RU2252254C2 - Subtilisin bacillus variant (variants), dna encoding the same, expression vector and cleaning composition - Google Patents
Subtilisin bacillus variant (variants), dna encoding the same, expression vector and cleaning composition Download PDFInfo
- Publication number
- RU2252254C2 RU2252254C2 RU2000112653/13A RU2000112653A RU2252254C2 RU 2252254 C2 RU2252254 C2 RU 2252254C2 RU 2000112653/13 A RU2000112653/13 A RU 2000112653/13A RU 2000112653 A RU2000112653 A RU 2000112653A RU 2252254 C2 RU2252254 C2 RU 2252254C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- subtilisin
- protease
- bacillus
- amino acid
- variant
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Detergent Compositions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Родственные заявкиRelated Applications
Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США №08/956323, поданной 23 октября 1998 г., заявки на патент США №08/956564, поданной 23 октября 1998 г., и заявки на патент США №08/956324, поданной 23 октября 1998 г., которые полностью включены в это описание изобретения в качестве ссылки.This application is a partial continuation of application for US patent No. 08/956323, filed October 23, 1998, application for US patent No. 08/956564, filed October 23, 1998, and patent application US No. 08/956324, filed October 23 1998, which are fully incorporated into this description by reference.
Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Сериновые протеазы входят в подгруппу карбонильных гидролаз. Они образуют класс разнообразных ферментов, обладающих различными специфичностями и биологическими функциями. Stroud R.Sci.Amer., 131:74-88. Несмотря на функциональное разнообразие, каталитический механизм сериновых протеаз присущ, по крайней мере, двум генетически различным семействам ферментов: 1) субтилизинам и 2) родственным химотрипсину человека и гомологичным бактериальным сериновым протеазам (таким как, трипсин и трипсин S.gresius). Эти два семейства сериновых протеаз обладают чрезвычайно похожими механизмами катализа. Kraut J., (1977), Annu.Rev.Biochem., 46:331-358. Кроме того, хотя первичные структуры ферментов этих двух семейств не являются родственными, их третичные структуры имеют консервативную каталитическую триаду аминокислот, состоящую из серина, гистидина и аспартата.Serine proteases are a subset of carbonyl hydrolases. They form a class of diverse enzymes with various specificities and biological functions. Stroud R. Sci. Amer., 131: 74-88. Despite the functional diversity, the catalytic mechanism of serine proteases is inherent in at least two genetically different families of enzymes: 1) subtilisins and 2) related human chymotrypsin and homologous bacterial serine proteases (such as trypsin and trypsin S.gresius). These two families of serine proteases have extremely similar catalysis mechanisms. Kraut J., (1977), Annu. Rev. Biochem., 46: 331-358. In addition, although the primary structures of the enzymes of these two families are not related, their tertiary structures have a conservative catalytic triad of amino acids consisting of serine, histidine, and aspartate.
Субтилизины являются сериновыми протеазами (примерная молекулярная масса 27500), которые в больших количествах секретируются различными видами Bacillus и другими микроорганизмами. Белковая последовательность субтилизина определена, по крайней мере, у девяти разных видов Bacillus. Markland. F.S., et al. (1983), Hoppe-Seyler’s Z.Physiol. Chem., 364:1537-1540. В научной литературе описана трехмерная кристаллографическая структура субтилизинов, выделенных из Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis и нескольких природных вариантов B.lentus. Эти исследования показывают, что, хотя у субтилизина нет генетического родства с сериновыми протеазами млекопитающих, он имеет сходную структуру активного сайта. Рентгеновские кристаллические структуры субтилизина, содержащие ковалентно связанные ингибиторы пептида (Robertus J.D., et al. (1972), Biochemistry, 11:2439-2449) или комплексы продуктов (Robertus J.D., et al. (1976), J.Biol.Chem., 251:1097-1103), также позволили получить информацию об активном сайте и предполагаемом субстратсвязывающем участке субтилизина. Помимо этого, было проведено большое количество исследований кинетических и химических модификаций субтилизина; Svendsen В. (1976), Carlsberg Res. Commun., 41:237-291; Markland F.S., там же), при этом, по крайней мере, в одной научной работе описывается превращение боковой цепи метионина в положении остатка 222 субтилизина в метионинсульфоксид под действием перекиси водорода (Stauffer D.C., et al. (1965), J.Biol.Chem., 244:5333-5338) и обширный сайтспецифический мутагенез (Wells and Estell (1988) TIBS 13:291-297).Subtilisins are serine proteases (approximate molecular weight of 27,500), which are secreted in large quantities by various species of Bacillus and other microorganisms. The subtilisin protein sequence has been determined in at least nine different species of Bacillus. Markland F.S., et al. (1983), Hoppe-Seyler’s Z.Physiol. Chem., 364: 1537-1540. The scientific literature describes the three-dimensional crystallographic structure of subtilisins isolated from Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, and several natural variants of B.lentus. These studies show that, although subtilisin does not have a genetic relationship with mammalian serine proteases, it has a similar active site structure. X-ray crystal structures of subtilisin containing covalently bound peptide inhibitors (Robertus JD, et al. (1972), Biochemistry, 11: 2439-2449) or product complexes (Robertus JD, et al. (1976), J. Biol. Chem., 251: 1097-1103), also provided information on the active site and the proposed substrate-binding site of subtilisin. In addition, a large number of studies have been conducted on the kinetic and chemical modifications of subtilisin; Svendsen B. (1976), Carlsberg Res. Commun., 41: 237-291; Markland FS, ibid.), While at least one scientific work describes the conversion of the side chain of methionine at the position of the residue 222 of subtilisin to methionine sulfoxide under the action of hydrogen peroxide (Stauffer DC, et al. (1965), J. Biol. Chem ., 244: 5333-5338) and extensive site-specific mutagenesis (Wells and Estell (1988) TIBS 13: 291-297).
Краткое изложение существа изобретенияSummary of the invention
Объектом этого изобретения является вариант протеазы с замещением аминокислоты в положениях одного или нескольких остатков, соответствующих положениям остатков, выбираемым из группы, включающей положения 62, 212, 230, 232, 252 и 257 субтилизина Bacillus amyloliquefaciens.The object of this invention is a variant of the protease with amino acid substitution at the positions of one or more residues corresponding to the positions of the residues selected from the group comprising the
Хотя может иметь место любая комбинация вышеуказанных замещений аминокислот, у предпочтительных ферментов варианта протеазы по настоящему изобретению могут быть замещены аминокислотные остатки в следующих комбинациях положений. Все указанные положения остатков соответствуют положениям субтилизина Bacillus amyloliquefaciens:Although any combination of the above amino acid substitutions may occur, the preferred enzymes of the protease variant of the present invention may be substituted with amino acid residues in the following combinations of positions. All of the indicated positions of the residues correspond to the provisions of the subtilisin of Bacillus amyloliquefaciens:
(1) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 62 и в одном или нескольких следующих положениях: 103, 104, 109, 159, 213, 232, 236, 245, 248 и 252;(1) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(2) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 212 и в одном или нескольких следующих положениях: 12, 98, 102, 103, 104, 159, 232, 236, 245, 248 и 252;(2) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(3) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 230 и в одном или нескольких следующих положениях: 68, 103, 104, 159, 232, 236 и 245;(3) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(4) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 232 и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 212, 213, 217, 230, 236, 245, 248, 252, 257, 260, 270 и 275;(4) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(5) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 232 и в одном или нескольких следующих положениях: 103, 104, 236 и 245;(5) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(6) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 232 и 103, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 212, 213, 217, 230, 236, 245, 248, 252, 257, 260, 270 и 275;(6) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(7) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 232 и 104, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 212, 213, 217, 230, 236, 245, 248, 252, 257, 260, 270 и 275;(7) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(8) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 232 и 236, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 212, 213, 217, 230, 236, 245, 248, 252, 257, 260, 270 и 275;(8) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(9) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 232 и 245, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 212, 213, 217, 230, 236, 245, 248, 252, 257, 260, 270 и 275;(9) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(10) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 232, 103, 104, 236 и 245, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 76, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 205, 209, 210, 212, 213, 217, 230, 236, 245, 248, 252, 257, 260, 270 и 275;(10) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(11) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 252 и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 210, 212, 213, 217, 232, 236, 245, 248 и 270;(11) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(12) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 252 и в одном или нескольких следующих положениях: 103, 104, 236 и 245;(12) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(13) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положениях 252 и 103, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 210, 212, 213, 217, 232, 236, 245, 248 и 270;(13) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(14) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положениях 252 и 104, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 210, 212, 213, 217, 232, 236, 245, 248 и 270;(14) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(15) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положениях 252 и 236, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 210, 212, 213, 217, 232, 236, 245, 248 и 270;(15) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(16) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положениях 252 и 245, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 210, 212, 213, 217, 232, 236, 245, 248 и 270;(16) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(17) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положениях 252, 103, 104, 236 и 245, и в одном или нескольких следующих положениях: 1, 9, 12, 61, 62, 68, 97, 98, 101, 102, 103, 104, 109, 130, 131, 159, 183, 185, 210, 212, 213, 217, 232, 236, 245, 248 и 270; и(17) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
(18) вариант протеазы с замещениями аминокислотных остатков в положении 257 и в одном или нескольких следующих положениях 68, 103, 104, 205, 209, 210, 232, 236, 245 и 275.(18) a protease variant with substitutions of amino acid residues at
Более предпочтительные варианты протеазы имеют совокупности замещений, выбираемых из группы, включающей положения остатков субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, соответствующие положениям, указанным в таблице 1.More preferred protease variants have a plurality of substitutions selected from the group consisting of the positions of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin residues corresponding to the positions indicated in Table 1.
