RU2274863C2 - Method for determining hcv-antigen/antibody complex - Google Patents
Method for determining hcv-antigen/antibody complex Download PDFInfo
- Publication number
- RU2274863C2 RU2274863C2 RU2003100884/15A RU2003100884A RU2274863C2 RU 2274863 C2 RU2274863 C2 RU 2274863C2 RU 2003100884/15 A RU2003100884/15 A RU 2003100884/15A RU 2003100884 A RU2003100884 A RU 2003100884A RU 2274863 C2 RU2274863 C2 RU 2274863C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hcv
- antibody
- epitope
- antigen
- antibodies
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область изобретенияField of Invention
Настоящее изобретение относится, в общем, к диагностике вирусов. В частности, изобретение относится к определению комплекса антиген/антитело для точного диагностирования инфекции вируса гепатита С.The present invention relates, in general, to the diagnosis of viruses. In particular, the invention relates to the determination of an antigen / antibody complex for the accurate diagnosis of hepatitis C virus infection.
Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Вирус гепатита С (HCV) - основная причина парентерального гепатита не-А, не-В (NANBH), который в основном передается при переливании крови и половых контактах. Вирус присутствует у 0,4-2,0% доноров крови. Хронический гепатит развивается примерно у 50% инфицированных, и примерно у 20% из них развивается цирроз печени, который иногда приводит к гепатоцеллюлярной карциноме. Поэтому изучение и контроль этого заболевания являются важными для медицины.Hepatitis C virus (HCV) is the main cause of non-A, non-B (NANBH) parenteral hepatitis, which is mainly transmitted through blood transfusion and sexual contact. The virus is present in 0.4-2.0% of blood donors. Chronic hepatitis develops in approximately 50% of those infected, and approximately 20% of them develop cirrhosis, which sometimes leads to hepatocellular carcinoma. Therefore, the study and control of this disease are important for medicine.
HCV был впервые определен и характеризован как причина NANBH Хофтеном с соавторами (Houghten et al.). См. также Международную Публикацию № WO 89/04699, WO 90/11089 и WO 90/14436. HCV имеет геном, представленный 9,5 т.п.н. смысловой, одно-цепочечной РНК и является членом семейства вирусов Flaviridae. По меньшей мере шесть отдельных, хотя и родственных генотипов HCV было идентифицировано на основе филогенетических анализов (Simmonds et al., J.Gen.Virol (1993) 74: 2391-2399). Вирус кодирует единственный полипротеин, имеющий более 3000 аминокислотных остатков (Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88: 1711-1715). Во время и после трансляции этот протеин преобразуется как в структурные, так в неструктурные (NS) белки.HCV was first identified and characterized as the cause of NANBH by Hoften et al. (Houghten et al.). See also International Publication No. WO 89/04699,
В частности, как показано на фиг.1, геном HCV кодирует несколько белков. Порядок и номенклатура продуктов расщепления полипротеина HCV следующая: NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Начальное расщепление полипротеина катализируется протеазами хозяина, которые высвобождают три структурных белка, N-концевой нуклеокапсидный белок (обозначаемый «кор») и два оболочечных гликопротеина, «Е1» (также известный как «Е») и «Е2» (также известный, как «E2/NS1»), также как неструктурные (NS) белки, содержащие вирусные ферменты. NS области обозначены NS2, NS3, NS4 и NS5. NS2 - интегральный мембранный протеин с протеолитической активностью. NS2, как один, так и вместе с N33, расщепляет NS2-NS3 слабую связь, которая, в свою очередь, создает N-конец NS3 и высвобождает большой полипротеин, который обладает активностью как сериновой протеазы, так и РНК-хеликазы. NS3-протеаза служит для преобразования оставшегося полипротеина. Окончание созревания полипротеина инициируется автокаталитическим расщеплением соединения NS3-NS4a, катализируемым NS3 сериновой протеазой. Последующие расщепления полипротеина HCV, опосредованные NS3, скорее всего, включают в себя распознавание расщепляющихся связей полипротеина молекулой N33 другого полипептида. В этих реакциях NS3 высвобождает NS3 кофактор - (NS4a), два белка (NS4b и NS5a) и РНК зависимую РНК-полимеразу (NS5b).In particular, as shown in FIG. 1, the HCV genome encodes several proteins. The order and nomenclature of HCV polyprotein cleavage products are as follows: NH 2 -C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. The initial cleavage of the polyprotein is catalyzed by host proteases that release three structural proteins, an N-terminal nucleocapsid protein (denoted by “core”) and two enveloped glycoproteins, “E1” (also known as “E”) and “E2” (also known as “ E2 / NS1 "), as well as non-structural (NS) proteins containing viral enzymes. NS areas are designated NS2, NS3, NS4 and NS5. NS2 is an integral membrane protein with proteolytic activity. NS2, alone or with N33, cleaves the NS2-NS3 weak bond, which in turn creates the N-terminus of NS3 and releases a large polyprotein that has both serine protease and RNA helicase activity. NS3 protease converts the remaining polyprotein. The termination of polyprotein maturation is initiated by autocatalytic cleavage of the NS3-NS4a compound catalyzed by the NS3 serine protease. Subsequent cleavage of HCV polyprotein mediated by NS3 most likely involves recognition of cleavable polyprotein bonds by the N33 molecule of another polypeptide. In these reactions, NS3 releases the NS3 cofactor - (NS4a), two proteins (NS4b and NS5a) and RNA dependent RNA polymerase (NS5b).
Описан ряд общих и специфических полипептидов, полученных из полипротеина HCV, пригодных в качестве иммунологических и диагностических реагентов. Например, Houghton et al., Европейская публикация №318,216 и 388,232; Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Houghton et al., Hepatology (1991) 14:381-388; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8-S33-39; Chien et al., Международная публикация № WO 93/00365, Chinen D. Y. Международная публикация № WO 94/01778. Эти публикации создают значительные предпосылки как для исследований HCV в целом, так и для производства и применения иммунологических реагентов для полипептида HCV.A number of general and specific polypeptides derived from HCV polyprotein are described that are useful as immunological and diagnostic reagents. For example, Houghton et al., European Publication Nos. 318,216 and 388,232; Choo et al., Science (1989) 244: 359-362; Kuo et al., Science (1989) 244: 362-364; Houghton et al., Hepatology (1991) 14: 381-388; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8-S33-39; Chien et al., International Publication No. WO 93/00365, Chinen D. Y. International Publication No. WO 94/01778. These publications provide significant prerequisites for both HCV studies in general and the production and use of immunological reagents for the HCV polypeptide.
Чувствительные, специфические способы отбора и идентификации носителей HCV и крови и ее продуктов, зараженных HCV, создадут значительный прогресс в медицине. Пост-трансфузионный гепатит встречается примерно у 10% пациентов, перенесших переливание крови, и HCV отмечен вплоть до 90% в этих случаях. Лечение больных, а также профилактика и передача HCV с кровью и продуктами крови или при близком личном контакте требует надежных диагностических и прогностических средств. Таким образом, было разработано несколько анализов для серодиагностики HCV инфекции. Например, см. Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al.. Science (1989) 244,: 362-364; Choo et al., Br. Med. Bull. (1990) 46:423-441; Ebeling et al., Lancet (1990) 335:982-983; van der Poel et al.. Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel et al., Lancet. (1991) 337:317-319; Chien, D.Y., Международная публикация № WO 97/01178; Valenzuela et al., Международная публикация № WO 97/44469; и Kashiwakuma et al., U.S. Patent No. 5,871,904.Sensitive, specific methods for the selection and identification of carriers of HCV and blood and its products infected with HCV will create significant progress in medicine. Post-transfusion hepatitis occurs in approximately 10% of patients who have undergone a blood transfusion, and HCV is noted up to 90% in these cases. Treatment of patients, as well as the prevention and transmission of HCV with blood and blood products or with close personal contact, requires reliable diagnostic and prognostic agents. Thus, several tests have been developed for serodiagnosis of HCV infection. For example, see Choo et al., Science (1989) 244: 359-362; Kuo et al .. Science (1989) 244: 362-364; Choo et al., Br. Med. Bull. (1990) 46: 423-441; Ebeling et al., Lancet (1990) 335: 982-983; van der Poel et al .. Lancet (1990) 335: 558-560; van der Poel et al., Lancet. (1991) 337: 317-319; Chien, D.Y., International Publication No. WO 97/01178; Valenzuela et al., International Publication No. WO 97/44469; and Kashiwakuma et al., U.S. Patent No. 5,871,904.
В некоторых анализах на базе сыворотки возникла серьезная проблема из-за значительного интервала между заражением и обнаружением вируса, который часто превышает 80 дней. Этот интервал может создать большой риск для реципиентов крови. Для преодоления этой проблемы были разработаны тесты на основе нуклеиновой кислоты (NAT), которые непосредственно определяют вирусную РНК, и тесты на коровый HCV антиген, которые являются анализом на вирусный антиген, вместо ответной реакции антитела. См., например, Kashiwakuma et al., Патент США №5,871,904; Beld et al.. Transfusion (2000) 40:575-579.Some serum-based assays have encountered a serious problem due to the significant interval between infection and virus detection, which often exceeds 80 days. This interval can pose a great risk to blood recipients. To overcome this problem, nucleic acid (NAT) tests have been developed that directly detect viral RNA, and core HCV antigen tests, which are a test for viral antigen, instead of antibody response. See, for example, Kashiwakuma et al., US Patent No. 5,871,904; Beld et al. Transfusion (2000) 40: 575-579.
Тем не менее сохранилась необходимость в чувствительных и точных диагностических и прогностических средствах, позволяющих как организовать соответствующее лечение пациентов, так и предотвратить передачу HCV с кровью и продуктами крови или при близком личном контакте.Nevertheless, there remains a need for sensitive and accurate diagnostic and prognostic tools that allow both the organization of appropriate treatment for patients and the prevention of the transmission of HCV with blood and blood products or with close personal contact.
Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение частично основано на открытии того, что отвечающие на HCV сывороточные антитела являются типично антикбровыми и анти-NS3 (хеликаза). Соответственно, изобретение связано с определением комплекса коревого антигена HCV и NS3-антитела, которое дает возможность обнаруживать как HCV-антигены, так и антитела, находящиеся в образце, с использованием отдельного твердого матрикса.The present invention is based in part on the discovery that HCV-responsive serum antibodies are typically anti-blood and anti-NS3 (helicase). Accordingly, the invention relates to the determination of a complex of measles HCV antigen and an NS3 antibody, which makes it possible to detect both HCV antigens and antibodies in a sample using a separate solid matrix.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления, предметом изобретения является твердая подложка для иммуноанализа, включающая в себя по меньшей мере одно HCV-антикоровое антитело и по меньшей мере один выделенный NS3/4a-эпитоп HCV, связанные с ней. Антитело и NS3/4а-эпитоп могут быть любыми из описанных здесь молекул. Кроме того, твердая подложка может включать в себя любой из описанных здесь слитых антигенов со множественными эпитопами, таких как слитый антиген со множественными эпитопами, включающий в себя аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.7A-7F.Thus, in one embodiment, the subject of the invention is a solid support for immunoassay, comprising at least one HCV anticorrosive antibody and at least one isolated HCV NS3 / 4a epitope associated with it. The antibody and the NS3 / 4a epitope may be any of the molecules described herein. In addition, the solid support may include any of the fusion antigens with multiple epitopes described herein, such as a fusion antigen with multiple epitopes, including the amino acid sequence shown in figa-7F.
В определенных вариантах осуществления, твердая подложка включает в себя по меньшей мере два связанных с ней HCV-антикоровых антитела. Кроме того, антикоровое антитело может быть моноклональным антителом. К тому же NS3/4а-эпитоп может быть конформационным эпитопом, таким как конформационный NS3/4a-эпитоп, содержащий аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.4A-4D.In certain embodiments, the solid support includes at least two associated HCV anticorrosive antibodies. In addition, the anticorrosive antibody may be a monoclonal antibody. In addition, the NS3 / 4a epitope may be a conformational epitope, such as a conformational NS3 / 4a epitope containing the amino acid sequence shown in figa-4D.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к твердой подложке для иммуноанализа, содержащей по меньшей мере два HCV-антикоровых моноклональных антитела и по меньшей мере один конформационный эпитоп NS3/4a HCV, содержащий аминокислотную последовательность, изображенную на фиг.4A-4D, связанные с ней.In another embodiment, the invention relates to a solid substrate for immunoassay containing at least two HCV-anticorrosive monoclonal antibodies and at least one conformational epitope of HCV NS3 / 4a containing the amino acid sequence shown in figa-4D associated with it .
В следующем варианте осуществления, изобретение относится к способу определения инфекции HCV в биологическом образце. Способ включает в себя в себя: (а) получение твердой подложки для иммуноанализа, как описано выше; (b) комбинирование биологического образца с твердой подложкой в условиях, которые позволяют HCV-антигенам и антителам, когда они присутствуют в биологическом образце, связываться по меньшей мере с одним антикоровым антителом и NS3/4a-эпитопом, соответственно; (с) добавление к твердой подложке со стадии (b) при комплексообразующих условиях (i) первого меченого антитела, где первое обнаруживаемое меченое антитело является антикоровым антителом HCV с обнаруживаемой меткой, где меченое антикоровое антитело направлено против другого коревого эпитопа HCV, чем по меньшей мере одно антикоровое антитело, связанное с твердой подложкой; (ii) антигена, который взаимодействует с HCV-антителом из биологического образца, реагирующим с NS3/4a-эпитопом и (iii) второго меченого антитела, где второе антитело с определяемой меткой может реагировать с антигеном (ii); и (d) определение комплексов, образованных между антителами и антигенами, если они присутствуют, в качестве указания на наличие инфекции HCV в биологическом образце. NS3/4a-эпитоп может быть конформационным эпитопом, таким как конформационный эпитоп, представленный последовательностью NS3/4a, изображенной на фигурах 4A-4D.In a further embodiment, the invention relates to a method for determining HCV infection in a biological sample. The method includes: (a) preparing a solid support for immunoassay as described above; (b) combining the biological sample with a solid support under conditions that allow HCV antigens and antibodies, when present in the biological sample, to bind to at least one anti-core antibody and an NS3 / 4a epitope, respectively; (c) adding to the solid support from step (b) under complexing conditions (i) a first labeled antibody, where the first detectable labeled antibody is a detectable HCV antibody, where the labeled anti-core antibody is directed against a different measles HCV epitope than at least one anti-core antibody bound to a solid support; (ii) an antigen that interacts with an HCV antibody from a biological sample that reacts with an NS3 / 4a epitope; and (iii) a second labeled antibody, where a second antibody with a detectable label can react with antigen (ii); and (d) determining complexes formed between antibodies and antigens, if present, as an indication of the presence of HCV infection in a biological sample. The NS3 / 4a epitope may be a conformational epitope, such as a conformational epitope, represented by the NS3 / 4a sequence depicted in figures 4A-4D.
Еще в одном варианте осуществления, изобретение относится к,способу определения HCV инфекции в биологическом образце. Данный способ включает в себя в себя: (а) получение твердой подложки иммуноанализа как минимум с двумя связанными с ней антикоровыми антителами HCV, как было описано выше; (b) добавление биологического образца к твердой подложке в условиях, позволяющих антигенам и антителам HCV, в случае их присутствия в биологическом образце, связываться по меньшей мере с двумя антикоровыми антителами и NS3/4a-эпитопом, соответственно; (с) добавление к твердой подложке со стадии (b) в комплексообразующих условиях (i), первого антитела с обнаруживаемой меткой, где это первое антитело с обнаруживаемой меткой мечено обнаруживаемым образом антикоровым антителом HCV, где меченое антикоровое антитело направлено против иного коревого эпитопа HCV, чем антикоровые антитела, связанные с твердой подложкой; (ii) эпитопа из области с33с полипротеина HCV, соединенного с аминокислотной последовательностью hSOD; и (iii) второе антитело с обнаруживаемой меткой, где это второе антитело с обнаруживаемой меткой реагирует с аминокислотной последовательностью hSOD; и (d) определение комплексов, образованных между антителами и антигенами, если они присутствуют, в качестве указания на HCV-инфекцию в биологическом образце. NS3/4a-эпитоп может быть конформационным эпитопом, таким как конформационный эпитоп, представленный последовательностью NS3/4a, изображенной на фигурах 4A-4D.In yet another embodiment, the invention relates to a method for determining HCV infection in a biological sample. This method includes: (a) obtaining a solid immunoassay substrate with at least two HCV anti-core antibodies associated with it, as described above; (b) adding a biological sample to a solid support under conditions that allow HCV antigens and antibodies, if present in the biological sample, to bind to at least two anti-core antibodies and an NS3 / 4a epitope, respectively; (c) adding to the solid support from step (b) under complexing conditions (i) a first detectable label antibody, where this first detectable label antibody is detectably labeled with an HCV anticorrosive antibody, where the labeled anticorrosive antibody is directed against another measles HCV epitope, than anti-core antibodies bound to a solid support; (ii) an epitope from the c33c region of an HCV polyprotein coupled to the hSOD amino acid sequence; and (iii) a second detectable label antibody, where the second detectable label antibody reacts with the hSOD amino acid sequence; and (d) determining complexes formed between antibodies and antigens, if present, as an indication of HCV infection in a biological sample. The NS3 / 4a epitope may be a conformational epitope, such as a conformational epitope, represented by the NS3 / 4a sequence depicted in figures 4A-4D.
В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, антикоровое антитело может быть направлено против N-концевой области HCV коревого антигена, такой как аминокислоты 10-53 HCV, пронумерованные относительно HCV1 полипротеиновой последовательности, и/или определяемо меченое HCV антикоровое антитело может быть направлено против С-концевой области HCV корового антигена, такого как аминокислоты 120-130 HCV, пронумерованные относительно HCV1 полипротеиновой последовательности. К тому же антиген, который реагирует с HCV-ангителом из биологического образца, может быть из NS3 области, например, эпитоп из с33с области полипротеина HCV, и может быть слит с аминокислотной последовательностью супероксиддисмутазы человека (hSOD). В этом варианте осуществления, второе антитело с обнаруживаемой меткой реагирует с аминокислотной последовательностью hSOD.In any of the above embodiments, the anticorrosive antibody can be directed against the N-terminal region of the HCV measles antigen, such as amino acids 10-53 of the HCV, numbered relative to the HCV1 polyprotein sequence, and / or the detectably labeled HCV anticorrosive antibody can be directed against the C-terminal HCV regions of core antigen, such as amino acids 120-130 of HCV, numbered relative to the HCV1 polyprotein sequence. In addition, an antigen that reacts with an HCV antibody from a biological sample can be from the NS3 region, for example, an epitope from the c33c region of the HCV polyprotein, and can be fused to the amino acid sequence of human superoxide dismutase (hSOD). In this embodiment, a second detectable label antibody reacts with the hSOD amino acid sequence.
Еще в одном варианте осуществления изобретение направлено способ определения инфекции HCV в биологическом образце. Способ включает в себя в себя: (а) получение твердой подложки для иммунологического анализа, включающей в себя два HCV антикоровых моноклональных антитела и конформационный эпитоп, включающий в себя аминокислотную последовательность, изображенную на фигурах" 4A-4D; (b) добавление биологического образца к твердой подложке, в условиях, позволяющих антигенам и антителам HCV, когда они присутствуют в биологическом образце, связываться по меньшей мере с двумя антикбровыми антителами и NS3/4а конформационням эпитопом, соответственно; (с) добавление к твердой подложке со стадии (b) в комплексообразующих условиях (i) первого антитела с обнаруживаемой меткой, где это антитело с обнаруживаемой меткой обнаруживаемо помечено HCV антикоровым антителом, и где это антикоровое антитело с обнаруживаемой меткой направлено против другого коревого эпитопа HCV, чем как минимум два антикоровых антитела, связанных с твердой подложкой; (ii) эпитопа из области с33с полипротеина HCV, соединенного с аминокислотной последовательностью hSOD; и (iii) второго антитела с обнаруживаемой меткой, где это второе антитело с обнаруживаемой меткой реагирует с упомянутой аминокислотной последовательностью hSOD; (d) определение образующихся комплексов между антителами и антигенами, если они присутствуют, в качестве указания на присутствие HCV-инфекции в биологическом образце.In yet another embodiment, the invention provides a method for determining HCV infection in a biological sample. The method includes: (a) obtaining a solid support for immunological analysis, including two HCV anticorrosive monoclonal antibodies and a conformational epitope that includes the amino acid sequence shown in figures "4A-4D; (b) adding a biological sample to a solid support, under conditions that allow HCV antigens and antibodies, when present in a biological sample, to bind to at least two anti-brow antibodies and an NS3 / 4a conformational epitope, respectively; (c) adding to t on the substrate from step (b) under complexing conditions (i) of a first detectable label antibody, where this detectable label antibody is detectably labeled with an HCV anticorrosive antibody, and where this detectable label anticorrosive antibody is directed against another measles HCV epitope than at least two anti-core antibodies bound to a solid support; (ii) an epitope from the c33c region of the HCV polyprotein coupled to the hSOD amino acid sequence; and (iii) a second detectable label antibody, where the second detectable label antibody reacts with said hSOD amino acid sequence; (d) determining the resulting complexes between antibodies and antigens, if present, as an indication of the presence of HCV infection in a biological sample.
В некоторых вариантах осуществления, как минимум два антикоровых антитела направлены против N-концевой области коревого антигена HCV, например, против аминокислот 10-53 HCV, пронумерованных относительно полипротеина HCV1, и HCV-антикбровое антитело с обнаруживаемой меткой направлено против С-концевой области HCV коревого антигена, как, например, против аминокислот 120-130 HCV, пронумерованных относительно последовательности HCV1 полипротеина.In some embodiments, at least two anti-core antibodies are directed against the N-terminal region of HCV measles antigen, for example, against HCV amino acids 10-53 numbered relative to HCV1 polyprotein, and a detectable HCV antibody directed against the C-terminal region of measles HCV antigen, such as, for example, against amino acids 120-130 of HCV, numbered relative to the HCV1 sequence of the polyprotein.
В следующем варианте осуществления, изобретение относится к способу определения HCV-инфекции в биологическом образце. Способ включает в себя: (а) получение твердой подложки для иммунологического анализа, которая включает в себя слитый антиген со множественными эпитопами; (b) комбинирование биологического образца с твердой подложкой в условиях, которые позволяют антигенам и антителам HCV, когда они присутствуют в биологическом образце, связываться по меньшей мере с одним антикоровым антителом, NS3/4a-эпитопом и слитым антигеном с множественными эпитопами; (с) добавление к твердой подложке со стадии (b) в комплексообразующих условиях (i) первого антитела с обнаруживаемой меткой, где это первое антитело с обнаруживаемой меткой является антикоровым антителом HCV с обнаруживаемой меткой, где это меченое антикоровое антитело направлено против другого HCV коревого эпитопа, чем по меньшей мере одно антикоровое антитело, связанное с твердой подложкой; (ii) первого и второго антигенов, которые реагируют с HCV-антителом из биологического образца, реагирующего с NS3/4a-эпитопом, и слитым антигеном со множественными эпитопами, соответственно; (iii) второго антитела с обнаруживаемой меткой, способного реагировать с антигенами из (ii); (d) определение комплексов, образовавшихся между антителами и антигенами, если они присутствуют, в качестве указания на присутствие инфекции HCV в биологическом образце.In a further embodiment, the invention relates to a method for determining HCV infection in a biological sample. The method includes: (a) obtaining a solid support for immunological analysis, which includes a fused antigen with multiple epitopes; (b) combining the biological sample with a solid support under conditions that allow HCV antigens and antibodies, when present in the biological sample, to bind to at least one anticorrosive antibody, an NS3 / 4a epitope, and a fused antigen with multiple epitopes; (c) adding to the solid support from step (b) under complexing conditions (i) a first detectable label antibody, where the first detectable label antibody is a detectable label HCV antibody, where this labeled anti-core antibody is directed against another measles epitope HCV than at least one anticorrosive antibody bound to a solid support; (ii) the first and second antigens that react with an HCV antibody from a biological sample that reacts with an NS3 / 4a epitope and a fusion antigen with multiple epitopes, respectively; (iii) a second detectable label antibody capable of reacting with the antigens of (ii); (d) determining complexes formed between antibodies and antigens, if present, as an indication of the presence of HCV infection in a biological sample.
