RU2272842C2 - Linear ?-1,4-glucanes and method for their preparing - Google Patents

Abstract

FIELD: genetic engineering, biochemistry.

SUBSTANCE: method involves transformation of plant with DNA encoding protein possessing with enzymatic activity of amylosaccharase. Interaction of protein obtained from plant with sucrose-containing solution provides conversion of sucrose to α-1,4-glucanes and/or fructose. Invention can be used in preparing linear α-1,4-glucanes in plants.

EFFECT: improved preparing method.

6 cl, 2 dwg, 6 ex

Description

Изобретение относится к методам рекомбинантных ДНК для получения растений и микроорганизмов, способных к внутри- или внеклеточной экспрессии протеина, обладающего амилосахаразной активностью и катализирующего синтез линейных α-1,4-глюканов из сахарозы.The invention relates to recombinant DNA methods for producing plants and microorganisms capable of intracellular or extracellular expression of a protein having amylosucrase activity and catalyzing the synthesis of linear α-1,4-glucans from sucrose.

Кроме того, настоящее изобретение относится к новым последовательностям ДНК и плазмидам, содержащим указанные последовательности ДНК, которые после интеграции в геном растения или после трансформации в микроорганизмах, в частности в бактериях или в грибах, приводят к экспрессии фермента, катализирующего синтез линейных α-1,4-глюканов из сахарозы, а также к трансгенным организмам (т.е. растениям, грибам и микроорганизмам), содержащим вышеуказанные последовательности ДНК.In addition, the present invention relates to new DNA sequences and plasmids containing these DNA sequences, which, after integration into the plant genome or after transformation in microorganisms, in particular bacteria or fungi, lead to the expression of an enzyme that catalyzes the synthesis of linear α-1, 4-glucans from sucrose, as well as transgenic organisms (i.e. plants, fungi and microorganisms) containing the above DNA sequences.

Линейные α-1,4-глюканы представляют собой полисахариды, состоящие из мономеров глюкозы, причем последние связаны друг с другом исключительно через α-1,4-глюкозидные связи. Наиболее часто встречающимся природным α-1,4-глюканом является амилоза - компонент крахмала растений. В последнее время все большее и большее значение придается коммерческому применению линейных α-1,4-глюканов. Вследствие своих физико-химических свойств амилоза может быть использована для получения бесцветных, не имеющих запаха и вкуса, нетоксичных и биологически разложимых пленок. В настоящее время уже существуют различные возможности применения, например, в пищевой промышленности, текстильной промышленности, в производстве стекловолокна и в производстве бумаги.Linear α-1,4-glucans are polysaccharides consisting of glucose monomers, the latter being linked exclusively via α-1,4-glucoside bonds. The most common natural α-1,4-glucan is amylose, a component of plant starch. Recently, more and more importance has been attached to the commercial use of linear α-1,4-glucans. Due to its physicochemical properties, amylose can be used to produce colorless, odorless and tasteless, non-toxic and biodegradable films. Currently, there are already various applications, for example, in the food industry, textile industry, in the manufacture of fiberglass and in the manufacture of paper.

Также достигнуты определенные успехи в производстве волокон из амилозы, свойства которых сходны с таковыми природных целлюлозных волокон и которые позволяют частично или даже полностью заменить последние в производстве бумаги.Certain successes have also been achieved in the production of amylose fibers, the properties of which are similar to those of natural cellulose fibers and which partially or even completely replace the latter in paper production.

Являясь наиболее важным представителем линейных α-1,4-глюканов, амилоза, в частности, находит применение в качестве связующего вещества при изготовлении таблеток, в качестве загустителя для пудингов и кремов, в качестве заменителя желатина, в качестве связующего вещества при производстве звукоизолирующих панелей стен и для улучшения текучести низкозастывающих масел.Being the most important representative of linear α-1,4-glucans, amylose, in particular, is used as a binder in the manufacture of tablets, as a thickener for puddings and creams, as a substitute for gelatin, as a binder in the manufacture of soundproofing wall panels and to improve the fluidity of low-setting oils.

Другим свойством α-1,4-глюканов, которое недавно привлекло повышенное внимание, является способность их молекул образовывать вещества, включенные в органические комплексные соединения, вследствие их спирального строения. Это свойство позволяет применять α-1,4-глюканы для разнообразных целей. Указанные свойства определяют возможность их применения для молекулярного инкапсулирования витаминов, фармацевтических соединений и ароматических веществ, а также их применения для хроматографического разделения смеси веществ на иммобилизованных линейных α-1,4-глюканах.Another property of α-1,4-glucans, which has recently attracted increased attention, is the ability of their molecules to form substances included in organic complex compounds due to their spiral structure. This property allows the use of α-1,4-glucans for a variety of purposes. These properties determine the possibility of their use for the molecular encapsulation of vitamins, pharmaceutical compounds and aromatic substances, as well as their use for the chromatographic separation of a mixture of substances on immobilized linear α-1,4-glucans.

Амилоза также служит в качестве исходного материала при получении так называемых циклодекстринов (также называемых циклоамилозами, цикломальтозами), которые в свою очередь находят широкое применение в фармацевтической промышленности, в технологии изготовления пищевых продуктов, при производстве косметики и в технологии аналитического разделения. Указанные циклодекстрины представляют собой циклические мальтолигосахариды, составленные из 6-8 моносахаридных фрагментов и обладающие способностью легко растворяться в воде, но включающие гидрофобные полости, что может использоваться для получения включенных соединений.Amylose also serves as a starting material for the production of so-called cyclodextrins (also called cycloamyloses, cyclomaltoses), which in turn are widely used in the pharmaceutical industry, food processing technology, cosmetics production and analytical separation technology. These cyclodextrins are cyclic maltoligosaccharides composed of 6-8 monosaccharide moieties and capable of being readily soluble in water, but including hydrophobic cavities, which can be used to produce incorporated compounds.

В настоящее время линейные α-1,4-глюканы получают в виде амилозы из крахмала. Сам крахмал состоит из двух компонентов. Первым компонентом является амилоза в виде неразветвленной цепи, состоящей из остатков глюкозы, соединенных α-1,4-связями. Другим компонентом является амилопектин, представляющий собой полимер с высокой степенью ветвления, который состоит из остатков глюкозы и в котором кроме α-1,4-связей глюкозные цепи также могут быть разветвлены с помощью α-1,6-связей. Вследствие своего различного строения и обусловленных этим различных физико-химических свойств эти два компонента также находят применение для различных целей. Чтобы иметь возможность непосредственно использовать свойства отдельных компонентов, необходимо получить их в чистом виде. Оба компонента могут быть получены из крахмала, однако этот процесс требует нескольких стадий очистки, занимает много времени и является дорогостоящим.Currently, linear α-1,4-glucans are prepared as amylose from starch. Starch itself consists of two components. The first component is a straight chain amylose consisting of glucose residues joined by α-1,4 bonds. Another component is amylopectin, which is a highly branched polymer that consists of glucose residues and in which, in addition to the α-1,4 bonds, glucose chains can also be branched using α-1,6 bonds. Owing to their different structure and various physicochemical properties resulting from these, these two components also find application for various purposes. In order to be able to directly use the properties of individual components, it is necessary to obtain them in pure form. Both components can be obtained from starch, however this process requires several stages of purification, it takes a lot of time and is expensive.

Следовательно, существует необходимость в получении обоих компонентов крахмала в однородном виде. Для этой цели вырабатывающие крахмал растения изменяли путем селекции или с помощью генной инженерии с целью получить крахмал с измененной пропорцией амилозы/амилопектина. Хотя обычно процентное содержание амилопектина в кукурузном крахмале составляет, например, 70%, с помощью селекции удалось получить сорт кукурузы (восковую кукурузу), крахмал которой состоит практически на 100% из амилопектина (Akatsuka и Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241: 2280-2285).Therefore, there is a need to obtain both components of starch in a uniform form. For this purpose, starch producing plants were altered by selection or by genetic engineering to obtain starch with a modified proportion of amylose / amylopectin. Although usually the percentage of amylopectin in corn starch is, for example, 70%, by selection it was possible to obtain a variety of corn (waxy maize), the starch of which consists almost 100% of amylopectin (Akatsuka and Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241 : 2280-2285).

Кроме того, путем селекции было получено несколько сортов кукурузы, обладающих повышенным содержанием амилозы (60-70%), например, сорта amylose extender и dull (Wolf и др., 1955, J. Am. Chem. Soc. 77: 1654-1659; Boyer и др., 1976, Die Stärke: 28: 405-410). Для получения сортов, которые синтезируют однородный крахмал в виде амилопектина, использовали другие виды растений, например, рис (Sano, 1984, Theor. Appl. Genet. 68: 467-473) и ячмень (Shannon и Garwood, 1984, в Whistler, Bemiller, Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, Oriando, 2-е изд., 25-86), или таковые, которые синтезируют крахмал с высоким содержанием амилозы (например, различные виды гороха). Помимо указанных выше методик классического скрещивания опубликованы методики, основанные на генетическом воздействии на вырабатывающие крахмал растения.In addition, several maize varieties with a high amylose content (60-70%) were obtained by selection, for example, amylose extender and dull varieties (Wolf et al., 1955, J. Am. Chem. Soc. 77: 1654-1659 ; Boyer et al., 1976, Die Stärke: 28: 405-410). To obtain varieties that synthesize homogeneous starch in the form of amylopectin, other plant species were used, for example, rice (Sano, 1984, Theor. Appl. Genet. 68: 467-473) and barley (Shannon and Garwood, 1984, in Whistler, Bemiller , Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, Oriando, 2nd ed., 25-86), or those that synthesize starch with a high amylose content (for example, various types of peas). In addition to the above methods of classical crossbreeding, techniques based on the genetic effect on starch-producing plants have been published.

Например, у Visser и др., (1991, Mol. Gen. Genet. 255: 289-296) говорится, что сорта картофеля, синтезирующие практически чистый амилопектиновый крахмал, могут быть получены путем антисмыслового ингибирования гена, который кодирует крахмал-синтетазу, необходимую для связывания гранул крахмала.For example, Visser et al., (1991, Mol. Gen. Genet. 255: 289-296) state that potato varieties synthesizing substantially pure amylopectin starch can be obtained by antisense inhibition of a gene that encodes starch synthetase necessary for binding starch granules.

В международной заявке WO 92/14827 описано получение растений картофеля, которые вследствие анитсмыслового ингибирования экспрессии фермента разветвления вырабатывают крахмал с повышенной пропорцией амилозы/аминопектина. Однако растения, описанные в WO 92/14827, не обладают способностью производить крахмал с более высоким содержанием амилозы.WO 92/14827 describes the preparation of potato plants which, due to an antisense inhibition of the expression of a branching enzyme, produce starch with an increased proportion of amylose / aminopectin. However, the plants described in WO 92/14827 do not have the ability to produce starch with a higher amylose content.

Несмотря на многочисленные попытки и разнообразные подходы до сих пор никому не удалось добиться успеха в получении растений, производящих чистый амилозный крахмал.Despite numerous attempts and diverse approaches, so far no one has been successful in obtaining plants producing pure amylose starch.

Также до сих пор не описаны возможности получения амилозы с высокой степенью чистоты или чистых линейных α-1,4-глюканов с использованием других способов, например, генной инженерией микроорганизмов.Also, the possibilities of obtaining high purity amylose or pure linear α-1,4-glucans using other methods, for example, genetic engineering of microorganisms, have not yet been described.

Кроме того, до сих пор не были обнаружены последовательности ДНК, кодирующие ферменты, которые обладали бы способностью катализировать синтез линейных α-1,4-глюканов в растениях, грибах, микроорганизмах или in vitro.In addition, DNA sequences encoding enzymes that have the ability to catalyze the synthesis of linear α-1,4-glucans in plants, fungi, microorganisms, or in vitro have not yet been discovered.

Таким образом, целью настоящего изобретения является получение последовательностей ДНК и разработка способов, дающих возможность получать растения, грибы и микроорганизмы, способные синтезировать линейные α-1,4-глюканы.Thus, the aim of the present invention is to obtain DNA sequences and the development of methods that make it possible to obtain plants, fungi and microorganisms capable of synthesizing linear α-1,4-glucans.

Задачи настоящего изобретения решены посредством различных вариантов выполнения изобретения, представленных в пунктах формулы изобретения.The objectives of the present invention are solved by various embodiments of the invention presented in the claims.

Следовательно, изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим протеины, обладающие ферментативной активностью амилосахаразы.Therefore, the invention relates to DNA sequences encoding proteins having amylosaccharase enzymatic activity.

В частности изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим протеин, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No.1, и к кодирующей ДНК-последовательности, представленной в SEQ ID No.1. Кроме того, настоящее изобретение относится к последовательностям ДНК, гибридизирующимся с вышеуказанными последовательностями по изобретению и кодирующим протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, а также к последовательностям ДНК, которые вследствие генетического кода являются вырожденными по сравнению с вышеуказанными последовательностями ДНК по изобретению.In particular, the invention relates to DNA sequences encoding a protein that has the amino acid sequence shown in SEQ ID No.1, and to the coding DNA sequence shown in SEQ ID No.1. In addition, the present invention relates to DNA sequences hybridizing with the above sequences of the invention and encoding a protein having amylosaccharase enzymatic activity, as well as to DNA sequences which, due to the genetic code, are degenerate compared to the above DNA sequences of the invention.

В этом контексте термин "гибридизация" обозначает гибридизацию в обычных условиях гибридизации, предпочтительно в строгих условиях, таких, как описано, например, у Sambrook и др. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Hatbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).In this context, the term “hybridization” means hybridization under ordinary hybridization conditions, preferably under stringent conditions, such as described, for example, by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Hatbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

В другом варианте осуществления изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, и получаемым с помощью способа, включающего следующие стадии:In another embodiment, the invention relates to DNA sequences encoding a protein having amylosucrase enzyme activity and obtained by a method comprising the following steps:

(а) получение библиотеки геномной или кДНК на основе геномной ДНК или мРНК клеток организма;(a) obtaining a library of genomic or cDNA based on genomic DNA or mRNA of body cells;

(б) трансформацию приемлемого хозяина с помощью библиотеки, созданной на стадии (а);(b) transformation of an acceptable host using the library created in stage (a);

(в) обработку трансформированных клеток парами йода;(c) treating the transformed cells with iodine vapors;

(г) выявление клеток, окрашенных в голубой цвет;(d) identification of cells stained in blue;

(д) выделение и культивирование клеток, выявленных на стадии (г); и(e) the selection and cultivation of cells identified in stage (g); and

(е) выделение геномной ДНК-вставки или кДНК-вставки из трансформированных клеток.(e) isolation of the genomic DNA insert or cDNA insert from transformed cells.

Приемлемым хозяином, упомянутым в стадии (б), является, например, E.coli.An acceptable host mentioned in step (b) is, for example, E. coli.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим амилосахаразу из микроорганизмов, в частности из грамотрицательных микроорганизмов, предпочтительно из бактерий рода Neisseria и наиболее предпочтительно из Neisseria polysaccharea.In a preferred embodiment, the invention relates to DNA sequences encoding amylosaccharase from microorganisms, in particular from gram-negative microorganisms, preferably from bacteria of the genus Neisseria and most preferably from Neisseria polysaccharea.

