RU2264409C2 - 2'-amino-2'-deoxynucleosides as inhibitors if measles and marburg virusus reproduction - Google Patents

Abstract

FIELD: organic chemistry, biochemistry, medicine, virology.

SUBSTANCE: invention relates to derivatives of 2'=amino-2'-deoxynucleosides of the formula:

wherein R means hydrogen atom (H), alkyl, aminoalkyl; R¹ means -(R²NR³) wherein R² and/or R³ means H, -OH, -NH₂, alkyl, benzyl under condition that R doesn't represent H or methyl when R² and R³ mean H. Compounds elicit an antiviral activity with respect to measles and Marburg viruses exceeding that of ribavirin.

EFFECT: valuable properties of compounds.

4 tbl, 2 dwg, 18 ex

Description

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно к применению новых производных нуклеозидов для подавления репродукции вирусов кори и Марбург.The invention relates to the field of molecular biology, virology and medicine, namely to the use of new derivatives of nucleosides to suppress the reproduction of measles and Marburg viruses.

В настоящее время известен целый ряд соединений - аналогов нуклеотидов, обладающих противовирусной активностью, в том числе и используемых в медицинской практике. К последним относятся ацикловир, азидотимидин, рибавирин и другие препараты. Для лечения тяжелых случаев коревой инфекции применяют в основном рибавирин [1-(β-d-рибофуранозил-1)-1,2,4-триазол-3-карбоксамид] [1]. Проходя через клеточные мембраны, рибавирин метаболизируется, превращаясь в моно- и трифосфат. Монофосфат является конкурентным ингибитором инозинмонофосфат дегидрогеназы, что приводит к торможению синтеза вирусных РНК и ДНК, слабо действуя на клетки хозяина. Кроме вируса кори рибавирин подавляет репродукцию вирусов гриппа типа А и В, герпеса, гепатита А и В и других [2, 3].Currently, a number of compounds are known - analogues of nucleotides with antiviral activity, including those used in medical practice. The latter include acyclovir, azidothymidine, ribavirin and other drugs. Ribavirin [1- (β-d-ribofuranosyl-1) -1,2,4-triazole-3-carboxamide] is mainly used to treat severe cases of measles infection [1]. Passing through cell membranes, ribavirin is metabolized, turning into mono- and triphosphate. Monophosphate is a competitive inhibitor of inosine monophosphate dehydrogenase, which leads to inhibition of the synthesis of viral RNA and DNA, weakly affecting the host cells. In addition to measles virus, ribavirin inhibits the reproduction of influenza viruses of type A and B, herpes, hepatitis A and B and others [2, 3].

Однако в отношении вируса Марбург нет препаратов, обладающих противовирусной активностью.However, there are no drugs with antiviral activity against Marburg virus.

Известны L-нуклеозиды и его фармацевтически приемлемые соли для лечения заболеваний вирусных инфекций (заявка на патент РФ №96117323, МПК С 07 Н 19/06, опубл. 10.12.1998) [4].Known L-nucleosides and its pharmaceutically acceptable salts for the treatment of diseases of viral infections (RF patent application No. 96117323, IPC C 07 H 19/06, publ. 10.12.1998) [4].

Однако препараты, приготовленные на основе указанных соединений, эффективны для лечения заболеваний, вызванных вирусом гепатита В и вирусом Эпштейна-Барра, и не проявляют активность в отношении вирусов кори и Марбург.However, preparations based on these compounds are effective for the treatment of diseases caused by hepatitis B virus and Epstein-Barr virus, and do not show activity against measles and Marburg viruses.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) являются фармацевтические соединения, включающие в себя замещенные или незамещенные нуклеозиды и их аналоги, которые активны в отношении геморрагической лихорадки, вызванной вирусом Денге, и вирусной инфекции кори (Международная заявка № WO 00/15214, МПК А 61 К 31/19, опубл. 23.03.2000) [5].The closest technical solution (prototype) are pharmaceutical compounds, including substituted or unsubstituted nucleosides and their analogues, which are active against hemorrhagic fever caused by Dengue virus and measles virus infection (International application No. WO 00/15214, IPC A 61 K 31/19, publ. 23.03.2000) [5].

Однако указанные фармацевтические соединения не проявляют активности в отношении вируса Марбург и вируса кори.However, these pharmaceutical compounds are not active against Marburg virus and measles virus.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является использование производных нуклеозидов, эффективных в отношении вирусов кори и Марбург, способных проникать внутрь клетки и обладающих избирательной активностью в подавлении репродукции указанных вирусов.The technical result of the invention is the use of derivatives of nucleosides effective against measles and Marburg viruses, capable of penetrating into the cell and having selective activity in suppressing the reproduction of these viruses.

Указанный технический результат достигается тем что, ингибиторами репродукции вирусов являются производные нуклеозидов, согласно изобретению в качестве производных нуклеозидов используют пиримидиновые 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды с химической формулой:The specified technical result is achieved in that the inhibitors of the reproduction of viruses are nucleoside derivatives, according to the invention, pyrimidine 2'-amino-2'-deoxynucleosides with the chemical formula are used as nucleoside derivatives:

где R=H, галоид, галоидалкил, алкил, аминоалкил, арил, арилалкил и др. R¹=(R²NR³), R² или (и) R³=H, ОН, NH₂, алкил, арил, арилалкил и др. Известно несколько способов синтеза пиримидиновых 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов, основанных на модификации углеводного остатка нуклеозида [6-9].where R = H, halogen, haloalkyl, alkyl, aminoalkyl, aryl, arylalkyl, etc. R ¹ = (R ² NR ³ ), R ² or (s) R ³ = H, OH, NH ₂ , alkyl, aryl, arylalkyl et al. Several methods are known for the synthesis of pyrimidine 2'-amino-2'-deoxynucleosides based on a modification of the carbohydrate residue of a nucleoside [6-9].

2'-Амино-2'-дезоксиуридин и его модифицированные по 5-положению нуклеинового основания производные были синтезированы авторами заявляемого технического решения по приведенной ниже схеме I с общим выходом 35-50%:2'-amino-2'-deoxyuridine and its derivatives modified at the 5-position of the nucleic base were synthesized by the authors of the claimed technical solution according to the following scheme I with a total yield of 35-50%:

где R=H, галоид, галоидалкил, алкил, аминоалкил, арил, арилалкил и др.where R = H, halogen, haloalkyl, alkyl, aminoalkyl, aryl, arylalkyl, etc.

На первой стадии синтеза в результате воздействия дифенилкарбоната на коммерческий уридин (I, R=H) либо на модифицированный по 5-положению нуклеинового основания уридин (I, R=галоид, алкил, аминоалкил, арил, арилалкил и др.) были синтезированы 2,2'-O-ангидропроизводные (5-R)-уридина (II). Следующая стадия синтеза - азидирование 2,2'-O-ангидро-(5-R)-уридина (II). Последней стадией синтеза было восстановление 2'-азидогруппы до аминогруппы. Выделение целевого 2'-амино-2'-дезокси-(5-R)-уридина осуществляли ионообменной хроматографией на колонке с Dowex 50 (H⁺) с последующей очисткой на колонке с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 и лиофилизацией продукта (IV).At the first stage of synthesis, as a result of the action of diphenyl carbonate on commercial uridine (I, R = H) or on a 5-position modified nucleic base uridine (I, R = halogen, alkyl, aminoalkyl, aryl, arylalkyl, etc.), 2 were synthesized. 2'-O-anhydro derivatives of (5-R) -uridine (II). The next synthesis step is the azidation of 2,2'-O-anhydro- (5-R) -uridine (II). The last step in the synthesis was the reduction of the 2'-azido group to the amino group. The target 2'-amino-2'-deoxy- (5-R) -uridine was isolated by ion exchange chromatography on a Dowex 50 (H ⁺ ) column, followed by purification on a LiChroprep RP-8 reverse phase silica gel column and lyophilization of product (IV).

2'-Амино-2'-дезокси-N⁴-(R^l,R²)-цитидин (VIII) и его модифицированные по 5-положению нуклеинового основания производные были синтезированы авторами заявляемого технического решения из соответствующих 2'-азидо-2'-дезокси-(5-R)-уридинов (III) по приведенной ниже схеме II с общим выходом 30-65%:2'-amino-2'-deoxy-N ⁴ - (R ^l , R ² ) -cytidine (VIII) and its derivatives modified at the 5-position of the nucleic base were synthesized by the authors of the claimed technical solution from the corresponding 2'-azido-2 ' -deoxy- (5-R) -uridines (III) according to the following scheme II with a total yield of 30-65%:

где R=H, галоид, галоидалкил, алкил, аминоалкил, арил, арилалкил и др.where R = H, halogen, haloalkyl, alkyl, aminoalkyl, aryl, arylalkyl, etc.

R¹ или (и) R²=H, ОН, NH₂, алкил, арил, арилалкил и др.R ¹ or (s) R ² = H, OH, NH ₂ , alkyl, aryl, arylalkyl, etc.

