандартный материал, применяемый для этой цели, как-то: хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод или углеводород, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, или их комбинации. Подходящие детергенты включают сорбитантриолеат и соевый лецитин. Олеиновая кислота также может быть полезной в качестве детергента. Затем эту смесь заправляют в ингалятор. Пример коммерчески доступного дозирующего ингалятора, пригодного для настоящего изобретения, - это дозирующий ингалятор Ventolin фирмы Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.Particles of the desired size are then suspended in the propellant with a detergent. The propellant can be any standard material used for this purpose, such as chlorofluorocarbon, hydrochlorofluorocarbon, hydrofluorocarbon or hydrocarbon, including trichlorofluoromethane, dichlorodifluoromethane, dichlorotetrafluoroethanol and 1,1,1,2-tetrafluoroethane, or combinations thereof. Suitable detergents include sorbitan trioleate and soya lecithin. Oleic acid may also be useful as a detergent. Then this mixture is charged into the inhaler. An example of a commercially available metered dose inhaler suitable for the present invention is a Ventolin metered dose inhaler from Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.
Композиции для порошковых ингаляторов включают тонко измельченный сухой порошок, содержащий вариант, а также могут включать увеличивающее объем вещество, такое как лактоза, сорбит, сахароза или маннит, в таком количестве, которое способствует распылению порошка из устройства, например, от 50% до 90% от веса композиции. Частицы порошка должны обладать такими аэродинамическими свойствами в легких, которые соответствуют частицам, имеющим плотность около 1 г/см2 и средний диаметр менее 10 мкм, предпочтительно от 0,5 до 5 мкм, наиболее предпочтительно от 1,5 до 3,5 мкм. Пример порошкового ингалятора, пригодного для применения в соответствии с настоящим изобретением, - порошковый ингалятор Spinhaler фирмы Fisons Corp., Bedford, Mass.Compositions for powder inhalers include finely divided dry powder containing the option, and may also include a volume-increasing substance, such as lactose, sorbitol, sucrose or mannitol, in such an amount that helps to disperse the powder from the device, for example, from 50% to 90% by weight of the composition. The powder particles should have such aerodynamic properties in the lungs that correspond to particles having a density of about 1 g / cm 2 and an average diameter of less than 10 microns, preferably from 0.5 to 5 microns, most preferably from 1.5 to 3.5 microns. An example of a powder inhaler suitable for use in accordance with the present invention is a Spinhaler powder inhaler from Fisons Corp., Bedford, Mass.
Порошки для этих устройств можно получить и/или вводить способами, раскрытыми в US 5997848, US 5993783, US 5985248, US 5976574, US 5922354, US 5785049 и US 5654007.Powders for these devices can be obtained and / or administered by the methods disclosed in US 5997848, US 5993783, US 5985248, US 5976574, US 5922354, US 5785049 and US 5654007.
К механическим устройствам, предназначенным для легочного введения лекарственных препаратов, относятся, не ограничиваясь ими, распылители, дозирующие ингаляторы и порошковые ингаляторы, причем все они известны специалистам в этой области. Конкретные примеры коммерчески доступных устройств, пригодных для осуществления настоящего изобретения, - это распылитель Ultravent фирмы Mallinckrodt Inc., St. Louis, Missouri; распылитель Acorn II фирмы Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; дозирующий ингалятор Ventolin фирмы Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; порошковый ингалятор Spinhaler фирмы Fisons Corp., Bedford, Massachusetts; устройство типа "стоячее облако" фирмы Inhale Therapeutic Systems Inc., San Carlos, California; ингалятор AIR фирмы Alkermes, Cambridge, Massachusetts; и система для легочного введения лекарств AERx фирмы Aradigm Corporation, Hayward, California.Mechanical devices for pulmonary administration of drugs include, but are not limited to, nebulizers, metered-dose inhalers and powder inhalers, all of which are known to those skilled in the art. Specific examples of commercially available devices suitable for carrying out the present invention are an Ultravent atomizer from Mallinckrodt Inc., St. Louis, Missouri; Acorn II nebulizer from Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin metered dose inhaler from Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; Spinhaler Powder Inhaler from Fisons Corp., Bedford, Massachusetts; standing cloud device from Inhale Therapeutic Systems Inc., San Carlos, California; AIR inhaler from Alkermes, Cambridge, Massachusetts; and AERx pulmonary drug administration system from Aradigm Corporation, Hayward, California.
Далее изобретение раскрывается на следующих примерах. Эти примеры ни в коем случае не следует воспринимать как ограничивающие универсальность настоящего описания и формулы изобретения.The invention is further disclosed by the following examples. These examples should in no way be taken as limiting the universality of the present description and claims.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫMATERIALS AND METHODS
МатериалыMaterials
Клетки СНО-К1 (доступны American Type Culture Collection (ATCC#CCL-61)).CHO-K1 cells (American Type Culture Collection (ATCC # CCL-61) available).
Клетки HeLa (доступны American Type Culture Collection (ATCC#CCL-2)).HeLa cells (available American Type Culture Collection (ATCC # CCL-2)).
ISRE-Luc от фирмы Stratagene, La Jolla, USA.ISRE-Luc from Stratagene, La Jolla, USA.
pCDNA 3.1/hygro от фирмы InVitrogen, Carlsbad, USA.pCDNA 3.1 / hygro from InVitrogen, Carlsbad, USA.
Рестрикционные ферменты и полимеразы получены от фирмы New England Biolabs Inc., Beverly, USA.Restriction enzymes and polymerases were obtained from New England Biolabs Inc., Beverly, USA.
Среда DMEM: модифицированная Дюльбекко среда Игла (DMEM), 10% эмбриональная телячья сыворотка и гигромицин В были получены от фирмы Life Technologies A/S, Копенгаген, Дания.DMEM Medium: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% fetal calf serum and hygromycin B were obtained from Life Technologies A / S, Copenhagen, Denmark.
Субстрат LucLite был получен от фирмы Packard Bioscience, Гронинген, Нидерланды.LucLite substrate was obtained from Packard Bioscience, Groningen, The Netherlands.
Люминометр TopCount получен от фирмы Packard Bioscience, Гронинген, Нидерланды.TopCount luminometer obtained from Packard Bioscience, Groningen, The Netherlands.
Биотинилированное поликлональное антитело BAF285 против IFNG человека было получено от фирмы R&D Systems Inc., Minneapolis, USA.BAF285 biotinylated polyclonal anti-human IFNG antibody was obtained from R&D Systems Inc., Minneapolis, USA.
Конъюгированный с пероксидазой хрена стрептавидин РОЗ 97 получен от фирмы DAKO, Копенгаген, Дания.Horseradish peroxidase conjugated streptavidin ROS 97 obtained from DAKO, Copenhagen, Denmark.
Реагент ТМВ для блоттинга получен от фирмы KEM-EN-TEC, Копенгаген, Дания.TMB reagent for blotting was obtained from KEM-EN-TEC, Copenhagen, Denmark.
МетодыMethods
Принцип определения интерферонаThe principle of determining interferon
Ранее сообщалось, что IFNG реагирует с рецепторами IFNG на поверхности клеток HeLa и активирует их. Вследствие этого активируется транскрипция на промоторах, содержащих стимулируемый интерфероном респонсивный элемент (ISRE). Поэтому для скрининга на агонисты рецептора интерферона можно использовать конъюгированный с ISRE репортерный ген люциферазы (ISRE-luc), помещенный в клетки HeLa.It was previously reported that IFNG reacts with IFNG receptors on the surface of HeLa cells and activates them. As a result, transcription is activated on promoters containing an interferon-stimulated responsive element (ISRE). Therefore, for screening for interferon receptor agonists, an ISRE conjugated luciferase reporter gene (ISRE-luc) placed in HeLa cells can be used.
Первичный анализPrimary analysis
Клетки HeLa трансфицировали ISRE-Luc совместно с pCDNA 3.1/hygro и получали очаги (клеточные клоны) при селекции в среде DMEM, содержащей гигромицин В. Клеточные клоны подвергали скринингу на люциферазную активность в присутствии и в отсутствие IFNG. Клоны, проявляющие самое высокое отношение стимулированной к нестимулированной люциферазной активности, использовали для дальнейшего анализа.HeLa cells were transfected with ISRE-Luc together with pCDNA 3.1 / hygro and obtained foci (cell clones) by selection in DMEM medium containing hygromycin B. Cell clones were screened for luciferase activity in the presence and absence of IFNG. Clones exhibiting the highest ratio of stimulated to unstimulated luciferase activity were used for further analysis.
Для скрининга вариантов полипептида в 96-луночные планшеты засевали по 15000 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи в среде DMEM. На следующий день к клеткам добавляли варианты полипептида в различных концентрациях, а также известный стандарт. В качестве "известного стандарта" использовали Actimmune®; ампулу Actimmune® разбавляли до 300 Ед/мл в DMEM с 5% FBS и хранили при -80°С до употребления.To screen for polypeptide variants, 96,000 wells were seeded in 96-well plates and incubated overnight in DMEM. The next day, polypeptide variants were added to the cells at various concentrations, as well as a well-known standard. Actimmune® was used as the "known standard"; The Actimmune® ampoule was diluted to 300 U / ml in DMEM with 5% FBS and stored at -80 ° C until use.