Антикоровое антитело может быть направлено против N-концевой области HCV-корового антигена, и упомянутое первое HCV-антикоровое антитело с обнаруживаемой меткой может быть направлено против С-концевой области HCV-корового антигена, как описано выше. Кроме того, первый антиген, реагирующий с HCV-антителом из биологического образца, может включать в себя эпитоп из области с33с полипротеина HCV и может быть слит с аминокислотной последовательностью hSOD. Таким образом, второе определяемо меченое антитело реагирует с аминокислотной последовательностью hSOD. К тому же, второй антиген, реагирующий с HCV-антителом из биологического образца, может включать в себя эпитоп из с22 области полипротеина HCV, такой как эпитоп, включающий в себя аминокислоты Lys10-Ser99 долипротеина HCV, с делецией Аrg47 и заменой Trp на Leu в положении 44, пронумерованной относительно последовательности полипротеина HCV1. Эпитоп может быть слит с аминокислотной последовательностью hSOD. В этом случае второе антитело с обнаруживаемой меткой реагирует с аминокислотной последовательностью hSOD. Слитый антиген с множественными эпитопами может включать в себя аминокислотную последовательность, изображенную на фигурах 7A-7F.The anti-cortical antibody can be directed against the N-terminal region of the HCV core antigen, and the first detectable HCV anticorrosive antibody mentioned can be directed against the C-terminal region of the HCV core antigen, as described above. In addition, the first antigen that reacts with an HCV antibody from a biological sample can include an epitope from the c33c region of the HCV polyprotein and can be fused to the hSOD amino acid sequence. Thus, the second detectably labeled antibody reacts with the amino acid sequence of hSOD. In addition, a second antigen that reacts with an HCV antibody from a biological sample may include an epitope from the c22 region of an HCV polyprotein, such as an epitope comprising the amino acids Lys 10 -Ser 99 of HCV doliprotein, with an Arg47 deletion and replacing Trp with Leu at position 44, numbered relative to the HCV1 polyprotein sequence. The epitope can be fused to the amino acid sequence of hSOD. In this case, the second detectable antibody antibody reacts with the hSOD amino acid sequence. A fusion antigen with multiple epitopes may include the amino acid sequence shown in figures 7A-7F.
Еще в одном варианте осуществления, изобретение относится к способу определения HCV инфекции в биологическом образце, причем указанный способ включает в себя: (а) получение твердой подложки для иммуноанализа, которая включает в себя два антикоровых моноклональных антитела HCV, NS3/4a-конформационный эпитоп HCV, включающий в себя аминокислотную последовательность, изображенную на фигурах 4A-4D, и слитый антиген с множественными эпитопами, содержащий аминокислотную последовательность, изображенную на фигурах 7A-7F, связанную с ним; (b) комбинирование биологического образца с твердой подложкой в условиях, которые позволяют антигенам и антителам HCV, когда они присутствуют в биологическом образце, связываться по меньшей мере с двумя антикоровыми антителами, NS3/4а конформационным эпитопом и слитым антигеном со множественными эпитопами, соответственно; (с) добавление к твердой подложке из стадии (b) при комплексообразующих условиях (i) первого антитела с обнаруживаемой меткой, где первое антитело с обнаруживаемой меткой является HCV антикоровым антителом с обнаруживаемой меткой, где меченое антикоровое антитело направлено против иного HCV-корового эпитопа, чем как минимум два антикоровых антитела, связанных с твердой подложкой; (ii) эпитопа из области с33с полипротеина HCV, слитого с аминокислотной последовательностью hSOD, и эпитопа из области с22 полипротеина HCV, слитого с аминокислотной последовательностью hSOD; и (iii) второго антитела с обнаруживаемой меткой, где указанное второе антитело с обнаруживаемой меткой способно реагировать с упомянутыми аминокислотными последовательностями hSOD; (d) определение комплексов, образующихся между антителами и антигенами, если они присутствуют, в качестве указания на присутствие HCV инфекции в биологическом образце.In yet another embodiment, the invention relates to a method for determining HCV infection in a biological sample, said method comprising: (a) preparing a solid immunoassay substrate that includes two anti-core HCV monoclonal antibodies, the NS3 / 4a conformational HCV epitope comprising the amino acid sequence shown in figures 4A-4D, and a fused antigen with multiple epitopes containing the amino acid sequence shown in figures 7A-7F associated with it; (b) combining the biological sample with a solid support under conditions that allow HCV antigens and antibodies, when present in the biological sample, to contact at least two anticorrosive antibodies, an NS3 / 4a conformational epitope, and a fused antigen with multiple epitopes, respectively; (c) adding to the solid support of step (b) under complexing conditions (i) a first detectable label antibody, where the first detectable label antibody is a detectable label HCV antibody, where the labeled anti-core antibody is directed against another HCV cortical epitope, than at least two anti-core antibodies bound to a solid support; (ii) an epitope from the c33c region of the HCV polyprotein fused to the hSOD amino acid sequence and an epitope from the c22 region of the HCV polyprotein fused to the hSOD amino acid sequence; and (iii) a second detectable label antibody, wherein said second detectable label antibody is capable of reacting with said hSOD amino acid sequences; (d) determining the complexes formed between antibodies and antigens, if present, as an indication of the presence of HCV infection in a biological sample.
В этом варианте осуществления, по меньшей мере два антикоровых антитела могут быть направлены против N-концевой области HCV-корового антигена, такой как аминокислоты 10-53 HCV, нумерованные относительно HCVl-полипротеина, и HCV-антикоровое антитело с обнаруживаемой меткой направлено против С-концевой области HCV-корового антигена, такой как аминокислоты 120-130 HCV, пронумерованные в соответствии с последовательностью полипротеина HVC1. К тому же, эпитоп из области с22 может включать в себя аминокислоты Lys10-Ser99, полипротеина HCV с делецией Аrg47 и заменой Trp на Leu в положении 44, пронумерованные соответственно с последовательностью полипротеина HVC1.In this embodiment, at least two anticorrosive antibodies can be directed against the N-terminal region of the HCV core antigen, such as amino acids 10-53 of HCV, numbered relative to the HCVl polyprotein, and a detectable HCV antibody against the C- the terminal region of the HCV core antigen, such as amino acids 120-130 HCV, numbered in accordance with the sequence of the HVC1 polyprotein. In addition, an epitope from region c22 may include the amino acids Lys 10 -Ser 99 , HCV polyprotein with an Arg47 deletion, and Trp replaced by Leu at position 44, numbered respectively with the HVC1 polyprotein sequence.
В других вариантах осуществления, изобретение относится к получению иммунодиагностического тестового набора, включающего в себя твердую подложку для иммуноанализа, описанную выше, и инструкции для проведения иммунодиагностического теста.In other embodiments, the invention relates to the preparation of an immunodiagnostic test kit comprising a solid support for immunoassay as described above and instructions for conducting an immunodiagnostic test.
Еще в одном варианте осуществления, изобретение относится к способам получения твердой подложки для иммуноанализа, включающим в себя в себя: (а) получение твердой подложки; и (b) связывание с ней по меньшей мере одного HCV-антикорового антитела, например одного, двух или больше, и по меньшей мере одного выделенного NS3/4a-эпитопа HCV, и, необязательно, слитого антигена с множественными эпитопами. Антикоровые антитела, NS3/4a-эпитопы и слитые антигены с множественными эпитопами описаны выше.In yet another embodiment, the invention relates to methods for producing a solid support for immunoassay, including: (a) preparing a solid support; and (b) binding to it of at least one HCV anticorrosive antibody, for example one, two or more, and at least one isolated HCV NS3 / 4a epitope, and, optionally, a fusion antigen with multiple epitopes. Anticorrosive antibodies, NS3 / 4a epitopes and fusion antigens with multiple epitopes are described above.
В дополнительных вариантах осуществления, изобретение относится к слитому антигену со множественными эпитопами, включающему в себя в себя аминокислотную последовательность, изображенную на фигурах 7A-7F, или аминокислотную последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 80%, например, идентичную на 90% или более и, кроме того, имеющего специфическую реакцию на анти-HVC антитела, находящиеся в биологическом образце от HCV-инфицированного субъекта. В определенных вариантах осуществления, слитый антиген с множественными эпитопами состоит из аминокислотной последовательности, изображенной на фигурах 5A-5F.In further embodiments, the invention relates to a fusion antigen with multiple epitopes, including the amino acid sequence depicted in figures 7A-7F, or an amino acid sequence identical to it by at least 80%, for example, identical by 90% or more and, furthermore, having a specific response to anti-HVC antibodies present in a biological sample from an HCV-infected subject. In certain embodiments, a fusion antigen with multiple epitopes consists of the amino acid sequence depicted in Figures 5A-5F.
В последующих вариантах осуществления, изобретение относится к полинуклеотиду, включающему в себя кодирующую последовательность для вышеупомянутого слитого антигена со множественными эпитопами, рекомбинантным векторам, включающим в себя полинуклеотиды, клеткам-хозяевам, трансформированным рекомбинантными векторами, и способам получения рекомбинантного слитого антигена со множественными эпитопами, включающим в себя: (а) получение популяции вышеупомянутых клеток-хозяев; и (b) культурирование популяции клеток в условиях, при которых экспрессируется слитый антиген с множественными эпитопами, кодируемый кодирующей последовательностью, находящейся в рекомбинантном векторе.In further embodiments, the invention relates to a polynucleotide comprising a coding sequence for the aforementioned fusion antigen with multiple epitopes, recombinant vectors comprising polynucleotides, host cells transformed with recombinant vectors, and methods for producing a recombinant fusion antigen with multiple epitopes in itself: (a) obtaining a population of the aforementioned host cells; and (b) culturing a cell population under conditions in which a fusion antigen with multiple epitopes is expressed, encoded by a coding sequence located in a recombinant vector.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными при ознакомлении с нижеследующим детальным описанием и прилагаемыми чертежами.These and other aspects of the present invention will become apparent upon reading the following detailed description and the accompanying drawings.
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
Фигура 1 представляет собой графическое изображение генома HCV, изображающее различные области полипротеина, из которого получают реагенты для настоящего анализа (белки и антитела).Figure 1 is a graphical representation of the HCV genome, depicting various regions of the polyprotein from which the reagents for the present assay (proteins and antibodies) are obtained.
Фигура 2 представляет собой схематический рисунок иллюстративного комплекса антиген/антитело согласно изобретению.Figure 2 is a schematic drawing of an illustrative antigen / antibody complex according to the invention.
На фигуре 3 изображена аминокислотная последовательность иллюстративного NS3/4a конформационного антигена, для использования в настоящих анализах. Выделенный жирным аланин в положении 182 заменяется природным серином, в норме находящимся в этом положении.Figure 3 depicts the amino acid sequence of an illustrative NS3 / 4a conformational antigen for use in the present assays. Fatty alanine at position 182 is replaced by natural serine, normally in that position.
На фигурах 4A-4D изображают ДНК и соответствующую аминокислотную последовательность другого иллюстративного NS3/4a конформационного эпитопа для использования в настоящих анализах. Аминокислоты в положениях 403-404 фигур 4A-4D представляют собой замены Thr на Pro и Ser на Ile в природной аминокислотной последовательности HCV-1.4A-4D depict DNA and the corresponding amino acid sequence of another exemplary NS3 / 4a conformational epitope for use in the present assays. The amino acids at positions 403-404 of Figures 4A-4D are substitutions of Thr for Pro and Ser for Ile in the natural amino acid sequence of HCV-1.
На фигуре 5 - диаграмма строения pd.HCV1a.ns3ns4aPIFigure 5 is a structural diagram of pd.HCV1a.ns3ns4aPI
На фигуре 6 - графическое представление MEFA 12.6 is a graphical representation of
На фигурах 7A-7F изображены последовательность ДНК и соответствующая аминокислотная последовательность MEFA 12.Figures 7A-7F depict the DNA sequence and the corresponding amino acid sequence of
Фигура 8 является схематическим рисуноком иллюстративного иммунологического анализа согласно изобретению с использованием MEFA 12.Figure 8 is a schematic drawing of an illustrative immunological assay according to the
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
В практическом применении настоящего изобретения будут использованы, если не указано иначе, обычные методы химии, биохимии, методики рекомбинации ДНК и иммунологии, в -пределах квалификации специалистов данной области. Такие методики полно представлены в литературе. См., например. Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N.Fields and D.M.Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); Т.Е.Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H.Freeman and Company, 1993); A.L.Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S.Colowick and N.Kaplan eds.. Academic Press, Inc.).In the practical application of the present invention will be used, unless otherwise indicated, the usual methods of chemistry, biochemistry, DNA recombination techniques and immunology, within the limits of qualification of specialists in this field. Such techniques are fully represented in the literature. See for example. Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knife, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds .. Academic Press, Inc.).
Необходимо отметить, что в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа следует понимать во множественном числе, если содержание явно не диктует обратного. Так, например, «антиген» подразумевает смесь двух или более антигенов, и тому подобное.It should be noted that in this description and the attached claims, the singular forms should be understood in the plural, unless the content clearly dictates otherwise. So, for example, "antigen" means a mixture of two or more antigens, and the like.
В тексте использованы следующие сокращения названий аминокислот:The following abbreviations of amino acid names are used in the text:
ОпределенияDefinitions
Ниже приводятся термины, используемые в описании настоящего изобретения, и их определения.The following are the terms used in the description of the present invention, and their definitions.
Термины «полипептид» и «белок» относятся к полимерам аминокислотных остатков и не ограничены минимальной длиной продукта. Таким образом, пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и им подобное включены в это определение. Как полноразмерные белки, так и их фрагменты также включены в это определение.The terms “polypeptide” and “protein” refer to polymers of amino acid residues and are not limited to the minimum product length. Thus, peptides, oligopeptides, dimers, multimers and the like are included in this definition. Both full-sized proteins and fragments thereof are also included in this definition.
Термины также включают в себя постэкспрессионные модификации полипептида, например гликозилрование, ацетилирование, фосфорилирование и им подобные. Кроме того, для целей данного изобретения, термин «полипептид» относится к белку, который содержит модификации в природной последовательности, такие как делеции, добавки или замены (как правило, консервативные по природе), до тех пор, пока этот белок сохраняет необходимую активность. Эти модификации могут быть созданы намеренно, например, при сайт-специфическом мутагенезе, или случайно, например, при мутациях у хозяина, продуцирующего белки, или ошибках ПЦР-амплификации.The terms also include post-expression modifications of the polypeptide, for example glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like. In addition, for the purposes of this invention, the term "polypeptide" refers to a protein that contains modifications in the natural sequence, such as deletions, additives or substitutions (usually conservative in nature), as long as this protein retains the necessary activity. These modifications can be created intentionally, for example, during site-specific mutagenesis, or accidentally, for example, during mutations in a protein producing host, or PCR amplification errors.
Полипептид HCV является полипептидом, как определено выше, получаемым из полипротеина HCV. Нет необходимости в том, чтобы этот полипептид физически происходил из HCV, он может быть получен с помощью синтеза или рекомбинации. К тому же полипептид может быть получен из различных штаммов HCV, таких как штаммы HCV 1, 2, 3 или 4. У этих штаммов известен ряд сохраняющихся и вариабельных областей, и в целом аминокислотные последовательности эпитопов, происходящих из этих областей, будут иметь высокую степень гомологии последовательности, более 30%, предпочтительно более 40%, когда обе последовательности выровнены. Так, например, термин полипептид «NS3/4a» относится к природному NS3/4a любого из различных штаммов HCV, также как и аналоги NS3/4a, мутеины и иммуногенные фрагменты, как будет определено ниже. Известны полные генотипы многих из этих штаммов. См., например. Патент США №6150087 и GenBank поступление № AJ 238800 и AJ 238799.The HCV polypeptide is a polypeptide, as defined above, derived from HCV polyprotein. This polypeptide does not need to physically come from HCV, it can be obtained by synthesis or recombination. In addition, the polypeptide can be obtained from various strains of HCV, such as strains of
Термины «аналог» и «мутеин» относятся к биологически активных производным базовой молекулы или фрагментов таких производных, которые сохраняют желаемую активность, такую как иммунореактивность в описанных здесь анализах. Обычно термин «аналог» относится к соединениям, имеющим природную полипептидную последовательность и структуру с одной или более аминокислотными вставками, заменами (обычно консервативными по природе) и/или делениями, по сравнению с природной молекулой, до тех пор, пока эти модификации не нарушают иммуногенной активности. Термин «мутеин» относится к пептидам, имеющим одну или более пептидных имитаций (пептоидов), таких, как описанные в Международной публикации № WO 091/04282. Предпочтительно, аналог или мутеин обладает по меньшей мере такой же иммуноактивностью, как и природная молекула. Способы создания аналогов и мутеинов полипептидов известны в данной области и описаны ниже.The terms “analogue” and “mutein” refer to biologically active derivatives of a base molecule or fragments of such derivatives that retain the desired activity, such as immunoreactivity in the assays described herein. Typically, the term “analogue” refers to compounds having a natural polypeptide sequence and structure with one or more amino acid inserts, substitutions (usually conservative in nature) and / or divisions, compared with a natural molecule, until these modifications violate the immunogenic activity. The term “mutein” refers to peptides having one or more peptide mimetics (peptoids), such as those described in International Publication No. WO 091/04282. Preferably, the analogue or mutein has at least the same immunoactivity as the native molecule. Methods for creating analogues and muteins of polypeptides are known in the art and are described below.
Наиболее предпочтительные аналоги включают в себя замены, которые консервативны по природе, т. е. такие замены, которые происходят в пределах семейства аминокислот, родственного своими боковыми цепями. В частности, аминокислоты в целом разделены на четыре семейства: (1) кислотные - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Например, вполне предсказуемо, что изолированная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серии или подобная консервативная замена аминокислоты на структурно близкую аминокислоту не будет иметь большого эффекта на биологическую активность. Например, полипептид, представляющий интерес, может нести примерно до 5-10 консервативных и неконсервативных аминокислотных замен, или даже примерно до 15-25 консервативных или неконсервативных замен, или любое целое число между 5-25, при условии, что желаемая функция молекулы остается невредимой. Специалист в данной области может легко определить области в интересующей молекуле, допускающие замены, обратившись к схемам Hopp/Woods и Kyte-Doolittle, хорошо известным в данной области.Most preferred analogues include substitutions that are conservative in nature, i.e., such substitutions that occur within the family of amino acids related to their side chains. In particular, amino acids are generally divided into four families: (1) acidic - aspartate and glutamate; (2) the main ones are lysine, arginine, histidine; (3) non-polar - alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; and (4) uncharged polar glycine, asparagine, glutamine, cysteine, series, threonine, tyrosine. Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are sometimes classified as aromatic amino acids. For example, it is predictable that an isolated replacement of leucine with isoleucine or valine, aspartate with glutamate, threonine in series, or a similar conservative replacement of an amino acid with a structurally similar amino acid will not have a large effect on biological activity. For example, a polypeptide of interest can carry up to about 5-10 conservative and non-conservative amino acid substitutions, or even up to about 15-25 conservative or non-conservative substitutions, or any integer between 5-25, provided that the desired function of the molecule remains unharmed . One of skill in the art can easily identify regions in the molecule of interest that are replaceable by referring to the Hopp / Woods and Kyte-Doolittle schemes well known in the art.
Термином «фрагмент» обозначен полипептид, состоящий только из части последовательности и структуры целого, полноразмерного полипептида. Этот фрагмент может включать в себя С-концевую делецию и/или N-концевую делецию природного полипептида. «Иммуногенный фрагмент» HCV - белка, в частности, обычно включает в себя не менее примерно 5-10 смежных аминокислотных остатков из полноразмерной молекулы, предпочтительно не менее 15-20 смежных аминокислотных остатков из полноразмерной молекулы, и наиболее предпочтительно - не менее примерно 20-50 или более смежных аминокислотных остатков из полноразмерной молекулы, определяющих эпитоп, или любое целое число от 5 аминокислотных остатков до полноразмерной последовательности, при условии, что рассматриваемый фрагмент сохраняет иммунореактивность в описанных здесь анализах. Например, предпочтительный иммуногенный фрагмент включает в себя, хотя и не ограничен ими, коровые фрагменты HCV, которые содержат, например, аминокислоты 10-45, 10-53, 67-88 и 120-130 полипротеина, эпитоп 5-1-1 (в NS3-области вирусного генома), также как и определенные эпитопы, полученные из областей Е1, Е2, с33с (NS3), c100 (NS4), NS3/4a и NS5 полипротеина HCV, a также любой из различных эпитопов, определенных в HCV-полипротеине. Например, см. Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., Международная публикация № WO 93/00365; Chien D. Y.,. Международная публикация № WO 94/01778; Патент США №6150087 и 6121020.The term "fragment" refers to a polypeptide consisting only of part of the sequence and structure of a whole, full-sized polypeptide. This fragment may include a C-terminal deletion and / or N-terminal deletion of a natural polypeptide. An "immunogenic fragment" of an HCV protein, in particular, typically includes at least about 5-10 adjacent amino acid residues from a full-sized molecule, preferably at least 15-20 adjacent amino acid residues from a full-sized molecule, and most preferably at least about 20- 50 or more contiguous amino acid residues from a full-sized molecule defining an epitope, or any integer from 5 amino acid residues to a full-sized sequence, provided that the fragment in question retains the immunoreactive spine in the assays described herein. For example, a preferred immunogenic fragment includes, but is not limited to, core HCV fragments that contain, for example, amino acids 10-45, 10-53, 67-88 and 120-130 polyprotein, epitope 5-1-1 (in NS3 regions of the viral genome), as well as certain epitopes derived from regions E1, E2, c33c (NS3), c100 (NS4), NS3 / 4a and NS5 of the HCV polyprotein, as well as any of the various epitopes defined in the HCV polyprotein . For example, see Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al., International Publication No. WO 93/00365; Chien D. Y.,. International Publication No. WO 94/01778; U.S. Patent Nos. 6150087 and 6121020.
Термин «эпитоп», как он использован в данном описании, относится к последовательности, состоящей по меньшей мере примерно из 3-5 аминокислот, предпочтительно, примерно из 5-10 или 15, и не более, чем примерно из 1000 (или любое целое число в данном диапазоне), которые определяют последовательность, которая сама по себе или как часть большей последовательности связывается с антителом, которое генерируется в ответ на эту последовательность. Нет критического верхнего предела длины фрагмента, который может включать в себя почти полноразмерную белковую последовательность или даже слитый белок, включающий в себя два или больше эпитопов из полипротеина HCV. Эпитоп для использования в объекте изобретения не ограничен полипептидом, обладающим точной последовательностью той части родительского белка, из которой он был получен. Действительно, вирусные геномы находятся в состоянии постоянного изменения и содержат несколько вариабельных доменов, которые демонстрируют высокие уровни изменчивости между изолятами. Таким образом, термин «эпитоп» включает в себя как последовательности, идентичные природной последовательности, так и модификации природной последовательности, такие как делеции, вставки и замены (обычно консервативной природы).The term "epitope", as used herein, refers to a sequence consisting of at least about 3-5 amino acids, preferably from about 5-10 or 15, and not more than about 1000 (or any integer in this range) that define a sequence that, by itself or as part of a larger sequence, binds to an antibody that is generated in response to that sequence. There is no critical upper limit to the length of a fragment, which may include an almost full-length protein sequence or even a fusion protein comprising two or more epitopes from HCV polyprotein. An epitope for use in an aspect of the invention is not limited to a polypeptide having the exact sequence of that portion of the parent protein from which it was derived. Indeed, viral genomes are in a state of constant change and contain several variable domains that exhibit high levels of variability between isolates. Thus, the term “epitope” includes both sequences identical to the natural sequence and modifications of the natural sequence, such as deletions, insertions and substitutions (usually of a conservative nature).
Области данного полипептида, содержащие эпитоп, могут быть идентифицированы с использованием любого числа методик картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. Например, см. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Bioligy, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1966) Humana Press, Totowa, New Jersey. В частности, линейные эпитопы можно определять с помощью, например, одновременного синтеза большого числа пептидов на твердых подложках, сопоставления этих пептидов с частями молекулы белка и проведения реакции этих пептидов с антителами, когда пептиды еще связаны с подложками. Подобные методики известны в данной области и описаны, в частности, Патент США 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Geysen etal (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. С использованием этой методики было определено число эпитопов HCV. Например, см. Chien et al., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) pp. 320-324, и далее ниже. Также конформационные эпитопы легко определяются при определении пространственной конформации аминокислот с помощью, например, рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. Например, см. Epitope mapping protocol, supra. Антигенные области белка можно также определить, используя стандартные графики антигенности и гидропатии, такие как вычисляемые программой Omiga, версия 1.0, доступной в Oxford Molecular Group. В этой компьютерной программе используется метод Hopp/Woods, Hopp et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 для определения профилей антигенности, и методика Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 152:105-132 для графиков гидропатии.Regions of a given polypeptide containing an epitope can be identified using any number of epitope mapping techniques well known in the art. For example, see Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Bioligy, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1966) Humana Press, Totowa, New Jersey. In particular, linear epitopes can be determined by, for example, simultaneously synthesizing a large number of peptides on solid substrates, comparing these peptides with parts of a protein molecule and reacting these peptides with antibodies when the peptides are still bound to the substrates. Similar techniques are known in the art and are described, in particular, US Pat. No. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 178-182; Geysen etal (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. Using this technique, the number of HCV epitopes was determined. For example, see Chien et al., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) pp. 320-324, and further below. Conformational epitopes are also easily determined when determining the spatial conformation of amino acids using, for example, x-ray crystallography and 2-dimensional nuclear magnetic resonance. For example, see Epitope mapping protocol, supra. Antigenic regions of a protein can also be determined using standard graphs of antigenicity and hydropathy, such as those computed by Omiga, version 1.0, available from the Oxford Molecular Group. This computer program uses the Hopp / Woods method, Hopp et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78: 3824-3828 for determining antigenicity profiles, and methodology of Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 152: 105-132 for hydropathy schedules.
