RU2261911C1 - Method for preparing biocatalyst and biocatalyst for detoxifying organophosphorus compounds - Google Patents
Method for preparing biocatalyst and biocatalyst for detoxifying organophosphorus compounds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2261911C1 RU2261911C1 RU2004107942/13A RU2004107942A RU2261911C1 RU 2261911 C1 RU2261911 C1 RU 2261911C1 RU 2004107942/13 A RU2004107942/13 A RU 2004107942/13A RU 2004107942 A RU2004107942 A RU 2004107942A RU 2261911 C1 RU2261911 C1 RU 2261911C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biocatalyst
- immobilized
- enzyme
- protein
- preparing
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов, может быть использовано для удаления фосфорорганических соединений (ФОС) с различных поверхностей, в том числе кожных покровов, и последующей их детоксикации, а также для применения в качестве эффективных средств индивидуальной защиты.The invention relates to biotechnology, and in particular to methods for producing biocatalysts based on immobilized enzymes, can be used to remove organophosphorus compounds (FOS) from various surfaces, including skin, and their subsequent detoxification, as well as for use as effective means of individual protection.
Фосфорорганические соединения представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфосфоновых кислот и их производных, которые широко применяются в качестве боевых отравляющих веществ (БОВ) нервно-паралитического действия, в качестве пестицидов в сельском хозяйстве, а также в качестве бытовых инсектицидов [М.A.Gallo, N.J.Lawryk, Organic phosphorous pesticides. The Handbook of Pesticide Toxicology, Academic press, San Diego, CA 1991; Somani, S.M., Solana, R.P., Dube, S.N., Chemical warfare agents. San Diego: Academic Press, 1992, p.67-123; Вредные вещества в промышленности. Справочник; Изд. 7-е. В трех томах. Т.III. Неорганические и элементоорганические соединения. Под ред. Н.В.Лазарева, И.Д.Гадаскиной: Л.: Химия, 1977, 608 с.]. Ежегодное применение ФОС в больших количествах (десятки и сотни тысяч тонн в год - в зависимости от страны мира) для нужд сельского хозяйства, а также низкие скорости разложения ФОС приводят к накоплению этих веществ в почвах, грунтовых и речных водах, в различных сельскохозяйственных продуктах, продуктах переработки сельскохозяйственного сырья, индустриальных отходах и домашней пыли [Fukushima М., Yamaguchi Y., Evalution of the status of industrial chemical pollution (triesters of organophosphorous compounds).// Biochemistry, 1994, V. 23, p.74-76]. Токсичное воздействие ФОС на живые организмы может быть острым или кумулятивным, проявляющимся в различного рода расстройствах нервной системы, вплоть до появления нервно-паралитического эффекта [Gallo M.A., Lawryk N.J., Organic phosphorous pesticides. The Handbook of Pesticide Toxicology, Academic press, San Diego, CA, 1991]. ФОС также являются сильными мутагенами, вызывающими появление множественных хромосомных аберраций [Краснюк Е.П., Лубянова И.П., Профессиональные заболевания работников сельского хозяйства.// Ред. Кундиев Ю.И., Краснюк Е.П.. Киев: Здоровье, 1989, с.38-50]. При проведении мероприятий, связанных с хранением, транспортировкой и уничтожением ФОС, являющихся БОВ, требуются соответствующие средства защиты персонала. В случае аварийной ситуации в качестве средств детоксикации ФОС используются химические составы (например, состав на основе гипохлорита, а также состав DS2, представляющий собой смесь диэтилентриамина, этиленгликоля и натриевой щелочи, и др.), являющиеся коррозионными для оборудования и токсичными для человека и окружающей среды. Безопасные средства и неагрессивные для человека, технических устройств, окружающей среды способы элиминирования угрозы любых контактов с ФОС представляют собой большой практический интерес.Organophosphorus compounds are esters of orthophosphoric and alkylphosphonic acids and their derivatives, which are widely used as nerve agents, as pesticides in agriculture, and also as household insecticides [M.A. Gallo, NJ Lawryk, Organic phosphorous pesticides. The Handbook of Pesticide Toxicology, Academic press, San Diego, CA 1991; Somani, S.M., Solana, R.P., Dube, S.N., Chemical warfare agents. San Diego: Academic Press, 1992, p. 67-123; Harmful substances in industry. Directory; Ed. 7th In three volumes. T.III. Inorganic and organoelement compounds. Ed. N.V. Lazareva, I. D. Gadaskina: L .: Chemistry, 1977, 608 pp.]. The annual use of FOS in large quantities (tens and hundreds of thousands of tons per year - depending on the country of the world) for agricultural needs, as well as low FOS decomposition rates lead to the accumulation of these substances in soils, ground and river waters, in various agricultural products, processed agricultural products, industrial waste and house dust [Fukushima M., Yamaguchi Y., Evaluation of the status of industrial chemical pollution (triesters of organophosphorous compounds). // Biochemistry, 1994, V. 23, p. 74-76] . The toxic effect of FOS on living organisms can be acute or cumulative, manifested in various kinds of disorders of the nervous system, up to the appearance of a nerve-paralytic effect [Gallo M.A., Lawryk N.J., Organic phosphorous pesticides. The Handbook of Pesticide Toxicology, Academic press, San Diego, CA, 1991]. FOS are also strong mutagens that cause the appearance of multiple chromosomal aberrations [Krasnyuk EP, Lubyanova IP, Occupational diseases of agricultural workers. // Ed. Kundiev Yu.I., Krasnyuk EP. Kiev: Health, 1989, p. 38-50]. When carrying out activities related to the storage, transportation and destruction of FOS, which are BOV, appropriate personal protective equipment is required. In case of emergency, chemical compounds are used as means of detoxification of FOS (for example, a composition based on hypochlorite, as well as a composition DS2, which is a mixture of diethylene triamine, ethylene glycol and sodium alkali, etc.), which are corrosive to the equipment and toxic to humans and the environment Wednesday. Safe means and non-aggressive methods for the elimination of the threat of any contacts with FOS for humans, technical devices, and the environment are of great practical interest.
Органофосфатгидролаза (ОРН) (арилдиалкилфосфатаза, параоксоназа, фосфотриэстераза, ЕС 3.1.8.1) - фермент, катализирующий гидролиз эфирной связи в триэфирах фосфорной кислоты. Фермент в разной степени способен катализировать гидролиз Р-O, P-F и P-S связей в триэфирах фосфорной кислоты [Ефременко Е.Н., Сергеева B.C. Органофосфатгидролаза - фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов.// Известия АН Сер. Хим., 2001, с.1743-1749]. Скорости ферментативного гидролиза ряда ФОС на 1-2 порядка выше, чем химического. Большой интерес к ферментативному способу гидролиза ФОС в "мягких" условиях и возможности создания на его основе новых препаратов для детоксикации ФОС очевиден.Organophosphate hydrolase (ORH) (aryl dialkyl phosphatase, paraoxonase, phosphotriesterase, EC 3.1.8.1) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of an ether bond in phosphoric acid triesters. The enzyme is capable of catalyzing the hydrolysis of P-O, P-F, and P-S bonds in phosphoric acid triesters to different degrees [Efremenko EN, Sergeeva B.C. Organophosphate hydrolase is an enzyme that catalyzes the degradation of phosphorus-containing toxic substances and pesticides.// Izvestia AN Ser. Chem., 2001, pp. 1743-1749]. The rate of enzymatic hydrolysis of a number of FOS is 1-2 orders of magnitude higher than chemical. Great interest in the enzymatic method of hydrolysis of FOS in “mild” conditions and the possibility of creating new drugs for the detoxification of FOS on its basis is obvious.
