RU2290204C1 - Recombinant fused protein, preparation for immunotherapy based on thereof and method for immunotherapy of relapsing larynx papillomatosis - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine, biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the development of a recombinant fused protein consisting of an oncoprotein E7 VPCH 11 type with a sequence SEQ № 2 and protein of "heat shock" Hsp 70 from M. tuberculosis cells prepared by using plasmid pQE30-E711-dnaK in E. coli cells. The preparation is used against relapsing human papillovirus comprises the recombinant fused protein in the effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier. Method for immunotherapy of relapsing larynx papillomatosis involves intracutaneous administration of indicated preparation in a patient. The advantage of invention involves the development of a novel preparation showing improved immunological indices. Proposed preparative formulations can be used in immunotherapy of relapsing larynx papillomatosis in humans.

EFFECT: valuable medicinal properties of protein, improved method for treatment.

3 cl, 6 dwg, 7 ex

Description

Рецидивирующий (возвратный) респираторный папилломатоз (РРП) - наиболее часто встречающаяся опухоль дыхательных путей, занимающая первое место среди причин возникновения хронической обструкции гортани у детей. Несмотря на то, что папиллома является доброкачественной опухолью, у детей в связи с частым рецидивированием, бурным ростом и анатомической узостью просвета гортани заболевание клинически протекает тяжело, с явлениями стеноза дыхательных путей, который при неоказании своевременной помощи может привести к летальному исходу.Recurrent (recurrent) respiratory papillomatosis (RRP) is the most common airway tumor, ranking first among the causes of chronic laryngeal obstruction in children. Despite the fact that papilloma is a benign tumor, in children due to frequent relapse, rapid growth and anatomical narrowness of the lumen of the larynx, the disease is clinically difficult, with symptoms of stenosis of the respiratory tract, which if failure to provide timely help can lead to death.

Этиологическим фактором РРП является вирус папилломы человека (ВПЧ). В настоящее время определено более 70 типов вируса, однако, по данным литературы, при идентификации ДНК ВПЧ в биопсийном материале большинства больных РРП определяются, в основном, генотипы вируса 6, 11, 16 и 18. Данные, приводимые в литературе по сравнительной распространенности различных субтипов ВПЧ у детей, их взаимосвязи с тяжестью заболевания и влиянию на эффективность противорецидивного лечения весьма противоречивы.The etiological factor of RRS is the human papillomavirus (HPV). Currently, more than 70 types of virus have been identified, however, according to the literature, when identifying HPV DNA in the biopsy material of most patients with RRS, the genotypes of the virus 6, 11, 16 and 18 are determined mainly. Data cited in the literature on the comparative prevalence of various subtypes HPV in children, their relationship with the severity of the disease and the effect on the effectiveness of anti-relapse treatment is highly controversial.

По данным литературы, в США частота возникновения РРП составляет приблизительно 2350 новых случаев в год у детей и 3600 - у взрослых (0,6-4,3 на 100000 и 1,6-3,8 на 100000 соответственно). В Дании частота РРП составляет 3,84 на 100000, в том числе у детей -3,62 на 100000 и у взрослых - 3,94 на 100000 населения.According to the literature, in the United States the incidence of RRS is approximately 2,350 new cases per year in children and 3,600 in adults (0.6–4.3 per 100,000 and 1.6–3.8 per 100,000, respectively). In Denmark, the frequency of RRS is 3.84 per 100,000, including 3.62 per 100,000 in children and 3.94 per 100,000 in adults.

В клинике восстановительной хирургии гортани ДГКБ св. Владимира (клиническая база научной группы НИЦ ММА им. И.М.Сеченова) в 2002 г находилось на лечении 182 ребенка страдающих РРП; ежегодно в клинику госпитализируется 15-30 новых больных. В целом в Российской Федерации ежегодно регистрируется около 4000 новых случаев папилломатоза гортани у детей и взрослых.At the Clinic for Reconstructive Surgery of the Larynx of DGKB St. Vladimir (the clinical base of the scientific group of the Research Center of MMA named after I.M.Sechenov) in 2002, 182 children suffering from RRS were treated; annually 15-30 new patients are hospitalized in the clinic. In general, about 4000 new cases of laryngeal papillomatosis in children and adults are registered annually in the Russian Federation.

