RU2268751C2 - Медицинская повязка, содержащая комплекс протеолитических ферментов, включая коллагенолитические протеазы, из гепатопанкреаса краба - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине. Заявлено раневое покрытие из химически модифицированной целлюлозы, к которой за счет образования химических связей присоединены ферменты, в том числе и коллагенолитические, входящие в ферментный комплекс гепатопанкреаса краба. Заявлен также способ получения такой повязки. Раневое покрытие сохраняет высокую терапевтическую активность. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, конкретно к медицинским повязкам, содержащим ферменты, в частности обладающих коллагенолитическим действием.

Медицинские повязки, содержащие ферменты, широко известны. Можно сослаться, например, на заявку Великобритании №2240040, речь в которой идет о медицинской повязке из частично окисленного целлюлозосодержащего материала в форме марли, к которому за счет образования химических связей присоединены ферменты, обладающие протеолитической, коллагенолитической и/или бактериолитической активностью.

В патенте Российской Федерации №2127128 описан способ получения раневого покрытия, который заключается в смешении раствора коллагена с комплексом протеолитических ферментов, выделяемых из гепатопанкреаса камчатского краба и обладающих коллагенолитической активностью, с последующим структурированием, в ряде случаев, в парах формальдегида. К недостаткам способа можно отнести то обстоятельство, что смешение фермента с его субстратом (т.е. коллагенолитик с коллагеном) вынуждает очень строго контролировать рН и температуру; кроме того, формальдегид, следы которого неизбежно присутствуют в покрытии, обладает канцерогенным действием в отношении слизистых оболочек (носа и, возможно, раны).

Целью изобретения является создание раневого покрытия, лишенного перечисленных выше недостатков и сохраняющего высокую терапевтическую активность.

Поставленная цель достигнута благодаря тому, что в раневом покрытии, состоящем из основы, содержащей комплекс протеолитических ферментов из гепатопанкреаса краба, обладающих коллагенолитической активностью, в качестве основы выбрана целлюлоза, модифицированная химическим путем.

Заявлен также способ получения такой повязки, включающий следующие этапы:

- частичное окисление целлюлозы в виде медицинской марли до содержания альдегидных групп 0,13÷0,25 мМоль/г;

- приготовление раствора ферментов гепатопанкреаса концентрации 0,4÷1,5 мг/мл;

- введение полученного раствора ферментов при модуле ванны 5-10 во взаимодействие с частично окисленной целлюлозой в течение 1-3 часов при температуре 15÷25°С и рН 6,8÷8,5;

- отделение модифицированным белком материала, промывка буферным раствором для удаления физически адсорбированных белка и сушка до постоянной массы или, альтернативно, взаимодействие раствора ферментов, полученного выше, с фосфорным эфиром целлюлозы, в указанных выше условиях.

Коллагеназы, т.е. ферменты, способные при физиологических условиях расщеплять молекулы нативного коллагена, хорошо известны и широко используются. Сказанное в особенности касается микробных коллагеназы из Clostridium his. ("Biochemistry", 1984, vol.23, р.3085-3091) и коллагеназы из тканей млекопитающих (Extracellular Matrix Biochemistry, N.Y., Elsevier Publishers, 1984). Сравнительно недавно были открыты коллагенолитические протеиназы из краба Uca pugilator (Biochemistry, 1973, vol.12, р.1814-1822), камчатского краба Paralithodes camchatica (Biochem. Biophys. Res. Communs., 1990, vol.166, No 3, p.1411-1420) и краба-стригуна Chionoecetes opilio ("Доклады Акад. Наук СССР", 1991, том 317, №2, стр.482-484).

Отмечается, что коллагенолитические ферменты различного происхождения значительно отличаются друг от друга по субстратной специфичности, причем коллагенолитические протеазы принадлежат к суперсемейству трипсинов.

Для выделения коллагенолитических протеаз гепатопанкреас краба экстрагировали водными буферными растворами, содержавшими NaCl и Са²⁺-ион, с последующими ультра- и микрофильтрацией и гель-фильтрацией на колонке с Sephadex G-50 и получением смеси 9 белков, имеющих молекулярную массу от 23 до 36 кДа и проявляющих коллагенолитическую активность. Для ферментов из гепатопанкреаса краба характерна широкая специфичность: они способны гидролизовать как нативный коллаген и эластин, так и стандартные белковые субстраты (желатин, казеин) в широком диапазоне температур (4-40°С) и рН (4,5-10,5).

