RU2277423C1 - Способ коррекции структурно-функциональных изменений соединительной ткани - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, в частности к нехирургическим способам коррекции патологических процессов в соединительной ткани, а также ее возрастных изменений. Для этого осуществляют инъекционное введение в соединительную ткань суспензии, содержащей до 500 тыс. фибробластов, вводимых на микросферах с диаметром от 50 до 400 мкм. Способ обеспечивает восстановление структуры любого типа соединительной ткани, содержащей фибробласты, повышая эффективность лечения пародонтита, возрастных косметических дефектов кожи, свищей, ран, рубцов, мочеточникового рефлюкса. 3 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к нехирургическим способам коррекции патологических процессов в соединительной ткани, а также ее возрастных изменений. Изобретение посвящено использованию фибробластов для коррекции структурно-функциональных изменений соединительной ткани.

Соединительная ткань является составной частью всех органов и тканей. Повсеместное распространение соединительной ткани и ее структурная организация обусловливают ее участие практически во всех физиологических и патологических процессах (физиологическая и репаративная регенерация, воспаление, заживление ран, склеротические процессы и т.д.).

В основе патогенеза структурно-функциональных изменений соединительной ткани лежат изменения в обмене веществ. Они развиваются либо в результате накопления продуктов метаболизма поступающих из крови и лимфы путем инфильтрации, либо вследствие дезорганизации основного вещества и волокон соединительной ткани, либо - неправильного синтеза компонентов соединительной ткани. Структурно-функциональные изменения соединительной ткани проявляются сдвигами количественных соотношений структурных биополимеров (например, понижение содержания эластина или гликозаминогликанов), общим замедлением метаболитических процессов, уменьшением численности клеток. Уменьшение численности клеток, ответственных за синтез компонентов соединительной ткани, в свою очередь, является причиной нарушения регенерации и обновления соединительной ткани. Главной клеточной популяцией соединительной ткани, ответственной за эти процессы, являются клетки мезенхимального происхождения - фибробласты. Они участвуют в заживлении ран, инкапсуляции инородных тел, процессах регенерации, обновления соединительной ткани и многих других физиологических процессах. Особенностью строения любой соединительной ткани является наличие хорошо развитых межклеточных структур (волокон и межклеточного вещества), что определяет ее опорно-механическую, трофическую и защитную функции. Такое строение соединительной ткани обеспечивается также благодаря фибробластам, которые вырабатывают и секретируют проколлаген, проэластин и гликозаминогликаны, а также белок миофибрил, входящих в состав эластиновых волокон и другие компоненты межклеточного матрикса.

Достижения биологии в последние годы привели к разработке и применению клеточных технологий для решения проблемы дефицита клеточной составляющей при целом ряде изменений соединительной ткани. Известно стимулирующее влияние фибробластов на регенерацию соединительной ткани при ее различных патологиях и возрастных изменениях. В частности, установлено, что in vivo данные клетки стимулируют репаративные процессы в соединительной ткани и способствуют восстановлению ее нормальной структурной организации при пародонтите, возрастных косметических дефектах кожи, ранах, мочеточниковом рефлюксе. Использование фибробластов при этом обосновано не только для коррекции заболеваний соединительной ткани, но и для коррекции ее возрастных изменений. Это обусловлено тем, что границу между патологическими изменениями соединительной ткани и ее возрастными изменениями провести трудно, что связано со схожими патогенетическими механизмами приобретенных изменений соединительной ткани и генеза старения, а также тем, что некоторые из приобретенных изменений обнаруживают четкую возрастную зависимость. Таким образом, используя данный подход, можно не только эффективно воздействовать на дефекты соединительной ткани и дистрофические изменения, связанные с деструктивными изменениями в волокнистых структурах, но и сдерживать процесс старения соединительной ткани (например, дермы кожи).

Данные наблюдения, послужившие основой настоящего изобретения, могут иметь существенное значение для коррекции нарушений, связанных с дистрофическими изменениями, повреждениями соединительной ткани и недостаточностью указанных клеток. Общность в строении соединительной ткани различной локализации и закономерностей обменных процессов в ней позволяет предполагать возможность использования данного подхода для любого типа соединительной ткани, содержащей фибробласты.

