RU2265027C2 - Tumor-targeted peptide - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, medicine, oncology, peptides.

SUBSTANCE: invention relates to a method based on phage display for preparing peptides interacting specifically with mammary Ehrlich tumor and can be used in therapy and diagnosis of malignant neoplasm. Peptides are prepared by affinity selection from phage peptide libraries comprising ten millions of different peptides of size 15 amino acid residues, the group of nine peptides wherein each peptide shows ability for accumulation in Ehrlich tumor. For practice using mimetic-peptides selected by such manner can be prepared by chemical synthesis and to use for preparing conjugates on their basis with the known cytotoxic preparations, radioactive isotopes and they can be incorporated in the composition of liposomal preparations for visualization of tumor neoplasm also.

EFFECT: valuable medicinal properties of peptides.

2 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии. Конкретно - к получению с помощью фагового дисплея пептидов, специфически взаимодействующих с опухолью молочной железы Эрлиха.The invention relates to biotechnology, genetic and protein engineering. Specifically, to obtain peptides using a phage display that specifically interact with an Ehrlich breast tumor.

В последние годы с помощью селекции фаговых библиотек против очищенных клеточных маркеров, культур клеток и даже in vivo на животных удалось идентифицировать целый ряд пептидов, специфичных в отношении тех или иных клеток [1]. Ранние работы в этой области касаются выделения пептидных лигандов для интегринов, представляющих класс гетеродимерных белков клеточной адгезии, выполняющих многие важные биологические функции, такие как рецепция матриксных белков и факторов роста, иммунологический контроль и др. [2]. Было показано, что пептиды, селектированные на очищенных интегринах, могут использоваться для избирательного связывания с клетками-мишенями. Селекция фаговых библиотек по связыванию с интактными клетками имеет ряд преимуществ, так как не требуется информация о предполагаемых рецепторах. Впервые этот подход был использован для выделения 20-мерного пептида, связывающегося с фибробластами [1]. Группа Ruoslahti из La Jolla Cancer Research Center разработала систему селекции in vivo, позволяющую выделять из пептидной фаговой библиотеки фаги, избирательно связывающиеся с различными органами и тканями [3]. Было показано, что органоспецифические фаги связываются с соответствующим органом в 4-9 раз лучше, чем в контроле. Органоспецифические фаги идентифицированы для легких, кожи, поджелудочной железы, тонкого кишечника, матки, надпочечников и сетчатки. При этом установлено, что фаг, связывающийся с легочной тканью, обладал наибольшей селективностью - в 35 раз больше, чем неселективный фаг [4].In recent years, using the selection of phage libraries against purified cell markers, cell cultures, and even in vivo in animals, it has been possible to identify a number of peptides specific for particular cells [1]. Early work in this area concerned the isolation of peptide ligands for integrins, which are a class of heterodimeric cell adhesion proteins that perform many important biological functions, such as the reception of matrix proteins and growth factors, immunological control, etc. [2]. It has been shown that peptides selected on purified integrins can be used to selectively bind to target cells. The selection of phage libraries for binding to intact cells has several advantages, since information on putative receptors is not required. This approach was first used to isolate a 20-dimensional peptide that binds to fibroblasts [1]. The Ruoslahti group of La Jolla Cancer Research Center has developed an in vivo selection system that allows phages to selectively bind to various organs and tissues from a peptide phage library [3]. It was shown that organ-specific phages bind to the corresponding organ 4-9 times better than in the control. Organ-specific phages have been identified for the lungs, skin, pancreas, small intestine, uterus, adrenal gland and retina. It was found that the phage that binds to lung tissue had the highest selectivity — 35 times more than non-selective phage [4].

Исследуя первичные структуры этих пептидов и получая в дальнейшем химическим синтезом такие пептиды, можно создавать конъюгаты с известными цитотоксическими препаратами, используемыми в настоящее время при терапии рака, тем самым повышая доставку препаратов в опухолевую ткань и уменьшая токсическое воздействие их на здоровые ткани, а также использовать для диагностики опухолей и их метастазов с большой точностью и эффективностью.Investigating the primary structures of these peptides and subsequently producing such peptides by chemical synthesis, one can create conjugates with the known cytotoxic drugs currently used in cancer therapy, thereby increasing the delivery of drugs to the tumor tissue and reducing their toxic effect on healthy tissues, as well as using for the diagnosis of tumors and their metastases with great accuracy and effectiveness.

Адресная доставка лекарственных препаратов к опухолям возможна пока лишь в некоторых случаях и ограничивается использованием моноклональных антител, причем с переменным успехом [5, прототип]. Одним из главных ограничений применения антител для диагностики опухолей в клинике является плохое поглощение и распределение антител в опухолях. Это обусловлено главным образом физиологическими факторами (неравномерным кровотоком и интерстициальной гипертензией), а также большими размерами молекул антител [6].Targeted delivery of drugs to tumors is possible so far only in some cases and is limited to the use of monoclonal antibodies, with varying success [5, prototype]. One of the main limitations of the use of antibodies for the diagnosis of tumors in the clinic is poor absorption and distribution of antibodies in tumors. This is mainly due to physiological factors (uneven blood flow and interstitial hypertension), as well as the large size of antibody molecules [6].

Один из путей преодоления этой проблемы состоит в использовании опухоль-специфичных лигандов небольшого размера. Малые молекулы часто имеют более высокие коэффициенты проницаемости и интерстициальной диффузии и способны проникать в опухоли более глубоко. Принципиально новый подход к решению проблемы адресованной химиотерапии опухолей состоит в использовании фаговых пептидных библиотек, включающих в себя набор статистических пептидов, экспонированных в составе одного из поверхностных белков нитчатых бактериофагов.One way to overcome this problem is to use small tumor-specific ligands. Small molecules often have higher coefficients of permeability and interstitial diffusion and are able to penetrate into the tumor more deeply. A fundamentally new approach to solving the problem of targeted chemotherapy for tumors consists in the use of phage peptide libraries, which include a set of statistical peptides exposed as a part of one of the surface proteins of filamentous bacteriophages.

Технической задачей изобретения является поиск опухоль-специфических пептидов, взаимодействующих с опухолью молочной железы Эрлиха, с помощью фаговых пептидных библиотек.An object of the invention is the search for tumor-specific peptides interacting with an Ehrlich breast tumor using phage peptide libraries.

Поставленная цель достигается путем аффинной селекции из фаговых пептидных библиотек, содержащих десятки миллионов разных пептидов длиной 15 а.о, тех пептидов, которые способны специфично накапливаться в опухоли Эрлиха. Пептиды в библиотеке экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида [7].This goal is achieved by affinity selection from phage peptide libraries containing tens of millions of different peptides with a length of 15 a.o., those peptides that can specifically accumulate in Ehrlich's tumor. Peptides in the library are exposed on the surface of bacteriophages as part of the minor membrane protein pIII, with each phage particle containing 5 copies of one peptide [7].

