RU2256464C1 - Method for preparing human c-1 esterase inhibitor amd product for using in medicine - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology, medicine, pharmacy, veterinary science.

SUBSTANCE: method involves addition of DEAE-Sephadex A-50 to cryosupernatant from human blood plasma, incubation, filtration and addition of QAE-Sephadex to filtrate followed by incubation. Filtered off precipitate of QAE-Sephadex is subjected for successive step-by-step washing out with buffer solution at pH 5.5 and 7.5, elution at pH 7.7 and dialysis. Then PEG-6000 is added to dialyzed solution to the concentration 12%, solution is incubated and centrifuged. To the prepared supernatant glycine is added to the final concentration 100 mM and lysine is added to the final concentration 10 mM at pH 7.2, then Twin-80 is added and pH value is corrected to 6.8-7.2 followed by addition of tri-n-butyl phosphate to the final concentration 0.3%. Prepared suspension is stirred, subjected for chromatography on DEAE-Sepharose FF at pH 7.0, chromatography on Zn-chelating Sepharose FF at pH 7.5 and the end product with specific activity from 7.5 ± 0.5 U/mg of protein and above, and with the final concentration of lysine 10 mM, not less, and with the final concentration of glycine 100 mM, not less. Method provides safety of activity in antiviral treatment and preparing product containing the natural C-1 esterase inhibitor from blood plasma with high specific activity.

EFFECT: improved method for preparing.

6 cl, 2 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, фармации и медицины и касается нового способа получения Cl-эстеразного ингибитора, фармацевтический продукт которого в последнее время все шире используется в медицине.The invention relates to the field of biotechnology, pharmacy and medicine, and relates to a new method for producing Cl-esterase inhibitor, a pharmaceutical product of which has been increasingly used in medicine recently.

Cl-эстеразный ингибитор является белком крови (молекула представляет собой цепь из 478 аминокислотных остатков, молекулярная масса 105 кДа) и основным ингибитором классического пути системы комплемента, непрямым ингибитором калликреин-кининовой, свертывающей и фибринолитической систем, которые, в свою очередь, продуцируют биологически активные белки. То есть Cl-эстеразный ингибитор является одним из регуляторов системы развития воспалительной реакции организма, а также ингибирует активированный фактор XI и может служить ингибитором коагуляции, а также тканевого активатора плазминогена и плазмина (A. Groner et al., US 6242239).Cl-esterase inhibitor is a blood protein (the molecule is a chain of 478 amino acid residues, molecular weight 105 kDa) and the main inhibitor of the classical complement system pathway, an indirect inhibitor of kallikrein-kinin, coagulation and fibrinolytic systems, which, in turn, produce biologically active squirrels. That is, the Cl esterase inhibitor is one of the regulators of the inflammatory response of the body, and also inhibits activated factor XI and can serve as an inhibitor of coagulation, as well as tissue plasminogen activator and plasmin (A. Groner et al., US 6242239).

Такая роль Cl-эстеразного ингибитора в организме предопределила возможность его использования в заместительной терапии при ангионевротических отеках, для профилактики и лечения сепсиса, в том числе тяжелого, и септического шока, для профилактики и лечения полиорганной дисфункции, синдрома повышенной проницаемости капилляров при сепсисе и септическом шоке, для профилактики и лечения острого респираторного дистресс-синдрома, для адъювантной терапии при атеросклеротическом поражении сосудов любой локализации, для профилактики и лечения ишемического инсульта и его осложнений, повторного острого нарушения мозгового кровообращения, профилактики и лечения шоковых состояний в операционном и послеоперационном периодах при аортокоронарном шунтировании, для предупреждения и лечения шоковых состояний при проведении транслюминальной ангиопластики, для профилактики и лечения синдрома реперфузии после аортокоронарного шунтирования и транслюминальной ангиопластики в комбинации с прямыми антикоагулянтами, для профилактики и лечения реакции отторжения при трансплантации органов и тканей (в том числе - костного мозга), для лечения или предупреждения системных ревматологических заболеваний, протекающих с активацией комплемента (системная красная волчанка, системная склеродеромия, дерматомиозит, ревматоидный артрит и т.д.), для профилактики и лечения осложнений у больных с травматологическими повреждениями различной локализации, для адъювантной терапии любых состояний, в том числе - новообразований, протекающих с активацией системы комплемента.This role of the Cl esterase inhibitor in the body has predetermined the possibility of its use in replacement therapy for angioedema, for the prevention and treatment of sepsis, including severe and septic shock, for the prevention and treatment of multiple organ dysfunction, increased capillary permeability syndrome in sepsis and septic shock , for the prevention and treatment of acute respiratory distress syndrome, for adjuvant therapy for atherosclerotic vascular lesions of any location, for prevention and treatment I of ischemic stroke and its complications, repeated acute cerebrovascular accident, prevention and treatment of shock conditions in the surgical and postoperative periods with coronary artery bypass grafting, for the prevention and treatment of shock conditions during transluminal angioplasty, for the prevention and treatment of reperfusion syndrome after coronary artery bypass grafting and transplant in combination with direct anticoagulants, for the prevention and treatment of transplant rejection reactions organs and tissues (including bone marrow), for the treatment or prevention of systemic rheumatological diseases that occur with complement activation (systemic lupus erythematosus, systemic scleroderma, dermatomyositis, rheumatoid arthritis, etc.), for the prevention and treatment of complications in patients with traumatic injuries of various localization, for adjuvant therapy of any conditions, including neoplasms that occur with the activation of the complement system.