Планшеты инкубировали 6 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2. После этого в каждую лунку добавляли субстрат LucLite (Packard Bioscience, Groningen, Нидерланды). Планшеты плотно закрывали и измеряли люминесценцию в люминометре TopCount (Packard) в режиме SPC (счета единичных фотонов).The plates were incubated for 6 hours at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . Thereafter, a LucLite substrate (Packard Bioscience, Groningen, Netherlands) was added to each well. The plates were tightly closed and luminescence was measured in a TopCount (Packard) luminometer in the SPC mode (counting of single photons).
В каждом планшете имеются лунки, инкубируемые в присутствии IFNG в качестве стимулированного контроля, и другие лунки, содержащие нормальную среду в качестве нестимулированного контроля. Соотношение между стимулированной и нестимулированной люциферазной активностью служит внутренним стандартом как на активность IFNG, так и на вариации от эксперимента к эксперименту. Для каждого образца IFNG рассчитывали количество единиц относительно стандарта Actimmune® и выражали в единицах активности (AU).Each plate contains wells incubated in the presence of IFNG as a stimulated control, and other wells containing normal medium as an unstimulated control. The relationship between stimulated and unstimulated luciferase activity serves as an internal standard for both IFNG activity and variation from experiment to experiment. For each IFNG sample, the number of units relative to the Actimmune® standard was calculated and expressed in units of activity (AU).
Определение повышенной степени гликозилированияDetermination of increased glycosylation
Для определения различных степеней гликозилирования мономеров варианта IFNG разгоняли гель SDS-PAGE в стандартных условиях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Проводили Вестерн-блоттинг согласно стандартной методике, используя биотинилированное поликлональное антитело против IFNG человека (BAF285 фирмы R&D Systems) в качестве первичного антитела и конъюгированный с пероксидазой хрена стрептавидин (Р0397 фирмы DAKO) в качестве вторичного антитела, а затем окрашивали с помощью реагента ТМВ для блоттинга (KEM-EN-TEC, Копенгаген, Дания). Распределение мономеров варианта IFNG с различной степенью гликозилирования оценивали путем визуального осмотра окрашенной мембраны.To determine the different degrees of glycosylation of the monomers of the IFNG variant, SDS-PAGE gel was dispersed under standard conditions and transferred onto a nitrocellulose membrane. Western blotting was performed according to a standard procedure using a biotinylated polyclonal anti-human IFNG antibody (BAF285 from R&D Systems) as a primary antibody and horseradish peroxidase conjugated streptavidin (DAKO P0397) as a secondary antibody, and then stained with TMB blot reagent for (KEM-EN-TEC, Copenhagen, Denmark). The distribution of monomers of the IFNG variant with varying degrees of glycosylation was evaluated by visual inspection of the stained membrane.
Определение AUCsc AUC sc definition
AUCsc у крыс определяли путем однократного (200 мкл) подкожного болюсного введения равного количества (по активности) варианта полипептида IFNG по изобретению.AUCsc in rats was determined by a single (200 μl) subcutaneous bolus injection of an equal amount (in activity) of an IFNG variant polypeptide of the invention.
Для этих экспериментов использовали самок крыс Sprag-Dawley весом 220-260 г. Полипептид IFNG вводили в рецептуру с сукцинатом натрия (720 мг/л), маннитом (40 г/л) и полисорбатом-20 (100 мг/л) при pH 6,0.For these experiments, female Sprag-Dawley rats weighing 220-260 g were used. The IFNG polypeptide was formulated with sodium succinate (720 mg / L), mannitol (40 g / L) and Polysorbate-20 (100 mg / L) at
Перед подкожным введением отбирали пробу крови из хвостовой вены, чтобы убедиться, что не обнаруживается фоновой активности IFNG. После введения отбирали пробы крови из хвостовой вены через 10 мин, 20 мин, 40 мин, 60 мин, 120 мин, 240 мин, 480 мин, 720 мин, 1440 мин, 1620 мин, 1920 мин и 2880 мин (иногда и через 3600 мин). Получали сыворотку, оставляя пробы крови на 20 мин при комнатной температуре для свертывания, после чего центрифугировали 20 мин при 5000xg при комнатной температуре. Затем выделяли сыворотку и хранили при -80°С до определения активности IFNG, используя "Первичный анализ", описанный выше. Следует отметить, что при определении количества единиц в образцах сыворотки из опытов по фармакокинетике у крыс стандарт Actimmune® разбавляли в DMEM с 5% FBS и 5% сыворотки крыс.Before subcutaneous administration, a blood sample was taken from the tail vein to ensure that no background IFNG activity was detected. After administration, blood samples were taken from the tail vein after 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 120 min, 240 min, 480 min, 720 min, 1440 min, 1620 min, 1920 min and 2880 min (sometimes after 3600 min ) Serum was obtained, leaving blood samples for 20 min at room temperature for coagulation, and then centrifuged for 20 min at 5000xg at room temperature. Serum was then isolated and stored at -80 ° C until the IFNG activity was determined using the "Primary Assay" described above. It should be noted that when determining the number of units in serum samples from rat pharmacokinetics experiments, the Actimmune® standard was diluted in DMEM with 5% FBS and 5% rat serum.
Затем количество единиц в сыворотке (AU/мл) наносили на график зависимости от времени и рассчитывали AUCsc с помощью GraphPad Prism 3.01.Then, the number of units in serum (AU / ml) was plotted against time and the AUC sc was calculated using GraphPad Prism 3.01.
Аналогичные эксперименты проводили с применением huIFNG в гликозилированной форме и/или Actimmune® для того, чтобы оценить повышение AUCsc у варианта полипептида IFNG по изобретению по сравнению с гликозилированной формой huIFNG и/или Actimmune®.Similar experiments were performed using huIFNG in glycosylated form and / or Actimmune® in order to evaluate the increase in AUC sc of the IFNG variant polypeptide of the invention compared to the glycosylated form of huIFNG and / or Actimmune®.
Время полужизни в сывороткеSerum Half-Life
Время полужизни в сыворотке у крыс определяли путем однократного болюсного внутривенного введения (200 мкл) равного количества (по активности) варианта полипептида IFNG по изобретению.The serum half-life in rats was determined by a single bolus intravenous administration (200 μl) of an equal amount (in activity) of an IFNG variant polypeptide of the invention.
Для этих экспериментов использовали самок крыс Sprag-Dawley весом 220-260 г. Полипептид IFNG вводили в рецептуру с сукцинатом натрия (720 мг/л), маннитом (40 г/л) и полисорбатом-20 (100 мг/л) при pH 6,0.For these experiments, female Sprag-Dawley rats weighing 220-260 g were used. The IFNG polypeptide was formulated with sodium succinate (720 mg / L), mannitol (40 g / L) and Polysorbate-20 (100 mg / L) at
Перед внутривенным введением отбирали пробу крови из хвостовой вены, чтобы убедиться, что не обнаруживается фоновой активности IFNG. После введения в хвостовую вену отбирали пробы крови из другой хвостовой вены через 5 мин, 10 мин, 20 мин, 40 мин, 60 мин, 120 мин, 240 мин, 480 мин, 720 мин, 1440 мин, 1620 мин, 1920 мин и 2880 мин. Получали сыворотку, оставляя пробы крови на 20 мин при комнатной температуре для свертывания, после чего центрифугировали 20 мин при 5000×g при комнатной температуре. Затем выделяли сыворотку и хранили при -80°С до определения активности IFNG, используя "Первичный анализ", описанный выше. Следует отметить, что при определении количества единиц в образцах сыворотки из опытов по фармакокинетике у крыс стандарт Actimmune® разбавляли в DMEM с 5% FBS и 5% сыворотки крыс.Before intravenous administration, a blood sample was taken from the tail vein to ensure that no background IFNG activity was detected. After being introduced into the tail vein, blood samples were taken from the other tail vein after 5 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 120 min, 240 min, 480 min, 720 min, 1440 min, 1620 min, 1920 min and 2880 min Serum was obtained, leaving blood samples for 20 min at room temperature for coagulation, and then centrifuged for 20 min at 5000 × g at room temperature. Serum was then isolated and stored at -80 ° C until the IFNG activity was determined using the "Primary Assay" described above. It should be noted that when determining the number of units in serum samples from rat pharmacokinetics experiments, the Actimmune® standard was diluted in DMEM with 5% FBS and 5% rat serum.
Затем количество единиц в сыворотке (AU/мл) наносили на график зависимости от времени и рассчитывали время полужизни в сыворотке с помощью WinNonLin Pro 3.3.Then, the number of units in serum (AU / ml) was plotted against time and the serum half-life was calculated using WinNonLin Pro 3.3.
Аналогичные эксперименты проводили с применением huIFNG в гликозилированной форме и/или Actimmune® для того, чтобы оценить повышение времени полужизни в сыворотке у варианта полипептида IFNG по изобретению по сравнению с гликозилированной формой huIFNG и/или Actimmune®.Similar experiments were performed using huIFNG in glycosylated form and / or Actimmune® in order to evaluate the increase in serum half-life of the IFNG variant polypeptide of the invention compared to the glycosylated form of huIFNG and / or Actimmune®.