Метод аффинной селекции in vivo заключается в следующем. Фаговую библиотеку в количестве 10¹³ фаговых частиц (TU - трансдуцирущих единиц) вводят в хвостовую вену мыши. Через несколько минут мышь забивают и выделяют ткань, на которую ведут селекцию. Ткань гомогенизируют, отмывают от не связавшихся фагов, а связавшиеся фаги после амплификации в E.coli повторно вводят мышам. После нескольких таких раундов из библиотеки отбираются фаги, экспонирующие на своей поверхности тканеспецифичные пептиды [3]. Обогащение фаговой популяции определяют по увеличению выхода фагов после каждого раунда селекции. Из обогащенной таким образом фаговой библиотеки после 1, 1, 3-го раундов аффинной селекции отбирают индивидуальные фаговые клоны и определяют их специфичность. Для подтверждения тканеспецифичности отдельных фаговых популяций, полученных после аффинной селекции, фаги вводятся мышам на 24 часа. После чего в органах и тканях определяется количество накопившихся фагов (Tu/мг ткани) [8].The in vivo affinity selection method is as follows. A phage library in the amount of 10 ¹³ phage particles (TU - transducing units) is injected into the tail vein of the mouse. After a few minutes, the mouse is killed and the selected tissue is isolated. The tissue is homogenized, washed from unbound phages, and the bound phages, after amplification in E. coli, are re-injected into mice. After several such rounds, phages are selected from the library that expose tissue-specific peptides on their surface [3]. Enrichment of the phage population is determined by the increase in the output of phages after each round of selection. After the 1st, 1st, 3rd rounds of affinity selection, individual phage clones are selected from the phage library enriched in this way and their specificity is determined. To confirm the tissue specificity of individual phage populations obtained after affinity selection, phages are introduced into mice for 24 hours. After that, the number of accumulated phages (Tu / mg of tissue) is determined in organs and tissues [8].

По результатам скрининга отбирают фаги, наиболее активно накапливающиеся в опухоли. Аминокислотный состав специфичных к опухоли пептидов, расположенных на поверхности фаговых частиц, определяют секвенированием фаговых ДНК по модифицированному методу Сэнгера [9] в кодирующей пептид области.Based on the results of the screening, phages that are most actively accumulating in the tumor are selected. The amino acid composition of tumor-specific peptides located on the surface of phage particles is determined by phage DNA sequencing according to the modified Sanger method [9] in the region encoding the peptide.

Для локализации бактериофага проводят иммуногистохимическое исследование образцов на парафиновых срезах. Эндогенную пероксидазу блокируют 3% перекисью водорода в забуференном физиологическом растворе в течение 10 минут. Неспецифического окрашивания избегают путем инкубирования срезов в бычьем сывороточном альбумине. В качестве первых антител используют антитела к В-белку нитчатого бактериофага fuse 2, первые антитела выявляют конъюгатом антител свиньи против иммуноглобулинов кролика с пероксидазой хрена. Пероксидазную активность выявляют 3,3'-аминобензидином. Положительным контролем служат высушенные осадки фаговой библиотеки. В качестве отрицательного контроля пропускается использование первых антител.To localize the bacteriophage, an immunohistochemical study of the samples is carried out on paraffin sections. Endogenous peroxidase is blocked with 3% hydrogen peroxide in buffered saline for 10 minutes. Nonspecific staining is avoided by incubation of sections in bovine serum albumin. Antibodies to the b-protein of the filamentous bacteriophage fuse 2 are used as the first antibodies, the first antibodies are detected by the conjugate of pig antibodies against rabbit immunoglobulins with horseradish peroxidase. Peroxidase activity is detected by 3,3'-aminobenzidine. A positive control is the dried sediments of the phage library. As a negative control, the first antibodies are skipped.

Для практического использования селектированные таким образом пептиды-миметики можно получать химическим синтезом и создавать на их основе конъюгаты с известными цитотоксическими препаратами, которые разрешены для терапии онкологических заболеваний, а также создавать конъюгаты с радиоактивными изотопами для использования как в терапии, так и диагностике опухолей и их метастазов, включать в состав липосомальных препаратов для визуализации опухолевых новообразований.For practical use, mimetic peptides selected in this way can be obtained by chemical synthesis and based on them, conjugates with known cytotoxic drugs that are allowed for the treatment of cancer, as well as the creation of conjugates with radioactive isotopes for use both in therapy and diagnosis of tumors and their metastases, to be included in the composition of liposome preparations for the visualization of tumor neoplasms.

Сущность изобретения заключается в том, что селектированные из фаговой пептидной библиотеки пептиды, аминокислотные последовательности которых приведены на фиг.2, обладают свойством избирательно накапливаться в опухоли Эрлиха.The essence of the invention lies in the fact that peptides selected from a phage peptide library, the amino acid sequences of which are shown in figure 2, have the property of selectively accumulating in Ehrlich's tumor.

Таким образом, впервые получены пептиды, избирательно накапливающиеся в опухоли Эрлиха. Пептиды экспонированы на поверхности нитчатых бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида.Thus, for the first time, peptides selectively accumulated in Ehrlich tumors were obtained. Peptides are exposed on the surface of filamentous bacteriophages as part of the minor membrane protein pIII, with each phage particle containing 5 copies of one peptide.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:The invention is illustrated by the following figures:

Фиг.1. Скрининг индивидуальных фаговых клонов на мышах с привитой опухолью Эрлиха. В качестве отрицательного контроля взят фаг fuse2, который не экспонирует рандомизованный пептид.Figure 1. Screening of individual phage clones in mice inoculated with an Ehrlich tumor. The fuse2 phage, which does not exhibit a randomized peptide, was taken as a negative control.

Фиг.2. Аминокислотные последовательности пептидов, экспонированные на поверхности фагов.Figure 2. Amino acid sequences of peptides exposed on the surface of phages.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют примеры его осуществления.For a better understanding of the essence of the invention, the following are examples of its implementation.

Пример 1. Способ проведения аффинной селекции пептидов, накапливающихся в опухоли Эрлиха.Example 1. The method of affinity selection of peptides that accumulate in Ehrlich tumor.

Первый раунд аффинной селекции фаговой библиотеки проводят по следующей схеме [3]. Мышам линии СВА с привитой подкожно опухолью Эрлиха, которая достигла размера ~1 см, вводили в хвостовую вену пептидную фаговую библиотеку 10¹⁴ трансдуцирующих единиц в 200 мл DMEM. Через 5 минут мышь усыпляют эфиром. Опухоль удаляют, взвешивают и гомогенизируют в 1 мл DMEM-PI (DMEM, содержащая ингибиторы протеаз: PMSF 1 mM, aprotinin 20 мкг/мл, leupeptin 1 мкг/мл). Опухоль трижды промывают DMEM-PI (4°С), содержащей 1% BSA, и инкубируют с 1 мл компетентной культурой Е.coli 1 час. Добавляют 10 мл питательной среды YTx2, содержащей 0,2 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют, перемешивая, при 37°С 1 час. 200 мкл переносят на чашку Петри с агаром, содержащим 40 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют ночь при 37°С. Колонии смывают 1 мл YTx2, содержащей 20 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют в 5 мл, перемешивая 16 часов при 37°С. Выделяют фаг и проводят второй и третий раунды аффинной селекции как описано выше. Фаги титруют с использованием клеток К91Каn, выращенных на ТВ-среде, с последующим высевом на чашки с агаром, содержащим канамицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (40 мкг/мл), титр фагов определяют по числу колоний (трансдуцирующих единиц (TU)) по G.P.Smith [7]. Количество фаговых частиц рассчитывают по формуле 1 TU=20 вирионов.The first round of affinity selection of the phage library is carried out according to the following scheme [3]. A CBA mouse subcutaneously inoculated with an Ehrlich tumor, which reached a size of ~ 1 cm, was injected into the tail vein with a peptide phage library of 10 ¹⁴ transducing units in 200 ml of DMEM. After 5 minutes, the mouse is euthanized with ether. The tumor is removed, weighed and homogenized in 1 ml DMEM-PI (DMEM containing protease inhibitors: PMSF 1 mM, aprotinin 20 μg / ml, leupeptin 1 μg / ml). The tumor is washed three times with DMEM-PI (4 ° C) containing 1% BSA and incubated with 1 ml of competent E. coli culture for 1 hour. Add 10 ml of YTx2 growth medium containing 0.2 μg / ml tetracycline and incubate, stirring, at 37 ° C for 1 hour. 200 μl was transferred to a Petri dish with agar containing 40 μg / ml tetracycline and incubated overnight at 37 ° C. Colonies are washed off with 1 ml of YTx2 containing 20 μg / ml tetracycline and incubated in 5 ml, stirring for 16 hours at 37 ° C. The phage are isolated and the second and third rounds of affinity selection are performed as described above. Phages are titrated using K91Kan cells grown on TV medium, followed by plating on plates with agar containing kanamycin (100 μg / ml) and tetracycline (40 μg / ml), the phage titer is determined by the number of colonies (transducing units (TU) ) by GPSmith [7]. The number of phage particles is calculated by the formula 1 TU = 20 virions.