Известен способ устранения мочеточникового рефлюкса, включающий инъекционное эндоскопическое введение суспензии ауто- или аллофибробластов в количестве 3,5-7 млн клеток в физиологическом растворе под устье мочеточника (RU 2002129065/14). Он предполагает локальную стимуляцию роста соединительной ткани, за счет чего изменяется угол отхождения мочеточника и устраняется рефлюкс мочи в лоханку почки.

Известен способ восстановления дефектов дермы кожи путем трансплантации аутологичных дермальных фибробластов, выращенных на тромбиновом сгустке (который получают из плазмы крови того же пациента) или путем введения аутологичных дермальных фибробластов в виде суспензии в физиологическом растворе (ЕР 1-358857 A1, US 5591444).

Известен способ коррекции дефектов мягких тканей, предусматривающий введение суспензии фибробластов, а также их введение в или на матриксе, выполненном в виде губки, мембраны или деминерализованой кости (WO 2004048557).

Недостатком перечисленных способов является трансплантация клеток в виде суспензии и, как следствие этого, низкая эффективность метода. Это обусловлено следующими причинами. Во-первых, введение клеток в суспензии требует предварительного ферментативного снятия фибробластов с подложки, что неизбежно травмирует клетки. Во-вторых, поскольку фибробласты являются субстрат зависимыми клетками и в суспензии находятся в состоянии стресса, сопровождающегося изменением цитоскелета клетки и внутриклеточного метаболизма, они очень быстро теряют свою жизнеспособность и полностью погибают менее чем за сутки. Поэтому использование суспензии фибробластов, особенно в физиологическом растворе, снижает сроки хранения такого трансплантата (требует практически немедленного введения) и количество жизнеспособных клеток (причем не только по признаку исключения витальных красителей, но и по способности последующего роста в культуре при обратном высаживании на пластик). Кроме того, большой процент нежизнеспособных клеток при таких методиках требует увеличения количества вводимых клеток. Это обусловливает то, что данные процедуры могут приводить к осложнениям, например к фибромам. Другим недостатком является ограничение показаний к применению (как правило, какой-то определенный участок тела при определенной патологии).

Недостатками способа трансплантации клеток на тромбиновом сгустке являются также необходимость взятия крови у пациента, трудоемкость процесса приготовления трансплантата, ограниченные показания к применению и необходимость предварительной процедуры шлифовки кожи (только как повязка после дермоабразии).

Недостатком способа введения фибробластов в или на матриксе (губка, мембрана) является необходимость хирургического вмешательства для внесения трансплантируемого материала, что снижает эффективность метода за счет излишней травматизации тканей.

Известен заменитель живой кожи (RU 2104039 С1), состоящий из суспензии покрытых клетками дермы и эпидермиса микросфер, который может быть нанесен на поврежденную кожу аналогично пасте или мази. Недостатком указанного способа является невозможность корректировать изменения соединительной ткани, которые не сопровождаются наличием открытой раны.

Известны способы введения клеток внутри микрокапсул (Cell Transplant., 2000, 9 (6), 785-9; J. Microencapsul., 2003, 20(3), 303-16). Данные способы основываются на выделении клетками биологически активных веществ (ферменты, факторы роста), которые могут проникать через материал микрокапсулы. Недостатком указанных способов является невозможность прохождения через материал микрокапсулы более крупных молекул и, как следствие, невозможность коррекции структурных изменений соединительной ткани, поскольку микрокапсулы не позволяют фибробластам обновлять соединительную ткань за счет синтеза компонентов межклеточного матрикса (коллагена, эластина, гликозаминогликанов).

Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является использование фибробластов в качестве оптимизаторов раневого заживления в хирургической пародонтологии для восстановления соединительной ткани в пародонте (пат. РФ 2210352 от 07.12.01) Способ основан на использования культуры постнатальных дермальных фибробластов, доставляемых в область костного дефекта на носителе - синтетическом гидроксиапатите. Использование фибробластов в данном случае позволяет повысить лечебный эффект за счет стимулирующей активности клеточного компонента, способствующего сокращению сроков заживления раневой поверхности, снижению выраженности постоперационной рецессии десны и обеспечению увеличения сроков ремиссии хронического заболевания. Однако использование гидроксиаппатита в качестве носителя имеет недостатки, что обусловливает рецедив заболевания в значительном проценте случаев. Это обусловлено тем, что после лоскутных операций с использованием синтетического гидроксиапатита в течение уже первой недели наблюдается миграция эпителия десны вдоль поверхности корня зуба. Особенность такого заживления тканей пародонта - образование остаточного пародонтального кармана, способного вызвать рецидив болезни. Кроме того, при использовании имплантационных материалов на основе гидроксиапатита возможно инкапсулирование фиброзной тканью частиц имплантатов. В таких случаях наблюдается образование вытянутого эпителиального прикрепления, что сопоставимо с исходами коррекции пародонтита после механической обработки корня зуба или обычной хирургии пародонта.

Целью настоящего изобретения является создание универсального, высоко эффективного способа коррекции любых структурно-функциональных изменений соединительной ткани, обусловленных недостаточностью клеточного компонента в соединительной ткани, на основе использования фибробластов.

Результатом настоящего изобретения является восстановление нормального функционирования собственных клеток соединительной ткани, устранение дефектов соединительной ткани, стимуляция ее регенерации и ее омоложение за счет улучшения ее структуры биологической стимуляцией клеточных процессов.

Для этого предлагается простой, недорогой, унифицированный, физиологически совместимый способ коррекции структурно-функциональных изменений соединительной ткани путем введения (трансплантации) в место патологии (или дефекта) культуры фибробластов человека, полученных из различных тканей и вводимых на микросферах. Данный трансплантат можно производить серийно в промышленном масштабе и создавать банки клеточных трансплантатов.

Способ представляет собой инъекционное введение трансплантата, содержащего фибробласты. В готовом виде трансплантат представляет собой суспензию, включающую микросферы с прикрепленными на их поверхности фибробластами в питательной среде или физиологическом растворе.

Используемые фибробласты представляют собой фибробласты человека - собственные (аутологичные) и/или донорские (аллогенные), выделенные из кожи, костного мозга, плодного или эмбрионального материала и предварительно культивируемые in vitro. Фибробласты являются самоподдерживающейся популяцией. В эмбриональном периоде они дифференцируются непосредственно из мезенхимы. В постнатальном периоде, при регенерации соединительной ткани, источником активных (молодых) фибробластов являются фибробласты непосредственно данной соединительной ткани, а также костный мозг и адвентициальные клетки сосудов. Общее мезенхимальное происхождение основного клеточного компартмента соединительной ткани позволяет использовать фибробласты, полученные из любых источников. Такими источниками могут быть: дерма кожи, строма костного мозга, фетальные ткани, эмбрионы человека. Для коррекции структурно-функциональных изменений соединительной ткани можно использовать как собственные (аутологичные), так и донорские (аллогенные) фибробласты, выделенные из указанных выше источников, что обусловлено общими закономерностями репаративных процессов в соединительной ткани под их действием.

Микросферы представляют собой биодеградируемые пористые или беспористые коллагеновые, или желатиновые, или декстрановые, или иные сферы диаметром от 50 до 400 мкм, а предпочтительно от 100 до 300 мкм.

Использование фибробластов на микросферах лишено недостатков, связанных с их трансплантацией в виде суспензии. Применение микросфер в качестве подложки для выращивания и трансплантации клеток позволяет создать оптимальные условия для поддержания их жизнеспособности, исключить необходимость их ферментативного перевода в суспензию перед введением и, не травмируя, доставлять их в место дефекта путем инъекции.

Это дает возможность повысить количество живых клеток и за счет этого снизить концентрацию вводимых клеток в десятки и сотни раз (в зависимости от патологии).