Также представляется возможным модифицировать последовательности ДНК по изобретению путем мутации или с помощью последовательности, измененной путем инсерции (вставки), делеции, замещения или рекомбинации с целью изменить определенное свойство протеина, подлежащего экспрессии. Одной из этих модификаций, среди прочего, является делеция сигнальной последовательности, обеспечивающей секрецию фермента, и вставки других сигнальных последовательностей или последовательностей ДНК, кодирующих транзитные пептиды и тем самым влияющих на локализацию экспрессируемого протеина.It is also possible to modify the DNA sequences of the invention by mutation or by a sequence altered by insertion, insertion, deletion, substitution or recombination in order to change a specific property of the protein to be expressed. One of these modifications, among other things, is the deletion of a signal sequence that provides secretion of the enzyme, and the insertion of other signal sequences or DNA sequences encoding transit peptides and thereby affect the localization of the expressed protein.

Последовательности ДНК по изобретению, в частности последовательность ДНК по изобретению, представленная в SEQ ID No.1, или ее часть, могут применяться для определения, присутствуют ли гомологичные последовательности ДНК в определенных организмах или экспрессируются ими. Для достижения этого образцы ДНК или мРНК конкретного организма гибридизируют с последовательностью ДНК по изобретению в пригодных для этой цели условиях гибридизации в соответствии с обычными способами.The DNA sequences of the invention, in particular the DNA sequence of the invention presented in SEQ ID No.1, or part thereof, can be used to determine if homologous DNA sequences are present in or expressed by certain organisms. To achieve this, DNA samples or mRNAs of a particular organism hybridize to the DNA sequence of the invention under suitable hybridization conditions in accordance with conventional methods.

В соответствии со стандартными методиками из генома различных организмов также можно выделять гомологичные последовательности, которые также кодируют амилосахаразы или ферменты, обладающие аналогичными свойствами, используя последовательность ДНК по изобретению. В данном контексте гомология означает идентичность последовательности по крайней мере на 40-60%, предпочтительно более чем на 60%, особенно предпочтительно более чем на 80%, наиболее предпочтительна идентичность последовательности более чем на 95%. Кроме того, гомология означает, что соответствующие последовательности ДНК или кодируемые аминокислотные последовательности являются функционально и/или структурно эквивалентными. Последовательности, которые гомологичны последовательностям по изобретению и которые отличаются от последовательности ДНК или кодируемой аминокислотной последовательности по изобретению по одному или нескольким позициям, являются нормальными вариантами указанной последовательности, представляющими собой модификации, имеющие такую же функцию. Это могут быть варианты, встречающиеся в естественных условиях, такие как последовательности из других организмов, или мутации. Указанные мутации могут возникать естественным путем, или их можно получать с помощью специфичного мутагенеза. Кроме того, эти варианты могут быть последовательностями, полученными синтетическим путем. Все эти последовательности ДНК равным образом подпадают под объем изобретения.In accordance with standard techniques, homologous sequences can also be isolated from the genome of various organisms that also encode amylosaccharases or enzymes having similar properties using the DNA sequence of the invention. In this context, homology means sequence identity of at least 40-60%, preferably more than 60%, particularly preferably more than 80%, most preferred sequence identity is more than 95%. In addition, homology means that the corresponding DNA sequences or encoded amino acid sequences are functionally and / or structurally equivalent. Sequences that are homologous to the sequences of the invention and which differ from the DNA sequence or the encoded amino acid sequence of the invention in one or more positions are normal variants of this sequence, which are modifications having the same function. These may be in vivo variants, such as sequences from other organisms, or mutations. These mutations can occur naturally, or they can be obtained using specific mutagenesis. In addition, these options may be synthetic sequences. All of these DNA sequences are equally within the scope of the invention.

Протеины, кодируемые различными вариантами последовательности ДНК по изобретению, обладают общими специфичными характеристиками, такими как ферментативная активность, иммунологическая реактивность, конформация и т.д., а также физическими свойствами, такими как электрофоретическая подвижность, хроматографическое свойства, коэффициент седиментации, растворимость, спектроскопические свойства, стабильность и т.д.Proteins encoded by various variants of the DNA sequence according to the invention have common specific characteristics, such as enzymatic activity, immunological reactivity, conformation, etc., as well as physical properties, such as electrophoretic mobility, chromatographic properties, sedimentation coefficient, solubility, spectroscopic properties stability etc.

Чтобы выявить родственные последовательности ДНК, должны быть получены библиотеки генов организма, подлежащего исследованию, которые являются характерными для присущих организму генов, или генов, полученных в результате экспрессии в организме или в определенной ткани организма. К первому из вышеуказанных типов относятся геномные библиотеки, к последнему относятся библиотеки кДНК.To identify related DNA sequences, libraries of genes of the organism to be studied must be obtained, which are characteristic of genes inherent in the body, or genes resulting from expression in the body or in a particular body tissue. The first of the above types includes genomic libraries, the latter include cDNA libraries.

Идентификацию и выделение гомологичных последовательностей ДНК из таких библиотек осуществляют путем гибридизации в соответствии со стандартными методиками (см., например, у Sambrook и др., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Hatbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).The identification and isolation of homologous DNA sequences from such libraries is carried out by hybridization in accordance with standard methods (see, for example, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Hatbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

В качестве гибридизирующего зонда могут быть использованы молекулы ДНК, которые имеют точно такую же или практически такую же последовательность ДНК, как и последовательность, представленная в SEQ ID No.1, или часть указанной последовательности. Фрагменты ДНК, используемые в качестве гибридизирующих зондов, также могут представлять собой синтетические фрагменты ДНК, которые были получены в соответствии с обычными методами синтеза ДНК и являются практически идентичными последовательности по изобретению. После идентификации и выделения генов, гибридизирующих с последовательностью ДНК по изобретению, необходимо определить последовательность и проанализировать свойства протеинов, кодируемых указанной последовательностью.As a hybridizing probe, DNA molecules that have exactly the same or substantially the same DNA sequence as the sequence shown in SEQ ID No.1, or part of this sequence, can be used. The DNA fragments used as hybridizing probes can also be synthetic DNA fragments that were obtained in accordance with conventional DNA synthesis methods and are substantially identical to the sequences of the invention. After the identification and isolation of genes hybridizing with the DNA sequence of the invention, it is necessary to determine the sequence and analyze the properties of the proteins encoded by the specified sequence.

Амилосахараза (также обозначаемая как сахараза: α-1,4-глюкан-4-α-глюкозилтрансфераза, К.Ф. 2.4.1.4.) представляет собой фермент, для которого предложена следующая реакционная схема:Amylosaccharase (also referred to as sucrose: α-1,4-glucan-4-α-glucosyltransferase, KF 2.4.1.4.) Is an enzyme for which the following reaction scheme has been proposed:

сахараза + (α-1,4-D-глюкозил)_n --->sucrose + (α-1,4-D-glucosyl) _n --->

D-фруктоза + (α-1,4-D-глюкозил)_n+1 D-fructose + (α-1,4-D-glucosyl) _{n + 1}

Эта реакция представляет собой реакцию трансглюкозилирования. Продуктами этой реакции являются линейные α-1,4-глюканы и фруктоза. Кофакторы при этом не требуются. До сих пор амилосахаразная активность была обнаружена только у нескольких видов бактерий, в частности у видов рода Neisseria (MacKenzie и др., 1978, Can. J. Microbiol. 24: 357-362), а фермент был оценен только с точки зрения его ферментативной активности. По данным Okada и др. частично очищенный фермент из Neisseria perflava после добавления сахарозы приводит к синтезу гликогенподобных полисахаридов, которые являются слабо разветвленными (Okada и др., 1974, J. Biol. Chem. 249: 126-135). Аналогично этому синтезируемые внутри- или внеклеточно глюканы Neisseria perflava и Neisseria polysaccharea обладают определенной степенью разветвленности (Riou и др., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911). До настоящего времени остается неясным, получаются ли эти разветвления вследствие действия амилосахаразы или благодаря другому ферменту, присутствующему в препаратах очищенной амилосахаразы в качестве примеси. Поскольку фермент, вызывающий разветвление, до сих пор не выявлен, предполагают, что амилосахараза катализирует как реакцию полимеризации, так и реакцию разветвления (Okada и др., 1974, J. Biol. Chem. 249: 126-135).This reaction is a transglucosylation reaction. The products of this reaction are linear α-1,4-glucans and fructose. Cofactors are not required. So far, amylosucrase activity has been detected in only a few bacterial species, in particular in species of the genus Neisseria (MacKenzie et al., 1978, Can. J. Microbiol. 24: 357-362), and the enzyme was evaluated only from the point of view of its enzymatic activity. According to Okada et al., A partially purified enzyme from Neisseria perflava after adding sucrose leads to the synthesis of glycogen-like polysaccharides that are weakly branched (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem. 249: 126-135). Similarly, Neisseria perflava and Neisseria polysaccharea synthesized intracellularly or extracellularly have a certain degree of branching (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911). Until now, it remains unclear whether these branches result from the action of amylosucrase or due to another enzyme present as an impurity in the preparations of purified amylosucrase. Since the branching enzyme has not yet been identified, it is believed that amylosucrase catalyzes both the polymerization reaction and the branching reaction (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem. 249: 126-135).

Фермент, который экспрессируют присущим ему образом в Neisseria, является особенно стабильным, очень сильно связывается с продуктами полимеризации и конкурентно ингибируется продуктом фруктозой (MacKenzie и др., 1978, Can. J. Microbiol. 24: 357-362). Вид Neisseria, а именно Neisseria polysaccharea, секретирует амилосахаразу (Riou и др., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911), в то время как у другого вида Neisseria она сохраняется в клетке.The enzyme, which is expressed in an inherent manner in Neisseria, is particularly stable, binds very strongly to polymerization products and is competitively inhibited by the fructose product (MacKenzie et al., 1978, Can. J. Microbiol. 24: 357-362). The Neisseria species, namely, Neisseria polysaccharea, secretes amylosaccharase (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911), while it remains in the cell in another Neisseria species.

Ферменты, обладающие амилосахаразной активностью, могут быть обнаружены только в микроорганизмах. Растения, имеющие амилосахаразы, не известны.Enzymes with amylosaccharose activity can only be found in microorganisms. Plants having amylosaccharases are not known.

В соответствии с изобретением можно показать, что продуктом реакции, катализируемой амилосахаразой, являются линейные α-1,4-глюканы, которые не являются разветвленными, как это предполагалось до сих пор (см. выше).According to the invention, it can be shown that the reaction product catalyzed by amylosaccharase are linear α-1,4-glucans, which are not branched, as was previously assumed (see above).

Обнаружение ферментативной активности амилосахаразы может быть осуществлено путем обнаружения синтезированных глюканов, как описано ниже в примере 3. Обнаружение обычно осуществляют, используя окрашивание йодом. Бактериальные колонии, экспрессирующие амилосахаразу, можно идентифицировать с помощью, например, обработки парами йода. Колонии, синтезирующие линейные α-1,4-глюканы, окрашиваются в голубой цвет.Detection of the enzymatic activity of amylosucrase can be carried out by detecting synthesized glucans, as described below in Example 3. Detection is usually carried out using iodine staining. Bacterial colonies expressing amylosucrase can be identified by, for example, treatment with iodine vapor. Colonies synthesizing linear α-1,4-glucans turn blue.

Ферментативная активность очищенного фермента может быть обнаружена, например, на содержащих сахарозу агарозных пластинках. Если протеин наносят на такую пластинку и инкубируют в течение 1 ч или более при 37°С, он диффундирует в агарозу и катализирует синтез линейных глюканов. Последние могут быть обнаружены при обработке парами йода. Кроме того, протеин может быть обнаружен в нативных полиакриламидных гелях. После электрофореза в нативном полиакриламидном геле гель уравновешивают в натрий-цитратном буфере (50 мМ, рН 6,5) и инкубируют в течение ночи в растворе сахарозы (5%-ной в натрий-цитратном буфере). Если гель после этого окрашивают раствором Люголя, то зоны, в которых локализованы протеины, обладающие амилосахаразной активностью, окрашиваются в голубой цвет вследствие синтеза линейных α-1,4-глюканов.The enzymatic activity of the purified enzyme can be detected, for example, on sucrose-containing agarose plates. If the protein is applied to such a plate and incubated for 1 h or more at 37 ° C, it diffuses into agarose and catalyzes the synthesis of linear glucans. The latter can be detected by treatment with iodine vapor. In addition, protein can be found in native polyacrylamide gels. After electrophoresis in a native polyacrylamide gel, the gel was equilibrated in sodium citrate buffer (50 mM, pH 6.5) and incubated overnight in sucrose solution (5% in sodium citrate buffer). If the gel is then stained with Lugol's solution, then the zones in which proteins with amylosucrase activity are localized are colored blue due to the synthesis of linear α-1,4-glucans.

С помощью последовательностей ДНК по изобретению можно получить растения, способные производить чистый амилозный крахмал, т.е. линейные α-1,4-глюканы, и модифицировать вырабатывающие крахмал растения таким образом, чтобы они имели более высокое содержание крахмала и в то же время увеличенную пропорцию амилозы/амилопектина. Последовательности ДНК по изобретению могут применяться для получения микроорганизмов и грибов, в частности дрожжей, способных производить фермент, катализирующий синтез линейных α-1,4-глюканов из сахарозы.Using the DNA sequences of the invention, plants capable of producing pure amylose starch, i.e. linear α-1,4-glucans, and modify starch-producing plants so that they have a higher starch content and at the same time an increased proportion of amylose / amylopectin. The DNA sequences of the invention can be used to produce microorganisms and fungi, in particular yeast, capable of producing an enzyme that catalyzes the synthesis of linear α-1,4-glucans from sucrose.

Кроме того, с помощью последовательностей ДНК по изобретению или кодируемых ими протеинов при небольших затратах на производство можно получать чистый фруктозный сироп.In addition, using the DNA sequences of the invention or the proteins encoded by them at a low production cost, pure fructose syrup can be obtained.