Термин «конформационный эпитоп», используемый здесь, означает часть полноразмерного белка, или аналог, или мутеин, обладающий' природными структурными свойствами аминокислотной последовательности, кодирующей эпитоп в полноразмерном природном белке. Природные структурные свойства включают в себя, не ограничиваясь ими, гликозилирование и трехмерную структуру. Длина последовательности, определяющей эпитоп, может широко варьировать, так как считается, что эпитопы формируются трехмерной формой антигена (например, складчатостью). Таким образом, аминокислоты, определяющие эпитоп, могут быть сравнительно малочисленны, но широко рассеяны по длине молекулы (или даже разных молекул, в случае димеров и т.п.) и собираться в правильную конформацию эпитопа за счет складчатости. Части антигена между остатками, определяющими эпитоп, могут быть несущественными для конформационной структуры эпитопа. Например, делеция или замена этих промежуточных последовательностей может не влиять на последовательности, создающие конформационный эпитоп, необходимые для сохранения конформации эпитопа (например, цистеин, участвующий в дисульфидной связи; участки гликолизирования и т.д.).The term "conformational epitope," as used herein, means a portion of a full-sized protein, or an analog, or a mutein having the "natural structural properties of an amino acid sequence encoding an epitope in a full-sized natural protein." Natural structural properties include, but are not limited to, glycosylation and three-dimensional structure. The length of the sequence determining the epitope can vary widely, since it is believed that the epitopes are formed by the three-dimensional form of the antigen (for example, folding). Thus, the amino acids that determine the epitope can be relatively small, but widely scattered along the length of the molecule (or even different molecules, in the case of dimers, etc.) and assemble into the correct conformation of the epitope due to folding. Parts of the antigen between residues defining the epitope may not be relevant to the conformational structure of the epitope. For example, deletion or substitution of these intermediate sequences may not affect the sequences generating the conformational epitope necessary to maintain the conformation of the epitope (for example, cysteine involved in a disulfide bond; glycolization sites, etc.).
Конформационный эпитоп, находящийся в - области NS3/4a, надежно определяется с использованием способов, обсуждаемых выше. Кроме того, присутствие или отсутствие конформационного эпитопа в данном полипептиде можно легко определить с помощью скрининга интересующего антигена с антителом (поликлональным сывороточным или моноклональным к конформационному эпитопу), и сравнения его реакционной способности с денатурированной версией антигена, который сохраняет только линейные - эпигоны (если есть). В подобном скрининге с использованием поликлональных антител можно вначале абсорбировать поликлональную сыворотку денатурированным антигеном и посмотреть, остались ли антитела к интересующему антигену. Кроме того, в случае NS3/4a, молекула, которая сохраняет природную конформацию, будет также обладать ферментативной активностью протеазы и, необязательно, хеликазы. Эти активности можно определить с помощью ферментативных анализов, как будет описано ниже.The conformational epitope located in the - region of NS3 / 4a is reliably determined using the methods discussed above. In addition, the presence or absence of a conformational epitope in a given polypeptide can be easily determined by screening an antigen of interest with an antibody (polyclonal serum or monoclonal to a conformational epitope), and comparing its reactivity with a denatured version of the antigen that retains only linear epigones (if any) ) In such a screening using polyclonal antibodies, one can first absorb the polyclonal serum with the denatured antigen and see if antibodies to the antigen of interest remain. In addition, in the case of NS3 / 4a, a molecule that retains its natural conformation will also have the enzymatic activity of a protease and, optionally, a helicase. These activities can be determined using enzymatic assays, as will be described below.
Предпочтительно, конформационный эпитоп получают путем рекомбинации, и он выделяется клеткой, из которой он может быть извлечен в условиях, которые сохраняют его желаемые структурные особенности, т.е. без денатурации эпитопа. Эти клетки включают в себя клетки бактерий, дрожжей, насекомых и млекопитающих. Выделение и изоляция рекомбинантных конформационных эпитопов из полипротеина HCV описана, в частности, в Международных публикациях №№ WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. В качестве альтернативы, можно выделять антигены и затем ренатурировать белок после выделения. Также понятно, что химический синтез также позволяет получать мимитопы конформационного антигена, которые перекрестно реагируют с конформационным эпитопом «природного» антигена.Preferably, the conformational epitope is obtained by recombination, and it is secreted by the cell from which it can be extracted under conditions that retain its desired structural features, i.e. without denaturation of the epitope. These cells include cells of bacteria, yeast, insects and mammals. Isolation and isolation of recombinant conformational epitopes from HCV polyprotein is described, in particular, in International Publication Nos. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. Alternatively, you can select antigens and then renature the protein after isolation. It is also understood that chemical synthesis also allows the production of conformational antigen mimitopes that cross-react with the conformational epitope of a “natural” antigen.
Термин «слитый антиген с множественными эпитопами», или "MEFA", используемый здесь, означает полипептид, в котором множественные антигены HCV являются частью единой, непрерывной цепи аминокислот, которая не встречается в природе. HCV-антигены могут быть соединены непосредственно друг с другом пептидными связями или могут быть разделены промежуточными аминокислотными последовательностями. Слитые антигены могут также содержать последовательности, экзогенные по отношению к полипротеину HCV. Более того, присутствующие последовательности HCV могут происходить из разнообразных генотипов и/или изолятов HCV. Примеры конкретных МЕРА для использования в настоящих иммунологических анализах детализированы, например, в Международной публикации № WO 97/44469 и описаны ниже.The term "fusion antigen with multiple epitopes", or "MEFA", as used here, means a polypeptide in which multiple HCV antigens are part of a single, continuous chain of amino acids that is not found in nature. HCV antigens can be connected directly to each other by peptide bonds or can be separated by intermediate amino acid sequences. Fusion antigens may also contain sequences exogenous to HCV polyprotein. Moreover, HCV sequences present can be derived from a variety of HCV genotypes and / or isolates. Examples of specific MERA for use in these immunological assays are detailed, for example, in International Publication No. WO 97/44469 and are described below.
«Антитело» означает молекулу, которая по химическим или физическим причинам специфически связывается с представляющим интерес полипептидом. Таким образом, HCV-коровое антитело является молекулой, которая специфически связывается с HCV коровым белком. Термин «антитело», как он использован здесь, включает в себя антитела, полученные как из поликлональных, так и моноклональных препаратов, так же, как следующее: гибридные (химерные) молекулы антител (см., например. Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299; Патент США №4816567); F(ab')2- и F(ab)-фрагменты, Fv-молекулы (не-ковалентные гетеродимеры, см., например, Inbar et ai. (1972) Proc Nati Acad Scl USA 69:2659-2662; and Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096); одноцепочечные Fv молекулы (sFv) (см.,например, Huston et ai. (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:5879-5883); димерные и гримерные конструкции фрагментов антител, минитела (см., например. Pack et al. (1992) Blochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 1498:120-126); гумманизированные молекулы антител (см., например, Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536; и Патентная публикация Англии № GB 2276169, опубликованная 21 сентября 1994 г.); и любые функциональные фрагменты, полученные из таких молекул, которые сохраняют иммунологические связывающие свойства родительской молекулы антитела.“Antibody” means a molecule that, for chemical or physical reasons, specifically binds to a polypeptide of interest. Thus, an HCV core antibody is a molecule that specifically binds to an HCV core protein. The term “antibody” as used herein includes antibodies derived from both polyclonal and monoclonal preparations, as well as the following: hybrid (chimeric) antibody molecules (see, for example, Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299; US Pat. No. 4,816,567); F (ab ') 2 and F (ab) fragments, Fv molecules (non-covalent heterodimers, see, for example, Inbar et ai. (1972) Proc Nati Acad Scl USA 69: 2659-2662; and Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096); single chain Fv molecules (sFv) (see, for example, Huston et ai. (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85: 5879-5883); dimeric and makeup designs of antibody fragments, minitel (see, for example, Pack et al. (1992) Blochem 31: 1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 1498: 120-126); humanized antibody molecules (see, for example, Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534-1536; and British Patent Publication No. GB 2276169, published September 21, 1994 .); and any functional fragments derived from such molecules that retain the immunological binding properties of the parent antibody molecule.
Термин «моноклональное антитело», как он используется здесь, относится к композиции антител, имеющих гомогенную популяцию антител. Этот термин не ограничен ни видом или источником антител, ни способом их получения. Так, этот термин включает в себя антитела, полученные из мышиных гибридом, так же, как и моноклональные антитела, полученные при использовании скорее человеческих, чем мышиных гибридом. Например, см., Cote, et al. Monclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, p. 77.The term "monoclonal antibody", as used here, refers to a composition of antibodies having a homogeneous population of antibodies. This term is not limited either by the type or source of antibodies, nor by the method of their preparation. Thus, this term includes antibodies derived from murine hybridomas, as well as monoclonal antibodies obtained using human rather than mouse hybridomas. For example, see Cote, et al. Monclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, p. 77.
«Рекомбинантный» белок - это белок, сохраняющий желательную активность и полученный с помощью методики рекомбинации ДНК, как описано здесь. В целом, представляющий интерес ген клонируют и затем экспрессируют в трансформированном организме, как описано ниже. Организм хозяина экспрессирует чужеродный ген для продуцировакия белка в условиях экспрессии.A “recombinant” protein is a protein that retains the desired activity and is obtained using a DNA recombination technique as described herein. In general, the gene of interest is cloned and then expressed in a transformed organism, as described below. The host organism expresses a foreign gene for the production of protein under expression conditions.
Когда имеют в виду полипептид, под «выделенным» подразумевают, что указанная молекула выделена и отделена от целого организма, в котором эта молекула обнаружена в природе, или она находится в значительной степени в отсутствие других биологических макромолекул того же типа. Термин «выделенный» в отношении полинуклеотида означает молекулу нуклеиновый кислоты, лишенную, полностью или частично, последовательностей, обычно связанных с ней в природе; или последовательность, такую, как она существует в природе, но включающую в себя гетерологичную последовательность, с которой она связана; либо молекулу, диссоциированную с хромосомой.When referring to a polypeptide, “isolated” means that the molecule is isolated and separated from the whole organism in which this molecule is found in nature, or it is largely in the absence of other biological macromolecules of the same type. The term "isolated" in relation to a polynucleotide means a nucleic acid molecule lacking, in whole or in part, of sequences normally associated with it in nature; or a sequence, such as it exists in nature, but including a heterologous sequence with which it is associated; or a molecule dissociated with a chromosome.
Под «эквивалентной антигенной детерминантой» следует понимать антигенную детерминанту из другого подвида или штамма HCV, такого как HCV-штаммы 1, 2 или 3. Более конкретно, известны эпитопы, такие как 5-1-1, и эти эпитопы варьируют у штаммов 1, 2 и 3. Таким образом, эпитопы 5-1-1 из трех разных штаммов являются эквивалентными антигенными детерминантами и, таким образом, являются «копиями», даже если их последовательности и неидентичны. В целом, аминокислотные последовательности эквивалентных антигенных детерминант будут иметь высокую степень гомологии последовательности, например гомология аминокислотной последовательности более 30%, предпочтительно более 40%, когда две последовательности выровнены.By “equivalent antigenic determinant” is meant an antigenic determinant from another subspecies or strain of HCV, such as HCV strains 1, 2 or 3. More specifically, epitopes such as 5-1-1 are known, and these epitopes vary among
«Гомология» означает процент сходства между двумя полинуклеотидными или двумя полипептидными последовательностями. Две ДНК или две - полипептидные последовательности являются «существенно гомологичными» по отношению друг к другу, когда последовательности демонстрируют по меньшей мере около 50%, предпочтительно, по меньшей мере около 75%, более предпочтительно - по меньшей мере около 80-85%, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере около 95-98% сходства последовательностей на протяжении определенной длины молекул. «Существенно гомологичный» здесь также относится к последовательностям, демонстрирующим полную идентичность с определенными ДНК или полипептидными последовательностями."Homology" means the percentage of similarity between two polynucleotide or two polypeptide sequences. Two DNA or two polypeptide sequences are “substantially homologous” to each other when the sequences show at least about 50%, preferably at least about 75%, more preferably at least about 80-85%, and most preferably at least about 95-98% sequence similarity over a given length of molecules. “Substantially homologous” also refers to sequences showing complete identity with specific DNA or polypeptide sequences.
Обычно «идентичность» относится в точном нуклеотид-нуклеотид или аминокислота-аминокислота соответствии двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, соответственно. Процент идентичности можно определить путем прямого сравнения информации о последовательности между двумя молекулами при помощи выравнивания последовательностей, подсчета точного числа соответствий между двумя выровненными последовательностями, деления на длину более короткой последовательности и умножения на 100.Typically, "identity" refers to the exact nucleotide-nucleotide or amino acid-amino acid matching two polynucleotide or polypeptide sequences, respectively. The percentage of identity can be determined by directly comparing sequence information between two molecules by aligning the sequences, counting the exact number of matches between two aligned sequences, dividing the length of the shorter sequence, and multiplying by 100.
Для помощи в анализе сходства и идентичности можно использовать легко доступные компьютерные программы, такие как ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and. Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppi. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, которая адаптирует алгоритм локальной гомологии Смита и Ватермана (Smith & Waterman Advances in Appl. Math. 2: 482-489, 1981) для анализа пептидов. Программы для определения сходства и идентичности, нуклеотидных последовательностей доступны в Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 (доступна от Genetics Computer Group, Madison, WI), например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, в которых также использован алгоритм Смита и Ватермана. Эти программы легко применяются с параметрами по умолчанию, рекомендованными производителем и описаны в Wisconsin Sequence Analysis Package, упомянутом выше. Например, процентное сходство конкретной нуклеотидной последовательности с контрольной последовательностью можно определить, используя алгоритм гомологии Смита и Ватермана с установленными по умолчанию оценочной таблицей и отрицательным счетом за промежуток в шесть нуклеотидных положений.Easily accessible computer programs such as ALIGN, Dayhoff, M.O. can be used to help analyze similarities and identities. in Atlas of Protein Sequence and. Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppi. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, which adapts Smith & Waterman's Local Homology Algorithm (Smith & Waterman Advances in Appl. Math. 2: 482-489, 1981) for peptide analysis. Programs for determining similarity and identity, nucleotide sequences are available in the Wisconsin Sequence Analysis Package, version 8 (available from Genetics Computer Group, Madison, WI), for example, BESTFIT, FASTA and GAP programs, which also use the Smith and Waterman algorithm. These programs are easy to use with default settings recommended by the manufacturer and are described in the Wisconsin Sequence Analysis Package mentioned above. For example, the percentage similarity of a particular nucleotide sequence to a control sequence can be determined using the Smith and Waterman homology algorithm with a default score table and a negative score for the gap of six nucleotide positions.
Еще одним способом установления процентного сходства в контексте настоящего изобретения является использование пакета программ MPSRCH, с авторскими правами Университета Эдинбурга, разработанного John F.Collins and Shane S.Sturrok и распространяемого IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). У этого набора программ алгоритм Смита и Ватермана используется при параметрах по умолчанию, установленных для оценочной таблицы (например, отрицательный счет -12 при открытом промежутке, отрицательный счет - 1 при расширенном промежутке и промежуток - 6 положений). В полученных данных значение "Match" отражает «сходство последовательностей». Другие подходящие программы для расчета процентной идентичности или сходства между последовательностями, в целом, известны в данной области, например, еще одной программой выравнивания является программа BLAST, используемая с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP можно использовать со следующими параметрами по умолчанию: genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Подробности этих программ можно найти по следующему Интернет-адресу: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.Another way of establishing percent similarity in the context of the present invention is to use the MPSRCH software package, copyright of the University of Edinburgh, developed by John F. Colins and Shane S. Strorok and distributed by IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). For this set of programs, the Smith and Waterman algorithm is used with the default parameters set for the scorecard (for example, a negative score of -12 with an open gap, a negative count of 1 with an extended gap and a gap of 6 positions). In the data obtained, the value “Match” reflects “sequence similarity”. Other suitable programs for calculating percent identity or similarity between sequences are generally known in the art, for example, another alignment program is the BLAST program used with default parameters. For example, BLASTN and BLASTP can be used with the following default parameters: genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Details of these programs can be found at the following Internet address: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
В качестве альтернативы, гомологию можно определять путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, когда образуются стабильные дуплексы между гомологичными регионами, с последующим перевариванием одноцепочечно-специфической нуклеазой (нуклеазами) и определением размеров переваренных фрагментов. Существенно гомологичные ДНК-последовательности можно определять при помощи эксперимента по Саузерн-блот-гибридизации, например, в жестких условиях, как определено в этой конкретной системе. Определение соответствующих условий гибридизации находится в пределах квалификации специалистов данной области. Например, см. Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.Alternatively, homology can be determined by hybridization of polynucleotides under conditions when stable duplexes are formed between homologous regions, followed by digestion with single chain-specific nuclease (s) and sizing of the digested fragments. Significantly homologous DNA sequences can be determined using the Southern blot hybridization experiment, for example, under stringent conditions, as defined in this particular system. Determination of the appropriate hybridization conditions is within the qualifications of specialists in this field. For example, see Sambrook et al., Supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
«Кодирующая последовательность» или последовательность, которая «кодирует» избранный полипептид, - это молекула нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) или транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo или in vitro, будучи помещенной под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определены стартовым кодоном на 5'-(амино) конце и кодоном остановки трансляции на 3'-(карбокси) конце. Последовательность, останавливающая транскрипцию, может находиться в интервале от 3' конца до кодирующей последовательности.A “coding sequence” or a sequence that “encodes” a selected polypeptide is a nucleic acid molecule that is transcribed (in the case of DNA) or translated (in the case of mRNA) into a polypeptide in vivo or in vitro, when placed under the control of the corresponding regulatory sequences. The boundaries of the coding sequence are determined by the start codon at the 5 '- (amino) end and the translation stop codon at the 3' - (carboxy) end. The sequence that stops transcription may be in the range from the 3 'end to the coding sequence.
«Оперативно связанный» относится к расположению элементов, при котором компоненты, охарактеризованные таким образом, скомпонованы так, чтобы выполнять требуемую функцию. Так, данный промотор, оперативно связанный с кодирующей последовательностью, способен воздействовать на экспрессирование кодирующей последовательности, когда присутствуют надлежащие трансляционные факторы и т.п. Промотор необязательно должен граничить с кодирующей последовательностью, поскольку его функция состоит в управлении ее экспрессией. Так, например, промежуточные нетранслируемые, хотя и транскрибируемые, последовательности могут находиться между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью, как, например, транскрибируемые интроны, и промоторная последовательность может тем не менее считаться «оперативно связанной» с кодирующей последовательностью.“Operationally coupled” refers to an arrangement of elements in which components characterized in such a way are arranged to perform a desired function. Thus, a given promoter operably linked to a coding sequence is capable of influencing the expression of a coding sequence when proper translation factors are present and the like. The promoter does not have to border on the coding sequence, since its function is to control its expression. So, for example, intermediate untranslated, albeit transcribed, sequences can be between the promoter sequence and the coding sequence, such as, for example, transcribed introns, and the promoter sequence can nevertheless be considered “operably linked” to the coding sequence.
Термин «контролирующий элемент» относится к полинуклеотидной последовательности, которая способствует экспрессии кодирующей последовательности, с которой она связана. Термин включает в себя промоторы, последовательности, терминирующие транскрипцию, вышерасположенные регуляторные домены, сигналы полиаденилирования, нетранслируемые области, включая 5'-UTR и 3'-UTR, и, при соответствующих условиях, лидерные последовательности и энхансеры, которые коллективно обусловливают транскрипцию и трансляцию кодирующих последовательностей в клетке-хозяине.The term "control element" refers to a polynucleotide sequence that facilitates the expression of the coding sequence with which it is associated. The term includes promoters, transcription termination sequences, upstream regulatory domains, polyadenylation signals, untranslated regions, including 5'-UTR and 3'-UTR, and, under appropriate conditions, leader sequences and enhancers that collectively determine the transcription and translation of coding sequences in the host cell.
Термин «промотор», используемый здесь, относится к регуляторной области ДНК, способной связываться с РНК-полимеразой в клетке-хозяине и инициировать транскрипцию нижележащей (в направлении 3') кодирующей последовательности, оперативно с ней связанной. Для целей настоящего изобретения промоторная последовательность включает в себя минимальное число оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции гена, представляющего интерес, на уровне, обнаруживаемом выше фона. Промоторная последовательность содержит сайт, инициирующий транскрипцию также, как и белок-связывающие домены (консенсусные последовательности), ответственные за присоединение РНК-полимеразы. Промоторы эукариот часто, но не всегда, содержат «ТАТА»-боксы и «САТ»-боксы.The term “promoter” as used herein refers to a regulatory region of DNA capable of binding to RNA polymerase in a host cell and initiating transcription of the downstream (3 ′ direction) coding sequence operably linked to it. For the purposes of the present invention, the promoter sequence includes the minimum number of bases or elements necessary to initiate transcription of the gene of interest at a level found above the background. The promoter sequence contains a site that initiates transcription as well as protein-binding domains (consensus sequences) responsible for the attachment of RNA polymerase. Eukaryotic promoters often, but not always, contain “TATA” boxes and “CAT” boxes.
Управляющая последовательность «руководит транскрипцией» кодирующей последовательности в клетке, когда РНК-полимераза будет присоединять промоторную последовательность и транскрибировать кодирующую последовательность в мРНК; которая затем транслируется в полипептид, кодируемый кодирующей последовательностью.The control sequence “directs the transcription” of the coding sequence in the cell when the RNA polymerase will attach the promoter sequence and transcribe the coding sequence into mRNA; which is then translated into a polypeptide encoded by a coding sequence.
"Кассета экспрессии или "экспрессирующая конструкция" относится к совокупности последовательностей, которая способна управлять экспрессией представляющей интерес последовательности (последовательностей) или гена (генов). Кассета экспрессии включает в себя регуляторные элементы, как было описано выше, такие как промотор, который оперативно связан (для того чтобы управлять их транскрипцией) с представляющей интерес последовательностью (последовательностями) или геном (генами), и часто также включает в себя полиаденилированные последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения описанная здесь кассета экспрессии может находиться внутри плазмидной конструкции. В добавление к компонентам кассеты экспрессии плазмидная конструкция может также содержать один или более выбираемых маркеров, сигнал, который позволяет плазмидной конструкции существовать в виде одноцепочечной ДНК (например, точка начала репликации М13), по меньшей мере один многократно клонирующий сайт, и точка начала репликации «млекопитающего» (например, SV40 или точка начала репликации аденовируса).An "expression cassette or" expression construct "refers to a combination of sequences that is capable of driving the expression of a sequence (s) or gene (s) of interest. An expression cassette includes regulatory elements, as described above, such as a promoter that is operably linked ( in order to control their transcription) with the sequence (s) or gene (s) of interest, and often also includes polyadenylated sequences In some embodiments, the expression cassette described herein may be located within the plasmid construct. In addition to the components of the expression cassette, the plasmid construct may also contain one or more selectable markers, a signal that allows the plasmid construct to exist as single-stranded DNA (eg, the start point M13 replication), at least one multiple cloning site, and a “mammalian” replication origin (eg, SV40 or adena replication origin) ovirus).
Термин «трансформация», как он использован здесь, относится к вставке экзогенного полинуклеотида в клетку-хозяина, безотносительно к способу, использованному для вставки: например, трансформация путем прямого поглощения, трансфицирования, инфицирования и т.п. Об отдельных методах трансфекции, см. ниже. Экзогенные полинуклеотиды могут содержаться в виде неинтегрированного вектора, например, как эписома, или - как альтернатива - может быть интегрирован в геном хозяина.The term "transformation", as used here, refers to the insertion of an exogenous polynucleotide into a host cell, regardless of the method used for insertion: for example, transformation by direct absorption, transfection, infection, etc. For individual transfection methods, see below. Exogenous polynucleotides can be contained as a non-integrated vector, for example, as an episoma, or - as an alternative - can be integrated into the host genome.