После введения микросферы подвергаются постепенной биодеградации в течение 1-3 месяцев (в зависимости от материала, из которого они изготовлены), а сами фибробласты мигрируют с них в окружающую соединительную ткань. При этом запускаются процессы регенерации, в которых участвуют как вводимые фибробласты, так и собственные фибробласты (пришедшие впоследствии из крови и соседних участков соединительной ткани в ответ на введение клеток). Фибробласты стимулируют естественную регенерацию соединительной ткани, активизируя процессы обновления клеток, местного метаболизма, естественного производства коллагена и эластина (в том числе собственными фибробластами пациента), усиливают рост капилляров в сторону участков, где клетки испытывают гипоксию ввиду недостаточности кровоснабжения ткани. За счет опосредованного влияния фибробластов возрастает скорость деления клеток. Как следствие этих процессов происходит обновление соединительной ткани, нормализация ее механических свойств, исчезновение дефектов, нормализация обменных процессов.

Выращивание фибробластов (наращивание необходимой клеточной массы) производится на пластиковых подложках (культуральных флаконах) в виде монослоя по стандартной методике в питательной среде Игла, 199 или DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Полученные клетки могут подвергаться длительному (более года) хранению при температуре жидкого азота или непосредственно сразу быть высажены на микросферы в концентрации от 10 до 500 тыс./мл. Количество микросфер при этом составляет от 0,3 до 1 мг на мл суспензии.

Культивирование клеток на микросферах производится в стационарных условиях или в роллерной установке (при необходимости масштабного производства). Масштабирование производства клеток производится добавлением микросфер. Полученные клетки на микросферах также могут подвергаться длительному (более года) хранению при температуре жидкого азота. По достижении необходимого прироста клеток для приготовления непосредственно готового к использованию трансплантата производится смена питательной среды полного состава на питательную среду без сыворотки. В таком виде трансплантат может подвергнуться хранению при температуре от +26°С до +37°С в течение 5 суток. Введение фибробластов на микросферах производится в той же питательной среде или физиологическом растворе. Для введения в физиологическом растворе подготовка к введению производится ех temporae. Подготовка заключается в частичной замене среды, в которой транспортируются клетки на микросферах, на физиологический раствор. Для этого после оседания микросфер (определяется визуально) надосадочная жидкость забирается шприцом, а затем вносится равный объем физиологического раствора. Полученная суспензия забирается в шприц и после перемешивания подлежит немедленному использованию.

Используя данный способ коррекции структурно-функциональных изменений соединительной ткани, достигается следующий технический результат:

- универсальный подход к коррекции структурно-функциональных изменений соединительной ткани в не зависимости от типа, характера и локализации дефектов или изменений;

- снижение концентрации вводимых клеток;

- возможность использования фибробластов, полученных из любых тканей мезенхимального происхождения;

- простой способ введения;

- возможность комбинации с другими методами;

- возможность более длительного сохранения клеточного материала в жизнеспособном состоянии и, как следствие этого, возможность более длительного хранения имплантируемого материала и стабильный результат;

- отсутствие синдрома отмены.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Пример 1. Способ апробирован и реализован при стимуляции роста неодермы в модели гранулирующей раны с исключением контракции на животных.

Протокол опыта №125. У 10 крыс линии Вистар (самцы), весом 250 г под общим наркозом тиопенталом натрия (0,006 мг на 100 г веса) в области верхней трети части спины иссечен полнослойный кожный лоскут площадью около 3 см². Для предотвращения контракции в рану помещено пластиковое кольцо, имеющее вертикальную и горизонтальную поверхности. Свободные края кожи стянуты кисетным швом над горизонтальной поверхностью кольца. Рана укрыта перевязочным средством "Jelonet" и тампоном, смоченным в физиологическом растворе с гентамицином (0,16 мг/ мл). На четвертые сутки в формирующиеся грануляции произведена трансплантация фибробластов, полученных из двух недельных эмбрионов крыс. Фибробласты на микросферах введены иньекционно, серией последовательных вколов в грануляции в объеме 0,3 мл с концентрацией клеток 500 тыс./мл. При гистологическом исследовании грануляционной ткани через 10 суток наблюдалась повышенная васкуляризация, лейкоцитарная инфильтрация и увеличение числа фибробластов. У контрольных животных, у которых введение фибробластов не проводилось, при гистологическом исследовании грануляционная ткань была выражена слабо, количество новообразованных сосудов и клеточных элементов незначительное. Таким образом, введение фибробластов на микросферах достоверно усиливает образование и созревание грануляционной ткани, которая является одной из разновидностей соединительной ткани.

