RU2292895C2 - Method for selecting mononuclear human bone marrow cells - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method involves bone marrow sample obtained by aspiration in puncturing iliac bone crest. It is layered over density gradient of 1.077 g/l and centrifuged 30 min long at 400 g and temperature of 18-22°C. Mononuclear cells are collected from phase separation boundary. To take 100 ml of bone marrow by aspiration, 20 ml of heparinized physiologic saline is introduced with heparin concentration of 2500 units/ml. Before layering, the heparinized aspirated bone marrow IS preliminarily precipitated during 30 min at temperature of 18-22°C. Then, upper 2/3 of cellular suspension is taken and the sample is diluted twice as much with heparinized phosphate-bufferized physiologic saline having heparin concentration of 10 units/ml. After having finished layering and centrifuging, the cell layer, collected from phase separation boundary, is washed with heparinized phosphate-bufferized physiologic saline having heparin concentration of 10 units/ml by means of triple centrifuging 10 min long each, at 400 g and temperature of 18-22°C, and the cellular suspension is brought to required concentration.

EFFECT: higher amount of viable cells.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в кардиологии при внедрении методов регенерационной клеточной терапии у больных инфарктом миокарда.The invention relates to medicine, namely to immunology, and can be used in cardiology when introducing methods of regenerative cell therapy in patients with myocardial infarction.

Известен способ выделения фракции мононуклеаров из периферической крови и костного мозга человека [1], который включает взятие 3 мл костного мозга или 5 мл периферической крови с гепарином в дозе 20 ЕД на 1 мл костного мозга или периферической крови. В случае работы с цельной кровью ее разводят равным объемом фосфатно-солевого буфера с рН 7,2 (ФСБ). В случае работы с лейковзвесью кровь предварительно термостатируют в течение 30 мин при 37°С для оседания эритроцитов, затем собирают лейковзвесь, не затрагивая осевшие эритроциты. Взвесь клеток, полученную обоими способами, наслаивают на рабочий раствор градиента плотности (1,077 г/л) и центрифугируют 30 мин при 400 g и температуре 18-22°С. Собранный с границы раздела фаз слой клеток центрифугируют 10 мин при 300 g, удаляют надосадочную жидкость и после разведения раствором Хэнкса центрифугируют 10 мин при 300 g. После чего удаляют надосадочную жидкость, подсчитывают количество клеток, определяют их жизнеспособность и доводят до нужной рабочей концентрации.A known method of isolating a fraction of mononuclear cells from human peripheral blood and bone marrow [1], which involves taking 3 ml of bone marrow or 5 ml of peripheral blood with heparin at a dose of 20 PIECES per 1 ml of bone marrow or peripheral blood. When working with whole blood, it is diluted with an equal volume of phosphate-saline buffer with a pH of 7.2 (FSB). In the case of work with leukemia suspension, the blood is preliminarily thermostated for 30 min at 37 ° C for sedimentation of red blood cells, and then a leukemia suspension is collected without affecting the settled red blood cells. The cell suspension obtained by both methods, layered on a working solution of a density gradient (1.077 g / l) and centrifuged for 30 min at 400 g and a temperature of 18-22 ° C. The cell layer collected from the interface is centrifuged for 10 min at 300 g, the supernatant is removed, and after dilution with Hanks solution, centrifuged for 10 min at 300 g. Then remove the supernatant, count the number of cells, determine their viability and bring to the desired working concentration.

Недостатком этого способа является значительная потеря мононуклеарных клеток в результате тромбообразования в шприце и их адгезии на стенках пробирок.The disadvantage of this method is the significant loss of mononuclear cells as a result of thrombosis in the syringe and their adhesion to the walls of the tubes.

Цель изобретения: увеличение количества жизнеспособных мононуклеарных клеток костного мозга для их использования в различных способах регенерационной клеточной терапии.The purpose of the invention: increasing the number of viable mononuclear cells of the bone marrow for their use in various methods of regenerative cell therapy.