Первой стадией синтеза явилось ацетилирование 2'-азидо-2'-дезокси-(5-R)-уридина (III). Полученный 3',5'-ди-O-ацетил-2'-азидо-2'-дезокси-(5-R)-уридин (V) обрабатывали свежеприготовленным фосфо-тристриазолидом. По окончании реакции проводили замещение триазолидной группы в соединении VI на N⁴-(R¹NR²) -группу действием NH₄OH либо соответствующего амина с последующим удалением защитных групп. Последней стадией синтеза было восстановление 2'-азидогруппы в (VII) до аминогруппы. Выделение целевого 2'-амино-2'-дезокси-N⁴-(R¹, R²)-(5-R)-цитидина (VIII) осуществляли ионообменной хроматографией на колонке с Dowex 50 (Н⁺) с последующей очисткой на колонке с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 и лиофилизацией продукта (VIII).The first step in the synthesis was acetylation of 2'-azido-2'-deoxy- (5-R) -uridine (III). The resulting 3 ', 5'-di-O-acetyl-2'-azido-2'-deoxy- (5-R) -uridine (V) was treated with freshly prepared phospho-tristriazolid. At the end of the reaction, the triazolid group in compound VI was replaced by an N ⁴ - (R ¹ NR ² ) group by the action of NH ₄ OH or the corresponding amine, followed by removal of the protective groups. The last step in the synthesis was the reduction of the 2'-azido group in (VII) to the amino group. Isolation of the desired 2'-amino-2'-deoxy-N ⁴ - (R ¹ , R ² ) - (5-R) -cytidine (VIII) was carried out by ion exchange chromatography on a column with Dowex 50 (H ⁺ ), followed by purification on a column with reverse phase silica gel LiChroprep RP-8 and lyophilization of the product (VIII).

Структура 2'-амино-2'-дезокси-(5-R)-уридина (IV) и 2'-амино-2'-дезокси-N⁴-(R^l,R²)-(5-R)-цитидина (VIII) была подтверждена масс-, УФ- и ЯМР-спектрами. Чистота целевых субстанций была оценена с помощью ВЭЖХ и составляет 98%.Structure of 2'-amino-2'-deoxy- (5-R) -uridine (IV) and 2'-amino-2'-deoxy-N ⁴ - (R ^l , R ² ) - (5-R) -cytidine (VIII) was confirmed by mass, UV and NMR spectra. The purity of the target substances was evaluated using HPLC and is 98%.

Ингибирование репродукции вируса кори и вируса Марбург исследовали в первично инфицированных клетках почки зеленой мартышки Vero в присутствии экспериментального препарата, конечная концентрация которого в культуральной среде составляла 0,1-400 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 5 суток в случае вируса кори и 6 суток при исследовании вируса Марбург. Об ингибировании исследуемым соединением репродукции вируса в культуре чувствительных клеток судили по снижению вирус-индуцированного цитопатического действия в присутствии препарата по сравнению с контролем. В качестве препарата сравнения использовали рибавирин.The inhibition of the reproduction of measles virus and Marburg virus was studied in primary infected Vero green monkey kidney cells in the presence of an experimental preparation, the final concentration of which in the culture medium was 0.1-400 μg / ml, during one passage for 5 days in the case of measles virus and 6 days in the study of the Marburg virus. Inhibition of the virus reproduction by the test compound in the culture of sensitive cells was judged by the decrease in the virus-induced cytopathic effect in the presence of the drug compared to the control. Ribavirin was used as a reference drug.

Противовирусную активность в отношении вируса Марбург исследовали также методом количественного определения вируса в культуре клеток Vero под полужидким агаровым покрытием.Antiviral activity against Marburg virus was also investigated by the method of quantitative determination of the virus in a culture of Vero cells under semi-liquid agar coating.

На чертежах приведены дозозависимые кривые, иллюстрирующие ингибирующую активность заявляемых соединений. На фиг.1 приведены графики, иллюстрирующие противовирусную активность соединений (IVa), (VIIIa) и рибавирина в отношении вируса кори. На фиг.2 приведены графики, иллюстрирующие цитотоксичность и противовирусную активность соединения (VIIIa) в отношении вируса Марбург.The drawings show dose-dependent curves illustrating the inhibitory activity of the claimed compounds. Figure 1 shows graphs illustrating the antiviral activity of compounds (IVa), (VIIIa) and ribavirin against measles virus. Figure 2 shows graphs illustrating the cytotoxicity and antiviral activity of compound (VIIIa) against the Marburg virus.

Ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.The following are specific examples that reveal the essence of the invention.

Пример 1. Синтез 2'-амино-2'-дезоксиуридина (соединение IVa, R=H)Example 1. Synthesis of 2'-amino-2'-deoxyuridine (compound IVa, R = H)

Раствор 1,95 г (8 ммол) уридина, 1,93 г (9 ммол) дифенилкарбоната и 100 мг NaHCO₃ в 5 мл абс. диметилформамида (ДМФ) нагревали при 120°С до прекращения выделения газа (5 час.), затем упарили до 1/2 объма, охладили и отфильтровали осадок 2,2'-O-ангидроуридина, промыли его 5 мл холодного метанола. Продукт суспендировали в 3 мл метанола и кипятили при перемешивании 3 часа, затем охладили, осадок отфильтровали, промыли его 5 мл холодного метанола, 5 мл эфира и высушили в вакуум-эксикаторе над КОН. Выход 2,2'-O-ангидроуридина (II) 1,4 г 78%.A solution of 1.95 g (8 mmol) of uridine, 1.93 g (9 mmol) of diphenyl carbonate and 100 mg of NaHCO ₃ in 5 ml of abs. dimethylformamide (DMF) was heated at 120 ° С until gas evolution ceased (5 hours), then it was evaporated to 1/2 volume, the 2,2'-O-anhydrouuridine precipitate was cooled and filtered, washed with 5 ml of cold methanol. The product was suspended in 3 ml of methanol and boiled with stirring for 3 hours, then cooled, the precipitate was filtered, washed with 5 ml of cold methanol, 5 ml of ether and dried in a vacuum desiccator over KOH. The yield of 2,2'-O-anhydrouridine (II) 1.4 g 78%.

К раствору 0,9 г (4 ммол) 2,2'-O-ангидроуридина (II) в 10 мл абс. ДМФ добавили 0,98 г (20 ммол.) LiN₃, 0,54 г (10 ммол.) NH₄Cl, 0,61 г (10 ммол.) LiCl×H₂O и 0,45 мл гексаметилфосфотриамида. Смесь нагревали при перемешивании при 110°С в течение 8 час., затем упарили, к остатку добавили 9 мл МеОН и 18 мл ацетона и оставили на 18 час при 0°С. Осадок отфильтровали, промыли 10 мл смеси МеОН/ацетон (1/3), раствор упарили, остаток растворили в 3 мл ацетона и профильтровали через колонку с силикагелем в ацетоне (3×10 см). Фильтрат упарили. Густое масло растворили в 3 мл МеОН и нанесли на колонку с силикагелем (2×21 см) в хлороформе. Целевой продукт элюировали системой хлороформ-метанол 8:2. 2'-Азидо-2'-дезоксиуридин (III) получен с выходом 0,59 г (55%).To a solution of 0.9 g (4 mmol) of 2,2'-O-anhydrouridine (II) in 10 ml of abs. DMF was added 0.98 g (20 mmol.) LiN ₃ , 0.54 g (10 mmol.) NH ₄ Cl, 0.61 g (10 mmol.) LiCl × H ₂ O and 0.45 ml of hexamethylphosphotriamide. The mixture was heated with stirring at 110 ° C for 8 hours, then evaporated, 9 ml of MeOH and 18 ml of acetone were added to the residue, and left for 18 hours at 0 ° C. The precipitate was filtered off, washed with 10 ml of MeOH / acetone (1/3), the solution was evaporated, the residue was dissolved in 3 ml of acetone and filtered through a column of silica gel in acetone (3 × 10 cm). The filtrate was evaporated. The thick oil was dissolved in 3 ml of MeOH and applied to a column of silica gel (2 × 21 cm) in chloroform. The target product was suirable system of chloroform-methanol 8: 2. 2'-Azido-2'-deoxyuridine (III) was obtained in a yield of 0.59 g (55%).

К раствору 0,54 г (2 ммол) 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (III) в 10 мл смеси диоксан-вода (1:1) добавили трифенилфосфин 1,31 г (5 ммол.) и 2 мл 25% NH₄OH. Через 18 час при 20°С смесь упарили, растворили в 50 мл воды, раствор проэкстрагировали хлороформом (2×10 мл) и нанесли на колонку с Dowex 50 (Н⁺) (3×10 см), которую промыли 100 мл 30% МеОН. Продукт элюировали 2% NH₄OH в 30% МеОН, элюат упарили, остаток растворили в 2 мл воды и нанесли на колонку с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 (3×24 см). Элюировали в градиенте концентраций МеОН (0→5%) в присутствии 0,01 М NH₄НСО₃. Целевые фракции упарили, переупарили с водой (3×10 мл) и лиофилизовали. Выход 2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVa) 0,39 г (80%).To a solution of 0.54 g (2 mmol) of 2'-azido-2'-deoxyuridine (III) in 10 ml of dioxane-water (1: 1) was added triphenylphosphine 1.31 g (5 mmol.) And 2 ml of 25% NH ₄ OH. After 18 hours at 20 ° C, the mixture was evaporated, dissolved in 50 ml of water, the solution was extracted with chloroform (2 × 10 ml) and applied to a Dowex 50 (H ⁺ ) column (3 × 10 cm), which was washed with 100 ml of 30% MeOH . The product was eluted with 2% NH ₄ OH in 30% MeOH, the eluate was evaporated, the residue was dissolved in 2 ml of water and applied to a LiChroprep RP-8 silica gel column (3 × 24 cm). Eluted in a concentration gradient of MeOH (0 → 5%) in the presence of 0.01 M NH ₄ HCO ₃ . The desired fractions were evaporated, re-evaporated with water (3 × 10 ml) and lyophilized. The yield of 2'-amino-2'-deoxyuridine (IVa) 0.39 g (80%).

2'-Амино-2'-дезоксиуридин (IV, R=H), 2'-amino-2'-deoxyuridine C₉H₁₃N₃O₅ Mr 243.2,2'-amino-2'-deoxyuridine (IV, R = H), 2'-amino-2'-deoxyuridine C ₉ H ₁₃ N ₃ O ₅ Mr 243.2,

УФ: λmax 261 (ε9600), [D₂O; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,90 d (1H, J_5,6 8, H-6), 5,90 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 5,67 d (1H, H-5), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 m (1H, H-4'), 3,62 m (2H, H-5').UV: λmax 261 (ε9600), [D ₂ O; δ, ppm; (J, Hz)]: 7.90 d (1H, J _5.6 8, H-6), 5.90 d (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 5, 67 d (1H, H-5), 4.31 br t (1H, J _{, 2.3 '} 5.5, J _{, 3', 4 '} 5, H-3'), 4.03 t (1H, H-2 '), 3.90 m (1H, H-4'), 3.62 m (2H, H-5 ').

Пример 2.Синтез 5-Метил-2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVb, R=СН₃)Example 2 Synthesis of 5-Methyl-2'-amino-2'-deoxyuridine (IVb, R = CH ₃ )

5-Метил-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IV, R=СН₃) получен из тимидина, как в примере 1, с выходом 85%.5-Methyl-2'-amino-2'-deoxyuridine (IV, R = CH ₃ ) was obtained from thymidine, as in Example 1, in 85% yield.

5-Метил-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IV, R=СН₃), УФ: λmax 265 (ε9800), [D₂O; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,91 s (1H, H-6), 5,92 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, H-2'), 3.92 m (1H, H-4'), 3,65 m (2H, H-5'), 1.89 s (3Н, СН₃).5-Methyl-2'-amino-2'-deoxyuridine (IV, R = CH ₃ ), UV: λ max 265 (ε9800), [D ₂ O; δ, ppm; (J, Hz)]: 7.91 s (1H, H-6), 5.92 d (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.35 br t (1H, J _{, 2,3 '} 5,5, J _{, 3', 4 '} 5, H-3'), 4.07 t (1H, H-2 '), 3.92 m (1H, H-4'), 3 , 65 m (2H, H-5 '), 1.89 s (3H, CH ₃ ).

Пример 3. Синтез 5-Бром-2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVc, R=Br)Example 3. Synthesis of 5-Bromo-2'-amino-2'-deoxyuridine (IVc, R = Br)

5-Бром-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVc, R=Br) получен из 5-бром-2'-дезоксиуридина, как в примере 1, с выходом 68%.5-Bromo-2'-amino-2'-deoxyuridine (IVc, R = Br) was prepared from 5-bromo-2'-deoxyuridine, as in Example 1, in 68% yield.

5-Бром-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVc, R=Br) 5-Bromo-2'-amino-2'-deoxyuridine М-322.12, C₉H₁₂BrN₃O₅, УФ: λmax 265 (ε9800), [D₂O; δ, м.д.; (J, Гц)]:8,09 s (1H, H-6), 5,92 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, H-2'), 3.92 m (1H, H-4'), 3,65 m (2H, H-5'), 1.89 s (3H, СН₃).5-Bromo-2'-amino-2'-deoxyuridine (IVc, R = Br) 5-Bromo-2'-amino-2'-deoxyuridine M-322.12, C ₉ H ₁₂ BrN ₃ O ₅ , UV: λmax 265 (ε9800), [D ₂ O; δ, ppm; (J, Hz)]: 8.09 s (1H, H-6), 5.92 d (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.35 br t (1H, J _{, 2,3 '} 5,5, J _{, 3', 4 '} 5, H-3'), 4.07 t (1H, H-2 '), 3.92 m (1H, H-4'), 3 , 65 m (2H, H-5 '), 1.89 s (3H, CH ₃ ).

Пример 4. Синтез 5-Аминометил-2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVd, R=CH₂NH₂)Example 4. Synthesis of 5-Aminomethyl-2'-amino-2'-deoxyuridine (IVd, R = CH ₂ NH ₂ )

5-Аминометил-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVd, R=CH₂NH₂) получен из 5-азидометил-2'-амино-2'-дезоксиуридина[10], как в примере 1, с выходом 63%.5-Aminomethyl-2'-amino-2'-deoxyuridine (IVd, R = CH ₂ NH ₂ ) was obtained from 5-azidomethyl-2'-amino-2'-deoxyuridine [10], as in example 1, with a yield of 63 %

5-Аминометил-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVd, R=CH₂NH₂) УФ: λmax 265 (ε9800), [D₂O, δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,91 s (1H, H-6), 5,90 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H,J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2Н, Н-5'), 2,77t (2H,J 6, CH ₂NH₂).5-Aminomethyl-2'-amino-2'-deoxyuridine (IVd, R = CH ₂ NH ₂ ) UV: λmax 265 (ε9800), [D ₂ O, δ, ppm; (J, Hz)]: 7.91 s (1H, H-6), 5.90 d (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.35 br t (1H, J _{, 2,3 '} 5,5, J _{, 3', 4 '} 5, H-3'), 4.07 t (1H, H-2 '), 3.90 br q (1H, J _{4', 5 '} 4 H-4 '), 3.62 m (2H, H-5'), 2.77 t (2H, J 6, CH ₂ NH ₂ ).

Пример 5. Синтез 5-Аминометил-2'-амино-2'-дезоксиуридина (IVe, R=CH₂-O(CH₂)₆NH₂)Example 5. Synthesis of 5-Aminomethyl-2'-amino-2'-deoxyuridine (IVe, R = CH ₂ —O (CH ₂ ) ₆ NH ₂ )

5-(6-аминогексилоксиметил)-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVe, R=CH₂-O(CH₂)₆NH₂) получен из 5-(6-азидогексилоксиметил)-2'-амино-2'-дезоксиуридина [11], как в примере 1, с выходом 65%.5- (6-aminohexyloxymethyl) -2'-amino-2'-deoxyuridine (IVe, R = CH ₂ -O (CH ₂ ) ₆ NH ₂ ) obtained from 5- (6-azidohexyloxymethyl) -2'-amino-2 '-deoxyuridine [11], as in example 1, with a yield of 65%.

5-(6-аминогексилоксиметил)-2'-амино-2'-дезоксиуридин (IVe, R=CH₂-O(CH₂)₆NH₂), УФ: λmax 265 (ε9800), [D₂O δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,89 s (1H, H-6), 5,90 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3'. 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,15 s (2H,5-CH₂), 4,07 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, Н-5'), 3,31 t (2H, J 6,OCH ₂C₅H₁₀), 2,77 t (2H, J 6, CH₂N), 1.41 m, 1,15 m [8Н,(CH₂)₄].5- (6-aminohexyloxymethyl) -2'-amino-2'-deoxyuridine (IVe, R = CH ₂ -O (CH ₂ ) ₆ NH ₂ ), UV: λmax 265 (ε9800), [D ₂ O δ, m .d .; (J, Hz)]: 7.89 s (1H, H-6), 5.90 d (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.35 br t (1H, J _{, 2.3 '} . 5.5, J _{, 3', 4 '} 5, H-3'), 4.15 s (2H, 5-CH ₂ ), 4.07 t (1H, H-2 ' ), 3.90 br q (1H, J _{4 ', 5'} 4 H-4 '), 3.62 m (2H, H-5'), 3.31 t (2H, J 6, O CH ₂ C ₅ H ₁₀ ), 2.77 t (2H, J 6, CH ₂ N), 1.41 m, 1.15 m [8H, (CH ₂ ) ₄ ].

Пример 6. Синтез 2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIa, R=Н)Example 6. Synthesis of 2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIa, R = H)

К раствору 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIa) 1,35 г (5 ммол) в 5 мл абс. пиридина добавили 1.2, мл (13,3 ммол.) уксусного ангидрида и смесь выдерживали 16 час при 20°С, затем упарили, остаток переупарили с н.бутанолом (2×5 мл) и толуолом. 3',5'-Диацетил-2'-азидо-2'-дезоксиуридин (Va) был получен в виде маслянистого осадка с выходом 1,59 г (90%).To a solution of 2'-azido-2'-deoxyuridine (IIIa) 1.35 g (5 mmol) in 5 ml abs. pyridine was added 1.2 ml (13.3 mmol.) of acetic anhydride and the mixture was kept for 16 hours at 20 ° С, then evaporated, the residue was re-evaporated with n-butanol (2 × 5 ml) and toluene. 3 ', 5'-diacetyl-2'-azido-2'-deoxyuridine (Va) was obtained as an oily precipitate with a yield of 1.59 g (90%).