Наиболее предпочтительные варианты протеазы имеют совокупности замещений, выбираемых из группы, включающей положения остатков субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, соответствующие положениям, указанным в таблице 2.The most preferred protease variants have a combination of substitutions selected from the group comprising the positions of the subtilisin residues of Bacillus amyloliquefaciens corresponding to the positions indicated in table 2.
Другим объектом этого изобретения являются последовательности ДНК, кодирующие такие варианты протеазы, а также экспрессирующие векторы, содержащие последовательности ДНК таких вариантов.Another object of this invention are DNA sequences encoding such protease variants, as well as expression vectors containing DNA sequences of such variants.
Еще одним объектом этого изобретения являются клетки-хозяева, трансформированные такими векторами, а также клетки-хозяева, способные экспрессировать такую ДНК для продуцирования вариантов протеазы внутриклеточно или внеклеточно.Another object of this invention are host cells transformed with such vectors, as well as host cells capable of expressing such DNA to produce intracellular or extracellular protease variants.
Данное изобретение относится далее к очищающей композиции, содержащей вариант протеазы по настоящему изобретению.The present invention further relates to a cleansing composition comprising a protease variant of the present invention.
Кроме того, это изобретение относится к корму для животных, содержащему вариант протеазы по настоящему изобретению.In addition, this invention relates to animal feed containing a variant of the protease of the present invention.
Данное изобретение относится также к композиции для обработки ткани, содержащей вариант протеазы по настоящему изобретению.The invention also relates to a composition for treating a tissue comprising a protease variant of the present invention.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На фиг.1А-В показаны последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для субтилизина Bacillus amyloliquefaciens и частичная рестрикционная карта этого гена.1A-B show the DNA sequence and amino acid sequence for subtilisin Bacillus amyloliquefaciens and a partial restriction map of this gene.
На фиг.2 показаны консервативные аминокислотные остатки субтилизинов из Bacillus amyloliquefaciens (bpn)’ и Bacillus lentus (дикого типа).Figure 2 shows the conserved amino acid residues of subtilisins from Bacillus amyloliquefaciens (bpn) ’and Bacillus lentus (wild type).
На фиг.3А и 3В показаны аминокислотные последовательности четырех субтилизинов. Верхний ряд относится к аминокислотной последовательности субтилизина из Bacillus amyloliquefaciens (который иногда определяется как субтилизин BPN’). Второй ряд относится к аминокислотной последовательности субтилизина из Bacillus subtilis. Третий ряд относится к аминокислотной последовательности субтилизина из B.licheniformis. Четвертый ряд относится к аминокислотной последовательности субтилизина из Bacillus lentus (который именуется также субтилизином 309 в РСТ WO 89/06276). Символ * означает отсутствие специфических аминокислотных остатков по сравнению с субтилизином BPN’.3A and 3B show the amino acid sequences of four subtilisins. The top row refers to the amino acid sequence of subtilisin from Bacillus amyloliquefaciens (which is sometimes defined as subtilisin BPN ’). The second row refers to the amino acid sequence of subtilisin from Bacillus subtilis. The third row relates to the amino acid sequence of subtilisin from B.licheniformis. The fourth row relates to the amino acid sequence of subtilisin from Bacillus lentus (also referred to as subtilisin 309 in PCT WO 89/06276). The symbol * means the absence of specific amino acid residues compared to subtilisin BPN ’.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Протеазы являются карбонильными гидролазами, которые обычно расщепляют пептидные связи белков или пептидов. В используемом здесь значении термин "протеаза" означает природную или рекомбинантную протеазу. К природным протеазам относятся гидролаза α-аминоацилпептида, гидролаза пептидиламинокислоты, ациламиногидролаза, сериновая карбоксипептидаза, металлокарбоксипептидаза, тиолпротеиназа, карбоксилпротеиназа и металлопротеиназа. В объем этого изобретения входят сериновые протеазы, металлопротеазы, тиолпротеазы и кислотные протеазы, а также эндо- и экзопротеазы.Proteases are carbonyl hydrolases that typically cleave peptide bonds of proteins or peptides. As used herein, the term "protease" means a natural or recombinant protease. Natural proteases include α-aminoacyl peptide hydrolase, peptidyl amino acid hydrolase, acylamino hydrolase, serine carboxypeptidase, metallocarboxypeptidase, thiolproteinase, carboxylproteinase and metalloproteinase. The scope of this invention includes serine proteases, metalloproteases, thiol proteases and acid proteases, as well as endo and exoproteases.
Настоящее изобретение относится к ферментам протеазы, которые не являются природными вариантами карбонильной гидролазы (вариантами протеазы), так как они обладают другой протеолитической активностью, устойчивостью, специфичностью к субстрату, профилем рН и/или эффективностью по сравнению с карбонильной гидролазой-предшественником, из которой получена аминокислотная последовательность этого варианта. В частности, такие варианты протеазы содержат аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе, которую получают путем замещения нескольких аминокислотных остатков протеазы-предшественника другими аминокислотами. Протеаза-предшественник может быть природной или рекомбинантной протеазой.The present invention relates to protease enzymes that are not natural variants of carbonyl hydrolase (protease variants), since they have different proteolytic activity, resistance, substrate specificity, pH profile and / or efficiency compared to the carbonyl precursor hydrolase from which it is obtained amino acid sequence of this variant. In particular, such protease variants contain a non-naturally occurring amino acid sequence that is obtained by substituting several amino acid residues of the precursor protease with other amino acids. The precursor protease may be a natural or recombinant protease.
В вариантах протеазы по настоящему изобретению могут быть замещены любые из девятнадцати природных L-аминокислот в указанных положениях аминокислотных остатков. Такие замещения могут быть произведены в субтилизине-предшественнике (прокариотический субтилизин, эукариотический субтилизин, субтилизин млекопитающих и т.д.). В этом описании изобретения разные аминокислоты обозначены общепринятыми одно- и трехбуквенными кодами. Такие коды приведены в справочнике Dale M.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Appendix B.In the protease variants of the present invention, any of nineteen naturally occurring L-amino acids at the indicated positions of amino acid residues can be substituted. Such substitutions can be made in the precursor subtilisin (prokaryotic subtilisin, eukaryotic subtilisin, mammalian subtilisin, etc.). In this description of the invention, different amino acids are indicated by conventional one- and three-letter codes. Such codes are listed in the Dale M.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Appendix B.
Варианты протеазы по этому изобретению предпочтительно получают из субтилизина Bacillus. Более предпочтительно варианты протеазы получают из субтилизина Bacillus lentus и/или субтилизина 309.The protease variants of this invention are preferably derived from Bacillus subtilisin. More preferably, protease variants are derived from Bacillus lentus subtilisin and / or 309 subtilisin.
Субтилизины являются протеазами бактерий или грибов, которые обычно расщепляют пептидные связи белков или пептидов. В используемом здесь значении термин "субтилизин" означает природный или рекомбинантный субтилизин. Известно, что разные виды микроорганизмов продуцируют и часто секретируют целый ряд природных субтилизинов. Аминокислотные последовательности этих субтилизинов не являются полностью гомологичными. Однако субтилизины, входящие в эту группу, обладают одинаковой или подобной протеолитической активностью. Этот класс сериновых протеаз имеет общую аминокислотную последовательность, определяющую каталитическую триаду, которая отличает их от класса сериновых протеаз, родственных химотрипсину. Как субтилизины, так и родственные химотрипсину сериновые протеазы имеют каталитическую триаду, состоящую из аспартата, гистидина и серина. В протеазах, родственных субтилизину, эти аминокислоты при считывании от аминоконца к карбоксильному концу расположены в следующем относительном порядке: аспартат-гистидин-серин. Однако родственные химотрипсину протеазы имеют следующий относительный порядок расположения этих аминокислот: гистидин-аспартат-серин. Таким образом, субтилизин относится к сериновой протеазе, имеющей каталитическую триаду родственных субтилизину протеаз. Примерами таких субтилизинов являются, но не ограничиваются ими, субтилизины, показанные на фиг.3. Нумерация этих аминокислот в протеазах обычно и в соответствии с целями настоящего изобретения соответствует номерам, присвоенным последовательности зрелого субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, изображенной на фиг.1.Subtilisins are proteases of bacteria or fungi that usually cleave peptide bonds of proteins or peptides. As used herein, the term "subtilisin" means natural or recombinant subtilisin. It is known that different types of microorganisms produce and often secrete a number of natural subtilisins. The amino acid sequences of these subtilisins are not completely homologous. However, the subtilisins included in this group have the same or similar proteolytic activity. This class of serine proteases has a common amino acid sequence defining a catalytic triad that distinguishes them from the class of serine proteases related to chymotrypsin. Both subtilisins and chymotrypsin-related serine proteases have a catalytic triad consisting of aspartate, histidine and serine. In proteases related to subtilisin, these amino acids, when read from the amino terminus to the carboxyl end, are located in the following relative order: aspartate-histidine-serine. However, chymotrypsin-related proteases have the following relative arrangement of these amino acids: histidine-aspartate-serine. Thus, subtilisin refers to a serine protease having a catalytic triad of subtilisin-related proteases. Examples of such subtilisins are, but are not limited to, the subtilisins shown in FIG. 3. The numbering of these amino acids in proteases is usually and in accordance with the objectives of the present invention corresponds to the numbers assigned to the sequence of mature subtilisin Bacillus amyloliquefaciens shown in figure 1.