Важным показателем Cl-эстеразного ингибитора является его специфическая активность, выражаемая как ед/мг белка или МЕ/мг белка (здесь и далее - международных единиц) или U/mg (IU/mg).An important indicator of a Cl-esterase inhibitor is its specific activity, expressed as u / mg protein or IU / mg protein (hereinafter, international units) or U / mg (IU / mg).

Однако доказанное исследовательскими работами многообразие функций Cl-эстеразного ингибитора не позволяет широко использовать его в медицинской практике ввиду невысокой чистоты получаемого до сих пор препарата: наилучшие результаты, показанные W.Schoenhofel et al. (EP 1244706) для трансгенного Cl-эстеразного ингибитора в результате сложной и дорогой системы очистки, не превышали 6 ME на 1 мг белка при декларируемой теоретически возможной (но практически не подтвержденной) активности до 8 МЕ/мг (активность определяется общепринятым в настоящее время методом с использованием тест-системы Berichrom Cl-INH, Dade-Behring Diagnostics). He стоит игнорировать и нежелательные побочные эффекты, вызванные введением в организм чужеродных белков (аллергические реакции, тромбоз вен и т.п.) (Caiezi С. et al. Pharmacological Reviews 2000, v.52 (1): 91-112).However, the variety of functions of the Cl-esterase inhibitor proved by research does not allow its widespread use in medical practice due to the low purity of the preparation so far obtained: the best results shown by W. Schchoenhofel et al. (EP 1244706) for a transgenic Cl-esterase inhibitor as a result of a complex and expensive purification system, did not exceed 6 ME per 1 mg of protein with a declared theoretically possible (but practically not confirmed) activity up to 8 IU / mg (activity is determined by the currently generally accepted method using the Berichrom Cl-INH test system, Dade-Behring Diagnostics). He should not ignore the unwanted side effects caused by the introduction of foreign proteins into the body (allergic reactions, venous thrombosis, etc.) (Caiezi C. et al. Pharmacological Reviews 2000, v.52 (1): 91-112).

Основная задача данного изобретения - получение продукта, содержащего природный Cl-эстеразный ингибитор из плазмы крови с изначально высокой активностью, от 7,5±0,5 МЕ/мг белка и более.The main objective of this invention is to obtain a product containing a natural Cl-esterase inhibitor from blood plasma with initially high activity, from 7.5 ± 0.5 IU / mg protein or more.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Известны способы получения Cl-эстеразного ингибитора из плазмы крови человека. Все они сводятся к комбинации методов предварительной очистки белка с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) и двух-трех хроматографических стадий. Однако либо это были лабораторные подходы, которые трудно масштабировать для широкого промышленного производства (Harrison R. Biochemistry, 1983, 22, 5001-5007), либо использовались дорогостоящие аффинные носители (Pilatte Y.M. et al., US 5030578), либо метод давал невысокий выход конечного продукта и имел ряд технических и экономических недостатков (Poulle M. et al., US 5681750), либо выделялся неактивный Cl-ингибитор (Розина М.Н. и др. РФ 2068693), либо предлагаемый подход не давал хорошего выхода конечного препарата с высокой удельной активностью по причине отсутствия эффективных стабилизаторов на этапах проведения вирусной инактивации (Schoenhofer W. et al. EP 1244706).Known methods for producing Cl-esterase inhibitor from human blood plasma. They all boil down to a combination of protein pretreatment methods using polyethylene glycol (PEG) and two to three chromatographic steps. However, either these were laboratory approaches that were difficult to scale for wide industrial production (Harrison R. Biochemistry, 1983, 22, 5001-5007), or they used expensive affinity carriers (Pilatte YM et al., US 5030578), or the method gave a low yield the final product and had a number of technical and economic disadvantages (Poulle M. et al., US 5681750), either an inactive Cl inhibitor (Rozina M.N. et al. RF 2068693) was isolated, or the proposed approach did not give a good yield of the final drug with high specific activity due to the lack of effective stability isators at the stages of viral inactivation (Schoenhofer W. et al. EP 1244706).

Подбор эффективных стабилизаторов играет важную роль при проведении процессов вирусной инактивации, таких как обработка сольвент/детергентом или тепловая обработка, поскольку известно, что эти факторы могут приводить к необратимым конформационным изменениям серпинов (Mast A.E. et al., Blood 1999, 94, 11, 3922-3927), что, в свою очередь, отрицательно сказывается на их активности.The selection of effective stabilizers plays an important role in viral inactivation processes, such as solvent / detergent treatment or heat treatment, since it is known that these factors can lead to irreversible conformational changes in serpines (Mast AE et al., Blood 1999, 94, 11, 3922 -3927), which, in turn, negatively affects their activity.

Для стабилизации белков широко используются сахара, полиолы, полимеры, аминокислоты (См., например: Структура и стабильность биологических макромолекул под ред. Тимашеффа С.Н. и Фасмана Г.Д. M.: Мир, 1973; Привалов П.С. Биофизика 1987, 32, 742-759; Введение в прикладную этимологию под ред. Березина И.В. и Мартинека К. M.: МГУ, 1982; Айсина Р.Б. и др. Биоорганическая химия 1994, 20, 2, 182-189). Выбор стабилизатора определяется как природой стабилизируемого белка, так и природой воздействия.To stabilize proteins, sugars, polyols, polymers, amino acids are widely used (See, for example: Structure and stability of biological macromolecules edited by Timasheff S.N. and Fasman G.D. M .: Mir, 1973; Privalov P.S. Biophysics 1987, 32, 742-759; Introduction to applied etymology under the editorship of IV Berezin and K. Martinek M .: Moscow State University, 1982; Aisina RB and others. Bioorganic chemistry 1994, 20, 2, 182-189 ) The choice of stabilizer is determined by both the nature of the stabilized protein and the nature of the effect.