«Клетка-хозяин» - это клетка, которая трансформирована или способна к трансформации экзогенной последовательностью ДНК.A “host cell” is a cell that is transformed or capable of being transformed with an exogenous DNA sequence.
«Обычная твердая подложка» означает отдельную твердую основу с которой HCV-полипептиды, использующиеся в целях иммунологических анализов, связаны ковалентной связью или нековалентным способом, таким как гидрофобная адсорбция.“Conventional solid support” means a single solid support with which HCV polypeptides used for immunological assays are linked by a covalent bond or a non-covalent method, such as hydrophobic adsorption.
«Иммунологически реактивный» означает рассматриваемый антиген, который специфически реагирует с анти-НСУ-антителами, находящимися в биологическом образце, полученном у HVC-инфицированного субъекта."Immunologically reactive" means the antigen of interest that specifically reacts with anti-NSI antibodies found in a biological sample obtained from an HVC-infected subject.
«Иммунный комплекс» означает комплекс, образовавшийся, когда антитело связывается с эпитопом антигена."Immune complex" means a complex formed when an antibody binds to an epitope of an antigen.
Термин «биологический образец», как он используется здесь, относится к образцу ткани или жидкости, полученному у субъекта, включающему в себя, но не ограниченного ими, например, кровь, плазму, сыворотку, фекальные массы, мочу, костный мозг, желчь, спинномозговую жидкость, лимфу, образцы кожи, наружные выделения кожи, дыхательной системы, кишечного и мочеполового трактов, слезы, слюну, молоко, клетки крови, органы, биопсии и также образцы компонентов культуры клеток in vitro, включающие в себя, но не ограниченные ими, кондиционированную среду, полученную в результате роста клеток и тканей в культуральной среде, например, рекомбинантные клетки и клеточные компоненты.The term “biological sample”, as used here, refers to a sample of tissue or fluid obtained from a subject, including but not limited to, for example, blood, plasma, serum, fecal matter, urine, bone marrow, bile, cerebrospinal fluid, lymph, skin samples, external secretions of the skin, respiratory system, intestinal and genitourinary tracts, tears, saliva, milk, blood cells, organs, biopsies and also samples of components of cell culture in vitro, including, but not limited to, conditioned wednesday, semi ennuyu resulting growth of cells and tissues in culture medium, e.g., recombinant cells, and cell components.
Термины «метка» и «обнаруживаемая метка» относятся к молекуле, которую возможно обнаружить, включая в себя, но не ограничиваясь ими: радиоактивные изотопы, люминофоры, хемилюминесцентные вещества, хромофоры, ферменты, субстраты ферментов, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, хромофоры, красители, ионы металлов, золи металлов, лиганды (например, биотин, стрепавидин или гаптены) и им подобные. Термин «люминофор» относится к веществу или его дозе, которая способна флуоресцировать а регистрируемом диапазоне. Частные примеры меток, которые можно использовать в данном изобретении, включают в себя, не ограничиваясь ими: пероксидазу хрена (HRP), флуоресцеин, FITC, родамин, дансил, умбеллиферон, диметилакридиновый эфир (DMAE), Техасский красный, люминол, НАДФН и α-β-галактозидазу.The terms “label” and “detectable label” refer to a molecule that can be detected, including, but not limited to: radioactive isotopes, phosphors, chemiluminescent substances, chromophores, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, chromophores, dyes , metal ions, metal sols, ligands (e.g., biotin, strepavidin or haptens) and the like. The term "phosphor" refers to a substance or its dose, which is capable of fluorescence in the recorded range. Particular examples of labels that can be used in this invention include, but are not limited to: horseradish peroxidase (HRP), fluorescein, FITC, rhodamine, dansil, umbelliferone, dimethyl acridine ether (DMAE), Texas red, luminol, NADPH and α- β-galactosidase.
II. Варианты осуществления изобретенияII. Embodiments of the invention
Прежде чем детально описывать настоящее изобретение, необходимо понять, что данное изобретение не ограничивается частными рецептурами или параметрами процесса, поскольку они, естественно, могут варьировать. Также должно быть ясно, что терминология, используется здесь только для описания конкретных вариантов осуществления данного изобретения, и не должна трактоваться как ограничительная.Before describing the present invention in detail, it is necessary to understand that the present invention is not limited to particular formulations or process parameters, as they naturally may vary. It should also be clear that the terminology used here is only to describe specific embodiments of the present invention, and should not be construed as limiting.
Хотя в практической реализации данного изобретения можно использовать различные композиции и способы, подобные или эквивалентные описанным здесь, в тексте описаны предпочтительные материалы и способы.Although various compositions and methods similar or equivalent to those described herein can be used in the practice of this invention, preferred materials and methods are described in the text.
Как отмечалось выше, настоящее изобретение основано на открытии новых диагностических способов точного определения ранней инфекции HCV. Способы основаны на идентификации и использовании высокоиммуногенных антител и антигенов HCV, которые присутствуют на ранних стадиях HCV-сероконверсии, таким образом увеличивая точность определения и уменьшая долю ошибочных результатов. Данные способы могут быть легко применены в виде единого анализа.As noted above, the present invention is based on the discovery of new diagnostic methods for accurately determining early HCV infection. The methods are based on the identification and use of highly immunogenic antibodies and HCV antigens that are present in the early stages of HCV seroconversion, thereby increasing the accuracy of determination and reducing the proportion of erroneous results. These methods can be easily applied as a single analysis.
Конкретнее, анализ проводится на твердой подожке, с которой сшиты одно или более HCV-антикоровых антител (направленных против либо одного и того же, либо различных HCV-коровых эпитопов), и эпитоп, полученный из NS3/4a-области полипротеина HCV. Примеры конкретных антикоровых антител, применимых в настоящем изобретении, включают в себя, не ограничиваясь ими, молекулы антител, такие как моноклональные антитела, направленные против эпитопов в коровой области, найденной между аминокислотами 10-53, аминокислотами 10-45, аминокислотами 67-88, аминокислотами 120-130, или антитела, направленные против любых из коровых эпитопов, установленных, например, в: Houghton et ai., Патент США №5350671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) -89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., Международная публикация № WO 93/00365; Chien, D. Y., Международная публикация № WO 94/01778; Патентная заявка США с одним правопреемником. Сер. №08/403590 и 08/444818.More specifically, the assay is performed on a solid substrate with which one or more HCV anticorrosive antibodies (directed against either the same or different HCV core epitopes) are crosslinked and an epitope derived from the NS3 / 4a region of HCV polyprotein. Examples of specific anti-core antibodies useful in the present invention include, but are not limited to, antibody molecules, such as monoclonal antibodies directed against epitopes in the core region found between amino acids 10-53, amino acids 10-45, amino acids 67-88, amino acids 120-130, or antibodies directed against any of the core epitopes found, for example, in: Houghton et ai., US Patent No. 5350671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) -89: 10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al., International Publication No. WO 93/00365; Chien, D. Y., International Publication No. WO 94/01778; U.S. Patent Application with One Assignee. Ser. No. 08/403590 and 08/444818.
Описана NS3/4a-область полипротеина HCV, и аминокислотная последовательность и полная структура белка описана, например, в Yao et al.. Structure (November 1999) 7:1353-1363; Sali et al., Blochezn. (1998) 37:3392-3401; and Bartenschlager, R., J.Viral Hepat. (1999) 6:165-181. Также см. Dasmahapatra et al., Патент США №5843752. Заявленью иммунологические анализы используют по меньшей мере один конформационный эпитоп, полученный из NS3/4a-области, найденной в природной частице HCV или ее инфицирующем продукте, что подтверждается сохранением протеазной или - необязательно - хеликазной активности, в норме демонстрируемой генным продуктом NS3/4a и/или иммунореактивностью антигена с антителами в образце, полученном у HCV-инфицированного субъекта, и потерей иммунореактивности эпитопа при денатурации антигена. Например, конформационный эпитоп можно разрушить путем нагревания, изменения рН в сторону очень кислых или щелочных значений или добавления известных органических денатураторов, таких как дитиотреитол (DTT), или подходящего детергента. Например, см. Protein Purification Methods, a practical approach (E.L.V.Harris and S.Angal eds., IRL Press), и денатурированный продукт сравнивают с продуктом, который не обрабатывали, как описано выше.The NS3 / 4a region of HCV polyprotein is described, and the amino acid sequence and complete protein structure are described, for example, in Yao et al .. Structure (November 1999) 7: 1353-1363; Sali et al., Blochezn. (1998) 37: 3392-3401; and Bartenschlager, R., J. Viral Hepat. (1999) 6: 165-181. Also see Dasmahapatra et al., U.S. Patent No. 5,843,752. The immunological assays claimed use at least one conformational epitope derived from the NS3 / 4a region found in the natural HCV particle or its infectious product, as evidenced by the retention of the protease or optionally helicase activity normally demonstrated by the NS3 / 4a and / or immunoreactivity of an antigen with antibodies in a sample obtained from an HCV-infected subject, and loss of epitope immunoreactivity upon denaturation of the antigen. For example, a conformational epitope can be destroyed by heating, changing the pH to very acidic or alkaline values, or adding known organic denaturants, such as dithiothreitol (DTT), or a suitable detergent. For example, see Protein Purification Methods, a practical approach (E.L. V. Harris and S. Angel eds., IRL Press), and a denatured product is compared with a product that has not been processed as described above.
Протеазную и хеликазную активности можно определить, используя стандартные ферментные анализы, хорошо известные в данной области. Например, протеазную активность можно определить, используя анализы, хорошо известные в данной области. Например, Takeshita et al. Anal. Biochem. (1997) 241:242-246: Kakiuchi et al., J. Biochem. (1997) 122:749-755; Sali et al., Biochemistry (1998) 37:3392-3401; Cho et al., J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115; Cerretani et al., Anal. Biochem. (1999) 266:192-197; Zhang et al., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275; Kakiuchi et al., J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84; Fowler et al., J. Blomol. Screen. (2000) 5:153-158; and Kim et al., Anal. Biochem. (2000) 284:42-48. Конкретный подходящий анализ для тестирования протеазной активности описан далее в примерах.Protease and helicase activity can be determined using standard enzyme assays well known in the art. For example, protease activity can be determined using assays well known in the art. For example, Takeshita et al. Anal. Biochem. (1997) 241: 242-246: Kakiuchi et al., J. Biochem. (1997) 122: 749-755; Sali et al., Biochemistry (1998) 37: 3392-3401; Cho et al., J. Virol. Meth. (1998) 72: 109-115; Cerretani et al., Anal. Biochem. (1999) 266: 192-197; Zhang et al., Anal. Biochem. (1999) 270: 268-275; Kakiuchi et al., J. Virol. Meth. (1999) 80: 77-84; Fowler et al., J. Blomol. Screen. (2000) 5: 153-158; and Kim et al., Anal. Biochem. (2000) 284: 42-48. A specific suitable assay for testing protease activity is described further in the examples.
Точно так же, анализы хеликазной активности хорошо известны в данной области и хеликазную активность NS3/4a-эпитопа можно определять, используя, например, анализ ELISA, как описано, например, в Hsu et al., Biochem. Blophys. Res. Common. (1998) 253:594-599; систему анализа сцинтилляционного сходства, как описано у Kyono et al., Anal. Biochem. (1998) 257;120-126; анализы на основе скрининга высокой пропускной способности, как писано например, в Hicham et al., Antiviral Res. (2000) 466:181-193 and Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000) 24:97-116; также как и с помощью других аналитических методов, известных в данной области. Например, Khu et al., J. Virol. (2001) 75:205-214; Utama et al.. Virology (2000) 273:316-324; Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000) 81;1335-1345; Preugschat et al., Biochemistry (2000) 39:5174-5183; Preugschat et al., Methods Mol. Med. (1998) 19:353-364; and Hesson et al., Biochemistry (2000) 39:2619-2625.Similarly, helicase activity assays are well known in the art and the helicase activity of the NS3 / 4a epitope can be determined using, for example, ELISA analysis, as described, for example, in Hsu et al., Biochem. Blophys. Res. Common (1998) 253: 594-599; a scintillation similarity analysis system as described by Kyono et al., Anal. Biochem. (1998) 257; 120-126; high throughput screening assays, as described for example in Hicham et al., Antiviral Res. (2000) 466: 181-193 and Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000) 24: 97-116; as well as using other analytical methods known in this field. For example, Khu et al., J. Virol. (2001) 75: 205-214; Utama et al .. Virology (2000) 273: 316-324; Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000) 81; 1335-1345; Preugschat et al., Biochemistry (2000) 39: 5174-5183; Preugschat et al., Methods Mol. Med. (1998) 19: 353-364; and Hesson et al., Biochemistry (2000) 39: 2619-2625.
Длина данного антигена достаточна для того, чтобы содержать иммунореактивный конформационный эпитоп. Часто полипептид, содержащий используемый антиген, может быть полноразмерным, однако полипептид может быть и укороченным, например, для увеличения растворимости или для улучшения секреции. Как правило, конформационный эпитоп, найденный в NS3/4a, экспрессируется в клетке как рекомбинантный полипептид, и этот полипептид образует эпитоп в требуемой форме, как будет описано в деталях ниже.The length of this antigen is sufficient to contain an immunoreactive conformational epitope. Often the polypeptide containing the antigen used may be full-sized, however, the polypeptide may also be shortened, for example, to increase solubility or to improve secretion. Typically, the conformational epitope found in NS3 / 4a is expressed in the cell as a recombinant polypeptide, and this polypeptide forms the epitope in the desired form, as will be described in detail below.
Иллюстративные аминокислотные последовательности NS3/4a полипептидов показаны, в фигуре 3 и фигурах 4A-4D. Выделенный жирным аланин, занимающий положение 182 на фигуре 3, заменяет природный серин, найденный в этом положении, для того, чтобы предотвратить автокатализ молекулы, который в противном случае может произойти. Аминокислотная последовательность, показанная в положении 2-686 в фигурах 4A-4D, соответствует аминокислотным положениям 1027-1711 HCV-1. Инициирующий кодон (ATG), кодирующий Met, показан в позиции 1. Кроме того, Thr, в норме встречающийся в положении 1428 HCV-1 (аминокислотное положение 403 на фигуре 4) изменяется на Pro, и Ser, в норме встречающийся в положении 1429 HCV-1 (аминокислотное положение 404 на фигуре 4) изменяется на Ile. Однако либо природная последовательность, имеющая или не имеющая N-концевой Met, изображенный аналог, имеющий или не имеющий N-концевой Met, либо другие аналоги или фрагменты могут быть использованы в заявленных анализах, при условии, что эпитоп получают с использованием метода, который сохраняет или восстанавливает его природную конформацию, такую как протеазную активность, и - необязательно - сохраняется хеликазная активность. В обоих патентах: Dasmahapatra et al., Патент США №5843752 и Zhang et al. Патент США №5990276 - описываются аналоги NS3/4a.Illustrative amino acid sequences of the NS3 / 4a polypeptides are shown in FIG. 3 and FIGS. 4A-4D. The fatty alanine in position 182 of Figure 3 replaces the natural serine found in this position in order to prevent autocatalysis of the molecule, which otherwise might occur. The amino acid sequence shown at position 2-686 in figures 4A-4D corresponds to amino acid positions 1027-1711 of HCV-1. The initiating codon (ATG) encoding Met is shown at
NS3-протеаза из NS3/4a найдена приблизительно в положениях 1027-1207, пронумерованных соответственно HCV-1, положениях 2-182 на фиг.4. Структура NS3-протеазы и ее активного центра известны. Например, см. De Francesco et al., Antivir. Ther. (1998) 3:99-109; Koch et al., Biochemistry (2001) 40:631-640. В норме допускаются изменения в природной последовательности, которые находятся вне активного центра молекулы. В частности, желательно сохранять аминокислоты с 1-й или 2-й по 155-ю (фиг.4), с небольшим числом замен или только консервативными заменами. Аминокислоты после 155-й допускают бóльшие изменения. Кроме того, если используют фрагменты последовательности NS3/4a, изображенной на фиг.4, эти фрагменты должны, как правило, включать в себя по меньшей мере аминокислоты 1- или 2-155, предпочтительно аминокислоты 1- или 2-175, и наиболее предпочтительно аминокислоты 1- или 2-182, с N-концевым Met или без него. Домен хеликазы обнаружен в области положений 1193-1657 HCV-1 (положения 207-632, фигура 4). Таким образом, если необходима хеликазная активность, эта часть молекулы должна быть сохранена с небольшими или только консервативными изменениями. На основе известной структуры NS3/4a специалист в данной области легко определит другие области, в которых изменения допустимы.The NS3 protease from NS3 / 4a is found at approximately positions 1027-1207, numbered HCV-1, respectively, positions 2-182 in FIG. 4. The structure of the NS3 protease and its active center are known. For example, see De Francesco et al., Antivir. Ther. (1998) 3: 99-109; Koch et al., Biochemistry (2001) 40: 631-640. Normally, changes in the natural sequence that are outside the active center of the molecule are allowed. In particular, it is desirable to preserve
Твердая подложка может также включать в себя другие антигены. Например, слитые антигены с множественными эпитопами (обозначенные «MEFA»), как это описано в Международной публикации WO/44469, которые могут быть пришиты к твердой подложке для использования в заявленных анализах. Подобные MEFA содержат множественные эпитопы, полученные из двух или более разных вирусных областей, показанных на фигуре 1 и в таблице 1. В частности, как показано в фиг.1 и таблице 1, при расщеплении полипротеин HCV образует не менее 10 отдельных продуктов в порядке NH2-Kop-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Коровый полипептид находится в положениях 1-191, пронумерованных относительно HCV-1 (см. Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, для HCV-1 генома). Этот полипептид в дальнейшем обрабатывается для получения HCV приблизительно с аминокислотами 1-173. Полипептиды оболочки Е1 и Е2 находятся примерно в положениях 192-383 и 384-746, соответственно. Домен Р7 найден примерно в положениях 747-809. NS2 - интегральный мембранный протеин с протеолитической активностью обнаружен примерно в положениях полипротеина 810-1026. NS2, как один, так и в комбинации с NS3 (находящийся примерно в положениях 1027-1657) расщепляет слабую связь NS2-NS3, которая, в свою очередь, образует N-конец NS3 и высвобождает большой полипротеин, включающий в себя активности как сериновой протеазы, так и РНК-хеликазы. Протеаза NS3, обнаруженная примерно в положениях 1027-1207, служит для обработки остающегося полипротеина. Хеликазная активность обнаруживается в районе положений 1193-1657. Завершение созревания полипротеина инициируется автокаталитическим расщеплением связи NS3-NS4a, катализируемое сериновой протеазой NS3. Обнаружено, что NS3-опосредственные расщепления полипротеина HCV включают в себя распознавание расщепляемых связей полипротеина молекулой NS3 другого полипептида. В этой реакции NS3 высвобождает кофактор NS3 (NS4a, 1658-1711), два белка (NS4b, отмеченный примерно в положениях 1712-1972, и NS5a, находящийся примерно в положениях 1973-2420) и РНК - зависимую РНК-полимеразу (NS5b, находящуюся примерно в положениях 2421-3011).The solid support may also include other antigens. For example, fusion antigens with multiple epitopes (designated "MEFA"), as described in International Publication WO / 44469, which can be sutured to a solid support for use in the claimed assays. Similar MEFAs contain multiple epitopes derived from two or more different viral regions shown in FIG. 1 and Table 1. In particular, as shown in FIG. 1 and Table 1, when cleaved, the HCV polyprotein forms at least 10 separate products in NH order 2- Kop-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. The core polypeptide is located at positions 1-191 numbered relative to HCV-1 (see Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455, for the HCV-1 genome). This polypeptide is further processed to produce HCV with approximately amino acids 1-173. Shell polypeptides E1 and E2 are located at approximately 192-383 and 384-746, respectively. The P7 domain is found at approximately 747-809. NS2 - an integral membrane protein with proteolytic activity found approximately at the positions of polyprotein 810-1026. NS2, both alone and in combination with NS3 (located at positions 1027-1657) cleaves the weak NS2-NS3 bond, which in turn forms the N-terminus of NS3 and releases a large polyprotein, which includes activities as a serine protease and RNA helicases. Protease NS3, found at approximately positions 1027-1207, serves to treat the remaining polyprotein. Helicase activity is found in the region of provisions 1193-1657. The completion of polyprotein maturation is initiated by autocatalytic cleavage of the NS3-NS4a bond, catalyzed by the NS3 serine protease. NSV-mediated cleavages of HCV polyprotein have been found to include recognition of cleavable polyprotein bonds by an NS3 molecule of another polypeptide. In this reaction, NS3 releases the cofactor NS3 (NS4a, 1658-1711), two proteins (NS4b, marked at approximately positions 1712-1972, and NS5a, located at approximately 1973-2420), and RNA-dependent RNA polymerase (NS5b, located approximately in positions 2421-3011).
Множественные HCV-антигены являются частью единой, непрерывной цепи аминокислот, которая не встречается в природе. Таким образом, линейный порядок эпитопов отличается от их линейного порядка в геноме, в котором они встречаются. Предпочтительно, чтобы линейный порядок последовательностей MEFA, используемых здесь, был аранжирован для получения оптимальной антигенности. Предпочтительно, чтобы эпитопы были более чем из одного штамма HCV, обеспечивая таким образом дополнительную возможность обнаруживать разные штаммы HCV в одном анализе. Таким образом MEFA, используемые здесь, могут содержать различные иммуногенные области, полученные из описанного выше полипротеина. К тому же, белок, полученный при сдвиге рамки считывания в коровой области полипротеина, такой, как описанный в Международной публикации № WO 99/63941, может быть использован для MEFA. При желании по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более одного или более эпитопов, полученных из HCV-полипротеина, могут находиться в слитом белке.Multiple HCV antigens are part of a single, continuous chain of amino acids that is not found in nature. Thus, the linear order of the epitopes differs from their linear order in the genome in which they occur. Preferably, the linear order of the MEFA sequences used herein is arranged to obtain optimal antigenicity. Preferably, the epitopes were from more than one HCV strain, thus providing an additional opportunity to detect different HCV strains in one analysis. Thus, the MEFAs used herein may contain various immunogenic regions derived from the polyprotein described above. In addition, a protein obtained by reading frame shift in the core region of a polyprotein, such as described in International Publication No. WO 99/63941, can be used for MEFA. If desired, at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more of one or more epitopes derived from HCV polyprotein can be present in a fusion protein.
Например, эпитопы, полученные, в частности, из сверхвариабельной области Е2, такой как область, охватывающая аминокислоты 384-410 или 390-410, могут быть включены в MEFA-антиген. Особенно эффективный эпитоп Е2 является одним из тех, которые включают в себя консенсусную последовательность, полученную из этой области, такую, как консенсусная последовательность Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, которая представляет собой консенсусную последовательность аминокислот 390-410 генома HCV типа 1. Иллюстративный Е2-эпитоп, представленный в MEFA согласно изобретению, может содержать гибридный эпитоп, охватывающий аминокислоты 390-444. Подобный гибридный Е2-эпитоп может включать в себя консенсусную последовательность, представляющую аминокислоты 390-410, слитые с природной аминокислотной последовательностью 411-444 из Е2 HCV.For example, epitopes obtained, in particular, from the supersubstantial region of E2, such as the region spanning amino acids 384-410 or 390-410, can be included in the MEFA antigen. A particularly effective epitope E2 is one that includes a consensus sequence derived from this region, such as the consensus sequence Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser- Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, which is a consensus amino acid sequence 390-410 of the
Кроме того, антигены можно получать из различных штаммов HCV. Известно много вирусных штаммов HCV, и в слитом белке можно использовать эпитопы, полученные из этих штаммов. Хорошо известно, что любой вид организмов варьирует от одной особи к другой и, более того, что каждый организм, включая вирус, может иметь ряд различных пород (штаммов). Например, как показано выше, HCV включает в себя по меньшей мере 6 генотипов. Каждый из этих генотипов включает в себя эквивалентные антигенные детерминанты. Более конкретно, каждый штамм содержит ряд антигенных детерминант, которые находятся во всех штаммах вируса, но слегка варьируют от одного вирусного штамма к другому. Например, HCV содержит антигенную детерминанту, известную как 5-1-1 (см. фиг.1). Эта конкретная антигенная детерминанта встречается в трех различных формах в трех разных вирусных штаммах HCV. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления данного изобретения все три формы 5-1-1 присутствуют в слитом антигене со множественными эпитопами, используемом в заявленных иммунологических анализах. Точно так же, могут присутствовать эквивалентные антигенные детерминанты из коровых областей различных штаммов HCV. Обычно эквивалентные антигенные детерминанты обладают высоким уровнем гомологии в отношении аминокислотной последовательности, их уровень гомологии, когда они выровнены, обычно составляет 30% или более, предпочтительно 40% или более. Мультикопийный эпитоп согласно изобретению может также включать в себя множественные копии, являющиеся точной копией одного и того же эпитопа.In addition, antigens can be obtained from various strains of HCV. Many viral HCV strains are known, and epitopes derived from these strains can be used in a fusion protein. It is well known that any kind of organisms varies from one individual to another and, moreover, each organism, including a virus, can have a number of different breeds (strains). For example, as shown above, HCV includes at least 6 genotypes. Each of these genotypes includes equivalent antigenic determinants. More specifically, each strain contains a number of antigenic determinants that are found in all strains of the virus, but vary slightly from one viral strain to another. For example, HCV contains an antigenic determinant known as 5-1-1 (see FIG. 1). This particular antigenic determinant occurs in three different forms in three different HCV viral strains. Accordingly, in a preferred embodiment of the invention, all three forms 5-1-1 are present in a fusion antigen with multiple epitopes used in the claimed immunological assays. Similarly, equivalent antigenic determinants from the core regions of various HCV strains may be present. Usually equivalent antigenic determinants have a high level of homology with respect to the amino acid sequence, their level of homology, when aligned, is usually 30% or more, preferably 40% or more. The multi-copy epitope according to the invention may also include multiple copies that are exact copies of the same epitope.