Пример 2. Способ апробирован и реализован при лечении нормотрофического рубца в модели рубца на животных.

Протокол опыта №140. У 10 крыс линии Вистар (самцы), весом 250 г под общим наркозом тиопенталом натрия (0,006 мг на 100 г веса) в области верхней трети хвоста иссечен полнослойный кожный лоскут площадью около 0,7 см². К 7 суткам произошло полное закрытие и эпителизация раны. Через 30 дней в рубец формирующийся на месте послеоперационной раны произведено введение фибробластов на микроносителях в объеме 0,2 мл с концентрацией клеток 250 тыс./мл. Клетки введены иньекционно, серией последовательных вколов. При гистологическом исследовании через 30 суток бывшее место дефекта было представлено соединительной тканью, сходной по своему строению с нормальной. Количество плотных коллагеновых волокон незначительное. Отмечалась повышенная васкуляризация, лейкоцитарная инфильтрация и увеличение числа фибробластов. У контрольных животных, у которых введение фибробластов не проводилось, при гистологическом исследовании бывшее место дефекта было представлено грубоволокнистой соединительной тканью с большим количеством плотных однонаправленно расположенных коллагеновых волокон, незначительным количество сосудов и клеточных элементов, что соответствует типичной гистологической картине рубца. Таким образом, введение фибробластов на микросферах нормализует и стимулирует регенерацию соединительной ткани, направляя регенерационные процессы по пути формирования соединительной ткани, близкой по своему строению к таковой в норме.

Пример 3. Способ апробирован и реализован при коррекции возрастных изменений кожи.

Проведена коррекция косметических дефектов кожи на лице (увядающая кожа, морщины) у 6 добровольцев. Фибробласты на микросферах введены иньекционно, серией последовательных вколов в средние слои дермы в объеме 3 мл с концентрацией клеток 250 тыс./мл. После иньекций через 1 месяц наблюдалось исчезновение косметического дефекта или объективное улучшение (отмечаемое и самими пациентами), которое выражалось в изменении микрорельефа кожи, выравнивании дефектов с уровнем здоровой кожи, изменении цвета дефекта в сторону физиологической окраски кожи, увеличении тургора, повышении эластичности и тонуса кожи. Во всех случаях эффект был длительным и сохранялся в течение всех 5 месяцев наблюдения. Таким образом, введение фибробластов на микросферах способствует улучшению структурно функциональных характеристик кожи и ее омоложению путем улучшения ее структуры биологической стимуляцией клеточных процессов в дерме.

Пример 4. Способ апробирован и реализован при лечении пародонтита в модели пародонтита на животных.

Протокол опыта №110. У 10 кроликов массой 3-3,5 кг, возраст 4-5 месяцев, под общим наркозом (кетамин 1 мл на 1 кг веса, 0,5 мл реланиума, 0,5 мл димедрола) и под инфильтрационной анестезией нижней челюсти (1% раствора лидокаина 2 мл) рассечен межзубной сосочек в области резцов нижней челюсти на две части: вестибулярную и оральную. Пародонтологическим распатором с вестибулярной стороны отслоен слизисто-надкостничный лоскут от шеек зубов. Шелковой лигатурой оплетены резцы ниже экватора в виде "восьмерки". Лигатура фиксирована к мягким тканям десны в 3-х точках нерезорбируемым шовным материалом.

