RU2236466C2 - Method for selection of cryoprotecting agents for cryopreserving biological samples (variants) - Google Patents
Method for selection of cryoprotecting agents for cryopreserving biological samples (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2236466C2 RU2236466C2 RU2002131661/13A RU2002131661A RU2236466C2 RU 2236466 C2 RU2236466 C2 RU 2236466C2 RU 2002131661/13 A RU2002131661/13 A RU 2002131661/13A RU 2002131661 A RU2002131661 A RU 2002131661A RU 2236466 C2 RU2236466 C2 RU 2236466C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strength
- coli
- effect
- freezing
- samples
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано в технологии криоконсервации биологических образцов, например, спермы ценных видов промысловых рыб (осетровые, лососевые).The invention relates to cryobiology and can be used in the technology of cryopreservation of biological samples, for example, sperm of valuable species of commercial fish (sturgeon, salmon).
Низкотемпературные криобанки спермы рыб являются одним из наиболее эффективных способов сохранения необходимого числа редких и исчезающих видов. Однако, поскольку глубокая заморозка - оттаивание это довольно сложные биотехнологические процессы, их эффективная работа зависит от множества технологических факторов, в том числе качества сред для криоконсервации.Low-temperature cryobanks of fish sperm are one of the most effective ways to preserve the required number of rare and endangered species. However, since deep freezing and thawing are rather complex biotechnological processes, their effective operation depends on many technological factors, including the quality of cryopreservation media.
Известен способ определения качества криопротекторов (ДМСО, ДЭСО) методом проникающих катионов тетрафенилфосфония. В результате глубокого замораживания бактерий Е.соli мембранный потенциал резко уменьшается (с 198 до 85 мВ). Инкубация бактерий в среде, содержащей диметилсульфоксид и диэтилсульфоксид в качестве криопротекторов, приводит к уменьшению значений потенциала на 16 и 27 мВ соответственно. Таким образом, диэтилсульфоксид является более эффективным криопротектором по сравнению с диметилсульфоксидом /1/.A known method for determining the quality of cryoprotectants (DMSO, DESO) by the method of penetrating tetraphenylphosphonium cations. As a result of deep freezing of E. coli bacteria, the membrane potential decreases sharply (from 198 to 85 mV). Incubation of bacteria in a medium containing dimethyl sulfoxide and diethyl sulfoxide as cryoprotectants leads to a decrease in potential values by 16 and 27 mV, respectively. Thus, diethyl sulfoxide is a more effective cryoprotectant compared with dimethyl sulfoxide / 1 /.
ДМСО - это классический криопротектор, который широко применяется, в частности, при работе со спермой осетровых рыб /2/. Однако в высоких концентрациях это вещество становится токсичным. По этой причине, при увеличении концентрации ДМСО до 20-25% его защитное действие снижается. Для компенсации токсического действия и повышения его защитных свойств известно использование гликопротеина. В систему для заморозки, содержащую 1М и 3М растворы ДМСО, вносили раствор гликопротеина (концентрация 20 мг/мл), из трески (Gadus morhya), обитающей в Белом море. Количество эмбрионов, развившихся до стадии компактной морулы, составило 65% /3/.DMSO is a classic cryoprotectant that is widely used, in particular, when working with semen of sturgeon fish / 2 /. However, in high concentrations, this substance becomes toxic. For this reason, with an increase in the concentration of DMSO to 20-25%, its protective effect decreases. To compensate for the toxic effect and increase its protective properties, the use of glycoprotein is known. A glycoprotein solution (concentration of 20 mg / ml) from cod (Gadus morhya) living in the White Sea was added to the freezing system containing 1M and 3M DMSO solutions. The number of embryos that developed to the compact morula stage was 65% / 3 /.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к способу по п.1 формулы изобретения является использование биосенсора на основе светящихся рекомбинантных клеток E.coli, несущих ген люциферазы светляков, иммобилизированных в криогеле поливинилового спирта. Данный биосенсор использован для подбора криопротекоров, используемых для иммобилизации в криогеле лабильных макромолекул /4/.The closest in technical essence and the achieved effect to the method according to
К способу по п.2, кроме вышеизложенного, наиболее близким является способ замораживания спермы баранов, сущность его в том, что в качестве криозащитных веществ в среду для заморозки добавляли синтетические жирорастворимые антиоксиданты (ИХФГАН - 1, ИХФГАН - 2, ИХФГАН - 3), синтезированные в институте химической физики РАН. Результаты осеменения спермой, замороженной с антиоксидантом, показали, что при однократном осеменении овец объягнилось на 9% больше, чем при осеменении спермой без антиоксиданта /5/.To the method according to
Целью настоящего изобретения является создание экспресс-метода для оценки качества потенциальных криопротекторов и повышение их криопротекторного эффекта с использованием в качестве тест-объекта светящихся бактерий.The aim of the present invention is the creation of an express method for assessing the quality of potential cryoprotectants and increasing their cryoprotective effect using luminous bacteria as a test object.