Поставленная цель достигается техническим решением, представляющим способ выделения мононуклеарных клеток костного мозга человека, заключающийся в получении 100 мл аспирата костного мозга во время пункции гребня подвздошной кости с 20 мл гепаринизированного физиологического раствора с концентрацией гепарина 2500 ЕД/мл в шприцах. Далее гепаринизированный аспират костного мозга предварительно отстаивают в течение 30 мин при температуре 18-22°С, затем собирают верхние 2/3 клеточной взвеси обедненной эритроцитами, после чего эту пробу разводят в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором (рН 7,2-7,4) с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл. Затем полученную пробу наслаивают на градиент плотности HISTOPAQUE-1077 (SIGMA diagnostics), центрифугируют в течение 30 мин при 400 g и температуре 18-22°С. После чего собирают слой мононуклеарных клеток с границы раздела фаз. Собранные мононуклеарные клетки трехкратно отмывают гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл центрифугированием по 10 мин при 400 g и температуре 18-22°С, после чего доводят клеточность суспензии до нужной концентрации.The goal is achieved by a technical solution, which represents a method for isolating human bone marrow mononuclear cells, which consists in obtaining 100 ml of bone marrow aspirate during puncture of the iliac crest with 20 ml of heparinized saline solution with a heparin concentration of 2500 IU / ml in syringes. Next, heparinized bone marrow aspirate is pre-sedimented for 30 min at a temperature of 18-22 ° C, then the upper 2/3 cell suspension of red blood cells depleted is collected, after which this sample is diluted 2 times with heparinized phosphate-buffered saline (pH 7.2- 7.4) with a heparin concentration of 10 PIECES / ml. Then the resulting sample is layered on a density gradient HISTOPAQUE-1077 (SIGMA diagnostics), centrifuged for 30 min at 400 g and a temperature of 18-22 ° C. Then collect a layer of mononuclear cells from the phase boundary. The collected mononuclear cells are washed three times with heparinized phosphate-buffered saline with a concentration of heparin of 10 IU / ml by centrifugation for 10 min at 400 g and a temperature of 18-22 ° C, after which the suspension is brought to the desired concentration.

Новым в предлагаемом способе является то, что взятие аспирата костного мозга проводят с гепаринизированным физиологическим раствором в шприцах, перед наслаиванием гепаринизированный аспират костного мозга предварительно отстаивают, собирают верхние 2/3 клеточной взвеси, обедненной эритроцитами, разводят в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором, после наслаивания и центрифугирования слой клеток отмывают гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором, 3-кратным центрифугированием и доводят клеточность суспензии до нужной концентрации, а также режимы и условия осуществления данных новых стадий.New in the proposed method is that the capture of bone marrow aspirate is carried out with heparinized saline in syringes, before layering the heparinized bone marrow aspirate is pre-sedimented, the upper 2/3 of the cell suspension depleted in red blood cells is collected, diluted 2 times with heparinized phosphate-buffered saline , after layering and centrifugation, the cell layer is washed with heparinized phosphate-buffered saline, 3 times centrifuged and they bring the cellularity of the suspension to the desired concentration, as well as the modes and conditions for the implementation of these new stages.

В регенерационной клеточной терапии, в настоящее время, используются стволовые клетки костного мозга в силу их плюрипотентности. Вместе с тем, способы выделения чистого пула стволовых клеток костного мозга слишком затратны. Стволовые клетки (гемопоэтические и мезенхимальные) содержатся в мононуклеарной фракции клеток костного мозга. Обладая мультипотентными свойствами, эти клетки могут способствовать замещению дефектов тканей и неоангиогенезу. Кроме того, лимфоидные клетки этой фракции в силу своих морфогенетических способностей могут принимать участие в процессах восстановительной регенерации поврежденных органов и тканей. Это обусловливает востребованность мононуклеарных клеток костного мозга в клинической медицине.In regenerative cell therapy, bone marrow stem cells are currently used because of their pluripotency. However, methods for isolating a clean pool of bone marrow stem cells are too costly. Stem cells (hematopoietic and mesenchymal) are contained in the mononuclear fraction of bone marrow cells. With multipotent properties, these cells can contribute to the replacement of tissue defects and neoangiogenesis. In addition, the lymphoid cells of this fraction, due to their morphogenetic abilities, can take part in the processes of regenerative regeneration of damaged organs and tissues. This determines the demand for bone marrow mononuclear cells in clinical medicine.