Согласно другому варианту осуществления изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, таким как векторы, в частности плазмиды, содержащие последовательности ДНК по изобретению или их части, например, плазмида pNB2, которая была депонирована под каталожным номером DSM No. 9196. В частности изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, в которых последовательность ДНК по изобретению сцепляют с последовательностями, обеспечивающими экспрессию протеина, обладающего амилосахаразной активностью, в микроорганизмах, грибах или растениях, например, к плазмидам, содержащим следующие последовательности ДНК:According to another embodiment, the invention relates to recombinant DNA molecules, such as vectors, in particular plasmids containing the DNA sequences of the invention or parts thereof, for example, plasmid pNB2, which was deposited under catalog number DSM No. 9196. In particular, the invention relates to recombinant DNA molecules in which the DNA sequence of the invention is linked to sequences providing expression of a protein having amylosucrase activity in microorganisms, fungi or plants, for example, plasmids containing the following DNA sequences:

(а) соответствующий промотор, активный в микроорганизмах и обеспечивающий транскрипцию кодирующей последовательности в микроорганизмах в прямом направлении от него, и(a) an appropriate promoter active in microorganisms and providing transcription of the coding sequence in microorganisms in the forward direction from it, and

(б) последовательность ДНК, кодирующая полипептид, обладающий амилосахаразной активностью и сцепленный с промотором таким образом, чтобы обеспечить образование транслируемой РНК в полипептиде, или к плазмидам, содержащим следующие последовательности ДНК:(b) a DNA sequence encoding a polypeptide having amylosaccharose activity and linked to a promoter in such a way as to ensure the formation of translational RNA in the polypeptide, or to plasmids containing the following DNA sequences:

(а) соответствующий промотор, активный в растениях, обеспечивающий транксрипцию кодирующей последовательности в прямом направлении от него в соответствующее время или на соответствующей стадии развития трансгенного растения или в определенных тканях трансгенного растения, и(a) an appropriate promoter active in plants, providing transcription of the coding sequence in the forward direction from it at the appropriate time or at the appropriate stage of development of the transgenic plant or in certain tissues of the transgenic plant, and

(б) последовательность ДНК, кодирующую полипептид, обладающий амилосахаразной активностью и сцепленный с промотором таким образом, чтобы обеспечить образование транслируемой РНК в полипептиде.(b) a DNA sequence encoding a polypeptide having amylosucrose activity and linked to a promoter in such a way as to ensure the formation of translational RNA in the polypeptide.

Кроме того, предметом изобретения являются микроорганизмы, грибы и растения, содержащие рекомбинантые молекулы ДНК по изобретению.In addition, the subject of the invention are microorganisms, fungi and plants containing the recombinant DNA molecules of the invention.

Еще одним предметом изобретения являются обладающие ферментативной активностью амилосахаразы протеины, которые кодируются одной из последовательностей ДНК по изобретению, в частности таковые, имеющие происхождение из микроорганизмов, предпочтительно из грамотрицательных микроорганизмов, в частности рода Neisseria и наиболее предпочтительно из Neisseria polysaccharea. Кроме того, предметом изобретения являются амилосахаразы, имеющие по данным гель-электрофореза молекулярную массу 63±20 кДа, предпочтительно 63±15 кДа и наиболее предпочтительно 63 ±10 кДа.Another subject of the invention are enzyme-containing amylosaccharase proteins that are encoded by one of the DNA sequences of the invention, in particular those originating from microorganisms, preferably from gram-negative microorganisms, in particular of the genus Neisseria and most preferably from Neisseria polysaccharea. In addition, the subject of the invention is amylosaccharases having, according to gel electrophoresis, a molecular weight of 63 ± 20 kDa, preferably 63 ± 15 kDa and most preferably 63 ± 10 kDa.

Далее предметом изобретения являются конкретные протеины, которые обладают ферментативной активностью амилосахаразы и аминокислотная последовательность которых представлена в SEQ ID No.1. Кроме того, изобретение относится к протеинам, имеющим аминокислотные последовательности, которые практически идентичны аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No.1, или которые отличаются от указанной последовательности по одной или нескольким позициям. Эти отличия предпочтительно представляют собой обмены консервативными аминокислотами, так что протеин обладает ферментативной активностью амилосахаразы. Таким образом, изобретение также относится к амилосахаразам, аминокислотная последовательность которых имеет высокую гомологичность аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No.1, в частности гомологичность по крайней мере на 70%, предпочтительно более чем на 80%, более предпочтительно более чем на 90%, особенно предпочтительна гомологичность по крайней мере на 99%.Further, the subject of the invention is specific proteins that possess the enzymatic activity of amylosaccharase and whose amino acid sequence is presented in SEQ ID No.1. In addition, the invention relates to proteins having amino acid sequences that are substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID No.1, or which differ from the indicated sequence in one or more positions. These differences are preferably conservative amino acid exchanges, so that the protein has amylosaccharase enzymatic activity. Thus, the invention also relates to amylosaccharases, the amino acid sequence of which has a high homology of the amino acid sequence shown in SEQ ID No.1, in particular homology of at least 70%, preferably more than 80%, more preferably more than 90% at least 99% homology is particularly preferred.

Кроме того, один из вариантов выполнения изобретения относится к применению последовательности ДНК по изобретению и молекул ДНК, в частности плазмид, содержащих указанные последовательности ДНК, для трансформации клеток прокариот или эукариот, а также для экспрессии амилосахаразы в клетках прокариот или эукариот, а также к способу получения протеинов по изобретению путем выращивания в соответствующей питательной среде микроорганизма, содержащего рекомбинантную молекулу ДНК по изобретению.In addition, one embodiment of the invention relates to the use of the DNA sequence of the invention and DNA molecules, in particular plasmids containing the indicated DNA sequences, for the transformation of prokaryotic or eukaryotic cells, as well as for the expression of amylosucrase in prokaryotic or eukaryotic cells, and also to a method obtaining proteins according to the invention by growing in an appropriate nutrient medium a microorganism containing a recombinant DNA molecule according to the invention.

В частности предметом настоящего изобретения является способ получения растений, которые способны синтезировать линейные α-1,4-глюканы, характеризующийся введением в клетки растения последовательности ДНК по изобретению, содержащей область, кодирующую протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, и сцепленную с последовательностями ДНК, обеспечивающими экспрессию в клетках растений и регенерацию целых растений из трансформированных клеток.In particular, the subject of the present invention is a method for producing plants that are capable of synthesizing linear α-1,4-glucans, characterized by introducing into the plant cells a DNA sequence according to the invention containing a region encoding a protein having amylosaccharase enzymatic activity and linked to DNA sequences providing expression in plant cells and regeneration of whole plants from transformed cells.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения растительных клеток и растений, способных синтезировать линейные α-1,4-глюканы, включающему следующие стадии:In addition, the present invention relates to a method for producing plant cells and plants capable of synthesizing linear α-1,4-glucans, comprising the following steps:

(а) получение полигенного экспрессирующего кластера, имеющего следующие частичные последовательности:(a) obtaining a polygenic expression cluster having the following partial sequences:

(I) промотор, активный в растениях и обеспечивающий образование РНК в соответствующей ткани-мишени или в клетках-мишенях;(I) a promoter that is active in plants and provides for the formation of RNA in the corresponding target tissue or in target cells;

(II) по крайней мере одну последовательность ДНК, кодирующую протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы и слитую с промотором в смысловой ориентации;(Ii) at least one DNA sequence encoding a protein having amylosaccharase enzymatic activity and fused to the promoter in a sense orientation;

(III) функционирующий в растениях сигнал для прекращения транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК;(III) a plant-functioning signal for terminating transcription and polyadenylation of an RNA molecule;

(б) перенос полигенного экспрессирующего кластера в клетки растений; и(b) transferring the polygenic expression cluster to plant cells; and

(в) регенерацию целых интактных растений из трансформированных растительных клеток.(c) regeneration of whole intact plants from transformed plant cells.

Пригодными для этой цели промоторами являются такие промоторы, которые обеспечивают конститутивную экспрессию гена во всех тканях растений, такие как промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV), a также таковые, которые обеспечивают экспрессию только в определенных органах или только на определенных стадиях развития растения. Известны промоторы, обеспечивающие специфичную экспрессию в клубнях растений картофеля, такие как промотор В33 (Liu и др., 1990, Mol. Gen. Genet. 223: 401-406), или таковые, которые обеспечивают специфичную экспрессию в корнеплодах сахарной свеклы. Кроме того, в литературе описаны последовательности ДНК, обеспечивающие зависящую от света и тканеспецифичную экспрессию в клетках листьев последовательностей ДНК, расположенных ниже по ходу транскрипции (Orozco и Ogren, 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138).Suitable promoters for this purpose are those promoters that provide constitutive gene expression in all plant tissues, such as the 35S cauliflower mosaic virus (CaMV) promoter, as well as those that provide expression only in certain organs or only at certain stages of plant development. Promoters are known that provide specific expression in potato plant tubers, such as the B33 promoter (Liu et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 223: 401-406), or those that provide specific expression in sugar beet roots. In addition, DNA sequences are described in the literature that provide light-dependent and tissue-specific expression in leaf cells of DNA sequences located downstream of transcription (Orozco and Ogren, 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138).

Последовательность ДНК, указанная в пункте (II) на стадии (а) процесса по существу может представлять собой любую последовательность ДНК, содержащую кодирующую область, которая кодирует протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы. Пригодные для этой цели последовательности ДНК, в частности, представляют собой последовательности ДНК, имеющие происхождение из микроорганизмов, предпочтительно из грамотрицательных микроорганизмов, прежде всего из бактерий рода Neisseria и в частности из Neisseria polysaccharea.The DNA sequence indicated in paragraph (II) in step (a) of the process can essentially be any DNA sequence containing a coding region that encodes a protein having amylosaccharase enzymatic activity. Suitable DNA sequences for this purpose, in particular, are DNA sequences originating from microorganisms, preferably from gram-negative microorganisms, especially from bacteria of the genus Neisseria and in particular from Neisseria polysaccharea.

Предпочтительный вариант осуществления способа по изобретению включает применение последовательностей ДНК, кодирующих протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, причем протеин имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No.1, или аминокислотную последовательность, практически идентичную таковой.A preferred embodiment of the method of the invention comprises the use of DNA sequences encoding a protein having amylosaccharase enzymatic activity, the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID No.1 or an amino acid sequence substantially identical to that.

Предпочтительно применять последовательности ДНК, имеющие высокую степень гомологичности последовательности ДНК, представленной в SEQ ID No.1, и кодирующие амилосахаразу. Также могут применяться последовательности ДНК, которые могут быть получены из указанных последовательностей путем замещения, инсерции или делеции, в том случае, если не ухудшена их ферментативная активность.It is preferable to use DNA sequences having a high degree of homology of the DNA sequence shown in SEQ ID No.1 and encoding amylosaccharase. DNA sequences that can be obtained from these sequences by substitution, insertion, or deletion can also be used if their enzymatic activity is not impaired.

Особенно предпочтительный вариант осуществления способа относится к применению последовательности ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID No.1, или ее части, при условии, что длина этих частей достаточна для того, чтобы кодировать протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы.A particularly preferred embodiment of the method relates to the use of a DNA sequence having the nucleotide sequence shown in SEQ ID No.1, or part thereof, provided that the length of these parts is sufficient to encode a protein having the enzymatic activity of amylosucrase.

В соответствии с изобретением последовательность ДНК, кодирующую амилосахаразу, сцепляют в смысловой ориентации с промотором (3'-конец промотора с 5'-концом кодирующей последовательности). Указанная последовательность может быть модифицирована до или после сцепления с элементами, контролирующими транскрипцию (промотором и сигналом окончания транскрипции), чтобы изменять при необходимости свойства полипептида или его локализацию, как это более подробно описано ниже. Последовательность ДНК, представленная в SEQ ID No.1, например, кодирует внеклеточную амилосахаразу. Секреция обеспечивается сигнальной последовательностью, включающей 16 N-концевых остатков аминокислот, кодируемых нуклеотидами с 939 по 986 последовательности, представленной в SEQ ID No.1. Поскольку такие сигнальные последовательности прокариот обычно приводят к секреции протеина также и в растительных клетках, экспрессируемый протеин транспортируют в апопласт растения, когда используют последовательность, представленную в SEQ ID No.1.In accordance with the invention, the DNA sequence encoding an amylosaccharase is linked in the sense orientation to the promoter (3'-end of the promoter with the 5'-end of the coding sequence). The indicated sequence can be modified before or after coupling to transcription controlling elements (promoter and transcription end signal) to change, if necessary, the properties of the polypeptide or its localization, as described in more detail below. The DNA sequence presented in SEQ ID No.1, for example, encodes extracellular amylosucrose. Secretion is provided by a signal sequence comprising 16 N-terminal amino acid residues encoded by nucleotides 939 to 986 of the sequence shown in SEQ ID No.1. Since such prokaryotic signal sequences typically result in protein secretion also in plant cells, the expressed protein is transported to the plant apoplast when the sequence shown in SEQ ID No.1 is used.

Для осуществления экспрессии фермента в цитозоле растительных клеток сигнальная последовательность, оказывающая воздействие на секрецию, должна быть удалена. Если фермент, подлежащий экспрессии должен быть связан с определенными внутренними компартменами, такими как хлоропласты, амилопласты, митохондрии или вакуоли, сигнальная последовательность, оказывающая воздействие на секрецию, должна быть заменена на сигнальную последовательность или на последовательность, кодирующую транзитный пептид, который обеспечивает транспорт экспрессируемого протеина к соответствующему компартменту. Подобные последовательности известны. Для транспорта в пластиды, например, пригодны транзитные пептиды пептидов-предшественников малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы (рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилаза/оксигеназа RUBISCO) из картофеля (Wolter и др., 1988, Proc. Acad. Sci. USA 85: 846-850) или протеин-носитель ацила (АСР). Для транспорта в вакуооли, например, может быть использована сигнальная последовательность пататина (Sonnewald и др., 1991, Plant' J. 1: 95-106). Применяемые последовательности должны быть слиты в матрице с последовательностью ДНК, кодирующей фермент.For the expression of the enzyme in the cytosol of plant cells, the signal sequence that affects the secretion must be removed. If the enzyme to be expressed must be bound to certain internal compartments, such as chloroplasts, amyloplasts, mitochondria, or vacuoles, the signal sequence that affects secretion must be replaced by a signal sequence or a sequence encoding a transit peptide that allows transport of the expressed protein to the corresponding compartment. Similar sequences are known. For transport to plastids, for example, transit peptides of the peptide precursors of the small subunit of ribulose bisphosphate carboxylase (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase RUBISCO) from potatoes are suitable (Wolter et al., 1988, Proc. Acad. Sci. USA 85: 846-850 ) or acyl carrier protein (ACP). For transport in vacuoles, for example, a patatin signal sequence can be used (Sonnewald et al., 1991, Plant 'J. 1: 95-106). The sequences used must be fused in a matrix with the DNA sequence encoding the enzyme.

Перенос полигенного экспрессирующего кластера, сконструированного на стадии (а) способа, в растительные клетки предпочтительно осуществляют с использованием плазмид, например бинарных плазмид.The transfer of the polygenic expression cluster constructed in step (a) of the method to plant cells is preferably carried out using plasmids, for example binary plasmids.

Предпочтительно использовать методики, гарантирующие стабильную интеграцию полигенного экспрессирующего кластера в геном трансформированной растительной клетки.It is preferable to use methods that guarantee stable integration of the expression cassette into the genome of the transformed plant cell.

Способ по изобретению в основном может быть применен к любым видам растений. Интерес представляют как однодольные, так и двудольные растения. Методики трансформации были описаны ранее для различных видов однодольных и двудольных растений.The method according to the invention can mainly be applied to any species of plants. Of interest are both monocotyledonous and dicotyledonous plants. Transformation techniques have been described previously for various species of monocotyledonous and dicotyledonous plants.