Благодаря тому, что выделенные белки действуют "ансамблем", появляется возможность их совместного применения для лечения ран с различной и изменяющейся раневой средой.

Для иммобилизации нами был использован раствор протеолитического комплекса с рН от 6,0 до 8,5, т.к. использование растворов, имеющих рН ниже 6,0 и выше 8,5, приводит к полной и необратимой инактивации комплекса в процессе иммобилизации, высушивания и хранения иммобилизованного препарата; увеличение времени иммобилизации выше 3-х часов не ведет к иммобилизации дополнительного количества активного белка, а при иммобилизации менее 0,5 часа основная масса активного комплекса остается в растворе, что ведет к технологическим потерям; при использовании при иммобилизации раствора комплекса с концентрацией менее 0,4 мг/мл образующийся материал имеет ферментативную активность меньше требуемого лечебного значения, особенно в конце срока хранения препарата, а при увеличении концентрации комплекса в растворе для иммобилизации более 1,5 мг/мл большая часть препарата остается в растворе, что ведет к значительному перерасходу ферментного препарата; проведение процесса при температуре выше 25°С ведет к инактивации ферментного комплекса, а понижение температуры ниже 15°С требует дополнительных энергозатрат.

Изобретение детально поясняется следующими примерами своего практического осуществления.

ПРИМЕР 1. Готовят 1 л раствора комплекса гепатопанкреаса краба (производство ЗАО " Биопрогресс" п.Биокомбинат, Моск. обл.), содержащего 1,0 г вещества, которым заливают 100 г марли, частично окисленной периодатионом до содержания альдегидных групп 0,18 мМоль/г. Через 2 часа материал отжимают от избытка раствора и сушат с получением готового продукта, имеющего следующие характеристики:

- протеолитическая активность по казеину 0,5 ПЕ/г (метод Кунитца);

- триптическая активность по гидролизу этилового эфира бензоиларгинина паранитроанилида 0,50 мкМоль/г;

- химотриптическая активность по гидролизу этилового эфира ацетилтирозина 0,08 мкМ/г;

- активность в отношении гидролиза коллагена 30 ЕД/г (по методу Мандейла).

ПРИМЕР 2. В 1 л 1/15 М фосфатно-калий-натриевого буфера (рН 7,8) растворяют 1,0 г комплекса из гепатопанкреаса краба, которым заливают 100 г фосфорнокислого эфира целлюлозы (2,2 мг-экв/г фосфатных групп); через 3 часа продукт отжимают на вальцах и сушат. Полученный продукт обладает следующими характеристиками:

- протеолитическая активность по казеину 0,62 ЕД/г;

- триптическая активность по гидролизу этилового эфира бензоиларгинина паранитроанилида 0,65 мкМоль/г;

- химотриптическая активность по гидролизу этилового эфира ацетилтирозина 0,10 мкМоль/г;

- активность в отношении гидролиза коллагена 35 ЕД/г (по методу Мандейла).

ПРИМЕР 3. Из материала, полученного согласно примеру 1, нарезаны салфетки размером 7×10 см, которые были использованы в экспериментальных условиях для лечения гнойных ран. Результаты лечения (на 40 больных) отражены в таблице, в которой для сравнения приведены данные по лечению ран традиционным способом.

Таблица 1.
Время наступления заживления, дни.
№п/п	Изучаемые образцы	Очищение ран	Заживление ран
1.	Традиционные методы лечения	13,2±0,7	24,5±0,7
2.	Салфетки по примеру 3	2,7±0,2	13,2±0,1

Claims (4)

1. Раневое покрытие, состоящее из основы, содержащей комплекс протеолитических ферментов из гепатопанкреаса краба, обладающих коллагенолитической активностью, отличающееся тем, что в качестве основы выбрана целлюлоза, модифицированная химическим путем.

2. Раневое покрытие по п.1, отличающееся тем, что в качестве химически модифицированной целлюлозы выбрана частично окисленная целлюлоза, содержащая альдегидные группы.

3. Раневое покрытие по п.1, отличающееся тем, что в качестве химически модифицированной целлюлозы выбрана химически модифицированная марля, содержащая остатки фосфорной кислоты.

4. Способ получения раневого покрытия по любому из пп.1-3, включающий взаимодействие целлюлозы, модифицированной химическим путем, с коллагенолитическими ферментами в водном буферном растворе, отличающийся тем, что в качестве названных ферментов используют комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, реакцию ведут при рН 6,0-8,5, температуре 15-25°С в течение 1-3 ч при начальной концентрации комплекса 0,4-1,5 мг/мл и модуле ванны 5-10.