Эта цель достигается путем использования в качестве биосенсора рекомбинантного штамма В 5356 Е.Coli, несущего плазмиду, содержащую Lux-оперон, который помещают в среду для криоконсервации, содержащую анализируемый криопротектор, при плотности суспензии 106-107 кл/мл, экспозиции замораживания - 5 мин, экспозиции оттаивания – 30 мин, а силу протекторного эффекта определяют и по изменению люминесценции опытных проб по сравнению с контрольными. В другом варианте в качестве биосенсора используют рекомбинантный штамм В 5356 Е.Coli, несущий плазмиду, содержащую Lux-оперон, а в качестве модификатора в среду для криоконсервации, содержащую анализируемый криопротектор, добавляют аскорбиновую кислоту в концентрации 10 мкг/мл, при этом плотность суспензии составляет 106-107 кл/мл, экспозиция замораживания - 5 мин, экспозиция оттаивания - 30 мин, а силу протекторного эффекта определяют по изменению люминесценции опытных проб по сравнению с контрольными.This goal is achieved by using a recombinant E. coli strain B 5356 as a biosensor, carrying a plasmid containing a Lux operon, which is placed in a cryopreservation medium containing the analyzed cryoprotectant, with a suspension density of 10 6 -10 7 cells / ml, freezing exposure - 5 minutes, thawing exposure - 30 minutes, and the strength of the tread effect is also determined by the change in the luminescence of the experimental samples compared to the control ones. In another embodiment, a recombinant strain of E. coli B 5356 carrying a plasmid containing a Lux operon is used as a biosensor, and ascorbic acid at a concentration of 10 μg / ml is added as a modifier to the cryopreservation medium containing the analyzed cryoprotectant, the suspension density being is 10 6 -10 7 cells / ml, the exposure of freezing is 5 minutes, the exposure of thawing is 30 minutes, and the strength of the tread effect is determined by the change in the luminescence of the experimental samples compared to the control ones.
Достижение положительного эффекта согласно цели настоящего изобретения обеспечивается тем, что в качестве тест-объекта используется рекомбинантный штамм Е.Coli HB 101/pGB lux 37, коллекционный номер В 5356, полученного из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов - ВКПМ (г. Москва). Штамм несет плазмиду pGB lux 37, содержащую lux-оперон из Ph.leognati, под контролем конститутивного промотора.The achievement of a positive effect according to the purpose of the present invention is ensured by the fact that a recombinant E. coli HB 101 / pGB lux 37 strain, collection number B 5356 obtained from the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms - VKPM (Moscow) is used as a test object. The strain carries the plasmid pGB lux 37 containing the lux operon from Ph.leognati, under the control of a constitutive promoter.
В другом варианте недостаточное защитное действие криопротектора компенсируется введением дополнительно в среду для криоконсервации модификатора, в качестве которого используют аскорбиновую кислоту в концентрации 10 мкг/мл.In another embodiment, the insufficient protective effect of the cryoprotectant is compensated by the addition of a modifier to the cryopreservation medium, which is used ascorbic acid at a concentration of 10 μg / ml
Основная клеточная мишень деструктивного действия замораживания-оттаивания - это клеточная мембрана. Один из наиболее информативных бактериальных тестов на повреждение мембран - биолюминесцентный тест. Общность структуры биомембран отмечается для всех живых систем, что ставит предложенный тест в разряд наиболее показательных при определении качества криопротекторов. Он основан на регистрации интенсивности люминесценции светящихся бактерий, которая зависит от работы дыхательной цепи, большинство ферментов которой связаны с мембраной. Поэтому повреждение мембран вызывает изменение интенсивности биолюминесценции светящихся бактерий.The main cellular target of the destructive effect of freezing and thawing is the cell membrane. One of the most informative bacterial membrane damage tests is the bioluminescent test. A common structure of biomembranes is noted for all living systems, which puts the proposed test among the most indicative in determining the quality of cryoprotectants. It is based on recording the luminescence intensity of luminous bacteria, which depends on the work of the respiratory chain, most of the enzymes of which are associated with the membrane. Therefore, membrane damage causes a change in the bioluminescence intensity of luminous bacteria.