Через 2 недели под той же анестезией животным шелковую лигатуру и фиксирующие ее швы удалили. Между зубами, под десной и на разбухших лигатурах отмечалось скопление остатков пищи и фибринозный налет. В области нижних резцов появлялся карман (в норме отсутствует). Глубина кармана при зондировании составляла 5-6 мм, отделяемое кармана - густое, скудное, серозно-гнойное. Клинически фиксировали картину хронического пародонтита средней степени тяжести: десна синюшного цвета, отек, кровоточивость при зондировании II степени, подвижность резцов II степени. Рентгенологически отмечалась равномерная горизонтальная убыль кости на 3-4 мм. При гистологическом исследовании отмечалась потеря зубоэпителиального прикрепления в области шейки зуба и появление глубоких пародонтальных карманов, дно которых смещалось за счет миграции эпителия и было представлено цементом зуба. Периодонт был отечен, пропитан полиморфно-ядерными лейкоцитами, лимфоцитами, гистиоцитами, плазматическими клетками с явлениями воспалительной гиперемии и стазами. Коллагеновые волокна периодонта подвергались мукоидному и фибриноидному набуханию, их фрагменты пропитывались плазменными белками. Распад волокнистых структур периодонтальной связки был особенно выражен в группе коллагеновых волокон, идущих в радиальном направлении в окружности шейки и апекса зуба, что объясняет клинически установленные патологическую подвижность зубов и исчезновение зубоэпителиального прикрепления у экспериментальных животных. Все вышеперечисленное свидетельствует о развитии хронического пародонтита.

Всем животным одномоментно со снятием лигатур произведена трансплантация фибробластов на микросферах. Фибробласты введены иньекционно, серией последовательных вколов в десну в объеме 0,5 мл с концентрацией клеток 250 тыс./мл.

Через 20 суток после трансплантации визуально десна была розового цвета, плотная при пальпации. Подвижность центральных резцов уменьшалась до I степени, при зондировании зонд погружался под десну на 2-2,5 мм. Гистологически наблюдалось восстановление зубоэпителиального прикрепления в области шейки зуба. Репаративные процессы в периодонте сопровождались пролиферацией клеточно-волокнистых структур: коллагеновых, эластических, формировавших участки, напоминающие связочный аппарат зуба. В периодонтальной связке сохранялись скудная гистиоцитарная инфильтрация и умеренное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла. Воспалительные процессы в десне проявлялись в умеренно выраженных скоплениях лимфоцитов и гистиоцитов. Со стороны кортикальной пластинки альвеолярного отростка выявлялись остеобласты, что можно морфологически расценить как остеогенез.

Через 40 суток визуально десна розового цвета, плотная. Глубина зондирования зубодесневого прикрепления составила 1 мм, зубы были неподвижны. При гистологическом исследовании зубоэпителиальное прикрепление в области шейки зуба было тотальным с полным исчезновением пародонтального кармана. В рыхлой соединительной ткани периодонта сохранялось умеренное полнокровие сосудов, формировались волокнистые структуры. Эпителий десны без изменений. Воспалительные процессы в сосочковом слое собственной пластинки слизистой носили очаговый характер с преобладанием макрофагов и единичных лимфоцитов, плазмацитов и полиморфно-ядерных лейкоцитов. На рентгенограммах определялось повышение плотности костных структур межальвеолярной перегородки.