"Рекомбинантный субтилизин" или "рекомбинантная протеаза" означают субтилизин или протеазу, в которых последовательность ДНК, кодирующая субтилизин или протеазу, модифицирована с возможностью продуцирования варианта (или мутанта) последовательности ДНК, кодирующей замещение, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот в природной аминокислотной последовательности. Приемлемые способы выполнения такой модификации, которые можно использовать в сочетании со способами, описанными в этом изобретении, включают способы, описанные в патентах США №№ RE 34606, 5204015, 5185258, 5700676, 5801038 и 5763257."Recombinant subtilisin" or "recombinant protease" means a subtilisin or protease in which the DNA sequence encoding a subtilisin or protease is modified to produce a variant (or mutant) of a DNA sequence encoding the substitution, deletion or insertion of one or more amino acids in a natural amino acid sequence . Acceptable methods of making such a modification, which can be used in combination with the methods described in this invention, include the methods described in US patent No. RE 34606, 5204015, 5185258, 5700676, 5801038 and 5763257.
"Субтилизины, не принадлежащие человеку" и кодирующие их ДНК можно получить из многих прокариотических и эукариотических микроорганизмов. Приемлемыми примерами прокариотических микроорганизмов являются грамотрицательные микроорганизмы, такие как E.coli или Pseudomonas, и грамположительные бактерии, такие как Micrococcus или Bacillus. Примерами эукариотических микроорганизмов, из которых может быть получен субтилизин и его гены, являются дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, и грибы, такие как Aspergillus sp.Non-human subtilisins and their encoding DNA can be obtained from many prokaryotic and eukaryotic microorganisms. Suitable examples of prokaryotic microorganisms are gram-negative microorganisms, such as E. coli or Pseudomonas, and gram-positive bacteria, such as Micrococcus or Bacillus. Examples of eukaryotic microorganisms from which subtilisin and its genes can be obtained are yeast, such as Saccharomyces cerevisiae, and fungi, such as Aspergillus sp.
"Вариант протеазы" имеет аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности "протеазы-предшественника". Протеазы-предшественники являются природными и рекомбинантными протеазами. Аминокислотную последовательность варианта протеазы получают из аминокислотной последовательности протеазы-предшественника путем замещения, делении или вставки одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности предшественника. Это достигается путем модификации "последовательности ДНК-предшественника", кодирующей аминокислотную последовательность протеазы-предшественника, а не манипуляцией с ферментом протеазы-предшественника per se. Приемлемые способы такой модификации последовательности ДНК-предшественника включают описанные здесь способы, а также способы, известные специалистам в этой области (см., например, европейский патент №0328299, WO 89/06279 и приведенные выше патенты и заявки на патент США).A “protease variant” has an amino acid sequence derived from the amino acid sequence of a “precursor protease”. Precursor proteases are natural and recombinant proteases. The amino acid sequence of a protease variant is obtained from the amino acid sequence of the precursor protease by substituting, dividing or inserting one or more amino acids in the amino acid sequence of the precursor. This is achieved by modifying the “precursor DNA sequence” encoding the amino acid sequence of the precursor protease, rather than manipulating the precursor protease enzyme per se. Suitable methods for such a modification of the DNA precursor sequence include the methods described herein, as well as methods known to those skilled in the art (see, for example, European Patent No. 0328299, WO 89/06279 and the above US patents and patent applications).
В этом описании изобретения идентифицированы специфические замещения аминокислот в положениях одного или нескольких остатков, соответствующих положениям остатков, выбираемым из группы, включающей положения 62, 212, 230, 232, 252 и 257 субтилизина Bacillus amyloliquefaciens.In this description of the invention, specific amino acid substitutions at the positions of one or more residues corresponding to the positions of the residues selected from the group consisting of
Предпочтительными вариантами являются варианты с комбинацией замещений в положениях остатков, соответствующих положениям субтилизина Bacillus amyloliquefaciens в таблице 1.Preferred options are those with a combination of substitutions at the positions of the residues corresponding to the positions of the subtilisin of Bacillus amyloliquefaciens in table 1.
Более предпочтительными вариантами являются варианты с комбинациями замещений в положениях остатков, соответствующих положениям субтилизина Bacillus amyloliquefaciens в таблице 2.More preferred options are those with combinations of substitutions at the positions of the residues corresponding to the positions of the subtilisin of Bacillus amyloliquefaciens in table 2.
Другими предпочтительными вариантами являются варианты с комбинациями замещений в положениях остатков, соответствующих положениям субтилизина Bacillus amyloliquefaciens в таблице 3.Other preferred options are those with combinations of substitutions at the positions of the residues corresponding to the provisions of the subtilisin of Bacillus amyloliquefaciens in table 3.
Номера положений этих аминокислот относятся к номерам, присвоенным последовательности зрелого субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, показанной на фиг.1. Однако это изобретение не ограничивается зрелой формой этого субтилизина и включает протеазы-предшественники, содержащие аминокислотные остатки в положениях, которые "эквивалентны" конкретным идентифицированным остаткам в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения протеаза-предшественник является субтилизином Bacillus lentus, и замещения произведены в положениях, эквивалентных аминокислотным остаткам в B.lentus, которые соответствуют указанным выше.The position numbers of these amino acids refer to the numbers assigned to the mature subtilisin sequence of Bacillus amyloliquefaciens shown in FIG. However, this invention is not limited to the mature form of this subtilisin and includes precursor proteases containing amino acid residues at positions that are "equivalent" to the specific identified residues in Bacillus amyloliquefaciens subtilisin. In a preferred embodiment of the present invention, the precursor protease is Bacillus lentus subtilisin, and substitutions are made at positions equivalent to the amino acid residues in B.lentus that correspond to the above.
Положение остатка (аминокислоты) протеазы-предшественника эквивалентно положению остатка субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, если он гомологичен (то есть соответствует положению в первичной или третичной структуре) или аналогичен конкретному остатку или части этого остатка в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens (то есть обладает такой же или подобной функциональной способностью соединяться, реагировать или химически взаимодействовать).The position of the precursor protease residue (amino acid) is equivalent to the position of the Bacillus amyloliquefaciens subtilisin residue if it is homologous (i.e., corresponds to the position in the primary or tertiary structure) or is similar to a specific residue or part of this residue in the Bacillus amyloliquefaciens subtilisin (i.e., has the same or similar functional ability to connect, react or chemically interact).
Для установления гомологии с первичной структурой аминокислотную последовательность протеазы-предшественника сравнивают непосредственно с первичной последовательностью субтилизина Bacillus amyloliquefaciens и, в частности, с набором остатков, которые, как известно, являются неизменяемыми в субтилизинах и определяют характер последовательности. Например, на фиг.2 показаны консервативные остатки, которые являются общими для субтилизинов Bacillus amyloliquefaciens и B.lentus. После выполнения сравнительного анализа консервативных остатков, позволяющего определить вставки и делеции, необходимые для сохранения первичной структуры (то есть во избежание удаления консервативных остатков в результате случайных делеции и инсерции), определяют остатки, эквивалентные определенным аминокислотам в первичной последовательности субтилизина Bacillus amyloliquefaciens. Сравнение консервативных остатков предпочтительно должно выявить наличие 100% таких остатков. Однако наличие более 75% или не менее 50% консервативных остатков также является достаточным для определения эквивалентных остатков. Каталитическая триада, Asp32/His64/Ser221, должна быть полностью сохранена. Siezen et al. (1991) Protein Eng. 4(7):719-737 выполнили сравнительный анализ большого количества сериновых протеаз. Siezen et al. определяют эту группу как субтилазы или субтилизинподобные сериновые протеазы.To establish homology with the primary structure, the amino acid sequence of the precursor protease is compared directly with the primary sequence of the subtilisin of Bacillus amyloliquefaciens and, in particular, with a set of residues that are known to be unchanged in subtilisins and determine the nature of the sequence. For example, FIG. 2 shows conserved residues that are common to the subtilisins Bacillus amyloliquefaciens and B.lentus. After performing a comparative analysis of the conserved residues, which allows to determine the insertions and deletions necessary to preserve the primary structure (that is, to avoid the removal of conservative residues as a result of random deletions and insertions), residues equivalent to certain amino acids in the primary sequence of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin are determined. A comparison of conserved residues should preferably reveal the presence of 100% of such residues. However, the presence of more than 75% or at least 50% of the conserved residues is also sufficient to determine equivalent residues. The catalytic triad, Asp32 / His64 / Ser221, must be fully maintained. Siezen et al. (1991) Protein Eng. 4 (7): 719-737 performed a comparative analysis of a large number of serine proteases. Siezen et al. define this group as subtilases or subtilisin-like serine proteases.
Например, на фиг.3 показан сравнительный анализ аминокислотных последовательностей субтилизина из Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) и Bacillus lentus, целью которого является выявление максимальной гомологии между этими аминокислотными последовательностями. Сравнение этих последовательностей показывает, что в каждой последовательности имеется несколько консервативных остатков. Эти консервативные остатки (для BPN' и B.lentus) представлены на фиг.2.For example, FIG. 3 shows a comparative analysis of the amino acid sequences of subtilisin from Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) and Bacillus lentus, the purpose of which is to identify the maximum homology between these amino acid sequences. A comparison of these sequences shows that in each sequence there are several conserved residues. These conserved residues (for BPN 'and B.lentus) are presented in figure 2.