Последовательности ДНК по изобретению дают возможность модифицировать растения так, что они экспрессируют протеины, обладающие ферментативной активностью амилосахаразы, позволяя тем самым осуществлять в растениях синтез линейных α-1,4-глюканов. Поскольку α-1,4-глюканы с точки зрения их строения идентичны синтезируемой в растениях амилозе, то возможно получать растения, которые синтезируют чистую амилозу, и модифицировать растения, вырабатывающие крахмал, таким образом, чтобы они синтезировали крахмал с более высокой пропорцией амилозы.The DNA sequences of the invention make it possible to modify the plants so that they express proteins having the enzymatic activity of amylosucrase, thereby allowing the synthesis of linear α-1,4-glucans in plants. Since α-1,4-glucans are identical in structure to the amylose synthesized in plants, it is possible to obtain plants that synthesize pure amylose and modify plants that produce starch so that they synthesize starch with a higher proportion of amylose.

В большинстве растений продукты, образовавшиеся в результате поглощения света в процессе фотосинтеза, транспортируются по растению к соответствующим органам-мишеням в виде сахаров, более конкретно в основном в виде сахарозы. Поскольку субстратом для реакции полимеризации амилосахаразы является сахароза, указанный выше способ главным образом дает возможность модифицировать в отношении экспрессии амилосахаразы все растения, как двудольные, так и однодольные. Предпочтительными являются культурные растения, такие как кукуруза, рис, пшеница, ячмень, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, картофель или маниок, а также определенные виды фруктовых и овощных культур, в том числе яблоневые, сливы, морковь или томаты.In most plants, products resulting from the absorption of light during photosynthesis are transported throughout the plant to the corresponding target organs in the form of sugars, more specifically in the form of sucrose. Since sucrose is the substrate for the amylosucrase polymerization reaction, the above method mainly makes it possible to modify all plants, both dicotyledonous and monocotyledonous, in relation to amylosaccharose expression. Crop plants such as corn, rice, wheat, barley, sugar beets, sugarcane, tobacco, potatoes or cassava are preferred, as well as certain types of fruit and vegetable crops, including apple, plum, carrot or tomato.

Экспрессия амилосахаразной активности в растениях может, среди прочего, применяться для изменения в результате синтеза линейных α-1,4-глюканов вязкости получаемых из растений экстрактов. В этой связи интерес представляют томаты. В результате экспрессии амилосахаразы в плодах томатов происходит синтез линейных α-1,4-глюканов, что приводит к увеличению вязкости экстрактов, получаемых из этих плодов.The expression of amylosucrose activity in plants can, among other things, be used to alter the viscosity of extracts obtained from plants as a result of the synthesis of linear α-1,4-glucans. In this regard, tomatoes are of interest. As a result of the expression of amylosucrase in tomato fruits, the synthesis of linear α-1,4-glucans occurs, which leads to an increase in the viscosity of extracts obtained from these fruits.

Экспрессия амилосахаразы, кроме того, особенно целесообразна в тех органах растений, в которых запасается большое количество сахарозы. Такими органами являются, например, корнеплод сахарной свеклы или стебель сахарного тростника. Поскольку эти растения в норме не синтезируют какое-либо заметное количество крахмала, из этих растений могут быть выделены в чистом виде синтезируемые амилозой α-1,4-глюканы.The expression of amylosaccharase, in addition, is especially appropriate in those organs of plants in which a large amount of sucrose is stored. Such organs are, for example, a sugar beet root crop or a sugarcane stalk. Since these plants normally do not synthesize any appreciable amount of starch, α-1,4-glucans synthesized by amylose can be isolated from these plants in pure form.

Местом биосинтеза сахарозы в растительных клетках является цитозоль. Однако местом ее запасания является вакуоль. В процессе транспорта к запасающей ткани сахарной свеклы или картофеля или в процессе транспорта в эндосперм семян сахароза должна пройти через апопласт. Следовательно, все три компартмента клетки, т.е. цитозоль, вакуоль и апопласт, могут рассматриваться как пригодные для экспрессии амилосахаразы при синтезе линейных глюканов.The site of sucrose biosynthesis in plant cells is cytosol. However, the place of its storage is vacuole. During transport to the storage tissue of sugar beets or potatoes or during transport to the endosperm of seeds, sucrose must pass through the apoplast. Therefore, all three cell compartments, i.e. cytosol, vacuole and apoplast can be considered as suitable for the expression of amylosucrase in the synthesis of linear glucans.

В растениях, вырабатывающих крахмал, таких как картофель или кукуруза, у которых синтез крахмала и накопление крахмала обычно происходит в амилопластах, экспрессия амилосахаразы в апопласте, цитозоле или в вакуоли должна привести к дополнительному синтезу глюканов в этих компартментах, что означает значительное увеличение полезной продуктивности.In plants producing starch, such as potatoes or corn, in which starch synthesis and starch accumulation usually occur in amyloplasts, the expression of amylosucrase in the apoplast, cytosol or vacuole should lead to an additional synthesis of glucans in these compartments, which means a significant increase in useful productivity.

Поскольку картофель в процессе выделения крахмала дает возможность отделить крахмал, синтезированный в амилопластах, от линейных α-1,4-глюканов, синтезированных с помощью амилосахаразы в апопласте, в цитозоле или в вакуоли, одно и то же растение может использоваться для получения как крахмала, так и линейных α-1,4-глюканов.Since potatoes in the process of starch isolation make it possible to separate starch synthesized in amyloplasts from linear α-1,4-glucans synthesized using amylosaccharase in the apoplast, in the cytosol or in vacuole, the same plant can be used as starch, and linear α-1,4-glucans.

Кроме того, известны трансгенные растения картофеля и растения кукурузы, в которых путем ингибирования АДФ-глюкозопирофосфорилазы с помощью антисмыловой конструкции полностью подавляют синтез крахмала в клубнях и зернах соответственно. Вместо этого, например, у картофеля в клубнях аккумулируются растворимые сахара, в частности сахароза и глюкоза (Müller-Röber и др., 1992, EMBO J. 11: 1229-1238; ЕР-А-0455316). С помощью экспрессии амилосахаразы в цитозоле, вакуоли или апопласте этих растений, т.е. в компартментах, в которых отсутствуют разветвленные ферменты, можно достигнуть синтеза крахмала с высоким содержанием амилозы, т.е. крахмала, состоящего в основном из линейных α-1,4-глюканов. Механизм реакции, которая катализируется амилосахаразой, характеризуется тем, что остаток глюкозы непосредственно переносится от сахаразы к линейному глюкану. В процессе биосинтеза линейных глюканов из сахарозы в растениях сахароза сначала разлагается на глюкозу и фруктозу, которые в свою очередь превращаются в активированную промежуточную форму АДФ-глюкозы. Остаток глюкозы из АДФ-глюкозы с помощью фермента синтеза крахмала переносится к уже существующему глюкану, высвобождаяя при этом АДФ. Превращение сахарозы в две молекулы АДФ-глюкозы происходит в несколько стадий с поглощением энергии.In addition, transgenic potato plants and maize plants are known in which, by inhibiting ADP-glucose pyrophosphorylase using an anti-soap construct, completely inhibit starch synthesis in tubers and grains, respectively. Instead, for example, soluble sugars, in particular sucrose and glucose, accumulate in potatoes in tubers (Müller-Röber et al., 1992, EMBO J. 11: 1229-1238; EP-A-0455316). By the expression of amylosaccharase in the cytosol, vacuole or apoplast of these plants, i.e. in compartments without branched enzymes, starch synthesis with a high amylose content, i.e. starch, consisting mainly of linear α-1,4-glucans. The reaction mechanism, which is catalyzed by amylosaccharase, is characterized by the fact that the glucose residue is directly transferred from sucrose to linear glucan. In the process of biosynthesis of linear glucans from sucrose in plants, sucrose first decomposes into glucose and fructose, which in turn turn into an activated intermediate form of ADP-glucose. The glucose residue from ADP-glucose is transferred to the existing glucan using the starch synthesis enzyme, releasing ADP. The conversion of sucrose into two molecules of ADP-glucose occurs in several stages with the absorption of energy.

Следовательно, энергетический баланс реакции, катализируемой амилосахаразой, значительно лучше энергетического баланса синтеза сахарозы из амилозы в растительных клетках, что приводит к увеличению выхода синтезированных глюканов в растениях, экспрессирующих амилосахаразную активность.Therefore, the energy balance of the reaction catalyzed by amylosaccharase is much better than the energy balance of the synthesis of sucrose from amylose in plant cells, which leads to an increase in the yield of synthesized glucans in plants expressing amylosucrose activity.

Известно много клонирующих векторов, содержащих в доступной форме сигнал репликации для E.coli и ген-маркер для отбора трасформированных бактериальных клеток, которые могут применяться для достижения интродукции чужеродных генов в высшие растения. Примерами таких векторов являются pBR322, серии pUC, серии M13mp, pACYC184 и т.д. Требуемая последовательность может быть интродуцирована в вектор в соответствующем сайте рестрикции. Полученную плазмиду применяют для трансформации клеток E.coli. Трансформированные клетки E.coli культивируют в соответствующей среде и затем собирают и подвергают лизису. Плазмиду регенерируют. Методами анализа, обычно применяемыми для характеризации получаемых плазмид ДНК, являются рестрикционный анализ, гель-электрофорез, реакции секвенирования и другие способы, известные в биохимии и молекулярной биологии. После каждой операции ДНК плазмиды может быть расщеплена и сцеплена с другими последовательностями ДНК. Каждая последовательность плазмидной ДНК может быть клонирована в такой же или в других плазмидах.Many cloning vectors are known that contain an accessible form of a replication signal for E. coli and a marker gene for selecting transformed bacterial cells that can be used to achieve the introduction of foreign genes into higher plants. Examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184, etc. The desired sequence can be introduced into the vector at the corresponding restriction site. The resulting plasmid is used to transform E. coli cells. Transformed E. coli cells are cultured in an appropriate medium and then harvested and lysed. The plasmid is regenerated. Analysis methods commonly used to characterize the resulting DNA plasmids are restriction analysis, gel electrophoresis, sequencing reactions and other methods known in biochemistry and molecular biology. After each operation, the plasmid DNA can be cleaved and linked to other DNA sequences. Each plasmid DNA sequence can be cloned in the same or in other plasmids.

Для интродукции ДНК в растительную клетку-хозяина пригодны многочисленные методики. Эти методики включают трансформацию растительных клеток с помощью Т-ДНК с использованием Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующих агентов, слияние протопластов, инъекцию, электропорацию ДНК, интродукцию ДНК биобаллистическим методом, а также другие возможные методики. В зависимости от способа интродукции требуемых генов в растительные клетки могут быть необходимы другие последовательности ДНК. Если, например, для трансформации растительных клеток применяют Ti- или Ri-плазмиду, то по крайней мере правая пограничная последовательность, хотя часто и правая, и левая пограничная последовательность Т-ДНК Ti- или Ri-плазмид должны быть сцеплены с генами, подлежащими интродукции в качестве фланкирующей области.Numerous techniques are suitable for introducing DNA into a plant host cell. These techniques include transforming plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as transforming agents, protoplast fusion, injection, DNA electroporation, DNA introduction by the ballistic method, and other possible techniques. Depending on the method of introducing the required genes into plant cells, other DNA sequences may be necessary. If, for example, a Ti- or Ri plasmid is used to transform plant cells, then at least the right border sequence, although often the right and left border T-DNA sequence of Ti- or Ri plasmids, must be linked to the genes to be introduced as a flanking area.

Если для трансформации применяют Agrobacteria, то интродукцируемую ДНК необходимо клонировать в специальных плазмидах, т.е. либо в промежуточном векторе, либо в бинарном векторе. Промежуточные векторы могут быть интегрированы в Ti- или Ri-плазмиду Agrobacteria путем гомологичной рекомбинации, поскольку их последовательности гомологичны последовательностям Т-ДНК. Промежуточные векторы не способны реплицироваться в Agrobacteria. Промежуточный вектор может быть перенесен в Agrobacterium tumefaciens с использованием плазмиды-хелпера (конъюгация). Бинарные векторы способны реплицироваться как в E.coli, так и в Agrobacteria. Они содержат ген-маркер селекции и линкер или полилинкер, которые ограничены справа и слева пограничными областями Т-ДНК. Они могут быть непосредственно трансформированы в Agrobacteria (Holsters и др., 1978, Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). Agrobacterium, которая служит в качестве клетки-хозяина, может содержать плазмиду, несущую vir-область. vir-Область необходима для переноса Т-ДНК в клетку растения. В ней может присутствовать дополнительная Т-ДНК. Трансформированную таким образом Agrobacterium используют для трансформации растительных клеток.If Agrobacteria is used for transformation, the introduced DNA must be cloned in special plasmids, i.e. either in an intermediate vector or in a binary vector. Intermediate vectors can be integrated into the Agrobacteria Ti- or Ri plasmid by homologous recombination, since their sequences are homologous to T-DNA sequences. Intermediate vectors are not able to replicate in Agrobacteria. The intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens using a helper plasmid (conjugation). Binary vectors are able to replicate in both E. coli and Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are limited to the right and left border regions of T-DNA. They can be directly transformed into Agrobacteria (Holsters et al., 1978, Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). Agrobacterium, which serves as the host cell, may contain a plasmid carrying the vir region. The vir region is necessary for the transfer of T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present in it. Agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.

Применение Т-ДНК для трансформации растительных клеток интенсивно исследовалось и достаточно полно описано в ЕР 120516; у Hoekema и др. в The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam, 1985, глава V; Fraley и др., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46, и у An и др.; 1985, EMBO J. 4: 277-287.The use of T-DNA for the transformation of plant cells has been extensively studied and described quite fully in EP 120516; Hoekema et al. at The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam, 1985, chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46, and An et al .; 1985, EMBO J. 4: 277-287.

Для переноса ДНК в растительные клетки может оказаться целесообразным культивировать эксплантаты растений совместно с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes. Из зараженного растительного материала (например, из кусочков листьев, сегментов стеблей, корней, а также протопластов или клеток растений, выращенных в суспензии) в соответствующей среде, которая может содержать антибиотики или биоциды для отбора трансформированных клеток, может быть регенерировано целое растение. Полученные таким образом растения могут быть подвергнуты исследованию на присутствие интродуцированной ДНК.To transfer DNA to plant cells, it may be appropriate to cultivate plant explants together with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. An entire plant can be regenerated from infected plant material (for example, from pieces of leaves, segments of stems, roots, and also protoplasts or plant cells grown in suspension) in an appropriate medium that may contain antibiotics or biocides to select transformed cells. The plants thus obtained can be examined for the presence of introduced DNA.

Для плазмид, используемых для инъекции и электропорации ДНК в растительных клетках, не существует конкретных требований. Могут применяться простые плазмиды, такие как производные pUC. Однако если требуется регенерировать целые растения из таких трансформированных клеток, необходимо присутствие селектируемого маркера.For plasmids used for injection and electroporation of DNA in plant cells, there are no specific requirements. Simple plasmids, such as pUC derivatives, may be used. However, if it is desired to regenerate whole plants from such transformed cells, the presence of a selectable marker is necessary.