Иллюстративные MEFA, для применения в анализах согласно изобретению, описаны в международной публикации № WO 97/44469. Дополнительные иллюстративные MEFA, используемые здесь, включают в себя MEFA 12, MEFA 13 и MEFA 13.1. Надо понимать, что эти MEFA показаны только в качестве образца, и другие эпитопы, полученные из генома HCV, также могут быть использованы в данных анализах и могут быть встроены в эти или другие MEFA.Illustrative MEFA, for use in the assays of the invention, are described in international publication No. WO 97/44469. Additional illustrative MEFAs used herein include
Последовательность ДНК и соответствующая аминокислотная последовательность MEFA 12 показаны на фигурах 7A-7F. Общая структурная формула MEFA 12, показанная на фиг.6, выглядит следующим образом: hSOD-E1(тип1)-Е2 HVR консенсус(тип 1а)-Е2 HVR консенсус(типы 1 и 2)-с33с короткий(тип 1)-5-1-1(тип 1)-5-1-1(тип 3)-5-1-1(тип 2)-с100(тип 1)-NS5(тип l)-NS5(тип 1)-кор(типы 1 и 2) - кор(типы 1 и 2). Этот мультикопийный эпитоп включает в себя следующую аминокислотную последовательность, пронумерованную соответственно HCV-1 (нумерация аминокислот, данная ниже, следует нумерации, приведенной Choo, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, где аминокислота №1 - это 1-й метионин, - кодируемый кодирующей последовательностью коровой области): аминокислоты 1-69 супероксиддисмутазы (SOD, используемая для усиления рекомбинантной экспрессии белка); аминокислоты 303-320 полипротеина из области Е1; аминокислоты 390-410 полипротеина, представляющие собой консенсусную последовательность гипервариабельной области из Е2 HCV-1a, аминокислоты 384-414 полипротеина из области Е2, представляющие собой консенсусную последовательность гипервариабельных областей Е2 из HCV-1 и HCV-2; аминокислоты 1211-1457 из HCV-1-полипротеина, определяющие хеликазу; три копии эпитопа из 5-1-1, аминокислоты 1689-1735, один из HCV-1, один из HCV-3 и один из HCV-2, чьи копии являются эквивалентными антигенными детерминантами из трех разных вирусных штаммов HCV; HCV-полипептид С100 из HCV-1, аминокислоты 1901-1936 полипротеина; две точные копии эпитопа из NS5-области HCV-1, каждая с аминокислотами 2278-2313 HCV-полипротеина, и две копии трех эпитопов из коровой области, двух из HCV-1 и одного из HCV-2, чьи копии являются эквивалентными антигенными детерминантами, представленными аминокислотами 9-53 и 64-88 HCV-1 и 67-84 HCV-2.The DNA sequence and the corresponding amino acid sequence of
В таблице 2 показаны положения аминокислот различных эпитопов в MEFA 12 со ссылкой на фиг.7A-7F. Нумерация в таблице дана соответственно HCV-1. См. Choo, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 88:2451-2455. MEFA 13 и 13.1 разделяют общую формулу, приведенную выше для MEFA 12, с изменениями, как показано в таблицах 3 и 4, соответственно.Table 2 shows the amino acid positions of various epitopes in
Согласно одному из анализов, образец соединяют с твердой подложкой, как описано ниже. Если образец инфицирован HCV, коровый антиген, также как и антитела к эпитопам, находящимся на твердой подложке, будут связываться с компонентами твердой подложки. Затем добавляют антикоровое антитело с обнаруживаемой меткой. Меченое антикоровое антитело направленно против эпитопа, отличного от того, которое связано с твердой подложкой. Это антикоровое антитело связывается с коровым антигеном, захваченным антикоровыми антителами на твердой подложке.According to one analysis, the sample is combined with a solid support, as described below. If the sample is infected with HCV, the core antigen, as well as antibodies to epitopes located on a solid support, will bind to the components of the solid support. An detectable label with an anticorrosive antibody is then added. A labeled anticorrosive antibody is directed against an epitope other than that associated with a solid support. This anti-core antibody binds to core antigen captured by anti-core antibodies on a solid support.
Также добавляют антиген, реагирующий с захваченным HCV-антителом из биологического образца, где захваченное антитело из образца может реагировать с эпитопом NS3/4a. Предпочтительно этот антиген является эпитопом, полученным из NS3-области полипротеина HCV. Этот антиген связывает захваченное HCV-антитело из образца. Число антигенов, включающих такие эпитопы, известно и включает в себя, не ограничиваясь ими, антигены, полученные из областей с33с и с100, также как и слитые белки, включающие в себя NS3-эпитоп, такой как с25. Эти и другие NS3-эпитопы можно использовать в настоящих анализах, они известны в данной области и описаны, например, у Houghton et al., патент США 5350671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., Международная публикация № WO 93/00365; Chien, D. Y. Международная публикация № WO 94/01778; и Патентная заявка США с одним правопреемником №08/403590 и 08/444818.An antigen is also added that reacts with the captured HCV antibody from the biological sample, where the captured antibody from the sample can react with the NS3 / 4a epitope. Preferably, this antigen is an epitope derived from the NS3 region of HCV polyprotein. This antigen binds the captured HCV antibody from the sample. The number of antigens comprising such epitopes is known and includes, but is not limited to, antigens derived from regions c33c and c100, as well as fusion proteins including an NS3 epitope such as c25. These and other NS3 epitopes can be used in the present assays, they are known in the art and are described, for example, by Houghton et al., US Pat. No. 5,350,671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al., International Publication No. WO 93/00365; Chien, D. Y. International Publication No. WO 94/01778; and U.S. Patent Application No. 08/403590 and 08/444818.
Добавляют второе меченое антитело, против описанного выше антигена. Это антитело может быть направлено против любого эпитопа, находящегося в этом антигене. Например, это антитело может быть направлено против NS3-области, находящейся в антигене; Напротив, если упомянутый антиген экспрессируется как составной белок, второе меченое антитело может быть направлено против партнера слияния. К анализу могут быть добавлены дополнительные антигены и антитела, в особенности если твердая подложка включает в себя MEFA. Подобные анализы описаны ниже.A second labeled antibody is added against the antigen described above. This antibody can be directed against any epitope located in this antigen. For example, this antibody can be directed against the NS3 region located in the antigen; Conversely, if said antigen is expressed as a composite protein, the second labeled antibody can be directed against the fusion partner. Additional antigens and antibodies may be added to the assay, especially if the solid support includes MEFA. Similar analyzes are described below.
Иллюстративный анализ согласно изобретению изображен в фигуре 2. Как показано на фигуре, твердая подложка содержит два антикóровых моноклональных антитела, обозначенных с11-3 и c11-7. Эти антитела направлены против эпитопа, находящегося в N-концевой области коревого протеина, на аминокислотах 10-53, пронумерованных соответственно последовательности полипротеина HCV1. Твердая подложка также включает в себя эпитоп к NS3/4a. Биологический образец добавляют к твердой подложке. HCV-коровый антиген, также как и антитела, направленные против эпитопа NS3/4a, вместе присутствующие в образце, будут связывать реагенты захватывания на твердой подложке.An exemplary analysis according to the invention is depicted in Figure 2. As shown in the figure, the solid support contains two anti-core monoclonal antibodies, designated c11-3 and c11-7. These antibodies are directed against the epitope located in the N-terminal region of measles protein, on amino acids 10-53, numbered accordingly to the HCV1 polyprotein sequence. The solid support also includes an epitope for NS3 / 4a. A biological sample is added to the solid support. The HCV core antigen, as well as antibodies directed against the NS3 / 4a epitope, together present in the sample, will bind capture reagents on a solid support.
Затем добавляли меченое пероксидазой хрена (HPR) антикóровое моноклональное антитело c11-14, направленное против С-концевой области кора, занимающее аминокислотные положения 120-130, пронумерованные соответственно последовательности полипротеина HCV1. В качестве второго HPR-меченого антитела, направленного против SOD-части слитого белка, добавляют слитый белок, включающий в себя последовательность из SOD человека (hSOD) и эпитоп из области с33с. Слияние SOD-с33с свяжется с анти-NS3-антителом и анти-SOD-антителом, в свою очередь, свяжет слитый белок SOD-с33с. Обнаружение метки свидетельствует о присутствии HCV-инфекции.Then, horseradish peroxidase (HPR) -labeled c11-14 anti-core monoclonal monoclonal antibody directed against the C-terminal region of the cortex, occupying amino acid positions 120-130, numbered according to the HCV1 polyprotein sequence, was added. As a second HPR-labeled antibody directed against the SOD portion of the fusion protein, a fusion protein comprising a sequence of human SOD (hSOD) and an epitope from the c33c region is added. The fusion of SOD-c33c will bind to the anti-NS3 antibody and the anti-SOD antibody, in turn, will bind the SOD-c33c fusion protein. Label detection indicates the presence of HCV infection.
Другой иллюстративный анализ согласно изобретению изображен на фиг.8. Конфигурация анализа с использованием антител представляет собой анализ с захватом сэндвича антиген-антитело-антиген с использованием как NS3/4a, так и MEFA 12. Твердая подложка включает в себя два вышеописанных антикоровых моноклональных антитела, эпитоп к NS3/4a, также как и иллюстративные MEFA, MEFA12, которые включают в себя укороченную версию SOD человека. Как в случае вышеописанного анализа, к твердой подложке добавляют биологический образец. HCV-кбровый антиген, также как и антитела, направленные против NS3/4a-эпитопа и эпитопов MEFA, присутствующие в образце, будут связывать реагенты захватывания на твердой подложке. Добавляют два антигена, один - способный реагировать с антителами образца, которые связывают NS3/4a (как описано выше) и один - способный реагировать с антителами образца, которые связывают MEFA 12. На фигуре 8 антиген, реагирующий с комплексом MEFA 12/антитело образца, является слиянием между молекулой SOD и c22ks Δ47-L44W. Антиген c22ks происходит из коровой области и содержит аминокислоты полипротеина Lys10-Ser99, также как и присутствующую в норме делецию Аrg47 и замену Trp на Leu в положении 44. Детектируемый конъюгат антител является вторым HPR-меченым моноклональным анти-SOD-антителом, описанным выше.Another illustrative analysis according to the invention is shown in FIG. An antibody assay configuration is an antigen-antibody-antigen sandwich capture assay using both NS3 / 4a and
Вышеописанные анализы по определению комплекса антиген/антитело особенно удачны, так как и HCV-коровый антиген, и антитела к NS3/4a и/или кору могут быть обнаружены с помощью той же подложки в том же анализе. К тому же, для того чтобы покрыть другие неструктурные эпитопы HCV, в комбинированном коктейле можно использовать, как описано выше, дополнительные HCV-эпитопы, такие как SOD слитый с с100, 5-1-1, NS5-антигены, также как и белок, полученный в результате сдвига рамки считывания в коровой области полипротеина, такой как описан в Международной публикации № WO 99/63941.The above antigen / antibody complex assays described above are particularly successful since both the HCV core antigen and anti-NS3 / 4a and / or cortex antibodies can be detected using the same substrate in the same assay. In addition, in order to cover other non-structural HCV epitopes, additional HCV epitopes, such as SOD fused to c100, 5-1-1, NS5 antigens, as well as protein, can be used in a combination cocktail as described above obtained by shifting the reading frame in the core region of a polyprotein, such as described in International publication No. WO 99/63941.
Для лучшего понимания данного изобретения ниже дается более подробное обсуждение получения антител используемых в заявленных иммунологических анализах, получения полипептидов, используемых в иммунологических анализах, и способов проведения иммунологических анализов.For a better understanding of the present invention, a more detailed discussion is given below on the preparation of antibodies used in the claimed immunological assays, the preparation of polypeptides used in immunological assays, and methods for conducting immunological assays.
Получение антител для применения в HCV-иммунологических анализахObtaining antibodies for use in HCV immunological analyzes
Как показано выше, в данном анализе используются различные антитела, которые связаны с твердой подложкой (например, одно или более антикоровых антител), и таким образом обнаруживают комплексы антиген/антитело, образовавшиеся, если в образце присутствует инфекция HCV. Эти антитела могут быть поликлональными или моноклональными препаратами антител, моноспецифическими антисыворотками, антителами человека, или могут быть гибридными или химерными антителами такими, как гумманизированные антитела, измененные антитела, F(ab')2-фрагменты, F(ab)-фрагменты, Fv-фрагменты, однодоменные антитела, димерные или гримерные конструкции фрагментов антител, минитела или их функциональные фрагменты, которые связываются с рассматриваемым антигеном.As shown above, various antibodies are used in this assay that are coupled to a solid support (for example, one or more anticorrosive antibodies), and thus detect antigen / antibody complexes formed when an HCV infection is present in the sample. These antibodies may be polyclonal or monoclonal antibody preparations, monospecific antisera, human antibodies, or may be hybrid or chimeric antibodies such as humanized antibodies, altered antibodies, F (ab ') 2 fragments, F (ab) fragments, Fv- fragments, single-domain antibodies, dimeric or make-up constructions of antibody fragments, minitel or their functional fragments that bind to the antigen in question.
Антитела получают с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области и раскрытых, например, в Патентах США №4011308, 4722890, 4016043, 3876504, 3770380 и 4372745. Например, поликлональные антитела получают путем иммунизации антигеном, представляющим интерес, подходящих млекопитающих, таких как мышь, крыса, кролик, овца или коза. Для усиления иммуногенности антиген можно связать с носителем до иммунизации. Подобные носители хорошо известны специалистам в данной области. Иммунизация обычно выполняется посредством смешивания или эмульгации антигена в физиологическом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, и парентерального введения смеси или эмульсии (обычно подкожно или внутримышечно). Животное обычно подвергают вторичной инъекции антигена через 2-6 недель, одной или более инъекциями антигена в физиологическом растворе, предпочтительно используя неполный адъювант Фрейнда. Антитела можно получать также с помощью иммунизации in vitro, при помощи методов, известных в данной области. Затем от иммунизированного животного получают поликлональную антисыворотку. Для описания получения анти-HCV-поликлональных антител см., например, Houghton et al., Патент США №5350671.Antibodies are prepared using techniques well known to those skilled in the art and disclosed, for example, in US Pat. mouse, rat, rabbit, sheep or goat. To enhance immunogenicity, the antigen can be coupled to a carrier prior to immunization. Such carriers are well known to those skilled in the art. Immunization is usually carried out by mixing or emulsifying the antigen in physiological saline, preferably in an adjuvant, such as Freund's complete adjuvant, and parenterally administering the mixture or emulsion (usually subcutaneously or intramuscularly). The animal is usually subjected to secondary injection of antigen after 2-6 weeks, with one or more injections of antigen in saline, preferably using incomplete Freund's adjuvant. Antibodies can also be obtained by in vitro immunization using methods known in the art. Then, a polyclonal antiserum is obtained from the immunized animal. For a description of the preparation of anti-HCV polyclonal antibodies, see, for example, Houghton et al., US Patent No. 5350671.
Моноклональные антитела обычно получают, используя метод Колера и Мильштейна (Kohler, Milstein; 1975), Nature 256: 495-497, или его модификацию. В типичном случае мышь или крысу иммунизируют, как описано выше. Однако вместо отбора крови для выделения сыворотки, лучше извлекать селезенку (или, необязательно, несколько крупных лимфатических узлов) и разделять на отдельные клетки. Если требуется, клетки селезенки можно отсортировать (после удаления неспецифически-адгезивных клеток) путем нанесения суспензии клеток на планшет или лунку, покрытую антигеном. В-клетки, экспрессирующие специфический для данного антигена связанный с мембраной иммуноглобулин, будут связываться с планшетом и не будут смываться вместе с остатками суспензии. Оставшиеся В-клетки, или все диссоциированные клетки селезенки, затем индуцируют для слияния с клетками миеломы для образования гибридом, а затем культивируют в селективной среде (например, гипоксантине, аминоптерине, тимидиновой среде, «HAT»). Получившиеся в результате гибридомы размещают на планшете при ограниченном разбавлении и проверяют на продуцирование антител, которые специфически связываются с иммунизирующим антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Затем селективные моноклональные, секретирующие антитела гибридомы культивируют in vitro (например, в бутылях для культуры тканей или реакторах с полыми волокнами) или in vivo (например, асциты мышей).Monoclonal antibodies are usually obtained using the method of Kohler and Milstein (Kohler, Milstein; 1975), Nature 256: 495-497, or its modification. Typically, a mouse or rat is immunized as described above. However, instead of taking blood to isolate the serum, it is better to remove the spleen (or, optionally, several large lymph nodes) and separate it into separate cells. If required, spleen cells can be sorted (after removal of non-specific adhesive cells) by applying a cell suspension to a plate or well coated with antigen. B cells expressing a membrane-bound immunoglobulin specific for a given antigen will bind to the plate and will not wash off with the remainder of the suspension. The remaining B cells, or all dissociated spleen cells, are then induced to fuse with myeloma cells to form hybridomas, and then cultured in selective medium (eg, hypoxanthine, aminopterin, thymidine medium, “HAT”). The resulting hybridomas are placed on the plate with limited dilution and tested for the production of antibodies that specifically bind to the immunizing antigen (and which do not bind to extraneous antigens). Then, selective monoclonal, antibody-secreting hybridomas are cultured in vitro (for example, in tissue culture bottles or hollow fiber reactors) or in vivo (for example, mouse ascites).
Получение различных анти-HCV-моноклональных антител описано, например, у Houghton et al. Патент США №5350671, Chien et al. Международная публикация № WO 93/00365, Патентная заявка США с одним правопреемником №08/403590 и 08/444818 и Kashiwakuma et al. Патент США №5871904.The preparation of various anti-HCV monoclonal antibodies is described, for example, by Houghton et al. U.S. Patent No. 5,350,671 to Chien et al. International Publication No. WO 93/00365, US Patent Application with One Assignee No. 08/403590 and 08/444818 and Kashiwakuma et al. U.S. Patent No. 5,871,904.
Как показано выше, фрагменты антител, которые сохраняют способность распознавать представляющий интерес антиген, также найдут применение в заявленных иммунологических анализах. В данной области известен целый ряд фрагментов антител, которые содержат антиген-связывающие сайты, способные проявлять иммунологические связывающие свойства целой молекулы антитела. Например, можно получать функциональные фрагменты антител путем расщепления константных областей молекулы антитела, не ответственных за связывание с антигеном, с помощью, например, пепсина, чтобы получить F (ab')2-фрагменты. Эти фрагменты будут включать в себя два антиген-связывающих сайта, но в них будет отсутствовать часть константной области из каждой из тяжелых цепей. Также, если необходимо, Fab-фрагменты, включающие в себя единственный антиген-связывающий сайт, можно получать, например, путем переваривания поликлональных или моноклональных антител папаином. Функциональные фрагменты, содержащие только вариабельные области тяжелых и легких цепей, можно также получать с помощью стандартных методик, таких как получение рекомбинантов или избирательное. протеолитическое расщепление молекул иммуноглобулина. Эти фрагменты известны как Fv. Например, см. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Blochem 15:2706-2710; and Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096.As shown above, antibody fragments that retain the ability to recognize an antigen of interest will also find use in the claimed immunological assays. A variety of antibody fragments are known in the art that contain antigen binding sites capable of exhibiting immunological binding properties of an entire antibody molecule. For example, it is possible to obtain functional antibody fragments by cleaving the constant regions of the antibody molecule that are not responsible for binding to the antigen using, for example, pepsin to obtain F (ab ') 2 fragments. These fragments will include two antigen-binding sites, but they will lack a part of the constant region from each of the heavy chains. Also, if necessary, Fab fragments comprising a single antigen binding site can be obtained, for example, by digesting polyclonal or monoclonal antibodies with papain. Functional fragments containing only the variable regions of the heavy and light chains can also be obtained using standard techniques, such as obtaining recombinants or selective. proteolytic cleavage of immunoglobulin molecules. These fragments are known as Fv. For example, see Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad Sci. USA 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Blochem 15: 2706-2710; and Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096.
Одноцепочечный полипептид. Fv ("sFv", или "scFv") ковалентно связывается с VH-VL-гетеродимером, который экспрессируется слитым геном, включающим в себя VH- и VL-кодирующие гены, связанные пептид-кодирующим линкером. Huston et al., Proc. Nat. Acad. Scl. USA 85:5879-5883. Описано некоторое число методов различения и усовершенствования химических структур (линкеров), превращающих естественно агрегированные, но химически отдельные тяжелые и легкие цепи из области V-антитела, в sFv-молекулу, которая складывается в трехмерную структуру, весьма сходную со структурой антиген-сзязывающего сайта. Например, см. Патент США №5091513, 5132405 и 4946778. Молекулы sFv можно получать, используя методики, описанные в данной области. Например, см. Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Патент США №5091513, 5132405 и 4946778. Критерии дизайна включают в себя определение соответствующей длины, занимающей расстояние между С-концом одной цепи и N-концом другой, где линкер обычно образован небольшим гидрофильным аминокислотным остатком, который не имеет тенденции к скручиванию или образованию вторичных структур. Эти методы описаны в данной области. Например, см. Патент США №5091513, 5132405 и 4946778. Подходящие линкеры обычно содержат полипептидные цепи из перемежающихся групп остатков глицина и серина и могут включать в себя вставки остатков глутаминовой кислоты и лизина для увеличения растворимости.Single chain polypeptide. Fv ("sFv", or "scFv") covalently binds to a V H -V L heterodimer, which is expressed by a fusion gene including V H and V L coding genes linked by a peptide-coding linker. Huston et al., Proc. Nat. Acad Scl. USA 85: 5879-5883. A number of methods have been described for distinguishing and improving chemical structures (linkers) that convert naturally aggregated, but chemically separate heavy and light chains from the V-antibody region into an sFv molecule, which folds into a three-dimensional structure, very similar to the structure of the antigen-binding site. For example, see US Patent No. 5091513, 5132405 and 4946778. sFv molecules can be obtained using the techniques described in this field. For example, see Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad Sci. USA 85: 5879-5883; US patent No. 5091513, 5132405 and 4946778. Design criteria include determining the appropriate length, occupying the distance between the C-end of one chain and the N-end of the other, where the linker is usually formed by a small hydrophilic amino acid residue that does not tend to twist or form secondary structures. These methods are described in the art. For example, see US Patent Nos. 5091513, 5132405 and 4946778. Suitable linkers typically contain polypeptide chains from interleaved groups of glycine and serine residues and may include insertions of glutamic acid and lysine residues to increase solubility.
«Мини-антитела», или «мини-тела» также найдут применение в настоящем изобретении. Мини-тела являются цепями sFv-полипептида, которые включают в себя олигомеризованные домены на своем С-конце, отделенные от sFv областью петли. Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584. Олигомеризация домена включает в себя самоассоциирующиеся α-спирали, например, лейциновые «молнии», которые в дальнейшем могут быть стабилизированы дополнительными дисульфидными связями. Олигомеризованный домен должен быть совместимым с векторной упаковкой поперек мембраны - процессом, призванным содействовать пространственной упаковке полипептида in vivo в функциональный связывающий белок. Обычно минитела получают, используя методы рекомбинации, хорошо известные в данной области. Например, Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126."Mini-antibodies", or "mini-bodies" will also find use in the present invention. Mini-bodies are sFv polypeptide chains that include oligomerized domains at their C-terminus, separated from the sFv region of the loop. Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584. The oligomerization of a domain includes self-associating α-helices, for example, leucine zippers, which can be further stabilized by additional disulfide bonds. The oligomerized domain must be compatible with vector packaging across the membrane — a process designed to facilitate spatial packaging of the polypeptide in vivo into a functional binding protein. Usually minutel obtained using recombination methods well known in this field. For example, Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B: 120-126.