Таким образом, эти консервативные остатки можно использовать для определения соответствующих эквивалентных аминокислотных остатков субтилизина Bacillus amyloliquefaciens в других субтилизинах, таких как субтилизин из Bacillus lentus (публикация РСТ № WO 89/06279 от 13 июля 1989 г.), предпочтительный фермент протеазы-предшественника, или субтилизин, определяемый как РВ92 (европейский патент №0328299), который гомологичен предпочтительному субтилизину Bacillus lentus. На фиг.3А и 3В показан сравнительный анализ аминокислотных последовательностей некоторых из этих субтилизинов с последовательностью субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, позволяющий выявить максимальную гомологию консервативных остатков. Как видно, в последовательности Bacillus lentus имеется ряд делеций по сравнению с субтилизином Bacillus amyloliquefaciens. Так, например, аминокислота для Vall65 в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens эквивалентна изолейцину в других субтилизинах В.lentus и B.licheniformis.Thus, these conserved residues can be used to determine the corresponding equivalent amino acid residues of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in other subtilisins, such as subtilisin from Bacillus lentus (PCT Publication No. WO 89/06279 of July 13, 1989), the preferred precursor protease enzyme, or subtilisin, defined as PB92 (European Patent No. 0328299), which is homologous to the preferred subtilisin Bacillus lentus. On figa and 3B shows a comparative analysis of the amino acid sequences of some of these subtilisins with the subtilisin sequence of Bacillus amyloliquefaciens, which allows to identify the maximum homology of conserved residues. As can be seen, in the sequence of Bacillus lentus there are a number of deletions compared to subtilisin of Bacillus amyloliquefaciens. For example, the amino acid for Vall65 in the subtilisin of Bacillus amyloliquefaciens is equivalent to isoleucine in the other subtilisins of B.lentus and B.licheniformis.
"Эквивалентные остатки" можно также установить, определяя гомологию на уровне третичной структуры для протеазы-предшественника, третичная структура которой исследована рентгеновской кристаллографией. Эквивалентными остатками являются такие остатки, для которых атомные координаты двух или более атомов в главной цепи определенного аминокислотного остатка протеазы-предшественника и субтилизина Bacillus amyloliquefaciens (N перекрывает N, СА перекрывает СА, С перекрывает С и О перекрывает О) после упорядочения находятся в пределах 0,13 нм и предпочтительно в пределах 0,1 нм. Упорядочение первичной структуры достигается тогда, когда ориентация и расположение лучшей модели обеспечивает максимальное перекрывание атомных координат атомов белка, не являющихся водородом, у рассматриваемой протеазы и субтилизина Bacillus amyloliquefaciens. Лучшая модель является кристаллографической моделью, которая позволяет получить наименьший R-фактор для экспериментальных данных дифракции при самом высоком разрешении."Equivalent residues" can also be established by determining homology at the level of the tertiary structure for the precursor protease, the tertiary structure of which is investigated by x-ray crystallography. Equivalent residues are those residues for which the atomic coordinates of two or more atoms in the main chain of a certain amino acid residue of the precursor protease and subtilisin Bacillus amyloliquefaciens (N overlaps N, CA overlaps CA, C overlaps C and O overlaps O) after ordering are within 0 13 nm and preferably within 0.1 nm. The primary structure is ordered when the orientation and location of the best model provides maximum overlap of the atomic coordinates of non-hydrogen protein atoms in the protease and subtilisin of Bacillus amyloliquefaciens under consideration. The best model is a crystallographic model that allows you to obtain the smallest R-factor for the experimental diffraction data at the highest resolution.
Эквивалентные остатки, которые функционально аналогичны специфическому остатку Bacillus amyloliquefaciens, определяют в качестве аминокислот протеазы-предшественника, которые могут принять такую конформацию, при которой они могут изменять, модифицировать или стимулировать образование белковой структуры, связывание с субстратом или катализ аналогично определенному и свойственному специфическому остатку субтилизина Bacillus amyloliquefaciens. Кроме того, такие остатки являются остатками протеазы-предшественника (третичная структура которой установлена рентгеновской кристаллографией), занимающими аналогичное положение, при котором атомные координаты, по крайней мере, двух атомов в боковой цепи остатка находятся на расстоянии 0,13 нм от соответствующих атомов в боковой цепи субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, хотя атомы в главной цепи данного остатка могут не удовлетворять критерию эквивалентности с точки зрения гомологии положения. Координаты трехмерной структуры субтилизина Bacillus amyloliquefaciens приведены в публикации ЕРО №0251446 (соответствует патенту США №5182204, который включен в это описание изобретения в качестве ссылки), и, как указано выше, могут быть использованы для определения эквивалентных остатков на уровне третичной структуры.Equivalent residues that are functionally similar to the specific Bacillus amyloliquefaciens residue are defined as precursor amino acids that can take on such a conformation that they can alter, modify or stimulate the formation of a protein structure, binding to a substrate, or catalysis similar to a specific and inherent specific subtilisin residue Bacillus amyloliquefaciens. In addition, such residues are precursor protease residues (the tertiary structure of which is established by x-ray crystallography), occupying a similar position in which the atomic coordinates of at least two atoms in the side chain of the residue are 0.13 nm from the corresponding atoms in the side subtilisin chains of Bacillus amyloliquefaciens, although the atoms in the main chain of this residue may not satisfy the equivalence criterion in terms of position homology. The coordinates of the three-dimensional structure of the subtilisin Bacillus amyloliquefaciens are given in EPO publication No. 0251446 (corresponding to US patent No. 5182204, which is incorporated into this description by reference), and, as indicated above, can be used to determine equivalent residues at the level of the tertiary structure.
Некоторые замещаемые остатки являются консервативными остатками, в то время как другие остатки такими не являются. В случае остатков, которые не являются консервативными, замещение одной или нескольких аминокислот ограничено замещениями, позволяющими получить вариант, имеющий аминокислотную последовательность, которая не соответствует природной последовательности. В случае консервативных остатков такие замещения не должны привести к образованию природной последовательности. Варианты протеазы по настоящему изобретению включают зрелые формы вариантов протеазы, а также про- и препроформы таких вариантов протеазы. Препроформы являются предпочтительной конструкцией, так как они облегчают экспрессию, секрецию и созревание вариантов протеазы.Some substitutable residues are conserved residues, while other residues are not. In the case of residues that are not conserved, the substitution of one or more amino acids is limited to substitutions, allowing you to get a variant having an amino acid sequence that does not correspond to the natural sequence. In the case of conserved residues, such substitutions should not lead to the formation of a natural sequence. The protease variants of the present invention include mature forms of protease variants, as well as the pro- and preproforms of such protease variants. Preproforms are the preferred construct since they facilitate the expression, secretion and maturation of protease variants.
"Пропоследовательность" означает последовательность аминокислот, связанных с N-концевой частью зрелой формы протеазы, удаление которой вызывает появление "зрелой" формы протеазы. Многие протеолитические ферменты встречаются в природе в виде продуктов трансляции профермента, и при отсутствии посттрансляционного процессинга они экспрессируются в таком виде. Предпочтительной пропоследовательностью для получения вариантов протеазы является предполагаемая пропоследовательность субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, хотя можно использовать и другие пропоследовательности протеазы."Sequence" means the sequence of amino acids associated with the N-terminal portion of the mature form of the protease, the removal of which causes the appearance of a "mature" form of the protease. Many proteolytic enzymes are found in nature in the form of proenzyme translation products, and in the absence of post-translational processing, they are expressed in this form. A preferred sequence for preparing protease variants is the putative sequence of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin, although other protease sequences can be used.
"Сигнальная последовательность" или "препоследовательность" означает любую последовательность аминокислот, связанных с N-концевой частью протеазы или с N-концевой частью протеазы, которая может участвовать в секреции зрелой формы или проформы протеазы. Это определение сигнальной последовательности является функциональным и включает все аминокислотные последовательности, кодированные N-концевой частью гена протеазы, которые участвуют в секреции протеазы в естественных условиях. Такие последовательности использованы в настоящем изобретении для осуществления секреции описанных здесь вариантов протеазы. Одна приемлемая сигнальная последовательность содержит семь первых аминокислотных остатков сигнальной последовательности, выделенной из субтилизина Bacillus subtilis, слитых с остальной частью сигнальной последовательности субтилизина Bacillus lentus (ATCC 21536).“Signal sequence” or “presequence” means any amino acid sequence linked to the N-terminal portion of a protease or to the N-terminal portion of a protease that may be involved in the secretion of a mature form or pro-forma protease. This determination of the signal sequence is functional and includes all amino acid sequences encoded by the N-terminal portion of the protease gene that are involved in the secretion of the protease in vivo. Such sequences are used in the present invention to secrete the protease variants described herein. One acceptable signal sequence contains the first seven amino acid residues of the signal sequence isolated from Bacillus subtilis subtilisin fused to the rest of the Bacillus lentus subtilisin signal sequence (ATCC 21536).
"Препро" форма варианта протеазы содержит зрелую форму протеазы, имеющей пропоследовательность, операбельно связанную с аминоконцом протеазы, и "пре" или "сигнальную" последовательность, операбельно связанную с аминоконцом пропоследовательности.A "prepro" form of a protease variant contains a mature form of a protease having a pro-sequence operably linked to the amino terminus of the protease, and a "pre" or "signal" sequence operably linked to the amino-terminus of the pro-sequence.