В частности, вышеперечисленные сахара, аминокислоты, соли органических кислот (натрия каприлат, цитраты калия, натрия или аммония) ранее применяли для стабилизации Cl-эстеразного ингибитора в процессе его получения (Craigenne A.W. US 4379085; J Eibl et al US 5733885).In particular, the aforementioned sugars, amino acids, and salts of organic acids (sodium caprylate, potassium, sodium, or ammonium citrates) were previously used to stabilize the Cl esterase inhibitor during its preparation (Craigenne A.W. US 4379085; J Eibl et al US 5733885).

Поскольку наибольшей эффективностью при противовирусной обработке плазмы и ее компонентов является комбинация методов, подбор наиболее эффективной защиты для целевого белка является непростой задачей. Для Cl-эстеразного ингибитора данный аспект малоизучен. Видимо, это и является одной из основных причин низкого выхода целевого белка для большинства заявленных способов его выделения и очистки. Повышение же качества конечного препарата наряду с очевидными преимуществами позволяет значительно расширить область его применения.Since the combination of methods is the most effective in antiviral treatment of plasma and its components, the selection of the most effective protection for the target protein is not an easy task. For Cl-esterase inhibitor, this aspect is poorly understood. Apparently, this is one of the main reasons for the low yield of the target protein for most of the claimed methods for its isolation and purification. Improving the quality of the final drug, along with obvious advantages, can significantly expand its scope.

Наиболее близким по сущности к предлагаемому изобретению является способ получения Cl-эстеразного ингибитора, изложенный Poulle M. et al. в US 5681750.Closest to the essence of the invention is a method for producing Cl-esterase inhibitor set forth by Poulle M. et al. in US 5681750.

В способе-прототипе (Poulle M. et al. US 5681750) особенности получения Cl-эстеразного ингибитора состояли в том, что свободная от криопреципитата плазма подвергалась предварительной очистке от витамин К-зависимых белков на колонне с ДЕАЕ-сефарозой и от антитромбина Ш - на гепарин-сефарозе. Полученная таким образом фракция, содержащая Cl-эстеразный ингибитор, наносилась на слабый анионообменник (ДМАЕ-типа) для освобождения от сопутствующих белков (альбумина, иммуноглобулинов, альфа-антитрипсина, альфа-2-макроглобулина и т.д.).In the prototype method (Poulle M. et al. US 5681750), the specific features of the preparation of the Cl esterase inhibitor were that the plasma free of cryoprecipitate was preliminarily purified from vitamin K-dependent proteins on a DEAE-sepharose column and from antithrombin Sh - on heparin sepharose. The fraction thus obtained containing the Cl-esterase inhibitor was applied to a weak anion exchanger (DMAE type) to free it from associated proteins (albumin, immunoglobulins, alpha-antitrypsin, alpha-2-macroglobulin, etc.).

После проведения антивирусной обработки сольвент/детергентом (об изменении активности целевого белка в ходе такой процедуры авторы не сообщают) смесь наносится на сильный катионообменник для удаления антивирусных агентов. Фракционирование на этом носителе позволяет освободиться от IgM. После этапа концентрирования и диализа на ультрафильтрационной мембране проводят заключительную процедуру удаления вирусов. Для этого авторы предлагают использовать нанофильтрацию последовательно на фильтрах с диаметром пор 35 нм и 15 нм. Готовый продукт имел специфическую активность около 6 ед/мг белка.After antiviral treatment with solvent / detergent (the authors did not report any changes in the activity of the target protein during this procedure), the mixture is applied to a strong cation exchanger to remove antiviral agents. Fractionation on this carrier allows you to get rid of IgM. After the stage of concentration and dialysis on the ultrafiltration membrane, the final virus removal procedure is carried out. For this, the authors propose using nanofiltration sequentially on filters with a pore diameter of 35 nm and 15 nm. The finished product had a specific activity of about 6 units / mg protein.

Очевидно, что использованная комбинация методов в способе-прототипе имеет ряд недостатков. Во-первых, данный способ может существовать только сам по себе, и его нельзя внедрить в качестве модуля в процесс фракционирования плазмы по Кону, что делает его экономически невыгодным. Во-вторых, в способе-прототипе не учтен тот факт, что серпины, к которым относится и Cl-эстеразный ингибитор, могут заметно терять свою активность при антивирусной обработке сольвент-детергентами (Mast A.E. et al., Blood 1999, 94, 11, 3922-3927).It is obvious that the combination of methods used in the prototype method has several disadvantages. Firstly, this method can exist only on its own, and it cannot be implemented as a module in the Cohn plasma fractionation process, which makes it economically disadvantageous. Secondly, the prototype method does not take into account the fact that serpins, which include the Cl-esterase inhibitor, can noticeably lose their activity during antiviral treatment with solvent-based detergents (Mast AE et al., Blood 1999, 94, 11, 3922-3927).

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

В связи с этим была поставлена задача - разработать способ получения концентрата Сl-эстеразного ингибитора, лишенный этих недостатков, используя легко масштабируемые стадии.In this regard, the task was set to develop a method for producing a concentrate of Cl-esterase inhibitor, devoid of these disadvantages, using easily scalable stages.