Если интродуцированнную ДНК интегрируют в геном растительной клетки, она обычно сохраняет там стабильность и также может быть обнаружена в следующем поколении первоначально трансформированной клетки. Обычно она содержит маркер селекции, который придает трансформированным растительным клеткам устойчивость к биоциду или антибиотику, такому, как канамицин, G 418, блеомицин, гигромицин или глуфозинат и т.д. Таким образом, индивидуально подобранный маркер должен давать возможность отличать трансформированные клетки от клеток, лишенных интродуцированной ДНК.If the introduced DNA is integrated into the genome of a plant cell, it usually remains stable there and can also be found in the next generation of the originally transformed cell. It usually contains a selection marker that confers transformed plant cells resistance to a biocide or antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or glufosinate, etc. Thus, an individually selected marker should make it possible to distinguish transformed cells from cells lacking introduced DNA.

Трансформированные клетки развиваются внутри растения как обычные клетки (ср., например, McCormick и др., 1986, Plant Cell Reports 5: 81-84). Такие растения могут быть выращены обычным образом и могут быть скрещены с растениями, которые имеют такой же трансформированный генетический код или другие генетические коды. Образовавшиеся в результате этого гибридные особи обладают соответствующими фенотипическими свойствами.Transformed cells develop within the plant like ordinary cells (cf., for example, McCormick et al., 1986, Plant Cell Reports 5: 81-84). Such plants can be grown in the usual way and can be crossed with plants that have the same transformed genetic code or other genetic codes. The resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties.

Чтобы гарантировать стабильное закрепление и наследование фенотипических особенностей, необходимо получить два или несколько поколений. Кроме того, для подтверждения стабильного закрепления соответствующего фенотипа или других характеристик должен быть собран урожай семян.To guarantee stable fixation and inheritance of phenotypic features, it is necessary to obtain two or more generations. In addition, a seed crop must be harvested to confirm the stable fixation of the corresponding phenotype or other characteristics.

Еще одним предметом изобретения являются модифицированные растительные клетки и растения, полученные с помощью вышеуказанного процесса по изобретению, в частности растительные клетки и растения, содержащие последовательность ДНК по изобретению в сочетании с последовательностями ДНК, которые позволяют осуществлять экспрессию последовательности ДНК по изобретению в растительных клетках. Указанные растительные клетки характеризуются наличием экспрессии протеина, обладающего ферментативной активностью амилосахаразы, приводящей тем самым к синтезу линейных α-1,4-глюканов в клетках или растениях. Для трансгенных растительных клеток и растений, кроме того, характерно то, что они содержат рекомбинантную молекулу ДНК, которая стабильно интегрирована в их геном и которая содержит полигенный экспрессирующий кластер, причем полигенный экспрессирующий кластер содержит последовательность ДНК, кодирующую амилосахаразу.Another subject of the invention is modified plant cells and plants obtained by the above process according to the invention, in particular plant cells and plants containing the DNA sequence of the invention in combination with DNA sequences that allow expression of the DNA sequence of the invention in plant cells. These plant cells are characterized by the presence of expression of a protein having the enzymatic activity of amylosucrase, thereby leading to the synthesis of linear α-1,4-glucans in cells or plants. It is also characteristic of transgenic plant cells and plants that they contain a recombinant DNA molecule that is stably integrated into their genome and which contains a polygenic expression cluster, wherein the polygenic expression cluster contains a DNA sequence encoding an amylosucrose.

Линейные α-1,4-глюканы, образованные в трансгенных растительных клетках и растениях с помощью амилосахаразы, могут быть выделены из трансгенных растительных клеток и растений таким же образом, что и образующийся нормальным образом крахмал. Они также составляют предмет настоящего изобретения.Linear α-1,4-glucans formed in transgenic plant cells and plants using amylosucrase can be isolated from transgenic plant cells and plants in the same way as starch formed in a normal way. They also form the subject of the present invention.

Кроме того, изобретение относится к применению последовательностей ДНК по изобретению или их частей для экспрессии полипептида, обладающего амилосахаразной активностью, предпочтительно в микроорганизмах, не обладающих собственной амилосахаразной активностью.In addition, the invention relates to the use of DNA sequences of the invention or parts thereof for the expression of a polypeptide having amylosucrase activity, preferably in microorganisms that do not have their own amylosucrose activity.

В настоящей заявке под микроорганизмами понимают бактерии, а также все одноклеточные организмы, как они определены, например, у Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1985, стр.1-2).In the present application, microorganisms are understood to mean bacteria, as well as all unicellular organisms, as defined, for example, by Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1985, pp. 1-2).

В настоящее время в биотехнологических исследованиях для синтеза и получения огромного разнообразия веществ в большой степени используются микроорганизмы. Это стало возможным благодаря разработке множества различных систем для эффективной экспрессии генов прокариот и эукариот в микроорганизмах (см., например, обзор Methods in Enzymology 153: 385-516). Широкое применение нашли, например, штаммы таких видов бактерий, как Escherichia coli и Bacillus subtilis. Для получения последовательностей ДНК по изобретению, в частности последовательности ДНК, представленной в SEQ ID No.1, в настоящее время возможно экспрессировать протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, в микроорганизмах, для которых доступны соответствующие системы экспрессии.Currently, in biotechnological research, microorganisms are used to a large extent for the synthesis and production of a huge variety of substances. This was made possible by the development of many different systems for efficient expression of prokaryotic and eukaryotic genes in microorganisms (see, for example, Methods in Enzymology 153: 385-516). Widespread use, for example, strains of bacterial species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In order to obtain the DNA sequences of the invention, in particular the DNA sequence shown in SEQ ID No.1, it is now possible to express a protein having the amylosucrose enzyme activity in microorganisms for which appropriate expression systems are available.

Настоящее изобретение в частности относится к способу получения микроорганизмов, способных синтезировать внутриклеточно или внеклеточно линейные α-1,4-глюканы, в соответствии с которым последовательность ДНК по изобретению интродуцируют и экспрессируют в микроорганизме. Указанный процесс, например, может включать следующие стадии:The present invention in particular relates to a method for producing microorganisms capable of synthesizing intracellular or extracellular linear α-1,4-glucans, in accordance with which the DNA sequence of the invention is introduced and expressed in the microorganism. The specified process, for example, may include the following stages:

(а) получение полигенного экспрессирующего кластера, имеющего следующие частичные последовательности:(a) obtaining a polygenic expression cluster having the following partial sequences:

(I) промотор, активный в выбранном микроорганизме и обеспечивающий транскрипцию последовательности ДНК в прямом направлении от него;(I) a promoter that is active in the selected microorganism and transcribes the DNA sequence in the forward direction from it;

(II) последовательность ДНК, кодирующую амилосахаразу и слитую с промотором в смысловой ориентации;(Ii) a DNA sequence encoding an amylosaccharase and fused to a promoter in a sense orientation;

(III) функционирующий в микроорганизмах сигнал для прекращения транскрипции;(Iii) a signal functioning in microorganisms to terminate transcription;

(б) трансформацию соответствующего микроорганизма с помощью полигенного экспрессирующего кластера, полученного на стадии (а).(b) transformation of the corresponding microorganism using a polygenic expression cluster obtained in stage (a).

Векторы экспресии подробно описаны в данной области техники. В дополнение к гену-маркеру селекции и собственному репликону, обеспечивающему репликацию в выбранном хозяине, они обычно содержат бактериальный или вирусный промотор и сигнал прекращения траскрипции. Между промотором и сигналом прекращения траскрипции присутствует по крайней мере один сайт рестрикции или один полилинкер, который позволяет осуществить инсерцию кодирующей последовательности ДНК. В качестве промоторной последовательности можно применять последовательность ДНК, которая обычно контролирует транскрипцию соответствующего гена, при условии, что она проявляет активность в выбранном организме. Эта последовательность может быть замещена другими промоторными последовательностями. Могут применяться промоторы, которые оказывают воздействие на конститутивную экспрессию гена, или индуцируемые промоторы, позволяющие селективно регулировать экспрессию гена в прямом направлении от него. Бактериальные и вирусные промоторные последовательности, обладающие указанными свойствами, подробно описаны в данной области техники. К промоторам, позволяющим осуществлять наиболее сильную экспрессию гена в прямом направлении от него, относятся например, Т7-промотор (Studier и др., 1990, в Methods in Enzymology 185: 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer и др., в Rodriguez, R.L. и Chamberiin, M.J. (ред.). Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, 1982, стр. 462-481; DeBoer и др., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25), Ipp гас (Boros и др., 1986, Gene 42: 97-100) или промотор ompF.Expression vectors are described in detail in the art. In addition to the selection marker gene and their own replicon, which provides replication in the selected host, they usually contain a bacterial or viral promoter and a signal for termination of transcription. At least one restriction site or one polylinker is present between the promoter and the transcriptional termination signal, which allows the insertion of the coding DNA sequence. As the promoter sequence, you can use the DNA sequence, which usually controls the transcription of the corresponding gene, provided that it is active in the selected organism. This sequence may be substituted by other promoter sequences. Promoters that affect the constitutive expression of a gene, or inducible promoters that selectively regulate gene expression in the forward direction from it, can be used. Bacterial and viral promoter sequences having these properties are described in detail in the art. Promoters that allow the most powerful gene expression in the forward direction from it include, for example, the T7 promoter (Studier et al., 1990, Methods in Enzymology 185: 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer and et al., Rodriguez, RL and Chamberiin, MJ (eds.) Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, 1982, pp. 462-481; DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25), Ipp Gas (Boros et al., 1986, Gene 42: 97-100) or the ompF promoter.

Последовательность ДНК, указанная в пункте (II) стадии (а) процесса, может представлять собой любую последовательность ДНК, кодирующую протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы. Предпочтительно применяют последовательности ДНК, которые имеют происхождение из микроорганизмов, в частности грамотрицательных бактерий, предпочтительно рода Neisseria и особенно предпочтительно из Neisseria polysaccharea. В особенно предпочтительном варианте осуществления последовательность ДНК имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID No.1, или последовательность ДНК, которую гибридизируют с ней и которая кодирует протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, причем эта последовательность сцеплена с промотором в смысловой ориентации (3'-конец промотора с 5'-концом кодирующей последовательности).The DNA sequence specified in paragraph (II) of stage (a) of the process may be any DNA sequence encoding a protein having the enzymatic activity of amylosucrase. Preferably, DNA sequences are used which are derived from microorganisms, in particular gram-negative bacteria, preferably of the genus Neisseria and particularly preferably of Neisseria polysaccharea. In a particularly preferred embodiment, the DNA sequence has the nucleotide sequence shown in SEQ ID No.1, or a DNA sequence that is hybridized with it and which encodes a protein having the enzymatic activity of amylosucrase, and this sequence is linked to the promoter in a sense orientation (3'- the end of the promoter with the 5'-end of the coding sequence).

Применяемая последовательность может быть модифицирована либо до, либо после интеграции в вектор экспрессии, чтобы при необходимости изменять свойства полипептида или его локализацию, как более подробно описано выше.The sequence used can be modified either before or after integration into the expression vector in order to change the properties of the polypeptide or its localization, if necessary, as described in more detail above.

Вместо последовательности, представленной в последовательности SEQ ID No.1, могут применяться последовательности ДНК, которые могут быть получены из указанной последовательности путем замещения, инсерции или делеции, если при этом не ухудшается ферментативная активность кодируемого протеина.Instead of the sequence shown in SEQ ID No.1, DNA sequences can be used that can be obtained from the indicated sequence by substitution, insertion or deletion, if the enzymatic activity of the encoded protein is not impaired.

Трансформация микроорганизмов на стадии (б) обычно может быть осуществлена с помощью стандартных методик, таких как описанные у Maniatis и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).The transformation of microorganisms in stage (b) can usually be carried out using standard techniques, such as described by Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Трансформированный микроорганизм культивируют в среде, которая должна быть пригодной для потребностей конкретного используемого хозяина. Особенное внимание необходимо уделять значению рН, температуре, вентилированию и т.д.The transformed microorganism is cultured in an environment that must be suitable for the needs of the particular host used. Particular attention must be paid to pH, temperature, ventilation, etc.

Еще одним предметом изобретения являются микроорганизмы, которые получены описанным выше способом и которые характеризуются наличием последовательности ДНК, кодирующей амилосахаразу, причем последовательность является частью рекомбинантной молекулы ДНК. Указанная рекомбинантная молекула ДНК - в зависимости от использованного способа трансформации - может присутствовать в клетках либо вне генома, либо может быть стабильно интегрирована в геном клеток использованного микроорганизма.Another subject of the invention are microorganisms that are obtained as described above and which are characterized by the presence of a DNA sequence encoding an amylosucrose, the sequence being part of a recombinant DNA molecule. The indicated recombinant DNA molecule, depending on the transformation method used, may be present in the cells either outside the genome, or may be stably integrated into the cell genome of the used microorganism.

Амилосахараза, экспрессированная Neisseria polysaccharea, представляет собой внеклеточный фермент, который синтезирует линейные α-1,4-глюканы на основе сахарозы вне клеток. Для этого в отличие от большинства путей синтеза полисахаридов, протекающих внутри клетки, не требуются ни активированные производные глюкозы, ни кофакторы. Энергию, необходимую для образования α-1,4-глюкозидной связи между конденсированными остатками глюкозы, получают непосредственно за счет гидролиза связи между фрагментом глюкозы и фруктозы в молекуле сахарозы.Amylosaccharase expressed by Neisseria polysaccharea is an extracellular enzyme that synthesizes linear α-1,4-glucans based on sucrose outside of cells. For this, unlike most of the synthesis pathways of polysaccharides that occur inside the cell, neither activated glucose derivatives nor cofactors are required. The energy required for the formation of the α-1,4-glucoside bond between the condensed glucose residues is obtained directly by hydrolysis of the bond between the glucose and fructose fragment in the sucrose molecule.

Поэтому оказывается возможным выращивать секретирующие амилосахаразу микроорганизмы, которые были получены на стадиях описанного выше процесса, в среде, содержащей сахарозу, причем секретируемая амилоза приводит к синтезу линейных α-1,4-глюканов из сахарозы среды. Эти глюканы могут быть выделены из питательной среды.Therefore, it is possible to grow amylo-sucrose-secreting microorganisms that were obtained in the steps of the process described above in a medium containing sucrose, whereby secreted amylose leads to the synthesis of linear α-1,4-glucans from sucrose medium. These glucans can be isolated from the culture medium.

Кроме того, представляется возможным синтезировать α-1,4-глюканы in vitro путем получения фермента, лишенного клеток. В этом случае микроорганизмы, секретирующие амилосахаразу, выращивают в среде без сахарозы, давая возможность продолжать экспрессию амилосахаразы до достижения стационарной фазы роста. После удаления клеток из питательной среды путем центрифугирования секретированный фермент может быть получен из супернатанта. Затем для синтеза линейных α-1,4-глюканов фермент может быть добавлен в растворы, содержащие сахарозу. По сравнению с синтезом линейных α-1,4-глюканов непосредственно в питательной среде, содержащей сахарозу, преимуществом этого метода является то, что в этом случае условия реакции можно лучше контролировать и что продукты реакции оказываются существенно более чистыми и легче поддаются последующей очистке.In addition, it seems possible to synthesize α-1,4-glucans in vitro by producing an enzyme lacking cells. In this case, microorganisms secreting amylosaccharase are grown in a sucrose-free medium, allowing the expression of amylosaccharase to continue until a stationary growth phase is reached. After removing cells from the culture medium by centrifugation, a secreted enzyme can be obtained from the supernatant. Then, to synthesize linear α-1,4-glucans, the enzyme can be added to solutions containing sucrose. Compared to the synthesis of linear α-1,4-glucans directly in a saccharose-containing nutrient medium, the advantage of this method is that in this case the reaction conditions can be better controlled and that the reaction products turn out to be substantially cleaner and easier to clean.