Лечение детей с РРП представляет собой нерешенную проблему. Основным методом лечения является хирургическое удаление папиллом, заключающееся в удалении папиллом дыхательных путей микроинструментами, лазером или ультразвуком под контролем современной оптики. Однако изолированное использование хирургических методов не предотвращает развития последующих рецидивов заболевания. Более того, повторные операции зачастую приводят к развитию рубцового стеноза гортани, приводя к глубокой инвалидности. Кроме того, рост папиллом на голосовых складках приводит к возникновению выраженных нарушений голосовой функции, вплоть до афонии, обуславливая и множество психологических и социальных проблем, а также вызывая стойкие дезадаптивные изменения личности ребенка.Treatment of children with RRS is an unresolved problem. The main treatment method is surgical removal of papillomas, which consists in removing papillomas of the respiratory tract with micro-instruments, a laser or ultrasound under the control of modern optics. However, the isolated use of surgical methods does not prevent the development of subsequent relapses of the disease. Moreover, repeated operations often lead to the development of cicatricial stenosis of the larynx, leading to deep disability. In addition, the growth of papillomas in the vocal folds leads to the appearance of pronounced violations of the vocal function, up to aphonia, causing many psychological and social problems, as well as causing persistent maladaptive changes in the personality of the child.

В связи с этим на протяжении последних десятилетий активно проводится поиск возможностей повышения эффективности лечения РРП. В настоящее время наиболее эффективным является применение, наряду с хирургическим методом, препаратов интерферона (ИФН). Данные об эффективности применения препаратов ИФН разноречивы. По результатам различных авторов, эффект от ИФН-терапии составляет от 20% до 50%. Кроме того, использование рекомбинантных ИФН имеет существенные экономические, социальные и медицинские недостатки: высокая стоимость препаратов, необходимость внутримышечных инъекций 3 раза в неделю в течение 1-2 лет и более, возможные побочные эффекты.In this regard, over the past decades, a search has been actively conducted for ways to increase the effectiveness of treatment of RRS. Currently, the most effective is the use, along with the surgical method, of interferon preparations (IFN). Data on the effectiveness of the use of IFN drugs are controversial. According to the results of various authors, the effect of IFN therapy is from 20% to 50%. In addition, the use of recombinant IFN has significant economic, social and medical disadvantages: the high cost of drugs, the need for intramuscular injections 3 times a week for 1-2 years or more, possible side effects.

Наиболее перспективными представляются разработки таких новых методик лечения РРП как иммунотерапия с помощью вакцин.The most promising are the development of such new methods of treating RRS as vaccine immunotherapy.

Фармацевтическая компания «Стрессген Биотехнологии» (Stressgen Biotechnologies corp.) разработала терапевтическую вакцину для лечения РРП. Основой вакцины является гибридный рекомбинантный белок, состоящий из онкобелка Е7 ВПЧ 16 типа и белка «теплового шока» из M.tuberculosis Hsp 65 (патент США 6524825, Чу Н.Рандалл, Миззен Ли, Ву Хуаченг Билл. Иммунные ответы на антигены ВПЧ, вызываемые композициями, которые представляют собой ВПЧ антиген и стресс-белок либо экспрессионный вектор, способный к экспрессии указанных белков. (Chu N.Randall, Mizzen Lee, Wu Huacheng Bill. Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins). Данное техническое решение может быть указано в качестве ближайшего аналога-прототипа.The pharmaceutical company Stressgen Biotechnologies corp. Has developed a therapeutic vaccine for the treatment of RRS. The vaccine is based on a hybrid recombinant protein consisting of type E7 HPV oncoprotein 16 and heat shock protein from M. tuberculosis Hsp 65 (US patent 6524825, Chu N. Randall, Mizzen Lee, Wu Huacheng Bill. Immune responses to HPV antigens caused by compositions that are an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expressing these proteins. (Chu N. Randall, Mizzen Lee, Wu Huacheng Bill. Immune responses against HPV antigens elicited by composition composed an HPV antigen and stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins) .This technical solution can be specified as stve closest analog prototype.

Недавно были опубликованы результаты клинических испытаний этой вакцины. Трехкратное применение вакцины в дозе 500 мкг позволило более чем на 40% увеличить интервал между рецидивами.Recently published the results of clinical trials of this vaccine. Three-time use of the vaccine at a dose of 500 μg allowed more than 40% to increase the interval between relapses.