Добавление аскорбиновой кислоты в качестве модификатора в концентрации 10 мкг/мл полностью компенсирует токсическое действие высоких концентраций криопротекторов, например ДМСО, позволяет снизить их концентрации и при этом добиться достоверного повышения криопротекторного эффекта.The addition of ascorbic acid as a modifier at a concentration of 10 μg / ml completely compensates for the toxic effect of high concentrations of cryoprotectants, for example, DMSO, reduces their concentration and, at the same time, achieves a significant increase in the cryoprotective effect.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Вариант I.Option I.
В контрольные пробирки типа “Эппендорф” вносят по 1 мл буфера А (17% NaCl, 25% глюкоза, 1М трис - НСl, рН 7,5), в опытные пробирки - по 1 мл исследуемого криопротектора на основе буфера А. После этого во все пробирки добавляют по 50 мкл препарата штамма В 5356 Е.Соli и инкубируют в течение 10 мин. После инкубации часть контрольных и опытных пробирок подвергают замораживанию в жидком азоте (-196°С) в течение 5 мин. Разморозку проб осуществляют на водяной бане (30°С) в течение 30 мин. Измерения проводят на люминометре ЛТ-01. Результаты измерений вносят в протокол и по предложенной формуле рассчитывают силу протекторного эффекта Pp1 ml of buffer A (17% NaCl, 25% glucose, 1M Tris - HCl, pH 7.5) is added to control tubes of the Eppendorf type, and 1 ml of the studied cryoprotectant based on buffer A is added to the test tubes. all tubes add 50 μl of the preparation of strain B 5356 E. Coli and incubated for 10 minutes After incubation, part of the control and experimental tubes are subjected to freezing in liquid nitrogen (-196 ° C) for 5 minutes. The samples are thawed in a water bath (30 ° C) for 30 minutes. Measurements are carried out on a luminometer LT-01. The measurement results are entered into the protocol and the strength of the tread effect Pp is calculated using the proposed formula
где T - процент падения свечения после замораживания в жидком азоте и последующего оттаивания.where T is the percentage of luminescence after freezing in liquid nitrogen and subsequent thawing.
Процент падения свечения Т - величина безразмерная и определяется по формулеThe percentage of fall of the glow T is a dimensionless quantity and is determined by the formula
T=100%(Iо-I)/Iо,T = 100% (Io-I) / Io,
где Iо и I соответственно интенсивность биолюминесценции контрольной и исследуемой пробы через определенный интервал времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом.where Io and I, respectively, the intensity of the bioluminescence of the control and the test sample after a certain time interval of exposure of the test solution with the test object.
Вариант II.Option II.
В контрольные пробирки типа “Эппендорф” вносили по 1 мл буфера А (17% NaCl, 25% глюкоза, 1М трис - НСl, рН 7,5). Раствор аскорбиновой кислоты (10 мг/мл) готовили на основе предложенного буфера непосредственно перед использованием. В опытные пробирки вносили по 1 мл исследуемого криопротектора на основе буфера А с аскорбиновой кислотой. После этого во все пробирки добавляли по 50 мкл препарата штамма В 5356 Е.Соli и инкубировали в течение 10 мин. После инкубации часть контрольных и опытных пробирок подвергали замораживанию в жидком азоте (-196°С) в течение 5 мин. Разморозку проб осуществляли на водяной бане (30°С) в течение 30 мин. Измерения проводили на люминометре ЛТ-01. Результаты измерений вносили в протокол и по предложенной формуле рассчитывали силу протекторного эффекта Pp1 ml of buffer A (17% NaCl, 25% glucose, 1 M Tris — HCl, pH 7.5) was added to control tubes of the Eppendorf type. A solution of ascorbic acid (10 mg / ml) was prepared on the basis of the proposed buffer immediately before use. 1 ml of the studied cryoprotectant based on buffer A with ascorbic acid was introduced into the test tubes. After that, 50 μl of the preparation of strain B 5356 E. Coli were added to all tubes and incubated for 10 min. After incubation, part of the control and experimental tubes were subjected to freezing in liquid nitrogen (-196 ° С) for 5 min. Defrosting of the samples was carried out in a water bath (30 ° C) for 30 min. The measurements were carried out on an LT-01 luminometer. The measurement results were entered into the protocol and the strength of the tread effect Pp was calculated using the proposed formula
где T - процент падения свечения после замораживания в жидком азоте и последующего оттаивания.where T is the percentage of luminescence after freezing in liquid nitrogen and subsequent thawing.
Процент падения свечения Т - величина безразмерная и определяется по формулеThe percentage of decrease in luminescence T is a dimensionless quantity and is determined by the formula
Т=100%(Iо-I)/Iо,T = 100% (Io-I) / Io,
где Iо и I соответственно интенсивность биолюминесценции контрольной и исследуемой пробы через определенный интервал времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом.where Io and I, respectively, the intensity of the bioluminescence of the control and the test sample after a certain time interval of exposure of the test solution with the test object.