Заявляемый способ отличается тем, что из плазмы крови человека получают концентрат Сl-эстеразного ингибитора с удельной активностью в конечном препарате от 7,5±0,5 ед/мг белка и более, содержащий лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ. Способ включает следующие обязательные стадии в указанной последовательности: удаление белков плазмы с использованием ионообменников, фракционирование полиэтиленгликолем, добавление в полученный раствор глицина и лизина, проведение вирусной инактивации, удаление ее продуктов хроматографией и тонкую очистку конечного продукта от примесей.The inventive method is characterized in that from human blood plasma a concentrate of Cl-esterase inhibitor is obtained with a specific activity in the final preparation of 7.5 ± 0.5 units / mg protein or more, containing lysine in a final concentration of at least 10 mM and glycine in the final concentration of not less than 100 mm. The method includes the following mandatory steps in the sequence indicated: removal of plasma proteins using ion exchangers, fractionation with polyethylene glycol, addition of glycine and lysine to the resulting solution, viral inactivation, removal of its products by chromatography and fine purification of the final product from impurities.

При этом предпочтительно последовательное использование слабого и сильного анионообменника при разных значениях рН, а также выполнение тонкой очистки конечного продукта методом металл-хелаторной хроматографии; также предпочтительно, чтобы вирусную инактивацию проводили сольвент-детергентом.In this case, it is preferable to consistently use a weak and strong anion exchanger at different pH values, as well as perform fine purification of the final product by metal-chelator chromatography; it is also preferred that the viral inactivation is carried out with a solvent detergent.

Достоинством заявленного способа является возможность после использования ионообменников направления плазмы в процесс производства ее белковых препаратов спиртовым методом Кона.The advantage of the claimed method is the possibility, after using ion exchangers, of directing the plasma into the production process of its protein preparations by the Cohn alcohol method.

Более подробно способ приведен на Фиг. 1 (схема получения концентрата Сl-эстеразного ингибитора):The method is described in more detail in FIG. 1 (scheme for the preparation of a concentrate of Cl-esterase inhibitor):

- на первом, предварительном этапе освобождаются от белков протромбинового комплекса. Для этого свежезамороженную плазму размораживают, отделяют центрифугированием криопреципитат и к криосупернатанту добавляют сухой DEAE-сефадекс А-50 из расчета 1,5 г на литр криосупернатанта. После инкубации при постоянном перемешивании осадок отделяют фильтрованием. Осадок отправляют на регенерацию или получение компонентов протромбинового комплекса. К фильтрату после подведения рН до 5,5 уксусной кислотой добавляют сухой QАЕ-сефадекс из расчета 2,5 г на литр плазмы. После инкубации сефадекс с сорбированными на нем белками отделяют фильтрацией и подвергают последовательной промывке, рН фильтрата доводят до исходного уровня и возвращают для дальнейшего фракционирования по Кону.- at the first, preliminary stage, they are freed from the proteins of the prothrombin complex. For this, freshly frozen plasma is thawed, cryoprecipitate is separated by centrifugation, and dry DEAE-Sephadex A-50 is added to the cryosupernatant at a rate of 1.5 g per liter of cryosupernatant. After incubation with constant stirring, the precipitate was separated by filtration. The precipitate is sent for regeneration or preparation of the components of the prothrombin complex. After adjusting the pH to 5.5 with acetic acid, dry QAE-Sephadex is added to the filtrate at a rate of 2.5 g per liter of plasma. After incubation, Sephadex with proteins adsorbed on it is separated by filtration and subjected to sequential washing, the pH of the filtrate is adjusted to the initial level and returned for further Cohn fractionation.

Отфильтрованный осадок, содержащий QАЕ-сефадекс и сорбированные на нем белки, в том числе и Cl-эстеразный ингибитор, подвергают последовательной промывке сначала 100 мМ натрий ацетатньм буфером рН 5,5, содержащим 50 мМ хлорид натрия, затем 20 мм трис-НСl буфером рН 7,5, содержащим 200 мМ хлорид натрия. Элюцию проводят 20 мМ трис-НСl буфером рН 7,7, содержащим 1 М хлорид натрия.The filtered precipitate containing QAE-Sephadex and proteins sorbed on it, including the Cl-esterase inhibitor, are washed sequentially with 100 mM sodium acetate pH 5.5 buffer containing 50 mM sodium chloride, then 20 mm Tris-Hcl pH buffer 7.5 containing 200 mM sodium chloride. The elution is carried out with 20 mm Tris-Hcl buffer pH 7.7 containing 1 M sodium chloride.

Фракцию, содержащую Cl-эстеразный ингибитор, подвергают диафильтрации против 20 мМ трис-НСl буфера рН 7,4, содержащего 50 мМ хлорид натрия. Добавляют ПЭГ-6000 до концентрации 12% и инкубируют при перемешивании на холоде в течение часа. Центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут получают осадок голубого цвета и бесцветный супернатант.The fraction containing the Cl esterase inhibitor was diafiltered against 20 mM Tris-HCl pH 7.4 buffer containing 50 mM sodium chloride. PEG-6000 was added to a concentration of 12% and incubated with stirring in the cold for one hour. Centrifugation at 4000 rpm for 10 minutes gives a blue precipitate and a colorless supernatant.

Супернатант отделяют и добавляют глицин до конечной концентрации 100 мМ и лизин до конечной концентрации 10 мМ, подводят рН до 7,2 с помощью 0,5 М трис. К полученному раствору прибавляют твин 80 до конечной концентрации 1% и три(н-бутил)фосфат до конечной концентрации 0,3% для проведения инактивации вирусов. Процесс проводят при комнатной температуре в течение 6 часов. Потери активности при этом не наблюдается. В отсутствии же стабилизаторов активность падала примерно на 50% (Фиг. 2: Стабилизирующая роль глицина и лизина. А - активность Cl-эстеразного ингибитора до проведения процедуры вирусной инактивации, Б - активность Cl-эстеразного ингибитора при проведении вирусной инактивации в отсутствии глицина и лизина, В - активность Cl-эстеразного ингибитора при проведении вирусной инактивации в присутствии глицина и лизина). Для определения активности использовали тест-систему Berichrom Cl-INH, Dade-Behring Diagnostics, Германия (Плазма-калибратор Plasma S Dade-Behring). После проведения процедуры вирусной инактивации корректировали проводимость до 6,0 mS/cm.The supernatant is separated and glycine is added to a final concentration of 100 mM and lysine to a final concentration of 10 mM, the pH is adjusted to 7.2 with 0.5 M Tris. Tween 80 is added to the resulting solution to a final concentration of 1% and three (n-butyl) phosphate to a final concentration of 0.3% to inactivate the viruses. The process is carried out at room temperature for 6 hours. Loss of activity is not observed. In the absence of stabilizers, the activity decreased by about 50% (Fig. 2: The stabilizing role of glycine and lysine. A is the activity of the Cl esterase inhibitor before the viral inactivation procedure, B is the activity of the Cl esterase inhibitor during viral inactivation in the absence of glycine and lysine , B - Cl-esterase inhibitor activity during viral inactivation in the presence of glycine and lysine). To determine the activity used the test system Berichrom Cl-INH, Dade-Behring Diagnostics, Germany (Plasma S calibrator Dade-Behring). After the viral inactivation procedure, conductivity was adjusted to 6.0 mS / cm.

Смесь наносилась на колонну с DEAE-сефарозой FF, уравновешенную 10 мМ трис буфером рН 7,0, содержащим 50 мМ хлорид натрия. Колонну промывали 10 мМ трис-НСl буфером рН 7,0, содержащим 100 мМ хлорид натрия. Элюцию целевого белка вели 10 мМ трис-НСl буфером рН 7,0, содержащим 250 мМ хлорид натрия.The mixture was applied to a DEAE-Sepharose FF column equilibrated with 10 mM Tris buffer pH 7.0 containing 50 mM sodium chloride. The column was washed with 10 mM Tris-Hcl with pH 7.0 buffer containing 100 mM sodium chloride. The target protein was eluted with 10 mM Tris-Hcl buffer, pH 7.0, containing 250 mM sodium chloride.

Окончательная, тонкая очистка Cl-эстеразного ингибитора проводилась с использованием металлохелаторной хроматографии. Задача этого этапа - освободиться от минорных примесей. Целевой белок проходит через колонну, не сорбируясь, примесные же белки остаются связанными с носителем. С этой целью через колонну, наполненную Zn-хелатирующей сефарозой FF, уравновешенной 10 мМ трис буфером, содержащим 250 мМ хлорид натрия, рН 7,5, пропускали раствор белков, полученных на предыдущей стадии. Целевой белок проходил через колонну без задержки, на колонне сорбировались остатки неотделенного церуллоплазмина. Регенерацию колонны проводили 50 мМ натрий ацетатным буфером рН 4,0, содержащим 500 мМ хлорид натрия. После этого колону уравновешивали стартовьм буфером.The final, fine purification of the Cl-esterase inhibitor was carried out using metal chelator chromatography. The objective of this stage is to get rid of minor impurities. The target protein passes through the column without adsorption, while the impurity proteins remain bound to the carrier. For this purpose, a solution of the proteins obtained in the previous step was passed through a column filled with Zn-chelating Sepharose FF balanced with 10 mM Tris buffer containing 250 mM sodium chloride, pH 7.5. The target protein passed through the column without delay, the residues of unseparated cerulloplasmin were sorbed on the column. The column was regenerated with 50 mM sodium acetate buffer, pH 4.0, containing 500 mM sodium chloride. After that, the column was balanced with the start buffer.

Выход целевого белка составлял 30-40%. Удельная активность Cl-эстеразного ингибитора в конечном препарате (концентрате) - 7,5±0,5 ед/мг белка; содержание лизина - не менее 10 мМ, глицина - не менее 100 мМ.The yield of the target protein was 30-40%. The specific activity of the Cl-esterase inhibitor in the final preparation (concentrate) is 7.5 ± 0.5 units / mg protein; the content of lysine is not less than 10 mm, glycine - not less than 100 mm.

Для более детального представления предлагаемый способ может быть проиллюстрирован примером.For a more detailed presentation, the proposed method can be illustrated by example.