Продуцирование антигенов для применения в иммунологических анализах HCVAntigen production for use in HCV immunological assays
Как показано выше, молекулы согласно изобретению обычно получают с помощью рекомбинации. Так, полинуклеотиды, кодирующие антигены HCV, для использования в данном изобретении можно получать, используя стандартные методики молекулярной биологии. Например, полинуклеотидную последовательность, кодирующую описанные выше молекулы, можно получить, используя методы рекомбинации, такие как скрининг циклической ДНК и библиотек генов из клеток, экспреозирующих данный ген, или извлечение гена из вектора, который заведомо его содержит. Более того, желаемый ген можно выделять непосредственно из молекул нуклеиновой кислоты вируса, используя методики, известные в данной области, такие как Houghton et al. Патент США №5350671. Ген, представляющий интерес, лучше синтезировать, чем клонировать. Можно построить молекулы с соответствующим кодоном для конкретной последовательности. Затем полную последовательность собирают из перекрывающихся олигонуклеотидов, приготовленных по стандартной методике и собранных в полную кодирующую последовательность. Например, см. Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; and Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.As shown above, the molecules of the invention are usually prepared by recombination. Thus, polynucleotides encoding HCV antigens for use in this invention can be obtained using standard molecular biology techniques. For example, a polynucleotide sequence encoding the molecules described above can be obtained using recombination techniques, such as screening for cyclic DNA and gene libraries from cells expressing a given gene, or extracting a gene from a vector that contains it. Moreover, the desired gene can be isolated directly from virus nucleic acid molecules using techniques known in the art, such as Houghton et al. U.S. Patent No. 5,350,671. The gene of interest is better synthesized than cloned. You can build molecules with the appropriate codon for a specific sequence. Then, the complete sequence is assembled from overlapping oligonucleotides prepared according to standard procedures and assembled into a complete coding sequence. For example, see Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; and Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311.
Таким образом, конкретные нуклеотидные последовательности можно получать из векторов, содержащих требуемые последовательности, или синтезировать, полностью или частично, используя, когда целесообразно, различные способы синтеза олигонуклеотидов, известные в данной области, такие как сайт-специфический мутагенез и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Например, см. Sambrook, выше. В частности, существует один метод получения нуклеотидной последовательности, кодирующей требуемую последовательность при помощи отжига комплементарных наборов перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, полученных в стандартном автоматическом полинуклеотидном синтезаторе, с последующим лигированием соответствующей ДНК-лигазой и амплификацией лигированной нуклеотидной последовательности с помощью ПЦР. Например, см. Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. Кроме того, в рамках изобретения можно использовать прямой олигонуклеотидный синтез (Jones et al. (1986) Nature 54:75-82), нуклеотид-направленный мутагенез предсуществующих нуклеотидных областей (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 and Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), и ферментативное заполнение брешей в олигонуклеотидах при помощи ДНК-полимеразы Т4 (Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) для получения молекул, обладающих измененными или усиленными антиген-связывающими свойствами и/или сниженной иммуногенностью.Thus, specific nucleotide sequences can be obtained from vectors containing the desired sequences, or synthesized, in whole or in part, using, when appropriate, various oligonucleotide synthesis methods known in the art, such as site-specific mutagenesis and polymerase chain reaction (PCR) . For example, see Sambrook, above. In particular, there is one method for obtaining the nucleotide sequence encoding the desired sequence by annealing complementary sets of overlapping synthetic oligonucleotides obtained in a standard automatic polynucleotide synthesizer, followed by ligation with the appropriate DNA ligase and amplification of the ligated nucleotide sequence using PCR. For example, see Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4084-4088. In addition, direct oligonucleotide synthesis (Jones et al. (1986) Nature 54: 75-82), nucleotide-directed mutagenesis of preexisting nucleotide regions (Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327 and Verhoeyen can be used within the scope of the invention. et al. (1988) Science 239: 1534-1536), and enzymatic filling of gaps in oligonucleotides using T4 DNA polymerase (Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033) for obtaining molecules having altered or enhanced antigen-binding properties and / or reduced immunogenicity.
Когда кодирующие последовательности получены или выделены, такие последовательности можно клонировать в подходящий вектор или репликон. Специалистам в данной области известны многочисленные клонирующие векторы, и подбор подходящего клонирующего вектора - это вопрос выбора. Подходящие векторы включают в себя, не ограничиваясь ими, плазмиды, фаги, транспозоны, космиды, вирусные хромосомы, способные к репликации, в ассоциации с подходящими контрольными элементами.When coding sequences are obtained or isolated, such sequences can be cloned into a suitable vector or replicon. Numerous cloning vectors are known to those skilled in the art, and the selection of a suitable cloning vector is a matter of choice. Suitable vectors include, but are not limited to, plasmids, phages, transposons, cosmids, viral chromosomes capable of replication, in association with suitable control elements.
Затем кодирующая последовательность помещается под контроль подходящих контрольных элементов, в зависимости от системы, используемой для экспрессии. Так, кодирующая последовательность может быть помещена под контроль промотора, области связывания с рибосомами (для бактериальной экспрессии) и, необязательно, оператора, так, чтобы последовательность ДНК, представляющая интерес, транскрибировалась в РНК подходящим трансформантом. Кодирующая последовательность может содержать (а может и не содержать) сигнальные пептиды или лидерные последовательности, которые затем могут быть удалены хозяином в посттрансляционном процессинге. Например, см. Патенты США №4431739, 4425437 и 4338397.The coding sequence is then placed under the control of suitable control elements, depending on the system used for expression. Thus, the coding sequence can be placed under the control of the promoter, the binding region to the ribosomes (for bacterial expression) and, optionally, the operator, so that the DNA sequence of interest is transcribed into the RNA by a suitable transformant. The coding sequence may or may not contain signal peptides or leader sequences, which can then be removed by the host in post-translational processing. For example, see U.S. Patent Nos. 4,431,739, 4,425,437 and 4,338,397.
В дополнение к управляющим последовательностям желательно добавить регуляторные последовательности, которые позволяют регулировать экспрессию последовательностей в соответствии с ростом клетки-хозяина. Регуляторные последовательности известны специалистам в данной области, и в числе их примеров - такие, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на физические или химические стимулы, включая присутствие регуляторного соединения. Другие типы регуляторных элементов также могут присутствовать в этом векторе. Например, в нем можно использовать энхансерные элементы для увеличения уровней экспрессии конструкций. Примеры включают в себя ранний ген энхансер SV40 (Dijkema et al., (1985) EMBO J. 4:761), энхансер/промотор, полученный из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (German et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777), и элементы, полученные из CMV человека (Boshart et al. (1985) Cell 41:521), такие как элементы, входящие в А-последовательность CMV-интрона (Патент США №5688688). Кассета экспрессии может дополнительно содержать точку начала репликации для автономной репликации в подходящей клетке-хозяине, один или более выбираемых маркеров, один или более сайтов рестрикции, потенциал для большого числа копий и сильный промотор.In addition to the control sequences, it is desirable to add regulatory sequences that allow the expression of the sequences to be regulated in accordance with the growth of the host cell. Regulatory sequences are known to those skilled in the art, and among their examples are those that cause the expression of a gene to be turned on or off in response to physical or chemical stimuli, including the presence of a regulatory compound. Other types of regulatory elements may also be present in this vector. For example, enhancer elements can be used to increase expression levels of constructs. Examples include the SV40 early enhancer gene (Dijkema et al., (1985) EMBO J. 4: 761), an enhancer / promoter derived from the long terminal repeat (LTR) of Routh sarcoma virus (German et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777), and elements derived from human CMV (Boshart et al. (1985) Cell 41: 521), such as those entering the A-sequence of a CMV intron (US Patent No. 5,688,688). ) The expression cassette may further comprise an origin of replication for autonomous replication in a suitable host cell, one or more selectable markers, one or more restriction sites, potential for a large number of copies, and a strong promoter.
Экспрессирующий вектор сконструирован так, чтобы конкретная кодирующая последовательность была расположена в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями, и расположение и ориентация кодирующей последовательности относительно управляющих последовательностей было таким, чтобы кодирующая последовательность транскрибировалась под «контролем» управляющих последовательностей (т.е. РНК-полимераза, которая связывается с молекулой ДНК у контрольных последовательностей, транскрибирует кодирующую последовательность). Для достижения этого результата может потребоваться модификация последовательности, кодирующей молекулу, представляющую интерес. Например, в ряде случаев может быть необходимо модифицировать эту последовательность так, чтобы она могла прикрепляться к управляющей последовательности, имея соответствующую ориентациию, т.е. сохраняя рамку считывания. Управляющие последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью до вставки в вектор. Либо кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в вектор экспрессии, который уже содержит управляющие последовательности и соответствующий сайт рестрикции.The expression vector is designed so that a particular coding sequence is located in the vector along with the corresponding regulatory sequences, and the location and orientation of the coding sequence relative to the control sequences is such that the coding sequence is transcribed under the “control” of the control sequences (i.e., RNA polymerase, which binds to the DNA molecule in the control sequences, transcribes the coding sequence Nost). To achieve this result, it may be necessary to modify the sequence encoding the molecule of interest. For example, in some cases it may be necessary to modify this sequence so that it can be attached to the control sequence with the corresponding orientation, i.e. keeping the reading frame. Control sequences and other regulatory sequences may be ligated to the coding sequence prior to insertion into the vector. Or, the coding sequence can be cloned directly into an expression vector that already contains the control sequences and the corresponding restriction site.
Как показано выше, может быть также желательным получение мутантов или аналогов антигена, представляющего интерес. Это особенно справедливо в случае NS3/4a. Методы осуществления этого описаны, например, в Dasmahapatra et al. Патент США №5843752, и Zhang et al., Патент США №5990276. Мутанты или аналоги этого или другого белков HCV для применения в заявленных анализах могут быть получены путем делеции части последовательности, кодирующей интересующий полипептид, вставки последовательности и/или замены одного или более нуклеотидов в данной последовательности. Методики модификации нуклеотидных последовательностей, такие как сайт-направленный мутагенез, и т.п., хорошо известны специалистам в данной области. Например, см. Sambrook et al., supra; Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. (1987) BioTechnlques 5:786; Zoller and Smith (1983) Methods Enzyiaol. 100:468; Dalbie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:6409.As shown above, it may also be desirable to obtain mutants or analogs of an antigen of interest. This is especially true in the case of NS3 / 4a. Methods for implementing this are described, for example, in Dasmahapatra et al. U.S. Patent No. 5,843,752, and Zhang et al., U.S. Patent No. 5,990,276. Mutants or analogues of this or other HCV proteins for use in the claimed assays can be obtained by deletion of a portion of a sequence encoding a polypeptide of interest, insertion of a sequence, and / or substitution of one or more nucleotides in a given sequence. Techniques for modifying nucleotide sequences, such as site-directed mutagenesis, and the like, are well known to those skilled in the art. For example, see Sambrook et al., Supra; Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 448; Geisselsoder et al. (1987) BioTechnlques 5: 786; Zoller and Smith (1983) Methods Enzyiaol. 100: 468; Dalbie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 6409.
Молекулы могут быть экспрессированы в самых разнообразных системах, включая системы экспрессии насекомых, млекопитающих, бактерий, вирусов и дрожжей, также известные в данной области.Molecules can be expressed in a wide variety of systems, including the expression systems of insects, mammals, bacteria, viruses and yeast, also known in this field.
Например, системы экспрессии клетки насекомого, такие как бакуловирусные системы, известны специалистам в данной области и описаны, например, Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Материалы и методы в виде набора для экспрессионной системы бакуловирус/клетка насекомого доступны для приобретения, кроме прочего, в Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния (набор «МахВас»). Также системы экспрессии на основе бактериальных клеток и клеток млекопитающего хорошо известны в данной области и описаны, например, в Sambrook et al., выше. Дрожжевые системы экспрессии также известны в данной области и описаны, например, в Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, London.For example, insect cell expression systems, such as baculovirus systems, are known to those skilled in the art and are described, for example, by Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materials and methods in the form of a kit for the baculovirus / insect cell expression system are commercially available from, but not limited to, Invitrogen, San Diego, California (MachVas kit). Also, expression systems based on bacterial and mammalian cells are well known in the art and are described, for example, in Sambrook et al., Supra. Yeast expression systems are also known in the art and are described, for example, in Yeast Genetic Engineering (Barr et al., Eds., 1989) Butterworths, London.
Число подходящих клеток-хозяев для применения в упомянутых системах также известно. Например, клеточные линии млекопитающих известны в данной области и включают в себя иммортализованные клеточные линии, доступные в Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими; клетки яичников Китайского хомяка (СНО), клетки HeLa, клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки почки человеческого эмбриона, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер G2), клетки Медин-Дерби (Madin-Darby) бычьей почки ("MDBK"), а также и другие. Также бактериальные хозяева, такие как Е.Coli, Bacillis subtilis и Streptococcus spp., найдут применение в настоящих экспрессирующих конструкциях. Хозяева-дрожжи, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают в себя, кроме прочих, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces. lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и Yarroma lipolytica. Клетки насекомых, используемые в бакуловирусных экспрессирующих векторах, включают в себя, кроме прочего, Aedes aegypti, Autographs californica, Bombyx mori, Drosophila melanoqaster, Spodoptera frugiperda, и Trichoplusiani.The number of suitable host cells for use in these systems is also known. For example, mammalian cell lines are known in the art and include immortalized cell lines available from the American Type Culture Collection (ATCC), including, but not limited to; Chinese hamster ovary cells (CHO), HeLa cells, hamster baby kidney cells (WOC), monkey kidney cells (COS), human embryo kidney cells, human hepatocellular carcinoma cells (e.g., Hep G2), Madin-Darby cells ) bovine kidney ("MDBK"), as well as others. Also, bacterial hosts such as E. Coli, Bacillis subtilis and Streptococcus spp. Will find use in the present expression constructs. Yeast hosts that can be used in the present invention include, but are not limited to, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces. lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe and Yarroma lipolytica. Insect cells used in baculovirus expression vectors include, but are not limited to, Aedes aegypti, Autographs californica, Bombyx mori, Drosophila melanoqaster, Spodoptera frugiperda, and Trichoplusiani.
Молекулы нуклеиновой кислоты, включающие в себя нуклеотидные последовательности, представляющие интерес, могут быть устойчиво интегрированы в геном клетки-хозяина или сохраняться в стабильном эписомном элементе в подходящей клетке-хозяине, с помощью разнообразных методик доставки гена, хорошо известных в данной области. Например, см. Патент США №5399346.Nucleic acid molecules including nucleotide sequences of interest can be stably integrated into the genome of the host cell or stored in a stable episomal element in a suitable host cell using a variety of gene delivery techniques well known in the art. For example, see US Patent No. 5399346.
В зависимости от системы экспрессии и выбранного хозяина, при росте клеток, трансформированных описанным выше экспрессирующим вектором, получают молекулы в условиях, при которых экспрессируется белок. Затем экспрессированный белок выделяют из клеток-хозяев и очищают. Если системы экспрессии секретирует белок в среду для выращивания, продукт очищают прямо из этой среды. Если секреции не происходит, продукт можно выделить из клеточных лизатов. Подбор подходящих условий выращивания и способов восстановления находится в пределах квалификации специалистов в данной области.Depending on the expression system and the selected host, during the growth of cells transformed with the expression vector described above, molecules are obtained under the conditions under which the protein is expressed. The expressed protein is then isolated from the host cells and purified. If expression systems secrete the protein into the growth medium, the product is purified directly from this medium. If secretion does not occur, the product can be isolated from cell lysates. The selection of suitable growing conditions and recovery methods is within the qualifications of specialists in this field.
Описано получение разнообразных HCV-антигенов при помощи рекомбинации. Например, см. Houghton et al., Патент США №5350671, Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993). 8:S33-39; Chien et al. Международная публикация № WO 93/00365, Chien, D.Y., Международная публикация № WO 94/01778.The preparation of a variety of HCV antigens by recombination has been described. For example, see Houghton et al., US Patent No. 5350671, Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993). 8: S33-39; Chien et al. International Publication No. WO 93/00365, Chien, D.Y., International Publication No. WO 94/01778.
Иммунодиагностические анализыImmunodiagnostic tests
Сразу после получения упомянутые антикоровые антитела и NS3/4a-антигены помещают на соответствующую твердую подложку для использования в заявленных иммуноанализах. Твердая подложка для целей согласно изобретению может быть любым материалом, который может являться нерастворимой основой с жесткой или полужесткой поверхностью. Типичная твердая подложка включает в себя, не ограничиваясь ими, такие субстраты как нитроцеллюлоза (например, в форме мембраны или лунки для микротитрования), полихлорвинил (например, в форме листов или лунок для микротитрования), полистирольный латекс (например, в форме шариков или планшет для микротитрования), поливинилидинфторид, диазотированная бумага, нейлоновые мембраны, активированные шарики, шарики для магнитных мешалок и т.п. Частные случаи подложек включают в себя планшеты, гранулы, диски, капилляры, полые волокна, булавки, иглы, сплошные волокна, целлюлозные шарики, пористые стеклянные шарики, силикагели, полистироловые шарики, необязательно поперечносшитые с дивинилбензолом, шарики из привитого сополимера, полиакриламидные шарики, латексные шарики, диметилакриламидные шарики, необязательно поперечносшитые с N-N'-бис-акрилоилэтилендиамином, и стеклянные частицы, покрытые гидрофобным полимером.Immediately after receipt, the aforementioned anticorrosive antibodies and NS3 / 4a antigens are placed on an appropriate solid support for use in the claimed immunoassays. The solid support for the purposes of the invention may be any material that may be an insoluble base with a rigid or semi-rigid surface. A typical solid support includes, but is not limited to, substrates such as nitrocellulose (e.g., in the form of a membrane or microtiter wells), polyvinyl chloride (e.g., in the form of sheets or microtiter wells), polystyrene latex (e.g., in the form of balls or a tablet) for microtiter), polyvinylidine fluoride, diazotized paper, nylon membranes, activated balls, balls for magnetic stirrers, etc. Particular cases of substrates include tablets, granules, discs, capillaries, hollow fibers, pins, needles, solid fibers, cellulose balls, porous glass beads, silica gels, polystyrene beads, optionally crosslinked with divinylbenzene, grafted copolymer beads, polyacrylamide beads, dimethylacrylamide beads, optionally crosslinked with N-N'-bis-acryloylethylenediamine, and glass particles coated with a hydrophobic polymer.
При желании, молекулам, добавленным к твердой подложке, может быть легко придана функция образования стироловых или акрилатных фрагментов, таким образом создается возможность встраивания молекул в полистирол, полиакрилат и другие полимеры, такие как полиимид, полиакриламид, полиэтилен, поливинил, полидиацетилен, полифенилен-винилен, полипептид, полисахарид, полисульфон, полипиррол, полиимидазол, политиофен, полиэфир, эпоксидные смолы, кварцевое стекло, силикагель, силоксан, полифосфат, гидрогель, агароза, целлюлоза и т.п.If desired, the molecules added to the solid support can be easily given the function of forming styrene or acrylate moieties, thus making it possible to incorporate the molecules into polystyrene, polyacrylate and other polymers such as polyimide, polyacrylamide, polyethylene, polyvinyl, polydiacetylene, polyphenylene-vinylene , polypeptide, polysaccharide, polysulfone, polypyrrole, polyimidazole, polythiophene, polyester, epoxy resins, silica glass, silica gel, siloxane, polyphosphate, hydrogel, agarose, cellulose and the like.
В этом контексте, твердая подложка вначале реагирует с HCV-антикоровыми антителами и NS3/4a-эпитопом (вместе называемые здесь «твердофазными компонентами») и, необязательно, с одним или более MEFA, при подходящих условиях сшивки, при которых молекулы в достаточной степени иммобилизированы на подложке. Иногда иммобилизация на подложке может быть усилена первой связью антигена и/или антитела с белком, обладающим лучшими свойствами твердофазного связывания. Подходящие связывающие белки включают в себя, не ограничивася ими, такие макромолекулы как сывороточные альбумины, включая бычий сывороточный альбумин (BSA), гемоцианин морского блюдечка, молекулы иммуноглобулина, тироглобулин, яичный альбумин и другие белки, хорошо известные специалистам в данной области. Другие реагенты, которые можно использовать для связывания молекул с подложкой, включают в себя полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры и т.п. Такие молекулы и методы связывания этих молекул с антигенами хорошо известны специалистам в данной области. Например, см. Brinkley, М.А. (1992) Blo conjugate Chem. 3:2-13; Hashida et al. (1984) J. Appi. Biochem. 6:56-63; и Anjaneyulu and Staros (1987) International J. of Peptide and. Protein Res. 30:117-124.In this context, the solid support first reacts with HCV anticorrosive antibodies and the NS3 / 4a epitope (collectively referred to as “solid phase components”) and, optionally, with one or more MEFA, under suitable crosslinking conditions under which the molecules are sufficiently immobilized on the backing. Sometimes immobilization on a substrate can be enhanced by the first bond of the antigen and / or antibody to a protein having better solid-state binding properties. Suitable binding proteins include, but are not limited to, macromolecules such as serum albumin, including bovine serum albumin (BSA), saucer hemocyanin, immunoglobulin molecules, thyroglobulin, egg albumin and other proteins well known to those skilled in the art. Other reagents that can be used to couple molecules to a support include polysaccharides, polylactic acids, polyglycolic acids, polymeric amino acids, amino acid copolymers, and the like. Such molecules and methods for binding these molecules to antigens are well known to those skilled in the art. For example, see Brinkley, M.A. (1992) Blo conjugate Chem. 3: 2-13; Hashida et al. (1984) J. Appi. Biochem. 6: 56-63; and Anjaneyulu and Staros (1987) International J. of Peptide and. Protein Res. 30: 117-124.
После взаимодействия твердой подложки с твердофазными компонентами все неиммобилизированные твердофазные компоненты удаляют с подложки промыванием, и затем компоненты, связанные с подложкой, вступают в контакт с биологическим образцом, подозреваемым в наличии антител или антигенов HCV (вместе называемых здесь «лигандными молекулами») в подходящих для связывания условиях. После промывки для удаления всех несвязанных лигандных молекул в подходящих для связывания условиях добавляют второе антикоровое антитело, направленное против эпитопа, отличного от антикорового антитела, связанного с подложкой. Добавленное антикоровое антитело включает в себя обнаруживаемую метку, как описано выше, и связывает любой антикоровый антиген, который может присутствовать в образце, который прореагировал с антикоровым антителом, связанным с подложкой. Также добавляют один или более антигенов, которые могут реагировать с присутствующими в образце антителами, которые, в свою очередь, прореагировали с NS3/4a-эпитопом. Как объяснялось выше, этот антиген обычно получают из NS3-области HCV-полипротеина и, в частности, из с33с-области HCV. Данная область и полученные из нее эпитопы описаны у Houghton et al. Для описания этой области и полученных из нее эпитопов см. Патент США №5350671; Chien et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (1989) 89:10011-10015; Международная публикация № WO 93/00365 и Патентная заявка США с одним правопреемником №08/403590 и 08/444818. Также добавляют меченое антитело, направленное против этого антигена. Антитело затем связывается с антигеном, который прореагировал с анти-NS3-антителами, находящимися а образце. Эпитоп с33с можно легко получить для этой цели как слияние между с33с и супероксиддисмутазой человека (hSOD), полученное с помощью рекомбинации, например, по методике, описанной у Hough-ton et al.. Патент США №5350671. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности SOD человека известны и опубликованы в Haliewell et al., Патент США №5710033. Поэтому меченое антитело, направленное против SOD человека, может быть использовано для обнаружения присутствия комплексов, образованных между NS3/4а-эпитопом, любыми антителами в образце, которые реагируют с этим эпитопом, и HCV-полипептидами, которые, в свою очередь, связываются с этим антителом в образце.After the solid support interacts with the solid phase components, all non-immobilized solid phase components are removed from the substrate by washing, and then the components associated with the substrate come into contact with a biological sample suspected of having HCV antibodies or antigens (collectively referred to herein as “ligand molecules”) in suitable for binding conditions. After washing to remove all unbound ligand molecules under suitable binding conditions, a second anticorrosive antibody is added directed against an epitope other than the anticorrosive antibody bound to the support. The added anti-cortical antibody includes a detectable label as described above and binds to any anti-cortical antigen that may be present in a sample that has reacted with the anti-cortical antibody bound to the support. One or more antigens are also added that can react with antibodies present in the sample, which in turn have reacted with the NS3 / 4a epitope. As explained above, this antigen is usually obtained from the NS3 region of the HCV polyprotein and, in particular, from the c33c region of HCV. This region and the epitopes derived from it are described by Houghton et al. For a description of this region and the epitopes derived from it, see US Patent No. 5,350,671; Chien et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (1989) 89: 10011-10015; International Publication No. WO 93/00365 and US Patent Application with One Assignee No. 08/403590 and 08/444818. A labeled antibody directed against this antigen is also added. The antibody then binds to an antigen that has reacted with the anti-NS3 antibodies found in the sample. The c33c epitope can easily be obtained for this purpose as a fusion between c33c and human superoxide dismutase (hSOD), obtained by recombination, for example, according to the method described by Houghton et al .. US Patent No. 5350671. The nucleotide and amino acid sequences of human SOD are known and published in Haliewell et al., US Patent No. 5710033. Therefore, a labeled antibody directed against human SOD can be used to detect the presence of complexes formed between the NS3 / 4a epitope, any antibodies in the sample that react with this epitope, and HCV polypeptides, which in turn bind to this antibody in the sample.