Однако полной остановки рецидивов авторам добиться не удалось. По нашему мнению, неудачи в применении вакцины обусловлены тем, что в состав вакцины входит онкобелок Е7 ВПЧ 16-го типа, тогда как РРП вызывается в основном ВПЧ 11 и 6 типов. Причем как было показано нами, в специально проведенных исследованиях, в биопсийном материале больных РРП преимущественно обнаруживается ВПЧ 11 типа. Кроме того, ВПЧ 11 типа вызывает заболевание с более агрессивным течением. Таким образом, применение онкобелка Е7 16-го типа фармацевтической компанией «Стрессген Биотехнологии» (Stressgen Biotechnologies corp.) было не вполне оправдано. Достачно сравнить аминокислотные последовательности белков Е7 тип 11 и 16, чтобы убедиться в отсутствии выраженной гомологии между ними, а следовательно, и перекрестных антигенных детерминант. Поэтому трудно ожидать выраженного лечебного эффекта при терапии РРП, вызванного ВПЧ 11 типа, вакциной, сконструированной на основе белка Е7 16 типа. По нашему мнению, для иммунотерапии РРП следует использовать Е7 11 типа, что позволит достичь максимального эффекта. Причем аналогичный эффект следует ожидать при использовании нашей вакцины в случае терапии РРП, обусловленного ВПЧ 6 типа, так как между ними имеется выраженная гомология. Для улучшения иммуногенных свойств онкобелка Е7 компания «Стрессген Биотехнологии» (Stressgen Biotechnologies corp.) использовала белок «теплового шока» Hsp 65.However, the authors did not succeed in completely stopping relapses. In our opinion, the failure to use the vaccine is due to the fact that the vaccine contains the oncoprotein E7 HPV type 16, while RRS is caused mainly by HPV types 11 and 6. Moreover, as we have shown, in specially conducted studies, HPV type 11 is predominantly found in the biopsy material of patients with RRS. In addition, HPV type 11 causes a disease with a more aggressive course. Thus, the use of 16-type E7 oncoprotein by the pharmaceutical company Stressgen Biotechnologies (Stressgen Biotechnologies corp.) Was not entirely justified. It is sufficient to compare the amino acid sequences of the E7 type 11 and 16 proteins to ensure that there is no pronounced homology between them, and therefore, cross antigenic determinants. Therefore, it is difficult to expect a pronounced therapeutic effect in the treatment of RRP caused by HPV type 11, a vaccine designed on the basis of type E7 protein 16. In our opinion, type 11 E7 should be used for RRP immunotherapy, which will achieve the maximum effect. Moreover, a similar effect should be expected when using our vaccine in the case of RRP therapy caused by HPV type 6, since there is a pronounced homology between them. To improve the immunogenic properties of the E7 oncoprotein, the company Stressgen Biotechnologies (Stressgen Biotechnologies corp.) Used the heat shock protein Hsp 65.

Задача настоящего изобретения - получение рекомбинантного белка, препарата на его основе, имеющего улучшенные иммунологические характеристики, а также более эффективного способа иммунотерапии.The objective of the present invention is to obtain a recombinant protein, a drug based on it, having improved immunological characteristics, as well as a more effective method of immunotherapy.

Задача решается новым препаратом, созданным на основе рекомбинантного белка состоящего из онкобелка Е7 ВПЧ 11 типа и белка «теплового шока» из M.tuberculosis Hsp 70, и ее использованием для иммунотерапии рецидивирующего папилломатоза.The problem is solved by a new drug, created on the basis of a recombinant protein consisting of type 11 HPV oncoprotein HPV type 11 and heat shock protein from M. tuberculosis Hsp 70, and its use for immunotherapy of recurrent papillomatosis.

Рекомбинантный гибридный белок характеризуется тем, что состоит из онкобелка Е7 ВПЧ 11 типа с последовательностью SEQ №2 и белка «теплового шока» из M.tuberculosis Hsp 70, и получен с помощью плазмиды pQE30-E711-dnaK в клетках E.coli.The recombinant fusion protein is characterized in that it consists of type 11 HPV E7 oncoprotein with SEQ sequence No. 2 and heat shock protein from M. tuberculosis Hsp 70, and was obtained using plasmid pQE30-E711-dnaK in E. coli cells.

Препарат содержит синтезированный указанный рекомбинантный гибридный белок в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель. В качестве носителя могут быть любые приемлемые для введения иммуногенного белка основы, в частности, могут быть использованы гидроокись алюминия, маннитол, полиоксидоний. Под эффективным количеством следует понимать количество, которое должно быть достаточным для лечения или профилактики. Оно будет зависеть от возраста, пола, веса, состояния пациента. Эффективное количество предпочтительно составляет от 100 до 2500 мкг. Препарат обладает высокой степенью стандартности, слабой реактогенностью.The preparation contains a synthesized indicated recombinant fusion protein in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier. As the carrier can be any suitable for the introduction of immunogenic protein bases, in particular, can be used aluminum hydroxide, mannitol, polyoxidonium. An effective amount should be understood as an amount that should be sufficient for treatment or prevention. It will depend on the age, gender, weight, condition of the patient. An effective amount is preferably 100 to 2500 micrograms. The drug has a high degree of standardization, weak reactogenicity.

Разработан также способ иммунотерапии рецидивирующего папилломатоза гортани, согласно которому пациенту внутрикожно вводят препарат против папилломовируса человека в количестве 0,1-2,5 мг белка в одной дозе, при необходимости с повторным введением препарата через две недели.A method has also been developed for immunotherapy of recurrent laryngeal papillomatosis, according to which the patient is administered intradermally a drug against human papillomovirus in an amount of 0.1-2.5 mg of protein in a single dose, if necessary, with repeated administration of the drug after two weeks.

По нашим данным, Hsp 70 имеет лучшие иммуномодулирующие характеристики, которые не зависят от типа HLA. Разработанный препарат дает лучшие клинические результаты, а именно: значительно увеличивает интервал между рецидивами, и может быть использован при вакцинации неоднородной человеческой популяции, а также при тяжелых формах заболевания.According to our data, Hsp 70 has the best immunomodulating characteristics that are independent of the type of HLA. The developed drug gives the best clinical results, namely: it significantly increases the interval between relapses, and can be used for vaccination of a heterogeneous human population, as well as in severe forms of the disease.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами его осуществления.The invention can be illustrated by the following examples of its implementation.

Пример 1.Example 1

Типирование вирусов папилломы у пациентов с диагнозом РРП.Typing of papilloma viruses in patients diagnosed with RRS.

Послеоперационный материал от пациентов с диагнозом РРП использовался для определения типов ВПЧ. ДНК ВПЧ удалось определить у всех 26 детей (в том числе первичный результат был подтвержден при повторном исследовании у всех 3 детей, обследованных двухкратно). Изолированное инфицирование 11 типом вируса обнаружено у 15 пациентов (57,7%); изолированное инфицирование 6 типом вируса обнаружено у 7 детей (26,9%); остальные 4 ребенка (15,4%) оказались инфицированными и 6 и 11 типами ВПЧ одновременно (Фиг.1 и 2). Инфицирования 16 и 18 типами ВПЧ ни в одном случае выявлено не было.Postoperative material from patients diagnosed with RRP was used to determine the types of HPV. HPV DNA was detected in all 26 children (including the primary result was confirmed by repeated testing in all 3 children examined twice). Isolated infection with 11 types of virus was found in 15 patients (57.7%); isolated infection with type 6 virus was detected in 7 children (26.9%); the remaining 4 children (15.4%) were infected and 6 and 11 types of HPV at the same time (Figs. 1 and 2). Infections with 16 and 18 types of HPV were not detected in any case.

На фиг.1 представлена фотография агарозных гелей при исследовании папиллом ВПЧ 6 типа. (Стрелкой показаны целевые бенды. Поскольку праймеры были подобраны для последующего синтеза белков Е7 ВПЧ 6 и 11 типов, они дали дополнительные бенды с геномной ДНК человека).Figure 1 presents a photograph of agarose gels in the study of HPV type 6 papillomas. (The arrow shows the target bands. Since the primers were selected for subsequent synthesis of E7 HPV proteins of types 6 and 11, they gave additional bends with human genomic DNA).

На фиг.2 представлена фотография агарозных гелей при исследовании папиллом ВПЧ 11 типа. (Стрелкой показаны целевые бенды. Поскольку праймеры были подобраны для последующего синтеза белков Е 7 ВПЧ 6 и 11 типов, они дали дополнительные бенды с геномной ДНК человека).Figure 2 presents a photograph of agarose gels in the study of HPV type 11 papillomas. (The arrow shows the target bands. Since the primers were selected for the subsequent synthesis of E 7 HPV proteins of types 6 and 11, they gave additional bends with human genomic DNA).

Пример 2.Example 2

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей онкобелков Е7 ВПЧ 6, 11 и 16 типов.Comparative analysis of amino acid sequences of oncoproteins E7 HPV types 6, 11 and 16.

Alignment of E7 протеинов, ВПЧ 6 and 11Alignment of E7 Protein, HPV 6 and 11

Е7 ВПЧ6 SEQ №1E7 HPV6 SEQ No. 1

MHGRHVTLKDIVLDLQPPDPVGLHCYEQLVDSSEDEVDEVDGQDSQPLKQHYQIVTCCCGMHGRHVTLKDIVLDLQPPDPVVLLHCYEQLVDSSEDEVDEVDGQDSQPLKQHYQIVTCCCG

Е7 ВПЧ11 SEQ №2E7 HPV11 SEQ No. 2

MHGRLVTLKDIVLDLQPPDPVGLHCYEQLEDSSEDEVDKVDKQDAQPLTQHYQILTCCCGMHGRLVTLKDIVLDLQPPDPDPVGLHCYEQLEDSSEDEVDKVDKQDAQPLTQHYQILTCCCG