Несмотря на то что, костный мозг является очень пластичным материалом, и при потерях быстро восстанавливает свою клеточность, в клинических условиях, мы ограничены в объеме его одномоментного забора. Кроме того, стволовые клетки являются адгезирующими, и прилипают к стеклу и пластику во время их выделения. Это свойство затрудняет работу с ними особенно тогда, когда стоит задача их обратного переноса в организм человека для создания высокой концентрации в поврежденном органе. Поэтому оптимизация способов выделения стволовых клеток костного мозга, обеспечивающая получение их максимального количества, является необходимой задачей, решение которой будет способствовать повышению эффективности клеточной терапии.Despite the fact that the bone marrow is a very plastic material, and in case of loss it quickly regains its cellularity, in clinical conditions, we are limited in the volume of its simultaneous collection. In addition, stem cells are adherent and adhere to glass and plastic during their isolation. This property makes it difficult to work with them especially when the task is to transfer them back to the human body to create a high concentration in the damaged organ. Therefore, the optimization of methods for isolating bone marrow stem cells, ensuring their maximum number, is a necessary task, the solution of which will contribute to increasing the efficiency of cell therapy.

Работа с костным мозгом осложняется известной проблемой, а именно его повышенной свертываемостью. Это очень актуально при получении большого количества (100 мл) аспирата костного мозга, в результате чего пролонгируется время его забора, и экспозиция аспирата в шприце до начала выделения клеток. Наличие в шприце чистого гепарина в дозе 25000 ЕД во время забора костного мозга не приводит к полной профилактике тромбообразования. А разведение гепарина физиологическим раствором, до получения объема 20 мл, без увеличения дозы гепарина, приводит к увеличению поверхности соприкосновения гепарина и аспирата, что обеспечивает их быстрое взаимодействие, и в конечном итоге, обеспечивает отсутствие тромбообразования в шприце. Поскольку силикон снижает потери прикрепляющихся клеток, можно использовать силиконирование центрифужных пробирок. Это легко реализуется при работе in vitro. Однако когда выделенные клетки используются в терапевтических целях (для трансплантации), необходимо соблюдение определенных правил [2], предъявляемых экспертным советом Минздрава России. Одним из требований этой инструкции является использование стерильных одноразовых пластиковых расходных материалов. Из-за сложности соблюдения стерильности силиконирование пробирок в этих условиях не является эффективным способом решения проблемы потери клеток. По нашему мнению, применение гепаринизированного фосфатно-забуференного физиологического раствора во время работы с мононуклеарными клетками костного мозга устраняет необходимость силиконирования пробирок. Гепарин имеет большой отрицательный заряд [3] и обладает способностью адсорбироваться на клетках крови [4], и в результате отталкивания отрицательных зарядов нарушается адгезия и агрегация клеток крови. Кроме того, ингибирование образования тромбина гепарином приводит к прерыванию коагуляционного каскада гемостаза, следствием чего является отсутствие тромбообразования в шприце с аспиратом костного мозга.Work with bone marrow is complicated by a known problem, namely its increased coagulability. This is very important when receiving a large amount (100 ml) of bone marrow aspirate, as a result of which the time of its collection is prolonged, and the exposure of the aspirate in the syringe until cell isolation begins. The presence in the syringe of pure heparin at a dose of 25,000 units during bone marrow collection does not lead to complete prevention of thrombosis. And dilution of heparin with saline, until a volume of 20 ml is obtained, without increasing the dose of heparin, leads to an increase in the contact surface of heparin and aspirate, which ensures their rapid interaction, and ultimately ensures the absence of thrombosis in the syringe. Since silicone reduces the loss of adherent cells, centrifuge tubes can be used to siliconeize. It is easily realized when working in vitro. However, when the isolated cells are used for therapeutic purposes (for transplantation), certain rules must be observed [2], presented by the expert council of the Russian Ministry of Health. One of the requirements of this manual is the use of sterile disposable plastic consumables. Due to the difficulty of maintaining sterility, the siliconeization of tubes under these conditions is not an effective way to solve the problem of cell loss. In our opinion, the use of heparinized phosphate buffered saline while working with bone marrow mononuclear cells eliminates the need for silicone tubes. Heparin has a large negative charge [3] and has the ability to adsorb on blood cells [4], and as a result of repulsion of negative charges, the adhesion and aggregation of blood cells is disrupted. In addition, the inhibition of the formation of thrombin by heparin leads to the interruption of the coagulation cascade of hemostasis, resulting in the absence of thrombosis in a syringe with bone marrow aspirate.

Новые существенные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста.New significant features showed in the inventive combination of new properties that are not explicitly derived from the prior art in this field and are not obvious to a specialist.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в исследованной авторами литературе.An identical set of features was not found in the literature studied by the authors.

Предлагаемый способ может быть использован в медицинской практике, так как позволяет получить необходимое количество жизнеспособных мононуклеарных клеток костного мозга для различных способов регенерационной клеточной терапии.The proposed method can be used in medical practice, as it allows you to get the required number of viable bone marrow mononuclear cells for various methods of regenerative cell therapy.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое техническое решение соответствующим критериям охраноспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».Based on the foregoing, it should be considered that the proposed technical solution meets the eligibility criteria “Novelty”, “Inventive step”, “Industrial applicability”.

Способ осуществляется следующим образом. После обезболивания 10%-ным раствором лидокаина пунктируется крыло подвздошной кости человека в области ее передне-верхней трети по известной методике [5]. Взятие аспирата костного мозга выполняется в два 60-миллитровых шприца, в каждом из которых содержится 25000 ЕД гепарина и 10 мл стерильного физиологического раствора. Затем полученный аспират отстаивают для осаждения эритроцитов в течение 30 минут при температуре 18-22°С, собирают верхние 2/3 клеточной взвеси обедненной эритроцитами и разводят в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором (рН 7,2-7,4). После чего приготовленную пробу наслаивают на раствор HISTOPAQUE-1077 (SIGMA diagnostics) в соотношении 1:1 в десяти 50-миллилитровых центрифужных пробирках. После чего выполняют центрифугирование в течение 30 мин при 400 g и температуре 18-22°С. Собирают слой мононуклеарных клеток с раздела фаз и переносят в 4 другие центрифужные пробирки, разводят в 3-5 раз гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором, тщательно ресуспендируют, центрифугируют 10 мин при 400 g, удаляют надосадочную жидкость, полученный осадок клеток в каждой пробирке разводят 10 мл гепаринизированного фосфатно-забуференного физиологического раствора и центрифугируют 10 мин при 400 g, удаляют надосадочную жидкость, вновь разводят клеточный осадок в каждой пробирке 10 мл гепаринизированного фосфатно-забуференного физиологического раствора и центрифугируют 10 мин при 400 g, удаляют надосадочную жидкость и разводят весь клеточный осадок в пробирках 20 мл гепаринизированного физиологического раствора. Подсчитывают общее количество выделенных клеток. Для этого смешивают 0,2 мл пробы суспензии мононуклеаров из каждой пробирки и 3%-ный водный раствор уксусной кислоты в соотношении 1 к 20. Считают в камере Горяева и получают количество клеток в одном миллилитре. Проводят определение жизнеспособности клеток методом отторжения красителя (трипановый синий), при котором краситель не проникает сквозь мембраны живых клеток. Доводим концентрацию жизнеспособных клеток до 2-4×10⁶ в 1 мл гепаринизированным физиологическим раствором.The method is as follows. After anesthesia with a 10% solution of lidocaine, the human ilium wing is punctured in the region of its anterior-upper third by a known method [5]. Bone marrow aspirate is taken in two 60-milliliter syringes, each containing 25,000 units of heparin and 10 ml of sterile saline. Then, the obtained aspirate was defended for erythrocyte sedimentation for 30 minutes at a temperature of 18-22 ° C, the upper 2/3 cell suspension of red blood cells depleted was collected and diluted 2 times with heparinized phosphate-buffered saline (pH 7.2-7.4). Then the prepared sample is layered on a solution of HISTOPAQUE-1077 (SIGMA diagnostics) in a ratio of 1: 1 in ten 50-ml centrifuge tubes. Then perform centrifugation for 30 min at 400 g and a temperature of 18-22 ° C. A layer of mononuclear cells is collected from the phase separation and transferred to 4 other centrifuge tubes, diluted 3-5 times with heparinized phosphate-buffered saline, carefully resuspended, centrifuged for 10 min at 400 g, the supernatant is removed, the resulting cell pellet in each tube is diluted 10 ml of heparinized phosphate-buffered saline and centrifuged for 10 min at 400 g, remove the supernatant, re-dilute the cell pellet in each tube 10 ml of heparinized phosphate but-buffered saline, and centrifuged for 10 min at 400 g, the supernatant is removed and diluted whole cell pellet in 20 ml heparinized tubes saline. Count the total number of selected cells. To do this, mix 0.2 ml of a sample of a suspension of mononuclear cells from each tube and a 3% aqueous solution of acetic acid in a ratio of 1 to 20. Count in the Goryaev chamber and get the number of cells in one milliliter. Cell viability is determined by dye rejection (trypan blue), in which the dye does not penetrate the membranes of living cells. Bring the concentration of viable cells to 2-4 × 10 ⁶ in 1 ml of heparinized saline.

Пример.Example.

Больной Г., 60 лет, поступил в отделение неотложной кардиологии через 5 часов от начала ангинозного статуса с признаками ишемического повреждения миокарда в области переднебоковой стенки левого желудочка и острой сердечной недостаточности II ФК по Т. Killip. Больному выполнена системная тромболитическая терапия кабикиназой 750000 ЕД. На 16-е сутки болезни под местной анестезией 10%-ным раствора лидокаина, пунктировали гребень подвздошной кости в области передне-верхней ости и получили 100 мл аспирата костного мозга в шприцы, содержащие гепаринизированный физиологический раствор. Далее этот гепаринизированный аспират костного мозга отстаивали течение 30 мин при температуре 20°С, после чего собрали верхние 2/3 клеточной взвеси, обедненной эритроцитами, развели эту пробу в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл. Полученную пробу наслаивали на градиент плотности HISTOPAQUE-1077 (SIGMA diagnostics), центрифугировали в течение 30 мин при 400 g и температуре 20°С. Слой мононуклеарных клеток собрали с границы раздела фаз. Собранные мононуклеарные клетки трехкратно отмыли гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл с помощью центрифугирования по 10 мин при 400 g и температуре 20°С. Развели клеточный осадок в 20 мл гепаринизированного физиологического раствора с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл. Считали общее количество выделенных клеток в камере Горяева. Для этого смешали 0,2 мл пробы суспензии мононуклеаров из каждой пробирки и 3%-ный водный раствор уксусной кислоты в соотношении 1 к 20. В результате получили 108×10⁶ клеток с концентрацией 5,4×10⁶мл. Провели определение жизнеспособности клеток методом отторжения красителя (трипановый синий), которая составила 98%. Довели концентрацию жизнеспособных клеток до 2,5×10⁶ в 1 мл гепаринизированного физиологического раствора.Patient G., 60 years old, was admitted to the emergency cardiology department 5 hours after the onset of anginal status with signs of ischemic myocardial damage in the anterolateral wall of the left ventricle and acute heart failure II FC according to T. Killip. The patient underwent systemic thrombolytic therapy with cabicinase 750,000 units. On the 16th day of the disease under local anesthesia with a 10% lidocaine solution, the iliac crest was punctured in the anteroposterior spine and 100 ml of bone marrow aspirate was obtained in syringes containing heparinized saline. Next, this heparinized bone marrow aspirate was defended for 30 min at a temperature of 20 ° C, after which the upper 2/3 cell suspension, depleted in red blood cells, was collected, diluted this sample with 2 times heparinized phosphate-buffered saline solution with a concentration of 10 PIECES / ml heparin. The resulting sample was layered on a density gradient of HISTOPAQUE-1077 (SIGMA diagnostics), centrifuged for 30 min at 400 g and a temperature of 20 ° C. A layer of mononuclear cells was collected from the phase boundary. The collected mononuclear cells were washed three times with heparinized phosphate-buffered saline with a concentration of heparin of 10 U / ml by centrifugation for 10 min at 400 g and a temperature of 20 ° C. The cell pellet was diluted in 20 ml of heparinized saline solution with a heparin concentration of 10 PIECES / ml. The total number of selected cells in the Goryaev chamber was counted. For this, 0.2 ml of a sample of a suspension of mononuclear cells from each tube and a 3% aqueous solution of acetic acid were mixed in a ratio of 1 to 20. As a result, 108 × 10 ⁶ cells with a concentration of 5.4 × 10 ⁶ ml were obtained. The cell viability was determined by dye rejection (trypan blue), which amounted to 98%. The concentration of viable cells was adjusted to 2.5 × 10 ⁶ in 1 ml of heparinized saline.

В случаях, когда аспират костного мозга забирали в шприцы, без гепарина, происходило очень быстрое образование сгустка в шприце, что делало невозможным дальнейшую работу с клетками, если аспират костного мозга забирали в шприцы, содержащие неразведенный физиологическим раствором гепарин в той же дозе (25000 ЕД гепарина на шприц), образовывались тромбы, количество выделенных мононуклеарных клеток снижалось до 15-20 млн. Отмывание мононуклеарных клеток костного мозга фосфатно-забуференным физиологическим раствором без гепарина приводило к снижению количества выделенных клеток на 30%.In cases when bone marrow aspirate was taken into syringes without heparin, clot formation in the syringe was very rapid, which made it impossible to continue working with cells if bone marrow aspirate was taken into syringes containing undiluted saline in the same dose (25000 units heparin per syringe), blood clots formed, the number of isolated mononuclear cells decreased to 15-20 million. Washing of bone marrow mononuclear cells with phosphate-buffered saline without heparin led to sn decrease in the number of selected cells by 30%.