Если MEFA присутствует на твердой подложке, в анализ можно также добавить один или более дополнительных антигенов, которые реагируют с антителами из биологического образца, связанными с антигенами, представленными в MEFA. Особенно полезен в этом контексте антиген, полученный из коровой области HCV, и, в частности, из антигена с22, который включает в себя 119 N-концевых кóровых аминокислот полипротеина HCV. Таким антигеном, полученным из с22, является c22ks Δ47-L44W, который включает в себя аминокислоты полипротеина Lys10-Ser99, также как и в норме присутствующую делецию Аrg47 и замену Trp на Leu в положении 44. Как и с описанном выше эпитопом с33с, этот антиген можно получить как слияние с hSOD, и то же самое меченое антитело, направленное против SOD человека, можно использовать для обнаружения наличия комплексов, образованных между антителами, присутствующими в образце, и NS3/4а-эпитопом и/или MEFA, чьи комплексы также связаны с HCV-антигенами (например, с33с и с22).If MEFA is present on a solid support, one or more additional antigens that react with antibodies from a biological sample associated with the antigens presented in MEFA can also be added to the analysis. Particularly useful in this context is an antigen derived from the core region of HCV, and in particular, from c22 antigen, which includes 119 N-terminal core amino acids of HCV polyprotein. Such an antigen derived from c22 is c22ks Δ47-L44W, which includes the amino acids Lys 10 -Ser 99 polyprotein, as well as the normally present deletion of Arg47 and the replacement of Trp by Leu at position 44. As with the epitope c33c described above, this antigen can be obtained by fusion with hSOD, and the same labeled antibody directed against human SOD can be used to detect the presence of complexes formed between the antibodies present in the sample and the NS3 / 4a epitope and / or MEFA, whose complexes also associated with HCV antigens (e.g., c33c and c22).
В частности, можно использовать метод ELISA, в котором лунки планшета для микротитрования покрыты твердофазными компонентами. Затем в покрытые лунки добавляют биологический образец, который содержит или предположительно содержит лигандные молекулы. После периода инкубации, достаточного для того, чтобы лигандные молекулы связались с иммобилизированными твердофазными компонентами, планшет (планшеты) можно промыть для удаления несвязавшихся фрагментов и добавить вторично связывющую молекулу с обнаруживаемой меткой (меченое антикоровое антитело), NS3-эпитоп-содержащую молекулу и антитело, направленное против NS3-эпитопсодержащей молекулы. Этим молекулам дается время прореагировать с любым захваченным антигеном и антителом из образца, планшет промывают, и определяют присутствие меченых антител с помощью методики, хорошо известной в данной области.In particular, an ELISA method can be used in which the wells of a microtiter plate are coated with solid phase components. A biological sample is then added to the coated wells, which contains or presumably contains ligand molecules. After an incubation period sufficient to allow the ligand molecules to bind to the immobilized solid phase components, the plate (s) can be washed to remove unbound fragments and a second binding molecule with a detectable label (labeled anticorrosive antibody), an NS3-epitope-containing molecule and an antibody directed against an NS3-epitope-containing molecule. These molecules are given time to react with any trapped antigen and antibody from the sample, the plate is washed, and the presence of labeled antibodies is determined using a technique well known in the art.
Реагенты для - анализа, описанные выше, включая твердую подложку для иммунологического анализа с антителами и антигенами, также как и антитела и антигены для реакции с захваченным образцом, могут поставляться в виде наборов, с соответствующей инструкцией и другими необходимыми реагентами, для проведения иммуноанализа, как было описано выше. В зависимости от конкретного иммуноанализа набор может содержать соответствующие метки и другие упакованные реагенты и материалы (например, промывочный буфер и т.п.). С помощью этих наборов можно проводить описанные выше стандартные иммунологические анализы.The reagents for the analysis described above, including a solid support for immunological analysis with antibodies and antigens, as well as antibodies and antigens for reaction with the captured sample, can be supplied in the form of kits, with appropriate instructions and other necessary reagents, for immunoassay, as was described above. Depending on the specific immunoassay, the kit may contain appropriate labels and other packaged reagents and materials (e.g., wash buffer, etc.). Using these kits, the standard immunological assays described above can be performed.
III. Экспериментальная частьIII. experimental part
Ниже даны примеры специфических вариантов осуществления настоящего изобретения. Данные примеры предлагаются только для иллюстративных целей и не преследуют задачу ограничить рамки настоящего изобретения каким-либо образом.The following are examples of specific embodiments of the present invention. These examples are offered for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.
Были предприняты определенные усилия, чтобы гарантировать точность в отношении использованных цифр (например, количества, температуры и т.п.), но необходимо учесть возможность некоторых экспериментальных ошибок и отклонений.Some efforts have been made to ensure accuracy with respect to the numbers used (e.g., quantity, temperature, etc.), but it is necessary to take into account the possibility of some experimental errors and deviations.
ПРИМЕР 1EXAMPLE 1
Иммунологический анализ образования комплекса HCV-антиген/антитело.Immunological analysis of the formation of the complex HCV-antigen / antibody.
Настоящий иммунологический анализ образования комплекса HCV-антиген/антитело сравнивали с другими HCV-анализами, чтобы протестировать пределы выявления сероконверсии и сравнить эти пределы с таковыми, полученными в других доступных для приобретения анализах, как следует ниже.The present immunological analysis of the formation of the HCV-antigen / antibody complex was compared with other HCV assays to test the detection limits of seroconversion and compare these limits with those obtained in other commercially available assays, as follows.
А. Материалы и методыA. Materials and methods
Образцы крови: Использовали выборки образцов доступной для приобретения человеческой крови. Эти выборки образцов доступны, например, в Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI); Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP); и North American Biologies, Inc., BocoRatan, FL (NABI). Дни, показанные в таблицах 5 и 6, означают дни, когда кровь отбирали у доноров.Blood Samples: A sample of available human blood samples was used. These sample samples are available, for example, from Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI); Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP); and North American Biologies, Inc., BocoRatan, FL (NABI). The days shown in tables 5 and 6 indicate the days when blood was taken from donors.
Моноклональные антитела: Моноклональные антитела с11-3, с11-7 и c11-14 были получены в Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey. Антитела с11-3 и с11-7 направлены против N-концевой части кора (аминокислоты 10-53, пронумерованные соответственно HCV1-полипротеина). Моноклональное антитело c11-14 направлено против С-концевой части кора (аминокислоты 120-130, пронумерованные соответственно HCV1-полипротеина). Антитело c11-14 конъюгировали с пероксидазой хрена (HPR) с использованием стандартных методов.Monoclonal Antibodies: Monoclonal antibodies c11-3, c11-7, and c11-14 were obtained from Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey. Antibodies c11-3 and c11-7 are directed against the N-terminal portion of the core (amino acids 10-53, respectively numbered HCV1 polyprotein). Monoclonal antibody c11-14 is directed against the C-terminal portion of the core (amino acids 120-130, numbered accordingly HCV1-polyprotein). The c11-14 antibody was conjugated to horseradish peroxidase (HPR) using standard methods.
Моноклональное антитело 5А-3 и анти-SOD-антитело, направленное против аминокислот 1-65 SOD, получали с помощью стандартных методик. Антитело конъюгировали с (HPR), как описано выше.
В. Антигены:B. Antigens:
Антиген с33с (266 аминокислот, аминокислоты 1192-1457 HCV1-полипротеина) экспрессировали как внутренний SOD-слитый полипептид в Е.coli, с помощью методики, описанной для синтеза 5-1-1-антигена. (Choo, et al. Science (1989) 244:359-362). Рекомбинантный антиген был очищен и описан Chien, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 89:10011-10015. Также см. протокол получения SOD-с33с у Houghton et al. Патент США №5350671.The c33c antigen (266 amino acids, amino acids 1192-1457 of the HCV1 polyprotein) was expressed as an internal SOD fusion polypeptide in E. coli, using the procedure described for the synthesis of 5-1-1 antigen. (Choo, et al. Science (1989) 244: 359-362). The recombinant antigen was purified and described by Chien, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 89: 10011-10015. Also see the protocol for producing SOD-c33c from Houghton et al. U.S. Patent No. 5,350,671.
Эпитоп NS3/4a, использованный в анализе, является конформационным эпитопом, обладающим последовательностью, показанной на фиг.3.The epitope NS3 / 4a used in the analysis is a conformational epitope having the sequence shown in FIG.
С. Форматы иммунологических анализов:C. Immunological assay formats:
Анализ Abbot PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), является доступным для приобретения анализом на основе антител. Анализ проводили, используя инструкции производителя.The Abbot PRISM assay (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) is an available antibody-based assay. The analysis was performed using the manufacturer's instructions.
Тестовая система ELISA версия 3.0 ORTHO HCV (обозначенная здесь Ortho 3.0 анализ, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) является доступным для приобретения анализом на основе PCR. Анализ проводили, используя инструкции производителя.The ELISA test system version 3.0 ORTHO HCV (referred to here as Ortho 3.0 analysis, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) is a commercially available PCR based assay. The analysis was performed using the manufacturer's instructions.
Анализ Roche Amplicor (Roche, Pleasant, CA) является доступным для приобретения PCR-тестом. Анализ проводили, используя инструкции производителя.The Roche Amplicor assay (Roche, Pleasant, CA) is a commercially available PCR assay. The analysis was performed using the manufacturer's instructions.
Анализ Gen-Probe TMA (San Diego, Ca) является доступным для приобретения транскрипционно-опосредованным амплификационным анализом. Анализ проводили, используя инструкции производителя.The Gen-Probe TMA assay (San Diego, CA) is available for purchase by transcription-mediated amplification assay. The analysis was performed using the manufacturer's instructions.
Антигеный анализ Ortho (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) является анализом на основе антител. Анализ проводили, используя инструкции производителя.Ortho Antigen Analysis (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) is an antibody based assay. The analysis was performed using the manufacturer's instructions.
Заявленный иммуноанализ образования комплекса HCV-антиген/антитело проводили следующим образом. Очищенные моноклональные антитела (4 мг/мл каждое) СП-7 и СП-3 в 1х фосфантно-соляном растворе (PBS), рН 7,4, объединяли, хорошо перемешивая. В тот же покрывающий буфер добавляли 90 нг рекомбинантного антигена NS3/4a. Перед покрытием раствор перемешивали в течение 30 минут. Добавляли указанный раствор в лунки 96-луночного микротитровального планшета для связывающей среды Costar (Corning, Inc.), 200 мкл на лунку. Планшеты инкубировали при 15-30°С в течение 16-24 часов. Планшеты дважды промывали дистиллированной H2O, с последующим добавлением 300 мкл/лунку послепокровного буфера (1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 1х PBS) на один час и 300 мкл/лунку стабилизирующего буфера (1х PBS, 1% BSA, маннит, полиэтилен гликоль (PEG), желатин), на 1 час. Жидкость с планшетов удаляли, и сушили их при 4°С в течение 24 часов в лиофилизаторе. Планшеты помещали в пакеты с поглотителем влаги.The claimed immunoassay of the formation of the HCV-antigen / antibody complex was carried out as follows. Purified monoclonal antibodies (4 mg / ml each) SP-7 and SP-3 in 1x phosphate-saline solution (PBS), pH 7.4, were combined, mixing well. 90 ng of recombinant NS3 / 4a antigen was added to the same coating buffer. Before coating, the solution was stirred for 30 minutes. The indicated solution was added to the wells of a 96-well Costar Binding Medium Plate (Corning, Inc.), 200 μl per well. The plates were incubated at 15-30 ° C for 16-24 hours. The plates were washed twice with distilled H 2 O, followed by the addition of 300 μl / well post-coating buffer (1% bovine serum albumin (BSA), 1x PBS) for one hour and 300 μl / well of stabilization buffer (1x PBS, 1% BSA, mannitol, polyethylene glycol (PEG), gelatin), for 1 hour. The liquid from the plates was removed and dried at 4 ° C for 24 hours in a lyophilizer. The tablets were placed in bags with a moisture absorber.
Для проведения иммунологического анализа в планшет добавляли 100 мкл усиливающего лизис буфера (1% N-лаурилсаркозин, 0,65 М NaCl, 50 мг/мл мышиного IgG, технического качества (Sigma, St. Louis, МО), 1% модифицированного сульфогидрилом BSA (Bayer), 0,1% казеин). Затем добавляли 100 мкл образца. Все это инкубировали на шейкере при 40°С в течение часа. Планшеты промывали шесть раз с 1х PBS и 0,1% Tween-20 на мойке Ortho Plate Washer. 200 мкл раствора коньюгата (c11-14-HPR в разведении 1:75 с SOD-сЗЗс 250 нг/анализ, плюс анти-SOD-HPR мыши, разведенный 1:5000 в разбавителе для образца HCV 3.0 (ORTHO HCV версия 3.0 тестовая система ELISA, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) без экстракта SOD, все приготовляется за 30 минут до добавления). Раствор инкубировали при встряхивании в течение 45 минут при 40°С. Затем промывали шесть раз, как показано выше, и добавляли 200 мкл раствора субстрата (1 таблетка ODP/10 мл). Таблетка ODP, доступная в Sigma, St.Louis, МО, содержит о-фенилендиаминдигидрохлорид и перекись водорода для окрашивания реакции пероксидазы хрена. Все это инкубировали 30 минут при 15-30°С в темноте. Реакцию останавливали добавлением 50 мл 4н H2SO4, и планшеты считывали при 492 нм, относительно поглощения при 690 нм в качестве контроля.For immunological analysis, 100 μl of lysis-enhancing buffer (1% N-laurylsarcosine, 0.65 M NaCl, 50 mg / ml mouse IgG, technical grade (Sigma, St. Louis, MO), 1% BSA modified with sulfohydryl was added to the plate ( Bayer), 0.1% casein). Then, 100 μl of sample was added. All this was incubated on a shaker at 40 ° C for an hour. The plates were washed six times with 1x PBS and 0.1% Tween-20 on an Ortho Plate Washer. 200 μl of conjugate solution (c11-14-HPR diluted 1:75 with SOD-
D. Результаты:D. Results:
Результаты различных анализов показаны в таблицах 5 и 6, где изображены два отдельных эксперимента с образцами крови, инфицированными HCV, как показано. Серым показано обнаружение вируса. Как показано ниже, анализ комбинации антиген/антитело Чайрона (Chiron) выявлял сероконверсию во всех образцах, тогда как все другие анализы на основе антигенов и антител не смогли выявить сероконверсию ни в одном из образцов. В частности, ни один из анализов на основе антитела не выявил сероконверсию по меньшей мере до 18-го дня (таблица 5). Таблица 6 показывает, что ни один из анализов на основе антитела не выявил присутствие инфекции HCV на 22 день. Более того, после 85-ти дней анализ на основе Ortho-антигена не смог выявить сероконверсии.The results of various assays are shown in Tables 5 and 6, which depicts two separate experiments with blood samples infected with HCV, as shown. Gray indicates virus detection. As shown below, a Chiron antigen / antibody combination analysis (Chiron) detected seroconversion in all samples, while all other antigen and antibody-based analyzes failed to detect seroconversion in any of the samples. In particular, none of the antibody-based assays revealed seroconversion until at least day 18 (table 5). Table 6 shows that none of the assays based on antibodies revealed the presence of HCV infection on day 22. Moreover, after 85 days, an analysis based on the Ortho antigen was not able to detect seroconversion.
Таким образом, на основе вышеуказанных результатов становится ясно, что новый анализ комбинации антиген/антитело уменьшает число ложных негативных результатов, полученных при использовании других стандартных анализов на основе антигенов и антител.Thus, based on the above results, it becomes clear that a new antigen / antibody combination analysis reduces the number of false negative results obtained using other standard antigen and antibody assays.
Сероконверсия HCVTable 5
HCV Seroconversion
Сероконверсия HCVTable 6
HCV Seroconversion
ПРИМЕР 2EXAMPLE 2
Получение конформационного эпитопа NS3/4a с заменами Thr на Pro и Ser на IleObtaining a conformational epitope NS3 / 4a with substitutions of Thr for Pro and Ser for Ile
Конформационный эпитоп NS3/4a получали следующим образом. Этот эпитоп обладает последовательностью, показанной в фигурах 4A-4D и отличается от природной последовательности в положениях 403 (аминокислота 1428 полноразмерной последовательности HCV-1) и 404 (аминокислота 1429 полноразмерной последовательности HCV-1). Более точно, Thr в норме, находящийся в положении 1428 природной последовательности, мутирован на Pro, a Ser, встречающийся в положении 1429, мутирован на Ile.The conformational epitope NS3 / 4a was prepared as follows. This epitope has the sequence shown in figures 4A-4D and differs from the natural sequence at positions 403 (amino acid 1428 of the full-length sequence of HCV-1) and 404 (amino acid 1429 of the full-size sequence of HCV-1). More precisely, Thr normal, located at position 1428 of the natural sequence, is mutated at Pro, and Ser, found at position 1429, is mutated at Ile.
В частности, использовали описанный выше дрожжевой экспрессирующий вектор рВ324.1. Плазмиду pd.hcvla.ns3ns4aPL, которая кодировала иллюстративный эпитоп NS3/4a, использованный в заявляемых иммуноанализах, получали следующим образом. Использовали двухстадийную методику. Сначала лигировали следующие участки ДНК: (а) синтетические олигонуклеотиды, которые образуют 5' HindIII клонирующий сайт, за которым следует последовательность АСААААСААА, инициатор ATG и кодоны для HCVIa, начинающиеся с аминокислоты 1027 и продолжающиеся до сайта BglI на аминокислотах 1046; (b) фрагмент рестрикции 683 bp BglI-ClaI (кодирующий аминокислоты 1046-1274) из pAcHLTns3ns4aPI; и (с) вектор pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Accession Number X65332), который был переварен HindIII и ClaI, дефосфорилирован и очищен гель-фильтрацией. Плазмида pAcHLTns3ns4aPI была получена из pAcHLT, экспрессирующий вектор бакуловируса, доступный для приобретения в BD Pharmigen (Сан-Диего, Калифорния). В частности, был получен вектор pAcHLT EcoRI-PstI, также, как и следующие фрагменты: EcoRI-AlwnI, 935 пн, соответствующий аминокислотам 1027-1336 генома HCV-1; AlwnI-SacII, 247 пн, соответствующий аминокислотам 1336-1419 генома HCV-1; HinfI-BglI, 175 пн, соответствующий аминокислотам 1449-1509 генома HCV-1; BglI-PstI, 619 пн, соответствующий аминокислотам 1510-1711 генома HCV-1; плюс кодон терминации транскрипции. Синтезированный 91 пн фрагмент SacII-HinfI, соответствующий аминокислотам 1420-1448 генома HCV-1 и содержащий PI мутации (Thr-1428 заменен на Pro, Ser-1429 заменен на Ile), лигировали с 175 пн фрагментом HinfI-BglI, и 619 пн фрагментом BglI-PstI, описанными выше, и субклонировали в вектор pGEM-5Zf(+), переваренный SacII и PstI. pGEM-5Zf(+) является доступным для приобретения вектором Е.coli (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Accession Number X65308). После трансформации компетентными клетками НВ101, минискринингового анализа индивидуальных клонов и верификации последовательности, фрагмент 885 пн Sac II-Pstl из pGEM5. PI клон 2 очищали путем гель-фильтрации. Этот фрагмент лигировали с фрагментом EcoRI-AlwnI 935 пн, фрагментом AlwnI-SacII 247 пн и вектором pAcHLT EcoRI-PstI, описанным выше. Получившаяся в результате конструкция получила название pAcHLT Tns3ns4aPI.In particular, the yeast expression vector pB324.1 described above was used. Plasmid pd.hcvla.ns3ns4aPL, which encoded the illustrative epitope NS3 / 4a used in the claimed immunoassays, was obtained as follows. Used a two-stage technique. First, the following DNA sections were ligated: (a) synthetic oligonucleotides that form a 5 'HindIII cloning site, followed by the sequence ACAAAACAAA, ATG initiator and codons for HCVIa, starting from amino acid 1027 and continuing to the BglI site at amino acids 1046; (b) a 683 bp restriction fragment of BglI-ClaI (encoding amino acids 1046-1274) from pAcHLTns3ns4aPI; and (c) the pSP72 vector (Promega, Madison, WI, GenBank / EMBL Accession Number X65332), which was digested with HindIII and ClaI, dephosphorylated and gel filtered. Plasmid pAcHLTns3ns4aPI was obtained from pAcHLT expressing the baculovirus vector available for purchase at BD Pharmigen (San Diego, California). In particular, the pAcHLT EcoRI-PstI vector was obtained, as well as the following fragments: EcoRI-AlwnI, 935 bp corresponding to amino acids 1027-1336 of the HCV-1 genome; AlwnI-SacII, 247 bp corresponding to amino acids 1336-1419 of the HCV-1 genome; HinfI-BglI, 175 bp, corresponding to amino acids 1449-1509 of the HCV-1 genome; BglI-PstI, 619 bp corresponding to amino acids 1510-1711 of the HCV-1 genome; plus a codon of transcription termination. The synthesized 91 bp SacII-HinfI fragment corresponding to amino acids 1420-1448 of the HCV-1 genome and containing PI mutations (Thr-1428 replaced by Pro, Ser-1429 replaced by Ile) was ligated with 175 bp HinfI-BglI fragment, and 619 bp fragment BglI-PstI described above, and subcloned into the vector pGEM-5Zf (+), digested SacII and PstI. pGEM-5Zf (+) is a commercially available E. coli vector (Promega, Madison, WI, GenBank / EMBL Accession Number X65308). After transformation with competent HB101 cells, a mini-screening analysis of individual clones and sequence verification, a fragment of 885 bp Sac II-Pstl from pGEM5.
Вышеупомянутая лигационная смесь была трансформирована в HBlOl-компетентных клетках и помещена на агаровые планшеты Luria, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Miniprep анализы индивидуальных клонов приводили к определению мнимых позитивов, два из которых были амплифицированы. Плазмидную ДНК pSP72 1aHC клонов, #1 и #2, получали с помощью набора Qiagen Maxiprep и секвенировали.The above ligation mixture was transformed into HBlOl-competent cells and placed on Luria agar plates containing 100 μg / ml ampicillin. Miniprep analyzes of individual clones led to the identification of imaginary positives, two of which were amplified. Plasmid DNA of pSP72 1aHC clones, # 1 and # 2, was obtained using the Qiagen Maxiprep kit and sequenced.