После третьего раунда селекции получают индивидуальные фаговые колонии, которые используют для наработки одноцепочечной ДНК и фагов для имммуноферментного анализа (ИФА). Определение последовательности ДНК проводят по модифицированному методу Сэнгера [9]. В качестве праймера используют олигонуклеотид 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG [7].After the third round of selection, individual phage colonies are obtained, which are used to generate single-stranded DNA and phages for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). DNA sequence determination is carried out according to the modified Sanger method [9]. The oligonucleotide 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG [7] is used as a primer.

Пример 2. Скрининг индивидуальных фаговых клонов на мышах линии СВА с привитой опухолью Эрлиха.Example 2. Screening of individual phage clones on CBA mice inoculated with an Ehrlich tumor.

Мышам линии СВА с привитой подкожно опухолью Эрлиха, которая достигла размера ~1 см, вводят в хвостовую вену фаг в количестве 10⁹ трансдуцирующих единиц в 500 мл DMEM. Через 24 часа мышь усыпляют эфиром. Опухоль и контрольные органы (мышца, легкое и др.) удаляют, взвешивают и гомогенизируют в 1 мл DMEM-PI (DMEM, содержащая ингибиторы протеаз: PMSF 1 mM, aprotmin 20 мкг/мл, leupeptin 1 мкг/мл). Опухоль и контрольные органы трижды промывают DMEM-PI (4°С), содержащей 1% BSA, и инкубируют с 1 мл компетентной культурой E.coli 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 3 мл питательной среды YTx2, содержащей 0,2 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют, медленно перемешивая, при 37°С 20 минут. Образцы охлаждают до 4°С, отбирают аликвоты 5 мкл, 50 мкл и высевают на чашки Петри с агаром, содержащим канамицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (40 мкг/мл). Через 16 часов подсчитывают выросшие колонии и вычисляют количество фаговых частиц, содержащихся в 1 мг исследуемой ткани.CBA mice inoculated subcutaneously with an Ehrlich tumor, which reached a size of ~ 1 cm, were injected with phage in the tail vein in the amount of 10 ⁹ transducing units in 500 ml of DMEM. After 24 hours, the mouse is euthanized with ether. The tumor and control organs (muscle, lung, etc.) are removed, weighed and homogenized in 1 ml of DMEM-PI (DMEM containing protease inhibitors: PMSF 1 mM, aprotmin 20 μg / ml, leupeptin 1 μg / ml). The tumor and control organs are washed three times with DMEM-PI (4 ° C) containing 1% BSA and incubated with 1 ml of competent E. coli culture for 20 minutes at room temperature. Add 3 ml of YTx2 culture medium containing 0.2 μg / ml tetracycline, and incubate, slowly mixing, at 37 ° C for 20 minutes. Samples were cooled to 4 ° C, 5 μl, 50 μl aliquots were taken and plated on Petri dishes with agar containing kanamycin (100 μg / ml) and tetracycline (40 μg / ml). After 16 hours, the grown colonies are counted and the number of phage particles contained in 1 mg of the test tissue is calculated.

Таким образом, получены специфичные пептиды, избирательно накапливающиеся в опухоли Эрлиха, которые могут быть успешно использованы в терапии и диагностике злокачественных новообразовавний у онкологических больных.Thus, specific peptides that selectively accumulate in Ehrlich tumors were obtained, which can be successfully used in the treatment and diagnosis of malignant neoplasms in cancer patients.

ЛитератураLiterature

1. Brown КС. New approaches for cell-specific targeting: identification of cell-selective peptides from combinatorial libraries. Curr Opin ChemBiol. 2000, 4(1): 16-21.1. Brown cop. New approaches for cell-specific targeting: identification of cell-selective peptides from combinatorial libraries. Curr Opin ChemBiol. 2000, 4 (1): 16-21.

2. Kouivunen Е, Агар W, Rajotte D, Lahdenranta J, Pasqualini R. Identification of receptor ligands with phage display peptide library. J Nucl Med. 1999, 40(5): 883-8.2. Kouivunen E, Agar W, Rajotte D, Lahdenranta J, Pasqualini R. Identification of receptor ligands with phage display peptide library. J Nucl Med. 1999, 40 (5): 883-8.

3. Pasqualini R, Ruoslahti E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 1996. 380(6572): 364-366.3. Pasqualini R, Ruoslahti E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 1996.380 (6572): 364-366.

4. Rajotte D, Агар W, Hagerdom M, Koivunen E, Pasqualini R, Ruoslahti E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J Clin Invest. 1998, 102(2): 430-437.4. Rajotte D, Agar W, Hagerdom M, Koivunen E, Pasqualini R, Ruoslahti E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J Clin Invest. 1998, 102 (2): 430-437.

5. Pastan I. Targeted therapy of cancer with recombinant immunotoxins. Biochim Biophys Acta. 1997, 1333(2): 1-6.5. Pastan I. Targeted therapy of cancer with recombinant immunotoxins. Biochim Biophys Acta. 1997, 1333 (2): 1-6.

6. Gui J, Moyana Т, Xiang J. Selection of a peptide with affionity for the tumor-associated TAG72 antigen from a phage-display library. Biochem Biophys Res Commun. 1996, 218(1): 414-419.6. Gui J, Moyana T, Xiang J. Selection of a peptide with affionity for the tumor-associated TAG72 antigen from a phage-display library. Biochem Biophys Res Commun. 1996, 218 (1): 414-419.

7. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. // Science. 1990. V.249, p.386-390.7. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. // Science. 1990. V.249, p. 386-390.

8. Pasqualini R., Koivunen E., Ruoslahti E. av Integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands. Nature biotechnology. 1997. V.15. P.542-546.8. Pasqualini R., Koivunen E., Ruoslahti E. av Integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands. Nature biotechnology. 1997. V.15. P.542-546.

9. Kretz К., Callen W., Hedden V. Cycle sequencing // Methods of Enzimology. V.154. P.527-536.9. Kretz K., Callen W., Hedden V. Cycle sequencing // Methods of Enzimology. V.154. P.527-536.

Claims (1)

Пептид, специфически взаимодействующий с опухолью молочной железы Эрлиха, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей, приведенных на фиг.2:A peptide specifically interacting with an Ehrlich breast tumor having an amino acid sequence selected from the group of sequences shown in FIG. 2: последовательность 1sequence 1 GGSACTGSSFGSVCWGGSACTGSSFGSVCW последовательность 2sequence 2 LFSHHDTWSLGARWVLFSHHDTWSLGARWV последовательность 3sequence 3 QFIDRPWLQFIDRPWL последовательность 4sequence 4 RNVPPIFNDVYWIAFRNVPPIFNDVYWIAF последовательность 5sequence 5 RYRVGFTPGTIAAVLRYRVGFTPGTIAAVL последовательность 6sequence 6 RDSFLFSFSRAHTPVRDSFLFSFSRAHTPV последовательность 7sequence 7 VGAHLFHVPPGTTGVGAHLFHVPPGTTG последовательность 8sequence 8 GRTGPGGPGCPAVRAGRTGPGGPGCPAVRA последовательность 9sequence 9 EVPRLSLLAASLVAN.EVPRLSLLAASLVAN.

Images