"Экспрессирующий вектор" означает конструкцию на основе ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая операбельно связана с приемлемой регуляторной последовательностью, способной экспрессировать указанную ДНК в приемлемом хозяине. Такие регуляторные последовательности включают промотор для осуществления транскрипции, необязательную операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую сайты связывания рибосомы с приемлемой мРНК, и последовательности, контролирующие окончание транскрипции и трансляции. Вектор может быть плазмидой, фаговой частицей или просто потенциальной геномной вставкой. После введения приемлемому хозяину вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина, и в некоторых случаях он может интегрироваться в сам геном. В этом описании изобретения термины "плазмида" и "вектор" иногда использованы во взаимозаменяемом значении, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора в настоящее время. Однако в объем этого изобретения входят и другие формы экспрессирующих векторов, которые выполняют эквивалентные функции и известны в этой области.“Expression vector” means a DNA-based construct containing a DNA sequence that is operably linked to an acceptable regulatory sequence capable of expressing said DNA in an acceptable host. Such regulatory sequences include a transcriptional promoter, an optional transcriptional control operator sequence, a sequence encoding the ribosome binding sites of acceptable mRNA, and transcriptional and translational termination control sequences. The vector may be a plasmid, phage particle, or simply a potential genomic insertion. After administration to an acceptable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, and in some cases, it can integrate into the genome itself. In this specification, the terms “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably as the plasmid is the most commonly used form of the vector at present. However, other forms of expression vectors that perform equivalent functions and are known in the art are also within the scope of this invention.
"Клетки-хозяева", используемые в настоящем изобретении, обычно являются прокариотическими или эукариотическими хозяевами, которые предпочтительно подвергают обработке в соответствии со способами, описанными в патенте США № RE 34606, в результате чего они утрачивают способность секретировать ферментативно активную эндопротеазу. Предпочтительной клеткой-хозяином для экспрессии протеазы является штамм BG2036 Bacillus, который не имеет ферментативно активной нейтральной протеазы и щелочной протеазы (субтилизина). Конструирование штамма BG2036 подробно описано в патенте США №5264366. Другими клетками-хозяевами для экспрессии протеазы являются Bacillus subtilis I168 (которые описаны также в патентах США №№34606 и 5264366, включенных в это описание изобретения в качестве ссылки), а также любой приемлемый штамм Bacillus, такой как B.licheniformis, B.lentus и т.д.The "host cells" used in the present invention are typically prokaryotic or eukaryotic hosts, which are preferably treated in accordance with the methods described in US Pat. No. 3,4606, whereby they lose the ability to secrete an enzymatically active endoprotease. A preferred host cell for protease expression is Bacillus strain BG2036, which lacks an enzymatically active neutral protease and alkaline protease (subtilisin). The construction of strain BG2036 is described in detail in US patent No. 5264366. Other host cells for protease expression are Bacillus subtilis I168 (which are also described in US Pat. Nos. 3,4606 and 5,264,366, incorporated herein by reference), as well as any suitable Bacillus strain, such as B.licheniformis, B.lentus etc.
Клетки-хозяева трансформируют или трансфецируют векторами, сконструированными методами рекомбинантных ДНК. Такие трансформированные клетки-хозяева способны реплицировать векторы, кодирующие варианты протеазы, или экспрессировать требуемый вариант протеазы. В случае векторов, кодирующих пре- или препроформу варианта протеазы, такие варианты, будучи экспрессированными, обычно секретируются из клетки-хозяина в среду, содержащую клетки-хозяева.Host cells are transformed or transfected with vectors constructed by recombinant DNA methods. Such transformed host cells are capable of replicating vectors encoding protease variants or expressing the desired protease variant. In the case of vectors encoding the pre- or preproform of a protease variant, such variants, when expressed, are usually secreted from the host cell into the medium containing the host cells.
Термин "операбельно связанный", используемый для описания взаимосвязи между двумя областями ДНК, означает, что они функционально связаны друг с другом. Например, препоследовательность операбельно связана с пептидом, если она действует в качестве сигнальной последовательности, участвующей в секреции зрелой формы белка, вызывая расщепление указанной сигнальной последовательности. Промотор операбельно связан с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы операбельно связан с кодирующей последовательностью, если его положение делает возможной трансляцию.The term “operably linked”, used to describe the relationship between two regions of DNA, means that they are functionally related to each other. For example, a presequence is operably linked to a peptide if it acts as a signal sequence involved in the secretion of the mature form of the protein, causing cleavage of the specified signal sequence. A promoter is operably linked to a coding sequence if it controls sequence transcription; the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence, if its position makes translation possible.
Гены, кодирующие природную протеазу-предшественника, можно получить обычными методами, известными в этой области. Эти методы обычно включают синтез меченых зондов, имеющих мнимые последовательности, кодирующие области представляющей интерес протеазы, создание геномных библиотек из микроорганизмов, экспрессирующих протеазу, и скрининг этих библиотек в отношении требуемого гена путем гибридизации с зондами. Затем положительно гибридизирующие клоны картируют и секвенируют.Genes encoding a natural precursor protease can be obtained by conventional methods known in the art. These methods typically include the synthesis of labeled probes having imaginary sequences encoding regions of the protease of interest, creating genomic libraries of microorganisms expressing the protease, and screening these libraries for the desired gene by hybridization with the probes. Then, positively hybridizing clones are mapped and sequenced.
Клонированную протеазу используют для трансформации клетки-хозяина с целью экспрессии протеазы. Ген протеазы затем лигируют в плазмиду с большим количеством копий. Эта плазмида реплицируется в хозяевах, так как она содержит хорошо известные элементы, необходимые для репликации плазмиды: промотор, оперативно связанный с рассматриваемым геном (который может быть введен в виде гомологического промотора гена, если его распознает, то есть транскрибирует, хозяин), область терминации транскрипции и область полиаденилирования (которая необходима для обеспечения устойчивости мРНК, транскрибируемой хозяином из гена протеазы в определенных эукариотических клетках-хозяевах), которая является экзогенной или поддерживается эндогенной областью терминатора гена протеазы, и желательно селектируемый ген, в частности, ген устойчивости к антибиотикам, что делает возможным постоянное культивирование инфицированных плазмидой клеток-хозяев путем выращивания в средах, содержащих антибиотики. Плазмиды с большим количеством копий имеют также источник репликации для хозяина, что позволяет получать большие количества плазмид в цитоплазме без хромосомных ограничений. Однако настоящее изобретение относится также к интеграции нескольких копий гена протеазы в геном хозяина. Это облегчается прокариотическими и эукариотическими микроорганизмами, которые особенно подвержены гомологичной рекомбинации.The cloned protease is used to transform the host cell to express the protease. The protease gene is then ligated into a large copy number plasmid. This plasmid is replicated in the hosts, since it contains well-known elements necessary for the replication of the plasmid: a promoter operably linked to the gene in question (which can be introduced as a homologous promoter of a gene, if it is recognized, that is, transcribed, by the host), the termination region transcription and the polyadenylation region (which is necessary to ensure the stability of the mRNA transcribed by the host from the protease gene in certain eukaryotic host cells), which is exogenous sludge supported by the endogenous terminator region of the protease gene and the selectable gene is desired, in particular antibiotic resistance gene that enables continuous cultivation of plasmid-infected host cells by growth in media containing antibiotics. Plasmids with a large number of copies also have a source of replication for the host, which allows to obtain large quantities of plasmids in the cytoplasm without chromosomal restrictions. However, the present invention also relates to the integration of several copies of the protease gene into the host genome. This is facilitated by prokaryotic and eukaryotic microorganisms, which are particularly susceptible to homologous recombination.
Ген может быть природным геном B.lentus. Альтернативно можно получить синтетический ген, кодирующий природную или мутантную протеазу-предшественника. В этом случае определяют последовательность ДНК и/или аминокислотную последовательность протеазы-предшественника. Затем синтезируют несколько перекрывающихся фрагментов синтетической одноцепочечной ДНК, которые после гибридизации и лигирования образуют синтетическую ДНК, кодирующую протеазу-предшественника. Пример конструирования синтетического гена приведен в примере 3 патента США №5204015, который включен в это описание изобретения в качестве ссылки.The gene may be a natural B.lentus gene. Alternatively, a synthetic gene encoding a natural or mutant precursor protease can be obtained. In this case, the DNA sequence and / or amino acid sequence of the precursor protease is determined. Then several overlapping fragments of synthetic single-stranded DNA are synthesized, which, after hybridization and ligation, form synthetic DNA encoding a precursor protease. An example of constructing a synthetic gene is given in Example 3 of US Pat. No. 5,204,015, which is incorporated herein by reference.
После клонирования природного или синтетического гена протеазы-предшественника выполняют ряд модификаций, направленных на усиление синтеза гена по сравнению с природной протеазой-предшественником. Такие модификации включают продуцирование рекомбинантных протеаз, как это описано в патенте США № RE 34606 и в публикации ЕРО №0251446, а также продуцирование описанных здесь вариантов протеазы.After cloning a natural or synthetic precursor protease gene, a number of modifications are performed to enhance gene synthesis compared to a natural precursor protease. Such modifications include the production of recombinant proteases, as described in US patent No. RE 34606 and in publication EPO No. 0251446, as well as the production of protease variants described here.
Можно использовать нижеследующий способ кассетного мутагенеза, который облегчает конструирование вариантов протеазы по настоящему изобретению, хотя возможно применение и других способов. Сначала получают природный ген, кодирующий протеазу, который секвенируют полностью или частично. Затем последовательность сканируют для нахождения точки, в которой желательно произвести мутацию (делецию, вставку или замещение) одной или нескольких аминокислот в кодированном ферменте. Последовательности, фланкирующие эту точку, исследуют на наличие сайтов рестрикции для замены короткого сегмента гена пулом олигонуклеотидов, которые в экспрессированном состоянии должны кодировать разные мутанты. Такие сайты рестрикции предпочтительно являются уникальными сайтами в гене протеазы, облегчающими замену сегмента гена. Однако можно использовать любой удобный сайт рестрикции, который не является избыточным в гене протеазы, при условии, что фрагменты гена, полученные в результате рестриктирования, можно вновь собрать в требуемую последовательность. Если сайты рестрикции отсутствуют в местах, расположенных на удобном расстоянии от выбранной точки (от 10 до 15 нуклеотидов), такие сайты можно создать, замещая нуклеотиды в гене так, чтобы в конечной конструкции не были изменены ни рамка считывания, ни кодированные аминокислоты. Мутацию гена с целью изменения его последовательности так, чтобы она соответствовала требуемой последовательности, осуществляют при помощи праймера М13 в соответствии с известными методами. Задача локализации приемлемых фланкирующих областей и определения необходимых изменений для получения двух удобных последовательностей в сайте рестрикции значительно облегчается благодаря наличию избыточного генетического кода, рестрикционной карты фермента гена и большого количества разных рестрикционных ферментов. Следует отметить, что при наличии удобного фланкирующего сайта рестрикции рассмотренный выше метод необходимо использовать только в случае фланкирующей области, не имеющей нужного сайта.You can use the following method of cassette mutagenesis, which facilitates the construction of variants of the protease of the present invention, although it is possible to use other methods. First, a natural gene encoding a protease is obtained, which is sequenced in whole or in part. The sequence is then scanned to find the point at which it is desirable to mutate (deletion, insertion or substitution) of one or more amino acids in the encoded enzyme. The sequences flanking this point are examined for the presence of restriction sites to replace a short gene segment with a pool of oligonucleotides, which in the expressed state must encode different mutants. Such restriction sites are preferably unique sites in the protease gene that facilitate replacement of a gene segment. However, any convenient restriction site that is not redundant in the protease gene can be used, provided that the fragments of the gene resulting from the restriction can be reassembled into the desired sequence. If restriction sites are absent in places located at a convenient distance from the selected point (from 10 to 15 nucleotides), such sites can be created by replacing nucleotides in the gene so that neither the reading frame nor the encoded amino acids are changed in the final construct. Mutation of a gene in order to change its sequence so that it matches the desired sequence is carried out using primer M13 in accordance with known methods. The task of localizing acceptable flanking regions and determining the necessary changes to obtain two convenient sequences at the restriction site is greatly facilitated by the presence of an excessive genetic code, a restriction map of the gene enzyme and a large number of different restriction enzymes. It should be noted that in the presence of a convenient flanking restriction site, the above method should be used only in the case of a flanking region that does not have the desired site.
После клонирования природной или синтетической ДНК сайты рестрикции, фланкирующие предназначенные для мутации положения, расщепляют родственными рестрикционными ферментами и лигируют в ген несколько кассет олигонуклеотидов, комплементарных концевым областям. Этот метод позволяет упростить мутагенез, так как все олигонуклеотиды можно синтезировать так, чтобы они имели одинаковые сайты рестрикции, причем для создания сайтов рестрикции не требуются синтетические линкеры.After cloning of natural or synthetic DNA, the restriction sites flanking the positions intended for mutation are cleaved by related restriction enzymes and several oligonucleotide cassettes complementary to the terminal regions are ligated into the gene. This method allows to simplify mutagenesis, since all oligonucleotides can be synthesized so that they have the same restriction sites, and synthetic linkers are not required to create restriction sites.
В используемом здесь значении термин "протеолитическая активность" означает скорость гидролиза пептидных связей на миллиграмм активного фермента. Известно много методов измерения протеолитической активности (K.M.Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A.Fiechter ed., 1988). Помимо или в качестве альтернативы модифицированной протеолитической активности у вариантов ферментов по настоящему изобретению могут быть изменены другие свойства, такие как Кm, kcat, отношение kcat/Km, специфичность к субстрату и/или профиль активности в зависимости от рН. Эти ферменты могут быть предназначены для определенного субстрата, который, как предполагается, будет иметь место, например, при получении пептидов или в гидролитических процессах, применяемых при стирке.As used herein, the term "proteolytic activity" means the rate of hydrolysis of peptide bonds per milligram of active enzyme. Many methods for measuring proteolytic activity are known (KMKalisz, "Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, A.Fiechter ed., 1988). In addition to or as an alternative to the modified proteolytic activity, other properties such as K m , k cat , k cat / K m ratio, substrate specificity and / or activity profile depending on pH can be changed in the enzyme variants of the present invention. These enzymes can be designed for a specific substrate, which is expected to take place, for example, in the preparation of peptides or in hydrolytic processes used in washing.
В одном из аспектов этого изобретения целью является получение варианта протеазы с измененными, предпочтительно улучшенными, моющими характеристиками по сравнению с протеазой-предшественником, по крайней мере, в одном моющем составе и/или, по крайней мере, в одном режиме стирки.In one aspect of this invention, the aim is to provide a protease variant with altered, preferably improved, detergent characteristics compared to the precursor protease in at least one detergent composition and / or in at least one washing mode.
Условия стирки, воздействию которых может подвергаться вариант протеазы, являются весьма разнообразными, включая разные моющие средства, разный объем моечной воды, разную температуру моечной воды и продолжительность стирки. Например, моющие составы, используемые в разных регионах, характеризуются разными концентрациями моющих компонентов в моечной воде. Например, детергенты, применяемые в Европе, обычно содержат около 4500-5000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде, в то время как детергенты, применяемые в Японии, обычно содержат примерно 667 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. В Северной Америке, в частности в США, детергенты обычно содержат около 975 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.The washing conditions to which the protease variant may be exposed are very diverse, including different detergents, different volumes of washing water, different temperatures of washing water and duration of washing. For example, detergent compositions used in different regions are characterized by different concentrations of detergent components in the washing water. For example, detergents used in Europe usually contain about 4,500-5,000 parts per million detergent components in washing water, while detergents used in Japan usually contain about 667 parts per million detergent components in washing water. In North America, in particular in the USA, detergents usually contain about 975 parts per million detergent components in washing water.
Система с низкой концентрацией детергента включает детергенты, характеризующиеся наличием менее 800 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. Японские детергенты обычно считаются системами с низкой концентрацией детергента, так как они содержат примерно 667 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.A low detergent concentration system includes detergents characterized by less than 800 parts per million detergent components in the washing water. Japanese detergents are generally considered low detergent systems because they contain approximately 667 parts per million detergent components in washing water.
Система со средней концентрацией детергента включает детергенты, характеризующиеся наличием от около 800 до около 2000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. Детергенты, используемые в Северной Америке, обычно считаются системами со средней концентрацией детергента, так как они содержат примерно 975 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. В Бразилии обычно используются детергенты, содержащие примерно 1500 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.A system with an average concentration of detergent includes detergents characterized by the presence of from about 800 to about 2000 parts per million detergent components in the washing water. Detergents used in North America are generally considered systems with an average concentration of detergent, as they contain approximately 975 parts per million detergent components in the washing water. In Brazil, detergents containing approximately 1,500 parts per million detergent components in washing water are commonly used.
Система с высокой концентрацией детергента включает детергенты, характеризующиеся наличием более 2000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. Европейские детергенты обычно считаются системами с высокой концентрацией детергента, так как они содержат примерно 4500-5000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.A system with a high concentration of detergent includes detergents characterized by the presence of more than 2000 parts per million detergent components in the washing water. European detergents are usually considered systems with a high concentration of detergent, as they contain approximately 4,500-5,000 parts per million detergent components in the washing water.
Детергенты, используемые в Латинской Америке, обычно являются высокопенными, модифицированными фосфатом детергентами, поэтому их можно классифицировать как системы со средней и высокой концентрацией детергента, так как они характеризуются наличием от 1500 до 6000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. Как указывалось выше, бразильские детергенты обычно содержат примерно 1500 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. Однако в других регионах, для которых характерно применение высокопенных, модифицированных фосфатом детергентов и которые не ограничиваются странами Латинской Америки, могут использоваться системы с высокой концентрацией детергента, содержащие до 6000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.The detergents used in Latin America are usually high-foam phosphate-modified detergents, so they can be classified as systems with medium and high concentrations of detergent, as they are characterized by the presence of 1,500 to 6,000 parts per million detergent components in washing water. As indicated above, Brazilian detergents typically contain approximately 1,500 parts per million detergent components in the wash water. However, in other regions that are characterized by the use of high-foam phosphate-modified detergents and which are not limited to Latin America, systems with a high concentration of detergent containing up to 6,000 parts per million detergent components in washing water can be used.
В свете вышеизложенного становится очевидным тот факт, что концентрации детергентов в типичных моечных растворах, используемых в различных регионах мира, изменяются от менее 800 частей на миллион ("регионы применения систем с низкой концентрацией детергента"), например около 667 частей на миллион в Японии, до около 800-2000 частей на миллион ("регионы применения систем со средней концентрацией детергента"), например около 975 частей на миллион в США и около 1500 частей на миллион в Бразилии, и более 2000 частей на миллион ("регионы применения систем с высокой концентрацией детергента"), например около 4500-5000 частей на миллион в Европе и около 6000 частей на миллион в регионах применения высокопенных, модифицированных фосфатом детергентов.In light of the foregoing, it becomes apparent that the concentrations of detergents in typical washing solutions used in different regions of the world vary from less than 800 parts per million (“regions of application of systems with low concentration of detergent”), for example, about 667 parts per million in Japan, up to about 800-2000 parts per million ("regions of application of systems with an average concentration of detergent"), for example, about 975 parts per million in the USA and about 1,500 parts per million in Brazil, and more than 2,000 parts per million ("regions of application of systems with high “detergent concentration”), for example, about 4,500-5,000 ppm in Europe and about 6,000 ppm in the regions where high-foam phosphate-modified detergents are used.