E7 ВПЧ6 SEQ №3 CDSNVRLWQCTETDIREVQQLLLGTLNIVCPICAPKTE7 HPV6 SEQ No. 3 CDSNVRLWQCTETDIREVQQLLLGTLNIVCPICAPKT

E7 ВПЧ11 SEQ №4 CDSNVRLWECTDGDIRQLQDLLLGTLNIVCPICAPKPE7 HPV11 SEQ No. 4 CDSNVRLWECTDGDIRQLQDLLLGTLNIVCPICAPKP

Multiple alignment of E7 proteins, ВПЧ 6, 11 and 16Multiple alignment of E7 proteins, HPV 6, 11 and 16

E7 ВПЧ6E7 HPV6

MHGRHVTLKDIVLDLQPPDPVGLHCYEQLVDSSEDEVDEVDGQDSQPLKQHYQIVTCCMHGRHVTLKDIVLDLQPPDPVVLLHCYEQLVDSSEDEVDEVDGQDSQPLKQHYQIVTCC

Е7 ВПЧ11E7 HPV11

MHGRLVTLKDIVLDLQPPDPVGLHCYEQLEDSSEDEVDKVDKQDAQPLTQHYQILTCCMHGRLVTLKDIVLDLQPPDPVVLLHCYEQLEDSSEDEVDKVDKQDAQPLTQHYQILTCC

E7 ВПЧ16E7 HPV16

MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

E7 ВПЧ6 CGCDSNVRLWQCTETDIREVQQLLLGTLN1VCPICAPKTE7 HPV6 CGCDSNVRLWQCTETDIREVQQLLLGTLN1VCPICAPKT

E7 ВПЧ11 CGCDSNVRLWECTDGDIRQLQDLLLGTLNIVCPICAPKPE7 HPV11 CGCDSNVRLWECTDGDIRQLQDLLLGTLNIVCPICAPKP

E7 ВПЧ16 CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPE7 HPV16 CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP

Пример 3Example 3

Конструирование рекомбинантной вакцины, кодирующей синтез гибридного белка Е7 11-Hsp 70 (см. фиг.3).Construction of a recombinant vaccine encoding the synthesis of a hybrid protein E7 11-Hsp 70 (see figure 3).

Пример 4Example 4

Получение продуцента гибридного белка, содержащего Е7 пептид ВПЧ 11 типа и DnaK (HSP70) М.tuberculosis.Obtaining a producer of a hybrid protein containing E7 type 11 HPV peptide and M. tuberculosis DnaK (HSP70).

1. ПЦР-амплификация гена Е7 вируса папилломы человека 11 типа.1. PCR amplification of the E7 gene of human papillomavirus type 11.

В качестве матрицы был использован предоставленный препарат геномной ДНК клинического образца, прошедший предварительную проверку на присутствие ДНК 11 типа вируса папилломы человека.As the matrix, the provided preparation of the genomic DNA of the clinical sample was used, which passed a preliminary test for the presence of DNA of type 11 human papillomavirus.

ПЦР амплификацию проводили с помощью праймеров:PCR amplification was performed using primers:

Е7-11-FE7-11-F GAAGATCTATGCATGGAAGACTTGTTACGAAGATCTATGCATGGAAGACTTGTTAC Е7-11-RE7-11-R CGGGATCCTGGTTTTGGTGCGCAGATGGCGGGATCCTGGTTTTGGTGCGCAGATGG

Инициирующий кодон находится в одной рамке считывания с последовательностью 6HIS tag, терминирующий кодон отсутствует.The initiating codon is in the same reading frame with the 6HIS tag sequence; there is no terminating codon.

2. Клонирование последовательности гена Е7 в рекомбинантном векторе-продуценте DnaK.2. Cloning of the sequence of the E7 gene in a recombinant producer vector DnaK.

Был использован ранее полученный вектор pQESO-dnaK-Y (см. схему на фиг.4), обеспечивающий экспрессию белка DnaK, слитого с последовательностью 6HIS на N-конце. ПЦР фрагмент гена Е7 был обработан рестриктазами BamHI и BgIII и клонирован в BamHI сайте плазмиды pQE30-dnaK-Y. Рекомбинанты, имеющие вставку в правильной ориентации, были идентифицированы при помощи рестрикционного анализа. Схема конструкции приводится на прилагаемом фиг.4. Следует отметить, что рекомбинантная плазмида pQE30-Е711-dnaK обеспечивает продукцию гибридного белка 6HIS-Е7(тип 11)-DnaK.The previously obtained pQESO-dnaK-Y vector was used (see the scheme in Fig. 4), which provides expression of the DnaK protein fused to the 6HIS sequence at the N-terminus. The PCR fragment of the E7 gene was digested with restriction enzymes BamHI and BgIII and cloned at the BamHI site of plasmid pQE30-dnaK-Y. Recombinants having the insert in the correct orientation were identified by restriction analysis. The design diagram is given in the attached figure 4. It should be noted that the recombinant plasmid pQE30-E711-dnaK provides the production of the hybrid protein 6HIS-E7 (type 11) -DnaK.

3. Выращивание штамма продуцента белка Е7 ВПЧ тип 11 и DnaK(HSP70) M.tuberculosis.3. The cultivation of the producer protein strain E7 HPV type 11 and DnaK (HSP70) M. tuberculosis.

Для культивирования штамма продуцента используют питательную среду Лурия-Бертани состава:For the cultivation of the producer strain using a nutrient medium Luria-Bertani composition:

На 10 л берут 100 г триптона, 50 г дрожжевого экстракта, 100 г натрия хлорида и бакто агар. К стерилизованной среду добавляют ампициллин до конечной концентрации 50 мг/мл. Инкубируют среду с штаммом при 37°С в течение ночи.100 g of tryptone, 50 g of yeast extract, 100 g of sodium chloride and bacto agar are taken per 10 l. Ampicillin is added to the sterilized medium to a final concentration of 50 mg / ml. Incubate the medium with the strain at 37 ° C. overnight.

4. Продукция Е7(11)-DnaK4. Products E7 (11) -DnaK

Синтез гибридного белка E7(11)-DnaK индуцировали при помощи IPTG следующим способом:The synthesis of the E7 (11) -DnaK fusion protein was induced using IPTG in the following manner:

Ночную культуру DLT1270/ pQE30-E711-dnaK, выращенную в LB-бульоне, разводили 1:100 и выращивали в LB-бульоне (среда Лурия-Бертани) на качалке до плотности OD₆₀₀-0.5.The night culture DLT1270 / pQE30-E711-dnaK grown in the LB broth was diluted 1: 100 and grown in the LB broth (Luria-Bertani medium) on a shaker to a density of OD ₆₀₀ -0.5.

Затем вносили 0.1 mM IPTG и продолжали выращивание в течение 3 часов.Then, 0.1 mM IPTG was added and cultivation was continued for 3 hours.

Продукцию белка контролировали при помощи SDS-PAGE. Наблюдали синтез белка ожидаемой молекулярной массы.Protein production was monitored by SDS-PAGE. The protein synthesis of the expected molecular weight was observed.

5. Выделение рекомбинантного гибридного белка, состоящего из онкобелка Е7 ВПЧ 11 типа с последовательностью SEQ №2 и белка «теплового шока» из M.tuberculosis Hsp 70, и полученного с помощью плазмиды pQE30-E711-dnaK в клетках E.coli.5. Isolation of a recombinant fusion protein consisting of type 11 HPV oncoprotein E7 with SEQ sequence No. 2 and heat shock protein from M. tuberculosis Hsp 70 and obtained using plasmid pQE30-E711-dnaK in E. coli cells.

Сырьем служит биомасса рекомбинантного штамма E.coli.The raw material is the biomass of the recombinant E. coli strain.

Рекомбинантный белок, по мере роста штамма, накапливается в протоплазме в виде телец включения.Recombinant protein, as the strain grows, accumulates in the protoplasm in the form of inclusion bodies.

Получение и отмывка телец включения.Obtaining and washing inclusion bodies.

К клеточной биомассе Е.coli добавляли раствор А: 50 mM Tris (121.14 г/моль) 0.5 М, NaCl (58.44 г/моль), 5 mM EDTA (372.2 г/моль), 1% неионного детергента Nonidet P-40, ImM PMSF (174.2 г/моль). pH=7.5±0.3Solution A was added to the E. coli cell biomass: 50 mM Tris (121.14 g / mol) 0.5 M, NaCl (58.44 g / mol), 5 mM EDTA (372.2 g / mol), 1% non-ionic detergent Nonidet P-40, ImM PMSF (174.2 g / mol). pH = 7.5 ± 0.3

Получали гомогенный раствор, который подвергали обработке ультразвуком на дезинтеграторе B.Braun (USA).A homogeneous solution was obtained, which was subjected to sonication on a B. Braun disintegrator (USA).

Обработанный ультразвуком раствор суспензии центрифугировали на центрифуге Beckman J2-21, при 10000 RPM, при +4°С, в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали. К осадку (тельца включения) добавляли раствор В: 50 mM Tris (121.14 г/моль), 0.5 М NaCl (58.44 г/моль), 4 mM EDTA (372.2 г/моль), 2М мочевина (60.06 г/моль), 0.5 mM PMSF (174.2 г/моль), 0.05% Nonidet P-40 (w/w), pH=7.5±0.3, гомогенизировали его и центрифугировали в том же режиме.The sonicated suspension solution was centrifuged on a Beckman J2-21 centrifuge, at 10,000 RPM, at + 4 ° C, for 10 min. The supernatant was discarded. Solution B was added to the precipitate (inclusion bodies): 50 mM Tris (121.14 g / mol), 0.5 M NaCl (58.44 g / mol), 4 mM EDTA (372.2 g / mol), 2M urea (60.06 g / mol), 0.5 mM PMSF (174.2 g / mol), 0.05% Nonidet P-40 (w / w), pH = 7.5 ± 0.3, homogenized it and centrifuged in the same mode.