Фермент может быть очищен из питательной среды с помощью обычных методов очистки, таких как осаждение, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, гель-фильтрация, ЖХВД-хроматография с обращенной фазой и т.д. Кроме того, возможно осуществлять экспрессию полипептида с помощью модифицированной последовательности ДНК, встроенной в вектор экспрессии, что приводит к получению полипептида, который вследствие своих определенных свойств может быть более легко выделен из питательной среды. Кроме того, возможно экспрессировать фермент в виде протеина, слитого с другой полипептидной последовательностью, чьи специфические характеристики связывания позволяют выделять слитый протеин с помощью аффинной хроматографии.The enzyme can be purified from the culture medium using conventional purification methods such as precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration, reverse phase HPLC, etc. In addition, it is possible to express the polypeptide using a modified DNA sequence inserted into the expression vector, which leads to the production of a polypeptide, which due to its specific properties can be more easily isolated from the nutrient medium. In addition, it is possible to express the enzyme in the form of a protein fused to a different polypeptide sequence, whose specific binding characteristics allow the fusion protein to be isolated by affinity chromatography.

Известными методами являются, например, экспрессия протеина, слитого с глутатион-S-трансферазой, и последующая очистка с помощью аффинной хроматографии на колонке с глутатионом, основанной на сродстве глутатион-S-трансферазы к глутатиону (Smith и Johnson, 1988, Gene 67: 31-40). Другим известным методом является экспрессия протеина, слитого с протеином, связывающим мальтозу, (ПСМ) и последующая очистка на амилозной колонке (Guan и др., 1988, Gene 67: 21-30; Maina и др., 1988, Gene 74: 365-373).Known methods are, for example, expression of a protein fused to glutathione S-transferase and subsequent purification by affinity chromatography on a glutathione column based on the affinity of glutathione S-transferase for glutathione (Smith and Johnson, 1988, Gene 67: 31 -40). Another known method is the expression of a protein fused to a maltose binding protein (PSM) and subsequent purification on an amylose column (Guan et al., 1988, Gene 67: 21-30; Maina et al., 1988, Gene 74: 365- 373).

Помимо возможности синтеза линейных α-1,4-глюканов путем непосредственного добавления очищенного фермента в раствор, содержащий сахарозу, существует другой способ, основанный на иммобилизации фермента на носителе. Преимущества такой иммобилизации состоят в том, что фермент как катализатор синтеза может быть легко возвращен в исходное состояние и может применяться несколько раз. Поскольку очистка ферментов обычно требует много времени и является дорогостоящей, иммобилизация и повторное использование фермента приводят к существенному снижению затрат. Другим преимуществом является высокая степень чистоты продуктов реакции, что, среди прочего, является следствием того факта, что условия реакции можно лучше контролировать в случае, когда используются иммобилизованные ферменты. Нерастворимые линейные глюканы, получаемые в виде продуктов реакции, затем легко могут быть подвергнуты дальнейшей очистке.In addition to the possibility of synthesizing linear α-1,4-glucans by directly adding the purified enzyme to a solution containing sucrose, there is another method based on the immobilization of the enzyme on a carrier. The advantages of such immobilization are that the enzyme as a synthesis catalyst can be easily returned to its original state and can be used several times. Since purification of enzymes is usually time consuming and expensive, immobilization and reuse of the enzyme leads to a significant reduction in costs. Another advantage is the high degree of purity of the reaction products, which, among other things, is a consequence of the fact that the reaction conditions can be better controlled when immobilized enzymes are used. The insoluble linear glucans obtained as reaction products can then easily be further purified.

Существует множество веществ, пригодных в качестве носителей для иммобилизации протеинов, которые могут быть связаны с носителем либо через ковалентные, либо через нековалентные связи (см. обзор Methods in Enzymology, тома 135, 136 и 137). Широко применяемыми в качестве носителей материалами являются, например, агароза, целлюлоза, полиакриламид, двуокись кремния или найлон.There are many substances that can be used as carriers for immobilizing proteins that can be bound to the carrier either through covalent or non-covalent bonds (see Methods in Enzymology, Volumes 135, 136 and 137). Widely used carrier materials are, for example, agarose, cellulose, polyacrylamide, silicon dioxide or nylon.

По аналогии с очищенным ферментом микроорганизмы, экспрессирующие необходимый полипептид или секретирующие конкретный метаболит, также могут быть иммобилизованы. Обычно иммобилизация достигается путем включения клеток в соответствующее вещество, такое как, например, альгинат, полиакриламид, желатин, целлюлозу или хитозан. Однако также можно адсорбировать или ковалентно связывать клетки с носителем (см. Brodelius и Mosbach, в Methods in Enzymology, том 135: 173-175). Преимуществом иммобилизации клеток является то, что в этом случае может быть получена существенно более высокая плотность клеток по сравнению с культиварованием в жидкой среде, приводящая к более высокой продуктивности. В этом случае затраты на смешение и вентиляцию культуры, а также на поддержание ее стерильности являются более низкими. Важным аспектом является то, что иммобилизация дает возможность организации непрерывного производства, поскольку при этом можно избежать или существенно сократить продолжительные непродуктивные фазы, которые обычно имеют место в процессах ферментации.By analogy with a purified enzyme, microorganisms expressing the desired polypeptide or secreting a particular metabolite can also be immobilized. Typically, immobilization is achieved by incorporating cells into an appropriate substance, such as, for example, alginate, polyacrylamide, gelatin, cellulose or chitosan. However, it is also possible to adsorb or covalently bind cells to a carrier (see Brodelius and Mosbach, Methods in Enzymology, Volume 135: 173-175). The advantage of cell immobilization is that in this case, a significantly higher cell density can be obtained compared to cultivation in a liquid medium, leading to higher productivity. In this case, the costs of mixing and ventilation of the culture, as well as maintaining its sterility are lower. An important aspect is that immobilization makes it possible to organize continuous production, since this can avoid or significantly reduce the lengthy unproductive phases that usually occur in fermentation processes.

Подобно микроорганизмам последовательности ДНК по изобретению также могут применяться для экспрессии амилосахаразной активности в грибах, в частности в дрожжевых грибах, например в Saccharomyces cerevisiae. Векторы, применяемые для экспрессии гетерологичных генов в дрожжах, описаны в литературе (например, у Bitter и др., Methods in Enzymology, 153: 516-544). В дополнение к гену-маркеру селекции и сайту инициации репликации для культивирования в бактериях эти векторы содержат по крайней мере один дополнительный ген-маркер селекции, позволяющий идентифицировать трансформированные клетки дрожжей, последовательность ДНК, позволяющую осуществлять репликацию в дрожжах, и полилинкер для встраивания требуемого полигенного экспрессирующего кластера. Полигенный экспрессирующий кластер конструируют из промотора, последовательности ДНК, подлежащей экспрессии, и последовательности ДНК, осуществляющей окончание транскрипции и полиаденилирование транскрипта. Промоторы и сигналы окончания транскрипции из Saccharomyces также описаны в литературе и являются доступными. Вектор экспрессии может быть интродуцирован в клетки дрожжей путем трансформации в соответствии с обычными методами (см. Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Клетки, содержащие вектор, отбирают и культивируют в соответствующей селекционной среде. Кроме того, клетки дрожжей дают возможность интегрировать полигенный экспрессирующий кластер в геном клетки путем гомологичной рекомбинации с использованием соответствующего вектора, приводящего к стабильному наследованию признаков.Like microorganisms, the DNA sequences of the invention can also be used to express amylosaccharase activity in fungi, in particular in yeast fungi, for example in Saccharomyces cerevisiae. The vectors used to express heterologous genes in yeast are described in the literature (e.g., in Bitter et al., Methods in Enzymology, 153: 516-544). In addition to the selection marker gene and the site of replication initiation for cultivation in bacteria, these vectors contain at least one additional selection marker gene that identifies transformed yeast cells, a DNA sequence that allows replication in yeast, and a polylinker for embedding the desired polygenic expression a cluster. The expression polygenic cluster is constructed from a promoter, a DNA sequence to be expressed, and a DNA sequence that terminates transcription and polyadenylates the transcript. Saccharomyces promoters and transcriptional termination signals are also described in the literature and are available. The expression vector can be introduced into yeast cells by transformation in accordance with conventional methods (see Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Cells containing the vector are selected and cultured in an appropriate selection medium. In addition, yeast cells make it possible to integrate the polygenic expression cluster into the cell genome by homologous recombination using the appropriate vector, leading to stable inheritance of characters.

По аналогии с микроорганизмами для получения секретируемой амилосахаразы также могут использоваться штаммы дрожжей, экспрессирующие амилосахаразу. Методы культивирования дрожжей в литературе описаны достаточно полно (см., например, Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Также возможна иммобилизация дрожжей, и этот метод уже нашел применение для получения этанола в экономически значимых масштабах (Nagashima и др., в Methods in Enzymology, том 136: 394-405; Nojima и Yamada, в Methods in Enzymology, том 136: 380-394).By analogy with microorganisms, yeast strains expressing amylosaccharase can also be used to produce secreted amylosucrase. Methods of culturing yeast in the literature are described quite fully (see, for example, Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Yeast immobilization is also possible, and this method has already found application for the production of ethanol on an economically significant scale (Nagashima et al., In Methods in Enzymology, vol. 136: 394-405; Nojima and Yamada, in Methods in Enzymology, vol. 136: 380- 394).

Однако применение дрожжей, секретирующих амилосахаразу, для синтеза линейных α-1,4-глюканов в среде, содержащей сахарозу, пока представляется проблематичным, поскольку дрожжи секретируют инвертазу, осуществляющую гидролиз внеклеточной сахарозы. Дрожжи получают образовавшиеся гексозы с помощью переносчика гексозы. Однако у Gozalbo и Hohmann (1990, Current Genetics 17, 77-79) описан штамм дрожжей, который несет дефектный ген suc2 и в результате не может секретировать инвертазу. Кроме того, эти клетки дрожжей не имеют транспортной системы для доставки сахарозы в клетки. Если указанный штамм модифицируют с помощью последовательности ДНК по изобретению таким образом, чтобы он секретировал амилосахаразу в среде для культивирования, амилосахараза осуществляет синтез линейных α-1,4-глюканов, если питательная среда содержит сахарозу. Фруктоза, образующаяся в качестве продукта реакции, затем может поступать в клетки дрожжей.However, the use of amylosaccharose secreting yeast for the synthesis of linear α-1,4-glucans in a sucrose containing medium is still problematic, since the yeast secrete invertase, which hydrolyzes extracellular sucrose. Yeast gets the resulting hexoses using a hexose transporter. However, Gozalbo and Hohmann (1990, Current Genetics 17, 77-79) describe a yeast strain that carries the defective suc2 gene and as a result cannot secrete invertase. In addition, these yeast cells do not have a transport system for the delivery of sucrose to the cells. If the indicated strain is modified using the DNA sequence of the invention so that it secrets amylosaccharase in the culture medium, amylosaccharose synthesizes linear α-1,4-glucans if the culture medium contains sucrose. Fructose, formed as a reaction product, can then enter the yeast cells.

Таким образом, настоящее изобретение также отосится к способу получения клеток грибов, способных синтезировать либо внутриклеточно, либо внеклеточно линейные α-1,4-глюканы, при этом последовательность ДНК по изобретению интродуцируют в клетки грибов и экспрессируют. Указанный процесс в качестве примера может включать следующие стадии:Thus, the present invention also relates to a method for producing fungal cells capable of synthesizing either intracellular or extracellular linear α-1,4-glucans, wherein the DNA sequence of the invention is introduced into fungal cells and expressed. The specified process as an example may include the following stages:

(а) получение полигенного экспрессирующего кластера, имеющего следующие частичные последовательности:(a) obtaining a polygenic expression cluster having the following partial sequences:

(I) промотор, активный в выбранном грибе и обеспечивающий транскрипцию последовательности ДНК в прямом направлении от него;(I) a promoter that is active in the selected fungus and transcribes the DNA sequence in the forward direction from it;

(II) последовательность ДНК, кодирующую амилосахаразу и слитую с промотором в смысловой ориентации;(Ii) a DNA sequence encoding an amylosaccharase and fused to a promoter in a sense orientation;

(III) функционирующий в клетках гриба сигнал для прекращения транскрипции; и(III) a signal functioning in the cells of the fungus to terminate transcription; and

(б) трансформацию клеток гриба с помощью полигенного экспрессирующего кластера, сконструированного на стадии (а).(b) transformation of fungal cells using a polygenic expression cluster constructed in step (a).

Еще одним предметом настоящего изобретения является возможность получать чистый фруктозный сироп недорогим путем при использовании последовательностей ДНК по изобретению. Традиционные способы получения фруктозы предполагают либо ферментативный гидролиз сахарозы с использованием инвертазы, либо разложение крахмала до фрагментов глюкозы, часто путем ацидолиза, и последующее ферментативное превращение глюкозы во фруктозу при помощи глюкозоизомеразы. Оба метода приводят к получению смесей глюкозы и фруктозы. Оба компонента должны быть отделены друг от друга с помощью хроматографических методов.Another object of the present invention is the ability to obtain pure fructose syrup in an inexpensive way using the DNA sequences of the invention. Conventional methods for producing fructose involve either enzymatic hydrolysis of sucrose using invertase, or the decomposition of starch into glucose fragments, often by acidolysis, and subsequent enzymatic conversion of glucose to fructose using glucose isomerase. Both methods result in mixtures of glucose and fructose. Both components must be separated from each other by chromatographic methods.

Получение чистой фруктозы или чистого фруктозного сиропа с использованием протеина, обладающего ферментативной активностью амилосахаразы, предпочтительно осуществляют в лишенной клеток системе с использованием очищенного фермента. Последний может быть иммобилизован на соответствующем носителе или может присутствовать в растворенном виде. Наличие сахарозы приводит к синтезу линейных глюканов и к высвобождению фруктозы. Отделение субстрата от продуктов реакции или разделение двух продуктов реакции может быть достигнуто, например, с помощью мембран, проницаемых для фруктозы, но непроницаемых для сахарозы или глюканов. Если фруктозу непрерывно удаляют с помощью такой мембраны, сахароза более или менее полно превращается во фруктозу и линейные глюканы.The preparation of pure fructose or pure fructose syrup using a protein having the enzymatic activity of amylosucrase is preferably carried out in a cell-free system using a purified enzyme. The latter may be immobilized on an appropriate carrier or may be present in dissolved form. The presence of sucrose leads to the synthesis of linear glucans and to the release of fructose. Separation of the substrate from the reaction products or separation of the two reaction products can be achieved, for example, using membranes that are permeable to fructose, but impermeable to sucrose or glucans. If fructose is continuously removed using such a membrane, sucrose is more or less fully converted to fructose and linear glucans.