На фиг.1 - график изменения силы протекторного эффекта ДМСО различных концентраций при криоконсервации штамма В 5356 Е.Соli.Figure 1 - graph of changes in the strength of the protective effect of DMSO of various concentrations during cryopreservation of strain B 5356 E. Coli.
На фиг.2 - график изменения силы протекторного эффекта глицерина различных концентраций при криоконсервации штамма В 5356 Е.Соli.Figure 2 is a graph of changes in the strength of the protective effect of glycerol of various concentrations during cryopreservation of strain B 5356 E. Coli.
На фиг.3 - график изменения силы протекторного эффекта трегалозы различных концентраций при криоконсервации штамма В 5356 Е.Coli.Figure 3 is a graph of changes in the strength of the protective effect of trehalose of various concentrations during cryopreservation of strain E. coli B 5356.
На фиг.4 - график зависимости силы протекторного эффекта ДМСО различных концентраций при внесении в среду для криоконсервации аскорбиновой кислоты.Figure 4 is a graph of the dependence of the strength of the protective effect of DMSO of various concentrations when added to the environment for cryopreservation of ascorbic acid.
На фиг.5 - график зависимости силы протекторного эффекта глицерина различных концентраций при внесении в среду для криоконсервации аскорбиновой кислоты.Figure 5 is a graph of the dependence of the strength of the protective effect of glycerol of various concentrations when added to the environment for the cryopreservation of ascorbic acid.
Примеры осуществления способа по варианту I.Examples of the method according to option I.
Пример 1.Example 1
1. Подготовка к выполнению измерений.1. Preparing to take measurements.
Подготовку люминометра и его калибровку проводили в соответствии с инструкцией по эксплуатации.The preparation of the luminometer and its calibration was carried out in accordance with the instruction manual.
2. Выполнение анализа.2. Perform analysis.
2.1 Приготовление буфера А (17% NaCl, 25% глюкоза, 1М трис - HCl, PH 7,5).2.1 Preparation of buffer A (17% NaCl, 25% glucose, 1M Tris - HCl, PH 7.5).
2.2 Приготовление раствора ДМСО - 15% на основе буфера А.2.2 the Preparation of a solution of DMSO - 15% based on buffer A.
2.3 Полученный в 2.2 раствор добавляли по 1 мл в опытные пробирки, а в контрольные добавляли 1 мл буфера А.2.3. The solution obtained in 2.2 was added 1 ml to the test tubes, and 1 ml of buffer A was added to the control tubes.
2.4. Приготовление препарата штамма В 5356 Е.Coli. Для этого штамм В 5356 Е.Coli подращивали в течение 18 ч при 37°С на чашке Петри с полной средой МПА с ампициллином в концентрации 50 мг/л. Затем клетки тестерного штамма смывали с чашки Петри буфером А.2.4. Preparation of the preparation of strain B 5356 E. Coli. For this, E. coli strain B 5356 was grown for 18 h at 37 ° C on a Petri dish with full MPA medium with ampicillin at a concentration of 50 mg / L. Then the cells of the test strain were washed off the Petri dish with buffer A.
2.5 50 мкл препарата штамма В 5356 Е.Coli добавляли в контрольные и в опытные пробирки.2.5 50 μl of the preparation of strain B 5356 E. Coli was added to the control and experimental tubes.
2.6 Десятиминутная инкубация.2.6 Ten-minute incubation.
2.7 Пятиминутная заморозка в жидком азоте (-196°С).2.7 Five-minute freezing in liquid nitrogen (-196 ° С).
2.8 Размораживание на водяной бане (30°С) в течение 30 мин.2.8 Defrosting in a water bath (30 ° C) for 30 minutes.
2.9 Измерение биолюминесценции на люминометре ЛТ-01.2.9 Bioluminescence measurement on an LT-01 luminometer.
3 Обработка полученных данных.3 Processing the received data.
3.1 Расчет процента падения свечения по формуле:3.1 Calculation of the percentage of fall of the glow according to the formula:
Т=(0,847-0,557)/0,847*100=34,25%.T = (0.847-0.557) / 0.847 * 100 = 34.25%.
3.2 Расчет силы протекторного эффекта по формуле:3.2 Calculation of the strength of the tread effect according to the formula:
Рр=(92,6-34,25)/92,6*100=63%.Pp = (92.6-34.25) / 92.6 * 100 = 63%.
Пример 2. Аналогично примеру 1 использовали 20% раствор ДМСО.Example 2. Analogously to example 1, a 20% DMSO solution was used.
Сила протекторного эффекта составила 74%.The strength of the protective effect was 74%.
Пример 3. Аналогично примеру 1 использовали 25% раствор ДМСО.Example 3. Analogously to example 1, a 25% DMSO solution was used.
Сила протекторного эффекта составила 55,7%.The strength of the protective effect was 55.7%.
Пример 4. Аналогично примеру 1 исследовали силу протекторного эффекта глицерина в концентрации 1%, которая составила 9%.Example 4. Analogously to example 1, we studied the strength of the protective effect of glycerol at a concentration of 1%, which amounted to 9%.
Пример 5. Аналогично примеру 1 использовали 3% раствор глицерина.Example 5. Analogously to example 1, a 3% glycerol solution was used.
Сила протекторного эффекта составила 47%.The strength of the protective effect was 47%.
Пример 6. Аналогично примеру 1 использовали 5% раствор глицерина.Example 6. Analogously to example 1, a 5% glycerol solution was used.
Сила протекторного эффекта составила 82,1%.The strength of the protective effect was 82.1%.
Пример 7. Аналогично примеру 1 использовали 10% раствор глицерина.Example 7. Analogously to example 1, a 10% glycerol solution was used.
Сила протекторного эффекта составила 85%.The strength of the protective effect was 85%.
Пример 8. Аналогично примеру 1 использовали 15% раствор глицерина.Example 8. Analogously to example 1, a 15% glycerol solution was used.
Сила протекторного эффекта составила 100%.The strength of the tread effect was 100%.
Пример 9. Аналогично примеру 1 исследовали силу протекторного эффекта трегалозы в концентрации 0.25%, которая составила 11,8%.Example 9. Analogously to example 1, we studied the strength of the protective effect of trehalose at a concentration of 0.25%, which amounted to 11.8%.
Пример 10. Аналогично примеру 1 использовали 0.5% раствор трегалозы.Example 10. Analogously to example 1, a 0.5% trehalose solution was used.
Сила протекторного эффекта составила 17,9%.The strength of the protective effect was 17.9%.
Пример 11. Аналогично примеру 1 использовали 1% раствор трегалозы.Example 11. Analogously to example 1, a 1% trehalose solution was used.
Сила протекторного эффекта составила 66%.The strength of the protective effect was 66%.
Пример 12. Аналогично примеру 1 использовали 2% раствор трегалозы.Example 12. Analogously to example 1, a 2% trehalose solution was used.
Сила протекторного эффекта составила 77%.The strength of the protective effect was 77%.
Как видно из примеров 1-3 и графика на фиг.1, наибольший криопротекторный эффект ДМСО достигается при концентрации 15 и 20%, при дальнейшем повышении концентрации наблюдается резкое снижение протекторного действия и проявление токсичности, которая может быть обусловлена окисленными примесями, в том числе диметилсульфатом /6/.As can be seen from examples 1-3 and the graph in figure 1, the greatest cryoprotective effect of DMSO is achieved at a concentration of 15 and 20%, with a further increase in concentration there is a sharp decrease in the protective effect and the manifestation of toxicity, which may be due to oxidized impurities, including dimethyl sulfate / 6 /.
На фиг.2 сведены результаты опытов в примерах 4-8 криопротекторного эффекта глицерина. Полученные данные показывают, что криопротекторное действие глицерина практически линейно увеличивается с увеличением концентрации и достигает 100% при концентрации глицерина 15%, отметим, что 10-15% концентрации глицерина являются оптимальными для криоконсервации клеток самых разных водных объектов.Figure 2 summarizes the results of the experiments in examples 4-8 of the cryoprotective effect of glycerol. The data obtained show that the cryoprotective effect of glycerol almost linearly increases with increasing concentration and reaches 100% at a glycerol concentration of 15%, note that 10-15% glycerol concentrations are optimal for cryopreservation of cells of various water bodies.
На фиг.3 изображена сила протекторного эффекта трегалозы (примеры 9-12), чей протектррный эффект проявляется в значительно меньших, по сравнению с глицерином, концентрациях.Figure 3 shows the strength of the protective effect of trehalose (examples 9-12), whose protective effect manifests itself in significantly lower concentrations compared to glycerol.
Все исследованные криопротекторы известны, данные, полученные в результате испытаний, совпадают с литературными.All investigated cryoprotectants are known, the data obtained as a result of tests coincide with the literature.
Таким образом, вариант 1 способа позволяет как воспроизводить криопротекторное действие известных криопротекторов, так и оценивать силу протекторного эффекта новых, т.е. решать задачу широкого скрининга потенциальных криопротекторов среди веществ разных классов.Thus,
Примеры осуществления способа по варианту II.Examples of the method according to option II.
Пример 13.Example 13
1. Подготовка к выполнению измерений.1. Preparing to take measurements.
Подготовку люминометра и его калибровку проводили в соответствии с инструкцией по эксплуатации.The preparation of the luminometer and its calibration was carried out in accordance with the instruction manual.
2. Выполнение анализа.2. Perform analysis.
2.1 Приготовление буфера А (17% NaCl, 25% глюкоза, 1 М трис - НСl, РН 7,5).2.1 Preparation of buffer A (17% NaCl, 25% glucose, 1 M Tris - Hcl, pH 7.5).
2.2 Приготовление раствора аскорбиновой кислоты (10 мкг/мл) на основе буфера А.2.2 Preparation of a solution of ascorbic acid (10 μg / ml) based on buffer A.
2.3 Приготовление растворов ДМСО концентрацией 15% на основе раствора аскорбиновой кислоты.2.3 Preparation of DMSO solutions with a concentration of 15% based on a solution of ascorbic acid.
2.4 Полученный в 2.3 раствор добавляли по 1 мл в опытные пробирки, а в контрольные добавляли 1 мл буфера А.2.4. The resulting solution in 2.3 was added 1 ml to the test tubes, and 1 ml of buffer A was added to the control tubes.
2.5 Приготовление препарата штамма В 5356 Е.Соli. Для этого штамм В 5356 Е.Соli растили в течение 18 ч при 37°С на чашке Петри с полной средой МПА с ампициллином в концентрации 50 мг/л. Затем клетки тестерного штамма смывали с чашки Петри буфером А.2.5 Preparation of the preparation of strain B 5356 E. Coli. For this, E. coli strain B 5356 was grown for 18 h at 37 ° C on a Petri dish with a complete MPA medium with ampicillin at a concentration of 50 mg / L. Then the cells of the test strain were washed off the Petri dish with buffer A.
2.6 Добавление по 50 мкл препарата штамма В 5356 Е.Сoli в контрольные и в опытные пробирки.2.6 Addition of 50 μl of the preparation of strain B 5356 E. Coli to control and experimental tubes.
2.7 Десятиминутная инкубация проб.2.7 Ten-minute incubation of samples.
2.8 Пятиминутная заморозка в жидком азоте (-196°С).2.8 Five-minute freezing in liquid nitrogen (-196 ° С).
2.9 Размораживание на водяной бане (30°С) в течение 30 мин.2.9 Defrosting in a water bath (30 ° C) for 30 minutes.
2.10 Измерение биолюминесценции на люминометре ЛТ-01.2.10 Bioluminescence measurement on an LT-01 luminometer.
3. Обработка полученных данных.3. Processing the received data.
3.1 Расчет среднеарифметического значения величины падения свечения.3.1 Calculation of the arithmetic mean value of the magnitude of the fall of the glow.
3.2 Расчет процента падения свечения, Т=25,9%.3.2 Calculation of the percentage of decrease in luminescence, T = 25.9%.
3.3 Расчет силы протекторного эффекта Рр проводили аналогично примеру 1, Рр=72%.3.3 Calculation of the strength of the protective effect of PP was carried out analogously to example 1, PP = 72%.
Пример 14. Аналогично примеру 13 готовили раствор ДМСО концентрацией 20%.Example 14. Analogously to example 13, a DMSO solution of 20% concentration was prepared.
Сила протекторного эффекта составила 100%.The strength of the tread effect was 100%.
Пример 15. Аналогично примеру 13 готовили раствор ДМСО концентрацией 25%.Example 15. Analogously to example 13, a DMSO solution of 25% concentration was prepared.
Сила протекторного эффекта составила 100%.The strength of the tread effect was 100%.
Пример 16. Аналогично примеру 13 готовили раствор глицерина концентрацией 3%.Example 16. Analogously to example 13, a glycerol solution of 3% concentration was prepared.
Сила протекторного эффекта составила 73,22%.The strength of the protective effect was 73.22%.
Пример 17. Аналогично примеру 13 готовили раствор глицерина концентрацией 5%.Example 17. Analogously to example 13, a glycerol solution of 5% concentration was prepared.
Сила протекторного эффекта составила 94,5%.The strength of the protective effect was 94.5%.
Пример 18. Аналогично примеру 13 готовили раствор глицерина концентрацией 10%.Example 18. Analogously to example 13, a glycerol solution of 10% concentration was prepared.
Сила протекторного эффекта составила 95%.The strength of the protective effect was 95%.
Как видно из примеров 13-15 и графика на фиг.4, внесение в среду для криоконсервации аскорбиновой кислоты снижает токсическое действие ДМСО и повышает силу протекторного эффекта.As can be seen from examples 13-15 and the graph in figure 4, the introduction of ascorbic acid into the cryopreservation medium reduces the toxic effect of DMSO and increases the strength of the protective effect.
Из графика на фиг.5 и примеров 16-18 видно, что криопротекторный эффект глицерина значительно повышается при криоконсервации в присутствии аскорбиновой кислоты.From the graph in FIG. 5 and examples 16-18 it can be seen that the cryoprotective effect of glycerol is significantly increased during cryopreservation in the presence of ascorbic acid.
Источники информацииSources of information
1. Маркарян Ш.А., Баграмян К.А., Аракелян В.Б. Мембранный потенциал до и после глубокого замораживания Escherichia coli в присутствии диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида // Биофизика, 2002, т.47, вып.2. С.315-317.1. Markaryan Sh.A., Bagramyan K.A., Arakelyan V.B. Membrane potential before and after deep freezing of Escherichia coli in the presence of dimethyl sulfoxide and diethyl sulfoxide // Biophysics, 2002, v. 47,
2. Odintsova N., Kiselev К., Sanina N., Kostetsky E. Cryopreservation of primary cell cultures of marine invertebratebrates. // Cryo Letters 2001 V.75. N.1 / P.299-310.2. Odintsova N., Kiselev K., Sanina N., Kostetsky E. Cryopreservation of primary cell cultures of marine invertebratebrates. // Cryo Letters 2001 V.75. N.1 / P.299-310.
3. Каранова М.В., Цветкова Л.И., Петропавлов Н.Н. Криопротекторный эффект низкомолекулярных и высокомолекулярных антифризных гликопротеинов при замораживании спермы среднерусского карпа Cyprinus Widdle-Russia // Биофизика, 1997, т.42, вып.3. С.725-727.3. Karanova M.V., Tsvetkova L.I., Petropavlov N.N. The cryoprotective effect of low molecular weight and high molecular weight antifreeze glycoproteins during sperm freezing of Central Russian carp Cyprinus Widdle-Russia // Biophysics, 1997, v. 42,
4. Н.Н. Угарова, Л.Ю. Бровко. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ. Методические разработки, МГУ, химфак, 1981, 133 с.4. N.N. Ugarova, L.Yu. Brovko. Bioluminescence and bioluminescent analysis. Methodological developments, Moscow State University, chemical faculty, 1981, 133 pp.
5. Ерохин А.С., Епишина И.М., Чернова И.Е. Новый антиоксидант - криопротектор спермы баранов // Зоотехния, 1994. №10. С.28-29.5. Erokhin A.S., Epishina I.M., Chernova I.E. A new antioxidant - cryoprotectant of ram sperm // Zootechny, 1994. No. 10. S.28-29.
6. Hoffmarm G.R. Genetic effects of dimethyl sulfate, diethyl sulfate, and related compounds. // Mutat.Res. 1980 V.75. N.1. P.63-129.6. Hoffmarm G.R. Genetic effects of dimethyl sulfate, diethyl sulfate, and related compounds. // Mutat.Res. 1980 V.75. N.1. P.63-129.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002131661/13A RU2236466C2 (en) | 2002-11-25 | 2002-11-25 | Method for selection of cryoprotecting agents for cryopreserving biological samples (variants) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002131661/13A RU2236466C2 (en) | 2002-11-25 | 2002-11-25 | Method for selection of cryoprotecting agents for cryopreserving biological samples (variants) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002131661A RU2002131661A (en) | 2004-05-20 |
| RU2236466C2 true RU2236466C2 (en) | 2004-09-20 |
Family
ID=33433203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002131661/13A RU2236466C2 (en) | 2002-11-25 | 2002-11-25 | Method for selection of cryoprotecting agents for cryopreserving biological samples (variants) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2236466C2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2508397C1 (en) * | 2012-10-04 | 2014-02-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Биохимической Физики Им. Н.М. Эмануэля Российской Академии Наук (Ибхф Ран) | Cryopreservation method of cells of phototrophic microorganisms |
| RU2650786C1 (en) * | 2017-09-15 | 2018-04-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Калужский Государственный Университет им. К.Э. Циолковского" | Method of cryopreservation of cyanobacterium cells |
| RU2686107C1 (en) * | 2018-01-16 | 2019-04-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method of optimal cryoprotector selection having glycogen content in preserved blood leukocytes |
| RU2689328C1 (en) * | 2017-12-05 | 2019-05-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for determining an optimal cryoprotector according to a cytochemical indicator of content of succinate dehydrogenase in blood plasma leukocytes |