3',5'-Диацетил-2'-азидо-2'-дезоксиуридин (Va, 2,46 ммол.) в 5 мл абс. ацетонитрила охладили до -10°С. Триазол (1,43 г, 20 ммол) растворили в 5 мл. абс. ацетонитрила и 2,9 мл триэтиламина (20 ммол), охладили до -10°С и добавили при перемешивании POCl₃, (0,64 мл, 6,9 ммол). Реакционную смесь перемешивали 30 мин при -10°С, затем отфильтровали в колбу с (Va). Реакционную смесь перемешивали 2 час при комнатной температуре, затем добавили 0,5 мл воды, упарили, остаток растворили в этилацетате, промыли его водой, нас. NaHCO₃, водой, высушили Na₂SO₄ и профильтровали через колонку с силикагелем в этилацетате (3×10 см). Фильтрат упарили. N⁴-Триазолил-3',5'-диацетил-2'-азидо-2'-дезоксиуридин (VIa) был получен в виде маслянистого осадка с выходом 0,78 (78%).3 ', 5'-diacetyl-2'-azido-2'-deoxyuridine (Va, 2.46 mmol.) In 5 ml of abs. acetonitrile was cooled to -10 ° C. Triazole (1.43 g, 20 mmol) was dissolved in 5 ml. abs. acetonitrile and 2.9 ml of triethylamine (20 mmol) were cooled to -10 ° C and POCl ₃ , (0.64 ml, 6.9 mmol) was added with stirring. The reaction mixture was stirred for 30 min at -10 ° C, then filtered into a flask with (Va). The reaction mixture was stirred for 2 hours at room temperature, then 0.5 ml of water was added, evaporated, the residue was dissolved in ethyl acetate, washed with water, us. NaHCO ₃ , water, dried Na ₂ SO ₄ and filtered through a column of silica gel in ethyl acetate (3 × 10 cm). The filtrate was evaporated. N ⁴ -Triazolyl-3 ', 5'-diacetyl-2'-azido-2'-deoxyuridine (VIa) was obtained as an oily precipitate with a yield of 0.78 (78%).

К раствору N⁴-триазолил-3',5'-диацетил-2'-азидо-2'-дезоксиуридина (VIa, 0,67 г, 1,64 ммол) в 6 мл диоксана добавили 25 ммол. соответствующего амина и оставили на 48 час при комнатной температуре, затем добавили 2 мл конц. NH₄OH и оставили на 18 час при комнатной температуре. Реакционную смесь упарили, остаток растворили в 50 мл 30% МеОН и нанесли на колонку с Dowex 50 (H⁺) (3×10 см), которую промыли 100 мл 30% МеОН. Продукт элюировали 2% NH₄OH в 30% МеОН, элюат упарили, остаток растворили в 2 мл воды и нанесли на колонку с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 (3×24 см). Продукт элюировали в градиенте концентраций МеОН (0→30%) в присутствии 0,01 М NH₄HCO₃. Целевые фракции переупаривали с водой (3×10 мл) и лиофилизовали. 2'-Азидо-2'-дезоксицитидин (VIIa) был получен с выходом 0,33 г (75%).To a solution of N ⁴ -triazolyl-3 ', 5'-diacetyl-2'-azido-2'-deoxyuridine (VIa, 0.67 g, 1.64 mmol) in 6 ml of dioxane was added 25 mmol. the corresponding amine and left for 48 hours at room temperature, then 2 ml of conc. NH ₄ OH and left for 18 hours at room temperature. The reaction mixture was evaporated, the residue was dissolved in 50 ml of 30% MeOH and applied to a Dowex 50 (H ⁺ ) column (3 × 10 cm), which was washed with 100 ml of 30% MeOH. The product was eluted with 2% NH ₄ OH in 30% MeOH, the eluate was evaporated, the residue was dissolved in 2 ml of water and applied to a LiChroprep RP-8 silica gel column (3 × 24 cm). The product was eluted in a concentration gradient of MeOH (0 → 30%) in the presence of 0.01 M NH ₄ HCO ₃ . The desired fractions were re-evaporated with water (3 × 10 ml) and lyophilized. 2'-Azido-2'-deoxycytidine (VIIa) was obtained in a yield of 0.33 g (75%).

К раствору 2'-азидо-2'-дезоксицитидина (VI, 0,54 г, 2 ммол) в 10 мл смеси диоксан-вода (1:1) добавили трифенилфосфин (1,31 г, 5 ммол) и 2 мл. 25% NH₄OH. Через 18 час при 20°С смесь упарили, растворили в 50 мл воды, раствор проэкстрагировали хлороформом (2×10 мл) и нанесли на колонку с Dowex 50 (Н⁺) (3×10 см), которую промыли 100 мл 30% МеОН. Продукт элюировали 2% NH₄OH в 30% МеОН, элюат упарили, остаток растворили в 2 мл воды и нанесли на колонку с обращеннофазовым силикагелем LiChroprep RP-8 (3×24 см). Элюировали в градиенте концентраций МеОН (0→30%) в присутствии 0,01 М NH₄HCO₃. Целевые фракции упарили, переупарили с водой (3×10 мл) и лиофилизовали. Выход 2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIa) 0,39 г (80%).Triphenylphosphine (1.31 g, 5 mmol) and 2 ml were added to a solution of 2'-azido-2'-deoxycytidine (VI, 0.54 g, 2 mmol) in 10 ml of a mixture of dioxane-water (1: 1). 25% NH ₄ OH. After 18 hours at 20 ° C, the mixture was evaporated, dissolved in 50 ml of water, the solution was extracted with chloroform (2 × 10 ml) and applied to a Dowex 50 (H ⁺ ) column (3 × 10 cm), which was washed with 100 ml of 30% MeOH . The product was eluted with 2% NH ₄ OH in 30% MeOH, the eluate was evaporated, the residue was dissolved in 2 ml of water and applied to a LiChroprep RP-8 silica gel column (3 × 24 cm). Eluted in a concentration gradient of MeOH (0 → 30%) in the presence of 0.01 M NH ₄ HCO ₃ . The desired fractions were evaporated, re-evaporated with water (3 × 10 ml) and lyophilized. The yield of 2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIa) 0.39 g (80%).

2'-Амино-2'-дезоксицитидин (VIII, R=R¹=R²=H), M=242, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, H-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5'). 2'-amino-2'-deoxycytidine.2'-amino-2'-deoxycytidine (VIII, R = R ¹ = R ² = H), M = 242, UV: pH 7.5: λmax 271 (ε8200), pH 2: λmax 276 (ε11900), [ DMSO-d ₆ ; δ, ppm; (J, Hz)]: 7.79 d (1H, J _5.6 7.5, H-6), 7.12 br s (2H, NH ₂ ), 5.79 d (1H, H-5) , 5.67 d, (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.31 br t (1H, J _{, 2.3'} 5.5, J _{, 3 ', 4'} 5, H-3 '), 4.03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J _{4 ', 5'} 4 H-4 '), 3.62 m (2H, H-5 '). 2'-amino-2'-deoxycytidine.

Пример 7. Синтез (5-Метил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIb, R=СН₃, R¹=R²=H))Example 7. Synthesis of (5-Methyl) -2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIb, R = CH ₃ , R ¹ = R ² = H))

(5-Метил)-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIb, R=СН_з, R¹=R²=H) получен из (5-метил)-2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIb), как в примере 6, с общим выходом 52%(5-methyl) -2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIb, R = CH _z, R ¹ = R ² = H) was obtained from (5-methyl) -2-azido-2'-deoxyuridine (IIIb ), as in example 6, with a total yield of 52%

(5-Метил)-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIb, R=СН₃, R¹=R²=H), УФ: рН 7,5: λmax 272 (ε8200), рН 2: λmax 278 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,91 s (1H, H-6), 7,14 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,35 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, Н-2'), 3.92 m (1H, 4 H-4'), 3,65 m (2H, Н-5'), 1.89 s (3Н, СН₃).(5-Methyl) -2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIb, R = CH ₃ , R ¹ = R ² = H), UV: pH 7.5: λmax 272 (ε8200), pH 2: λmax 278 (ε11900), [DMSO-d ₆ ; δ, ppm; (J, Hz)]: 7.91 s (1H, H-6), 7.14 br s (2H, NH ₂ ), 5.79 d (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H- 1 '), 4.35 br t (1H, J _{, 2.3'} 5.5, J _{, 3 ', 4'} 5, H-3 '), 4.07 t (1H, H-2'), 3.92 m (1H, 4 H-4 '), 3.65 m (2H, H-5'), 1.89 s (3H, CH ₃ ).

Пример 8. Синтез (5-Аминометил)-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIc, R=CH₂NH₂, R¹=R²=H)Example 8. Synthesis of (5-Aminomethyl) -2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIc, R = CH ₂ NH ₂ , R ¹ = R ² = H)

(5-Аминометил)-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIc, R=CH₂NH₂, R¹=R²=H) получен из (5-азидометил)-2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIc), как в примере 6, с общим выходом 43%.(5-Aminomethyl) -2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIc, R = CH ₂ NH ₂ , R ¹ = R ² = H) obtained from (5-azidomethyl) -2'-azido-2'-deoxyuridine (IIIc), as in example 6, with a total yield of 43%.

(5-Аминометил)-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIc, R=CH₂NH₂, R¹=R²=H), УФ: рН 7,5: λmax 274 (ε8200), рН 2: λmax 280 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,89 s (1H, H-6), 7,14 br s (2H, NH₂), 5,82 d (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,36 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_3',4' 5, H-3'), 4,07 t (1H, H-2'), 3.90 m (1H, H-4'), 3,62 m (2H, H-5'), 2,77 t (2H, J 6, CH ₂NH₂).(5-Aminomethyl) -2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIc, R = CH ₂ NH ₂ , R ¹ = R ² = H), UV: pH 7.5: λmax 274 (ε8200), pH 2: λmax 280 (ε11900), [DMSO-d ₆ ; δ, ppm; (J, Hz)]: 7.89 s (1H, H-6), 7.14 br s (2H, NH ₂ ), 5.82 d (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H- 1 '), 4.36 br t (1H, J _{, 2.3'} 5.5, J _{3 ', 4'} 5, H-3 '), 4.07 t (1H, H-2'), 3.90 m (1H, H-4 '), 3.62 m (2H, H-5'), 2.77 t (2H, J 6, CH ₂ NH ₂ ).

Пример 9. Синтез N⁴-окси-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIId, R=R¹=H, R²=OH)Example 9. Synthesis of N ⁴ -oxy-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIId, R = R ¹ = H, R ² = OH)

N⁴-окси-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIId, R=R¹=H, R²=OH) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIId), как в примере 6, с общим выходом 51%.N ⁴ -oxy-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIId, R = R ¹ = H, R ² = OH) is obtained from 2'-azido-2'-deoxyuridine (IIId), as in example 6, s total yield 51%.

N⁴-окси-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIId, R=R¹=H, R²=ОН), УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5 H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5').N ⁴ -oxy-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIId, R = R ¹ = H, R ² = OH), UV: pH 7.5: λmax 271 (ε8200), pH 2: λmax 276 (ε11900 ), [DMSO-d ₆ ; δ, ppm; (J, Hz)]: 7.79 d (1H, J _5.6 7.5 H-6), 7.12 br s (2H, NH ₂ ), 5.79 d (1H, H-5), 5.67 d, (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.31 br t (1H, J _{, 2.3'} 5.5, J _{, 3 ', 4'} 5 , H-3 '), 4.03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J _{4 ', 5'} 4 H-4 '), 3.62 m (2H, H-5' )

Пример 10. Синтез N⁴-амино-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIe, R=R¹=H, R²=NH₂)Example 10. Synthesis of N ⁴ -amino-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIe, R = R ¹ = H, R ² = NH ₂ )

N⁴-амино-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIe, R=R¹=Н, R²=NH₂) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 39%.N ^4- amino-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIe, R = R ¹ = H, R ² = NH ₂ ) was obtained from 2'-azido-2'-deoxyuridine (IIIe), as in example 6, with a total yield of 39%.

N⁴-амино-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIe, R=R¹=Н, R²=NH₂) М=257.25, С₉Н₁₅O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, H-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_,4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, N⁴-Amino-2'-amino-2'-deoxycytidine.N ⁴ -amino-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIe, R = R ¹ = H, R ² = NH ₂ ) M = 257.25, C ₉ H ₁₅ O ₄ , UV: pH 7.5: λmax 271 (ε8200), pH 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d ₆ ; δ, ppm; (J, Hz)]: 7.79 d (1H, J _5.6 7.5, H-6), 7.12 br s (2H, NH ₂ ), 5.79 d (1H, H-5) , 5.67 d, (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.31 br t (1H, J _{, 2.3'} 5.5, J _{, 3 ', 4'} 5, H-3 '), 4.03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J _{, 4 ', 5'} 4 H-4 '), 3.62 m (2H, N ⁴ -Amino-2'-amino-2'-deoxycytidine.

Пример 11. Синтез N⁴-бензил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIf, R=R¹=Н, R²=СН₂С₆Н₅)Example 11. Synthesis of N ^4- benzyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIf, R = R ¹ = H, R ² = CH ₂ C ₆ H ₅ )

N⁴-бензил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIf, R=R¹=Н, R²=NHCH₂С₆Н₅) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 52%.N ^4- benzyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIf, R = R ¹ = H, R ² = NHCH ₂ C ₆ H ₅ ) is obtained from 2'-azido-2'-deoxyuridine (IIIe), as in example 6, with a total yield of 52%.

N⁴-бензил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIf, R=R¹=Н, R²=NHCH₂C₆H₅), М=332.36, C₁₆H₂₀N₄O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,25 m (5H, С₆Н₅) 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,4 s (2H, СН ₂С₆Н₅), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5'). N⁴-Benzyl-2'-amino-2'-deoxycytidineN ^4- benzyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIf, R = R ¹ = H, R ² = NHCH ₂ C ₆ H ₅ ), M = 332.36, C ₁₆ H ₂₀ N ₄ O ₄ , UV: pH 7.5: λmax 271 (ε8200), pH 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d ₆ ; δ, ppm; (J, Hz)]: 7.79 d (1H, J _5.6 7.5, H-6), 7.25 m (5H, C ₆ H ₅ ) 7.12 br s (2H, NH ₂ ) 5.79 d (1H, H-5), 5.67 d, (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.4 s (2H, CH ₂ C ₆ H ₅ ), 4.31 br t (1H, J _{, 2.3 '} 5.5, J _{, 3', 4 '} 5, H-3'), 4.03 t (1H, H-2 '), 3.90 br q (1H, J _{4 ', 5'} 4 H-4 '), 3.62 m (2H, H-5'). N ⁴ -Benzyl-2'-amino-2'-deoxycytidine

Пример 12. Синтез N⁴-диэтил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIg, R=Н, R¹=R²=C₂H₅)Example 12. Synthesis of N ^4- diethyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIg, R = H, R ¹ = R ² = C ₂ H ₅ )

N⁴-диэтил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIg, R=H, R¹=R²=C₂H₅) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 58%.N ^4- diethyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIg, R = H, R ¹ = R ² = C ₂ H ₅ ) was obtained from 2'-azido-2'-deoxyuridine (IIIe), as in the example 6, with a total yield of 58%.

N⁴-диэтил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIg, R=Н, R¹=R²=C₂H₅), М=298.34, C₁₃H₂₂N₄O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d⁶; δ, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.50 m (5H, H-4' + (СН₂СН₃)₂), 3,62 m (2H, Н-5'), 1.1 s (6H, (CH ₂CH₃)₂). N⁴-Diethyl-2'-amino-2'-deoxycytidine.N ^4- diethyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIg, R = H, R ¹ = R ² = C ₂ H ₅ ), M = 298.34, C ₁₃ H ₂₂ N ₄ O ₄ , UV: pH 7 5: λmax 271 (ε8200), pH 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d ⁶ ; δ, ppm; (J, Hz)]: 7.79 d (1H, J _5.6 7.5, H-6), 7.12 br s (2H, NH ₂ ), 5.79 d (1H, H-5) , 5.67 d, (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.31 br t (1H, J _{, 2.3'} 5.5, J _{, 3 ', 4'} 5, H-3 '), 4.03 t (1H, H-2'), 3.50 m (5H, H-4 '+ (CH ₂ CH ₃ ) ₂ ), 3.62 m (2H, H-5 '), 1.1 s (6H, ( CH ₂ CH ₃ ) ₂ ). N ⁴ -Diethyl-2'-amino-2'-deoxycytidine.

Пример 13. Синтез N⁴-этил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIh R=R¹=H, R²=C₂H₅)Example 13. The synthesis of N ^4- ethyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIh R = R ¹ = H, R ² = C ₂ H ₅ )

N⁴-этил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIh R=R¹=Н, R²=С₂H₅ получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 53%. N⁴-этил-2'-амино-2'-дезоксицитидин (VIIIh R=R¹=Н, R²=С₂Н₅), M=270.29, C₁₁H₁₈N₄O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; 5, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, Н-5), 5,67 d,(1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,3 1br t(1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5' a, b), 3,21 m (2H, CH ₂СН₃), 1,03 m (3H, СН₂ СН ₃). N⁴-Ethyl-2'-атто-2'-deoxycytidine.N ^4- ethyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIh R = R ¹ = H, R ² = C ₂ H ₅ obtained from 2'-azido-2'-deoxyuridine (IIIe), as in example 6, with a total yield of 53%. N ^4- ethyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIh R = R ¹ = H, R ² = C ₂ H ₅ ), M = 270.29, C ₁₁ H ₁₈ N ₄ O ₄ , UV: pH 7.5: λmax 271 (ε8200), pH 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d ₆ ; 5, ppm; (J, Hz)]: 7.79 d (1H, J _5.6 7.5, H-6), 7.12 br s (2H, NH ₂ ), 5.79 d (1H, H-5), 5.67 d, (1H, J _{1 ', 2 '} 5.5, H-1'), 4.3 1br t (1H, J _{, 2.3 '} 5.5, J _{, 3', 4 '} 5, H-3'), 4.03 t (1H , H-2 '), 3.90 br q (1H, J _{4', 5 '} 4 H-4'), 3.62 m (2H, H-5 'a, b), 3.21 m (2H, CH ₂ CH ₃ ), 1.03 m (3H, CH ₂ CH ₃ ). N ⁴ -Ethyl-2'-atto-2'-deoxycytidine.

Пример 14. Синтез N⁴-метил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIi, R=R¹=Н, R²=СН₃)Example 14. Synthesis of N ⁴ -methyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIi, R = R ¹ = H, R ² = CH ₃ )

N⁴-метил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIi, R=R¹=Н, R²=СН,) получен из 2'-азидо-2'-дезоксиуридина (IIIe), как в примере 6, с общим выходом 58%. N⁴-метил-2'-амино-2'-дезоксицитидина (VIIIi, R=R¹=Н, R²=СН₃), M=256.26, C₁₀H₁₆N₄O₄, УФ: рН 7,5: λmax 271 (ε8200), рН 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d₆; 5, м.д.; (J, Гц)]: 7,79 d (1H, J_5,6 7,5, H-6), 7,12 br s (2H, NH₂), 5,79 d (1H, H-5), 5,67 d, (1H, J_1',2' 5,5, Н-1'), 4,31 br t (1H, J_,2,3' 5,5, J_,3',4' 5, H-3'), 4,03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H,.J_4',5' 4 H-4'), 3,62 m (2H, H-5'), 2,71 m (1H, CH₃). N⁴-Methyl-2'-amino-2'-deoxycytidine.N ^4- methyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIi, R = R ¹ = H, R ² = CH,) was obtained from 2'-azido-2'-deoxyuridine (IIIe), as in example 6, with a total yield of 58%. N ^4- methyl-2'-amino-2'-deoxycytidine (VIIIi, R = R ¹ = H, R ² = CH ₃ ), M = 256.26, C ₁₀ H ₁₆ N ₄ O ₄ , UV: pH 7.5 : λmax 271 (ε8200), pH 2: λmax 276 (ε11900), [DMSO-d ₆ ; 5, ppm; (J, Hz)]: 7.79 d (1H, J _5.6 7.5, H-6), 7.12 br s (2H, NH ₂ ), 5.79 d (1H, H-5) , 5.67 d, (1H, J _{1 ', 2'} 5.5, H-1 '), 4.31 br t (1H, J _{, 2.3'} 5.5, J _{, 3 ', 4'} 5, H-3 '), 4.03 t (1H, H-2'), 3.90 br q (1H, .J _{4 ', 5'} 4 H-4 '), 3.62 m (2H, H- 5 '), 2.71 m (1H, CH ₃ ). N ⁴ -Methyl-2'-amino-2'-deoxycytidine.

Пример 15. Оценка цитотоксичности 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидовExample 15. Evaluation of the cytotoxicity of 2'-amino-2'-deoxynucleosides

Цитотоксичность соединений оценивают путем добавления разведений каждого препарата в среде Игла MEM к монослою клеточной культуры Vero в лунки 96-луночного планшета ("Cel-Cult", England) до конечных концентраций 0,1-400 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в CO₂-инкубаторе в течение 5 суток. Контролем служат клетки без добавления соединения (1). Жизнеспособность клеток оценивают по оптической плотности (при 570 нм) после окрашивания раствором кристаллического фиолетового (1,3 г красителя, 50 мл этанола, до 700 мл Н₂О, 300 мл 40% формалина) в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Токсичность различных доз соединений определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля, по полученным результатам рассчитывают дозу, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD₅₀). Данные приведены в таблице 1. Следует отметить, что 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды обладают слабой цитотоксичностью.The cytotoxicity of the compounds is assessed by adding dilutions of each preparation in MEM Eagle’s medium to the Vero cell culture monolayer in the wells of a 96-well plate (Cel-Cult, England) to final concentrations of 0.1-400 μg / ml (three wells per dose ) followed by cultivation at 37 ° C in a CO ₂ incubator for 5 days. The control cells are without the addition of compound (1). Cell viability is assessed by optical density (at 570 nm) after staining with a crystal violet solution (1.3 g of dye, 50 ml of ethanol, up to 700 ml of H ₂ O, 300 ml of 40% formalin) for 1.5 hours at room temperature. The toxicity of various doses of the compounds is determined by the viability of the cells relative to the control, according to the results obtained, the dose is calculated that reduces the cell viability by 50% (CD ₅₀ ). The data are shown in table 1. It should be noted that 2'-amino-2'-deoxynucleosides have weak cytotoxicity.

Пример 16. Исследование влияния 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов на репродукцию вируса кори в культуре клеток VeroExample 16. The study of the effect of 2'-amino-2'-deoxynucleosides on the reproduction of measles virus in a culture of Vero cells

Исследование противовирусной активности экспериментальных препаратов в отношении вируса кори проводят на перевиваемой линии чувствительных клеток почки зеленой мартышки Vero. Для заражения используют супернатант инфицированных клеток, хранившийся в жидком азоте, множественность заражения составляет 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. В лунки 96-луночного планшета ("Cel-Cult", England) помещают суспензию клеток Vero с посевной концентрацией 150 тыс кл/мл, инкубируют 2 суток при 37°С в СО₂-инкубаторе. После формирования монослоя из лунок планшета удаляют культуральную жидкость, вносят вирус (15 мкл) и одновременно такой же объем ростовой среды с исследуемым соединением до конечной концентрации 0,1-400 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу). Контролями служат инфицированные клетки Vero без добавления препарата (вместо препарата вносят такое же количество среды Игла MEM без добавок) и неинфицированные клетки.A study of the antiviral activity of experimental drugs against measles virus is carried out on the transplanted line of sensitive cells of the Vero green monkey kidney. For infection using the supernatant of infected cells stored in liquid nitrogen, the multiplicity of infection is 0.2-0.5 infectious units per cell. A suspension of Vero cells with a seed concentration of 150 thousand cells / ml was placed in the wells of a 96-well plate (Cel-Cult, England), incubated for 2 days at 37 ° C in a CO ₂ incubator. After the formation of a monolayer, the culture fluid is removed from the wells of the plate, the virus is introduced (15 μl) and at the same time the same volume of growth medium with the test compound to a final concentration of 0.1-400 μg / ml (three wells per dose). The controls are infected Vero cells without the addition of the drug (instead of the drug, the same amount of MEM needle medium is added without additives) and uninfected cells.

Адсорбцию вируса проводят в течение 1,5 часов при 37°С в СО₂-инкубаторе. Затем в лунки вносят питательную среду Игла MEM с добавлением 2% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина, 100 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл линкомицина и исследуемым соединением до конечной концентрации 0,1-400 мкг/мл. В контрольные лунки вносят питательную среду со всеми добавками, но без препарата. Через 5 суток культивирования удаляют культуральную жидкость, вносят по 30 мкл раствора кристаллического фиолетового в каждую лунку, выдерживают 1,5 часа при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 570 нм. Относительную степень защиты инфицированных клеток рассчитывают по формуле:Virus adsorption is carried out for 1.5 hours at 37 ° C in a CO ₂ incubator. Nutrient medium MEM is added to the wells with the addition of 2% fetal bovine serum pre-inactivated by heating at 56 ° C for 30 minutes, 300 mg / ml L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin, 100 μg / ml lincomycin and the test compound to a final concentration of 0.1-400 μg / ml. A nutrient medium with all additives, but without the drug, is added to control wells. After 5 days of cultivation, the culture fluid is removed, 30 μl of a crystal violet solution is added to each well, incubated for 1.5 hours at room temperature and the absorbance is measured on a spectrophotometer at a wavelength of 570 nm. The relative degree of protection of infected cells is calculated by the formula:

Защита (%)=(А-O)/(В-O)·100%,Protection (%) = (A-O) / (B-O) · 100%,

где А - % жизнеспособности инфицированных клеток в присутствии соединения на 5 сутки культивирования, В - % жизнеспособности в контроле клеток, О - % жизнеспособности инфицированных клеток без добавления соединения (контроль вируса).where A is the% viability of infected cells in the presence of the compound on the 5th day of cultivation, B is% viability in the control of cells, O is% viability of infected cells without adding the compound (virus control).

По полученным данным строят график зависимости защиты клеток от возрастающих доз соединения (для соединения VIIIa на фиг.1) и находят дозу препарата, на 50% защищающую клетки (ED₅₀). Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS), определяют как отношение концентрации соединения, токсичной для 50% клеток (CD₅₀), к концентрации, на 50% защищающей клетки от гибели (ED₅₀):According to the data obtained, a graph is built of the dependence of cell protection on increasing doses of the compound (for compound VIIIa in FIG. 1) and the dose of the drug is found that protects cells by 50% (ED ₅₀ ). The therapeutic index, or selectivity index (IS), is defined as the ratio of the concentration of a compound toxic to 50% of the cells (CD ₅₀ ) to the concentration of 50% protecting cells from death (ED ₅₀ ):

IS=CD₅₀/ED₅₀ IS = CD ₅₀ / ED ₅₀

В таблице 1 представлены результаты по цитотоксичностии и противокоревой активности 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов. Из этих данных видно, что выраженной противовирусной активностью кори обладает соединение (VIIIa), результаты исследования которого показаны в табл. 2. Соединение (IVa) обладает противокоревой активностью, сравнимой с антивирусным действием рибавирина.Table 1 presents the results on the cytotoxicity and anti-measles activity of 2'-amino-2'-deoxynucleosides. From these data it is seen that compound (VIIIa) has a pronounced antiviral activity of measles, the results of the study of which are shown in Table. 2. Compound (IVa) has anti-measles activity comparable to the antiviral effect of ribavirin.

Таблица 1
Данные по цитотоксичности и противовирусной активности 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов в отношении вируса кориTable 1
Data on the cytotoxicity and antiviral activity of 2'-amino-2'-deoxynucleosides against measles virus СоединениеCompound CD₅₀, μМCD ₅₀ , μM ED₅₀, μMED ₅₀ , μM ISIS IVaIva 823823 140140 5,95.9 IVcIvc >620,9> 620.9 не достигаетdoes not reach   VIIIaVIIIa 846,7846.7 25,425,4 33,333.3 VIIIdVIIId >774,6> 774.6 не достигаетdoes not reach   VIIIfViiif >601,9> 601.9 601,9601.9 >1> 1 VIIIgVIIIg >670,4> 670.4 670,4670.4 >1> 1 VIIIiVIIIi >780,5> 780.5    

Из таблицы 2 видно, что 50% эффективная доза рибавирина равна 57 мкМ или 12,4 мкг/мл, что соответствует данным литературы [12]. 50% эффективная доза соединения (VIIIa) составила 25,4 мкМ или 6,25 мкг/мл. 50% цитотоксичные дозы, полученные для рибавирина и соединения (VIIIa), отличаются незначительно (846,7 и 823 мкМ соответственно), индексы селективности, или терапевтические индексы, равны 14,37 и 33,3 соответственно. Таким образом, противовирусное действие соединения (VIIIa) в отношении вируса кори превосходит антивирусную активностью рибавирина in vitro.From table 2 it is seen that the 50% effective dose of ribavirin is equal to 57 μm or 12.4 μg / ml, which corresponds to the literature [12]. The 50% effective dose of compound (VIIIa) was 25.4 μM or 6.25 μg / ml. 50% of the cytotoxic doses obtained for ribavirin and compound (VIIIa) differ slightly (846.7 and 823 μM, respectively), selectivity indices, or therapeutic indices, are 14.37 and 33.3, respectively. Thus, the antiviral effect of compound (VIIIa) against measles virus is superior to the antiviral activity of ribavirin in vitro.

Пример 17. Исследование влияния соединения (IVa) на репродукцию вируса кори в культуре клеток Vero в комбинации с рибавирином.Example 17. The study of the effect of compound (IVa) on the reproduction of measles virus in a culture of Vero cells in combination with ribavirin.

Исследование противовирусной активности заявляемого соединения в комбинации с рибавирином проводят на перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки Vero. Для заражения используют супернатант инфицированных клеток, хранившийся в жидком азоте, множественность заражения составляет 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. В лунки 96-луночного планшета ("Cel-Cult", England) помещают суспензию клеток Vero с посевной концентрацией 150 тыс кл/мл, инкубируют 2 суток при 37°С в CO₂-инкубаторе. После формирования монослоя из лунок планшета удаляют культуральную жидкость, вносят вирус (15 мкл) и сразу такой же объем ростовой среды с исследуемыми соединениями в концентрации: рибавирин - 3,125-25 мкг/мл, соединение (IVa) - 8,750-70 мкг/мл (по три лунки на каждую комбинацию доз). Контролями служат инфицированные клетки Vero без добавления препаратов (вносят такое же количество среды RPMI-1640 без добавок) и неинфицированные клетки.A study of the antiviral activity of the claimed compound in combination with ribavirin is carried out on the transplanted cell line of the Vero green monkey kidney. For infection using the supernatant of infected cells stored in liquid nitrogen, the multiplicity of infection is 0.2-0.5 infectious units per cell. Vero cell suspension with a seed concentration of 150 thousand cells / ml was placed in the wells of a 96-well plate (Cel-Cult, England), incubated for 2 days at 37 ° C in a CO ₂ incubator. After the formation of a monolayer, the culture fluid is removed from the wells of the plate, the virus is introduced (15 μl) and the same volume of growth medium with the studied compounds at once is concentrated: ribavirin - 3.125-25 μg / ml, compound (IVa) - 8.750-70 μg / ml ( three wells for each combination of doses). Controls are infected Vero cells without the addition of drugs (add the same amount of RPMI-1640 medium without additives) and uninfected cells.

Адсорбцию вируса проводят в течение 1,5 часов при 37°С в CO₂-инкубаторе. Затем в лунки вносят питательную среду RPMI-1640 с добавлением 2% фетальной сыворотки КРС, предварительно инактивированной прогреванием при 56°С в течение 30 минут, 300 мг/мл L-глютамина и 100 мкг/мл гентамицина, содержащую исследуемую комбинацию соединений в нужной концентрации. В контрольные лунки вносят питательную среду со всеми добавками, но без соединений. Через 5 суток культивирования удаляют питательную среду, вносят по 30 мкл на лунку раствора генциан виолета, выдерживают 1,5 часа при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 570 нм. Относительную степень защиты инфицированных клеток от гибели различными комбинациями рибавирина и соединения (IVa) рассчитывают по формуле:Virus adsorption is carried out for 1.5 hours at 37 ° C in a CO ₂ incubator. Then RPMI-1640 nutrient medium was added to the wells with the addition of 2% fetal bovine serum pre-inactivated by heating at 56 ° C for 30 minutes, 300 mg / ml L-glutamine and 100 μg / ml gentamicin containing the studied combination of compounds in the desired concentration . A nutrient medium was added to the control wells with all additives, but no compounds. After 5 days of cultivation, the nutrient medium is removed, 30 μl per well of a solution of gentian violet is added, it is kept for 1.5 hours at room temperature and the optical density is measured on a spectrophotometer at a wavelength of 570 nm. The relative degree of protection of infected cells from death by various combinations of ribavirin and compound (IVa) is calculated by the formula:

Защита (%)=(А-O)/(В-O)×100,Protection (%) = (A-O) / (B-O) × 100,

где А - % жизнеспособности инфицированных клеток в присутствии соединений на 4 сутки культивирования, В - % жизнеспособности в контроле клеток, О - % жизнеспособности инфицированных клеток без добавления соединения (1) и (или) рибавирина (контроль вируса).where A is the% viability of infected cells in the presence of compounds on the 4th day of cultivation, B is% viability in the control of cells, O is% viability of infected cells without adding compound (1) and (or) ribavirin (virus control).

По полученным данным строят графики зависимости защиты клеток от возрастающих доз рибавирина и соединения (IVa) (фиг.2) и находят дозу рибавирина, которая в сочетании с соединением (IVa) на 50% защищает клетки от гибели, и дозу соединения (IVa), которая в сочетании с рибавирином на 50% защищает клетки от гибели (ID₅₀). В таблице 3 представлены значения ID₅₀, рассчитанные для разных сочетаний рибавирина и соединения (IVa).According to the data obtained, graphs of the dependence of cell protection on increasing doses of ribavirin and compound (IVa) are constructed (Fig. 2) and a dose of ribavirin is found, which, in combination with compound (IVa), protects cells from death by 50%, and the dose of compound (IVa), which in combination with ribavirin protects cells from death by 50% (ID ₅₀ ). Table 3 shows the ID ₅₀ values calculated for different combinations of ribavirin and compound (IVa).

Из таблицы 3 видно, что использование в комбинации с рибавирином соединение (IVa) в концентрации 70 мкМ снижает 50% эффективную дозу рибавирина в 4,45 раза.From table 3 it is seen that the use of compound (IVa) in combination with ribavirin at a concentration of 70 μM reduces a 50% effective dose of ribavirin by 4.45 times.

Пример 18. Влияние соединеия (VIIIa) на репродукцию вируса Марбург в культуре клеток Vero.Example 18. The effect of compound (VIIIa) on the reproduction of the Marburg virus in Vero cell culture.

Исследование проводят с помощью количественного определения вируса в культуре клеток под полужидким агаровым покрытием.The study is carried out using a quantitative determination of the virus in cell culture under a semi-liquid agar coating.

Перевиваемую линию чувствительных клеток почки зеленой мартышки Vero вносят в пенфлаконы (посевная концентрация 200 тыс кл/мл) и инкубируют 2 суток при 37°С в атмосфере 5% CO₂. После формирования монослоя из пенфлаконов удаляют культуральную жидкость, вносят вирус в дозе 5,5×10⁴ БОЕ в объеме 0,1 мл. Адсорбцию проводят при 37°С. Затем во флаконы вносят по 2 мл полужидкого агарового покрытия (среда Игла MEM с 2% сывороки, 10% агара (2,4% гель), антибиотиками по 100 ЕД/мл и препаратом) и инкубируют 6 суток при 37°С. Контролями служат инфицированные клетки Vero без добавления препарата (контроль вируса) и неинфицированные клетки (контроль клеток). После окончания культивирования агаровое покрытие удаляют, монослой окрашивают кристаллическим фиолетовым в течение 1 часа, промывают водой и подсчитывают количество бляшек. Результаты представлены в таблице 4.A transplantable line of sensitive cells of the Vero green monkey kidney is introduced into penflasks (inoculum concentration of 200 thousand cells / ml) and incubated for 2 days at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ . After the monolayer is formed, the culture fluid is removed from the penflasks, the virus is introduced in a dose of 5.5 × 10 ⁴ PFU in a volume of 0.1 ml. Adsorption is carried out at 37 ° C. Then, 2 ml of semi-liquid agar coating was added to the vials (MEM Eagle medium with 2% serum, 10% agar (2.4% gel), 100 U / ml antibiotics and the drug) and incubated for 6 days at 37 ° C. Controls are infected Vero cells without the addition of a drug (virus control) and uninfected cells (cell control). After cultivation, the agar coating was removed, the monolayer was stained with crystal violet for 1 hour, washed with water and the number of plaques was counted. The results are presented in table 4.

По данным, представленным в таблице 4, определяют комбинационный индекс, FIC, который равен:According to the data presented in table 4, determine the combination index, FIC, which is equal to:

FIC=ID_{50 вещества А в смеси}/ID_{50 вещества А}+ID_{50 вещества В в смеси}/ID_{50 вещества В} FIC = ID _{50 substance A in the mixture} / ID _{50 substance A} + ID _{50 substance B in the mixture} / ID _{50 substance B}

Комбинационный индекс позволяет оценить характер взаимодействия препаратов в смеси: если FIC меньше 1, делают вывод о синергическом взаимодействии препаратов, если FIC больше 1, то об антагонистическом взаимодействии [13]. Комбинационный индекс для комбинации рибавирина и соединения (IVa) равен:The combination index makes it possible to assess the nature of the interaction of drugs in the mixture: if FIC is less than 1, a conclusion is made about the synergistic interaction of drugs, if FIC is more than 1, then about antagonistic interaction [13]. The combination index for the combination of ribavirin and compound (IVa) is:

FIC=12,8/57+49/140=0,575, т.е. взаимодействие рибавирина и соединения (IVa) синергическое.FIC = 12.8 / 57 + 49/140 = 0.575, i.e. the interaction of ribavirin and compound (IVa) is synergistic.

Таблица 4
Ингибирование репродукции вируса Марбург соединением (VIIIa)Table 4
Inhibition of Marburg Virus Reproduction by Compound (VIIIa) Концентрация препарата, мкг/млThe concentration of the drug, mcg / ml Количество бляшекPlaque count IMB-119IMB-119 Контроль вирусаVirus control Общее*General * x±s_x x ± s _x Общее*General * x±S_x x ± S _x 100,0100.0 4141 14,0±1,514.0 ± 1.5 78,078.0 26,0±2,026.0 ± 2.0 50,050,0 3838 12,6±2,812.6 ± 2.8 25,025.0 3636 12,0±2,012.0 ± 2.0 12,512.5 4444 14,6±1,214.6 ± 1.2 6,256.25 7373 24,3±2,824.3 ± 2.8 * Сумма трех измерений* Sum of three measurements

Из представленных в таблице 4 данных видно, что ингибирование репродукции вируса Марбург не достигало 100% даже при дозе препарата 100 мкг/мл, однако концентрации соединения (VIIIa), равные 12,5 мкг/мл и выше, снижали количество вирусиндуцированных бляшек на 50%.From the data presented in table 4, it can be seen that the inhibition of Marburg virus reproduction did not reach 100% even at a dose of 100 μg / ml, however, concentrations of compound (VIIIa) of 12.5 μg / ml and higher reduced the number of virus-induced plaques by 50% .

Таким образом, показано, что 2'-амино-2'-дезоксиуридин и 2'-амино-2'-дезоксицитидин обладают слабой цитотоксичностью в культуре клеток Vero (CD₅₀ равны 823 и 846,7 мкМ соответственно) и выраженным противовирусным действием в отношении вируса кори (ID₅₀ равны 140 мкг и 25,4 мкМ, соответственно). Кроме того, 2'-амино-2'-дезоксицитидин оказывает противовирусное действие в отношении вируса Марбург: в концентрации 12,5 мкг/мл и более соединение (VIIIa) снижает количество вирусиндуцированных бляшек или вирусиндуцированного цитопатического действия в культуре клеток Vero на 50%.Thus, it was shown that 2'-amino-2'-deoxyuridine and 2'-amino-2'-deoxycytidine have weak cytotoxicity in Vero cell culture (CD ₅₀ are 823 and 846.7 μM, respectively) and a pronounced antiviral effect on measles virus (ID ₅₀ are 140 μg and 25.4 μM, respectively). In addition, 2'-amino-2'-deoxycytidine has an antiviral effect against Marburg virus: at a concentration of 12.5 μg / ml or more, compound (VIIIa) reduces the number of virus-induced plaques or virus-induced cytopathic effects in Vero cell culture by 50%.

2'-Амино-2'-дезоксицитидин по своим противовирусным свойствам превосходит препарат сравнения рибавирин, и в связи с этим представляется перспективной разработка лекарственного препарата на основе соединения (VIIIa) для терапии инфекций, вызванных вирусами кори или Марбург.2'-amino-2'-deoxycytidine is superior in its antiviral properties to the reference drug ribavirin, and in this regard, it seems promising to develop a drug based on compound (VIIIa) for the treatment of infections caused by measles or Marburg viruses.

Источники информацииSources of information

1. Mason W.H. Measles. // Adolesc. Med. - 1995. - v.6. - p.1-14.1. Mason W.H. Measles. // Adolesc. Med. - 1995. - v.6. - p. 1-14.

2. Hosoya M., Shigeta S., Nakamura K., De Clerq E. Inhibitory effect of selected antiviral compounds on measles (SSPE) virus replication in vitro. // Antiviral res. - 1989. - v.12. - p.87-98.2. Hosoya M., Shigeta S., Nakamura K., De Clerq E. Inhibitory effect of selected antiviral compounds on measles (SSPE) virus replication in vitro. // Antiviral res. - 1989. - v. 12. - p. 87-98.

3. Shigeta S., Mori S., Baba M., Honzumi К., Nakamura К., Numazaki Y., Matsuda A., Obara T. Antiviral activities of ribavirin, 5-ethynyl-1-b-ribofuranosylimidazole-4-carboxamide, and 6'-(R)-methylneplanocin A against several ortho- and paramyxoviruses. // Antimicrob. Agents chemother. - 1992. - v.36. - p.435-9.3. Shigeta S., Mori S., Baba M., Honzumi K., Nakamura K., Numazaki Y., Matsuda A., Obara T. Antiviral activities of ribavirin, 5-ethynyl-1-b-ribofuranosylimidazole-4- carboxamide, and 6 '- (R) -methylneplanocin A against several ortho- and paramyxoviruses. // Antimicrob. Agents chemother. - 1992. - v. 36. - p. 435-9.

4. Заявка на патент РФ №96117323, МПК С 07 Н 19/06, опубл. 10.12.1998.4. Application for RF patent No. 96117323, IPC C 07 H 19/06, publ. 12/10/1998.

5. Международная заявка WO № 00/15214, МПК А 61 К 31/19, опубл. 23.03.20005. International application WO No. 00/15214, IPC A 61 K 31/19, publ. 03/23/2000

6. Verheyden. J.P.H., Wagner. D., Moffat. J.G. // Synthesis of some pyrimidine 2'-amino-2'-deoxynucleosides. // J. Org. Chem. V.36, pp.250-254, 1971.6. Verheyden. J.P. H., Wagner. D., Moffat. J.G. // Synthesis of some pyrimidine 2'-amino-2'-deoxynucleosides. // J. Org. Chem. V.36, pp. 250-254, 1971.

7. Wagner. D., Verheyden. J.P.H., Moffat. J.G. // Preparation and synthetic utility of some organotin derivatives of nucleosides. // J. Org. Chem., V.39, pp.24-30,1974.7. Wagner. D., Verheyden. J.P. H., Moffat. J.G. // Preparation and synthetic utility of some organotin derivatives of nucleosides. // J. Org. Chem., V.39, pp. 24-30, 1974.

8. Matsuda. A., Yasuoka. J., Sasaki Т., Ueda. Т. // Nucleosides and Nucleotides. 95. Improved synthesis of 1-(2-azido-2-deoxy-β-D-arabinofuranosyl)cytosine (Cytarazide) and thymine. Inhibitory spectrum of cytarazide on the growth of various human tumor cells in vitro. // J. Med. Chem., V.34, pp.999-1002, 1991.8. Matsuda. A., Yasuoka. J., Sasaki, T., Ueda. T. // Nucleosides and Nucleotides. 95. Improved synthesis of 1- (2-azido-2-deoxy-β-D-arabinofuranosyl) cytosine (Cytarazide) and thymine. Inhibitory spectrum of cytarazide on the growth of various human tumor cells in vitro. // J. Med. Chem., V.34, pp. 999-1002, 1991.

9. McGee. D.P.C., Vaughn-Settle. A., Vargeese. C., Zhai. Y. // 2'-Amino-2'-deoxyuridine via an intermolecular cyclization of a trichloroacetimidate // J. Org. Chem., V.61, pp.781-785, 1996.9. McGee. D.P.C., Vaughn-Settle. A., Vargeese. C., Zhai. Y. // 2'-Amino-2'-deoxyuridine via an intermolecular cyclization of a trichloroacetimidate // J. Org. Chem., V.61, pp. 781-785, 1996.

10. Barwoiff, D., Langen, P. // in Townsend, L.B. and Tipson, R.S., (eds.) Nucleic Acid Chemistry, Wiley, NY. Vol.1, pp.359-366.10. Barwoiff, D., Langen, P. // in Townsend, L.B. and Tipson, R.S., (eds.) Nucleic Acid Chemistry, Wiley, NY. Vol. 1, pp. 359-366.

11. Alexandrova L.A., Skoblov A.Yu., Jasko M.V., Victorova L.S., Krayevsky A.A., 2'-Deoxynucleoside 5'-triphosphates modified at α-, β- and γ-phosphates as substrates for DNA polymerases, Nucl. Acids Res., 1998, 26, №3, 778-786.11. Alexandrova L.A., Skoblov A.Yu., Jasko M.V., Victorova L.S., Krayevsky A.A., 2'-Deoxynucleoside 5'-triphosphates modified at α-, β- and γ-phosphates as substrates for DNA polymerases, Nucl. Acids Res., 1998, 26, No. 3, 778-786.

12. Watanabe W., Konno К., Ijichi К., Inoue H., Yokota Т., Shigeta S. MTT colorimetric assay system for the screening of anti-orthomtxo- and anti-paramyxoviral agents. // J.Virol. Nethods. - 1994. - v.48. - p.257-65.12. Watanabe W., Konno K., Ijichi K., Inoue H., Yokota T., Shigeta S. MTT colorimetric assay system for the screening of anti-orthomtxo- and anti-paramyxoviral agents. // J. Virol. Nethods. - 1994. - v. 48. - p. 257-65.

13. Suhnel J. Evaluation of synergism or antagonism for the combined action of antiviral agents. // Antiviral res. - 1990. - v.13. - p.23-40.13. Suhnel J. Evaluation of synergism or antagonism for the combined action of antiviral agents. // Antiviral res. - 1990. - v.13. - p.23-40.

Claims (1)

2'-Амино-2'-дезоксинуклеозиды, имеющие формулу2'-amino-2'-deoxynucleosides having the formula

где R = Н, алкил, аминоалкил, where R = H, alkyl, aminoalkyl, R¹ = (R²NR³), где R² и/или R³ = Н, ОН, NH₂, алкил, бензил, R ¹ = (R ² NR ³ ), where R ² and / or R ³ = H, OH, NH ₂ , alkyl, benzyl, при условии, что R не представляет собой Н или метил, когда R² и R³ = Н.provided that R is not H or methyl when R ² and R ³ = N.

Images