Пример (лучший вариант осуществления изобретения)Example (best embodiment of the invention)

К 2 л криосупернатанта плазмы крови добавляем 3 г ДЕАЕ-сефадекса А50. После инкубации в течение 1 часа осадок отделяли фильтрацией. рН полученного таким образом фильтрата доводили 1М уксусной кислотой до 5,5. В конкретном примере на 1900 мл фильтрата добавляли 90 мл кислоты. Температуру раствора доводили до 5-8°С и добавляли сухой QAE-сефадекс А50 из расчета 2,5 г на 1 л плазмы. После двух часов инкубации сорбент со связанным Cl-эстеразным ингибитором отфильтровывали, а рН фильтрата доводили до 7,3-7,4. (Полученный раствор может быть использован для дальнейшего фракционирования, в частности по Кону). QAE-сефадекс со связанным с ним белками оставляли на фильтре и подвергали ступенчатой промывке. Процесс проводили при температуре 5-8°С. Вначале промывали 1 л 100 мМ натрий ацетатного буфера рН 5,5, содержащего 50 мМ хлорид натрия. После этого 1 литром 20 мМ трис-НСl буфера рН 7,5, содержащего 200 мМ хлорид натрия. Элюцию проводили 300 мл 20 мМ трис-НСl буфера рН 7,7, содержащего 1 М хлорид натрия. Элюат диализовали против 20 мМ трис-НСl буфера рН 7,4, содержащего 50 мМ хлорид натрия.To 2 l of cryosupernatant in blood plasma add 3 g of DEAE-Sephadex A50. After incubation for 1 hour, the precipitate was separated by filtration. The pH of the filtrate thus obtained was adjusted to 5.5 with 1M acetic acid. In a specific example, 90 ml of acid was added per 1900 ml of filtrate. The temperature of the solution was adjusted to 5-8 ° C. and dry QAE-Sephadex A50 was added at a rate of 2.5 g per 1 liter of plasma. After two hours of incubation, the sorbent with the bound Cl-esterase inhibitor was filtered off, and the pH of the filtrate was adjusted to 7.3-7.4. (The resulting solution can be used for further fractionation, in particular according to Cohn). QAE-Sephadex with its associated proteins was left on the filter and subjected to stepwise washing. The process was carried out at a temperature of 5-8 ° C. First washed with 1 l of 100 mm sodium acetate buffer pH 5.5, containing 50 mm sodium chloride. After that, 1 liter of 20 mm Tris-Hcl buffer pH 7.5, containing 200 mm sodium chloride. Elution was performed with 300 ml of 20 mM Tris-Hcl pH 7.7 buffer containing 1 M sodium chloride. The eluate was dialyzed against 20 mM Tris-Hcl pH 7.4 buffer containing 50 mM sodium chloride.

К 250 мл диализованного раствора было добавлено 79 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000. Полученную суспензию перемешивали в течение 1 часа при температуре 5-8°С, после чего центрифугировали в течение 10 минут при 4000 об/мин.79 ml of a 50% solution of polyethylene glycol 6000 were added to 250 ml of the dialyzed solution. The resulting suspension was stirred for 1 hour at a temperature of 5-8 ° C, after which it was centrifuged for 10 minutes at 4000 rpm.

К полученным 325 мл супернатанта добавляли глицин и лизин до конечной концентрации 100 мМ и 10 мМ соответственно, после чего корректировали величину рН с помощью 0,5 М трис, доводя до 7,25 единиц. Затем вносили 11% твин-80 до конечной концентрации в 1% и вновь корректировали рН, доводя его до 6,8-7,2 с помощью 0,5 М трис. После этого добавляли три-н-бутил-фосфат в количестве, необходимом для создания конечной концентрации в 0,3%. Суспензию перемешивали в течение 6 часов при комнатной температуре, после чего 2 М хлоридом натрия доводили проводимость раствора до величины 6,0-6,2 mS/cm, a pH до 6,8-7,0 с помощью 0,5 М трис.Glycine and lysine were added to the resulting 325 ml of supernatant to a final concentration of 100 mM and 10 mM, respectively, after which the pH was adjusted using 0.5 M Tris, bringing to 7.25 units. Then, 11% tween-80 was added to a final concentration of 1% and the pH was adjusted again, bringing it to 6.8-7.2 using 0.5 M Tris. After that, tri-n-butyl phosphate was added in an amount necessary to create a final concentration of 0.3%. The suspension was stirred for 6 hours at room temperature, after which the conductivity of the solution was adjusted with 2 M sodium chloride to 6.0-6.2 mS / cm, and the pH was 6.8-7.0 with 0.5 M Tris.

Полученный раствор наносили на колонну, содержащую ДЕАЕ-сефарозу, уравновешенную 10 мМ трис-НСl буфером с pH 7,0, содержащим 50 мМ хлорид натрия и имеющему проводимость 6,0 mS/cm. Колонну промывали стартовым буфером, а затем 10 мМ трис-НСl буфером pH 7,0, содержащим 100 мМ хлорид натрия. Проводимость буфера 11,4 mS/cm. Целевой белок элюировали 10 мМ трис-НСl буфером pH 7,0, содержащим 250 мМ хлорид натрия.The resulting solution was applied to a column containing DEAE-Sepharose, equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer with a pH of 7.0, containing 50 mM sodium chloride and having a conductivity of 6.0 mS / cm. The column was washed with start buffer and then with 10 mM Tris-Hcl buffer pH 7.0 containing 100 mM sodium chloride. The conductivity of the buffer is 11.4 mS / cm. The target protein was eluted with 10 mM Tris-Hcl pH 7.0 buffer containing 250 mM sodium chloride.

100 мл раствора, содержащего целевой белок, пропускали через колонну, заполненную Zn-хелатирующей сефарозой и уравновешенной 10 мМ трис-НСl буфером pH 7,5, содержащим 150 мМ хлорид натрия. Регенерацию колонны проводили 50 мМ натрий ацетатным буфером pH 4,0, содержащим 0,5 М хлорид натрия.100 ml of the solution containing the target protein was passed through a column filled with Zn-chelating Sepharose and equilibrated with 10 mM Tris-Hcl pH 7.5 buffer containing 150 mM sodium chloride. The column was regenerated with 50 mM sodium acetate buffer, pH 4.0, containing 0.5 M sodium chloride.