В контрольной группе животных, которым трансплантация не проводилась, через 20 суток визуально определялась гиперемия и отек в области межзубного сосочка. Подвижность зубов II степени, глубина зондирования зубодесневого прикрепления 4-5 мм. При гистологическом исследовании пародонтальный карман сохранялся, однако появлялось слабое зубоэпителиальное прикрепление, захватывавшее 1/3 шейки зуба. В стенке пародонтального кармана и рыхлой соединительной ткани периодонта отмечалось выраженное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла, лимфоцитарная и плазмацитарная инфильтрация со значительным количеством полиморфно-ядерных лейкоцитов. В периодонтальной соединительной ткани были обнаружены явления дистрофии и некробиоза. Наблюдалась грануляционная ткань, представленная коллагеновыми и эластиновыми волокнами и капиллярами. В костной ткани альвеолярного отростка преобладала лакунарная резорбция с разрастанием внутри лакун эндооссальных клеток в виде клеточно-волокнистой ткани. Через 40 суток визуально десна розового цвета, плотная. Подвижность зубов I степени, глубина зондирования зубодесневого прикрепления составила 2-2,5 мм. При гистологическом исследовании воспалительные явления не стихали, приобретая хронический характер. Зубоэпителиальное прикрепление, как и в предыдущем сроке исследования, было слабым, составляло 1/3 шейки зуба, пародонтальные карманы с гнойным экссудатом сохранялись. Периодонтальная связка была инфильтрирована лимфоцитами, плазматическими клетками, полиморфно-ядерными лейкоцитами, которые скапливались вокруг некротических масс в виде абсцессов, как в стенке пародонтального кармана, рыхлой волокнистой ткани периодонта, так и в альвеолярном отростке, что свидетельствовало о дальнейшем распространении воспалительного процесса с мягких тканей на костную. Пролиферирующие фибробласты в грануляциях периодонта продуцировали тонкие, фрагментированные, рыхло лежащие и не анастомозирующие между собой коллагеновые волокна, что свидетельствовало о замедленном течении репаративного процесса. В эпителии десны обнаруживались продуктивные васкулиты: пролиферация эндотелия с образованием пристеночных тромбов, дистрофические процессы и воспаление. В субэпителиальных тканях выявлялись круглоклеточные и плазмоклеточные инфильтраты с примесью лейкоцитов и воспалительная гиперемия сосудов. В альвеолярном отростке определялось гнойное расплавление костной ткани с деструкцией. При рентгенологическом исследовании плотность альвеолярной кости нижней челюсти была выражена слабее, чем в основной группе.

Таким образом, использование фибробластов на микросферах показало высокую эффективность, выражающуюся в стимуляции репаративных процессов в соединительной ткани периодонта при пародонтите и восстановлении ее нормальной структурной организации. В контрольной группе животных процесс приобретал хроническое течение с характерной картиной хронического пародонтита.

Пример 5. Способ апробирован и реализован при восстановлении длительно не заживающего послеоперационного свища.

Больной М., 30 лет, история болезни №1002, находился на стационарном лечении в ГВКГ им. Н.Н. Бурденко с диагнозом длительно не заживающий послеоперационный мочевой свищ. На момент трансплантации, In situ, в поясничной области справа свищевой ход длинной 5 см. Длительность существования свища 3 месяца. Отделяемое отсутствует. Свищевой ход представлен грануляционной тканью. Произведена трансплантация фибробластов на микросферах. Фибробласты введены иньекционно, серией последовательных вколов в грануляционную ткань в объеме 3 мл с концентрацией клеток 500 тыс./мл. Через 10 суток отмечено сужение свищевого хода и сокращение его длины до 2,5 см. К 21 суткам после трансплантации произошло закрытие дефекта, целостность соединительной ткани и кожного покрова над местом дефекта полностью восстановлена.

Таким образом, данное изобретение предоставляет возможность коррекции любых структурно-функциональных изменений соединительной ткани и восстановления ее структуры единым, универсальным способом, основанным на инъекционном введении суспензии фибробластов на микросферах, что дает право говорить о новом достигаемом техническом результате, неочевидном для специалиста в данной области. Также использование данного изобретения позволяет повысить эффективность коррекции пародонтита, возрастных изменений кожи, свищей, ран, рубцов, мочеточникового рефлюкса, что соответствует условиям промышленной применимости.

Claims (4)

1. Способ коррекции структурно-функциональных изменений соединительной ткани, включающий инъекционное введение суспензии фибробластов, предварительно культивированных in vitro на питательной среде, отличающийся тем, что фибробласты культивируют и вводят совместно с веществом, образующим пористые или беспористые микросферы диаметром от 50 до 400 мкм и способным подвергаться биодеструкции в структуре соединительной ткани, при этом суспензию, содержащую до 500 тыс. клеток на микросферах в 1 мл, инъецируют в участок соединительной ткани.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют аутологичные или аллогенные фибробласты человека, выделенные из кожи, или костного мозга, или плодного и эмбрионального материала.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве вещества используют коллаген, или желатин, или декстран.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед культивированием в суспензию фибробластов вносят от 0,3 до 1 мг микросфер на мл суспензии.