Обработку раствором В повторяли 2 раза при тех же параметрах.Solution B treatment was repeated 2 times with the same parameters.

Затем, тельца включения были обработаны 2 раза так же раствором С: 50 mM Tris (121.14 г/моль), 0.5 М NaCl (58.44 г/моль), 1.5 mM EDTA (372.2 г/моль), 2 М мочевина (60.06 г/моль).Then, inclusion bodies were treated 2 times with the same C solution: 50 mM Tris (121.14 g / mol), 0.5 M NaCl (58.44 g / mol), 1.5 mM EDTA (372.2 g / mol), 2 M urea (60.06 g / mole).

Растворение отмытых телец включения и рефолдинг целевого продукта.Dissolution of the washed inclusion bodies and refolding of the target product.

К полученному осадку (тельца включения) добавляли раствор Д: 25 mM Tris (121.14 г/моль), 0.25 М NaCl (58.44 г/моль), 8М мочевина (60.06 г/моль), 10 mM DTT (154.24 г/моль), рН=8.0±0.2 с последующим гомогенизированием.To the resulting precipitate (inclusion bodies), solution D was added: 25 mM Tris (121.14 g / mol), 0.25 M NaCl (58.44 g / mol), 8M urea (60.06 g / mol), 10 mM DTT (154.24 g / mol), pH = 8.0 ± 0.2 followed by homogenization.

Полученную смесь обрабатывали ультразвуком на дезинтеграторе B.Braun (USA).The resulting mixture was sonicated on a B. Braun disintegrator (USA).

После соникации, раствор декантировали, и центрифугировали на центрифуге Beckman J2-21, ротор Beckman JA-14, при 12000 RPM, при +4°С, в течение 20 мин.After sonication, the solution was decanted and centrifuged in a Beckman J2-21 centrifuge, Beckman JA-14 rotor, at 12000 RPM, at + 4 ° С, for 20 min.

Осадок отбрасывали, а супернатант декантировали. Раствор телец включения ставили на магнитную мешалку, подавали раствор PBS: 0.1 М Na₂HPO₄ (142 г/моль), 1.45 М NaCl (58.44 г/моль), рН=7.5±0.2 и перемешивали.The pellet was discarded, and the supernatant was decanted. The inclusion Taurus solution was placed on a magnetic stirrer, PBS solution was fed: 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (142 g / mol), 1.45 M NaCl (58.44 g / mol), pH = 7.5 ± 0.2, and mixed.

Полученный раствор подвергали тангенциальной ультрафильтрации с одновременным диализом на раствор PBS. Раствор был сконцентрирован.The resulting solution was subjected to tangential ultrafiltration with simultaneous dialysis on a solution of PBS. The solution was concentrated.

На фиг.5 и 6 представлена экспрессия гибридного белка, состоящего из онкобелка Е7 ВПЧ 11 типа с последовательностью SEQ №2 и белка «теплового шока» из M.tuberculosis Hsp 70, и полученного с помощью плазмиды pQE30-E711-dnaK в клетках E.coli.Figures 5 and 6 show the expression of a hybrid protein consisting of type 11 HPV oncoprotein E7 with SEQ sequence No. 2 and heat shock protein from M. tuberculosis Hsp 70 and obtained using plasmid pQE30-E711-dnaK in E. cells. coli.

Пример 5Example 5

Изготовление лекарственной формы вакцины.The manufacture of the dosage form of the vaccine.

Очищенный рекомбинантный белок смешивается с препаратом гидроокиси алюминия (в соотношении на 1 мг белка 0,4 мг гидроокиси алюминия), тщательно перемешивается в мягких условиях в течение 20 минут. После этого суспензия центрифугируется при 5000 оборотах/мин, супернатант собирается и используется для измерения остаточного белка. Осадок, представлющий собой гидроокись алюминия с сорбированным белком, суспендируется в фосфатном буфере и разливается по флаконам. Концентрация белка в одной дозе составляет 0,5 мг.The purified recombinant protein is mixed with an aluminum hydroxide preparation (in a ratio of 1 mg of protein 0.4 mg of aluminum hydroxide), thoroughly mixed under mild conditions for 20 minutes. After this, the suspension is centrifuged at 5000 rpm, the supernatant is collected and used to measure residual protein. The precipitate, which is aluminum hydroxide with sorbed protein, is suspended in phosphate buffer and poured into vials. The concentration of protein in a single dose is 0.5 mg.

Пример 6Example 6

Очищенный рекомбинантный белок в концентрации 2,5 мг в мл фосфатного буфера разливается во флаконы по 0,2 мл, содержащих 10 мг маннитола, и лиофилизирируется. Каждый флакон содержит 0,5 мг белка.Purified recombinant protein at a concentration of 2.5 mg per ml of phosphate buffer is dispensed into 0.2 ml vials containing 10 mg of mannitol and lyophilized. Each vial contains 0.5 mg of protein.

Пример 7Example 7

Способ иммунотерапии возвратного папилломатоза гортани.Method for immunotherapy of recurrent laryngeal papillomatosis.

Реакция на введение вакцинных препаратов чрезвычайно индивидуальна, что обусловлено особенностями организации основного комплекса гистосовместимости. В связи с этим каждый случай введения препарата требует индивидуально подхода и объективных лабораторных критериев эффективности проводимой терапии. В качестве таких критериев использован уровень антителогенеза в сыворотке пациентов после введения каждой очередной дозы препарата и показатель активации гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в отношении белка Е7. Этот параметр оценивали с помощью кожной пробы путем внутрикожного введения 10 мкг пептидов, содержащих антигенные детерминанты белка Е7. 12 пациентов с диагнозом «респираторный рецидивирующий папилломатоз» вакцинировались внутрикожно одной дозой препарата, полученного по примеру 1 и 4 пациента - препаратом по примеру 2. Повторное введение препарата проводилась через две недели. У всех пациентов определяли титр специфических антител и оценивали уровень ГЗТ. У 8 пациентов регистрировали достаточный уровень антителогенеза и уровень ГЗТ. У 8 пациентов эти показатели были недостаточно выражены, в связи с этим им был рекомендован повторный курс введения препарата. После двух вакцинаций препаратом с интервалом 2 недели показатели антителогенеза и кожная проба достигли необходимого уровня. Наблюдение за пациентами в течение года показало отсутствие рецидивов заболевания.The reaction to the introduction of vaccine preparations is extremely individual, due to the peculiarities of the organization of the main histocompatibility complex. In this regard, each case of drug administration requires an individual approach and objective laboratory criteria for the effectiveness of the therapy. As such criteria, the level of antibody genesis in the serum of patients after the administration of each regular dose of the drug and the delayed-type hypersensitivity activation indicator (HRT) with respect to the E7 protein were used. This parameter was evaluated using a skin test by intradermal injection of 10 μg of peptides containing antigenic determinants of the E7 protein. 12 patients with a diagnosis of “respiratory recurrent papillomatosis” were vaccinated intradermally with a single dose of the drug obtained in example 1 and 4 patients with the drug in example 2. Re-administration of the drug was carried out after two weeks. In all patients, the titer of specific antibodies was determined and the level of HRT was evaluated. A sufficient level of antibody production and HRT were recorded in 8 patients. In 8 patients, these indicators were not sufficiently expressed, in connection with this they were recommended a second course of drug administration. After two vaccinations with the drug with an interval of 2 weeks, the indicators of antibody production and skin test reached the required level. Observation of patients throughout the year showed no recurrence of the disease.

Claims (3)

1. Рекомбинантный гибридный белок, характеризующийся тем, что состоит из онкобелка Е7 ВПЧ 11 типа с последовательностью SEQ №2 и белка «теплового шока» из M.tuberculosis Hsp 70, и полученный с помощью плазмиды pQE30-E711-dnaK.1. Recombinant fusion protein, characterized in that it consists of type 11 HPV oncoprotein E7 with the sequence SEQ No. 2 and a heat shock protein from M. tuberculosis Hsp 70, and obtained using the plasmid pQE30-E711-dnaK. 2. Препарат против рецидивирующего папилломовируса человека, отличающийся тем, что он содержит рекомбинантный гибридный белок по п.1 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.2. A drug against recurrent human papillomovirus, characterized in that it contains the recombinant fusion protein according to claim 1 in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier. 3. Способ иммунотерапии рецидивирующего папилломатоза гортани, отличающийся тем, что пациенту внутрикожно вводят препарат против папилломовируса человека по п.2 в количестве 0,1-2,5 мг белка в одной дозе при необходимости с повторным введением препарата через две недели.3. The method of immunotherapy of recurrent laryngeal papillomatosis, characterized in that the patient is injected intradermally with the anti-human papillomovirus preparation according to claim 2 in an amount of 0.1-2.5 mg of protein in a single dose, if necessary, with repeated administration of the drug after two weeks.

Images