Растворимая форма ОРН подвержена влиянию многих факторов, приводящих к необратимой инактивации фермента, и вследствие этого является нестабильной. Для получения стабильной формы ОРН, способной осуществлять гидролиз ФОС, проводят ее иммобилизацию различными способами.The soluble form of ORN is influenced by many factors leading to irreversible inactivation of the enzyme, and is therefore unstable. To obtain a stable form of ORN capable of hydrolyzing FOS, it is immobilized in various ways.
Одной из главных характеристик любого способа получения биокатализатора на основе иммобилизованного фермента является максимальное количество белка, которое может быть иммобилизовано на единице носителя (на 1 г, мл, см2, см3).One of the main characteristics of any method for producing a biocatalyst based on an immobilized enzyme is the maximum amount of protein that can be immobilized on a carrier unit (per 1 g, ml, cm 2 , cm 3 ).
Основной характеристикой любого биокатализатора, полученного на основе иммобилизованного фермента, является каталитическая активность, локализованная на единице носителя (на 1 г, мл, см2, см3).The main characteristic of any biocatalyst obtained on the basis of an immobilized enzyme is catalytic activity localized on a unit of carrier (per 1 g, ml, cm 2 , cm 3 ).
За единицу ферментативной активности принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоль субстрата за одну минуту при 25°С и рН 9,0. Сравнение ферментативной активности разных биокатализаторов проводится по параоксону как самому широко распространенному субстрату.The unit of enzymatic activity is the amount of enzyme that catalyzes the hydrolysis of 1 μmol of substrate in one minute at 25 ° C and pH 9.0. A comparison of the enzymatic activity of different biocatalysts is carried out on paraoxon as the most widespread substrate.
Каталитическая эффективность действия фермента, представляющая собой отношение максимальной скорости ферментативной реакции (Vmax) к константе Михаэлиса (Km), отражающей степень сродства субстрата к ферменту, используется для сравнения каталитических свойств иммобилизованной и нативной форм фермента. Изменение величины каталитической эффективности действия фермента отражает влияние способа получения иммобилизованного фермента на его каталитические свойства.The catalytic efficiency of the enzyme, which is the ratio of the maximum rate of the enzymatic reaction (V max ) to the Michaelis constant (Km), reflecting the degree of affinity of the substrate for the enzyme, is used to compare the catalytic properties of the immobilized and native forms of the enzyme. The change in the catalytic efficiency of the enzyme action reflects the influence of the method of obtaining an immobilized enzyme on its catalytic properties.
Эти основные характеристики способов получения биокатализаторов и самих биокатализаторов используются для их сравнительного анализа.These main characteristics of the methods for producing biocatalysts and the biocatalysts themselves are used for their comparative analysis.
Известен ряд способов получения биокатализаторов на основе высокоочищенной ОРН, ковалентно иммобилизованной на частицах силикагеля, предназначенных для использования в качестве составной части биосенсорных систем [Simonian A.L., diSioudi B.D., Wild J.R., An enzyme based biosensor for the direct determination of diisopropyl fluorophosphates. //Analytica Chimica Acta, 1999, V.389, p.189-196; Singh A.K., Flounders A.W, Volponi J.V., Ashley C.S, Wally K., Schoeniger J.S, Development of sensors for direct detection of organophosphates. Part I: immobilization, characterization and stabilization of acetylcholinesterase and organophosphate hydrolase on silica supports. Biosensors & Bioelectronics, 1999, 14, 703-713]. Согласно этим способам первоначально проводят химическую активацию носителя сшивающим агентом (10%-ным глутаровым альдегидом в течение 1-2 ч), далее для иммобилизации фермента носитель приводят в контакт с раствором белка (в течение 12 ч). Полученные гранулы с иммобилизованным ферментом промывают 100 мМ глициновым буфером (в течение 0,5 ч) для блокирования не прореагировавших альдегидных остатков, а затем фосфатным буфером, содержащим 0,05% Твина-20 и 0,5 М хлорид натрия, для удаления белка, не специфически сорбировавшегося на носителе (в течение 0,5 ч). Общее время получения биокатализатора составляет 14-15 ч. В соответствии с данными, представленными авторами, максимальная активность частиц биокатализатора составляет не более 9,0 ед/г силикагеля, а общее количество нанесенного белка составляет не более 30 мг белка/г биокатализатора.A number of methods are known for producing biocatalysts based on highly purified ORN covalently immobilized on silica gel particles intended for use as an integral part of biosensor systems [Simonian A.L., diSioudi B.D., Wild J.R., An enzyme based biosensor for the direct determination of diisopropyl fluorophosphates. // Analytica Chimica Acta, 1999, V.389, p. 189-196; Singh A.K., Flounders A.W., Volponi J.V., Ashley C.S., Wally K., Schoeniger J.S, Development of sensors for direct detection of organophosphates. Part I: immobilization, characterization and stabilization of acetylcholinesterase and organophosphate hydrolase on silica supports. Biosensors & Bioelectronics, 1999, 14, 703-713]. According to these methods, the carrier is initially chemically activated with a crosslinking agent (10% glutaraldehyde for 1-2 hours), then the carrier is brought into contact with a protein solution (for 12 hours) to immobilize the enzyme. The obtained granules with an immobilized enzyme are washed with 100 mM glycine buffer (for 0.5 h) to block unreacted aldehyde residues, and then with a phosphate buffer containing 0.05% Tween-20 and 0.5 M sodium chloride to remove protein, not specifically adsorbed on the carrier (within 0.5 h). The total production time of the biocatalyst is 14-15 hours. In accordance with the data presented by the authors, the maximum activity of the particles of the biocatalyst is not more than 9.0 units / g of silica gel, and the total amount of protein deposited is not more than 30 mg of protein / g of the biocatalyst.
Большая продолжительность процесса иммобилизации, низкая активность биокатализаторов и механическая прочность легко разрушаемого носителя являются существенными недостатками способа получения биокатализаторов и самих биокатализаторов, применение которых возможно только в биосенсорных системах для гидролиза ФОС в жидкой среде.The long duration of the immobilization process, the low activity of biocatalysts and the mechanical strength of an easily degradable carrier are significant disadvantages of the method for producing biocatalysts and the biocatalysts themselves, the use of which is possible only in biosensor systems for the hydrolysis of FOS in a liquid medium.
Согласно другому способу получения биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН поверхность гранул (70-400 мкм в диаметре) пористого стекла этерефицируют (в течение 2-3 ч) с последующей обработкой гидразином и азотистой кислотой (в течение 1-1,5 ч) с целью получения азидных групп на поверхности стекла, далее проводят иммобилизацию белка (в течение 0,5 ч). [Munnecke D., Properties of an immobilized pesticide-hydrolasing enzyme. //Appl. Environ. Microbiol., 1977, p.503-507]. Общее время получения биокатализатора составляет 3,5-5 ч. Способ позволяет вводить до 190 мкг белка на 1 г носителя, при этом активность гранул составляет 0,035-0,15 ед/г стекла.According to another method for producing a biocatalyst based on immobilized ORN, the surface of the granules (70-400 μm in diameter) of porous glass is etherified (within 2-3 hours), followed by treatment with hydrazine and nitrous acid (for 1-1.5 hours) in order to obtain azide groups on the surface of the glass, then immobilize the protein (within 0.5 h). [Munnecke D., Properties of an immobilized pesticide-hydrolasing enzyme. // Appl. Environ. Microbiol., 1977, p. 503-507]. The total time for obtaining the biocatalyst is 3.5-5 hours. The method allows you to enter up to 190 μg of protein per 1 g of carrier, while the activity of the granules is 0.035-0.15 u / g glass.
Основным недостатком способа является крайне низкое количество иммобилизованного белка и, как следствие, очень низкая активность биокатализатора. Форма и физические свойства биокатализатора не позволяют использовать его для удаления ФОС с поверхностей, а только для проведения гидролиза ФОС в жидкой среде.The main disadvantage of this method is the extremely low amount of immobilized protein and, as a result, the very low activity of the biocatalyst. The shape and physical properties of the biocatalyst do not allow it to be used to remove FOS from surfaces, but only for hydrolysis of FOS in a liquid medium.
Способ получения биокатализатора на основе высокоочищенной ОРН, иммобилизованной на поверхности гранул (0,8-1,0 мм в диаметре) криогеля поливинилового спирта (ПВС) [Efremenko E., Lozinsky V., Sergeeva V., Kazankov G., Gladilin A., Addition of Polybrene improves stability of organophosphate hydrolase immobilized in poly(vinyl alcohol) cryogel carrier. //J.Biochem. Biophys. Methods, 2002, V.51, p.195-201], также предполагает модификацию поверхности носителя 7%-ным раствором глутарового альдегида (в течение 1 ч) с последующей экспозицией носителя с раствором фермента (в течение 5 ч) в присутствии полиэлектролита (полибрена), взятого в соотношении 20:1 по отношению к ферменту (масс.). Далее проводят удаление свободных альдегидных групп на носителе, выдерживая его в течение 2 ч в 100 мМ Трис-буфере. Общее время получения биокатализатора составляет 8 ч. Способ позволяет вводить до 8,8 мг белка на 1 г влажного геля. Каталитическая эффективность действия фермента снижается на 50-66% в результате иммобилизации.A method of producing a biocatalyst based on highly purified ORN immobilized on the surface of granules (0.8-1.0 mm in diameter) of polyvinyl alcohol (PVA) cryogel [Efremenko E., Lozinsky V., Sergeeva V., Kazankov G., Gladilin A. , Addition of Polybrene improves stability of organophosphate hydrolase immobilized in poly (vinyl alcohol) cryogel carrier. // J. Biochem. Biophys. Methods, 2002, V.51, p. 195-201], also involves modifying the surface of the carrier with a 7% glutaraldehyde solution (within 1 hour), followed by exposure of the carrier with the enzyme solution (within 5 hours) in the presence of a polyelectrolyte ( polybrene), taken in a ratio of 20: 1 with respect to the enzyme (mass.). Next, the free aldehyde groups are removed on the carrier, keeping it for 2 hours in 100 mM Tris buffer. The total time for obtaining the biocatalyst is 8 hours. The method allows you to enter up to 8.8 mg of protein per 1 g of wet gel. The catalytic efficiency of the enzyme is reduced by 50-66% as a result of immobilization.
Существенными недостатками способа получения биокатализатора являются: необходимость использования больших количеств дорогостоящего полиэлектролита (полибрена) для получения активного биокатализатора с иммобилизованным ферментом, стабилизированным полиэлектролитным комплексом, и достаточно низкие концентрации белка, вводимые в носитель и определяющие конечную активность биокатализатора. Форма и физические свойства биокатализатора не позволяют использовать его для удаления ФОС с поверхностей, а только для проведения гидролиза ФОС в жидкой среде.Significant disadvantages of the method for producing a biocatalyst are: the need to use large quantities of expensive polyelectrolyte (polybrene) to obtain an active biocatalyst with an immobilized enzyme stabilized by a polyelectrolyte complex, and fairly low protein concentrations introduced into the carrier and determining the final activity of the biocatalyst. The shape and physical properties of the biocatalyst do not allow it to be used to remove FOS from surfaces, but only for hydrolysis of FOS in a liquid medium.
Известен способ получения биокатализатора на основе нейлона, содержащего иммобилизованную ОРН [Caldwell, S.R., Raushel, F.M. Detoxification of organophosphate pesticides using a naylon based Immobilized phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.ll Appl. Biochem. Blotechnol., 1991, V.37, p.59-72]. Способ позволяет получать биокатализатор в форме трубки, мембраны или в виде мелкодисперсного порошка с поверхностью, содержащей иммобилизованный белок. Для иммобилизации частично очищенного фермента проводят активацию поверхности носителя, которую обрабатывают 12,5% раствором глутарового альдегида при 4°С в течение 2 ч, далее носитель выдерживают в контакте с раствором фермента при 4°С в течение 2 ч и промывают 0,1 М раствором бората натрия. Биокатализатор, выполненный в виде трубки, мембраны и порошка, имеет активность соответственно 72 ед/см3, 12,6 ед/см2 и 360 ед/г носителя. Общее время получения биокатализатора составляет 4 ч. Каталитическая эффективность действия фермента снижается в 160 раз в результате иммобилизации по сравнению с растворимой формой.A known method for producing a biocatalyst based on nylon containing immobilized ORN [Caldwell, SR, Raushel, FM Detoxification of organophosphate pesticides using a naylon based Immobilized phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.ll Appl. Biochem. Blotechnol., 1991, V.37, p. 59-72]. The method allows to obtain a biocatalyst in the form of a tube, membrane or in the form of a fine powder with a surface containing immobilized protein. To immobilize a partially purified enzyme, the surface of the support is activated, which is treated with a 12.5% glutaraldehyde solution at 4 ° C for 2 hours, then the support is kept in contact with the enzyme solution at 4 ° C for 2 hours and washed with 0.1 M sodium borate solution. The biocatalyst, made in the form of a tube, membrane and powder, has an activity of 72 units / cm 3 , 12.6 units / cm 2 and 360 units / g of carrier, respectively. The total production time of the biocatalyst is 4 hours. The catalytic efficiency of the enzyme is reduced by 160 times as a result of immobilization compared to the soluble form.
Необходимость проведения всего процесса иммобилизации фермента при низкотемпературных условиях и значительные потери активности ферментом в результате его иммобилизации являются явными недостатками способа получения биокатализатора и самого биокатализатора.The necessity of carrying out the entire process of immobilization of the enzyme under low temperature conditions and significant loss of activity of the enzyme as a result of its immobilization are obvious disadvantages of the method for producing the biocatalyst and the biocatalyst itself.
Известен способ получения биокатализатора на основе очищенной ОРН методом физической адсорбции на тритил-агарозе, содержащей до 65 мкмоль тритиловых групп на 1 мг агарозы [Caldwell S.R., Raushel F.M., Detoxification of Organophosphate Pesticides Using an Immobilized Phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.// Biotechnol. Bioeng., 1991, V.37, p.103-109]. Для иммобилизации раствор фермента смешивают с тритил-агарозой и оставляют в контакте при постоянном перемешивании в течение 10 мин. Далее биокатализатор отмывают 125 мМ раствором CHES буфера от белка, не сорбировавшегося на носителе. Общее время получения биокатализатора составляет 10-20 мин. Получаемый биокатализатор содержит не более 1,84 мг белка на 1 мл агарозы и имеет активность от 140 до 4600 ед/мл тритил-агарозы.A known method for producing a biocatalyst based on purified ORN by physical adsorption on trityl agarose containing up to 65 μmol of trityl groups per 1 mg of agarose [Caldwell S.R., Raushel F.M., Detoxification of Organophosphate Pesticides Using an Immobilized Phosphotriesterase from Pseudomon// Biotechnoluta. Bioeng., 1991, V.37, p.103-109]. To immobilize, the enzyme solution is mixed with trityl agarose and left in contact with constant stirring for 10 minutes. Next, the biocatalyst is washed with a 125 mM CHES buffer solution from a protein that is not adsorbed on the carrier. The total time for biocatalyst production is 10-20 minutes. The resulting biocatalyst contains not more than 1.84 mg of protein per 1 ml of agarose and has an activity of 140 to 4600 units / ml of trityl agarose.
Одним из недостатков данного биокатализатора является краткосрочность его возможного использования, а именно не более 2 ч в проточной системе при скорости протока до 45 мл/ч, способ предполагает проведение повторной иммобилизации новой порции фермента на том же носителе. Высокий расход фермента для регенерации и получения активного биокатализатора, а также достаточно высокая стоимость тритил-агарозы являются экономическими ограничениями этого способа получения биокатализатора. Большим недостатком биокатализаторов является высокое сродство ФОС (параоксон, малатион, диизопропилфторфосфат и кумафос), являющихся субстратами для фермента, к матрице носителя, что приводит к активной их сорбции на самом носителе, вместо ферментативного гидролиза. Способ получения биокатализатора также не позволяет получить в достаточной степени стабилизированный фермент, о чем свидетельствует его быстрая инактивация под действием различных факторов, в частности, в присутствии 1% органического растворителя. Форма и физические свойства биокатализатора не позволяют использовать его для удаления ФОС с поверхностей, а только для проведения гидролиза ФОС в жидкой среде.One of the disadvantages of this biocatalyst is the short duration of its possible use, namely, no more than 2 hours in the flow system at a flow rate of up to 45 ml / h, the method involves re-immobilization of a new portion of the enzyme on the same carrier. The high consumption of the enzyme for the regeneration and production of an active biocatalyst, as well as the relatively high cost of trityl agarose, are the economic limitations of this method of producing a biocatalyst. A big drawback of biocatalysts is the high affinity of FOS (paraoxon, malathion, diisopropyl fluorophosphate and coumaphos), which are substrates for the enzyme, to the support matrix, which leads to their active sorption on the support itself, instead of enzymatic hydrolysis. The method of obtaining the biocatalyst also does not allow to obtain a sufficiently stable enzyme, as evidenced by its rapid inactivation under the influence of various factors, in particular in the presence of 1% organic solvent. The shape and physical properties of the biocatalyst do not allow it to be used to remove FOS from surfaces, but only for hydrolysis of FOS in a liquid medium.
Известен способ получения биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН, предполагающий применение пенополиуретановой пены или губки в качестве носителя [Patent US 6642037, 2003; Preparation of enzymatically active sponges or foams for detoxification of hazardous compounds, C 12 N 11/04, C 12 N 11/08, C 12 S 9/00, C 12 S 13/00]. Готовый биокатализатор может содержать набор иммобилизованных ферментов, таких как ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза, органофосфатгидролаза и др. и предназначен для детоксикации ФОС. Способ получения биокатализатора заключается в приготовлении смеси (при весовом соотношении 1:1) двух фаз: водной фазы, состоящей из 1-2% раствора поверхностно-активного вещества (плюроник Р-65, Р-85 или L-62), приготовленного на основе 50 мМ фосфатного буфера (рН 8,0), и раствора высокоочищенного фермента, смешанных между собой в соотношении 10:1 по объему, и гидрофобной фазы, представляющей собой полиуретановый преполимер Hypol TDI 3000 или Hypol Plus FHP-5000 (толил-диизоцианат). Образующуюся двухфазную систему интенсивно перемешивают (2500 об/мин), взбивая в пену в течение 0,5-1 мин, и оставляют для формирования ферментсодержащей полимерной композиции (биокатализатора) в течение 10 мин. Полученный материал тщательно промывают 50 мМ фосфатным буфером (рН 8,0), высушивают (в течение 6 ч) и хранят в запаянном виде при 4°С. Общее время получения биокатализатора без учета периода сушки составляет 20-25 мин.A known method of producing a biocatalyst based on immobilized ORN, involving the use of polyurethane foam or sponge as a carrier [Patent US 6642037, 2003; Preparation of enzymatically active sponges or foams for detoxification of hazardous compounds, C 12
Авторы способа приводят в тексте патента только свойства биокатализатора, приготовленного на основе ацетил- и бутирилхолинэстеразы, данные по биокатализатору на основе ОРН в патенте отсутствуют. Анализ ряда статей тех же авторов, частично раскрывающих способ получения и свойства биокатализатора с иммобилизованной ОРН [LeJeune K.E., Mesiano A.J., Bower S.B., Grimsley J.K., Wild J.R., Russell A.J., Dramatically stabilized phosphotriesterase-polymers for nerve agents degradation. //Biotechnol. Bioeng., 1997.V. 54, p.105-114; LeJeune, K.E., Wild, J.R., Russel, A.J., Nerve agents degraded by enzymatic foams. // Nature, 1998, V. 392, p.27-28; Havens P.L., Rase H.F., Reusable Immobilized Enzyme/Polyurethane Sponge for Removal and Detoxification of Localized Organophosphate Pesticide Spills. //Ind. Eng.Chem. Res., 1993, V.32, №10, p.2254-2258], свидетельствует о том, что в состав биокатализатора можно вводить до 5 мг белка на 1 г преполимера, при этом 1 г иммобилизованного фермента может гидролизовать 112 моль параоксона в течение 1 ч, а это значит, что активность биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН максимально может составлять 9,34 ед на 1 г преполимера.The authors of the method cite in the patent text only the properties of the biocatalyst prepared on the basis of acetyl and butyrylcholinesterase, data on the biocatalyst based on ORN are not available in the patent. An analysis of a number of articles by the same authors, partially disclosing the method of preparation and properties of a biocatalyst with immobilized ORN [LeJeune K.E., Mesiano A.J., Bower S. B., Grimsley J.K., Wild J. R., Russell A. J., Dramatically stabilized phosphotriesterase-polymers for nerve agents degradation. // Biotechnol. Bioeng., 1997.V. 54, p. 105-114; LeJeune, K.E., Wild, J.R., Russel, A.J., Nerve agents degraded by enzymatic foams. // Nature, 1998, V. 392, p. 27-28; Havens P.L., Rase H.F., Reusable Immobilized Enzyme / Polyurethane Sponge for Removal and Detoxification of Localized Organophosphate Pesticide Spills. // Ind. Eng.Chem. Res., 1993, V.32, No. 10, p.2254-2258], indicates that up to 5 mg of protein per 1 g of prepolymer can be introduced into the biocatalyst, while 1 g of the immobilized enzyme can hydrolyze 112 mol of paraoxon in for 1 h, which means that the activity of a biocatalyst based on immobilized ORN can maximally be 9.34 units per 1 g of prepolymer.
Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу получения биокатализатора на основе ОРН, иммобилизованной в составе полимерной композиции, и по предназначению получаемого биокатализатора, принято за прототип.This technical solution, as the closest to the claimed method of producing a biocatalyst based on ORN, immobilized in the composition of the polymer composition, and the intended purpose of the obtained biocatalyst, is taken as a prototype.
Известное техническое решение имеет ряд существенных недостатков, главным из которых является получение биокатализатора с низкой концентрацией иммобилизованного белка и с низкой каталитической активностью.The known technical solution has a number of significant drawbacks, the main of which is to obtain a biocatalyst with a low concentration of immobilized protein and with low catalytic activity.
Задачей предлагаемого изобретения является получение на основе иммобилизованной ОРН эффективного биокатализатора, предназначенного для удаления ФОС с различных поверхностей, в том числе кожных покровов, и последующей их детоксикации.The objective of the invention is to obtain, on the basis of immobilized ORN, an effective biocatalyst designed to remove FOS from various surfaces, including skin, and their subsequent detoxification.
Поставленная задача решается тем, что нерастворимый пористый материал вносят в раствор полимера, представляющего собой аминополисахарид, с одновременным внесением в тот же раствор белка и глутарового альдегида с последующим отжимом формирующейся ферментсодержащей композиции и ее последовательной обработкой растворами боргидрида натрия и антимикробных веществ.The problem is solved in that insoluble porous material is introduced into the polymer solution, which is an aminopolysaccharide, with the simultaneous introduction of protein and glutaraldehyde into the same solution, followed by extraction of the formed enzyme-containing composition and its subsequent treatment with solutions of sodium borohydride and antimicrobial substances.
Использование тканых и нетканых материалов на основе хлопка (бязь, марля, войлок и др.) в качестве нерастворимого пористого материала обусловлено тем, что они, во-первых, материалы на основе хлопка, в отличие от синтетических, обладают высокой сорбционной емкостью и могут легко удерживать большие объемы гидрофильных жидкостей. Во-вторых, эти материалы производятся в больших объемах текстильной промышленностью и, следовательно, потенциальное производство биокатализатора на основе таких носителей может легко масштабироваться с использованием оборудования текстильных предприятий.The use of woven and non-woven materials based on cotton (calico, gauze, felt, etc.) as an insoluble porous material is due to the fact that, firstly, cotton-based materials, unlike synthetic ones, have a high sorption capacity and can easily hold large volumes of hydrophilic fluids. Secondly, these materials are produced in large volumes by the textile industry and, therefore, the potential production of a biocatalyst based on such carriers can be easily scaled using equipment from textile enterprises.
Использование аминополисахаридов при получении биокатализатора обусловлено их способностью при химическом взаимодействии с бифункциональными сшивающими агентами образовывать прочные пористые гели, обладающие биосовместимостью, высокой прочностью, пластичностью, большой гигроскопичностью и биодеградируемостью [Г.А.Вихорева, И.А.Шаблыкова, Н.Р.Кильдеева Модификация хитозановых пленок глутаровым альдегидом с целью регулирования их растворимости и набухания.// Химические волокна, №3, 2001. с.42-45; Е.А.Меркович, М.-Л.Карруэт, В.Г.Бабвк, Г.А.Вихорева, Л.С.Гальбрайх, В.Е.Ким. Вискозиметрическое исследование кинетики начальной стадии гелеобразования в растворах хитозана в присутствии глутарового альдегида.// Коллоидный журнал, 2001, №3, с.383-388; Г.А.Вихорева, Н.Р.Кильдеева, М.Ю.Устинов, Ю.Н.Ночевкина. Получение хитозановых пленок и исследование их деградируемости. //Химические волокна, 2002, №6, с.29-33]. Регулярная пористая структура образующихся гелей не создает диффузионных затруднений для процессов, катализируемых ферментом.The use of aminopolysaccharides in the preparation of a biocatalyst is due to their ability to form strong porous gels with biocompatibility, high strength, ductility, high hygroscopicity, and biodegradability upon chemical interaction with bifunctional crosslinking agents [G.A. Vikhoreva, I.A. Shabilikova, N. R. Kildeeva Modification of chitosan films with glutaraldehyde to regulate their solubility and swelling. // Chemical fibers, No. 3, 2001. p.42-45; E.A. Merkovich, M.-L. Carruet, V.G. Babvk, G.A. Vikhoreva, L.S. Galbraich, V.E. Kim. A viscometric study of the kinetics of the initial stage of gelation in chitosan solutions in the presence of glutaraldehyde. // Colloid Journal, 2001, No. 3, p. 383-388; G.A. Vikhoreva, N.R. Kildeeva, M.Yu. Ustinov, Yu.N. Nochevkina. Obtaining chitosan films and the study of their degradability. // Chemical fibers, 2002, No. 6, p.29-33]. The regular porous structure of the resulting gels does not create diffusion difficulties for processes catalyzed by the enzyme.
Использование нерастворимых пористых материалов, покрытых аминополисахаридными сшитыми гелями, существенно увеличивает их сорбционную емкость, и, таким образом, повышается эффективность удаления ФОС с различных поверхностей и удержания их, а также продуктов их детоксикации, в объеме биокатализатора.The use of insoluble porous materials coated with aminopolysaccharide crosslinked gels significantly increases their sorption capacity, and thus, the efficiency of removing FOS from various surfaces and retaining them, as well as their detoxification products, in the biocatalyst volume increases.
Отжим формирующейся ферментсодержащей композиции применяется для удаления непрореагировавших компонентов реакционной системы.The spin of the forming enzyme-containing composition is used to remove unreacted components of the reaction system.
Раствор боргидрида натрия применяется для восстановления образовавшихся азометиновых связей, что способствует химической стабильности и инертности структуры биокатализатора и, таким образом, устраняется риск какого-либо негативного воздействия биокатализатора на обрабатываемые поверхности.The sodium borohydride solution is used to restore the formed azomethine bonds, which contributes to the chemical stability and inertness of the biocatalyst structure and, thus, the risk of any negative effect of the biocatalyst on the treated surfaces is eliminated.
Введение в состав биокатализатора с высокой влажностью (выше 50%) антимикробных веществ, применение которых допустимо, в том числе и в детской косметологии, создает благоприятные условия для длительного хранения биокатализатора в герметичном виде при отсутствии порчи готовой продукции и в состоянии полной готовности к применению, способствует предотвращению какой-либо угрозы возникновения у потребителей заболеваний кожи, связанных с микробным заражением, вызванным, например, культурами Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris и др., а также делает потенциально безопасным применение биокатализатора потребителем без каких-либо возрастных ограничений.The introduction into the composition of a biocatalyst with high humidity (above 50%) antimicrobial substances, the use of which is permissible, including in children's cosmetology, creates favorable conditions for long-term storage of the biocatalyst in a sealed form in the absence of spoilage of the finished product and in a state of complete readiness for use, helps prevent any threat to consumers of skin diseases associated with microbial infection caused, for example, by cultures of Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, etc., as well as barks potentially safer use of biocatalyst consumer without any age restrictions.
Заявляемый способ получения биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН осуществляется следующим образом: нерастворимый пористый носитель помещают в раствор полимера, представляющего собой аминополисахарид, с одновременным внесением в тот же раствор белка и глутарового альдегида с последующим отжимом формирующейся ферментсодержащей композиции и ее последовательной обработкой растворами боргидрида натрия и антимикробных веществ, так, что конечные концентрации компонентов в биокатализаторе составляют, мас.%: белок - до 2,5; аминополисахарид - 12,0-40,0; нерастворимый пористый носитель - 28,0-60,0; глутаровый альдегид - 0,01-0,10; антимикробные вещества - до 3,0; вода - остальное до 100%.The inventive method of obtaining a biocatalyst based on immobilized ORN is as follows: an insoluble porous carrier is placed in a polymer solution, which is an aminopolysaccharide, with the simultaneous introduction of a protein and glutaraldehyde into the same solution, followed by extraction of the formed enzyme-containing composition and its sequential treatment with sodium borg solution substances, so that the final concentration of components in the biocatalyst is, wt.%: protein - up to 2.5; aminopolysaccharide - 12.0-40.0; insoluble porous carrier - 28.0-60.0; glutaraldehyde - 0.01-0.10; antimicrobial substances - up to 3.0; water - the rest is up to 100%.
Общее время получения биокатализатора составляет не более 20 мин, способ позволяет получать биокатализатор, содержащий до 25,2 мг белка на 1 г биокатализатора.The total time for obtaining the biocatalyst is no more than 20 minutes, the method allows to obtain a biocatalyst containing up to 25.2 mg of protein per 1 g of biocatalyst.
Вторым объектом изобретения является биокатализатор на основе иммобилизованной органофосфатгидролазы для детоксикации ФОС, полученный по этому способу, который имеет активность до 950 ед/г биокатализатора.The second object of the invention is a biocatalyst based on immobilized organophosphate hydrolase for detoxification of FOS obtained by this method, which has an activity of up to 950 u / g biocatalyst.
Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является высокая концентрация иммобилизованного белка в расчете на 1 г биокатализатора и высокая каталитическая активность биокатализатора. Непродолжительность процесса получения биокатализатора обеспечивает минимальное инактивирующее воздействие условий иммобилизации на каталитическую активность фермента. Способ получения биокатализатора значительно стабилизирует фермент и позволяет хранить препарат иммобилизованного фермента при 23°С в течение, как минимум, двух месяцев.An essential technical result of the claimed invention is a high concentration of immobilized protein per 1 g of biocatalyst and high catalytic activity of the biocatalyst. The short duration of the process of obtaining a biocatalyst provides a minimal inactivating effect of immobilization conditions on the catalytic activity of the enzyme. The method of producing a biocatalyst significantly stabilizes the enzyme and allows you to store the preparation of the immobilized enzyme at 23 ° C for at least two months.
Биокатализатор имеет макропористую структуру, обеспечивающую высокую влагоемкость, а именно присутствие аминополисахаридных гелей в структуре биокатализатора дает возможность дополнительного 3,5-4,5-кратного увеличения массы сорбируемой влаги к известному высокому (8-10-кратному) уровню влагоудержания натуральных волокнистых материалов, также используемых при получении биокатализатора. Иммобилизованный фермент сохраняет все свои каталитические характеристики, известные для нативного аналога.The biocatalyst has a macroporous structure that provides high moisture capacity, namely, the presence of aminopolysaccharide gels in the structure of the biocatalyst allows an additional 3.5-4.5-fold increase in the mass of adsorbed moisture to a known high (8-10-fold) level of moisture retention of natural fibrous materials, as well used in the preparation of the biocatalyst. The immobilized enzyme retains all its catalytic characteristics known for the native counterpart.
Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.The following are specific examples of the implementation of the proposed technical solution.
Пример 1. Получение биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН при использовании тканого целлюлозного материала (бязи) в качестве нерастворимого носителя, сульфата хитозана как аминополисахарида и пропилпарабена как антимикробного вещества.Example 1. Obtaining a biocatalyst based on immobilized ORN using a woven cellulosic material (calico) as an insoluble carrier, chitosan sulfate as an aminopolysaccharide and propyl paraben as an antimicrobial substance.
Тканый целлюлозный материал (бязь) (52 г) помещают в 8%-ный раствор сульфата хитозана (191 г) с одновременным внесением в тот же раствор 280 мл раствора ОРН (8 мг/мл, 250 ед/мг) и 280 мл 10%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку растворами боргидрида натрия и 100 мМ глициновым буфером, содержащим 5,26 г пропилпарабена, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 1,84, сульфат хитозана - 12,61, нерастворимый пористый носитель - 47,95, глутаровый альдегид - 0,023, антимикробное вещество - 3,0, вода - остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Способ позволяет ввести 18,4 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 905 ед/г биокатализатора.Woven cellulosic material (coarse calico) (52 g) is placed in an 8% solution of chitosan sulfate (191 g), while 280 ml of ORN solution (8 mg / ml, 250 units / mg) and 280 ml of 10% are added to the same solution glutaraldehyde solution. Next, the resulting enzyme-containing composition is squeezed on a plus machine and it is sequentially treated with sodium borohydride solutions and 100 mM glycine buffer containing 5.26 g of propyl paraben so that the resulting biocatalyst has the following composition, wt.%: Protein 1.84, chitosan sulfate - 12.61, insoluble porous carrier - 47.95, glutaraldehyde - 0.023, antimicrobial substance - 3.0, water - the rest is up to 100%. The total time for biocatalyst production is 20 minutes. The method allows you to enter 18.4 mg of protein / g of biocatalyst. The drug has an activity equal to 905 u / g biocatalyst.
Пример 2. Получение биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН при использовании тканого целлюлозного материала (марли) в качестве нерастворимого носителя и хитозана как аминополисахарида.Example 2. Obtaining a biocatalyst based on immobilized ORN using a woven cellulosic material (gauze) as an insoluble carrier and chitosan as an aminopolysaccharide.
Тканый целлюлозный материал (марлю) (30,5 г) помещают в 2%-ный раствор хитозана (376 г) с одновременным внесением в тот же раствор 80 мл раствора ОРН (20 мг/мл, 190 ед/мг) и 160 мл 20%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее обработку раствором боргидрида натрия так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 2,36, хитозан - 13,52, нерастворимый носитель - 60,04, глутаровый альдегид - 0,051, вода - остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 15 мин. Способ позволяет ввести 23,6 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 650 ед/г биокатализатора.Woven cellulosic material (gauze) (30.5 g) is placed in a 2% chitosan solution (376 g) while 80 ml of ORN solution (20 mg / ml, 190 u / mg) and 160 ml of 20 are added to the same solution % glutaraldehyde solution. Next, the formed enzyme-containing composition is squeezed on a plus machine and it is treated with a sodium borohydride solution so that the resulting biocatalyst has the following composition, wt.%: Protein 2.36, chitosan 13.52, insoluble carrier 60.04, glutaraldehyde 0,051, water - the rest is up to 100%. The total biocatalyst production time is 15 minutes. The method allows you to enter 23.6 mg of protein / g of biocatalyst. The drug has an activity equal to 650 u / g biocatalyst.
Пример 3. Получение биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН при использовании войлока в качестве нерастворимого носителя, карбоксиметил хитозана как аминополисахарида и катона CG как антимикробного вещества.Example 3. Obtaining a biocatalyst based on immobilized ORN using felt as an insoluble carrier, carboxymethyl chitosan as an aminopolysaccharide and CG caton as an antimicrobial substance.
Войлок (16 г) помещают в 3%-ный раствор карбоксиметил хитозана (275 г) с одновременным внесением в тот же раствор 25 мл раствора ОРН (4 мг/мл, 400 ед/мг) и 85 мл 5%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку раствором боргидрида натрия и 100 мМ глициновым буфером, содержащим 2,5 г катона CG, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 0,17, карбоксиметил хитозан - 20,7, нерастворимый носитель - 44,78, глутаровый альдегид - 0,011, антимикробное вещество - 2,24, вода - остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 15 мин. Способ позволяет ввести 17 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 475 ед/г биокатализатора.Felt (16 g) is placed in a 3% solution of carboxymethyl chitosan (275 g) while 25 ml of ORN solution (4 mg / ml, 400 units / mg) and 85 ml of 5% glutaraldehyde solution are added to the same solution . Next, the resulting enzyme-containing composition is squeezed out on a plus machine and it is sequentially treated with a solution of sodium borohydride and 100 mM glycine buffer containing 2.5 g of CG catone, so that the resulting biocatalyst has the following composition, wt.%: Protein - 0.17, carboxymethyl chitosan - 20.7, insoluble carrier - 44.78, glutaraldehyde - 0.011, antimicrobial substance - 2.24, water - the rest is up to 100%. The total biocatalyst production time is 15 minutes. The method allows you to enter 17 mg of protein / g of biocatalyst. The drug has an activity equal to 475 u / g biocatalyst.
Пример 4. Получение биокатализатора при использовании для иммобилизации ОРН нетканого целлюлозного материала в качестве нерастворимого носителя, сульфата хитозана в качестве аминополисахарида и хлорида бензетония в качестве антимикробного вещества.Example 4. Obtaining a biocatalyst when used to immobilize ORN non-woven cellulosic material as an insoluble carrier, chitosan sulfate as an aminopolysaccharide and benzetonium chloride as an antimicrobial substance.
Нетканый целлюлозный материал (15,5 г) помещают в 5%-ный раствор сульфата хитозана (480 г) с одновременным внесением в тот же раствор 50 мл раствора ОРН (32 мг/мл, 200 ед/мг) и 160 мл 50%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку растворами боргидрида натрия и 100 мМ глицинового буфера, содержащего 3,0 г хлорида бензетония, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 2,52, сульфат хитозана - 40,36, нерастворимый пористый носитель - 27,88, глутаровый альдегид - 0,108, антимикробное вещество - 1,08, вода - остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Способ позволяет ввести 25,2 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 880 ед/г биокатализатора.Non-woven cellulosic material (15.5 g) is placed in a 5% solution of chitosan sulfate (480 g) with the simultaneous introduction of 50 ml of ORN solution (32 mg / ml, 200 units / mg) and 160 ml of 50% - glutaraldehyde solution. Next, the resulting enzyme-containing composition is squeezed out on a plus machine and it is sequentially treated with solutions of sodium borohydride and 100 mM glycine buffer containing 3.0 g of benzetonium chloride, so that the resulting biocatalyst has the following composition, wt.%: Protein - 2.52, sulfate chitosan - 40.36, insoluble porous carrier - 27.88, glutaraldehyde - 0.108, antimicrobial substance - 1.08, water - the rest is up to 100%. The total time for biocatalyst production is 20 minutes. The method allows you to enter 25.2 mg of protein / g of biocatalyst. The drug has an activity equal to 880 u / g biocatalyst.
Пример 5. Получение биокатализатора при использовании льна в качестве нерастворимого носителя, сульфата хитозана в качестве аминополисахарида и метилпарабена в качестве антимикробного вещества.Example 5. Obtaining a biocatalyst when using flax as an insoluble carrier, chitosan sulfate as an aminopolysaccharide and methyl paraben as an antimicrobial substance.
Тканый целлюлозный материал (лен) (25 г) помещают в 9%-ный раствор сульфата хитозана (185 г) с одновременным внесением в тот же раствор 45 мл раствора гексагистидиновой ОРН (26 мг/мл, 180 ед/мг) и 165 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку растворами боргидрида натрия и 100 мМ глицинового буфера, содержащего 1,3 г метилпарабена, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок - 2,25, сульфат хитозана - 26,36, нерастворимый пористый носитель - 48,18, глутаровый альдегид - 0,053, антимикробное вещество - 1,35, вода - остальное до 100%. Общее время получения составляет 20 мин. Способ позволяет ввести 22,5 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 950 ед/г биокатализатора.Woven cellulosic material (flax) (25 g) is placed in a 9% solution of chitosan sulfate (185 g) while 45 ml of a solution of hexahistidine ORN (26 mg / ml, 180 units / mg) and 165 ml of 25 are added to the same solution % glutaraldehyde solution. Next, the resulting enzyme-containing composition is squeezed out on a plus machine and it is sequentially treated with solutions of sodium borohydride and 100 mM glycine buffer containing 1.3 g of methyl paraben, so that the obtained biocatalyst has the following composition, wt.%: Protein - 2.25, chitosan sulfate - 26.36, insoluble porous carrier - 48.18, glutaraldehyde - 0.053, antimicrobial substance - 1.35, water - the rest is up to 100%. The total production time is 20 minutes. The method allows you to enter 22.5 mg of protein / g of biocatalyst. The drug has an activity equal to 950 u / g biocatalyst.
Пример 6. Свойства биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу.Example 6. The properties of the biocatalyst obtained according to the claimed method.
Биокатализатор, полученный, как описано в Примере 1, имеет активность, равную 905 ед/г, и каталитические характеристики (константу Михаэлиса, Vmax, каталитическую эффективность действия фермента), представленные в таблице (таблица приведена в конце описания). The biocatalyst obtained as described in Example 1 has an activity of 905 u / g and catalytic characteristics (Michaelis constant, V max, catalytic efficiency of the enzyme) presented in the table (the table is shown at the end of the description).
На Фиг.1 представлены рН-зависимости каталитической активности биокатализатора и растворимого фермента. Снижение каталитической эффективности действия иммобилизованного фермента по отношению к растворимому не более чем в 3 раза свидетельствует о том, что биокатализатор способен осуществлять, как и растворимый фермент, высокоэффективный гидролиз различных ФОС.Figure 1 presents the pH dependence of the catalytic activity of the biocatalyst and soluble enzyme. A decrease in the catalytic efficiency of the action of the immobilized enzyme with respect to the soluble one no more than 3 times indicates that the biocatalyst is capable of carrying out, like the soluble enzyme, highly efficient hydrolysis of various FOS.
На Фиг.2 и 3 показана стабильность при хранении при 4°С и 23°С соответственно биокатализаторов, полученных с введением в их состав антимикробных веществ, как описано в Примерах 1, 2, 4 и 5.Figure 2 and 3 shows the storage stability at 4 ° C and 23 ° C, respectively, of biocatalysts obtained with the introduction of antimicrobial substances, as described in Examples 1, 2, 4 and 5.
На Фиг.4 и 5 приведены электронные микрофотографии биокатализаторов, полученных, как описано в Примерах 1 и 4 соответственно. На Фиг.6-8 приведены электронные микрофотографии аминополисахаридных гелей, формирующихся при получении биокатализаторов, согласно Примерам 1, 4 и 5 соответственно, которые подтверждают наличие у них макропористой структуры, не создающей диффузионных затруднений для процессов, катализируемых иммобилизованным ферментом.Figures 4 and 5 show electron micrographs of biocatalysts obtained as described in Examples 1 and 4, respectively. Figure 6-8 shows electron micrographs of aminopolysaccharide gels formed during the preparation of biocatalysts, according to Examples 1, 4 and 5, respectively, which confirm the presence of a macroporous structure that does not create diffusion difficulties for processes catalyzed by an immobilized enzyme.
На Фиг.9 приведены данные по способности аминополисахаридных гелей, формирующихся при получении биокатализаторов согласно Примерам 1 и 4, сорбировать влагу. Наличие в составе биокатализатора аминополисахаридного геля дает возможность дополнительного 3,5-4,5-кратного увеличения массы сорбируемой влаги к известному (8-10-кратному) уровню сорбционной способности натуральных волокнистых материалов, используемых при получении предлагаемого биокатализатора с его исходной 50-60% влажностью.Figure 9 shows data on the ability of aminopolysaccharide gels, formed upon receipt of biocatalysts according to Examples 1 and 4, to absorb moisture. The presence in the biocatalyst aminopolysaccharide gel allows an additional 3.5-4.5-fold increase in the mass of adsorbed moisture to a known (8-10-fold) level of sorption ability of natural fibrous materials used to obtain the proposed biocatalyst with its original 50-60% humidity.