Кроме того, амилосахараза предпочтительно может быть иммобилизована на носителе, расположенном между двумя мембранами, одна из которых проницаема для фруктозы, но не для сахарозы или глюканов, а другая позволяет проникать сахарозе, но не глюканам. Субстрат вводят через мембрану, проницаемую для сахарозы. Синтезируемые глюканы остаются в пространстве между двумя мембранами, а высвобожденная фруктоза может непрерывно удаляться из реакционной среды через мембрану, проницаемую только для фруктозы. Такое устройство позволяет эффективно разделять продукты реакции и, таким образом, получать, среди прочего, чистую фруктозу.In addition, amylosaccharase can preferably be immobilized on a carrier located between two membranes, one of which is permeable to fructose, but not to sucrose or glucans, and the other allows sucrose to penetrate, but not glucans. The substrate is introduced through a sucrose-permeable membrane. The synthesized glucans remain in the space between the two membranes, and the released fructose can be continuously removed from the reaction medium through a membrane that is permeable only to fructose. Such a device makes it possible to efficiently separate the reaction products and thus obtain, among other things, pure fructose.

Преимущества применения амилосахараз для получения чистой фруктозы состоят в том, что в качестве исходного материала может применяться относительно дешевый сахараный субстрат, а также в том, что фруктоза может быть выделена из реакционной смеси простым путем без применения хроматографических методов.The advantages of using amylosaccharases to obtain pure fructose are that relatively cheap sugar substrate can be used as starting material, and that fructose can be isolated from the reaction mixture in a simple way without using chromatographic methods.

Изобретение, кроме того, относится к применению протеинов, обладающих ферментативной активностью амилосахаразы, для получения фруктозы.The invention also relates to the use of proteins having the enzymatic activity of amylosaccharose to produce fructose.

Еще одной возможностью применения протеинов, обладающих амилосахаразной активностью, является их использование для получения циклодекстринов. Циклодекстрины получают путем разложения крахмала с помощью фермента циклодекстрин-трансглюкозилазы (КФ 2.4.1.19), который получают из бактерий Bacillus macerans. Вследствие разветвленности крахмала только приблизительно 40% остатков глюкозы может быть превращено в циклодекстрины с использованием этой системы. При использовании практически чистых протеинов, обладающих амилосахаразной активностью, оказывается возможным синтезировать циклодекстрины на основе сахарозы при одновременном действии амилосахаразы и циклодекстрин-трансглюкозилазы, причем амилосахараза катализирует синтез линейных глюканов из сахарозы, а циклодекстрин-трансглюкозилаза катализирует превращение этих глюканов в циклодекстрины.Another possibility for the use of proteins with amylosucrase activity is their use in the production of cyclodextrins. Cyclodextrins are obtained by decomposition of starch using the enzyme cyclodextrin transglucosylase (EC 2.4.1.19), which is obtained from the bacteria Bacillus macerans. Due to the branched starch, only approximately 40% of glucose residues can be converted to cyclodextrins using this system. When using practically pure proteins with amylosucrase activity, it is possible to synthesize sucrose-based cyclodextrins with the simultaneous action of amylosucrase and cyclodextrin transglucosylase, with amylosucrose catalyzing the synthesis of linear glucans from sucrose, and cyclodextrin transglucosylase catalyzes the conversion of these glucans to cyclodextrin.

Плазмиду pNB2 по изобретению в соответствии с Будапештским Договором депонировали в Немецкой коллекции микроорганизмов (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)), Брауншвейг, Германия, 6 мая 1994 г. под каталожным номером DSM 9196.The plasmid pNB2 according to the invention in accordance with the Budapest Treaty was deposited in the German collection of microorganisms (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Braunschweig, Germany, May 6, 1994 under catalog number DSM 9196.

Используемые сокращенияAbbreviations Used

ИПТП - изопропил-β-D-тиогалактопиранозидIPTP - isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

Используемые среды и растворыUsed media and solutions

YT-среда 8 г бактотриптонаYT medium 8 g bactotryptone

5 г дрожжевого экстракта5 g of yeast extract

5 г NaCl5 g NaCl

до 1000 мл dd H₂Oup to 1000 ml dd H ₂ O

YT-планшеты YT-среда с 15 г бактоагара/1000 млYT tablets YT medium with 15 g Bactoagar / 1000 ml

раствор Люголя 12 г KILugol's solution 12 g KI

6 г I₂ 6 g I ₂

до 1,8 л dd H₂Oup to 1.8 l dd H ₂ O

Описание чертежейDescription of drawings

На фиг.1 представлена схема плазмиды pNB2 (DSM 9196). Тонкая линия соответствует последовательности вектора клонирования pBluescript SK(-). Жирная линия соответствует геномной ДНК-вставке Neisseria polysaccharea длиной приблизительно 4,2 т.п.н. Кодирующая область амилосахаразы изображена в виде стрелки, расположенной под вставкой. Над вставкой изображена секвенируемая область. Все количественные значения соотнесены с этой областью длиной 2883 пары оснований.Figure 1 presents the scheme of the plasmid pNB2 (DSM 9196). The thin line corresponds to the sequence of the cloning vector pBluescript SK (-). The bold line corresponds to a genomic DNA insert of Neisseria polysaccharea approximately 4.2 kb in length. The coding region of amylosucrase is shown in the form of an arrow located under the insert. A sequenced area is shown above the insert. All quantitative values are correlated with this region with a length of 2883 base pairs.

На фиг.2 показано проявление амилосахаразной активности в трансформированных клетках E.coli, подвергнутых действию паров йода. Клетки E.coli, трансформированные плазмидой pBluescript II SK (стрелка А) и клетки E.coli, трансформированные плазмидой pNB2, (стрелка В) помещали на YT-планшеты (1,5%-ный агар; 100 мкг/мл ампициллина; 5%-ная сахароза; 0,2 мМ ИПТП) и инкубировали в течение ночи при 37°С. Затем планшеты подвергали действию паров йода. У колоний клеток, трансформированных плазмидой pNB2, видно выраженное голубое кольцо.Figure 2 shows the manifestation of amylosucrose activity in transformed E. coli cells exposed to iodine vapor. E. coli cells transformed with pBluescript II SK plasmid (arrow A) and E. coli cells transformed with pNB2 plasmid (arrow B) were placed on YT plates (1.5% agar; 100 μg / ml ampicillin; 5% sucrose; 0.2 mM IPTP) and incubated overnight at 37 ° C. Then the tablets were exposed to iodine vapor. In cell colonies transformed with pNB2 plasmid, a pronounced blue ring is visible.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах.Below the invention is illustrated by examples.

Пример 1Example 1

Выделение из Neisseria polvsaccharea последовательности геномной ДНК, кодирующей амилосахаразную активностьIsolation from Neisseria polvsaccharea of a sequence of genomic DNA encoding amylosucrase activity

Для выделения из Neisseria polysaccharea последовательности ДНК, кодирующей амилосахаразную активность, сначала создавали библиотеку геномной ДНК. Клетки Neisseria polysaccharea выращивали на "Колумбийском кровяном агаре" (Columbia blood agar, фирма Difco) в течение 2 дней при 37°С. Образовавшиеся колонии собирали с планшетов. Геномную ДНК выделяли в соответствии с методом Ausubel и др. (в Current Protocols in Molecular Biology (1987), J. Wiley & Sons, NY) и подвергали процессингу. Полученную таким образом ДНК частично разлагали с помощью рестрикционной эндонуклеазы Sau3A. Образовавшиеся фрагменты ДНК лидировали с разложенным с помощью BamHI вектором pBluescript SK(-). Продукты лигирования трансформировали в клетках E.coli штамма XLl-Blue. Для их отбора клетки помещали на YT-планшеты с добавлением ампициллина в качестве маркера селекции. Селекционная среда дополнительно содержала 5%-ную сахарозу и 1 мМ ИПТП. После инкубации в течение ночи при 37°С образовавшиеся бактериальные колонии окрашивали йодом, помещая кристаллический йод под крышку чашки Петри и помещая культуральные планшеты с колониями бактерий на 10 мин каждый в другую половину чашки Петри. Йод, который испаряется при комнатной температуре, окрашивал в голубой цвет некоторые области культу ральных планшетов, содержащих амилозоподобные глюканы. Из колоний бактерий, имевших голубое кольцо, выделяли ДНК плазмиды в соответствии с методом Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523). Эту ДНК ретрансформировали в клетках E.coli штамма SURE. Трансформированные клетки помещали на YT-планшеты с ампициллином в качестве маркера селекции. Выделяли положительные клоны.To isolate from Neisseria polysaccharea a DNA sequence encoding amylosucrase activity, a genomic DNA library was first created. Neisseria polysaccharea cells were grown on Columbia blood agar (Columbia blood agar, Difco) for 2 days at 37 ° C. The resulting colonies were collected from tablets. Genomic DNA was isolated according to the method of Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology (1987), J. Wiley & Sons, NY) and processed. The DNA thus obtained was partially digested with restriction endonuclease Sau3A. The resulting DNA fragments were leader with the pBluescript SK (-) vector decomposed using BamHI. Ligation products were transformed in E. coli cells of strain XLl-Blue. For their selection, cells were placed on YT plates with the addition of ampicillin as a selection marker. The selection medium additionally contained 5% sucrose and 1 mM IPTP. After incubation overnight at 37 ° C, the resulting bacterial colonies were stained with iodine, placing crystalline iodine under the lid of the Petri dish and placing culture plates with bacterial colonies for 10 min each in the other half of the Petri dish. Iodine, which evaporates at room temperature, stained blue some areas of culture plates containing amylose-like glucans. Plasmid DNA was isolated from bacterial colonies with a blue ring in accordance with the Birnboim & Doly method (1979, Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523). This DNA was transformed in E. coli cells of SURE strain. Transformed cells were placed on YT plates with ampicillin as a selection marker. Positive clones were isolated.

Пример 2Example 2

Анализ последовательности геномной ДНК-вставки плазмиды pNB2Sequence analysis of the genomic DNA insert of plasmid pNB2

Из клона Е.coli, полученного в соответствии с методикой из примера 1, выделяли рекомбинантную плазмиду. Рестрикционный анализ показал, что указанная плазмида представляла собой продукт лигирования, состоящий из двух молекул вектора и геномного фрагмента длиной приблизительно 4,2 т.п.н. Плазмиду разлагали с помощью рестрикционной эндонуклеазы PstI и выделяли геномный фрагмент (GeneClean, Bio101). Полученный таким образом фрагмент лидировали с вектором pBluescript II SK, линеаризованным с помощью PstI, что приводит к удвоению сайтов рестрикции PstI и Smal. Продукт лигирования трасформировали в клетках E.coli и затем помещали на планшеты с ампициллином для отбора. Выделяли позитивные клоны. Из одного из этих клонов выделяли плазмиду pNB2 (фиг.1), а часть последовательности ее геномной ДНК-вставки определяли стандартными методиками, используя дидезокси-метод (Sanger и др., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Длина всей вставки составляет приблизительно 4,2 т.п.н. Определяли нуклеотидную последовательность частичной последовательности, имеющей длину 2883 пары оснований. Эта нуклеотидная последовательность указана ниже (SEQ ID No.1). Локализация секвенированной области в геномной вставке показана на фиг.1.Recombinant plasmid was isolated from E. coli clone obtained in accordance with the procedure of Example 1. Restriction analysis showed that the indicated plasmid was a ligation product consisting of two vector molecules and a genomic fragment of approximately 4.2 kb in length. The plasmid was digested with restriction endonuclease PstI and a genomic fragment was isolated (GeneClean, Bio101). The fragment thus obtained was led with the pBluescript II SK vector linearized with PstI, which leads to a doubling of the restriction sites PstI and Smal. The ligation product was transformed into E. coli cells and then placed on ampicillin plates for selection. Positive clones were isolated. Plasmid pNB2 was isolated from one of these clones (FIG. 1), and part of the sequence of its genomic DNA insert was determined by standard methods using the dideoxy method (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 -5467). The length of the entire insert is approximately 4.2 kb. The nucleotide sequence of a partial sequence having a length of 2883 base pairs was determined. This nucleotide sequence is shown below (SEQ ID No.1). The localization of the sequenced region in the genomic insert is shown in figure 1.

Пример 3Example 3

Экспрессия внеклеточной амилосахаразной активности в трансформированных клетках E.coliExpression of extracellular amylosucrase activity in transformed E. coli cells

(а) Обнаружение амилосахаразной активности во время роста на YT-планшетах(a) Detection of amylosucrose activity during growth on YT plates

Для экспрессии внеклеточной амилосахаразной активности клетки E.coli трансформировали вектором pNB2 в соответствии со стандартными методиками. Колонию трансформированного пггамма инкубировали на YT-планшетах (1,5%-ный агар; 100 мкг/мл ампициллина; 5%-ная сахароза; 0,2 мМ ИПТП) и инкубировали в течение ночи при 37°С. Амилосахаразную активность определяли, подвергая колонию действию паров йода (фиг.2). У колоний, экспрессирующих амилосахаразу, проявляется голубое кольцо. Амилосахаразную активность можно обнаружить даже при отсутствии ИПТП, вероятно вследствие активности эндогенных промоторов амилосахаразы.To express extracellular amylosucrase activity, E. coli cells were transformed with the pNB2 vector in accordance with standard techniques. The colony of the transformed pg-gamma was incubated on YT plates (1.5% agar; 100 μg / ml ampicillin; 5% sucrose; 0.2 mM IPTP) and incubated overnight at 37 ° C. Amylosaccharase activity was determined by exposing the colony to iodine vapor (FIG. 2). Amylosaccharose expressing colonies show a blue ring. Amylosaccharase activity can be detected even in the absence of IPTP, probably due to the activity of endogenous amylosaccharase promoters.

(б) Обнаружение амилосахаразной активности во время роста в YT-среде(b) Detection of amylosucrase activity during growth in YT medium

Для экспрессии внеклеточной амилосахаразной активности E.coli трансформировали вектором pNB2 в соответствии со стандартными методиками. YT-среду (100 мкг/мл ампициллина; 5%-ная сахароза) инокулировали колонией трансформированного штамма. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С при постоянном перемешивании (роторный смеситель; 150-200 об/мин). Продукты реакции, катализируемой амилосахаразой, обнаруживали путем добавления раствора Люголя к супернатанту культуры, что приводило к окрашиванию в голубой цвет.To express extracellular amylosucrase activity, E. coli was transformed with the pNB2 vector in accordance with standard techniques. YT medium (100 μg / ml ampicillin; 5% sucrose) was inoculated with a colony of the transformed strain. Cells were incubated overnight at 37 ° C with constant stirring (rotary mixer; 150-200 rpm). The reaction products catalyzed by amylosaccharase were detected by adding a Lugol solution to the culture supernatant, which led to a blue color.