Идентификация экспонированных на поверхности аминокислотных остатковIdentification of surface exposed amino acid residues
СтруктурыStructures
Известны экспериментальные трехмерные структуры hulFNG, определенные методом рентгеноструктурного анализа. Ealick et al. Science 252: 698-702 (1991) представили контур расположения С-альфа атомов гомодимера IFNG. Walter et al. Nature 376: 230-235 (1995) представили структуру гомодимера IFNG в комплексе с двумя молекулами растворимой формы рецептора IFNG. Однако координаты этой структуры никогда не были обнародованы. Thiel et al. Structure 8: 927-936 (2000) представили структуру гомодимера IFNG в комплексе с двумя молекулами растворимой формы рецептора IFNG, при этом третья молекула рецептора в структуре не взаимодействовала с гомодимером IFNG.Known experimental three-dimensional structures of hulFNG, determined by x-ray diffraction analysis. Ealick et al. Science 252: 698-702 (1991) presented the outline of the C-alpha atoms of the IFNG homodimer. Walter et al. Nature 376: 230-235 (1995) presented the structure of the IFNG homodimer in complex with two molecules of the soluble form of the IFNG receptor. However, the coordinates of this structure have never been made public. Thiel et al. Structure 8: 927-936 (2000) presented the structure of the IFNG homodimer in complex with two molecules of the soluble form of the IFNG receptor, while the third receptor molecule in the structure did not interact with the IFNG homodimer.
Площадь доступной поверхности (ПДП)Accessible surface area (RAP)
Для расчета площади доступной поверхности (ПДП) индивидуальных атомов в структуре применяли компьютерную программу Access (В.Lee and F.M.Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971), версия 2 (© 1983 Yale University). В этом методе обычно применяется зонд размером в 1,4 Å, а площадь доступной поверхности (ПДП) определяется как площадь, образуемая центром зонда. Перед выполнением этих вычислений из набора координат исключали все молекулы воды, атомы водорода и другие атомы, не связанные непосредственно с белком.To calculate the accessible surface area (LAP) of individual atoms in the structure, the Access computer program was used (B. Lee and FM Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971), version 2 (© 1983 Yale University). The probe is typically 1.4 Å in size and the accessible surface area (DAP) is defined as the area formed by the center of the probe.All water molecules, hydrogen atoms, and other atoms not directly connected with the protein were excluded from the coordinate set before performing these calculations.
Значения относительной ПДП боковых цепейThe values of the relative RAP side chains
Значения относительной ПДП атомов боковой цепи вычисляли путем деления суммы ПДП атомов боковой цепи на величину, представляющую ПДП атомов боковой цепи остатка этого типа в развернутом трипептиде Ala-x-Ala (см. Hubbard, Campbell & Thomton (1991) J.Mol. Biol. 220, 507-530). В этом примере атом СА рассматривается как часть боковой цепи остатков глицина, но не остальных остатков. В качестве стандартных значений 100% ПДП для боковой цепи использовали следующие значения:The relative LDP of the side chain atoms was calculated by dividing the sum of the LDP of the side chain atoms by the value representing the LDP of the side chain atoms of the residue of this type in the expanded Ala-x-Ala tripeptide (see Hubbard, Campbell & Thomton (1991) J. Mol. Biol. 220, 507-530). In this example, the CA atom is considered as part of the side chain of glycine residues, but not of the remaining residues. The following values were used as standard values for 100% RAP for the side chain:
Остатки, не вошедшие в структуру, принимали за экспонированные на 100%, так как считается, что они находятся в гибких участках.Residues that were not included in the structure were taken as exhibited 100%, since it is believed that they are in flexible areas.
Определение расстояний между атомамиDetermination of distances between atoms
Расстояния меду атомами определяли с помощью компьютерной программы молекулярной графики InsightII v.98.0 фирмы MSI Inc.The distances to the honey atoms were determined using the computer program of molecular graphics InsightII v.98.0 company MSI Inc.
Определение сайта связывания с рецепторомDetermination of receptor binding site
Сайт связывания с рецептором определяется как включающий все остатки, у которых площадь доступной поверхности изменяется при связывании с рецептором. Это устанавливали по данным как минимум двух вычислений ПДП: одного для изолированного(ых) лиганда(ов) в комплексе лиганд(ы)/рецептор(ы) и другого для полного комплекса лиганд(ы)/рецептор(ы).The receptor binding site is defined as including all residues in which the surface area of the surface changes upon binding to the receptor. This was established from at least two LDP calculations: one for the isolated ligand (s) in the ligand (s) / receptor (s) complex and the other for the full ligand (s) / receptor (s) complex.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1. Определение экспонированных на поверхности аминокислотных остатковExample 1. Determination of surface exposed amino acid residues
Использовали рентгенографическую структуру гомодимера IFNG в комплексе с двумя молекулами растворимой формы рецептора IFNG, при этом третья молекула рецептора IFNG в структуре не взаимодействовала с гомодимером IFNG, описанную Thiel et al. Structure 8: 927-936 (2000). Структура состоит из гомодимера IFNG, две молекулы которого обозначены А и B. В целях конструирования сюда вставлен дополнительный метионин перед последовательностью IFNG, обозначенный как МО, и последовательность укорочена с С-конца на 10 остатков (последним остатком в сконструированной молекуле является Q133). МО исключали из структуры при всех вычислениях данного примера. Структура двух мономеров IFNG имеет очень слабую электронную плотность после остатка 120, и моделирование остатков доводили только до остатка Т126. Поэтому остатки S121-Т126 исключали из структуры перед проведением вычислений данного примера. Фрагменты двух рецепторов, обозначенные как С и D, непосредственно взаимодействуют с гомодимером IFNG, а третья молекула рецептора, обозначаемая как Е, не имеет контакта с гомодимером IFNG и не включена в эти вычисления.The radiographic structure of the IFNG homodimer was used in combination with two molecules of the soluble form of the IFNG receptor, while the third IFNG receptor molecule in the structure did not interact with the IFNG homodimer described by Thiel et al. Structure 8: 927-936 (2000). The structure consists of an IFNG homodimer, the two molecules of which are designated A and B. For design purposes, additional methionine is inserted here before the IFNG sequence, designated as MO, and the sequence is shortened from the C-terminus by 10 residues (the last residue in the constructed molecule is Q133). MOs were excluded from the structure for all calculations of this example. The structure of the two IFNG monomers has a very weak electron density after
Экспонирование на поверхностиSurface exposure
Проведение расчетов значений относительных ПДП в гомодимере из молекул А и В, исключая МО и S121-T126 в обеих молекулах, показало, что у следующих остатков более 25% боковой цепи экспонировано на поверхности по крайней мере у одного из мономеров: Q1, D2, Р3, К6, Е9, N10, К12, К13, Y14, N16, G18, Н19, S20, D21, А23, D24, N25, G26, Т27, G31, К34, N35, К37, Е38, Е39, S40, К55, К58, N59, К61, D62, D63, Q64, S65, Q67, Кб8, Е71, Т72, К74, Е75, N78, V79, К80, N83, S84, N85, К86, К87, D90, Е93, К94, N97, S99, Т101, D102, L103, N104, H111, Q115, A118 и Е119.Calculation of the relative PDL values in the homodimer of molecules A and B, excluding MO and S121-T126 in both molecules, showed that in the following residues more than 25% of the side chain is exposed on the surface of at least one of the monomers: Q1, D2, P3 , K6, E9, N10, K12, K13, Y14, N16, G18, H19, S20, D21, A23, D24, N25, G26, T27, G31, K34, N35, K37, E38, E39, S40, K55, K58 , N59, K61, D62, D63, Q64, S65, Q67, Kb8, E71, T72, K74, E75, N78, V79, K80, N83, S84, N85, K86, K87, D90, E93, K94, N97, S99 , T101, D102, L103, N104, H111, Q115, A118 and E119.
У следующих остатков более 50% боковой цепи экспонировано на поверхности по крайней мере у одного из мономеров: Q1, D2, P3, K6, Е9, N10, К13, N16, G18, Н19, S20, D21, А23, D24, N25, G26, Т27, G31, К34, К37, Е38, Е39, К55, К58, N59, D62, Q64, S65, К68, Е71, Е75, N83, S84, К86, К87, К94, N97, S99, Т101, D102, L103, N104, Q115, А118, Е119.In the following residues, more than 50% of the side chain is exposed on the surface of at least one of the monomers: Q1, D2, P3, K6, E9, N10, K13, N16, G18, H19, S20, D21, A23, D24, N25, G26 , T27, G31, K34, K37, E38, E39, K55, K58, N59, D62, Q64, S65, K68, E71, E75, N83, S84, K86, K87, K94, N97, S99, T101, D102, L103 , N104, Q115, A118, E119.
Проведение расчетов значений относительных ПДП в гомодимере из молекул А и В, исключая МО и S121-Т126 в обеих молекулах, но в присутствии молекул рецептора С и D показало, что у следующих остатков более 25% боковой цепи экспонировано на поверхности по крайней мере у одного из мономеров: Q1, D2, Р3, К6, Е9, N10, К13, Y14, N16, G18, Н19, D21, N25, G26, G31, К34, N35, К37, Е38, Е39, S40, К55, К58, N59, К61, D62, D63, Q64, S65, Q67, К68, Е71, Т72, К74, Е75, N78, V79, К80, N83, S84, N85, К86, К87, D90, Е93, К94, N97, S99, Т101, D102, L103, N104, Е119.Calculation of the relative PDL values in the homodimer of molecules A and B, excluding MO and S121-T126 in both molecules, but in the presence of C and D receptor molecules, showed that in the following residues more than 25% of the side chain is exposed on at least one surface from monomers: Q1, D2, P3, K6, E9, N10, K13, Y14, N16, G18, H19, D21, N25, G26, G31, K34, N35, K37, E38, E39, S40, K55, K58, N59 , K61, D62, D63, Q64, S65, Q67, K68, E71, T72, K74, E75, N78, V79, K80, N83, S84, N85, K86, K87, D90, E93, K94, N97, S99, T101 , D102, L103, N104, E119.
У следующих остатков более 50% боковой цепи экспонировано на поверхности по крайней мере у одного из мономеров: Р3, К6, N10, К13, N16, D21, N25, G26, G31, К34, К37, Е38, Е39, К55, К58, N59, D62, Q64, S65, К68, Е71, Е75, N83, S84, К86, К87, К94, N97, S99, Т101, D102, L103 и N104.In the following residues, more than 50% of the side chain is exposed on the surface of at least one of the monomers: P3, K6, N10, K13, N16, D21, N25, G26, G31, K34, K37, E38, E39, K55, K58, N59 , D62, Q64, S65, K68, E71, E75, N83, S84, K86, K87, K94, N97, S99, T101, D102, L103 and N104.
Все указанные выше положения являются мишенями для модификации в соответствии с настоящим изобретением.All of the above positions are targets for modification in accordance with the present invention.
Сравнивая оба списка, получаем, что при связывании с рецептором из списка ПДП с более 25% боковой цепи исключаются К12, S20, А23, D24, Т27, H111, Q115 и А118, а из списка ПДП с более 50% боковой цепи при связывании с рецептором исключаются Q1, D2, Е9, G18, Н19, S20, А23, D24, Т27, Q115, А118 и E119.Comparing both lists, we find that when binding to a receptor, K12, S20, A23, D24, T27, H111, Q115, and A118 are excluded from the RAP list with more than 25% of the side chain, and from the list of RAPs with more than 50% of the side chain when binding to Q1, D2, E9, G18, H19, S20, A23, D24, T27, Q115, A118 and E119 are excluded by the receptor.
Остатки, не включенные при определении структуры, рассматриваются как полностью экспонированные на поверхности; это остатки S121, Р122, А123, А124, К125, Т126, G127, К128, R129, К130, R131, S132, Q133, М134, L135, F136, R137, G138, R139, R140, А141, S142, Q143. Эти остатки также представляют отдельные мишени для введения связующих групп в соответствии с настоящим изобретением (их можно рассматривать как принадлежащие к группе экспонированных на поверхности аминокислотных остатков, то есть у которых более 25% или более 50% боковой цепи экспонировано на поверхности).Residues not included in the determination of the structure are considered to be completely exposed on the surface; these are residues S121, P122, A123, A124, K125, T126, G127, K128, R129, K130, R131, S132, Q133, M134, L135, F136, R137, G138, R139, R140, A141, S142, Q143. These residues also represent separate targets for the introduction of linking groups in accordance with the present invention (they can be considered as belonging to the group exposed on the surface of amino acid residues, that is, in which more than 25% or more than 50% of the side chain is exposed on the surface).
Пример 2. Определение сайта связывания с рецепторомExample 2. The definition of the binding site of the receptor
Проведение расчетов ПДП, как описано выше, показало, что у следующих остатков молекулы IFNG значение ПДП уменьшается по крайней мере в одном из мономеров при образовании комплекса по сравнению с расчетными значениями для изолированного димера: Q1, D2, Y4, V5, Е9, К12, G18, Н19, S20, D21, V22, А23, D24, N25, G26, Т27, L30, K34, K37, K108, H111, E112, I114, Q115, A118, E119.Carrying out the calculations of the DAP, as described above, showed that for the following residues of the IFNG molecule, the DAP value decreases in at least one of the monomers during complex formation compared with the calculated values for an isolated dimer: Q1, D2, Y4, V5, E9, K12, G18, H19, S20, D21, V22, A23, D24, N25, G26, T27, L30, K34, K37, K108, H111, E112, I114, Q115, A118, E119.
Пример 3. Конструирование кассеты для экспрессии IFNG с оптимизированным употреблением кодоновExample 3. Construction of cassettes for the expression of IFNG with optimized use of codons
Последовательность ДНК (номер доступа X13274 в GenBank), охватывающей полноразмерную кДНК, кодирующую зрелый huIFNG с его природным сигнальным пептидом, модифицировали так, чтобы облегчить экспрессию на высоком уровне в клетках СНО. Кодоны нуклеотидной последовательности huIFNG модифицировали, создавая предпочтение в употреблении кодонов в сторону тех, что употребляются более часто у Homo sapiens. После этого определенные нуклеотиды в последовательности были заменены другими с тем, чтобы ввести сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции ДНК. Праймеры конструировали таким образом, чтобы можно было синтезировать ген.The DNA sequence (GenBank accession number X13274) encompassing full-length cDNA encoding mature huIFNG with its natural signal peptide was modified to facilitate high level expression in CHO cells. The codons of the huIFNG nucleotide sequence were modified, creating a preference for the use of codons in the direction of those used more often in Homo sapiens. After that, certain nucleotides in the sequence were replaced by others in order to introduce recognition sites for DNA restriction endonucleases. Primers were designed so that the gene could be synthesized.
Праймеры были собраны в синтетический ген методом ПЦР в одну стадию с помощью набора с Platinum Pfx-polymerase (Life Technologies) при стандартных параметрах трех циклов. Собранный ген амплифицировали методом ПЦР в тех же условиях и его последовательность представлена в SEQ ID No:42. Синтезированный ген клонировали в pcDNA3.1/hygro (InVitrogen) между сайтами BamHI и Xbal, получая pIGY-22.The primers were assembled into a synthetic gene by PCR in one step using a Platinum Pfx-polymerase kit (Life Technologies) with standard parameters of three cycles. The collected gene was amplified by PCR under the same conditions and its sequence is presented in SEQ ID No: 42. The synthesized gene was cloned into pcDNA3.1 / hygro (InVitrogen) between the BamHI and Xbal sites to give pIGY-22.
pIGY-22 трансфицировали в клетки СНО К1 с помощью Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в качестве трансфекционного агента. Через 24 часа культуральную среду собирали и анализировали на активность и концентрацию IFNG методом ELISA. При использовании "Первичного анализа", описанного выше, активность составила 1,4×107 AU/мл.pIGY-22 was transfected into CHO K1 cells using Lipofectamine 2000 (Life Technologies) as a transfection agent. After 24 hours, the culture medium was collected and analyzed for activity and IFNG concentration by ELISA. When using the "Primary analysis" described above, the activity was 1.4 × 10 7 AU / ml
Пример 4. Сайт-специфический мутагенезExample 4. Site-specific mutagenesis
Создание вариантов по гликозилированиюCreating glycosylation options
Для введения мутаций в IFNG конструировали олигонуклеотиды таким образом, чтобы можно было ввести ПЦР-индуцированные изменения в экспрессионную плазмиду (pIGY-22) классическим методом ПЦР в две стадии.To introduce mutations in IFNG, oligonucleotides were designed so that PCR-induced changes in expression plasmid (pIGY-22) could be introduced by the classical two-stage PCR method.
Использовали два праймера к вектору вместе со специфическими мутационными праймерами:Used two primers to the vector along with specific mutational primers:
ADJ013: 5′-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3′ (антисмысловой нижний праймер к вектору) (SEQ ID No:43) и ADJ014: 5′-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3′ (смысловой верхний праймер к вектору) (SEQ ID No:44).ADJ013: 5′-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3 ′ (antisense lower primer to vector) (SEQ ID No: 43) and ADJ014: 5′-GGTACGGTGGGAGGTCTAT-3 ′ (semantic upper primer to vector) (SEQ ID No: 44).
Вариант S99T создавали классическим методом ПЦР в две стадии, используя ADJ013 и ADJ014 в качестве праймеров к вектору, ADJ093 (5′-GTTCAGGTCTGTCACGGTGTAATTGGTCAGCTT-3′) (SEQ ID No:45) и ADJ094 (5′-AAGCTGACCAATTACACCGTGACAGACCTGAAC-3′) (SEQ ID No:46) в качестве мутационных праймеров и pIGY-22 в качестве матрицы. Продукт ПЦР длиной 447 п.о. субклонировали в pcDNA3.1/hygro (In Vitrogen) с помощью BamHI и Xbal, получая плазмиду pIGY-48.The S99T variant was created by the classical PCR method in two stages, using ADJ013 and ADJ014 as primers for the vector, ADJ093 (5′-GTTCAGGTCTGTCACGGTGTAATTGGTCAGCTT-3 ′) (SEQ ID No: 45) and ADJ094 (5′-AAGCTACCGCTGA) ID No: 46) as mutational primers and pIGY-22 as a template. 447 bp PCR Product subcloned into pcDNA3.1 / hygro (In Vitrogen) using BamHI and Xbal to obtain plasmid pIGY-48.
pIGY-48 трансфицировали в клетки СНО К1 с помощью Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в качестве трансфекционного агента. Через 24 часа культуральную среду собирали и анализировали на активность IFNG. При использовании "Первичного анализа", описанного выше, активность составила 5,1×106 AU/мл.pIGY-48 was transfected into CHO K1 cells using Lipofectamine 2000 (Life Technologies) as a transfection agent. After 24 hours, the culture medium was collected and analyzed for IFNG activity. Using the “Primary Assay” described above, the activity was 5.1 × 10 6 AU / ml.
Вариант E38N+S40T+S99T создавали классическим методом ПЦР в две стадии, используя ADJ013 и ADJ014 в качестве праймеров к вектору, ADJ091 (5′-CATGATCTTCCGATCGGTCTCGTTCTTCCAATT-3′) (SEQ ID No:47) и ADJ092 (5'-AATTGGAAGAACGAGACCGATCGGAAGATCATG-3') (SEQ ID No:48) в качестве мутационных праймеров и pIGY-48 в качестве матрицы. Продукт ПЦР в 447 bp субклонировали в pcDNA3.1/hygro (In Vitrogen) с помощью BamHI и XbaI, получая плазмиду pIGY-54.The E38N + S40T + S99T variant was created by the two-stage classical PCR method using ADJ013 and ADJ014 as primers for the vector, ADJ091 (5′-CATGATCTTCCGATCGGTCTCGTTCTTCCAATT-3 ′) (SEQ ID No: 47) and ADJ092 (5AGCATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGAT) ') (SEQ ID No: 48) as mutational primers and pIGY-48 as a template. The 447 bp PCR product was subcloned into pcDNA3.1 / hygro (In Vitrogen) using BamHI and XbaI to obtain plasmid pIGY-54.
pIGY-54 трансфицировали в клетки СНО К1 с помощью Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в качестве трансфекционного агента. Через 24 часа культуральную среду собирали и анализировали на активность IFNG. При использовании "Первичного анализа", описанного выше, активность составила 1,3×107 AU/мл.pIGY-54 was transfected into CHO K1 cells using Lipofectamine 2000 (Life Technologies) as a transfection agent. After 24 hours, the culture medium was collected and analyzed for IFNG activity. When using the "Primary analysis" described above, the activity was 1.3 × 10 7 AU / ml
Используя стандартные методы, аналогичные описанным выше, были получены несколько полноразмерных вариантов по гликозилированию. Эти варианты обобщены ниже в табл.1.Using standard methods similar to those described above, several full-sized glycosylation variants were obtained. These options are summarized below in table 1.
Создание укороченных с С-конца вариантов IFNGCreating C-terminated IFNG variants
Укороченные с С-конца варианты IFNG, содержащие стоп-кодон сразу после кодона для Leu135, получали методом ПЦР в одну стадию, используя pIGY-22, pIGY-48 и pIGY-54 в качестве матриц, после чего продукты ПЦР субклонировали в pcDNA3.1/hygro (In Vitrogen) с помощью BamHI и XbaI. При конструировании этих вариантов использовали праймеры: ADJ014 (см. выше, верхний) и 5′-GAGTCTAGATTACAGCATCTGGCTTCTCTT-3′) (SEQ ID No:49) (нижний). Полученные плазмиды были обозначены как pIGY-72 (IFNG дикого типа, укороченный после Leu135), pIGY-73 (вариант S99T, укороченный после Leu135) и pIGY-74 (E38N+S40T+S99T, укороченный после Leu135).C-terminated IFNG variants containing the stop codon immediately after the Leu135 codon were obtained in one-step PCR using pIGY-22, pIGY-48 and pIGY-54 as matrices, after which the PCR products were subcloned into pcDNA3.1 / hygro (In Vitrogen) using BamHI and XbaI. In the design of these variants, primers were used: ADJ014 (see above, upper) and 5′-GAGTCTAGATTACAGCATCTGGCTTCTCTT-3 ′) (SEQ ID No: 49) (lower). The resulting plasmids were designated as pIGY-72 (wild-type IFNG shortened after Leu135), pIGY-73 (S99T variant shortened after Leu135) and pIGY-74 (E38N + S40T + S99T shortened after Leu135).
Создание содержащих цистеин вариантов IFNGCreating cysteine-containing IFNG variants
Варианты IFNG, содержащие остатки цистеина, создавали с помощью набора для сайт-специфического мутагенеза QuickChange™ XL фирмы Stratagene согласно инструкциям изготовителя. Было создано 7 вариантов IFNG, содержащих по одному введенному остатку цистеина, используя pIGY-48 в качестве матрицы: N10C+S99T, N16C+S99T, E38C+S99T, N59C+S99T, N83C+S99T, K94C+S99T и S99T+N104C. Аналогичным образом было создано 6 вариантов IFNG, содержащих по одному введенному остатку цистеина, используя pIGY-54 в качестве матрицы: N10C+E38N+S40T+S99T, N16C+E38N+S40T+S99T, E38N+S40T+N59C+S99T, E38N+S40T+N83C+S99T, E38N+S40T+K94C+S99T, E38N+S40T+S99T+N104C.IFNG variants containing cysteine residues were created using the Stratagene QuickChange ™ XL site-specific mutagenesis kit according to the manufacturer's instructions. 7 IFNG variants were created containing one cysteine residue introduced each using pIGY-48 as the matrix: N10C + S99T, N16C + S99T, E38C + S99T, N59C + S99T, N83C + S99T, K94C + S99T and S99T + N104C. In a similar way, 6 IFNG variants were created containing one cysteine residue introduced using pIGY-54 as a matrix: N10C + E38N + S40T + S99T, N16C + E38N + S40T + S99T, E38N + S40T + N59C + S99T, E38N + S40T + N83C + S99T, E38N + S40T + K94C + S99T, E38N + S40T + S99T + N104C.
Пример 5. Получение PEG-производных содержащих цистеин вариантовExample 5. Obtaining PEG-derivatives containing cysteine options
Все буферы освобождали от кислорода перед употреблением. Концентрацию белка определяли, измеряя А280.All buffers were freed from oxygen before use. Protein concentration was determined by measuring A280.
Получение PEG-производных методом конъюгации через OPSSObtaining PEG-derivatives by conjugation via OPSS
7,2 мл варианта IFNG N16C+S99T (полноразмерного, 1,3 мг/мл) в 5 мМ сукцинате натрия, 4% манните, 0,01% Tween 20, рН 6,0, восстанавливали инкубацией с 300 мкл 0,5 М DTT в течение 30 мин при комнатной температуре. Вариант IFNG обессоливали, пропуская 3 порции по 2,5 мл через колонку для гель-фильтрации NAP25 (Pharmacia) в буфере А (50 мМ фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА, pH 8,1). Каждая порция элюировалась в объеме 3,5 мл.7.2 ml of IFNG variant N16C + S99T (full-size, 1.3 mg / ml) in 5 mM sodium succinate, 4% mannitol, 0.01
mPEG-OPSS (10 кДа) растворяли в буфере А до концентрации 2 мг/мл, добавляли в равном объеме к восстановленному и обессоленному варианту IFNG и инкубировали в течение 60 мин с легким встряхиванием при комнатной температуре.mPEG-OPSS (10 kDa) was dissolved in buffer A to a concentration of 2 mg / ml, added in an equal volume to the reconstituted and desalted IFNG variant and incubated for 60 min with gentle shaking at room temperature.
11 мл реакционной смеси концентрировали до 1-6 мл с помощью колонки Vivaspin 20 (VivaScience) и удаляли оставшийся mPEG гель-фильтрацией на колонке Sephacryl S-100 (Pharmacia), уравновешенной буфером А11 ml of the reaction mixture was concentrated to 1-6 ml using a
Модифицированный PEG вариант IFNG подвергали диафильтрации в 5 мМ сукцинате натрия, 4% манните, pH 6,0, с помощью колонки Vivaspin 6 (VivaScience) и добавляли Tween 20 до 0,01%. Очищенный модифицированный PEG вариант IFNG имел удельную активность в 1,3×106 AU/мг при измерении методом "Первичного анализа", описанным выше (15% от удельной активности соответствующего не модифицированного PEG варианта IFNG).The modified PEG IFNG variant was diafiltered in 5 mM sodium succinate, 4% mannitol, pH 6.0, using a
Получение PEG-производных методом конъюгации через MALObtaining PEG-derivatives by conjugation via MAL
1,6 мл варианта IFNG N59C+S99T (полноразмерного, 1,5 мг/мл) в 5 мМ сукцинате натрия, 4% манните, 0,01% Tween 20, рН 6,0, восстанавливали инкубацией с 64 мкл 0,5 М DTT в течение 30 мин при комнатной температуре. Вариант IFNG обессоливали пропусканием через колонку для гель-фильтрации NAP25 (Pharmacia) в буфере А (50 мМ фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА, pH 8,1). Вариант IFNG элюировался в объеме 3,5 мл.1.6 ml IFNG variant N59C + S99T (full-size, 1.5 mg / ml) in 5 mM sodium succinate, 4% mannitol, 0.01
mPEG-MAL (5 кДа) растворяли в буфере А до концентрации 0,5 мг/мл, добавляли в равном объеме к восстановленному и обессоленному варианту IFNG и инкубировали в течение 120 мин с легким встряхиванием при комнатной температуре.mPEG-MAL (5 kDa) was dissolved in buffer A to a concentration of 0.5 mg / ml, added in equal volume to the reconstituted and desalted IFNG variant and incubated for 120 min with gentle shaking at room temperature.
Добавляли сульфат аммония до концентрации 0,9 М и модифицированный PEG вариант IFNG наносили на колонку Resource™-phenyl (Pharmacia) объемом 1 мл, уравновешенную буфером В (20 мМ фосфат натрия, 0,9 М сульфат аммония, pH 6,6). Колонку промывали 5 объемами буфера В перед элюированием связавшегося модифицированного PEG варианта IFNG 30 колоночными объемами линейного градиента 0-50% буфера С (20 мМ фосфат натрия, pH 6,6). Модифицированный PEG вариант IFNG элюировался в районе 0,6 М сульфата аммония.Ammonium sulfate was added to a concentration of 0.9 M and a modified PEG IFNG variant was loaded onto a 1 ml Resource ™ phenyl (Pharmacia) column equilibrated with buffer B (20 mM sodium phosphate, 0.9 M ammonium sulfate, pH 6.6). The column was washed with 5 volumes of buffer B before eluting the bound PEG modified IFNG variant with 30 column volumes of a linear gradient of 0-50% buffer C (20 mM sodium phosphate, pH 6.6). The modified PEG IFNG variant was eluted in the region of 0.6 M ammonium sulfate.
Фракции, содержащие модифицированный PEG вариант IFNG, объединяли и подвергали диафильтрации в 5 мМ сукцинате натрия, 4% манните, pH 6,0, с помощью колонки Vivaspin 6 (VivaScience) и добавляли Tween 20 до 0,01%. Очищенный модифицированный PEG вариант IFNG имел удельную активность в 2,4×106 AU/мг при измерении методом "Первичного анализа", описанным выше (15% от удельной активности соответствующего не модифицированного PEG варианта IFNG).Fractions containing the modified PEG IFNG variant were pooled and diafiltered in 5 mM sodium succinate, 4% mannitol, pH 6.0, using a
Пример 6. Экспрессия IFNG и вариантов IFNG в клетках млекопитающихExample 6. Expression of IFNG and IFNG variants in mammalian cells
Для временной экспрессии IFNG клетки культивировали до 95% конфлюэнтности в среде DMEM, содержащей питательную смесь F-12 (Ham), L-глутамин, 15 мМ Hepes и пиридоксин-HCl (Life Technologies, кат. №31330-038), с добавлением 1:10 эмбриональной телячьей сыворотки (BioWhittaker, кат. №02-70 IF) и 1:100 смеси пенициллина и стрептомицина (BioWhittaker, кат. №17-602Е). Кодирующие IFNG плазмиды трансфицировали в клетки с помощью Lipofectamine 2000 (Life Technologies) согласно инструкциям изготовителя. Через 24 часа после трансфекции культуральную среду собирали и анализировали на активность IFNG. Кроме того, для определения относительного числа используемых сайтов гликозилирования проводили Вестерн-блоттинг, используя собранную культуральную среду.For the temporary expression of IFNG, cells were cultured up to 95% confluency in DMEM containing the nutrient mixture F-12 (Ham), L-glutamine, 15 mM Hepes and pyridoxine-HCl (Life Technologies, Cat. No. 31330-038), with the addition of 1 : 10 fetal calf serum (BioWhittaker, cat. No. 02-70 IF) and 1: 100 mixture of penicillin and streptomycin (BioWhittaker, cat. No. 17-602E). IFNG-encoding plasmids were transfected into cells using Lipofectamine 2000 (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. 24 hours after transfection, the culture medium was collected and analyzed for IFNG activity. In addition, Western blotting was performed using the collected culture medium to determine the relative number of glycosylation sites used.
Стабильные клоны, экспрессирующие IFNG, были получены при трансфекции клеток СНО К1 плазмидами, кодирующими IFNG, с последующей инкубацией клеток в среде, содержащей гигромицин (0,36 мг/мл). Выделяли и субклонировали стабильно трансфицированные клетки методом предельного разведения. Клоны, продуцирующие высокий уровень IFNG, идентифицировали методом ELISA.Stable clones expressing IFNG were obtained by transfection of CHO K1 cells with plasmids encoding IFNG, followed by incubation of the cells in a medium containing hygromycin (0.36 mg / ml). Stably transfected cells were isolated and subcloned by limiting dilution method. Clones producing high levels of IFNG were identified by ELISA.
Пример 7. Крупномасштабная продукцияExample 7. Large-scale production
Стабильные линии клеток, экспрессирующие IFNG или его варианты, культивировали до конфлюэнтности в среде DMEM, содержащей питательную смесь F-12 (Ham), L-глутамин, 15 мМ Hepes и пиридоксин-HCl (Life Technologies, кат. №31330-038), с добавлением 1:10 эмбриональной телячьей сыворотки (Bio Whittaker, кат. №02-701 F) и 1:100 смеси пенициллина и стрептомицина (Bio Whittaker, кат. №17-602 Е), в роллерных флоконах площадью 1700 см2 (Coming, №431200). Затем среду заменяли на 300 мл UltraCHO с L-глутамином (Bio Whittaker, кат. №12-724 Q), с добавлением 1:500 Ex-Cyte VLE (Serological Proteins Inc., №81-129) и 1:100 смеси пенициллина и стрептомицина (Bio Whittaker, кат. №17-602 Е). После 48 часов культивирования среду заменяли свежей средой UltraCHO с теми же добавками. После следующих 48 часов культивирования среду заменяли средой DMEM, содержащей питательную смесь F-12 (Ham), L-глутамин и пиридоксин-HCl (Life Technologies, кат. №21041-025), с добавлением 1:100 ITS-A (Gibco/BRL, №51300-044), 1:500 Ex-Cyte VLB (Serological Proteins Inc., №81-129) и 1:100 смеси пенициллина и стрептомицина (BioWhittaker, кат. №17-602Е). После этого, через каждые 24 часа культуральную среду собирали и заменяли на 300 мл свежей среды, не содержащей сыворотки, с теми же добавками. Собранную среду фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм для удаления клеток.Stable cell lines expressing IFNG or its variants were cultured to confluence in DMEM medium containing the nutrient mixture F-12 (Ham), L-glutamine, 15 mM Hepes and pyridoxine-HCl (Life Technologies, Cat. No. 31330-038), with the addition of 1:10 fetal calf serum (Bio Whittaker, cat. No. 02-701 F) and 1: 100 mixture of penicillin and streptomycin (Bio Whittaker, cat. No. 17-602 E), in roller flocs with an area of 1700 cm 2 (Coming No. 431200). Then the medium was replaced with 300 ml of UltraCHO with L-glutamine (Bio Whittaker, Cat. No. 12-724 Q), with the addition of 1: 500 Ex-Cyte VLE (Serological Proteins Inc., No. 81-129) and a 1: 100 mixture of penicillin and streptomycin (Bio Whittaker, Cat. No. 17-602 E). After 48 hours of cultivation, the medium was replaced with fresh UltraCHO medium with the same additives. After the next 48 hours of cultivation, the medium was replaced with DMEM containing the nutrient mixture F-12 (Ham), L-glutamine and pyridoxine-HCl (Life Technologies, Cat. No. 21041-025), with the addition of 1: 100 ITS-A (Gibco / BRL, No. 5100-044), 1: 500 Ex-Cyte VLB (Serological Proteins Inc., No. 81-129) and a 1: 100 mixture of penicillin and streptomycin (BioWhittaker, Cat. No. 17-602E). After that, every 24 hours, the culture medium was collected and replaced with 300 ml of fresh serum-free medium with the same additives. The collected medium was filtered through 0.22 μm filters to remove cells.
Пример 8. ОчисткаExample 8. Cleaning
Фильтрат подвергали микрофильтрации (0,22 мкм) и перед ультрафильтрацией приблизительно до 1/15 объема с помощью системы TFF фирмы Millipore. В той же системе концентрат подвергали диафильтрации в 10 мМ Трис, pH 7,6. Добавляли сульфат аммония до концентрации 1,7 М и после перемешивания удаляли выпавший осадок центрифугированием при 8000 об/мин в течение 25 мин в центрифуге Sorvall, используя ротор GS3.The filtrate was subjected to microfiltration (0.22 μm) and before ultrafiltration to approximately 1/15 of the volume using a Millipore TFF system. In the same system, the concentrate was diafiltered in 10 mM Tris, pH 7.6. Ammonium sulfate was added to a concentration of 1.7 M and, after stirring, the precipitate was removed by centrifugation at 8000 rpm for 25 min in a Sorvall centrifuge using a GS3 rotor.
Супернатант наносили на колонку Phenyl Sephasose High Performance (Pharmacia) объемом 25 мл, предварительно уравновешенную 10 мМ Трис, 1,7 М сульфатом аммония, pH 7,6. После нанесения колонку промывали 3 объемами 10 мМ Трис, 1,7 М сульфата аммония, pH 7,6, а затем элюировали связавшийся вариант IFNG пропусканием 10 колоночных объемов линейного градиента до 100% 10 мМ Трис, pH 7,6. Свободный объем, так же как и элюируемый вариант IFNG собирали отдельными фракциями. Фракции, обогащенные вариантом IFNG, объединяли и заменяли буфер на 10 мМ Трис, pH 9,0, путем диафильтрации с помощью системы Vivaflow 200 (VivaScience) с пределом исключения в 10000 кДа.The supernatant was applied to a 25 ml Phenyl Sephasose High Performance (Pharmacia) column, pre-equilibrated with 10 mM Tris, 1.7 M ammonium sulfate, pH 7.6. After application, the column was washed with 3 volumes of 10 mM Tris, 1.7 M ammonium sulfate, pH 7.6, and then the bound IFNG variant was eluted by passing 10 column volumes of a linear gradient to 100% 10 mM Tris, pH 7.6. The free volume, as well as the eluted IFNG variant, was collected in separate fractions. Fractions enriched in IFNG variant were pooled and replaced with 10 mM Tris buffer, pH 9.0, by diafiltration using a Vivaflow 200 system (VivaScience) with an exclusion limit of 10,000 kDa.
Вариант IFNG затем наносили на колонку Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) объемом 18 мл, предварительно уравновешенную 10 мМ Трис, рН 9,0. После нанесения колонку промывали 3 объемами 10 мМ Трис, рН 9,0 перед элюированием связавшегося варианта IFNG 15 колоночными объемами градиента 0-100% 10 мМ Трис, 0,5 М NaCl, рН 9,0. Свободный объем, так же как и элюируемый вариант IFNG собирали отдельными фракциями. Фракции, обогащенные вариантом IFNG, объединяли и заменяли буфер на 10 мМ фосфат натрия, рН 7,0, путем диафильтрации с помощью колонки Vivaspin 20 (VivaScience) с пределом исключения в 10000 кДа.The IFNG variant was then applied to a 18 ml Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) column, pre-equilibrated with 10 mM Tris, pH 9.0. After application, the column was washed with 3 volumes of 10 mM Tris, pH 9.0 before elution of the bound IFNG variant with 15 column volumes of a 0-100% gradient of 10 mM Tris, 0.5 M NaCl, pH 9.0. The free volume, as well as the eluted IFNG variant, was collected in separate fractions. Fractions enriched in IFNG variant were pooled and replaced with 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, by diafiltration using a
После этого вариант IFNG наносили на колонку с гидроксиапатитом СНТ (BioRad) объемом 8 мл, предварительно уравновешенную 10 мМ фосфатом натрия, рН 7,0. После нанесения колонку промывали 5 объемами 10 мМ фосфата натрия, рН 7,0 перед элюированием связавшегося варианта IFNG 30 колоночными объемами градиента 0-60% 500 мМ фосфата натрия, рН 7,0. Свободный объем, так же как и элюируемый вариант IFNG собирали отдельными фракциями. Фракции, содержащие вариант IFNG, объединяли и заменяли буфер на 5 мМ сукцинат натрия, 4% маннит, рН 6,0, с помощью колонки Vivaspin 20 (VivaScience), после чего добавляли Tween 20 до концентрации 0,01%. Вариант IFNG стерилизировали фильтрованием и хранили при -80°С.After that, the IFNG variant was applied to a column with 8 ml hydroxyapatite SNT (BioRad), previously equilibrated with 10 mM sodium phosphate, pH 7.0. After application, the column was washed with 5 volumes of 10 mM sodium phosphate, pH 7.0, before eluting the bound IFNG variant with 30 column volumes of a 0-60% gradient of 500 mM sodium phosphate, pH 7.0. The free volume, as well as the eluted IFNG variant, was collected in separate fractions. Fractions containing IFNG variant were pooled and replaced with 5 mM sodium succinate, 4% mannitol, pH 6.0 buffer using a
В качестве альтернативы варианты IFNG могут быть очищены по нижеследующей схеме очистки.Alternatively, IFNG variants may be purified according to the following purification schedule.
Фильтрат подвергают микрофильтрации (0,22 мкм) перед ультрафильтрацией приблизительно до 1/15 объема с помощью системы TFF фирмы Millipore. В той же системе концентрат подвергают диафильтрации в 10 мМ Трис, pH 7,6, после чего доводят pH до 9,0 и удаляют выпавший осадок фильтрованием через микрофильтр.The filtrate is subjected to microfiltration (0.22 μm) before ultrafiltration to approximately 1/15 of the volume using a Millipore TFF system. In the same system, the concentrate is diafiltered in 10 mM Tris, pH 7.6, after which the pH is adjusted to 9.0 and the precipitate formed is removed by filtration through a microfilter.
Образец наносят на колонку Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), предварительно уравновешенную 10 мМ Трис, pH 9,0. После нанесения колонку промывают 3 объемами 10 мМ Трис, pH 9,0 перед элюированием связавшегося варианта IFNG 15 колоночными объемами градиента 0-100% 10 мМ Трис, 0,5 М NaCl, pH 9,0. Свободный объем, так же как и элюируемый вариант IFNG собирают отдельными фракциями. Фракции, обогащенные вариантом IFNG, объединяют и доводят pH до 7,6. Добавляют сульфат аммония до 1,5 М и после перемешивания удаляют выпавший осадок центрифугированием.The sample was applied to a Q-Sepharose Fast Flow column (Pharmacia), pre-equilibrated with 10 mM Tris, pH 9.0. After application, the column is washed with 3 volumes of 10 mM Tris, pH 9.0 before elution of the bound IFNG variant with 15 column volumes of a gradient of 0-100% 10 mM Tris, 0.5 M NaCl, pH 9.0. The free volume, as well as the eluted IFNG variant, is collected in separate fractions. Fractions enriched in IFNG variant are combined and adjusted to pH 7.6. Ammonium sulfate is added up to 1.5 M and after stirring the precipitate is removed by centrifugation.
Вариант IFNG затем наносят на колонку Phenyl Sephasose High Performance (Pharmacia), предварительно уравновешенную 10 мМ Трис, 1,5 М сульфатом аммония, pH 7,6. После нанесения колонку промывают 3 объемами 10 мМ Трис, 1,5 М сульфатом аммония, pH 7,6 перед элюированием связавшегося варианта IFNG 10 колоночными объемами линейного градиента до 100% 10 мМ Трис, pH 7,6. Свободный объем, так же как и элюируемый вариант IFNG собирают отдельными фракциями. Фракции, обогащенные вариантом IFNG, объединяют и доводят концентрацию сульфата аммония до 1,7 М.The IFNG variant is then applied to a Phenyl Sephasose High Performance (Pharmacia) column, pre-equilibrated with 10 mM Tris, 1.5 M ammonium sulfate, pH 7.6. After application, the column is washed with 3 volumes of 10 mM Tris, 1.5 M ammonium sulfate, pH 7.6 before elution of the bound IFNG variant with 10 column volumes of linear gradient to 100% 10 mM Tris, pH 7.6. The free volume, as well as the eluted IFNG variant, is collected in separate fractions. Fractions enriched in IFNG variant are combined and the concentration of ammonium sulfate is adjusted to 1.7 M.
После этого вариант IFNG наносят на колонку Butyl Sepharose, предварительно уравновешенную 10 мМ фосфатом натрия, 1,7 М сульфатом аммония, pH 7,6. После нанесения колонку промывают 10 мМ фосфатом натрия, 1,7 М сульфатом аммония, pH 7,6 перед элюированием связавшегося варианта IFNG 10 мМ фосфата натрия, pH 6,5 в одну стадию. Свободный объем, так же как и элюируемый вариант IFNG, собирают отдельными фракциями.After that, the IFNG variant was applied to a Butyl Sepharose column, previously equilibrated with 10 mM sodium phosphate, 1.7 M ammonium sulfate, pH 7.6. After application, the column is washed with 10 mM sodium phosphate, 1.7 M ammonium sulfate, pH 7.6 before elution of the bound IFNG variant with 10 mM sodium phosphate, pH 6.5 in one step. The free volume, as well as the eluted IFNG variant, is collected in separate fractions.
Затем фракции, содержащие вариант IFNG, объединяют и наносят на колонку с гидроксиапатитом, предварительно уравновешенную 10 мМ фосфатом натрия, pH 6,5. После нанесения колонку промывают 5 объемами 10 мМ фосфата натрия, рН 6,5 перед элюированием связавшегося варианта IFNG 30 колоночными объемами линейного градиента 0-100% 500 мМ фосфата натрия, pH 6,5. Свободный объем, так же как и элюируемый вариант IFNG собирают отдельными фракциями.Then the fractions containing the IFNG variant are combined and applied to a hydroxyapatite column, previously equilibrated with 10 mM sodium phosphate, pH 6.5. After application, the column is washed with 5 volumes of 10 mM sodium phosphate, pH 6.5 before eluting the bound IFNG variant with 30 column volumes of a linear gradient of 0-100% 500 mM sodium phosphate, pH 6.5. The free volume, as well as the eluted IFNG variant, is collected in separate fractions.
Фракции, содержащие вариант IFNG, объединяют и заменяют буфер на 5 мМ сукцинат натрия, 4% маннит, pH 6,0. После этого добавляют Tween 20 до концентрации 0,01%. Вариант IFNG стерилизуют фильтрованием и хранят при -80°С.Fractions containing the IFNG variant are pooled and replaced with 5 mM sodium succinate, 4% mannitol buffer, pH 6.0. After that,
Пример 9. Активность вариантов и модифицированных PEG вариантовExample 9. The activity of variants and modified PEG variants
Используя "Первичный анализ", описанный выше, получили следующие данные по активности (после кратковременной трансфекции).Using the "Primary analysis" described above, the following activity data were obtained (after short-term transfection).
Активность полноразмерных и укороченных вариантов полипептида rhuIFNG после временной трансфекцииTable 1
The activity of full-sized and shortened variants of the rhuIFNG polypeptide after transient transfection
Используя "Первичный анализ", описанный выше, получили следующие данные по активности (после очистки).Using the "Primary analysis" described above, the following activity data were obtained (after purification).
Активность полноразмерных и укороченных вариантов полипептида rhuIFNG после очисткиtable 2
The activity of full-sized and shortened variants of the rhuIFNG polypeptide after purification
Активность ряда модифицированных PEG вариантов измеряли путем сравнения активности продуктов модификации PEG с образцами, подвергавшимися такой же процедуре модификации PEG (см. выше пример 5), но без добавления самого PEG в реакционную среду. Результаты приведены ниже в табл.3.The activity of a number of modified PEG variants was measured by comparing the activity of PEG modification products with samples subjected to the same PEG modification procedure (see Example 5 above), but without adding PEG to the reaction medium. The results are shown below in table.3.
Активность модифицированных PEG вариантов полноразмерного полипептида rhuIFNGTable 3
The activity of the modified PEG variants of the full-length rhuIFNG polypeptide
Следует подчеркнуть, что данные по активности в табл.1 отражают сочетание удельной активности и уровня экспрессии в клетках СНО-К1. Поэтому можно сделать вывод, что все варианты проявляют сравнимые уровни экспрессии/удельные активности относительно rhuIFNG.It should be emphasized that the activity data in Table 1 reflect the combination of specific activity and expression level in CHO-K1 cells. Therefore, we can conclude that all variants exhibit comparable levels of expression / specific activity relative to rhuIFNG.
Как видно из табл.2, все варианты с цистеином проявляют меньшую удельную активность по сравнению с rhuIFNG, тогда как варианты, содержащие мутации E38N, S40T и/или S99T, сохраняют удельную активность, сравнимую с rhuIFNG. Когда варианты с цистеином подвергались модификации PEG на 5 или 10 кДа, наблюдалось дальнейшее падение удельной активности в 2-3 раза (табл.3). Не ограничиваясь какой-либо одной теорией, можно предполагать, что уменьшение удельной активности может быть вызвано снижением связывания с рецептором вследствие стерических препятствий со стороны конъюгированной группировки PEG.As can be seen from Table 2, all variants with cysteine exhibit lower specific activity compared to rhuIFNG, while variants containing mutations E38N, S40T and / or S99T retain a specific activity comparable to rhuIFNG. When variants with cysteine underwent PEG modification by 5 or 10 kDa, a further decrease in specific activity by 2–3 times was observed (Table 3). Not limited to any one theory, it can be assumed that a decrease in specific activity may be caused by a decrease in receptor binding due to steric hindrances from the conjugated PEG moiety.
Пример 10. Оценка использования сайтов N-гликозилированияExample 10. Evaluation of the use of N-glycosylation sites
Для того, чтобы оценить относительное число используемых сайтов N-гликозилирования, проводили Вестерн-блоттинг, используя собранную культуральную среду (см. фиг.1). Оказалось, что в случае rhuIFNG (полноразмерного) дикого типа в приблизительно 50% используется оба сайта гликозилирования (2N), в примерно 40% используется один сайт гликозилирования (1N) и около 10% не гликозилировано (0N).In order to evaluate the relative number of N-glycosylation sites used, Western blotting was performed using the collected culture medium (see FIG. 1). It turned out that in the case of rhuIFNG (full-sized) wild-type, both glycosylation sites (2N) are used in about 50%, one glycosylation site (1N) is used in about 40%, and about 10% are not glycosylated (0N).
Эти данные согласуются с ранее опубликованными данными Hooker et al., 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287-295, и Sarenva et al., 1995, Biochem. J. 308, 9-14.These data are consistent with previously published data by Hooker et al., 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287-295, and Sarenva et al., 1995, Biochem. J. 308, 9-14.
Как видно из фиг.1, у варианта S99T (полноразмерного) два сайта гликозилирования используются значительно более эффективно, чем у соответствующего дикого типа. Оказалось, что у около 90% варианта S99T используется оба сайта гликозилирования (2N), у примерно 7% используется один сайт гликозилирования (1N) и около 3% не гликозилировано (ON).As can be seen from figure 1, in the variant S99T (full-sized), two glycosylation sites are used much more efficiently than in the corresponding wild type. It turned out that about 90% of the S99T variant uses both glycosylation sites (2N), about 7% uses one glycosylation site (1N) and about 3% is not glycosylated (ON).
Более того, из фиг.1 видно, что введенный сайт гликозилирования в положении 38 у варианта E38N+S40T (полноразмерного) используется значительно лучше по сравнению с неоптимизированным вариантом E38N (полноразмерным).Moreover, it can be seen from FIG. 1 that the introduced glycosylation site at
Эти данные четко показывают, что можно добиться лучшего использования сайтов гликозилирования, будь это природные или введенные сайты, при введении остатка треонина, а не остатка серина, в положение +2 относительно остатка аспарагина.These data clearly show that it is possible to make better use of glycosylation sites, whether these are natural or introduced sites, by introducing a threonine residue, rather than a serine residue, at position +2 relative to the asparagine residue.
Пример 11. Фармакокинетические исследованияExample 11. Pharmacokinetic studies
Значения AUC при подкожном введении (AUCsc) у крыс определяли, как описано выше, у ряда вариантов IFNG. Результаты обобщены в табл.4 и фиг.2, 3.Subcutaneous AUC values (AUC sc ) in rats were determined as described above in a number of IFNG variants. The results are summarized in table 4 and figure 2, 3.
Фармакокинетические данные при подкожном введении крысамTable 4
Pharmacokinetic data for subcutaneous administration to rats
Как видно из фиг.2, 3 и табл.4, варианты (включая модифицированные PEG варианты) проявляют значительно большие значения AUC при подкожном введении по сравнению с rhuIFNG, в частности по сравнению с коммерчески доступным Actimmune®. Обращаясь к фиг.3, следует отметить, что вводимые дозы двух модифицированных PEG вариантов были уменьшены в 2,5 раза по сравнению с вводимой дозой варианта [E38N+S40T+S99T].As can be seen from FIGS. 2, 3 and Table 4, the variants (including the modified PEG variants) show significantly higher AUC values when administered subcutaneously compared to rhuIFNG, in particular compared to the commercially available Actimmune®. Turning to FIG. 3, it should be noted that the administered doses of the two modified PEG variants were reduced by 2.5 times compared with the administered dose of the [E38N + S40T + S99T] variant.
Очевидно, это открывает возможность для введения меньших доз, что ведет к уменьшению побочных эффектов, и/или менее частого введения активного начала, чем в настоящее время, что ведет к лучшему выполнению пациентом назначений врача.Obviously, this opens up the possibility for the introduction of lower doses, which leads to a decrease in side effects and / or less frequent administration of the active principle than at present, which leads to a better fulfillment by the patient of doctor's prescriptions.
Claims (42)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200100579 | 2001-04-06 | ||
| DKPA200100579 | 2001-04-06 | ||
| DKPA200100714 | 2001-05-07 | ||
| DKPA200100714 | 2001-05-07 | ||
| DKPA200200198 | 2002-02-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003132454A RU2003132454A (en) | 2005-05-10 |
| RU2296130C2 true RU2296130C2 (en) | 2007-03-27 |
Family
ID=35746316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003132454/13A RU2296130C2 (en) | 2001-04-06 | 2002-04-04 | Variants of gamma-interferon polypeptide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2296130C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2656140C2 (en) * | 2016-11-14 | 2018-05-31 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России | Method for obtaining a hybrid protein containing a fused protein analogue of an interferon gamma conjugated with oligosaccharide |
| RU2787131C1 (en) * | 2022-08-02 | 2022-12-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Фармаклон" | RECOMBINANT PLASMID pET32a-IFG144 PROVIDING SYNTHESIS OF INTERFERON GAMMA, BACTERIAL STRAIN ESCHERICHIA COLI JM109/pET32a-IFG144 PRODUCER OF INTERFERON GAMMA PROTEIN AND METHOD FOR OBTAINING INTERFERON GAMMA |
-
2002
- 2002-04-04 RU RU2003132454/13A patent/RU2296130C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2656140C2 (en) * | 2016-11-14 | 2018-05-31 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России | Method for obtaining a hybrid protein containing a fused protein analogue of an interferon gamma conjugated with oligosaccharide |
| RU2787131C1 (en) * | 2022-08-02 | 2022-12-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Фармаклон" | RECOMBINANT PLASMID pET32a-IFG144 PROVIDING SYNTHESIS OF INTERFERON GAMMA, BACTERIAL STRAIN ESCHERICHIA COLI JM109/pET32a-IFG144 PRODUCER OF INTERFERON GAMMA PROTEIN AND METHOD FOR OBTAINING INTERFERON GAMMA |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003132454A (en) | 2005-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7504237B2 (en) | Polynucleotides encoding interferon gamma polypeptides | |
| US7419805B2 (en) | Polynucleotides encoding S99T interferon gamma polypeptide variants and means of expression | |
| US7390638B2 (en) | S99T C-11 Truncated polynucleotides encoding interferon gamma polypeptide variants | |
| US20030186386A1 (en) | Interleukin 10 | |
| US7230081B1 (en) | Interferon gamma conjugates | |
| EP1257574A1 (en) | Improved interleukin 10 | |
| WO2002081507A2 (en) | Interferon gamma polypeptide variants | |
| US7524931B2 (en) | Full-length interferon gamma polypeptide variants | |
| RU2268749C2 (en) | Interferon-gamma conjugates | |
| RU2296130C2 (en) | Variants of gamma-interferon polypeptide | |
| AU782635B2 (en) | Interferon gamma conjugates | |
| AU2002252971B2 (en) | Interferon gamma polypeptide variants | |
| AU2002252971A1 (en) | Interferon gamma polypeptide variants | |
| ZA200308376B (en) | Interferon gamma polypeptide variants. | |
| CZ20033016A3 (en) | Interferon gamma polypeptide variants | |
| CN101172160A (en) | Interferon gamma conjugates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090405 |