Таким образом, предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом обладает рядом преимуществ:Thus, the proposed invention in comparison with the prototype has several advantages:
- Способ получения биокатализатора позволяет увеличить удельную концентрацию иммобилизованного белка на единице носителя (мг/г) в 3,4-5 раз (Примеры 1, 2, 4, 5);- A method for producing a biocatalyst allows to increase the specific concentration of immobilized protein per carrier unit (mg / g) 3.4-5 times (Examples 1, 2, 4, 5);
- Биокатализатор, полученный согласно заявляемому способу, имеет каталитическую активность в 36,5-73 раза выше по сравнению с прототипом (Примеры 1-5);- The biocatalyst obtained according to the claimed method has a catalytic activity of 36.5-73 times higher compared to the prototype (Examples 1-5);
- Применение разнообразных тканых и нетканых материалов (бязь, марля, войлок и др.) (Примеры 1-5) в качестве нерастворимого пористого носителя позволяет варьировать геометрические размеры и формы биокатализатора и, таким образом, существенно расширяет возможность применения биокатализатора;- The use of a variety of woven and non-woven materials (calico, gauze, felt, etc.) (Examples 1-5) as an insoluble porous carrier allows you to vary the geometric dimensions and shapes of the biocatalyst and, thus, significantly expands the possibility of using a biocatalyst;
- Введение антимикробных веществ в состав биоктализатора позволяет длительно хранить его во влажном состоянии (Пример 6), не подвергая биокатализатор высушиванию, которое требуется для прототипа. Таким образом, для получения готовой формы биокатализатора не требуется проведения дополнительной достаточно длительной и дорогостоящей технологической стадии, как сушка;- The introduction of antimicrobial substances in the composition of the biocatalyst allows you to store it in a wet state for a long time (Example 6), without subjecting the biocatalyst to drying, which is required for the prototype. Thus, to obtain the finished form of the biocatalyst, it is not necessary to carry out an additional sufficiently long and expensive technological stage, such as drying;
- Биокатализатор, полученный на основе натуральных волокон и аминополисахаридных гелей, потенциально обладает более высокой гигроскопичностью по сравнению с синтетическим носителем (Пример 6);- Biocatalyst obtained on the basis of natural fibers and aminopolysaccharide gels, potentially has a higher hygroscopicity compared to a synthetic carrier (Example 6);
- Способ получения биокатализатора в отличие от прототипа не предполагает использование ацетил- и бутирилхолинэстераз в комбинации с ОРН, что исключает необходимость проведения регенерации холинэстераз, инактивированных при взаимодействии с ФОС, после каждого рабочего цикла биокатализатора.- The method for producing a biocatalyst, unlike the prototype, does not involve the use of acetyl and butyrylcholinesterase in combination with ORN, which eliminates the need for regeneration of cholinesterase inactivated by interaction with FOS after each biocatalyst working cycle.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004107942/13A RU2261911C1 (en) | 2004-03-18 | 2004-03-18 | Method for preparing biocatalyst and biocatalyst for detoxifying organophosphorus compounds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004107942/13A RU2261911C1 (en) | 2004-03-18 | 2004-03-18 | Method for preparing biocatalyst and biocatalyst for detoxifying organophosphorus compounds |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004107942A RU2004107942A (en) | 2005-08-27 |
| RU2261911C1 true RU2261911C1 (en) | 2005-10-10 |
Family
ID=35846581
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004107942/13A RU2261911C1 (en) | 2004-03-18 | 2004-03-18 | Method for preparing biocatalyst and biocatalyst for detoxifying organophosphorus compounds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2261911C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2451077C1 (en) * | 2011-01-12 | 2012-05-20 | Химический Факультет Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Method for enzymatic hydrolysis of organophosphorous soil compounds |
| US20130309746A1 (en) * | 2011-11-11 | 2013-11-21 | Augustine A. DiNovo | Biodegradable immobilized enzymes and methods of making the same |
| RU2525658C2 (en) * | 2012-09-13 | 2014-08-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | NANOSCALE ENZYME BIOCATALYST FOR in vivo DETOXIFICATION OF ORGANOPHOSPHOROUS COMPOUNDS |
-
2004
- 2004-03-18 RU RU2004107942/13A patent/RU2261911C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CALDWELL S.R., RAUSHEL P.M. Detoxification of organophosphate pesticides, using a naylon based Immobilized phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Appl. Biochem. Biotechnol. 1991, v.37, p.59-72. ЕФРЕМЕНКО E.H., СЕРГЕЕВА B.C. Органофосфатгидролаза - фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов. Известия АН. Сер. "Хим". 2001, с.1743-1749. * |
| LEJEUNE K.E, MESIANO A. J., BOWER S.B. et al. Dramatically stabilized phosphotriesterase-polymers for nerve agents degradation. Biotechonol. Bioeng. 1997, v. 54, p.105-114. HAVENS P.I., RASE H.F. Reusable Immobilized Enzyme/Polyurethane - Sponge for Removal and Detoxification of Localized Organophosphate Pesticide Spills. Ind. Eng. Chem. Res. 1993, v.32, n.10, p.2254-2258. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2451077C1 (en) * | 2011-01-12 | 2012-05-20 | Химический Факультет Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Method for enzymatic hydrolysis of organophosphorous soil compounds |
| US20130309746A1 (en) * | 2011-11-11 | 2013-11-21 | Augustine A. DiNovo | Biodegradable immobilized enzymes and methods of making the same |
| CN104114700A (en) * | 2011-11-11 | 2014-10-22 | 吉尔德联合有限公司 | Biodegradable immobilized enzymes and methods of making the same |
| US9944920B2 (en) * | 2011-11-11 | 2018-04-17 | Guild Associates, Inc. | Biodegradable immobilized enzymes and methods of making the same |
| RU2525658C2 (en) * | 2012-09-13 | 2014-08-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | NANOSCALE ENZYME BIOCATALYST FOR in vivo DETOXIFICATION OF ORGANOPHOSPHOROUS COMPOUNDS |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004107942A (en) | 2005-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bayazidi et al. | Immobilization of lysozyme on bacterial cellulose nanofibers: Characteristics, antimicrobial activity and morphological properties | |
| Gao et al. | Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles | |
| US11607345B2 (en) | Chitosan materials with entrapped enzyme and biocatalytic textiles and other biocatalytic materials comprising same | |
| US6642037B2 (en) | Preparation of enzymatically active sponges or foams for detoxification of hazardous compounds | |
| Talekar et al. | Optimization of immobilization of α-amylase in alginate gel and its comparative biochemical studies with free α-amylase | |
| JP6006121B2 (en) | Substrate for immobilizing functional substance and method for producing the same | |
| US9944920B2 (en) | Biodegradable immobilized enzymes and methods of making the same | |
| Krishnamoorthi et al. | Immobilized enzyme technology: potentiality and prospects | |
| Vitola et al. | Biocatalytic membrane reactor development for organophosphates degradation | |
| LeJeune et al. | Fighting nerve agent chemical weapons with enzyme technology | |
| CA1223382A (en) | Immobilization of proteins on polymeric supports | |
| Munnecke | Properties of an immobilized pesticide-hydrolyzing enzyme | |
| Prasad et al. | Immobilization of a thermostable, fungal recombinant chitinase on biocompatible chitosan beads and the properties of the immobilized enzyme | |
| RU2261911C1 (en) | Method for preparing biocatalyst and biocatalyst for detoxifying organophosphorus compounds | |
| US6762213B2 (en) | Buffer polymers, co-immobile buffer and enzyme polymers and methods of synthesis thereof | |
| Anita et al. | Immobilization of urease using Amberlite MB-1 | |
| RU2315103C1 (en) | Biocatalyst preparation method and a biocatalyst for detoxification of organophosphorus neurotoxic compounds in continuous-flow systems | |
| RU2330717C1 (en) | Filtering and sorbing self-decontaminating material for personal protective equipment from impact of organic phosphorus compounds | |
| RU2451077C1 (en) | Method for enzymatic hydrolysis of organophosphorous soil compounds | |
| CA1229808A (en) | Preparation of hydrophobic cotton cloth | |
| Mirzaei et al. | Polymer based formulation and immobilization approaches in enzymatic detoxification of organophosphorus compounds: A review | |
| RU2818272C1 (en) | Method of producing heterogeneous biocatalyst based on lipase immobilized on cation-exchange fibres “вион кн-1” in h-form | |
| Tercan | Immobilization of Thermophilic Recombinant Esterase Enzyme by Microencapsulation in Alginate-Chitosan/CaCI 2 Polyelectrolyte Beads | |
| Kulkarni et al. | Immobilized Enzymes | |
| Mafuma et al. | Immobilisation of Acetylcholinesterase onto Electrospun Nanofibres for Carbofuran and Demeton-S-Methyl Sulfone Detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130319 |