(в) Обнаружение амилосахаразной активности в супернатантах культуры трансформированных клеток E.coli, которые культивировали без сахарозы(c) Detection of amylosucrose activity in supernatants of a culture of transformed E. coli cells that were cultured without sucrose

Для экспрессии внеклеточной амилосахаразной активности клетки E.coli трансформировали вектором pNB2 в соответствии со стандартными методиками. YT-среду (100 мг/мл ампициллина) инокулировали колонией трансформированного штамма. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С при постоянном перемешивании (роторный смеситель; 150-200 об/мин). Затем клетки отделяли путем центрифугирования (30 мин, 4°С, 5500 об/мин, ротор JA10 фирмы Beckmann). Супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм (Schleicher & Schuell) в стерильных условиях.To express extracellular amylosucrase activity, E. coli cells were transformed with the pNB2 vector in accordance with standard techniques. YT medium (100 mg / ml ampicillin) was inoculated with a colony of the transformed strain. Cells were incubated overnight at 37 ° C with constant stirring (rotary mixer; 150-200 rpm). Then the cells were separated by centrifugation (30 min, 4 ° C, 5500 rpm, JA10 rotor from Beckmann). The supernatant was filtered through a 0.2 μm filter (Schleicher & Schuell) under sterile conditions.

Обнаружение амилосахаразной активности проводили путем:The detection of amylosucrose activity was carried out by:

(I) инкубирования супернатанта на агаровом планшете с добавлением сахарозы. В одну лунку в агаровом планшете (5%-ная сахароза в 50 мМ натрий-цитратном буфере, рН 6,5) помещали 40 мкл супернатанта и инкубировали по крайней мере в течение 1 часа при 37°С. Продукты реакции, катализируемой амилосахаразой, обнаруживали с помощью окрашивания парами йода. Присутствующие продукты реакции дают голубую окраску.(I) incubating the supernatant on a sucrose agar plate. 40 μl of the supernatant was placed in one well in an agar plate (5% sucrose in 50 mM sodium citrate buffer, pH 6.5) and incubated for at least 1 hour at 37 ° C. The reaction products catalyzed by amylosaccharase were detected by staining with iodine vapor. The reaction products present give a blue color.

(II) или путем электрофоретического разделения протеинов в супернатантах в нативном геле и обнаружения продуктов реакции в геле после инкубирования с сахарозой. Разделяли 40-80 мкл супернатанта с помощью гель-электрофореза на 8%-ном нативном полиакриламидном геле (0,375 М Трис, рН 8,8) при напряжении 100 вольт. Затем гель дважды уравновешивали в течение 15 минут с помощью приблизительно 100 мл 50 мМ натрий-цитратного буфера (рН 6,5) и инкубировали в течение ночи при 37°С в натрий-цитратном буфере с рН 6,5/5%-ной сахарозе. Чтобы визуализировать реакционный продукт катализируемой амилосахаразой реакции, гель промывали раствором Люголя. Полосы, имеющие амилосахаразную активность, окрашивались в голубой цвет.(II) or by electrophoretic separation of proteins in supernatants in a native gel and detection of reaction products in the gel after incubation with sucrose. 40-80 μl of the supernatant was separated by gel electrophoresis on an 8% native polyacrylamide gel (0.375 M Tris, pH 8.8) at a voltage of 100 volts. Then the gel was balanced twice for 15 minutes using approximately 100 ml of 50 mm sodium citrate buffer (pH 6.5) and incubated overnight at 37 ° C in sodium citrate buffer with a pH of 6.5 / 5% sucrose . To visualize the reaction product catalyzed by amylosaccharase reaction, the gel was washed with a Lugol solution. Bands having amylosaccharose activity were stained blue.

Пример 4Example 4

Получение глюканов in vitro с помощью частично очищенной амилосахаразыIn vitro production of glucans using partially purified amylosucrase

Для экспрессии внеклеточной амилосахаразной активности клетки E.coli трансформировали вектором pNB2 в соответствии со стандартными методиками. YT-среду (100 мг/мл ампициллина) инокулировали колонией трансформированного штамма. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С при постоянном перемешивании (роторный смеситель; 150-200 об/мин). Затем клетки отделяли путем центрифугирования (30 мин, 4°С, 5500 об/мин, ротор JA10 фирмы Beckmann). Супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм (Schleicher & Schuell) в стерильных условиях.To express extracellular amylosucrase activity, E. coli cells were transformed with the pNB2 vector in accordance with standard techniques. YT medium (100 mg / ml ampicillin) was inoculated with a colony of the transformed strain. Cells were incubated overnight at 37 ° C with constant stirring (rotary mixer; 150-200 rpm). Then the cells were separated by centrifugation (30 min, 4 ° C, 5500 rpm, JA10 rotor from Beckmann). The supernatant was filtered through a 0.2 μm filter (Schleicher & Schuell) under sterile conditions.

Затем супернатант концентрировали, уменьшая объем в 200 раз, с использованием камеры Amicon (мембрана типа YM30 с размером эксклюзии 30 кДа, компания Amicon) при избыточном давлении (р=3 бар). Концентрированный супернатант добавляли к 50 мл раствора сахарозы (5%-ная сахароза в 50 мМ натрий-цитратном буфере с рН 6,5). Весь раствор инкубировали при 37°С. При этом образуются белесые нерастворимые полисахариды.Then the supernatant was concentrated, reducing the volume by 200 times, using an Amicon chamber (YM30 type membrane with an exclusion size of 30 kDa, Amicon) at an overpressure (p = 3 bar). The concentrated supernatant was added to 50 ml of sucrose solution (5% sucrose in 50 mM sodium citrate buffer, pH 6.5). The whole solution was incubated at 37 ° C. In this case, whitish insoluble polysaccharides are formed.

Пример 5Example 5

Характеризация продуктов реакции, синтезированных с помощью амилосахаразы из примера 4Characterization of the reaction products synthesized using amylosucrase from example 4

Нерастворимые продукты реакции, описанные в примере 4, растворимы в 1М NaOH. Продукты реакции характеризовали путем измерения максимума абсорбции. Приблизительно 100 мг выделенных продуктов реакции (масса в сыром состоянии) растворяли в 200 мкл 1 М NaOH и разбавляли водой в соотношении 1:10. К 100 мкл этого разбавленного раствора добавляли 900 мкл 0,1 М NaOH и 1 мл раствора Люголя. Абсорбционный спектр измеряли в диапазоне от 400 до 700 нм. Максимум соответствует 605 нм (максимум абсорбции амилозы: приблизительно 614 нм).The insoluble reaction products described in Example 4 are soluble in 1M NaOH. The reaction products were characterized by measuring the maximum absorption. Approximately 100 mg of the isolated reaction products (wet weight) was dissolved in 200 μl of 1 M NaOH and diluted with water in a ratio of 1:10. To 100 μl of this diluted solution was added 900 μl of 0.1 M NaOH and 1 ml of Lugol's solution. The absorption spectrum was measured in the range from 400 to 700 nm. The maximum corresponds to 605 nm (maximum absorption of amylose: approximately 614 nm).

Анализ реакционной смеси, полученной в примере 4, с помощью ЖХВД на колонке CARBOPAC PA1 (фирма DIONEX) показал, что кроме нерастворимых продуктов также образуются растворимые продукты. Эти растворимые продукты представляют собой полисахариды с короткой цепью. Длина цепи составляла от приблизительно 5 до приблизительно 60 остатков глюкозы. Также можно было обнаружить, хотя и в меньшем количестве, даже более короткие или более длинные молекулы.Analysis of the reaction mixture obtained in Example 4 using HPLC on a CARBOPAC PA1 column (DIONEX company) showed that, in addition to insoluble products, soluble products are also formed. These soluble products are short chain polysaccharides. The chain length was from about 5 to about 60 glucose residues. It was also possible to detect, albeit in smaller numbers, even shorter or longer molecules.

Доступные аналитические методы не позволили обнаружить разветвление в продуктах синтеза.Available analytical methods did not detect branching in the synthesis products.

Пример 6Example 6

Экспрессия внутриклеточной амилосахаразной активности в трансформированных клетках E.coliExpression of intracellular amylosucrase activity in transformed E. coli cells

Применяя полимеразно-цепьевую реакцию (ПЦР) амплифицировали фрагмент плазмиды pNB2, содержащий нуклеотиды с 981 по 2871 последовательности, представленной в SEQ ID No.1. В качестве праймеров использовали следующие олигонуклеотиды:Using the polymerase chain reaction (PCR), a fragment of plasmid pNB2 containing nucleotides 981 through 2871 of the sequence shown in SEQ ID No.1 was amplified. The following oligonucleotides were used as primers:

TPN2 5'-СТС АСС ATG GGC АТС TTG GAC АТС-3' (SEQ ID No.3);TPN2 5'-STS ACC ATG GGC ATS TTG GAC ATS-3 '(SEQ ID No.3);

ТРС1 5'-CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G-3' (SEQ ID No.4).TPC1 5'-CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G-3 '(SEQ ID No.4).

Образовавшийся фрагмент содержит кодирующую область для амилосахаразы, за исключением нуклеотидов, кодирующих 16 N-концевых аминокислот. Эти аминокислоты включают последовательности, необходимые для выделения фермента из клетки. Кроме того, этот ПЦР-фрагмент содержит 88 пар оснований 3'-нетранслируемой области. С помощью использованных праймеров сайты рестрикции NcoI вводили в оба конца фрагмента.The resulting fragment contains the coding region for amylosucrase, with the exception of nucleotides encoding 16 N-terminal amino acids. These amino acids include the sequences necessary to isolate the enzyme from the cell. In addition, this PCR fragment contains 88 base pairs of the 3'-untranslated region. Using the primers used, NcoI restriction sites were introduced at both ends of the fragment.

После разложения с помощью рестрикционной энедонуклеазы NcoI образовавшийся фрагмент лидировали с разложенным с помощью NcoI вектором экспрессии рМех 7. Продукты лигирования трансформировали в клетках E.coli и отбирали трансформированные клоны. Позитивные клоны инкубировали в течение ночи при 37°С на YT-планшетах (1,5%-ный агар; 100 мкг/мл ампициллина; 5%-ная сахароза; 0,2 мМ ИПТП). После воздействия на планшеты паров йода в области, окружающей бактериальные колонии, не было обнаружено никакого голубого окрашивания, но можно было обнаружить образование гликогена внутри клеток (коричневое окрашивание трансформированных клеток в противоположность неокрашенным нетрансформированным клеткам XL1-Blue). Чтобы оценить функциональные свойства протеина, трансформированные клетки, которые выращивали на YT-среде, разрушали ультразвуком, а полученный неочищенный экстракт вносили с помощью пипетки на агаровые планшеты, содержащие сахарозу. После обработки планшетов парами йода можно было обнаружить голубое окрашивание.After decomposition with the restriction enedonuclease NcoI, the resulting fragment was led with the NcoI-decomposed expression vector pMex 7. The ligation products were transformed into E. coli cells and the transformed clones were selected. Positive clones were incubated overnight at 37 ° C on YT plates (1.5% agar; 100 μg / ml ampicillin; 5% sucrose; 0.2 mM IPTP). After exposure to iodine vapors on the plates, no blue staining was detected in the area surrounding the bacterial colonies, but glycogen formation within the cells could be detected (brown staining of transformed cells as opposed to unstained untransformed XL1-Blue cells). To evaluate the functional properties of the protein, transformed cells that were grown on a YT medium were disrupted by ultrasound, and the resulting crude extract was pipetted onto sucrose agar plates. After processing the tablets with iodine vapor, a blue stain could be detected.

Claims (6)

1. Способ получения линейных α-1,4 глюканов, отличающийся тем, что последовательность ДНК, кодирующую протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, и сцепленную с последовательностями ДНК, обеспечивающими экспрессию указанной последовательности ДНК, вводят в клетки растений, из указанных клеток растений регенерируют целое растение, а затем из растений выделяют линейные α-1,4 глюканы, синтезируемые в них.1. A method of producing linear α-1,4 glucans, characterized in that the DNA sequence encoding a protein having the enzymatic activity of amylosaccharase and linked to DNA sequences providing expression of the indicated DNA sequence is introduced into plant cells, the whole is regenerated from said plant cells plant, and then linear α-1,4 glucans synthesized in them are isolated from plants. 2. Способ по п.1, включающий следующие стадии:2. The method according to claim 1, comprising the following stages: (а) получение кассеты-экспрессии, включающей следующие отдельные последовательности:(a) obtaining an expression cassette comprising the following individual sequences: (I) промотор, активный в растениях и обеспечивающий образование РНК в соответствующей ткани-мишени или в клетках-мишенях;(I) a promoter that is active in plants and provides for the formation of RNA in the corresponding target tissue or in target cells; (II) по крайней мере одну последовательность ДНК, указанную в п.1 и кодирующую протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, и слитую с промотором в смысловой ориентации;(II) at least one DNA sequence specified in claim 1 and encoding a protein having the enzymatic activity of amylosucrase, and fused to the promoter in a sense orientation; (III) функционирующий в растениях сигнал терминации транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК;(III) a transcription termination and polyadenylation signal of the RNA molecule functioning in plants; (б) перенос кассеты экспрессии в клетки растений и(b) transferring the expression cassette into plant cells; and (в) регенерацию целых интактных растений из трансформированных клеток растений.(c) regeneration of whole intact plants from transformed plant cells. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что кассета экспрессии содержит последовательность, кодирующую транзитный пептид, который обеспечивает перенос протеина, обладающего активностью амилосахаразы, в вакуоль или апопласт.3. The method according to claim 1, characterized in that the expression cassette contains a sequence encoding a transit peptide that provides transfer of a protein having amylosucrase activity to a vacuole or apoplast. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная в (II) последовательность ДНК, которая кодирует протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, не содержит сигнальной последовательности, обеспечивающей эффективную экспрессию в апопласте.4. The method according to claim 1, characterized in that the DNA sequence specified in (II), which encodes a protein having the enzymatic activity of amylosucrase, does not contain a signal sequence that ensures efficient expression in the apoplast. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что обозначенный в (I) промотор обеспечивает экспрессию амилосахаразы в органах растениях, накапливающих сахарозу.5. The method according to claim 1, characterized in that the promoter indicated in (I) provides expression of amylosucrase in the organs of plants that accumulate sucrose. 6. Линейный α-1,4 глюкан, полученный с помощью способа, включающего следующие стадии:6. Linear α-1,4 glucan obtained using a method comprising the following steps: (а) введение последовательности ДНК, кодирующей протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, и сцепленной с последовательностями ДНК, обеспечивающими экспрессию указанной последовательности ДНК, в клетки-хозяина;(a) introducing a DNA sequence encoding a protein having the enzymatic activity of amylosucrase and linked to DNA sequences that allow expression of the indicated DNA sequence in the host cells; (б) выделение и очистку протеина, обладающего активностью амилосахаразы;(b) isolation and purification of a protein having amylosucrase activity; (в) взаимодействие раствора, содержащего сахарозу, с протеином, обладающим активностью амилосахаразы, в условиях, обеспечивающих конверсию сахарозы в α-1,4-глюканы и/или фруктозу с помощью амилосахаразы; и(c) the interaction of a solution containing sucrose with a protein having amylosucrose activity, under conditions providing for the conversion of sucrose to α-1,4-glucans and / or fructose using amylosucrose; and (г) извлечение полученных α-1,4-глюканов и/или фруктозы.(g) recovering the obtained α-1,4-glucans and / or fructose.

Images