-
2002
- 2002-11-25 RU RU2002131661/13A patent/RU2236466C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| УГАРОВА Н.Н. и др. Биолюминесценция и биолюминисцентный анализ. Методические разработки. МГУ, химфак. - 1981, 133 с. ЕРОХИН А.С. и др. Новый антиоксидант - криопротектор спермы баранов. Зоотехния. - 1994, №10, с.28 и 29. МАРКАРЯН Ш.А. и др. Мембранный потенциал до и после глубокого замораживания Escherichia coli в присутствии диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида. Биофизика. - 2002, т.47, вып.2, с.315-317. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2508397C1 (en) * | 2012-10-04 | 2014-02-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Биохимической Физики Им. Н.М. Эмануэля Российской Академии Наук (Ибхф Ран) | Cryopreservation method of cells of phototrophic microorganisms |
| RU2650786C1 (en) * | 2017-09-15 | 2018-04-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Калужский Государственный Университет им. К.Э. Циолковского" | Method of cryopreservation of cyanobacterium cells |
| RU2689328C1 (en) * | 2017-12-05 | 2019-05-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method for determining an optimal cryoprotector according to a cytochemical indicator of content of succinate dehydrogenase in blood plasma leukocytes |
| RU2686107C1 (en) * | 2018-01-16 | 2019-04-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Method of optimal cryoprotector selection having glycogen content in preserved blood leukocytes |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Crutchfield et al. | Cryopreservation of chlamydomonas reinhardtii (chlorophyta) | |
| Linhart et al. | Cryopreservation of sperm in common carp Cyprinus carpio: sperm motility and hatching success of embryos | |
| He et al. | Effects of dimethyl sulfoxide and glycine on cryopreservation induced damage of plasma membranes and mitochondria to striped bass (Morone saxatilis) sperm | |
| Gwo et al. | Cryopreservation of a marine microalga, Nannochloropsis oculata (Eustigmatophyceae) | |
| RU2317703C1 (en) | Method for cryogenic preservation of sturgeon fish semen | |
| US6610531B1 (en) | Viable dried bacteria produced by drying in the presence of trehalose and divalent cation | |
| Doello et al. | The essential role of sodium bioenergetics and ATP homeostasis in the developmental transitions of a cyanobacterium | |
| Singh et al. | Cryopreservation of microorganisms | |
| RU2236466C2 (en) | Method for selection of cryoprotecting agents for cryopreserving biological samples (variants) | |
| Fung et al. | Repair, growth, and enterotoxigenesis of Staphylococcus aureus S-6 injured by freeze-drying | |
| RU2675947C1 (en) | Method of express-evaluation of cryo-resistance of stallion sperm | |
| US20090221056A1 (en) | Pathogen-Detecting Cell Preservation Systems | |
| RU2522811C2 (en) | METHOD OF PREPARING SYMBIOTIC BACTERIA OF GENUS Xenorhabdus, ISOLATED FROM NEMATODES OF GENUS Steinernema feltiae protense, FOR STORAGE | |
| Lampinen et al. | Use of Escherichia coli cloned with genes encoding bacterial luciferase for evaluation of chemical toxicity | |
| CN114667998A (en) | Sheep semen low-temperature-storage antioxidant diluent and preparation method and application thereof | |
| Lin et al. | Use of luminometry and flow cytometry for evaluating the effects of cryoprotectants in the gorgonian coral endosymbiont Symbiodinium | |
| US20100267002A1 (en) | Peptide having life-lengthening effect on cells | |
| Irdani et al. | Low cryoprotectant concentrations and fast cooling for nematode cryostorage | |
| US20030044965A1 (en) | Long term preservation and storage of viable dried bacteria | |
| Fitzgerald et al. | Effect of storage temperature, equilibration time, and buffers on survival of Tritrichomonas foetus in the presence of glycerol at freezing temperatures | |
| RU2002131661A (en) | METHOD FOR SELECTING CRYOPROTECTORS FOR CRYO-CONSERVATION OF BIOLOGICAL SAMPLES (OPTIONS) | |
| Balczun et al. | Lyophilisation as a simple and safe method for long-term storage of free-living amoebae at ambient temperature | |
| ES2232290B1 (en) | PROCEDURE FOR CULTIVATION OF THE RECOMBINING PSEUDOMONAS (CECT 5279) FOR USE IN THE DESULFURATION OF DIBENZOTIOPHENE. | |
| Hancocks et al. | An investigation into the preservation of microbial cell banks for α-amylase production during 5 L fed-batch Bacillus licheniformis fermentations | |
| EP1086241B1 (en) | Non-viable cell preparation and assay reagent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20071126 |