Концентрации обычных моечных растворов определяются эмпирически. Например, в США обычная стиральная машина вмещает примерно 64,4 л моечного раствора. Таким образом, чтобы получить в моечном растворе концентрацию, равную примерно 975 частям на миллион детергента, в 64,4 л моечного раствора нужно добавить примерно 62,79 г моющей композиции. Именно это количество отмеривает потребитель при помощи мерного стаканчика, прилагаемого к детергенту.Concentrations of conventional washing solutions are determined empirically. For example, in the United States, a conventional washing machine holds approximately 64.4 liters of washing solution. Thus, in order to obtain a concentration of approximately 975 parts per million detergent in the washing solution, approximately 62.79 g of the washing composition must be added to 64.4 L of the washing solution. It is this quantity that the consumer measures with the help of a measuring cup attached to the detergent.
В качестве еще одного примера можно привести использование в разных регионах разной температуры стирки. Температура моечной воды в Японии обычно ниже, чем в Европе.Another example is the use of different washing temperatures in different regions. The temperature of washing water in Japan is usually lower than in Europe.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение включает вариант протеазы, который обладает более высоким моющим действием, по крайней мере, в одном режиме стирки.In one aspect, the present invention includes a protease variant that has a higher detergent effect in at least one washing course.
Другой целью этого изобретения является замещение аминокислоты в положениях одного или нескольких остатков, соответствующих положениям остатков, выбираемым из группы, включающей положения 62, 212, 230, 232, 252 и 257 субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, что имеет важное значение для улучшения моющего действия данного фермента.Another objective of this invention is the substitution of amino acids at the positions of one or more residues corresponding to the positions of the residues selected from the group consisting of
Эти замещения предпочтительно производят в субтилизине Bacillus lentus (рекомбинантного или нативного типа), хотя подобные замещения могут быть выполнены в любой протеазе Bacillus.These substitutions are preferably made in the subtilisin of Bacillus lentus (recombinant or native type), although similar substitutions can be made in any Bacillus protease.
На основании результатов, полученных при исследовании вариантов протеаз, можно отметить, что указанные мутации в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens имеют важное значение для протеолитической активности, эффективности и/или устойчивости этих ферментов, а также для очищающего или моющего действия таких вариантов ферментов.Based on the results obtained in the study of protease variants, it can be noted that these mutations in the subtilisin of Bacillus amyloliquefaciens are important for the proteolytic activity, effectiveness and / or stability of these enzymes, as well as for the cleansing or washing action of such enzyme variants.
Многие варианты протеазы по этому изобретению полезны для получения разных моющих композиций или средств личной гигиены, таких как шампуни или лосьоны. В композициях, содержащих мутанты протеазы по этому изобретению, можно использовать целый ряд известных соединений, являющихся приемлемыми поверхностно-активными веществами. Эти вещества являются неионогенными, анионными, катионными или цвиттерионными детергентами, описанными в патенте США №4404128, выданном Barry J.Anderson, и в патенте США №4261868, выданном Jiri Flora et al. Приемлемый моющий состав описан в примере 7 патента США №5204015 (ранее включенного в это описание изобретения в качестве ссылки). В этой области известны разные составы, которые можно использовать в качестве очищающих композиций. Понятно, что помимо обычных очищающих композиций варианты протеазы по этому изобретению могут быть использованы в любой области, где применяются нативные протеазы или протеазы дикого типа. Так, эти варианты можно использовать, например, при применениях твердого или жидкого мыла, составов для мытья посуды, растворов или продуктов для очистки контактных линз, составов для гидролиза пептидов, утилизации отходов, обработки тканей, а также в качестве расщепляющих ферментов при получении белков и т.д. Варианты по настоящему изобретению могут сообщать моющему составу более высокую эффективность (по сравнению с предшественником). Более высокая эффективность детергента определяется как лучшее выведение пятен, восприимчивых к конкретному ферменту, таких как пятна растительного происхождения или пятна крови, по методу обычной оценки после стандартного цикла стирки.Many protease variants of this invention are useful for preparing various detergent compositions or personal care products, such as shampoos or lotions. In compositions containing the protease mutants of this invention, a number of known compounds that are acceptable surfactants can be used. These substances are nonionic, anionic, cationic or zwitterionic detergents described in US Pat. No. 4,404,128 to Barry J. Anderson and US Pat. No. 4,262,868 to Jiri Flora et al. A suitable detergent composition is described in Example 7 of US Pat. No. 5,204,015 (previously incorporated herein by reference). Various formulations are known in the art that can be used as cleansing compositions. It is understood that, in addition to conventional cleansing compositions, the protease variants of this invention can be used in any field where native proteases or wild-type proteases are used. So, these options can be used, for example, in applications of solid or liquid soap, dishwashing preparations, solutions or products for cleaning contact lenses, compositions for hydrolysis of peptides, waste disposal, tissue processing, as well as cleaving enzymes for the production of proteins and etc. Variants of the present invention may impart higher efficacy to the detergent composition (compared to the precursor). Higher detergent efficacy is defined as better removal of stains susceptible to a particular enzyme, such as plant stains or blood stains, according to a routine assessment after a standard wash cycle.
Протеазы по этому изобретению могут входить в состав известных порошкообразных и жидких детергентов с рН от 6,5 до 12,0 и концентрацией от около 0,01 вес.% до около 5 вес.% (предпочтительно от 0,1% до 0,5%). Эти очищающие композиции с детергентами могут содержать другие ферменты, в частности известные протеазы, амилазы, целлюлазы, липазы или эндогликозидазы, а также добавки и стабилизаторы.The proteases of this invention may be included in known powder and liquid detergents with a pH of from 6.5 to 12.0 and a concentration of from about 0.01 wt.% To about 5 wt.% (Preferably from 0.1% to 0.5 %). These detergent cleansing compositions may contain other enzymes, in particular known proteases, amylases, cellulases, lipases or endoglycosidases, as well as additives and stabilizers.
Введение протеаз по этому изобретению в обычные очищающие композиции не связано с какими-либо особыми ограничениями. Другими словами, любые значения температуры и рН, приемлемые для данного детергента, приемлемы также для композиций по настоящему изобретению, если показатель рН находится в пределах вышеуказанного диапазона и данная температура ниже температуры денатурации описанной протеазы. Кроме того, протеазы по этому изобретению можно использовать в очищающей композиции без детергентов, отдельно или в сочетании с добавками и стабилизаторами.The incorporation of the proteases of this invention into conventional cleansing compositions is not subject to any particular limitations. In other words, any temperature and pH values acceptable for a given detergent are also acceptable for the compositions of the present invention if the pH is within the above range and this temperature is below the denaturation temperature of the described protease. In addition, the proteases of this invention can be used in a cleaning composition without detergents, alone or in combination with additives and stabilizers.
Настоящее изобретение относится также к очищающим композициям, содержащим варианты протеазы по этому изобретению. Очищающие композиции могут дополнительно содержать добавки, которые обычно используются в таких композициях. Эти добавки включают, но не ограничиваются ими, отбеливатели, поверхностно-активные вещества, модифицирующие компоненты, ферменты и катализаторы отбеливания. Специалисту в этой области должно быть очевидно, что добавки выбирают с учетом их пригодности для данной композиции. Приведенный здесь список не является исчерпывающим и должен рассматриваться только в качестве примеров приемлемых добавок. Специалисту в этой области должно быть также понятно, что необходимо использовать только те добавки, которые совместимы с ферментами и другими компонентами композиции, например с поверхностно-активным веществом.The present invention also relates to cleansing compositions comprising the protease variants of this invention. Cleansing compositions may additionally contain additives that are commonly used in such compositions. These additives include, but are not limited to, bleaches, surfactants, modifiers, enzymes, and bleach catalysts. One skilled in the art will appreciate that additives are selected for their suitability for a given composition. The list here is not exhaustive and should only be considered as examples of acceptable additives. The person skilled in the art should also understand that it is necessary to use only those additives that are compatible with enzymes and other components of the composition, for example with a surfactant.
Количество добавки в очищающей композиции, если она используется, составляет от около 0,01% до около 99,9%, предпочтительно от около 1% до около 95%, более предпочтительно от около 1% до около 80%.The amount of additive in the cleaning composition, if used, is from about 0.01% to about 99.9%, preferably from about 1% to about 95%, more preferably from about 1% to about 80%.
Варианты протеаз по настоящему изобретению могут быть введены в корм для животных в качестве части добавок, как это описано, например, в патентах США №№5612055, 5314692 и 5147642.The protease variants of the present invention can be introduced into animal feed as part of the additives, as described, for example, in US patent No. 5612055, 5314692 and 5147642.
Одним из аспектов этого изобретения является композиция для обработки ткани, включающая варианты протеаз по настоящему изобретению. Эту композицию можно использовать для обработки, например, шелка или шерсти, как это описано в таких публикациях, как RD 216034, европейский патент №134267, патент США №4533359 и европейский патент №344259.One aspect of this invention is a tissue treatment composition comprising the protease variants of the present invention. This composition can be used for processing, for example, silk or wool, as described in publications such as RD 216034, European patent No. 134267, US patent No. 4533359 and European patent No. 344259.
Далее настоящее изобретение иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем нижеследующей формулы изобретения.The present invention is further illustrated by examples which do not limit the scope of the following claims.
Все приведенные здесь публикации и патенты полностью включены в это описание изобретения в качестве ссылки.All publications and patents cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
ПРИМЕР 1EXAMPLE 1
Большое количество вариантов протеазы получено и очищено при помощи методов, хорошо известных в этой области. Все мутации произведены в субтилизине GG36 Bacillus lentus. Эти варианты приведены в таблице 4.A large number of protease variants were obtained and purified using methods well known in the art. All mutations were made in the subtilisin GG36 of Bacillus lentus. These options are shown in table 4.
ПРИМЕР 2EXAMPLE 2
Большое количество вариантов протеазы, полученных в примере 1, испытывали на эффективность в двух типах детергентов и условий стирки при помощи микроскопического анализа, описанного в патенте США №60/068796 "An improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition".A large number of protease variants obtained in Example 1 were tested for effectiveness in two types of detergents and washing conditions using the microscopic analysis described in US patent No. 60/068796 "An improved method of assaying for a preferred enzyme and / or preferred detergent composition" .
В таблице 5 представлены подвергнутые анализу варианты протеаз и результаты испытания в двух разных детергентах. В столбце А приведены данные для фильтрованного детергента Ariel Ultra (Procter & Gamble, Цинциннати, шт.Огайо, США) с концентрацией 0,67 г/л в растворе, содержащем 42,78 г/м3 (3 грана/галлон) смешанной жесткости Са2+/Мg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 20°С. В столбце В приведены данные для фильтрованного детергента Ariel Futur (Procter & Gamble, Цинциннати, шт.Огайо, США) с концентрацией 3,38 г/л в растворе, содержащем 213,9 г/м3 (15 гран/галлон) смешанной жесткости Са2+/Мg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 40°С.Table 5 presents the protease variants analyzed and the test results in two different detergents. Column A shows the data for Ariel Ultra filtered detergent (Procter & Gamble, Cincinnati, Ohio, USA) with a concentration of 0.67 g / l in a solution containing 42.78 g / m 3 (3 grains / gallon) of mixed hardness Ca 2+ / Mg 2+ and 0.3 ppm of enzyme in each container at 20 ° C. Column B shows data for a filtered Ariel Futur detergent (Procter & Gamble, Cincinnati, Ohio, USA) with a concentration of 3.38 g / l in a solution containing 213.9 g / m 3 (15 grains / gallon) of mixed hardness Ca 2+ / Mg 2+ and 0.3 ppm of enzyme in each container at 40 ° C.
ПРИМЕР 3EXAMPLE 3
В таблице 6 представлены подвергнутые анализу варианты протеаз по примеру 1 и результаты испытаний в четырех разных детергентах. Указанные варианты протеаз были подвергнуты тем же испытаниям на эффективность, что и в примере 2, с использованием нижеследующих детергентов. В столбце А приведены данные для фильтрованного детергента Ariel Ultra (Procter & Gamble, Цинциннати, шт.Огайо, США) с концентрацией 0,67 г/л в растворе, содержащем 42,78 г/м3 (3 грана/галлон) смешанной жесткости Са2+/Мg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 20°С. В столбце В приведены данные для фильтрованного детергента Ariel Futur (Procter & Gamble, Цинциннати, шт.Огайо, США) с концентрацией 3,38 г/л в растворе, содержащем 213,9 г/м3 (15 гран/галлон) смешанной жесткости Са2+/Мg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 40°С. В столбце С приведены данные для детергента с концентрацией 3,5 г/л HSP1 (Procter & Gamble, Цинциннати, шт.Огайо, США) в растворе, содержащем 114,08 г/м3 (8 гран/галлон) смешанной жесткости Са2+/Мg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 20°С. В столбце D приведены данные для детергента с концентрацией 1,5 г/л Tide КТ (Procter & Gamble, Цинциннати, шт.Огайо, США) в растворе, содержащем 42,78 г/м3 (3 грана/галлон) смешанной жесткости Са2+/Мg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 20°С.Table 6 presents the analyzed protease variants of example 1 and the test results in four different detergents. These protease variants were subjected to the same efficacy tests as in Example 2 using the following detergents. Column A shows the data for Ariel Ultra filtered detergent (Procter & Gamble, Cincinnati, Ohio, USA) with a concentration of 0.67 g / l in a solution containing 42.78 g / m 3 (3 grains / gallon) of mixed hardness Ca 2+ / Mg 2+ and 0.3 ppm of enzyme in each container at 20 ° C. Column B shows data for a filtered Ariel Futur detergent (Procter & Gamble, Cincinnati, Ohio, USA) with a concentration of 3.38 g / l in a solution containing 213.9 g / m 3 (15 grains / gallon) of mixed hardness Ca 2+ / Mg 2+ and 0.3 ppm of enzyme in each container at 40 ° C. Column C shows data for a detergent with a concentration of 3.5 g / L HSP1 (Procter & Gamble, Cincinnati, Ohio, USA) in a solution containing 114.08 g / m 3 (8 grains / gallon) of mixed hardness Ca 2 + / Mg 2+ and 0.3 ppm of enzyme in each container at 20 ° C. Column D shows the data for a detergent with a concentration of 1.5 g / L Tide CT (Procter & Gamble, Cincinnati, Ohio, USA) in a solution containing 42.78 g / m 3 (3 grains / gallon) of mixed hardness Ca 2+ / Mg 2+ and 0.3 ppm of enzyme in each container at 20 ° C.
Claims (6)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US95632497A | 1997-10-23 | 1997-10-23 | |
| US95632397A | 1997-10-23 | 1997-10-23 | |
| US08/956,323 | 1997-10-23 | ||
| US08/956,324 | 1997-10-23 | ||
| US08/956,564 | 1997-10-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000112653A RU2000112653A (en) | 2002-04-27 |
| RU2252254C2 true RU2252254C2 (en) | 2005-05-20 |
Family
ID=35820840
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000112653/13A RU2252254C2 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | Subtilisin bacillus variant (variants), dna encoding the same, expression vector and cleaning composition |
| RU2000112540/13A RU2252958C2 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | Subtilisin variant (variants), dna encoding the same, expression vector, cleaning composition, animal feed, composition for cloth treatment |
| RU2000112539/13A RU2269572C2 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | Multisubstituted protease (variants) |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000112540/13A RU2252958C2 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | Subtilisin variant (variants), dna encoding the same, expression vector, cleaning composition, animal feed, composition for cloth treatment |
| RU2000112539/13A RU2269572C2 (en) | 1997-10-23 | 1998-10-23 | Multisubstituted protease (variants) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (3) | RU2252254C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2541786C2 (en) * | 2008-06-06 | 2015-02-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Compositions and methods including versions of microbial proteases |
| RU2560978C2 (en) * | 2008-11-11 | 2015-08-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Proteases comprising one or more combinable mutations |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090129425A (en) * | 2007-03-12 | 2009-12-16 | 다니스코 유에스 인크. | Modified proteases |
| RU2569106C2 (en) * | 2007-06-06 | 2015-11-20 | ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН | Methods of improving protein efficiency |
| CN101784662B (en) * | 2007-06-06 | 2014-11-05 | 丹尼斯科美国公司 | Methods for improving protein properties |
| US7618801B2 (en) * | 2007-10-30 | 2009-11-17 | Danison US Inc. | Streptomyces protease |
| US9181296B2 (en) * | 2008-03-26 | 2015-11-10 | Novozymes A/S | Stabilized liquid enzyme compositions |
| CN102648277B (en) * | 2009-09-25 | 2015-05-20 | 诺维信公司 | Use of protease variants |
| CN102648273B (en) * | 2009-09-25 | 2017-04-26 | 诺维信公司 | Subtilase variants |
| CN105925556B (en) * | 2010-05-06 | 2020-11-13 | 丹尼斯科美国公司 | Compositions and methods comprising subtilisin variants |
| FI123425B (en) * | 2011-03-31 | 2013-04-30 | Ab Enzymes Oy | PROTEASE ENZYME AND ITS USES |
| CN106065381B (en) * | 2011-05-05 | 2019-07-26 | 宝洁公司 | Composition and method comprising serine protease variants |
| BR112013027963A2 (en) * | 2011-05-05 | 2016-11-29 | Danisco Us Inc | "Subtilisin variant with proteolytic activity, nucleic acid, expression vector, host cell, composition and cleaning method". |
| US10150957B2 (en) * | 2013-07-29 | 2018-12-11 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
-
1998
- 1998-10-23 RU RU2000112653/13A patent/RU2252254C2/en not_active IP Right Cessation
- 1998-10-23 RU RU2000112540/13A patent/RU2252958C2/en not_active IP Right Cessation
- 1998-10-23 RU RU2000112539/13A patent/RU2269572C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2541786C2 (en) * | 2008-06-06 | 2015-02-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Compositions and methods including versions of microbial proteases |
| RU2560978C2 (en) * | 2008-11-11 | 2015-08-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Proteases comprising one or more combinable mutations |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2269572C2 (en) | 2006-02-10 |
| RU2252958C2 (en) | 2005-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4511025B2 (en) | Multiple substitution protease mutant | |
| RU2252254C2 (en) | Subtilisin bacillus variant (variants), dna encoding the same, expression vector and cleaning composition | |
| US20030228995A1 (en) | Multiply-substituted protease variants with altered net charge for use in detergents | |
| EP2287321B1 (en) | Multiply-substituted protease variants | |
| MXPA00003806A (en) | Multiply-substituted protease variants with altered net charge for use in detergents |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161024 |