Таким образом, применение предлагаемого способа выделения мононуклеарных клеток костного мозга в отличие от прототипов приводило к увеличению количества получаемых жизнеспособных мононуклеарных клеток костного мозга, что, несомненно, будет способствовать повышения эффективности лечения.Thus, the application of the proposed method for the isolation of bone marrow mononuclear cells, in contrast to the prototypes, led to an increase in the number of viable bone marrow mononuclear cells obtained, which, undoubtedly, will increase the treatment efficiency.

Список литературыBibliography

1. Тотолян А.А., Балдуева И.А., Бубнова Л.Н., Закревская А.В., Зуева Е.Е., Калинина Н.М., Лисицина З.Н. Методические рекомендации. Стандартизация методов иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека // Медицинская иммунология. - 1999. - T.1, №5. - С.21-43.1. Totolyan A.A., Baldueva I.A., Bubnova L.N., Zakrevskaya A.V., Zueva E.E., Kalinina N.M., Lisitsina Z.N. Guidelines. Standardization of immunophenotyping methods for human blood cells and bone marrow // Medical Immunology. - 1999. - T.1, No. 5. - S. 21-43.

2. Временная инструкция о порядке исследований в области клеточных технологий и их использования в учреждениях здравоохранения // www.Celltransplantation.2. Temporary instructions on the order of research in the field of cellular technologies and their use in health facilities // www.Celltransplantation.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2 т. Т.2: пер. с англ. - М.: Мир, 2004. - С.330.3. Murray R., Grenner D., Meyes P., Rodwell V. Human biochemistry: 2 vol. Vol. 2: trans. from English - M .: Mir, 2004 .-- P.330.

4. Венгеровский А.И. Лекции по фармакологии для врачей и провизоров. - Томск: STT, 2001. - С.476.4. Vengerovsky A.I. Lectures on pharmacology for doctors and pharmacists. - Tomsk: STT, 2001. - P.476.

5. Руководство по гематологии: В 2 т. T.1/ под редакцией А.И.Воробьева. - М.: Медицина. - 1985. - С.53-57.5. Guide to hematology: In 2 vol. T.1 / edited by A.I. Vorobyov. - M.: Medicine. - 1985. - P.53-57.

Claims (1)

Способ выделения мононуклеарных клеток костного мозга человека, заключающийся в получении аспирата костного мозга во время пункции гребня подвздошной кости, наслаивании его на градиент плотности (1,077 г/л), центрифугировании в течение 30 мин при 400 g и температуре 18-22°С, сборе слоя мононуклеарных клеток с границы раздела фаз, отличающийся тем, что взятие 100 мл аспирата костного мозга проводят с 20 мл гепаринизированного физиологического раствора с концентрацией гепарина 2500 ЕД/мл, перед наслаиванием гепаринизированный аспират костного мозга предварительно отстаивают в течение 30 мин при температуре 18-22°С, затем собирают верхние 2/3 клеточной взвеси обедненной эритроцитами, после чего эту пробу разводят в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл, а далее, после наслаивания и центрифугирования, слой клеток собранный с границы раздела фаз отмывают гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД /мл трехкратным центрифугированием по 10 мин при 400 g и температуре 18-22°С, после чего доводят клеточность суспензии до нужной концентрации.The method of isolation of human bone marrow mononuclear cells, which consists in obtaining bone marrow aspirate during puncture of the iliac crest, layering it on a density gradient (1.077 g / l), centrifuging for 30 min at 400 g and a temperature of 18-22 ° C, collection layer of mononuclear cells from the phase boundary, characterized in that the capture of 100 ml of bone marrow aspirate is carried out with 20 ml of heparinized saline solution with a heparin concentration of 2500 IU / ml, before layering heparinized bone marrow aspirate pre-sediment for 30 min at a temperature of 18-22 ° C, then the upper 2/3 cell suspension of erythrocyte depleted is collected, after which this sample is diluted 2 times with heparinized phosphate-buffered saline solution with a heparin concentration of 10 PIECES / ml, and then after layering and centrifugation, the cell layer collected from the phase boundary is washed with heparinized phosphate-buffered saline with a heparin concentration of 10 IU / ml by centrifugation three times for 10 min at 400 g and a temperature of 18-22 ° C C, after which the cellularity of the suspension is adjusted to the desired concentration.