Удельная активность Cl-эстеразного ингибитора в конечном препарате (концентрате) составляла 7,6 ед/мг белка, содержание лизина - не менее 10 мМ, глицина - не менее 100 мМ. Для оценки активности Cl-эстеразного ингибитора использовали тест Berichrom Cl-INH фирмы Dade-Behring Diagnostics, Germany.The specific activity of the Cl-esterase inhibitor in the final preparation (concentrate) was 7.6 u / mg protein, the lysine content was not less than 10 mM, glycine not less than 100 mM. To assess the activity of the Cl-esterase inhibitor, the Berichrom Cl-INH test from Dade-Behring Diagnostics, Germany was used.

Выход целевого продукта составил 37%. Полученный продукт был апирогенным, не проявлял токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывал аллергических реакций при внутрикожном или внутривенном введении.The yield of the target product was 37%. The resulting product was pyrogen-free, did not show toxicity in experiments on laboratory animals (rats, rabbits), did not cause allergic reactions with intradermal or intravenous administration.

Другим аспектом заявленного изобретения является фармацевтический продукт для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях, содержащий концентрат Cl-эстеразного ингибитора, лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ, полученный способом, приведенным выше.Another aspect of the claimed invention is a pharmaceutical product for use in medicine, veterinary medicine and / or for research purposes, containing a concentrate of Cl-esterase inhibitor, lysine in a final concentration of not less than 10 mm and glycine in a final concentration of not less than 100 mm, obtained by the method, given above.

Продукт может быть представлен в виде раствора, лиофилизированного порошка (для чего указанный выше концентрат переносят во флаконы и сушат при замораживании под вакуумом), также он может дополнительно содержать традиционные фармацевтические наполнители, носители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального (например, внутривенного - струйно или инфузией, внутримышечного, внутрисуставного, коронарного, подкожного, внутрикожного, интраорбитального и/или интракраниального) введения. Перечисленные вспомогательные вещества смешивают с сухим концентратом или добавляют в раствор согласно общепринятым методам в соответствии с требованиями, предъявляемыми в технологии готовых лекарственных форм (см., например, “Технологию лекарств” И.С.Ажгихина или “Технологию лекарственных форм” под ред. Т.С.Кондратьевой).The product can be presented in the form of a solution, lyophilized powder (for which the above concentrate is transferred into vials and dried by freezing in vacuo), it can also contain traditional pharmaceutical excipients, carriers, solvents and / or excipients suitable for parenteral administration (for example, intravenous - by jet or infusion, intramuscular, intraarticular, coronary, subcutaneous, intradermal, intraorbital and / or intracranial) administration. The listed excipients are mixed with a dry concentrate or added to the solution according to generally accepted methods in accordance with the requirements for the technology of finished dosage forms (see, for example, “Technology of medicines” by I. S. Azhgikhin or “Technology of dosage forms” under the editorship of T .S. Kondratieva).

Наполнителями являются, например, сахара (в частности, глюкоза, лактоза), белки, например альбумин, необязательно антиоксиданты, традиционные для инъекционных фармацевтических композиций. В случае необходимости продукт может содержать неорганические и/или органические соли и/или их сочетания для поддержания рН в диапазоне 7,2-7,4. Растворителями могут служить дистиллированная апирогенная стерильная вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, раствор 1,3-бутандиола, гликозаминогликанов, декстрозы, также раствор может содержать в случае необходимости белки сыворотки крови - альбумины и/или церуллоплазмин (последние также могут быть наполнителями в лиофилизированном готовом продукте).Excipients are, for example, sugars (in particular glucose, lactose), proteins, for example albumin, optionally antioxidants, traditional for injectable pharmaceutical compositions. If necessary, the product may contain inorganic and / or organic salts and / or combinations thereof to maintain a pH in the range of 7.2-7.4. The solvents can be distilled pyrogen-free sterile water, physiological saline, buffered saline, a solution of 1,3-butanediol, glycosaminoglycans, dextrose, and the solution can also contain, if necessary, serum proteins - albumin and / or cerulloplasmin (the latter can also be excipients in lyophilized finished product).

Также можно лиофилизировать готовый раствор, содержащий концентрат Cl-эстеразного ингибитора, глицин и лизин, и любое из перечисленных вспомогательных веществ или их сочетания.You can also lyophilize a ready-made solution containing a concentrate of Cl-esterase inhibitor, glycine and lysine, and any of the listed auxiliary substances or their combinations.

В случае необходимости концентрат, содержащий Сl-эстеразный ингибитор, лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ, можно растворять перед введением в плазме крови, в сыворотке крови больного, или смешивать с растворами и/или фракциями белка (белков).If necessary, a concentrate containing a Cl-esterase inhibitor, lysine in a final concentration of not less than 10 mM and glycine in a final concentration of not less than 100 mM, can be dissolved before administration in the patient's plasma, blood serum, or mixed with solutions and / or fractions protein (s).

Продукт также может быть выполнен в виде разовой лекарственной формы, например, в виде флаконов или ампул с раствором или с лиофилизированным концентратом, содержащим Сl-эстеразный ингибитор, лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ, глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ и, необязательно вспомогательные вещества или их сочетания, при этом активность Cl-эстеразного ингибитора в каждой разовой дозе составляет 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200 или 500 ед; продукт дополнительно может иметь соответствующую упаковку и необязательно инструкцию по применению.The product can also be made in the form of a single dosage form, for example, in the form of vials or ampoules with a solution or with a lyophilized concentrate containing a Cl-esterase inhibitor, lysine in a final concentration of not less than 10 mM, glycine in a final concentration of not less than 100 mM and, optional excipients or combinations thereof, wherein the activity of the Cl esterase inhibitor in each single dose is 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, or 500 units; the product may additionally have appropriate packaging and optionally instructions for use.

Предложенный согласно изобретению продукт можно использовать в более широких областях по сравнению с известными ранее: лечение септического шока, в том числе в рефракторной фазе при неэффективности стандартной противошоковой терапии, лечение и профилактика синдрома полиорганной недостаточности, профилактика и лечение острого респираторного дистресс-синдрома, адъювантная терапия при атеросклеротическом поражении сосудов любой локализации, лечение и профилактика системных ревматологических заболеваний, протекающих с активацией комплемента (системная красная волчанка, системная склеродермия, дерматомиозит, ревматоидный артрит и т.д.).The product proposed according to the invention can be used in wider areas than previously known: treatment of septic shock, including in the refractory phase with the ineffectiveness of standard antishock therapy, treatment and prevention of multiple organ failure syndrome, prevention and treatment of acute respiratory distress syndrome, adjuvant therapy with atherosclerotic vascular lesions of any localization, treatment and prevention of systemic rheumatological diseases occurring with activation of mplementa (systemic lupus erythematosus, systemic scleroderma, dermatomyositis, rheumatoid arthritis, etc.).

Claims (6)

1. Способ получения концентрата C1-эстеразного ингибитора человека, характеризующийся тем, что к криосупернатанту плазмы крови человека добавляют DEAE-сефадекс А-50 из расчета 1,5 г на литр, инкубируют, фильтруют, к фильтрату при рН 5,5 добавляют QAE-сефадекс из расчета 2,5 г на 1 литр плазмы, инкубируют в течение двух часов, фильтруют, отфильтрованный осадок QAE-сефадекса подвергают последовательной ступенчатой промывке буферным раствором при рН 5,5 и 7,5, элюции при рН 7,7, диализу при рН 7,4, к диализованному раствору добавляют ПЭГ-6000 до концентрации 12%, инкубируют при температуре 5-8°С, центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют глицин до конечной концентрации 100 мМ и лизин до конечной концентрации 10 мМ при рН 7,2, вносят твин 80 до конечной концентрации 1%, корректируют рН до 6,8-7,2, затем добавляют три-н-бутил-фосфат до конечной концентрации 0,3%, полученную суспензию перемешивают, подвергают хроматографии на DEAE-сефарозе FF при рН 7,0, хроматографии на Zn-хелатирующей сефарозе FF при рН 7,5 и получают целевой продукт, с удельной активностью в конечном препарате от 7,5±0,5 ед/мг белка и более, содержащий лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ.1. A method of obtaining a concentrate of C1-esterase human inhibitor, characterized in that DEAE-Sephadex A-50 is added to the human blood plasma cryosupernatant at a rate of 1.5 g per liter, incubated, filtered, QAE- is added to the filtrate at pH 5.5 Sephadex at the rate of 2.5 g per 1 liter of plasma, incubated for two hours, filtered, the filtered precipitate of QAE-Sephadex is subjected to sequential step washing with buffer solution at pH 5.5 and 7.5, elution at pH 7.7, dialysis at pH 7.4, PEG-6000 is added to the dialyzed solution to a concentration of 12%, Inc. they are removed at a temperature of 5-8 ° C, centrifuged, glycine is added to the resulting supernatant to a final concentration of 100 mM and lysine to a final concentration of 10 mM at pH 7.2, tween 80 is added to a final concentration of 1%, the pH is adjusted to 6.8- 7.2, then tri-n-butyl phosphate is added to a final concentration of 0.3%, the resulting suspension is stirred, chromatographed on DEAE-Sepharose FF at pH 7.0, chromatographed on Zn-chelated Sepharose FF at pH 7.5 and get the target product, with a specific activity in the final preparation of 7.5 ± 0.5 units / mg protein or more, containing lysine in a final concentration of not less than 10 mM and glycine in a final concentration of not less than 100 mM. 2. Продукт, представляющий собой концентрат C1-эстеразного ингибитора, характеризующийся тем, что он получен из плазмы крови человека способом по п.1 с удельной активностью от 7,5±0,5 ед/мг белка и более и содержит лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ.2. The product, which is a concentrate of C1-esterase inhibitor, characterized in that it is obtained from human blood plasma according to claim 1 with a specific activity of 7.5 ± 0.5 u / mg protein or more and contains lysine in a final concentration not less than 10 mm and glycine in a final concentration of not less than 100 mm. 3. Продукт по п.2, который представляет собой раствор или лиофилизат.3. The product according to claim 2, which is a solution or lyophilisate. 4. Продукт по п.2, который дополнительно содержит фармацевтически приемлемые для парентерального введения наполнители, носители, растворители и/или эксципиенты.4. The product according to claim 2, which further comprises excipients, carriers, solvents and / or excipients that are pharmaceutically acceptable for parenteral administration. 5. Продукт по п.2, который предназначен для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях.5. The product according to claim 2, which is intended for use in medicine, veterinary medicine and / or for research purposes. 6. Продукт по п.2, который предназначен для лечения или предупреждения состояний, протекающих с активацией системы комплемента.6. The product according to claim 2, which is intended for the treatment or prevention of conditions occurring with activation of the complement system.

Images