Затем, следующие фрагменты были лигированы друг с другом: (а) 761 пн фрагмент HindIII-CalI из р8Р721аНС #1 (pSP72.laHC получали путем лигирования друг с другом: pSP72, который переварили HindIII и ClaI, синтетических олигонуклеотидов, которые образуют сайт клонирования 5' HindIII, за которым следует последовательность АСААААСААА, кодон инициации ATG и кодоны HCVIa, начинающиеся с аминокислоты 1027 и продолжающиеся до аминокислоты 1046 сайта BglII, и фрагмента рестрикции BglII-ClaI в 683 пн (кодирующего аминокислоты 1046-1274) из pAcHLTns3ns4aPI); (b) фрагмент BamHI-HindIII в 1353 пн гибридного промотора дрожжей ADH2/GAPDH; (с) фрагмент ClaI-SalI в 1320 пн (кодирующий аминокислоты HCVIa 1046-1711 с Thr 1428, замененным на Pro, и Ser 1429, замененным на Не) из pAcHLTns3ns4aPI; и (d) экспрессирующий вектор дрожжей pBS24.1, который был переварен BamHI и SalI, дефосфорилирован и очищен с помощью гель-фильтрации. Лигационная смесь была трансформирована в HB101-компетентных клетках и помещена на агаровые планшеты Luria, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Miniprep-анализы индивидуальных клонов приводили к определению отдельных клонов с ожидаемой вставкой BamHI-SalI в 3446 пн, которая состояла из промотора ADH2/GAPDH, инициирующего кодона ATG и NS3/4a из HCVIa, состоящего из аминокислот 1027-1711 (показанных как аминокислоты 1-686 на фиг.4A-4D) с Thr 1248 (аминокислотное положение 403 на фиг.4A-4D), замененным на Pro, и Ser (аминокислотное положение 404 на фиг.4A-4D), замененным на Не. Конструкция названа pd.HCVla.ns3ns4aPI (см. фиг.5).Then, the following fragments were ligated with each other: (a) 761 bp HindIII-CalI fragment from p8P721aHC # 1 (pSP72.laHC was obtained by ligation with each other: pSP72, which was digested with HindIII and ClaI, synthetic oligonucleotides that form the cloning site 5 'HindIII followed by the sequence ACAAAACAAAA, ATG initiation codon and HCVIa codons starting from amino acid 1027 and continuing to amino acid 1046 of the BglII site and the 683 bp BglII-ClaI restriction fragment (coding for amino acids 1046-1274) from pAcHLTns3ns4aPI); (b) a 1353 bp BamHI-HindIII fragment of the hybrid yeast promoter ADH2 / GAPDH; (c) 1320 bp ClaI-SalI fragment (encoding amino acids HCVIa 1046-1711 with Thr 1428 replaced by Pro and Ser 1429 replaced by He) from pAcHLTns3ns4aPI; and (d) the expression vector of yeast pBS24.1, which was digested with BamHI and SalI, dephosphorylated and purified by gel filtration. The ligation mixture was transformed in HB101-competent cells and placed on Luria agar plates containing 100 μg / ml ampicillin. Miniprep analyzes of individual clones led to the identification of individual clones with the expected 3446 bp BamHI-SalI insert, which consisted of the ADH2 / GAPDH promoter, the ATG initiation codon and HCVIa NS3 / 4a, consisting of amino acids 1027-1711 (shown as amino acids 1- 686 in FIGS. 4A-4D) with Thr 1248 (amino acid position 403 in FIGS. 4A-4D) replaced with Pro and Ser (amino acid position 404 in FIGS. 4A-4D) replaced with He. The design is named pd.HCVla.ns3ns4aPI (see FIG. 5).
Штамм S.cerevisiae AD3 трансформировали pd.HCVla.ns3ns4aPI и после истощения глюкозы в среде, проверяли на предмет экспрессии у отдельных трансформантов. В дрожжах был отмечен высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка, как было показано с помощью красителя Кумасси голубого и подтверждено с помощью анализа иммуноблоттинга с использованием поликлонального антитела к хеликазному домену N33.The strain S. cerevisiae AD3 was transformed with pd.HCVla.ns3ns4aPI and, after depletion of glucose in the medium, was checked for expression in individual transformants. In yeast, a high level of expression of the recombinant protein was noted, as was shown using the Kumasi blue dye and confirmed by immunoblot analysis using a polyclonal antibody to the N33 helicase domain.
ПРИМЕР 3EXAMPLE 3
Очистка конформационного эпитопа NS3/4aPurification of the conformational epitope NS3 / 4a
Конформационный эпитоп NS3/4a очищали следующим образом. Упомянутые клетки S. cerevisae, экспрессирующие эпитоп NS3/4a, собирали, как было описано выше. Клетки суспендировали в лизирующем буфере (50 мМ Tris pH 8,0; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1 мМ PMSF; 0,1 мкМ пепстатин; 1 мкМ леупептин) и лизировали в Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Базель, Швейцария) или аналогичном аппарате с использованием стеклянных шариков в соотношении 1:1:1 клетки:буффер:0,5 мм стеклянные шарики. Лизат центрифугировали при 30100 × g в течение 30 минут при 4°С и осадок, содержащий фракцию нерастворимого белка, добавляли к промывочному буферу (6 мл на грамм начального веса клеточного комочка) и перемешивали путем взбалтывания при комнатной температуре в течение 15 минут. Промывочный буфер состоял из 50нМ NaPO4 pH 8,0; 0,3 М NaCl; 5 мМ β-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 0,05% октилглюкозида, 1 мМ EDTA; 1 мМ PMSF, 0,1 мкМ пепстатина; 1 мкМ леупептина. Клеточные остатки удаляли путем центрифугирования при 30100 × g в течениие 30 минут при 4°С. Супернатант выливали и оставляли осадок.The conformational epitope NS3 / 4a was purified as follows. Said S. cerevisae cells expressing the NS3 / 4a epitope were harvested as described above. Cells were suspended in lysis buffer (50 mM Tris pH 8.0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM PMSF; 0.1 μM pepstatin; 1 μM leupeptin) and lysed in Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel , Switzerland) or a similar apparatus using glass beads in a ratio of 1: 1: 1 cells: buffer: 0.5 mm glass beads. The lysate was centrifuged at 30,000 × g for 30 minutes at 4 ° C, and a precipitate containing a fraction of insoluble protein was added to the wash buffer (6 ml per gram of the initial weight of the cell lump) and stirred by shaking at room temperature for 15 minutes. Wash buffer consisted of 50 nM NaPO 4 pH 8.0; 0.3 M NaCl; 5 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0.05% octyl glucoside, 1 mM EDTA; 1 mM PMSF, 0.1 μM pepstatin; 1 μM leupeptin. Cell residues were removed by centrifugation at 30,000 × g for 30 minutes at 4 ° C. The supernatant was poured and a precipitate was left.
Белок из осадка получали следующим образом. Добавляли 6 мл/г экстрагирующего буфера и перемешивали путем взбалтывания при комнатной температуре в течение 15 минут. Экстрагирующий буфер состоял из 50 нМ Tris рН 8,0; 1 М Nad; 5 мМ β-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 1 мМ EDTA; 1 мМ PMSF, 0,1 мкМ пепстатина; 1 мкМ лейпептина. Все это центрифугировали при 30100 × g в течение 30 минут при 4°С. Сохраняли супернатант и добавляли сульфат аммония до 17,5%, используя следующую формулу: объем супернатанта (мл) умноженный на х% сульфата аммония/(1 - х% сульфата аммония) = мл 4,1 М насыщенного сульфата аммония, который следует добавить в супернатант. Сульфат аммония добавляли по каплям при перемешивании на льду, и раствор перемешивали на льду в течение 10 минут. Раствор центрифугировали при 17700 × g в течение 30 минут при 4°С и осадок оставляли и сохраняли при 2-8°С вплоть до 48 часов.Protein from the precipitate was obtained as follows. 6 ml / g of extraction buffer was added and stirred by shaking at room temperature for 15 minutes. The extraction buffer consisted of 50 nM Tris pH 8.0; 1 M Nad; 5 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 1 mM EDTA; 1 mM PMSF, 0.1 μM pepstatin; 1 μM leipeptin. All this was centrifuged at 30,000 × g for 30 minutes at 4 ° C. The supernatant was retained and ammonium sulfate was added to 17.5% using the following formula: supernatant volume (ml) times x% ammonium sulfate / (1 - x% ammonium sulfate) = ml 4.1 M saturated ammonium sulfate, which should be added to supernatant. Ammonium sulfate was added dropwise with stirring on ice, and the solution was stirred on ice for 10 minutes. The solution was centrifuged at 17,700 × g for 30 minutes at 4 ° C and the precipitate was left and kept at 2-8 ° C for up to 48 hours.
Осадок ресуспендировали и пропускали через колонку Poly U (Poly U-Сефароза 4В, Amstersham Pharmacia) при 4°С следующим образом. Осадок ресуспендировали в Poly U-уравновешивающем буфере - 6 мл на грамм веса осадка. Уравновешивающий буфер состоял из 25 mm HEPES рН 8,0, 200 мМ NaCl, 5 мМ DTT (добавляют свежим), 10% глицерина, 1,2 октилглюкозида. Раствор перемешивали путем взбалтывания при 4°С в течение 15 минут и центрифугировали при 30100 × g в течениие 30 минут при 4°С.The precipitate was resuspended and passed through a Poly U column (Poly U-Sepharose 4B, Amstersham Pharmacia) at 4 ° C. as follows. The pellet was resuspended in Poly U-equilibration buffer — 6 ml per gram of pellet weight. The equilibration buffer consisted of 25 mm HEPES pH 8.0, 200 mM NaCl, 5 mM DTT (added fresh), 10% glycerol, 1.2 octyl glucoside. The solution was stirred by shaking at 4 ° C for 15 minutes and centrifuged at 30,000 × g for 30 minutes at 4 ° C.
Подготавливали Poly U-колонку (1 мл смолы на грамм начального веса осадка). Линейная скорость течения составляла 60 см/час, а скорость при набивке была 133% от 60 см/час. Колонка была уравновешена уравновешивающим буфером, и супернатант ресуспендированного аммонийно-сульфатного осадка загружали в уравновешенную колонку. Колонку промывали до исходного состояния уравновешивающим буфером и белок элюировали постадийной элюцией в следующем Poly U-элюирующем буфере: 25 мМ HEPES рН 0,8; 1М NaCl, 5 мМ DTT (добавляли свежим), 10% глицерин, 1,2 октилглюкозид. Элюат с колонки пропускали через SDS-PAGE (окрашенный Кумасси), и аликвоты замораживали и сохраняли при -80°С. Присутствие эпитопа NS3/4a подтверждали с помощью Вестерн-блот-анализа, с использованием поликлонального антитела, направленного против NS3-протеазного домена, и моноклонального антитела против 5-1-1-эпитопа (HCV 4а).A Poly U-column was prepared (1 ml of resin per gram of initial pellet weight). The linear flow rate was 60 cm / h, and the packing speed was 133% of 60 cm / h. The column was equilibrated with equilibration buffer, and the supernatant of the resuspended ammonium sulfate precipitate was loaded into the equilibrated column. The column was washed to the initial state with equilibration buffer and the protein was eluted by stepwise elution in the following Poly U-elution buffer: 25 mM HEPES pH 0.8; 1 M NaCl, 5 mM DTT (added fresh), 10% glycerol, 1.2 octyl glucoside. The eluate from the column was passed through SDS-PAGE (Coomassie stained), and aliquots were frozen and stored at -80 ° C. The presence of the NS3 / 4a epitope was confirmed by Western blot analysis using a polyclonal antibody directed against the NS3 protease domain and a monoclonal antibody against the 5-1-1-epitope (
Дополнительно, в процессе очистки отслеживали протеазную ферментативную активность следующим образом. Пептид NS4A (KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK) и образец, содержащий конформационный эпитоп NS3/4a, растворяли в 90 мкл реакционного буфера (25 мМ Tris, рН 7,5; 0,15 мМ NaCl, 0,5 мМ EDTA, 10% глицерин, 0,05 н-додецил-В-D-мальтозид, 5мМ DTT) и позволили перемешиваться в течение 30 минут при комнатной температуре. В планшет для микротитрования (Costar, Inc., Corning, NY) добавляли 90 мкл смеси и 10 мкл HCV субстрата (AnaSpec, Inc., Сан-Хосе, Калифорния). Содержимое планшета перемешивали и считывали на ридер-планшетах Fluostar. Результаты выражали в единицах относительной флюоресценции (RFU) в минуту.Additionally, during the purification process, protease enzymatic activity was monitored as follows. The NS4A peptide (KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK) and the sample containing the NS3 / 4a conformational epitope were dissolved in 90 μl of reaction buffer (25 mM Tris, pH 7.5; 0.15 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10% glycerol, 0.05 n-dodecyl-B-D-maltoside, 5 mM DTT) and allowed to mix for 30 minutes at room temperature. 90 μl of the mixture and 10 μl of HCV substrate (AnaSpec, Inc., San Jose, CA) were added to a microtiter plate (Costar, Inc., Corning, NY). The contents of the plate were mixed and read on a Fluostar reader tablets. The results were expressed in units of relative fluorescence (RFU) per minute.
При использовании этих методов, продукт экстракции 1М NaCl имел активность 3,7 RFU/мин, преципитат сульфата аммония имел активность 7,5 RFU/мин, продукт Poly U очистки имел активность 18,5 RFU/мин.Using these methods, the 1M NaCl extraction product had an activity of 3.7 RFU / min, the ammonium sulfate precipitate had an activity of 7.5 RFU / min, the Poly U purification product had an activity of 18.5 RFU / min.
Пример 4Example 4
Конкурентные исследования.Competitive research.
Были проведены следующие конкурентные исследования оценки того, может ли конформационный эпитоп NS3/4a распознавать другие антитела, по сравнению с иными HCV-антигенами. В частности, антиген NS3/4a сравнивали с антигеном с200 следующим образом.The following competitive studies have been conducted to evaluate whether the conformational epitope NS3 / 4a can recognize other antibodies compared to other HCV antigens. In particular, the NS3 / 4a antigen was compared with the c200 antigen as follows.
0,5 мкг и 0,1 мкг NS3/4a, полученных, как описано выше, или с200 (Hepatology (1992) 15; 19-25, доступно в ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jarsey) смешивали с 20 мкл образца PHV914-5 (образец ранней сероконверсии, полученный из крови инфицированного субъекта) в полном объеме 220 мкл (1 × PBS). Смесь инкубировали в течение часа в микролунке при 37°С. Планшеты промывали и проводили анализ следующим образом.0.5 μg and 0.1 μg NS3 / 4a, prepared as described above, or c200 (Hepatology (1992) 15; 19-25, available in ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jarsey ) was mixed with 20 μl of sample PHV914-5 (an early seroconversion sample obtained from the blood of an infected subject) in full 220 μl (1 × PBS). The mixture was incubated for one hour in a microwell at 37 ° C. The tablets were washed and analyzed as follows.
1 мкг антигена с200 добавляли к 10 мкг образца PHV914-5 в полном объеме 220 мкл. Смесь инкубировали в течение 1 часа в микролунке при 37°С, и 200 мкл переносили на планшет, покрытый NS3/4a (100 нг/анализ), и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Планшеты промывали пять раз с помощью 1 × PBS, 0,1 Tween-20. Добавляли 200 мкл раствора конъюгата (описан выше), планшеты инкубировали, и проводили анализ. Контрольные повторности, которые состояли из PHV914-5 и 1 × PBS (без антигена), обрабатывали таким же образом.1 μg of c200 antigen was added to 10 μg of sample PHV914-5 in a total volume of 220 μl. The mixture was incubated for 1 hour in a microwell at 37 ° C, and 200 μl was transferred to a plate coated with NS3 / 4a (100 ng / assay) and incubated for 1 hour at 37 ° C. The plates were washed five times with 1 × PBS, 0.1 Tween-20. 200 μl of conjugate solution (described above) was added, the plates were incubated, and analysis was performed. Control repeats that consisted of PHV914-5 and 1 × PBS (without antigen) were treated in the same manner.
Результаты показаны в таблице 7. Результаты процентного ингибирования, показанные в колонке 4, вычисляли следующим образом: колонка 3 минус (колонка 2, деленная на колонку 3 и умноженная на 100). Как можно видеть, данные показывают, что NS34a нейтрализуются антителами ранней сероконверсии, а с200 - нет. Достигался сильный сигнал, когда антитела в PHV914-5 с33с из выборки образцов ранней сероконверсии реагировали с NS34a, нанесенным на микропланшет. Антиген с200 не был нейтрализован этими антителами. Это показано в верхней части таблицы 7. Когда NS34a смешивали с образцом PHV914-5, он был нейтрализован, и поэтому в образце не оказалось антител, реагирующих с NS34a, нанесенным на микропланшет. Данные показывают, что NS34a мог распознать класс антител, отличных от тех, которые распознает с200.The results are shown in Table 7. The percent inhibition results shown in column 4 were calculated as follows:
Конкурентные исследования, показывающие, что NS34a антиген распознает другие антитела в выборке образцов ранней с33с сероконверсии. по сравнению с с200 антигеномCompetitive studies showing that the NS34a antigen recognizes other antibodies in a sample of early c33c seroconversion samples. compared to c200 antigen
ПРИМЕР 5EXAMPLE 5
Исследования стабильности конформационного эпитопа NS34a.Studies of the stability of the conformational epitope NS34a.
Для оценки роли стабильности NS3/4а-эпитопа в выполнении анализа было проведено следующее исследование, определяющее зависимость иммунореактивности NS3/4a от времени при комнатой температуре. Небольшие аликвоты имеющегося в наличии NS3/4a хранили при комнатной температуре и замораживали через интервалы, показанные в таблице 8. Все пузырьки были покрыты одновременно и протестированы на двух выборках образцов ранней сероконверсии NS3.To assess the role of the stability of the NS3 / 4a epitope in the analysis, the following study was carried out, which determines the dependence of NS3 / 4a immunoreactivity on time at room temperature. Small aliquots of available NS3 / 4a were stored at room temperature and frozen at the intervals shown in Table 8. All bubbles were coated simultaneously and tested on two samples of NS3 early seroconversion samples.
Как видно из таблицы 8, запас NS3/4a нестабилен и иммунореактивность уменьшается со временем. К тому же для сохранения иммунореактивности необходимо поддержание конформации NS3/4a.As can be seen from table 8, the supply of NS3 / 4a is unstable and immunoreactivity decreases with time. In addition, maintaining the NS3 / 4a conformation is necessary to maintain immunoreactivity.
Дальнейшие исследования стабильности были поставлены следующим образом. Два конформационных моноклональных антитела против NS3/4a, созданных с помощью стандартных процедур, заменили на выборку образцов ранней анти-HCV сероконверсии. Пузырьки NS3/4a из основного запаса хранили при комнатной температуре, увеличивая время хранения с интервалами 3, 6 и 24 часа. NS3/4a из замороженных пузырьков (90 нг/мл) наносили, и проводили анализ, используя описанную выше методику. Результаты свидетельствуют о том, что оба моноклональных антитела действительно были конформационными и их реакционная способность чувствительна к манипулирванию NS3/4a-антигеном из основного запаса при комнатной температуре. Реакционная способность моноклонального антитела в положительном контроле не изменялась.Further stability studies were posed as follows. Two conformational monoclonal antibodies against NS3 / 4a created using standard procedures were replaced with a sample of early anti-HCV seroconversion samples. Bubbles NS3 / 4a from the main stock were stored at room temperature, increasing storage time at intervals of 3, 6 and 24 hours. Frozen vesicle NS3 / 4a (90 ng / ml) was applied and analysis was performed using the procedure described above. The results indicate that both monoclonal antibodies were indeed conformational and their reactivity was sensitive to manipulation of the NS3 / 4a antigen from the stock at room temperature. The reactivity of monoclonal antibodies in the positive control did not change.
ПРИМЕР 6EXAMPLE 6
Иммунореактивность конформационного эпитопа NS3/4a в сравнении с денатурированным NS3/4a.Immunoreactivity of the conformational epitope of NS3 / 4a compared with denatured NS3 / 4a.
Иммунореактивность конформационного эпитопа NS3/4a, полученного как описано выше, сравнивали с NS3/4a, который был денатурирован путем добавления SDS к препарату конформационного эпитопа NS3/4a до итоговой концентрации 2%. Денатурированный NS3/4a и конформационный NS3/4a наносили на планшеты для микротитрования, как было описано выше. Антиген с200 (Hepatology (1992) 15:19-25, доступный в ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jarsey), также наносили на планшеты для микротитрования. Антиген с200, который использовали для сравнения, считается неконформационным из-за присутствующего в его рецептуре редуцирующего агента (DTT) и детергента (SDS).The immunoreactivity of the conformational epitope NS3 / 4a, obtained as described above, was compared with NS3 / 4a, which was denatured by adding SDS to the preparation of the conformational epitope NS3 / 4a to a final concentration of 2%. The denatured NS3 / 4a and conformational NS3 / 4a were applied to microtiter plates as described above. C200 antigen (Hepatology (1992) 15: 19-25, available in the ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jarsey) was also applied to microtiter plates. The c200 antigen, which was used for comparison, is considered non-conformational due to the reducing agent (DTT) and detergent (SDS) present in its formulation.
Иммунореактивность тестировали по отношению к двум выборкам образцов ранней HCV сероконверсии PHV 904 и PHV 914 (доступные для приобретения образцы крови человека из Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). Результаты показаны в таблице 9. Данные показывают, что денатурированная или линеаризованная форма NS3/4a (так же, как и с200) не распознает выборки образцов ранней сероконверсии так же рано, как NS3/4а-конформационный эпитоп.Immunoreactivity was tested against two samples of samples of early HCV seroconversion PHV 904 and PHV 914 (commercially available human blood samples from Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). The results are shown in Table 9. The data show that the denatured or linearized form of NS3 / 4a (as well as c200) does not recognize samples of early seroconversion samples as early as the NS3 / 4a conformational epitope.
Иммунореактивность конформационного эпитопа также тестировали с использованием моноклональных антител к NS3/4a, полученных стандартными методами. Моноклональные антитела были затем тестированы в формате ELISA против NS3/4a, денатурированного NS3/4a и антигена с200. Данные показывают, что анти-NS3/4а-моноклональные антитела сходным образом реагируют с NS3/4a и денатурированным NS3/4a на сероконверсионных панелях, показанных в таблице 10. Этот результат также является дальнейшим подтверждением того, что NS3/4a является конформационным по природе, так же, как и моноклональные антитела, которые можно изготовить с близкой реакционной способностью к выборкам образцов ранней с33с сероконверсии.Conformational epitope immunoreactivity was also tested using monoclonal antibodies to NS3 / 4a obtained by standard methods. Monoclonal antibodies were then tested in ELISA format against NS3 / 4a, denatured NS3 / 4a and c200 antigen. The data show that anti-NS3 / 4a monoclonal antibodies similarly react with NS3 / 4a and denatured NS3 / 4a in the seroconversion panels shown in Table 10. This result also further confirms that NS3 / 4a is conformational in nature, as well as monoclonal antibodies that can be made with close reactivity to samples of early c33c seroconversion samples.
Соответственно, открыты новые способы анализа для обнаружения HCV. На основании вышеописанного становится понятно, что несмотря на то, что конкретные варианты осуществления данного изобретения были описаны в иллюстративных целях, могут быть внесены разнообразные изменения без изменения сущности и рамок данного изобретения.Accordingly, new assay methods for detecting HCV have been discovered. Based on the foregoing, it becomes clear that although specific embodiments of the present invention have been described for illustrative purposes, various changes can be made without changing the nature and scope of the present invention.
Claims (53)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21208200P | 2000-06-15 | 2000-06-15 | |
| US60/212,082 | 2000-06-15 | ||
| US28081101P | 2001-04-02 | 2001-04-02 | |
| US60/280,867 | 2001-04-02 | ||
| US60/280,811 | 2001-04-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003100884A RU2003100884A (en) | 2004-08-27 |
| RU2274863C2 true RU2274863C2 (en) | 2006-04-20 |
Family
ID=36608382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003100884/15A RU2274863C2 (en) | 2000-06-15 | 2001-06-14 | Method for determining hcv-antigen/antibody complex |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2274863C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2793717C2 (en) * | 2018-04-20 | 2023-04-05 | Иллумина, Инк. | Methods of encapsulating single cells, the encapsulated cells and uses thereof |
| US11999945B2 (en) | 2018-10-26 | 2024-06-04 | Illumina, Inc. | Modulating polymer beads for DNA processing |
-
2001
- 2001-06-14 RU RU2003100884/15A patent/RU2274863C2/en active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2793717C2 (en) * | 2018-04-20 | 2023-04-05 | Иллумина, Инк. | Methods of encapsulating single cells, the encapsulated cells and uses thereof |
| US11999945B2 (en) | 2018-10-26 | 2024-06-04 | Illumina, Inc. | Modulating polymer beads for DNA processing |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1354204B2 (en) | Hcv antigen/antibody combination assay | |
| JP2009258128A (en) | Hcv assay | |
| EP1799868B1 (en) | Hcv non-structural protein mutants and uses thereof | |
| US7491808B2 (en) | HCV non-structural protein mutants and uses thereof | |
| RU2274863C2 (en) | Method for determining hcv-antigen/antibody complex | |
| EP1829891B1 (en) | Immunoassays for Anti-HCV Antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| HE4A | Notice of change of address of a patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20161003 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |